CN102933559B

CN102933559B - 光学活性二苄胺衍生物及其制备方法

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Publication number: CN102933559B
Application number: CN201180027596.9A
Authority: CN
Inventors: 扇谷忠明; 村上猛; 三代泽胜利; 涩谷公幸; 山崎浩市; 日下部太一
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 2010-06-04
Filing date: 2011-06-03
Publication date: 2016-01-27
Anticipated expiration: 2031-06-03
Also published as: EP2578574A1; IL223377A; EA024241B1; JP5555320B2; EP2578574A4; ES2581557T3; US8906895B2; AU2011259929A1; MX338024B; ZA201209372B; MX2012014149A; AU2011259929B2; PT2578574E; TWI492749B; JPWO2011152508A1; CN104529910A; TW201208688A; KR20170078865A; CA2801417A1; EP2578574B1

Abstract

具有降低PCSK9蛋白量、增加LDL受体量的作用的、实质上光学上纯的(S)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸、或其盐、或它们的溶剂合物。

Description

光学活性二苄胺衍生物及其制备方法

技术领域

本发明涉及作为药物的有效成分等有用的光学活性二苄胺衍生物及其制备方法。

背景技术

近年来，因生活水平提高而伴随的饮食向高热量和高胆固醇型变化、肥胖、运动不足、老龄化等，造成患有血脂障碍(高脂血症)和由此引起的动脉硬化性疾病的患者激增。以Framingham研究为首的多项病因学研究表明，低密度脂蛋白(LDL)胆固醇值与心脏病的发病率成正比，因此血脂障碍和动脉硬化的药物治疗将重点放在降低LDL胆固醇值上(非专利文献1)。

高LDL胆固醇血症是心血管疾病的重要风险因素之一，其治疗方法随着HMG-CoA还原酶抑制剂(statins，他汀类药物)的推出取得了飞跃性进步。然而，虽然他汀类药物有力地降低了LDL胆固醇，但心血管疾病引起的心脏意外、死亡率的降低仍停留在约30%。人们认为通过进一步降低LDL胆固醇可以进一步减轻心血管疾病引起的死亡风险，但是存在着他汀类药物的高剂量给予会增加横纹肌溶解症的风险，而无法应用的问题。

因此，希望有一种与他汀类药物的作用模式不同、并且具有强效的血中LDL胆固醇降低作用的药物。

前蛋白转化酶(PCs)是哺乳类的丝氨酸蛋白酶家族的成员，与细菌中的枯草杆菌蛋白酶、酵母中的kexin具有同源性。作为PCs之一的PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型：ProproteinConvertaseSubtilisin/kexin9)主要在肝脏中表达，分泌到细胞外，在肝细胞膜表面上与LDL受体结合，促进LDL受体向细胞内转移。转移到细胞内的LDL受体被细胞内器官分解。LDL受体具有将含LDL胆固醇的脂蛋白从循环血液中输送至肝脏的功能，因此PCSK9蛋白的产生抑制了肝脏对血中LDL胆固醇的摄取，结果使血中LDL胆固醇升高。实际上，已知在PCSK9基因中具有功能获得型突变的人的血中LDL胆固醇水平高，与常染色体显性高胆固醇血症有关(非专利文献2)。另一方面，在PCSK9基因中具有功能缺失突变的人的血中LDL胆固醇水平较低(非专利文献3)。此外，动物级别显示，肝脏的PCSK9基因缺失的小鼠的LDL胆固醇为低值(非专利文献4)。

根据以上内容，认为通过抑制PCSK9蛋白的产生等来降低该蛋白量或者抑制PCSK9蛋白的功能与LDL受体量的增加有关，进而与强效的LDL胆固醇降低作用相关。

在这种背景下，最近与PCSK9蛋白的功能抑制或产生抑制相关的研究日渐活跃。例如，作为使用抗体或反义寡核苷酸的技术，报导了通过PCSK9的单克隆抗体来抑制PCSK9蛋白的功能、通过RNA干扰来抑制PCSK9蛋白的产生等(非专利文献5～7)。另外，作为使用低分子化合物的技术，有黄连素(berberine)降低了HepG2细胞中的PCSK9的mRNA和蛋白水平的报道(非专利文献8)；作为膜联蛋白A2(annexinA2)活化剂的5-氮杂胞嘧啶核苷促进了PCSK9蛋白与膜联蛋白A2的结合，抑制了LDL受体的分解的报道(专利文献1)。然而，除了上述物质以外，几乎没有报道低分子化合物的PCSK9蛋白功能抑制剂或PCSK9蛋白产生抑制剂。

需要说明的是，专利文献2中公开了对胆固醇酯转运蛋白(CETP)显示强抑制活性、具有强的血中HDL胆固醇增加作用、具有二苄胺结构的嘧啶化合物，作为其实施例45化合物公开了为外消旋体的下式(I)所示化合物(反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸，在以下的说明书中也称“外消旋体化合物(I)”)，

但根本没有记载也没有暗示外消旋体化合物(I)与PCSK9蛋白的相关性。

由于PCs对癌细胞的增殖、运动、粘附、侵袭产生影响，作为癌症治疗的靶受到关注(非专利文献9)。还知道PCs与肥胖、糖尿病、阿尔茨海默病相关，还与获得性免疫缺乏综合征(AIDS)和严重急性呼吸器官综合症(SARS)等病毒感染症等疾病相关(非专利文献10和11)。

因此，也可以期待将具有降低PCSK9蛋白量的作用或抑制PCSK9蛋白功能的作用的化合物用作针对上述疾病的药物的有效成分。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2009/143633号小册子；

专利文献2：国际公开第2008/129951号小册子；

非专利文献

非专利文献1：日本临床,59卷增刊3,高脂血症(下),381-386(2001)；

非专利文献2：Nat.Genet.34,154-156(2003)；

非专利文献3：N.Engl.J.Med.354,1264-1272(2006)；

非专利文献4：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.102,5374-5379(2005)；

非专利文献5：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.106,9820-9825(2009)；

非专利文献6：J.Lipidres.48,763-767(2007)；

非专利文献7：Proc.Natl.Acad.Sci.USA.105,11915-11920(2008)；

非专利文献8：Atherosclerosis,201(2),266-73(2008)；

非专利文献9：Mol.Carcinogen.,44(3),151-161(2005)；

非专利文献10：J.Mol.Med.,83,842-843(2005)；

非专利文献11：J.Mol.Med.,83,844-855(2005)。

发明内容

发明要解决的课题

本发明的课题是提供具有降低PCSK9蛋白量、增加LDL受体量的作用的低分子化合物、以及用该低分子化合物作为有效成分的药物。

解决课题的手段

本发明人为了解决上述课题，进行了锐意研究，结果发现：外消旋体化合物(I)及其对映异构体之一，即下式(II)所示的(R)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸(在以下的说明书中也称为“(R)体化合物(II)”)几乎没有降低PCSK9蛋白量的作用、增加LDL受体量的作用，

而下式(III)所示的、左旋性的(S)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸(在以下的说明书中也称为“(S)体化合物(III)”)、或其盐、或它们的溶剂合物具有强的降低PCSK9蛋白量、增加LDL受体量的作用，

从而完成了本发明。

即，本发明提供：(S)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸、或其盐、或它们的溶剂合物(优选实质上光学上纯的(S)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸、或其盐、或它们的溶剂合物)。

从其他观点来看，本发明提供：反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸的左旋性对映异构体、或其盐、或它们的溶剂合物(优选实质上光学上纯的反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸的左旋性对映异构体、或其盐、或它们的溶剂合物)。

本发明还提供以(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物作为有效成分的药物。

本发明还提供含有作为有效成分的(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物、以及药学上可接受的载体的药物组合物。

该药物和药物组合物通过降低血中LDL胆固醇，可以用作用于预防和/或治疗起因于高血中LDL胆固醇状态的疾病(例如高LDL血症、血脂障碍(高脂血症)、动脉硬化、动脉粥样硬化、外周血管疾病、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、心血管功能障碍、心绞痛、缺血、心肌缺血、血栓形成、心肌梗塞、缺血再灌注损伤、血管形成性再狭窄、高血压等)的药物。

本发明还提供(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物在制备用于预防和/或治疗起因于高血中LDL胆固醇状态的疾病的药物中的应用；用于预防和/或治疗起因于高血中LDL胆固醇状态的疾病的(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物。

本发明还提供以(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物作为有效成分的PCSK9mRNA表达抑制剂；以(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物作为有效成分的PCSK9蛋白量的降低剂；以(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物作为有效成分的PCSK9蛋白产生抑制剂；以及以(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物作为有效成分的LDL受体量的增加剂。

本发明还提供(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物在制备PCSK9mRNA表达抑制剂、PCSK9蛋白量的降低剂、PCSK9蛋白产生抑制剂或LDL受体量的增加剂中的应用；以及用作PCSK9mRNA表达抑制剂、PCSK9蛋白量的降低剂、PCSK9蛋白产生抑制剂或LDL受体量的增加剂的有效成分的(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物。

本发明还提供以(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物作为有效成分的、用于预防和/或治疗PCs相关疾病(癌症、肥胖、糖尿病、阿尔茨海默病或病毒感染症等)的药物。

本发明还提供(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物在制备用于预防和/或治疗PCs相关疾病的药物中的应用；以及用于预防和/或治疗PCs相关疾病的(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物。

从其他观点来看，本发明提供以外消旋体化合物(I)、专利文献2中实施例44记载的化合物(反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基硫)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸)、或它们的对映异构体、或它们的盐、或它们的溶剂合物作为有效成分的HMG-CoA还原酶mRNA表达抑制剂；以外消旋体化合物(I)、专利文献2中实施例44记载的化合物、或它们的对映异构体、或它们的盐、或它们的溶剂合物作为有效成分的HMG-CoA还原酶产生抑制剂；以及以外消旋体化合物(I)、专利文献2中实施例44记载的化合物、或它们的对映异构体、或它们的盐、或它们的溶剂合物作为有效成分的、用于预防和/或治疗起因于HMG-CoA还原酶mRNA表达的疾病(例如炎症、癌症、阿尔茨海默病、骨质疏松症、前列腺肥大、肾小球疾病、寄生虫感染、病毒感染、牛皮癣、黄斑变性等)的药物。

本发明还提供外消旋体化合物(I)、专利文献2中实施例44记载的化合物、或它们的对映异构体、或它们的盐、或它们的溶剂合物在制备HMG-CoA还原酶mRNA表达抑制剂、HMG-CoA还原酶产生抑制剂、或用于预防和/或治疗起因于HMG-CoA还原酶mRNA表达的疾病的药物中的应用；以及用作HMG-CoA还原酶mRNA表达抑制剂、HMG-CoA还原酶产生抑制剂、或用于预防和/或治疗起因于HMG-CoA还原酶mRNA表达的疾病的药物的有效成分的外消旋体化合物(I)、专利文献2中实施例44记载的化合物、或它们的对映异构体、或它们的盐、或它们的溶剂合物。

本发明还提供抑制包括人在内的哺乳动物体内的PCSK9mRNA表达的方法，该方法包括将有效量的(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物给予包括人在内的哺乳动物的步骤；降低包括人在内的哺乳动物体内的PCSK9蛋白量的方法，该方法包括将有效量的(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物给予包括人在内的哺乳动物的步骤；抑制包括人在内的哺乳动物体内的PCSK9蛋白产生的方法，该方法包括将有效量的(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物给予包括人在内的哺乳动物的步骤；增加包括人在内的哺乳动物体内的LDL受体量的方法，该方法包括将有效量的(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物给予包括人在内的哺乳动物的步骤；以及降低包括人在内的哺乳动物的血中LDL的方法，该方法包括将有效量的(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物给予包括人在内的哺乳动物的步骤。

本发明还提供预防和/或治疗起因于包括人在内的哺乳动物的高血中LDL胆固醇状态的疾病的方法，该方法包括将有效量的(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物给予包括人在内的哺乳动物的步骤。

本发明还提供预防和/或治疗包括人在内的哺乳动物的PCs相关疾病的方法，该方法包括将有效量的(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物给予包括人在内的哺乳动物的步骤。

本发明还提供抑制包括人在内的哺乳动物体内的HMG-CoA还原酶mRNA表达的方法，该方法包括将有效量的外消旋体化合物(I)、专利文献2中实施例44记载的化合物、或它们的对映异构体、或它们的盐、或它们的溶剂合物给予包括人在内的哺乳动物的步骤；抑制包括人在内的哺乳动物体内的HMG-CoA还原酶产生的方法，该方法包括将有效量的外消旋体化合物(I)、专利文献2中实施例44记载的化合物、或它们的对映异构体、或它们的盐、或它们的溶剂合物给予包括人在内的哺乳动物的步骤；以及预防和/或治疗起因于包括人在内的哺乳动物的HMG-CoA还原酶mRNA表达的疾病的方法，该方法包括将有效量的外消旋体化合物(I)、专利文献2中实施例44记载的化合物、或它们的对映异构体、或它们的盐、或它们的溶剂合物给予包括人在内的哺乳动物的步骤。

本发明还提供以实质上光学上纯的形态制备(S)体化合物(III)和/或(R)体化合物(II)的方法。

专利文献2中虽然记载了外消旋体化合物(I)的制备方法，但如下所述，以实质上光学上纯的形态制备(S)体化合物(III)或(R)体化合物(II)是极为困难的。

即，一般而言，已知实质上光学上纯的化合物有时可以在合成了其外消旋体后，通过用手性柱进行光学拆分来制备。

然而，使用手性柱的光学拆分法因化合物不同，有时拆分条件的设定非常困难，而且不适合工业上大规模的制备。另外，通过使用手性柱的光学拆分法来制备实质上光学上纯的(S)体化合物(III)或(R)体化合物(II)，其拆分条件的设定非常困难。即，对手性柱的种类(例如CHIRALCELOD-H、CHIRALCELOJ-H等)、用作流动相的溶剂的种类、组成(例如MeOH/TFA混合液、EtOH/TFA混合液等)、流动相的流速等条件进行了各种变更，尝试从按照专利文献2中实施例45记载的方法制备的外消旋体化合物(I)中分离各对映异构体，但几乎在所有条件下分离都不顺利。其中，发现在后述实施例1-1记载的条件下，各对映异构体的分离是可能的，但还发现在该条件下产生分解物(乙酯化合物)。

另外，专利文献2中公开了外消旋体化合物(I)可以用下述方法制备：按照下述流程1所示方法，在碱存在下使中间体化合物(a)与外消旋体的苄基溴化合物(b)偶联，将获得的化合物(c)的酯基水解成为化合物(d)，最后氧化硫原子。

流程1：

本发明人尝试参考流程1，用光学活性的1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1-甲磺酰基氧基乙烷代替外消旋体的苄基溴化合物(b)来获得实质上光学上纯的(S)体化合物(III)或(R)体化合物(II)，发现1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1-甲磺酰基氧基乙烷的消去反应优先，无法获得目标化合物。

还使用具有甲苯磺酰基、氯甲磺酰基或2,4,6-三异丙基苯磺酰基等离去基团代替甲磺酰基的光学活性苄基化剂进行了研究，发现与1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1-甲磺酰基氧基乙烷的情况同样，无法获得实质上光学上纯的(S)体化合物(III)或(R)体化合物(II)。

目前为止，使用苄基溴化合物(b)时，已实现了[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1-乙基向中间体化合物(a)的氮原子引入。因此，认为可以通过使用光学活性的苄基溴化合物代替外消旋体的苄基溴化合物(b)来获得实质上光学上纯的(S)体化合物(III)或(R)体化合物(II)。

然而，众所周知，在溴化物离子脱去的亲核取代反应中，反应产生的溴化物离子在反应体系中与苄基溴反应而进行外消旋化。还有，通常认为苄基位的亲核取代反应因苄基阳离子的稳定化也竞争性地出现SN1型的取代反应，因此发生部分外消旋化。

此处，对于因部分外消旋化而光学纯度降低的结果获得的、具有中等程度光学纯度的化合物(本说明书中，“具有中等程度的光学纯度的化合物”是指10%ee左右以上但不足90%ee，优选20～80%ee左右，特别优选40～70%ee左右的光学纯度，具有中等程度的光学纯度的化合物在下文也称为“半手性体”。而且，对于该半手性体，下述的部分结构中，＊表示的不对称碳原子为S配置的化合物以比R配置的化合物大的量存在时，特别称为“(S)体占优的半手性体”。另一方面，对于该半手性体，＊表示的不对称碳原子为R配置的化合物以比S配置的化合物大的量存在时，特别称为“(R)体占优的半手性体”)，

已知其光学纯度可以通过仅使一种对映异构体优先晶析得到提高。

然而，根据本发明人的研究，外消旋体化合物(I)及其乙酯衍生物不出现结晶化，无法通过优先晶析法来提高光学纯度。

在这种状况下，本发明人在将外消旋体化合物(I)的羧酸变换为苄酯时，发现获得的苄酯化合物能够作为以外消旋体为主成分的结晶分离。

如下面的流程2所示，通过制备芳基烷基或杂芳基烷基酯化合物的半手性体(IV)，使外消旋体为占优成分的低光学纯度的结晶(在下面的说明书中有时称为“外消旋体占优的结晶”)晶析后除去，获得高光学纯度的芳基烷基或杂芳基烷基酯化合物(V)或(V')，将其作为原料，成功地以实质上光学上纯的形态制备出了外消旋体化合物(I)的希望的对映异构体((S)体化合物(III)和(R)体化合物(II))。

流程2：

(该流程图中，R表示可以具有取代基的C_6-10芳基或可以具有取代基的5～10元杂芳基，n表示1～6的整数)。

即，本发明提供实质上光学上纯的(S)体化合物(III)或实质上光学上纯的(R)体化合物(II)、或它们的盐、或它们的溶剂合物的制备方法，该方法包括如下步骤：

通过在溶剂中优先晶析(preferentialcrystallization)，从下述通式(IV)所示化合物的半手性体中除去外消旋体占优的结晶，来获得下述通式(V)或(V')所示的实质上光学上纯的化合物，

(式(IV)中，R表示可以具有取代基的C_6-10芳基或可以具有取代基的5～10元杂芳基，n表示1～6的整数)，

(式(V)或(V')中，R和n与通式(IV)中同义)。

上述方法中，在通式(IV)所示化合物为(S)体占优的半手性体时，可以制备(S)体化合物(III)，在通式(IV)所示化合物为(R)体占优的半手性体时，可以制备(R)体化合物(II)。

本发明还提供上述的方法，其进一步包括如下步骤：

从通式(V)或(V')所示化合物中除去-(CH₂)_n-R所示基团。

本发明还提供(A)上述的方法，其进一步包括如下步骤：

在溶剂中使下述通式(VI)所示化合物的半手性体与氧化剂反应，来制备通式(IV)所示化合物的半手性体，

(式(VI)中，R和n与通式(IV)中同义)；

提供(B)上述的方法(A)，其进一步包括如下步骤：

在溶剂中、在催化剂的存在下，使下式(VII)所示化合物的半手性体与下述通式(VIII)所示化合物反应，来制备通式(VI)所示化合物的半手性体，

，

(式(VIII)中，R和n与通式(IV)中同义)；

提供(C)上述的方法(B)，其进一步包括如下步骤：

在溶剂中、在碱的存在下使下述通式(IX)所示化合物的半手性体水解，来制备式(VII)所示化合物的半手性体，

(式(IX)中，R¹表示C_1-6烷基)；

提供(D)上述的方法(C)，其进一步包括如下步骤：

在溶剂中、在碱的存在下使下述通式(X)或(X')所示化合物与下述通式(XI)所示化合物反应，来制备通式(IX)所示化合物的半手性体，

(式(X)或(X')中，X表示卤原子)，

(式(XI)中，R¹与通式(IX)中同义)。

本发明还提供上述的方法(D)，其进一步包括如下步骤：

在卤化剂的存在下卤化光学活性1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇，来制备通式(X)或(X')所示化合物。

从其他观点来看，本发明提供上述通式(IV)所示化合物、或其盐、或它们的溶剂合物。该发明的优选方案是R为苯基、n为1的化合物、或其盐、或它们的溶剂合物。

本发明还提供上述通式(V)或(V')所示的实质上光学上纯的化合物、或其盐、或它们的溶剂合物。该发明的优选方案是R为苯基、n为1的化合物、或其盐、或它们的溶剂合物。

发明效果

(S)体化合物(III)具有优异的降低PCSK9蛋白量的作用、增加LDL受体量的作用，还显示优异的降低血中LDL胆固醇的作用，因此作为例如用于降低血中LDL胆固醇的药物的有效成分等是有用的。

而且，(S)体化合物(III)作为用于预防和/或治疗PCs相关疾病，更具体来说为癌症、肥胖、糖尿病、阿尔茨海默病或病毒感染症的药物的有效成分也是有用的。

并且，本发明的制备方法可以以实质上光学上纯的形态简便地制备外消旋体化合物(I)的希望的对映异构体((S)体化合物(III)和(R)体化合物(II))，适合用作制备例如作为药物的有效成分等有用的、实质上光学上纯的(S)体化合物(III)的方法。

具体实施方式

本说明书中，“实质上光学上纯的”是指化合物的光学纯度为90%ee以上，优选95～100%ee，特别优选97～100%ee。

因此，例如“实质上光学上纯的(S)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸”、“实质上光学上纯的反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸的左旋性对映异构体”和“实质上光学上纯的(S)体化合物(III)”是指光学纯度为90%ee以上、优选95～100%ee、特别优选97～100%ee的(S)体化合物(III)。

本发明中，作为(S)体化合物(III)的光学纯度，从获得良好的降低PCSK9蛋白量的作用和/或增加LDL受体量的作用的观点来看，在下述实施例1-1所示手性HPLC分析条件下，为98%ee以上是优选的，为99%ee以上是特别优选的。如果为所述的光学纯度，则实质上不含另一种对映异构体((R)体化合物(II))。

本说明书中，“C_1-6烷基”表示直链状或支链状的碳数1～6的烷基，例如有甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基等。

本说明书中，“可以具有取代基的C_6-10芳基”的“C_6-10芳基”部分是指碳数6～10的芳族烃基，例如有苯基、萘基、薁基等。

本说明书中，“可以具有取代基的5～10元杂芳基”的“5～10元杂芳基”部分是指含有1～4个选自氧原子、硫原子和氮原子的杂原子作为成环原子的5～10元单环式、多环式、或稠环式的芳族杂环基，例如有呋喃基、噻吩基、吡咯基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、咪唑基、吡唑基、噁二唑基、噻二唑基、三唑基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、苯并异噻唑基、苯并噁二唑基、苯并噻二唑基、苯并三唑基、喹啉基、异喹啉基、噌啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、酞嗪基、萘啶基、嘌呤基、蝶啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、吡咯并吡啶基、噁唑并吡啶基、噻唑并吡啶基、咪唑并吡啶基等。

本说明书中，“可以具有取代基的C_6-10芳基”、“可以具有取代基的5～10元杂芳基”的取代基例如有卤原子、羧基、氨基甲酰基、磺酰基、氨磺酰基、硝基等。取代基的数目为1至可取代的最大数，通常可以具有1～5个的取代基。卤原子可以使用氟原子、氯原子、溴原子或碘原子的任一种。

通式中，R中的可以具有取代基的C_6-10芳基优选苯基。

通式中，n表示的整数优选1。

通式中，R¹中的C_1-6烷基优选C_1-4烷基，更优选乙基。

通式中，X表示的卤原子优选氯原子或溴原子，更优选溴原子。

本发明中，各化合物(例如(S)体化合物(III)、通式(IV)所示化合物、通式(V)所示化合物、通式(V')所示化合物等)的盐例如有酸加成盐或碱加成盐等，只要是作为药物可接受的盐，就没有特别限制。具体来说，例如为酸加成盐时，有盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等与无机酸的酸加成盐；苯甲酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐等与有机酸的酸加成盐。为碱加成盐时，有钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、镁盐等与金属的碱加成盐；氨、三甲基胺、三乙基胺、吡啶、三甲基吡啶、二甲基吡啶等胺盐；与赖氨酸、精氨酸等有机碱的碱加成盐等。

本发明中，作为形成各化合物(例如(S)体化合物(III)、通式(IV)所示化合物、通式(V)所示化合物、通式(V')所示化合物等)或其盐的溶剂合物的溶剂，除水之外还有生理学上可接受的有机溶剂，例如乙醇、己烷、乙酸乙酯等，但不限于这些。本发明的药物的有效成分例如有水和物等，但不限于此。

本发明的实质上光学上纯的(S)体化合物(III)的制备方法的一个例子示于下述的流程3，本发明的实质上光学上纯的(R)体化合物(II)的制备方法的一个例子示于下述的流程4(下述流程图中，R、R¹、X和n与上述同义)。

流程3：

流程4：

<步骤A>

本步骤是在碱存在下、使胺(XI)与光学活性的苄基卤(X)或(X')反应，来制备半手性体(IX)的步骤。相对于化合物(XI)，化合物(X)或(X')的量按1.0～3.0摩尔当量、优选1.5～2.5摩尔当量使用即可。

需要说明的是，胺(XI)是公知的化合物，其制备方法例如记载于专利文献2中。

本反应可以在溶剂中、在碱的存在下进行。溶剂没有特别限制，例如可以单独或组合使用N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二甲基亚砜、二噁烷、四氢呋喃、乙腈、丙腈等。溶剂优选例如四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺及它们的混合溶剂。溶剂的量没有特别限定，相对于化合物(XI)，按2～20倍量(V/W)、优选5～12倍量(V/W)、更优选7～10倍量(V/W)使用即可。

对碱没有特别限制，例如可以使用氢化锂、氢化钠、氢化钾等氢化碱金属类；金属锂、金属钠、金属钾等碱金属类；氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等氢氧化碱金属类；碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯等碳酸碱金属类；二异丙基氨基锂、二异丙基氨基钠、二异丙基氨基钾、六甲基二硅基叠氮基锂(lithiumhexamethyldisilazide)、六甲基二硅基叠氮基钠、六甲基二硅基叠氮基钾等氨基碱金属类；叔丁醇钠、叔丁醇钾等烷氧基碱金属类；正丁基锂、仲丁基锂、叔丁基锂等有机锂类。碱优选例如氢化碱金属类，更优选氢化钠。相对于化合物(XI)，碱的量按1.0～5.0摩尔当量、优选2.0～4.0摩尔当量使用即可。

反应温度通常在-80～100℃的范围内进行即可，优选-30～50℃，更优选-20～5℃。反应时间通常为5分钟～48小时，优选30分钟～24小时，更优选3～8小时。本反应中优选使用实质上光学上纯的苄基卤(X)或(X')。通过该反应，进行部分外消旋化，获得半手性体(IX)。该半手性体(IX)可以直接用于下一步骤。在步骤B～D中光学纯度实质上得到维持，获得具有与半手性体(IX)相同程度的光学纯度的半手性体(IV)。需要说明的是，根据本发明人的研究，本步骤中即使使用R¹为苄基的胺(XI)与光学活性苄基卤(X)或(X')进行反应，也无法以良好的收率获得作为目标产物的半手性体(IX)，通过用C_1-6烷基作为R¹，则可以以良好的收率获得希望的半手性体(IX)。

<步骤B>

本步骤是将半手性体(IX)水解来制备半手性体(VII)的步骤。

本反应可以在溶剂中、在碱的存在下进行。溶剂没有特别限制，例如可以单独或组合使用甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、叔丁醇等醇类或乙腈、四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二噁烷和水等。溶剂优选例如醇类与水的组合，更优选乙醇与水的组合。溶剂的量没有特别限制，相对于化合物(IX)，按10～100倍量(V/W)、优选20～50倍量(V/W)、更优选30～40倍量(V/W)使用即可。

碱没有特别限制，例如可以使用氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等氢氧化碱金属类；碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯等碳酸碱金属类；氢氧化四甲基铵、氢氧化四乙基铵、氢氧化四丙基铵、氢氧化四丁基铵、氢氧化苄基三甲基铵(TritonB)等氢氧化叔铵等。碱优选例如氢氧化碱金属类，更优选氢氧化钠。相对于化合物(IX)，碱的量按优选1.0～5.0摩尔当量、更优选2.0～3.0摩尔当量使用即可。

反应温度通常在0～100℃的范围内进行即可，优选30～80℃、更优选40～60℃。反应时间通常优选5分钟～48小时、更优选30分钟～12小时、特别优选2～5小时。

<步骤C>

本步骤是将半手性体(VII)与醇(VIII)缩合来制备半手性体(VI)的步骤。相对于化合物(VII)，醇(VIII)的量按0.8～2.0摩尔当量、优选1.0～1.2摩尔当量使用即可。

本反应可以在溶剂中、在碱的存在或不存在下、使用缩合剂进行。也可以在缩合促进剂的存在下进行反应。溶剂没有特别限制，例如可以使用1,2-二氯乙烷、氯仿、二氯甲烷等卤化烃类；乙酸乙酯、乙酸异丙酯等乙酸酯类；甲苯、苯等芳族烃类；四氢呋喃、二噁烷、乙腈、丙腈等。溶剂优选例如卤化烃类，更优选二氯乙烷。溶剂的量没有特别限制，相对于化合物(VII)，按5～100倍量(V/W)、优选10～20倍量(V/W)使用即可。

碱没有特别限制，例如可以使用吡啶、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)、三甲基吡啶、二甲基吡啶、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(DBN)、1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(DABCO)、三乙基胺、二异丙基乙基胺、二异丙基戊基胺、三甲基胺等有机碱类；氢化锂、氢化钠、氢化钾等氢化碱金属类；氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等氢氧化碱金属类；碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯等碳酸碱金属类；碳酸氢钠、碳酸氢钾等碱金属碳酸氢盐等。

缩合促进剂没有特别限制，可以使用DMAP、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HODhbt)、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二羧基酰亚胺(HONB)、五氟苯酚(HOPfp)、N-羟基邻苯二甲酰亚胺(HOPht)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)。缩合促进剂优选DMAP。相对于化合物(VII)，缩合促进剂的量按0.001～1.0摩尔当量、优选0.05～0.5摩尔当量使用即可。

缩合剂没有特别限制，可以使用二环己基碳二酰亚胺(DCC)、二异丙基碳二酰亚胺(DIPCI)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基-碳二酰亚胺(通称水溶性碳二酰亚胺：WSCI)、WSC·HCl等。缩合剂优选WSC·HCl。相对于化合物(VII)，缩合剂的量按1.0～3.0摩尔当量、优选1.0～1.2摩尔当量使用即可。

反应温度通常在0～100℃的范围内进行即可，优选0～80℃、更优选10～30℃。反应时间通常优选5分钟～48小时，更优选30分钟～24小时、特别优选8～16小时。

<步骤D>

本步骤是通过氧化半手性体(VI)的硫原子来制备半手性体(IV)的步骤。

氧化方法可以适用将硫原子变换为磺酰基的通常方法。氧化剂例如可以使用：用在使用催化剂量的钨酸钠、二氯化二氧化钼或五氯化钽的氧化反应中的过氧化氢水溶液、或者过硼酸钠、Oxone(注册商标)、过碘酸钠、过碘酸钾、间氯过苯甲酸(mCPBA)、氯铬酸吡啶鎓(PCC)、重铬酸吡啶鎓(PDC)、N-氯琥珀酰亚胺(NCS)、N-溴琥珀酰亚胺(NBS)、N-碘琥珀酰亚胺(NIS)、碘、溴等。氧化剂优选五氯化钽与过氧化氢水溶液的组合。相对于化合物(VI)，五氯化钽的量按0.001～1.0摩尔当量、优选0.05～0.5摩尔当量使用即可。相对于化合物(VI)，过氧化氢水溶液的量按1.0～10摩尔当量、优选4.0～6.0摩尔当量使用即可。

溶剂没有特别限制，例如有水、甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇等醇类、乙腈、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、1,2-二氯乙烷、四氯化碳、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸等。溶剂优选例如醇类，更优选2-丙醇。溶剂的量没有特别限制，相对于化合物(VI)，按5～100倍量(V/W)、优选10～30倍量(V/W)使用即可。

反应温度通常在0～100℃的范围内进行即可，优选10～60℃、更优选10～30℃。反应时间通常优选5分钟～48小时，更优选30分钟～24小时、特别优选8～16小时。

<步骤E>

本步骤是通过从半手性体(IV)中优先晶析外消旋体占优的低光学纯度的结晶来制备高光学纯度的光学活性体(V)或(V')的步骤。

本步骤是通过在含有半手性体(IV)的溶剂中、使外消旋体占优的结晶发生结晶析出后，除去获得的外消旋体占优的结晶，使高光学纯度的化合物(V)或(V')残留在母液中的步骤。

溶剂有甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等醇类，优选直链状或支链状的碳数1～6的醇，特别优选乙醇、异丙醇。相对于化合物(IV)，溶剂的量为2～20倍量(V/W)，优选4～10倍量(V/W)、更优选5～8倍量(V/W)。

结晶化是将半手性体(IV)溶解于溶剂中，在10～40℃、优选15～20℃下搅拌30分钟～2天、优选15～24小时即可，若要提高结晶的收率，接下来可以将温度冷却至-10～10℃、优选-5～5℃，搅拌30分钟～24小时、优选2～5小时。外消旋体占优的结晶可以是完全的外消旋体结晶，一般来说是含60～100%左右外消旋体成分的低光学纯度(0～40%ee左右)的结晶。

本步骤也可以在另外制备的外消旋体的种晶的存在下进行。此处使用的外消旋体的种晶是上述通式(IV)所示化合物的外消旋体的结晶，例如有反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯的外消旋体的结晶。

本步骤E中获得的外消旋体占优的结晶可以直接用作外消旋体的种晶，也可以另外制备上述通式(IV)所示化合物的外消旋体，进行结晶化，将获得的结晶用作外消旋体的种晶。上述通式(IV)所示化合物的外消旋体例如可以用下示的方法制备。

本反应是将外消旋体化合物(I)与醇(VIII)缩合来制备外消旋体(IV)的反应。相对于外消旋体化合物(I)，醇(VIII)的量按0.8～2.0摩尔当量、优选1.0～1.2摩尔当量使用即可。

本反应可以在溶剂中、在碱的存在或不存在下、使用缩合剂来进行。也可以在缩合促进剂的存在下进行反应。溶剂没有特别限制，例如可以使用1,2-二氯乙烷、氯仿、二氯甲烷等卤化烃类；乙酸乙酯、乙酸异丙酯等乙酸酯类；甲苯、苯等芳族烃类；四氢呋喃、二噁烷、乙腈、丙腈等。溶剂优选例如卤化烃类，更优选二氯甲烷。溶剂的量没有特别限制，相对于外消旋体化合物(I)，按5～100倍量(V/W)、优选10～20倍量(V/W)使用即可。

缩合促进剂没有特别限制，可以使用DMAP、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HODhbt)、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二羧基酰亚胺(HONB)、五氟苯酚(HOPfp)、N-羟基邻苯二甲酰亚胺(HOPht)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)等。缩合促进剂优选DMAP。相对于外消旋体化合物(I)，缩合促进剂的量按0.001～1.0摩尔当量、优选0.05～0.5摩尔当量使用即可。

缩合剂没有特别限制，可以使用二环己基碳二酰亚胺(DCC)、二异丙基碳二酰亚胺(DIPCI)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基-碳二酰亚胺(通称水溶性碳二酰亚胺：WSCI)、WSC·HCl等。缩合剂优选WSC·HCl。相对于外消旋体化合物(I)，缩合剂的量按1.0～3.0摩尔当量、优选1.0～1.2摩尔当量使用即可。

通式(IV)所示化合物的外消旋体的结晶化(外消旋体的种晶的制备)可以在与从半手性体(IV)中优先晶析外消旋占优的结晶同样的条件下进行。

即，将外消旋体(IV)溶解于溶剂中，在10～40℃、优选15～20℃下搅拌30分钟～2天、优选15～24小时即可，若要提高结晶的收率，可以进一步将温度冷却至-10～10℃、优选-5～5℃，搅拌30分钟～24小时、优选2～5小时。溶剂有甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇等醇类，优选直链状或支链状的碳数1～6的醇，特别优选乙醇、异丙醇。相对于外消旋体(IV)，溶剂的量为2～20倍量(V/W)，优选4～10倍量(V/W)、更优选5～8倍量(V/W)。

<步骤F>

本步骤是通过将高光学纯度的化合物(V)或(V')脱保护来制备实质上光学上纯的(S)体化合物(III)或(R)体化合物(II)的步骤。

本反应可以通过在溶剂中使用金属催化剂和氢源的催化还原、或者在溶剂中使用碱的水解反应来进行。通过催化还原进行脱保护时，溶剂可以使用甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇等醇类；二乙基醚、四氢呋喃、二噁烷等醚类；乙酸乙酯、乙酸异丙酯等乙酸酯类；乙酸；水等。溶剂优选醇类，更优选乙醇。相对于化合物(V)或(V')，溶剂的量按5～30倍量(V/W)、优选5～15倍量(V/W)使用即可。

氢源例如可以使用氢、环己二烯、甲酸、甲酸铵等。氢源优选氢。金属催化剂例如可以使用钯碳、钯黑、阮内镍、二氧化铂、铂黑等。金属催化剂优选钯碳。相对于化合物(V)或(V')，钯碳的量作为10%Pd-C(湿)的量按0.001～0.5倍量(W/W)、优选0.05～0.2倍量(W/W)使用即可。

催化还原通常在0～100℃的范围内进行即可，优选10～60℃、更优选10～30℃。反应时间通常优选5分钟～24小时，更优选30分钟～16小时、特别优选1～6小时。

通过水解反应进行脱保护时，溶剂没有特别限制，例如可以单独或组合使用甲醇、乙醇、丙醇、2-丙醇、叔丁醇等醇类或乙腈、丙腈、四氢呋喃、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二噁烷和水等。碱没有特别限制，例如可以使用氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾等氢氧化碱金属类；碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铯等碳酸碱金属类；氢氧化四甲基铵、氢氧化四乙基铵、氢氧化四丙基铵、氢氧化四丁基铵、氢氧化苄基三甲基铵(TritonB)等氢氧化叔铵等。

需要说明的是，光学活性的苄基卤(X)或(X')例如可以用下示的方法合成。

本反应是在卤化剂的存在下卤化光学活性的1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇(XII)或(XII')，在几乎不降低光学纯度的情况下高效地制备光学活性的1-卤-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷(X)或(X')的步骤。

本反应中使用的卤化剂有：亚硫酰氯、三氯化磷、五氯化磷、氧氯化磷等氯化剂；三溴化磷、三溴化磷与溴化氢(30%乙酸溶液)、三溴化磷和吡啶、N-溴琥珀酰亚胺和二甲硫、N-溴琥珀酰亚胺和三苯基膦、1,2-二溴-1,1,2,2-四氯乙烷和三苯基膦、溴化二甲基溴化锍、三溴吡啶鎓和六甲基乙硅烷、溴和三苯基膦、溴和三丁基膦、溴和二甲硫、溴化锌和三苯基膦以及偶氮二羧酸二甲酯、溴化锂和三甲基氯硅烷、溴化锂和三氟乙酸酐、三甲基溴硅烷、四溴化碳和三苯基膦、亚硫酰溴等溴化剂；碘化氢、碘化钾和磷酸等碘化剂。卤化剂为溴化剂时，优选三溴化磷和溴化氢(30%乙酸溶液)，1,2-二溴-1,1,2,2-四氯乙烷和三苯基膦、N-溴琥珀酰亚胺和二甲硫。

下面，对使用三溴化磷和溴化氢作为卤化剂、和使用1,2-二溴-1,1,2,2-四氯乙烷和三苯基膦作为卤化剂的情况特别进行具体说明。

<使用三溴化磷和溴化氢(30%乙酸溶液)作为卤化剂时>

使用三溴化磷和溴化氢(30%乙酸溶液)作为卤化剂时，相对于苯基乙醇(XII)或(XII')，以0.3～2.0摩尔当量使用三溴化磷，也可以优选使用0.4～0.6摩尔当量。相对于苯基乙醇(XII)或(XII')，以0.7～3.0摩尔当量使用溴化氢，也可以优选使用0.8～1.2摩尔当量。

本反应可以在溶剂的存在或不存在下进行。在溶剂的存在下进行反应时，只要使用的溶剂不参与反应，就没有特别限制，例如有苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、氯苯、1,2-二氯苯、硝基苯等芳族烃类；正戊烷、正己烷、环己烷、正庚烷、正辛烷、正癸烷等脂族烃类；二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿和四氯化碳等卤化烃类等，其中，优选苯、甲苯、二甲苯、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、正戊烷、正己烷、正庚烷，特别是更优选甲苯、二氯甲烷、正庚烷。另外，这些溶剂也可以单独或组合使用，对溶剂的使用量没有特别限制。

反应温度通常在-50～150℃的范围内进行即可，更优选-20～80℃、特别优选0～15℃。反应时间通常优选5分钟～48小时，更优选30分钟～36小时、特别优选12～24小时。

<使用1,2-二溴-1,1,2,2-四氯乙烷和三苯基膦作为卤化剂时>

使用1,2-二溴-1,1,2,2-四氯乙烷和三苯基膦作为卤化剂时，相对于苯基乙醇(XII)或(XII')，以1.0～3.0摩尔当量使用1,2-二溴-1,1,2,2-四氯乙烷，也可以优选使用1.0～1.2摩尔当量。相对于苯基乙醇(XII)或(XII')，以1.0～3.0摩尔当量使用三苯基膦，也可以优选使用1.0～1.2摩尔当量。

本反应可以在溶剂的存在下进行。只要使用的溶剂不参与反应，就没有特别限制，例如有苯、甲苯、二甲苯、均三甲苯、氯苯、1,2-二氯苯、硝基苯等芳族烃类；正戊烷、正己烷、环己烷、正庚烷、正辛烷、正癸烷等脂族烃类；二氯甲烷、1,2-二氯乙烷、氯仿和四氯化碳等卤化烃类等。溶剂优选芳族烃类或卤化烃类，更优选苯、甲苯、二甲苯、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷，特别优选甲苯、二氯甲烷、1,2-二氯乙烷。另外，这些溶剂也可以单独或组合使用。溶剂的使用量没有特别限制，相对于苯基乙醇(XII)或(XII')，以1～10倍量(V/W)、优选2～4倍量(V/W)使用即可。

反应温度通常在-50～150℃的范围内进行即可，更优选-20～80℃、特别优选0～30℃。反应时间通常优选5分钟～48小时，更优选30分钟～36小时、特别优选1～2小时。

如下述实施例中具体显示的那样，(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物具有抑制PCSK9mRNA表达的作用，还具有降低PCSK9蛋白量的作用和增加LDL受体量的作用，具有降低活体内血中LDL胆固醇的作用。

虽然本发明不受下述推断(estimation)的限制，但是认为(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物通过抑制PCSK9蛋白的产生，抑制LDL受体的分解，增加了LDL受体的量，结果促进了LDL受体对血中LDL的摄取。推断该LDL受体对血中LDL的摄取的促进成为发挥降低血中LDL胆固醇值的作用的一个要因。

因此，含有(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物作为有效成分的药物或药物组合物可以用作用于预防和/或治疗高LDL血症、以及血脂障碍(高脂血症)、动脉硬化、动脉粥样硬化、外周血管疾病、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、心血管功能障碍、心绞痛、缺血、心肌缺血、血栓形成、心肌梗塞、缺血再灌注损伤、血管形成性再狭窄、或高血压等疾病的药物。

已知PCSK9所属的前蛋白转化酶(PCs)是与癌症、肥胖、糖尿病、阿尔茨海默病、或病毒感染症的发病、进展和恶化等有关的酶，因此也可以期待将含有(S)体化合物(III)、或其盐、或它们的溶剂合物作为有效成分的药物或药物组合物用作用于预防和/或治疗上述与PCs有关的疾病的药物。

另一方面，如下述实施例具体显示的那样，外消旋体化合物(I)、和专利文献2中实施例44记载的化合物(反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基硫)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸)具有抑制HMG-CoA还原酶mRNA表达的作用。因此，也可以期待将外消旋体化合物(I)、专利文献2中实施例44记载的化合物或它们的对映异构体、或它们的盐、或它们的溶剂合物用作用于预防和/或治疗起因于HMG-CoA还原酶mRNA表达的疾病(例如伴随进行RaS、Rho、RaC等各种蛋白质的翻译后脂质修饰而产生类异戊二烯(法尼基焦磷酸、香叶基香叶基焦磷酸等)的疾病，具体例如有炎症、癌症、阿尔茨海默病、骨质疏松症、前列腺肥大、肾小球疾病、寄生虫感染、病毒感染、牛皮癣、黄斑变性等)的药物。

作为本发明的药物，可以给予上述有效成分本身，但优选作为可通过本领域人员众所周知的方法制备的、经口或非经口的药物组合物给予。适合经口给予的药用组合物例如有锭剂、胶囊剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、液体剂、和糖浆剂等，适合非经口给予的药物组合物例如有静脉内注射剂、肌内注射剂等注射剂、滴剂、栓剂、吸入剂、滴眼剂、滴鼻剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂等，但不限于这些。

上述药物组合物可以添加药理学、制剂学上可接受的添加物后制备。药理学、制剂学上可接受的添加物的例子例如有赋形剂、粘合剂、填充剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、防腐剂、矫味剂、香料、包衣剂、稀释剂等，但不限于这些。

本发明的药物的给予量没有特别限定，可以根据疾病的种类、预防或治疗的目的、有效成分的种类等适当选择，还可以根据患者的体重、年龄、症状、给予途径等通常要考虑的各种因素，进行适当增减。例如，经口给予时，作为成人每一日有效成分的重量，可以在0.1~500mg左右的范围内使用，给予量可以由本领域人员适当选择，不限于上述的范围。

实施例

下面，举出实施例来进一步说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。需要说明的是，下述实施例中使用的缩写表示下述含义。

s：单峰(singlet)；

d：双峰(doublet)；

t：三重峰(triplet)；

q：四重峰(quartet)；

m：多重峰(muLtiplet)；

br：宽峰(broad)；

J：偶合常数(couplingconstant)；

Hz：赫兹(Hertz)；

CDCl₃：氘代氯仿；

¹H-NMR：质子核磁共振；

IR：红外吸收光谱。

实施例1：实质上光学上纯的(S)体化合物(III)的制备方法的确定

实施例1-1：使用手性柱的光学拆分

很明显，如果为下述条件，则能够从按照专利文献2(国际公开第2008/129951号小册子)中实施例45记载的方法制备的外消旋体化合物(I)中分离各种对映异构体，可以用于通过手性HPLC分析法测定(S)体化合物(III)和(R)体化合物(II)的光学纯度。需要说明的是，本发明提供使用下述手性HPLC分析条件(特别是下述柱与下述流动相的组合)测定外消旋体化合物(I)、(S)体化合物(III)或(R)体化合物(II)、或它们的盐、或它们的溶剂合物的光学纯度的方法。

柱：CHIRALCELOD-H；

流动相：己烷/乙醇/TFA＝90/10/0.1；

流速：1.0mL/分钟；

柱温：40℃；

检测波长：242nm；

保留时间：第一个峰/21.3分钟((R)体)、第二个峰/23.7分钟((S)体)。

然而，已经发现由于上述条件下流动相的溶剂中含有EtOH和TFA，它们与外消旋体化合物(I)和/或各对映异构体的羧酸反应，产生分解物(乙酯化合物)。

因此，虽然上述条件下的使用手性柱的光学拆分法可以用于测定光学纯度(手性HPLC分析)，但不适合作为实质上光学上纯的各对映异构体的制备方法，特别是在大规模下制备。

实施例1-2：通过优先晶析法制备实质上光学上纯的(S)体化合物(III)

本发明人实施的、使用优先晶析法的实质上光学上纯的(S)体化合物(III)的制备方法的概要如下示为流程5。

需要说明的是，各化合物的绝对构型由步骤1确认的(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷的绝对构型判断。

步骤6获得的(S)体化合物(III)((S)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸)的光学纯度通过上述1-1中记载的条件下的手性HPLC分析确定。

步骤1中获得的1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷、步骤4和5中获得的反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯的光学纯度均可通过下述条件下的手性HPLC分析确定。需要说明的是，本发明提供使用下述手性HPLC分析条件(特别是下述柱与下述流动相的组合)来测定各化合物、或它们的盐、或它们的溶剂合物的光学纯度的方法。

1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷的手性HPLC分析条件

柱：CHIRALPAKAS-RH；

流动相：乙醇/水＝60/40；

流速：0.5mL/分钟；

柱温：25℃；

检测波长：220nm；

保留时间：第一个峰/21.8分钟((R)体)、第二个峰/26.0分钟((S)体)。

反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯的手性HPLC分析条件

柱：CHIRALCELOD-H；

流动相：己烷/乙醇＝80/20；

流速：1.0mL/分钟；

柱温：40℃；

检测波长：242nm；

保留时间：第一个峰/11.3分钟((R)体)、第二个峰/13.0分钟((S)体)。

流程5：

(流程图中，Et表示乙基，Bn表示苄基)。

步骤1：(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷的制备

(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷通过下述1-(a)的方法制备，其绝对构型如下确认。即，将获得的(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷导入(S)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基胺中，之后通过与市售的绝对构型已知的(S)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基胺的标准品比较比旋光度的实测值的符号来确认。

(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷也可以另外通过下述1-(b)的方法制备。

1-(a)：(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷的制备之1

在氩气氛下，将1,2-二溴-1,1,2,2-四氯乙烷(7.57g、23.2mmoL)溶解于甲苯(12.5mL)中，在0℃下加入三苯基膦(6.1g、23.2mmoL)搅拌30分钟。在0℃用10分钟以上向其中滴加(S)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇(1)(5.0g、19.4mmoL、>99.5%ee)的甲苯溶液(12.5mL)，之后升至室温，在相同温度下搅拌1小时。向反应液中加入正己烷(25mL)，用Celite过滤。将滤液用水、饱和苏打水(饱和碳酸氢钠溶液)、饱和盐水依次洗涤，用硫酸钠干燥，之后减压蒸馏。通过将获得的残渣减压蒸馏(56oC、0.7mmHg)，获得5.52g为无色油状物的(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷(2)(收率：88.6%)。

手性HPLC分析：光学纯度>99.5%ee(主峰：第一个峰)、转化率≥99%

[α]_D ²⁵＋59.1(c＝1.03，CHCl₃)

¹H-NMR(CDCl₃)δ:2.08(3H，d，J＝7.1Hz)，5.21(1H，q，J＝7.1Hz)，7.81(1H，s)，7.87(2H，s)。

(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷的绝对构型的确认

向上述1-(a)中获得的(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷(2)(106mg、0.336mmoL、99%ee)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(1mL)中加入叠氮化钠(64.4mg、0.990mmoL)，在-18～-15℃下搅拌4小时。用乙酸乙酯/正己烷(1：1)和水萃取反应溶液，用饱和盐水洗涤有机层，用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，由此获得111.5mg的1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基叠氮化物(粗生成物：111.5mg)。

¹H-NMR(CDCl₃)δ：1.61(3H，d，J＝6.8Hz)，4.79(1H，q，J＝6.8Hz)，7.78(2H，s)，7.84(1H，s)。

将获得的1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基叠氮化物(粗生成物：111.5mg)溶解于甲醇(6mL)中，加入钯-蚕丝蛋白(palladium-fibroin)(18mg)进行氢置换，室温下搅拌1小时。用Celite过滤，减压浓缩滤液，将获得的残渣用硅胶柱层析(氯仿：甲醇＝50：1～5：1)纯化，得到77.6mg为无色油状物的1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基胺(收率：91%，2步骤)。

¹H-NMR(CDCl₃)δ：1.42(3H，d，J＝6.8Hz)，1.58(2H，br-s)，4.30(1H，q，J＝6.8Hz)，7.75(1H，s)，7.85(2H，s)。

获得的1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基胺的比旋光度如下：

[α]_D ²⁵-15.9(c＝1.31，CHCl₃)

另一方面，市售的标准品((S)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基胺(CentralGlass公司制：批号0102000，光学纯度：99%ee))的比旋光度如下：

[α]_D ²⁵-15.9(c＝1.15，CHCl₃)

比旋光度的实测值的符号与市售的标准品的符号一致，因此确认获得的1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基胺为(S)体。另外，该胺是经过叠氮化物离子的亲核取代反应由1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷获得的，因此确认上述1-(a)中获得的1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷为(R)体。

1-(b)：(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷的制备之2

在氩气氛下，在水浴下、20℃以下向(S)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇(1)(300g、1.16moL、96%ee)中滴加三溴化磷(157.3g、0.58moL)，在19～22℃下搅拌30分钟。冷却反应液，在0℃以下滴加溴化氢(30%乙酸溶液)(228mL、1.16moL)，在13～15℃下搅拌16小时。将反应液注入冰水中，用正己烷(3L×2)萃取。合并有机层，用饱和苏打水(3L)、饱和盐水(3L)依次洗涤，用无水硫酸镁干燥，之后减压(90～100mmHg)浓缩，获得389.2g粗产物。通过将获得的粗产物用柱层析(硅胶900g、展开溶剂：正己烷)纯化，获得349.8g为无色油状物的(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷(2)(收率93.8%)。

需要说明的是，在下述的手性HPLC分析中，由于第一个峰作为主峰出现，因此确认1-(b)中制备的1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷也与1-(a)同样，为(R)体。

手性HPLC分析：光学纯度>93.9%ee(主峰：第一个峰)、转化率97.8%

步骤2：反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基硫)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸的(S)体占优的半手性体的制备

在氩气氛下、在冰冷却下，向通过专利文献2(国际公开第2008/129951号小册子)记载的方法合成的反式-[4-([(乙基){2-[({5-[2-(甲基硫)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}氨基]甲基)环己基]乙酸乙酯(3)(565.4g、0.99moL)的无水四氢呋喃(THF、2.26L)溶液中加入NaH(60%油中，119g，2.98moL)，室温下搅拌1小时。将反应液冷却至-30℃，滴加步骤1中获得的(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷(2)(682g、1.99moL、93.9%ee)的无水N,N-二甲基甲酰胺(4.53L)溶液，使反应体系内达到-15℃以下，在-15℃～-1℃下搅拌5小时。将反应液注入冰水(35L)和甲苯(30L)的混合溶液中，加入柠檬酸，直至pH达到6.9，分离有机层。

将水层用甲苯(20L)萃取2次，合并有机层，用无水硫酸镁干燥后减压浓缩，获得粗产物。将粗产物溶解于乙醇(8L)中，在冰冷却下加入2MNaOH水溶液(1.24L、2.48moL)，在50℃下搅拌3.5小时。在冰冷却下向反应液中加入1MHCl水溶液、直至pH达到5.4，注入水(25L)，用乙酸乙酯(22L)萃取2次。将有机层用饱和盐水(12L)洗涤，用无水硫酸镁干燥后减压浓缩，通过将获得的残渣用柱层析(硅胶21g、展开溶剂：庚烷/丙酮＝7/1→3/1)纯化，获得反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基硫)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸的半手性体(4)(黄色油状物，744.1g、收率96%)。

需要说明的是，如上述步骤1所记载的那样，将绝对构型经确认的(R)-1-溴-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙烷(2)用作原料，通过胺(3)进行亲核取代反应，因此获得的半手性体(4)为(S)体占优的。

¹H-NMR(CDCl₃)δ:0.85-0.96(7H，m)，1.35-1.45(4H，m)，1.60-1.78(5H，m)，2.18-2.21(5H，m)，2.69(1H，m)，2.81-2.91(5H，m)，4.16(2H，q，J＝6.8Hz)，4.61(1H，d，J＝17.1Hz)，4.85(1H，d，J＝17.1Hz)，6.22(1H，q，J＝6.8Hz)，7.11(1H，d，J＝8.6Hz)，7.23(1H，s)，7.37(1H，d，J＝8.3Hz)，7.70(1H，s)，7.73(2H，s)，8.14(2H，s)。

步骤3：反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基硫)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯的(S)体占优的半手性体的制备

在氩气氛下、在冰冷却下，向步骤2中获得的反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基硫)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸的(S)体占优的半手性体(4)(744.1g、0.95moL)的无水二氯乙烷(11.6L)溶液中加入苄基醇(113.1g、1.05moL)、WSC·HCl(200.5g、1.05mol)和DMAP(11.9g、98mmoL)，室温下彻夜搅拌。向反应液中加入水(10L)，用氯仿(19L、14L)萃取，将有机层用饱和盐水(12L)洗涤，用无水硫酸镁干燥后减压浓缩，将获得的残渣用柱层析(硅胶28g、展开溶剂：庚烷/乙酸乙酯＝6/1)纯化，由此获得反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基硫)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯的半手性体(5)(黄色油状物、745.8g、收率90%)。

需要说明的是，获得的半手性体(5)与半手性体(4)同样，(S)体占优。

¹H-NMR(CDCl₃)δ:0.87-0.95(7H，m)，1.37(1H.m)，1.43(3H，d，J＝7.1Hz)，1.65-1.77(5H，m)，2.20(2H，d，J＝6.8Hz)，2.22(3H，s)，2.66-2.71(2H，m)，2.82-2.91(4H，m)，4.15(2H，t，J＝6.6Hz)，4.62(1H，d，J＝17.1Hz)，4.85(1H，d，J＝17.1Hz)，5.10(2H，s)，6.21(1H，q，J＝7.1Hz)，7.10(1H，d，J＝8.3Hz)，7.22(1H，s)，7.28-7.38(6H，m)，7.70(1H，s)，7.73(2H，s)，8.14(2H，s)。

步骤4：反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯的(S)体占优的半手性体的制备

在氩气氛下，向步骤3中获得的反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基硫)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯的(S)体占优的半手性体(5)(745.8g、0.87moL)的2-丙醇(15.2L)溶液中加入五氯化钽(31.3g、87.3mmoL)和30%过氧化氢水(496mL、4.38moL)，在室温下搅拌5小时。将反应液用饱和亚硫酸氢钠水溶液(3.1L)淬火，加入水(15L)，用氯仿(14L、12L)萃取，将有机层用饱和盐水(20L)洗涤，用无水硫酸镁干燥后减压浓缩，将获得的残渣用柱层析(硅胶26Kg、展开溶剂：庚烷/乙酸乙酯＝3/1→2/1)纯化，由此获得反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯的半手性体(6)(黄色无定形体、619.5g、收率79%)。

需要说明的是，获得的半手性体(6)与半手性体(4)和半手性体(5)同样，(S)体占优。

手性HPLC分析：光学纯度67.7%ee(主峰：第二个峰)

¹H-NMR(CDCl₃)δ：0.87-0.96(7H，m)，1.38(1H.m)，1.45(3H，d，J＝7.1Hz)，1.65-1.80(5H，m)，2.21(2H，d，J＝6.6Hz)，2.69(1H，m)，2.81-2.91(3H，m)，3.08(3H，s)，3.44(2H，t，J＝5.4Hz)，4.44(2H，t，J＝5.4Hz)，4.64(1H，d，J＝17.1Hz)，4.86(1H，d，J＝17.3Hz)，5.10(2H，s)，6.19(1H，q，J＝6.9Hz)，7.12(1H，d，J＝8.3Hz)，7.19(1H，s)，7.30-7.39(6H，m)，7.71(1H，s)，7.72(2H，s)，8.16(2H，s)。

步骤5：实质上光学上纯的(S)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯的制备

将步骤4中获得的反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯的(S)体占优的半手性体(6)(111.7g、123.7mmoL、67.7%ee)溶解于乙醇(825mL)中，在15℃～20℃下加入另外制备的种晶(下述步骤7中制备的外消旋体结晶)2.0mg，在相同温度下搅拌21小时，在0℃下搅拌3小时。过滤析出物，用冷乙醇(165mL)洗涤，之后将母液减压浓缩，由此获得实质上光学上纯的反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯(7)(黄色无定形体、66.38g、收率59%)。

需要说明的是，获得的反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯(7)是从(S)体占优的半手性体(6)中过滤外消旋体占优的结晶而获得的，因此是(S)体。

手性HPLC分析：光学纯度>99%ee(主峰：第二个峰)

[α]_D ²⁰-42.36(C＝1.0ｗ/v%，CHCl₃)

需要说明的是，过滤的外消旋体占优的结晶的光学纯度用手性HPLC分析，结果为22%ee(43.39g、收率39%)。

步骤6：实质上光学上纯的(S)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸的制备

在氮气氛下，向步骤5中获得的(S)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯(7)(34.2g、37.88mmoL、>99%ee)的乙醇(340mL)溶液中加入10%Pd-C(湿)(3.4g)，氢置换后在室温下搅拌2小时。用Celite过滤反应悬浮液，用乙醇(50mL)洗涤，减压浓缩洗液，由此获得实质上光学上纯的反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸(III)(白色无定形体、31.78g、收率100%)。

需要说明的是，如下述比旋光度所示的那样，获得的化合物为左旋性的化合物。另外，获得的化合物是由作为(S)体的苄酯(7)对酯进行脱保护而获得的，因此同样是(S)体。

手性HPLC分析：光学纯度>99%ee(主峰：第二个峰)

[α]_D ²⁰-46.68(c＝1.0，CHCl₃)

IR(ATR)cm^-1：2921,1706,1479,1279,1134

¹H-NMR(CDCl₃)δ：0.80-0.96(7H，m)，1.38(1H.m)，1.47(3H，d，J＝7.1Hz)，1.65-1.77(5H，m)，2.19(2H，d，J＝6.8Hz)，2.72(1H，m)，2.81-2.91(3H，m)，3.08(3H，s)，3.45(2H，t，J＝5.2Hz)，4.44(2H，q，J＝5.4Hz)，4.62(1H，d，J＝17.1Hz)，4.86(1H，d，J＝17.4Hz)，6.21(1H，q，J＝7.1Hz)，7.13(1H，d，J＝8.3Hz)，7.19(1H，s)，7.38(1H，d，J＝6.6Hz)，7.71(1H，s)，7.73(2H，s)，8.15(2H，s)。

步骤7：反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯的外消旋种晶的制备

在冰冷却下，向通过专利文献2(国际公开第2008/129951号小册子)实施例45记载的方法合成的、反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸(外消旋体化合物(I))(20g、24.61mmoL)的无水二氯甲烷(200mL)溶液中加入苄基醇(2.93g、27.07mmoL)、DMAP(300mg、2.46mmoL)和WSC·HCl(5.19g、27.07mmoL)，升至室温，搅拌16小时。向反应液中加入水(100mL)，用氯仿(500mL)萃取，将有机层用2M盐酸水溶液(100mL)和饱和盐水(100mL)洗涤，用无水硫酸镁干燥后减压浓缩，获得的残渣用柱层析(硅胶350g、展开溶剂：N-己烷/乙酸乙酯＝3/1→1/1)纯化，由此获得为白色无定形体的反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯(21.15g、收率95.2%)。

将获得的为白色无定形体的反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基硫)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯(7.9g)溶解于乙醇(40mL)中，在室温下搅拌15小时而获得析出物，过滤析出物，用冷乙醇(20mL)洗涤，在60℃下减压干燥4小时，由此获得反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸苄酯的外消旋结晶(白色结晶性粉末、6.98g、回收率88.4%)。

实施例2：确认(S)体化合物(III)对PCSK9蛋白量、LDL受体量的影响

向人肝癌细胞株HepG2细胞中添加被测化合物，用蛋白印迹法测定培养48小时后的PCSK9蛋白量和LDL受体(LDLR)量，由此确认被测化合物对PCSK9蛋白量、LDL受体量的影响。

即，将HepG2细胞按5×10⁵细胞/孔的浓度接种在6孔板中，培养一夜后，向培养液中加入1/1000倍量的溶解于二甲基亚砜(DMSO)的被测化合物、或仅加入DMSO。将细胞在CO₂培养箱中、37℃下培养48小时，之后加入100μLRIPA缓冲液(50mMTriS-HCl、pH7.8，150mMNaCl、1%NP-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、蛋白酶抑制剂)进行破碎，萃取蛋白质。将萃取的蛋白质以10000×g离心分离后回收上清液，加入SDS样品缓冲液(60mMTris-HCl、pH6.8、2%SDS、10%甘油、3%疏基乙醇)，通过使用8%丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)分离。分离结束后，使用iBlot凝胶转换系统(Invitrogen公司)将蛋白质固定在硝基纤维素膜上，用BlockAce(DSPharmaBiomedical公司，目录号UK-B80)进行封闭。

PCSK9蛋白、LDLR、β-Actin蛋白的检测及其量的测定如下进行：分别在第一抗体中使用Anti-PCSK9(Cayman公司、目录号1000718)、Anti-LDLR(BioVision公司、目录号3839-100)或Anti-β-Actin(Sigma公司、目录号A5316)，在第二抗体中使用Anti-RabbitIgG-HRP(Sigma公司、目录号A0545)或Anti-MouSeIgG-HRP(Sigma公司、目录号A4416)，将膜上的蛋白质用抗体标记，使化学发光试剂(HRP的基质)与膜上的第二抗体反应，之后用LuminoImageAnalyzerLAS-3000(富士胶片株式会社制)测定信号强度。将获得的信号强度用图像解析软件ScienceLab2002MultiGauge(富士胶片株式会社制)数值化。

获得的PCSK9蛋白量和LDL受体量的测定值以β-Actin蛋白量作为指标，在添加了各被测化合物的样品和对照样品(仅添加DMSO的样品)之间进行修正。修正后添加了各被测化合物的样品的PCSK9蛋白量和LDL受体量以对照样品的PCSK9蛋白量和LDL受体量分别为1时的相对值表示。

结果示于表1。

需要说明的是，被测化合物使用以下物质：

1：(S)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸((S)体化合物(III))

将(S)体化合物(III)(光学纯度>99%ee)添加到培养液中，使其终浓度为10μM。

2：(R)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸((R)体化合物(II))

将(R)体化合物(II)(光学纯度≥98%ee)添加到培养液中，使其终浓度为10μM。

3：反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸(外消旋体化合物(I))

将外消旋体化合物(I)添加到培养液中，使其终浓度为10μM。

[表1]

由表1中记载的结果可以看出，与对照相比，(S)体化合物(III)显著降低了PCSK9蛋白量，显著增加了LDL受体量，而(R)体化合物(II)和外消旋体化合物(I)几乎未显示上述作用。特别是，关于LDL受体量，在与对照的比较中仅(S)体化合物(III)显著增加。

由以上试验结果可知，(S)体化合物(III)具有降低PCSK9蛋白量的作用、增加LDL受体量的作用。

需要说明的是，本发明不受以下推测的限制。外消旋体化合物(I)虽然含有约50%的(S)体化合物(III)，但几乎未显示降低PCSK9蛋白量的作用，也完全未显示增加LDL受体量的作用，因此推测在外消旋体化合物(I)中，其组成成分(R)体化合物(II)抑制了(S)体化合物(III)表现其作用。还推测，提高(S)体化合物(III)的光学纯度而减少(R)体化合物(II)的含量，特别是在提高增加LDL受体量的作用方面是优选的。

实施例3：确认(S)化合物(III)对PCSK9mRNA表达的影响

为了确认上述实施例2中确认的、PCSK9蛋白量的降低作用的机理，向HepG2细胞中添加被测化合物，通过定量实时PCR法确认培养24小时后的PCSK9mRNA表达量。

即，将HepG2细胞按2×10⁵细胞/孔的浓度接种在24孔板中，培养一夜后，向培养液中加入1/1000倍量的溶解于二甲基亚砜(DMSO)的被测化合物、或仅加入DMSO。将细胞在CO₂培养箱中、37℃下培养24小时后，加入500μL的ISOGEN(NIPPONGENE公司，目录号31-02501)萃取总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems公司，目录号4368813)由萃取的总RNA合成cDNA。人PCSK9mRNA表达量通过使用对人PCSK9特异的引物(KourimateS.等人,JBiolChem.283卷，9666页)和FastSYBRGreenmastermix(AppliedBiosystems公司，目录号4385614)的定量实时PCR法测定。测定仪器使用7900HTFastRealtimePCRSystem。

获得的PCSK9mRNA表达量的测定值以β-ActinmRNA的表达量为指标，在添加了被测化合物的样品(3个样品)和对照样品(仅添加DMSO的样品：3个样品)之间进行修正。修正后添加了被测化合物的样品的PCSK9mRNA表达量以对照样品的PCSK9mRNA表达量的平均值为1时的相对值(平均值±标准误差)表示。

结果示于表2。

需要说明的是，被测化合物使用以下物质。

向(S)体化合物(III)(光学纯度>99%ee)中添加培养液，使其终浓度为10μM。

[表2]

由表2中记载的结果可知，在与对照的比较中，(S)体化合物(III)显著降低了PCSK9mRNA的表达量。

因此，实施例2中确认的、(S)体化合物(III)具有的PCSK9蛋白量的降低作用的至少一部分是基于PCSK9基因表达抑制作用的，认为(S)体化合物(III)具有抑制PCSK9蛋白产生的作用。

实施例4：研究(S)体化合物(III)的血中LDL胆固醇降低作用

使(S)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸((S)体化合物(III)：光学纯度>99%ee)悬浮在0.5%甲基纤维素溶液中，之后用金属探针按每天1次反复经口给予正常仓鼠(雄性叙利亚仓鼠)14天。最终给予4小时之后采血，获得血浆。血浆中脂蛋白的分析按照J.Lipid.Res.,43,805-814中记载的方法，通过使用postlabel法的HPLC系统自动测定。即，将15μL血浆样品用含1mMEDTA的PBS稀释10倍后，向与HPLC系统(进液单元：ShimadzuLC-20Asystem、岛津制作所)连接的凝胶过滤柱(Superose6柱(柱尺寸：10×300mm)、GEHealthcareBioscience制)中注入80μL。用含1mMEDTA的PBS作为电泳缓冲液，在流速0.5mL/分钟、柱温40℃下进行分离。以流速0.25mL/分钟向柱洗脱液中混合胆固醇测定试剂(胆固醇E-TestWako，和光纯药工业社制)，于反应盘管(0.5mm×15m)中、在进液下、40℃进行反应。在波长600nm下检测反应盘管的洗脱液中的胆固醇。求出LDL组分占获得的胆固醇的总峰面积的面积比，用预先使用胆固醇E-TestWako测定的总胆固醇量乘以LDL组分的面积比例，算出LDL胆固醇量。

需要说明的是，对照组(0.5%甲基纤维素溶液给予组)和被测化合物给予组((S)体化合物(III)，10mg/Kg体重、30mg/Kg体重给予组)分别使用预先以血浆总胆固醇值为指标分组的6只正常仓鼠。

各组的血浆中的LDL胆固醇量(LDL-C、mg/dl)示于表3。需要说明的是，表3中的＊和＊＊＊分别表示在对照组和被测化合物给予组之间进行的、多组比较检验(Dunnett的多重比较检验)的结果有显著性水平5%以下(p<0.05)和显著性水平0.1%以下(p<0.001)的显著差异。另外，在被测化合物给予组中，LDL胆固醇量相对于对照组的降低率作为LDL胆固醇降低率通过下述算式1算出，用%表示。

LDL胆固醇降低率(%)＝[(对照组的平均LDL胆固醇量-各化合物给予组的平均LDL胆固醇量)/对照组的平均LDL胆固醇量]×100(算式1)

[表3]

由表3中记载的结果可以看出，(S)体化合物(III)具有优异的血中LDL胆固醇降低作用。

由以上试验结果可知，(S)体化合物(III)作为具有血中LDL降低作用的药物的有效成分等是有用的。

实施例5：确认外消旋体化合物(I)等对HMG-CoA还原酶mRNA表达的影响

向HepG2细胞中添加被测化合物，培养8小时后通过定量实时PCR法测定HMG-CoA还原酶mRNA表达量。

即，将HepG2细胞按2×105细胞/孔的浓度接种在24孔板中，培养一夜后向培养液中加入1/1000倍量的溶解于二甲基亚砜(DMSO)的被测化合物、或仅加入DMSO。将细胞在CO2培养箱中、37℃下培养8小时后，加入500μLISOGEN(NIPPONGENE公司，目录号31-02501)萃取总RNA。用高容量cDNA逆转录试剂盒(AppliedBiosystems社、目录号4368813)由萃取的总RNA合成cDNA。人HMG-CoA还原酶mRNA表达量通过使用对人HMG-CoA还原酶特异的以下引物组：5'-GGTGTTCAAGGAGCATGCAAAG-3'和5'-TGACAAGATGTCCTGCTGCCA-3'及FastSYBRGreenmastermix(AppliedBiosystems社、目录号4385614)的定量实时PCR法测定。测定仪器使用7900HTFastRealtimePCRsystem。

获得的HMG-CoA还原酶mRNA表达量的测定值以β-ActinmRNA的表达量为指标、在添加了被测化合物的样品(各化合物均为3个样品)和对照样品(DMSO添加样品：3个样品)之间进行修正。修正后添加了被测化合物的样品的HMG-CoA还原酶mRNA表达量以对照的HMG-CoA还原酶mRNA表达量的平均值为1时的相对值(平均值±标准误差)表示。

结果示于表4。

需要说明的是，被测化合物使用以下物质：

1：反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸(外消旋体化合物(I))

向外消旋体化合物(I)中添加培养液，使其终浓度为10μM。

2：反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基硫)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸(专利文献2中实施例44记载的化合物)

向专利文献2实施例44记载的化合物中添加培养液，使其终浓度为10μM。

[表4]

由表4记载的结果可知，在与对照的比较中，外消旋体化合物(I)和专利文献2实施例44记载的化合物均显著降低了HMG-CoA还原酶mRNA的表达量。

产业上的可利用性

(S)体化合物(III)具有降低PCSK9蛋白量的作用、增加LDL受体量的作用，还显示出优异的血中LDL胆固醇降低作用，因此例如可以用作用于降低血中LDL胆固醇的药物的有效成分等，可以用于药品产业。

Claims

1.实质上光学上纯的(S)-反式-{4-[({2-[({1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙基}{5-[2-(甲基磺酰基)乙氧基]嘧啶-2-基}氨基)甲基]-4-(三氟甲基)苯基}(乙基)氨基)甲基]环己基}乙酸、或其盐的制备方法，

该方法包括：

通过在溶剂中优先晶析，从下述通式(IV)所示化合物的(S)体占优的半手性体中除去外消旋体占优的结晶，来制备下述通式(V)所示的实质上光学上纯的化合物的步骤，

式(IV)中，R表示可以具有取代基的C_6-10芳基或可以具有取代基的5～10元杂芳基，n表示1～6的整数，

式(V)中，R和n与上述同义；以及

从通式(V)所示化合物中除去-(CH₂)_n-R所示基团的步骤，

所述“实质上光学上纯的”是指化合物的光学纯度为90%ee以上，

所述“半手性体”是指具有10%ee以上但不足90%ee的光学纯度的化合物。

2.权利要求1中记载的方法，其进一步含有如下步骤：

在溶剂中使下述通式(VI)所示化合物的(S)体占优的半手性体与氧化剂反应，来制备通式(IV)所示化合物的(S)体占优的半手性体，

式(VI)中，R和n与上述同义。

3.权利要求2中记载的方法，其进一步含有如下步骤：

在溶剂中、在催化剂的存在下使下式(VII)所示化合物的(S)体占优的半手性体与下述通式(VIII)所示化合物反应，来制备通式(VI)所示化合物的(S)体占优的半手性体，

式(VIII)中，R和n与上述同义。

4.权利要求3中记载的方法，其进一步含有如下步骤：

在溶剂中、在碱的存在下水解下述通式(IX)所示化合物的(S)体占优的半手性体，来制备式(VII)所示化合物的(S)体占优的半手性体，

式(IX)中，R¹表示C_1-6烷基。

5.权利要求4中记载的方法，其进一步含有如下步骤：

在溶剂中、在碱的存在下使下述通式(X)所示化合物与下述通式(XI)所示化合物反应，来制备通式(IX)所示化合物的(S)体占优的半手性体，

式(X)中，X表示卤原子，

式(IX)中，R¹与上述同义。

6.权利要求5中记载的方法，其进一步含有如下步骤：

在卤化剂的存在下卤化(S)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇，来制备通式(X)所示化合物。

7.权利要求1中记载的通式(IV)所示化合物或其盐的(S)体占优的半手性体，该“半手性体”是指具有10%ee以上但不足90%ee的光学纯度的化合物。

8.权利要求1中记载的通式(V)所示化合物、或其盐。

9.权利要求7中记载的化合物或其盐的(S)体占优的半手性体，其中，R为苯基，n为1。

10.权利要求8中记载的化合物、或其盐，其中，R为苯基，n为1。