CN102847155B - 抑制肿瘤转移的方法 - Google Patents

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Abstract

白三烯C4和D4拮抗剂用于通过作用于抑制肿瘤细胞与内皮细胞的黏附，由此阻止肿瘤细胞的外渗来抑制肿瘤转移。

Description

抑制肿瘤转移的方法
本申请是中国申请200580030730.5的分案申请。
发明背景
发明领域
本发明涉及抑制肿瘤转移和抑制肿瘤细胞黏附到内皮细胞和/或肿瘤细胞的经内皮迁移形式的毛细管通透性的方法。
相关技术介绍
花生四烯酸(AA)响应于多种刺激如机械、热、化学、细菌和其它刺激而从细胞膜中的磷脂释放到细胞质中，并且已经发现其产物(类花生酸类化合物前列腺素和白三烯)以多种方式具有生物学重要性。大多数类花生酸类化合物趋于加重炎症，疼痛，和发热反应，并且它们成为对于抗炎和镇痛药物的广泛研究的靶标。例如，抗炎类固醇如可的松通过抑制由膜磷脂生成花生四烯酸的磷脂酶而发挥作用。止痛药如阿司匹林和布洛芬通过在一定程度上阻抑环加氧酶而起作用，所述环加氧酶控制花生四烯酸转化成类花生酸，前列腺素，前列环素，和血栓烷。
此外，已知前列腺素和白三烯有助于在外周和中枢神经系统(CNS)中形成炎症。尽管在过去三十年进行了研究，但确切地前列腺素如何有助于炎症仍然不清楚。相反地，最近利用白三烯受体拮抗剂的研究表明白三烯可能在此过程中发挥主要作用。
白三烯是有效的脂质介体并且基于半胱氨酸基团的存在或缺失而分成两类。白三烯B4并不包含这种基团，而白三烯C4，D4，E4和F4是半胱氨酸基白三烯。自从1980年代早期以来，已经认可这些化合物为炎症引起剂(von Sprecher等，1993和Piper，1984)。
在1990年代，鉴定了被称作″白三烯拮抗剂″的各种药物，其能够遏制和抑制白三烯在身体中的活性。在本文中以常规医学意义使用的术语“白三烯拮抗剂”，指抑制，阻抑，或减弱或对抗天然存在的白三烯的一种或多种亚型的浓度，活性或效应的药物。不过，这些白三烯拮抗剂能够基于作用机制的差别而分成两种不同的组，一种抑制5-脂加氧酶而另一种竞争性拮抗白三烯的受体。普仑司特，一种白三烯拮抗剂严格在白三烯C4和D4受体水平上起作用。
尽管已经公开了用于治疗脑炎的一些白三烯受体拮抗剂(例如，J63258-879-A，JO2-169583-A，WO9959964-A1，EP-287-471-A)，推测所有公开的白三烯受体拮抗剂穿过血-脑屏障(BBB)，因为按照常识分子必须能够穿过血-脑屏障以便减弱或抑制脑炎，或治疗缘自脑炎的脑的病症(Wilkinson等，2001)。由于到目前为止已知白三烯C4和D4受体拮抗剂并不穿过血-脑屏障，白三烯C4和D4受体拮抗剂之前从未用来治疗或预防脑炎，除了白三烯受体拮抗剂普仑司特(ONO-1078)对于大鼠(Zhang等，2002)和小鼠(Zeng等，2001)中病灶性大脑局部缺血的神经保护性作用。不过，白三烯C4和D4受体拮抗剂通常用于治疗哮喘。白三烯C4和D4受体拮抗剂普仑司特在临床上用作抗哮喘药物并且已知具有稍许副作用。普仑司特并不穿过血-脑屏障，或至多在极小的水平上穿过血-脑屏障，类似其它拮抗剂如扎鲁司特和孟鲁司特。已经提出这些化合物的其它药品标识外使用(off-label)用途，包括变应性疾病的治疗(Shih，美国专利号6,221,880)以及用于治疗偏头痛和簇集性头痛(Sheftell等，美国专利号6,194,432)。Demopulos等，美国专利号6,492,332，也报告了白三烯受体拮抗剂在抑制肿瘤细胞黏附，疼痛和炎症的方法和组合物中用作抗炎药，其中将包括另一种药剂的药剂的组合施用给进行手术操作以去除肿瘤的患者，所述另一种药剂抑制肿瘤细胞黏附/附着，和/或入侵和/或局部转移。
白细胞转移到急性或慢性炎症位点包括在这些细胞和内皮之间的黏附性相互作用。这种特异性黏附是由炎性刺激起始的级联中的起始事件，所以它对于生物的调控型防御极为重要。在炎症反应期间参与白细胞和内皮之间的相互作用的细胞黏附分子的类型目前有四种：(1)选择蛋白；(2)选择蛋白的(糖类和糖蛋白)配体；(3)整联蛋白；和(4)整联蛋白配体，其是免疫球蛋白基因超家族的成员。
选择蛋白是细胞-表面糖类结合蛋白，其介导在白细胞和血管内皮表面之间的细胞黏附。例如，e-选择蛋白与其在循环性嗜中性粒细胞表面表达的配体结合起始滚动(rolling)，一种在这些细胞补充到损伤或炎症位点的早期步骤。
癌症是在发达国家中死亡的主要原因。转移，细胞由原发肿瘤扩散到远端位点以及它们在那里的生长是癌症最可怕的方面。这种担心是有充分基础的。尽管在早期诊断，外科手术技术，常规患者护理，和局部以及全身辅助治疗中有显著的改善，但大多数源自癌症的死亡归因于耐受常规治疗的转移。生长证据提示糖类介导的癌/肿瘤细胞黏附到血管内皮上的选择蛋白涉及广泛种类的上皮癌的转移，所述上皮癌包括胃癌，结肠直肠癌，胰腺癌，肝癌，卵巢癌，头颈癌，以及乳腺癌等。
转移过程在图1中举例说明，其中：
1)在最初的转化事件中，肿瘤细胞的单细胞或多细胞生长必须是进行性的。
2)如果肿瘤块直径超过2mm则必须发生广泛的血管形成。
3)几种血管生成因子的合成与分泌在由周围宿主组织建立新毛细血管网络中发挥重要作用。
4)宿主基质被一些肿瘤细胞局部入侵可以通过几种互不相斥的机制发生。薄壁小静脉样的淋巴通道提供了对于肿瘤细胞的渗透极小的抗性并且提供了肿瘤细胞进入循环最常见的途径。
5)发生小肿瘤细胞团聚物的脱附作用和栓塞。
6)在循环中存活的肿瘤细胞必须阻滞在器官的毛细胞血管床中。E-和p-选择蛋白出现在激活的内皮细胞中以便与肿瘤细胞通过唾液酸-Lewisx和唾液酸-Lewisa抗原相互作用。
7)发生外渗(Exravasation)和
8)在器官软组织内的增殖实现了转移过程。
恶性细胞黏附到血管内皮表面涉及黏附受体家族，其类似参与炎性细胞补充到组织位点上的那些受体。选择蛋白涉及内皮细胞(EC)激活后的连续分子步骤的级联。
选择蛋白是在结构上和功能上统一的细胞黏附分子。在结构上，选择蛋白的特征是包括与钙依赖型凝集素(C-凝集素)具有同源性的结构域，表皮生长因子(egf)-样结构域和一些补体结合样的结构域(Bevilacqua等，1989；Johnston等，1989；Lasky等，1989；Siegalman，等，1989；和Stoolman，1989)。在功能上，选择蛋白分享介导细胞结合的共同能力，所述结合是通过在它们的凝集素结构域和细胞表面糖类配体之间的相互作用进行的(Brandley，等，1990；Springer和Lasky，1991；Bevilacqua和Nelson，1993和Tedder等，1989)。
到目前为止在细胞黏附分子的选择蛋白家族中有三种经鉴定的成员：L-选择蛋白(也叫作外周淋巴结归巢受体(pnHR)，LEC-CAM-1，LAM-1，gp90MEL，gp100MEL，gp110MEL，MEL-14抗原，Leu-8抗原，TQ-I抗原，DREG抗原)，E-选择蛋白(LEC-CAM-2，LECAM-2，ELAM-I)和P-选择蛋白(LEC-CAM-3，LECAM-3，GMP-140，PADGEM)。
经常在人癌细胞上表达的糖类决定簇，唾液酸Lewisa(SLea)和唾液酸Lewisx(SLex)，充当在血管内皮细胞上表达的e-选择蛋白的配体。这些糖类决定簇参与癌细胞黏附到血管内皮上并且因而促进癌的转移。选择蛋白是参与淋巴细胞补充的可诱导的内皮表达型黏附分子。由这些分子介导的最初黏附通过几种细胞因子的作用促进整联蛋白分子的激活。糖类配体在癌细胞表面上的表达程度与转移的频率密切相关联。单克隆抗体针对Slea或Slex阻抑的肿瘤细胞(白血病，结肠癌，和组织细胞性淋巴瘤细胞)黏附到EC和血小板上。选择蛋白表达还经常在乳腺癌内皮细胞上得以上调。
P-选择蛋白，也叫作GMP-140或PADGEM，是位于休眠的(未受刺激的)血小板和内皮的分泌颗粒中的膜糖蛋白。当介质激活这些细胞时，p-选择蛋白迅速重新分布到血浆膜中。选择蛋白构成结构和功能上相关的分子的家族。这些分子每一种所共有的结构基序包括N-末端凝集素样结构域，后接EGF样区域，一系列与补体结合蛋白中那些相关的共有重复序列，跨膜结构域和短胞质尾区。当P-选择蛋白在激活的血小板和内皮上表达时，它是嗜中性粒细胞和单核细胞的受体。这种特性有利于淋巴细胞在组织损伤区快速黏附到内皮上以及在炎症和出血位点上的血小板-白细胞相互作用。研究还发现p-选择蛋白在许多组织部分结合到肿瘤细胞上并且它结合到许多源自癌的细胞系成员的细胞表面上。与其它黏附分子作用相一致，p-选择蛋白参与肿瘤转移并且因此是阻抑黏附受体功能的药物的靶标。
支持选择蛋白在转移中的作用的研究是基于利用体外流动模型来将人结肠癌细胞系黏附于选择蛋白之上进行的。p-选择蛋白的重组形式以及中国仓鼠卵巢细胞表达的p-选择蛋白支持KM12-L4结肠癌细胞的黏附和滚动，并且这种效应被用神经氨酸酶预处理KM12-L4细胞所破坏。KM12-L4细胞通过PSGL-1-独立型黏附途径与p-选择蛋白相互作用。还发现e-选择蛋白-IgG嵌合体支持在液流下结肠癌细胞的依赖于唾液酸化部分的黏附。因而，在流动条件下唾液酸化部分参与选择蛋白介导的人癌细胞黏附到IL-I-刺激的内皮上。另外，已经发现e-选择蛋白介导的人结肠癌细胞结合到人和小鼠EC上的效力与癌细胞的转移潜力相关联。
最近的研究评估了e-选择蛋白-唾液酸Lewisx(Slex)/唾液酸Lewisa(Slea)相互作用在介导两种人结肠癌细胞系，HT-29和COLO 201体外黏附到人脐带内皮细胞(HUVEC)上中的作用。结肠癌细胞系具有糖类表位的强烈表达并且确证了HT-29和COLO201细胞与IL-1-刺激的HUVEC的黏附可以被针对e-选择蛋白的单克隆抗体所抑制。细胞与针对Slex的两种不同抗体以及针对Lewis表位，Lex和Lea的抗体的预先温育对于黏附并没有显著影响。针对Slea的三种抗体在它们抑制HT-29和COLO201细胞的黏附的能力上不同。因而，Slea表位对于主要由e-选择蛋白介导的结肠癌细胞的黏附是重要的。
其它研究已经证明用肿瘤坏死因子-α(TNF-alpha)预处理HUVEC增强COLO 205癌细胞系的结合。增强的附着与在4hr时发现的最大肿瘤细胞附着是浓度和时间依赖型的。这一结果与内皮上黏附分子e-选择蛋白的表达提高是一致的。在加入COLO 205之前将TNF--刺激的HUVECs与BB11，抗-e-选择蛋白mAb一起温育导致了肿瘤细胞附着的完全抑制。这些研究确认了针对e-选择蛋白的特异性抗体抑制肿瘤细胞附着到内皮细胞靶标上的用途。其它研究发现用抗-p-选择蛋白或抗-L-选择蛋白单克隆抗体(即，MAb PB 1.3和MAb DREG-200)，或包含唾液酸Lewisx的寡糖(Slex-OS)预处理在抑制细胞黏附中是有效的。
利用源自人胰腺癌的SW1990细胞，类似的体外和体内研究已经确证的选择蛋白在转移过程中的作用。SW1990细胞也强烈地表达Slea和SLex抗原，CD44H，和β1整联蛋白。这些细胞显示与IL-1-激活的HUVECS和人腹膜间皮细胞的结合活性。通过用针对Slea和针对β1整联蛋白的抗体处理抑制导致癌细胞植入内皮细胞中的黏附。在动物研究中，用针对Slea和β1整联蛋白的抗体处理每次都抑制在具有SW1990细胞的裸鼠中的肝转移的发展并且延长它们的存活。
本文引用任何文献并不意味着承认这种文献是相关的现有技术，或关于本申请的任何权利要求的可专利性的考虑材料。有关任何文件的内容或日期的任何说明是基于申请时申请人所能获得的信息，并不构成承认有关这种说明的正确性。
发明概述
本发明提供了通过向需要其的并未，即未同时进行手术操作的受试者，或向需要其的未使用任何其它具有抗肿瘤细胞黏附，抗侵染或抗转移性质的化合物的受试者施用有效量的白三烯拮抗剂来抑制肿瘤转移的方法。
本发明还提供了抑制肿瘤细胞黏附到内皮细胞和/或抑制肿瘤细胞的以经内皮迁移形式存在的毛细管通透性的方法。
本发明进一步提供了筛选肿瘤细胞毛细管通透性的抑制剂的方法。
附图简述
图1是转移过程的示意图。
图2是描述ONO-1078(普仑司特)对于葡聚糖诱导的水肿的作用的图解。
图3是当测量在脓毒病实验期间大鼠的CSF变化时套管的位置示意图。
图4A和4B是显示花生四烯酸(3.25μg/2μl)的施用引发两个不同个体中枢神经系统炎症的图解。图4A是大鼠#1而图4B是大鼠#2。
图5是显示普仑司特(490mg/kg，i.p.)对于大鼠中枢神经系统(CNS)中由花生四烯酸(3.25μg/2μm)引发的炎症的抑制作用的图解。数据获自四只大鼠。
图6显示在作为血脑屏障的部分的星形胶质细胞之间具有其多个沟(由白色箭头显示)的中央毛细血管的外侧表面。这些沟开放以提高毛细管通透性并且在白血细胞和癌细胞的外渗中发挥重要作用。
图7A-7C显示外渗期间癌细胞形状的变化。图7A和7B是相同的，除了在图7B中，一些用荧光标记PKH67染色的癌细胞被一些画出的白线列出，例如，癌细胞1，2和3。观察到在图7B中列出的癌细胞1和癌细胞2为从中央毛细血管出来进入CSF中的细胞的部分。癌细胞3正在穿过血脑屏障到CSF的中途并且它的形状还不是方形的。可以看到的黑色的小方块是嗜中性粒细胞，其粘附到内皮细胞上的p-选择蛋白，整联蛋白，和/或Ig-超家族CAM(细胞黏附分子)上。癌细胞的经内皮迁移在花生四烯酸施用到蛛网膜下隙后立即开始。白血细胞的经内皮迁移在花生四烯酸施用稍后发生，与癌细胞相比延迟了。图7C全面图示了癌细胞外观变平的顺序，使得它能够穿过甚至是血脑屏障的狭窄开口。
图8是在利用表1中的实验程序向动物施用蒸馏水-PBS-盐水之后，肿瘤或白血细胞(WBC)计数或CSF体积(μl)的时间作用图表。
图9是在将花生四烯酸(816ng/2μl)施用到蛛网膜下隙中后WBC计数和CSF体积(μl)的时间作用曲线图。
图10A-10C是在施用蒸馏水-肿瘤细胞(i.v.)-花生四烯酸(816ng/2μl)之后在蛛网膜下隙中测量的肿瘤细胞计数(图10A)，CSF体积(图10B)，和WBC计数(图10C)的时间作用曲线图。
图11是在施用普仑司特(490mg/kg)-PBS-花生四烯酸(816ng/2μl)之后的肿瘤细胞计数的时间作用图表。
图12A-12C是对于肿瘤细胞外渗(图12A)，花生四烯酸引发的癌细胞对CSF体积(μl)的影响(图12B)，和花生四烯酸引发的癌细胞对白血细胞计数的影响(图12C)的在时间作用曲线之下的面积图。星号代表由ANOVA所分析的统计学显著性，其中概率值p＜0.05，为显著的。
发明详述
本发明提供了抑制肿瘤转移的方法，包括向需要其的并未同时进行诸如除去肿瘤的外科手术操作的受试者，或向需要其的未使用任何其它具有抗肿瘤细胞黏附，抗侵染或抗转移性质的化合物，如在美国专利6,492,332中所公开的那些化合物的受试者施用有效量的白三烯C4和D4受体拮抗剂，优选普仑司特，或其药用盐。
在本文中以常规医学意义使用术语″白三烯拮抗剂″来指抑制，阻抑，或减弱或对抗天然存在的白三烯的一种或多种亚型的浓度，活性或效应的药物。白三烯拮抗剂典型地在受体水平上对抗白三烯的作用并且更加优选在本文称作″白三烯C4和D4受体拮抗剂″。
本文所用的术语″肿瘤″意指经转化细胞的块，其至少部分特征是包含生成血管的血管系统。术语″肿瘤″宽泛地用来包括肿瘤实质细胞以及支持性基质，包括渗透肿瘤实质细胞块的生成血管性血管。尽管肿瘤通常是恶性肿瘤，即，具有转移能力的癌症，但肿瘤也可以是非恶性的，前提是新血管形成与肿瘤相关联。本文所指的肿瘤细胞源自转移性肿瘤。本文所用的术语″转移″指继发性肿瘤，其与原发肿瘤分离生长并且发源自分离的，转运的细胞。
本发明人先前曾使用白三烯C4和D4受体拮抗剂，特别是，普仑司特研究过炎症机制。通常，当发生炎症发应时，各种细胞因子和其它炎症介质作用于局部血管，并提高内皮CAM的表达。认为这些促炎性(pro-inflammatory)细胞因子和炎性介质激活毛细血管的内皮细胞上的p-选择蛋白和e-选择蛋白并且随后起动白血细胞外渗过程，其接下来后跟步骤(1)滚动，(2)触发，(3)吸住/黏附，和(4)经内皮迁移。
炎症的过程理解如下：
1)由伤害性刺激激活的巨噬细胞在组织中分泌TNF-α，白介素-1β和白介素-6。
2)在毛细血管中血管内皮细胞通过TNF-α，和白介素-1β提高e-选择蛋白的表达，并且通过组胺和凝血酶提高p-选择蛋白的表达。
3)循环性白血细胞表达粘蛋白如PSGL-I或四糖唾液酸Lewis和唾液酸Lewisa和唾液酸Lewisx，其结合e-和p-选择蛋白。这种结合介导白血细胞对血管内皮的附着或束缚，让细胞在血液流动的方向上滚动(rolling)。尽管在大鼠的中-空肠中p-选择蛋白和唾液酸Lewis-依赖型变化是由白三烯C4/D4诱导的，白三烯受体拮抗剂并没有效果。自从那时，就发展了有效的选择蛋白抑制剂。
4)随着白血细胞滚动，产生了趋化因子(白介素8，MIP-I α/β，和MCP-I)和PAF，补体分离(C5a，C3a和C5b67)和各种N-甲酰肽。这些化学引诱物结合在白血细胞膜上的受体促发了与受体相关联的G-蛋白介导的激活信号。这种信号诱导白血细胞膜中整联蛋白分子的构象变化，提高了它们对于内皮上免疫球蛋白-超家族黏附分子(触发性的)的亲和性。
(5)随后在整联蛋白和免疫球蛋白-超家族CAMs之间的相互作用稳定了白血细胞对内皮细胞的黏附，使得细胞能够牢固地附着到内皮细胞上(吸住/黏附)。
白血细胞随后穿过血管壁迁移入组织中。经内皮迁移的步骤以及它是如何被引导的仍然在很大程度上未知。它们可能是通过白血细胞表面和毛细血管内皮细胞上的CD31之间的分子结合，或通过白血细胞上的LFA-I和毛细血管内皮细胞(经内皮迁移)上的JAM的结合进行介导的。
因而，白血外渗是由毛细血管内皮细胞，毛细血管内皮细胞上的分子，趋化因子和黏附分子(选择蛋白家族，整联蛋白家族，和免疫球蛋白-超家族)之间的相互作用引发的顺序反应。不过，以前未知白三烯C4和D4在中央毛细血管的白血细胞外渗中发挥任何作用。
本发明人发现白三烯C4和D4受体拮抗剂，普仑司特竞争性对抗白三烯C4和D4受体并且有效地抑制脑炎症(中枢炎症)和脓毒病(全身性炎症)。
本发明人以前发现葡聚糖诱导的大鼠爪部水肿由普仑司特以剂量依赖型的方式抑制。以大约490mg/kg的剂量腹膜内给药，普仑司特完全抑制葡聚糖诱导的爪部水肿。这提示白三烯C4和D4受体拮抗剂作用于毛细血管的内皮细胞中并抑制由葡聚糖诱导的毛细血管的增加的通透性。
白三烯C4和D4受体拮抗剂普仑司特的作用位点在毛细血管内腔内侧(包括毛细血管内皮细胞)。因为普仑司特并不穿过或仅仅极小量穿过血脑屏障，普仑司特的抗炎效应归因于(提高的)毛细管通透性的抑制以及包括白血细胞黏附到毛细血管内皮细胞上和白血细胞的经内皮迁移的在毛细血管内腔中的白血细胞外渗的抑制。因而，普仑司特制脑部炎症，而不会穿过血脑屏障。在提高了血脑屏障通透性的脑部炎症中，血浆中的普仑司特能够穿过已经提高了通透性的血脑屏障并且被递送到发炎区域。
在一般的毛细血管中，普仑司特的作用位点基本上与中央毛细血管中的相同，即，普仑司特通过抑制毛细血管内腔中的白血细胞外渗具有抗炎作用，所述外渗包括白血细胞黏附到毛细血管内皮细胞上，和白血细胞的经内皮迁移。不过，它可以更加广泛地分布在外周组织中，因为与中央毛细血管的结构相比，一般性毛细血管的结构具有更多的开口，如细胞内裂口，胞饮作用，和窗状开口。
如下面给出的数据所证明的，普仑司特的作用机制在外周以及中枢，在毛细血管后微静脉稳定内皮细胞，并且在炎症过程的第一阶段抑制通透性。炎症反应发生在三个不同的阶段，每一个阶段显然是由不同的机制介导的：
1.急性短暂第一阶段-血管舒张和提高的毛细血管渗透。
2.延迟的亚急性第二阶段-白细胞和吞噬细胞的渗透(白血细胞外渗)；和
3.慢性增殖第三阶段-组织恶化和纤维化。
在延迟的亚急性第二阶段，有四个连续的重叠步骤：(1)滚动，其中e-和p-选择蛋白出现在激活的内皮细胞上来通过唾液酸-Lewisx和唾液酸-Lewisa抗原与白细胞相互作用；(2)激活；(3)吸住/黏附；和(4)经内皮迁移。e-和p-选择蛋白在转移过程中还可以与肿瘤细胞相互作用，如在上面“相关技术介绍”部分所讨论的。由于本发明人预期在炎症的白血细胞外渗和转移中的肿瘤(癌)细胞外渗之间有共同的机制，还可以使用抑制白血细胞外渗的白三烯拮抗剂，优选白三烯C4和D4受体拮抗剂，来抑制在转移过程中的肿瘤细胞外渗。
白三烯拮抗剂，优选白三烯C4和D4受体拮抗剂并且最优选普仑司特，可以用在本发明的方法中来抑制需要其的具有肿瘤的患者，或打算在将来以外科手术手段去除肿瘤的患者中的肿瘤转移。本发明还通过引起白三烯拮抗剂接触内皮细胞以便由此阻抑肿瘤细胞黏附到接触白三烯拮抗剂的内皮细胞上和/或抑制肿瘤细胞以经内皮迁移形式存在的毛细管通透性，来抑制肿瘤细胞黏附到内皮细胞，优选毛细血管内皮细胞，和/或抑制肿瘤细胞以经内皮迁移形式存在的毛细管通透性。
用于本发明方法中的优选的白三烯C4和D4受体拮抗剂包括普仑司特(ONO-1078；Ono Pharmaceutical Company，Osaka，日本)，扎鲁司特和孟鲁司特或其药用盐和/或水合物。普仑司特，孟鲁司特，和zalfirluka的化学结构在下面显示。
Figure BDA00002181402400111
普仑司特
Figure BDA00002181402400112
孟鲁司特
Figure BDA00002181402400113
扎鲁司特
药用盐包括碱金属如锂，钠，钾，等，碱土金属如镁，钙，等，和铝。其它合适的白三烯C4和D4受体拮抗剂的非限制性的实例包括化合物，8-[2-(E)-[4-(4-氟苯基)丁氧基]苯基]乙烯基]-4-氧代-2-[5-1H-四唑基]-4H-1-苯并呋喃钠盐(MEN-91507；Menarini)，CR-3465(Rottapharm)，KP-496(Kaken Pharmaceutical)，4-[6-乙酰基-3-[3-[(4-乙酰基-3-羟基-2-丙基苯基)硫代]丙氧基]-2-丙基苯氧基]丁酸(MN-002；Kyorin Pharmaceutical；美国专利4,985,585)，和(R)-3-甲氧基-4-[1-甲基-5-[N-(2-甲基-4，4，4-三氟丁基)氨基甲酰基]吲哚-3-基甲基]-N-(2-甲基苯基磺酰基)苯甲酰胺(MCC-847；AstraZeneca；EP531078)。
尽管普仑司特，白三烯C4和D4受体拮抗剂是用于本发明的方法中的最优选的白三烯拮抗剂，在结构上类似于普仑司特并且具有抑制肿瘤细胞黏附到内皮细胞和/或抑制毛细管通透性以阻止肿瘤细胞的经内皮迁移的特性的另一组优选的白三烯C4和D4受体拮抗剂化合物也包括在本发明的用途之中。该组优选的化合物是具有通式(I)的化合物
Figure BDA00002181402400121
其中：
R1，R2，R3，R4和R5是相同或不同的，并且是氢，卤素，羟基，氨基，羧基，硝基，氰基，低级烷基，低级烷氧基，低级烷酰基，低级烷酰氧基，低级烷氧基羰基，单或二低级烷基取代的氨基，芳烷基，芳基，或杂芳基；Q是羧基，低级烷氧基羰基，或四唑基；
X是氧、硫或-NR-(其中R是氢或低级烷基)；
Z是氢或低级烷基；并且m是1-6的整数。
在式(I)的化合物中，其中R1，R2，R3，R4和R5是氢，Q是四唑基，X和Y是氧，Z是氢并且m＝4的化合物是如下显示的普仑司特。
Figure BDA00002181402400122
式(I)的化合物的取代基另外如下定义：
卤素是氟，氯，溴或碘；在术语“低级烷基”，″低级烷氧基″，″低级烷氧基羰基″，″单或二低级烷基取代的氨基″中适合的“低级烷基”可以是直链或支链的诸如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，己基，异己基，环丙基，环丁基，2-甲基环丙基，环丙基甲基，环戊基，环己基，等；在术语″低级烷酰基″中的适合的″低级烷酰基″和″低级烷酰氧基″可以是直链的或支链的或烷酰氧基的环，例如，甲酰基，乙酰基，丙酰基，丁酰基，异丁酰基，戊酰基，异戊酰基，新戊酰基，己酰基，环丙基羰基，环丁基，2-甲基环丙基，环己基羰基等；芳烷基是C7-C20的芳烷基原子团，例如苯甲基，乙氧苯基，α-甲基苯甲基，二苯甲基三苯甲基，萘基甲基，等；芳基是C6-C14的芳基原子团，例如苯基和萘基；和
杂芳基是C3-C8的杂芳基并且是包含相同或不同的1-4个N原子，氧原子或硫原子的单环，多环或合并的环，例如，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-喹啉基，3-喹啉基，4-喹啉基，5-喹啉基6-喹啉基，7-喹啉基，8-喹啉基，2-吲哚基，3-吲哚基，4-吲哚基，5-吲哚基，6-吲哚基，7-吲哚基，2-联糠酰，3-联糠酰，2-tieril，3-tieril，2-吡咯烷基，3-吡咯烷基，2-咪唑基，4-咪唑基，5-咪唑基，2-噁唑基，4-噁唑基，5-噁唑基，2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，等
除了优选的白三烯C4和D4受体拮抗剂之外的白三烯拮抗剂/抑制剂的非限制性实例包括四唑衍生物作为白三烯D4和H1拮抗剂(EP0905133A1)，噻唑基苯并呋喃衍生物(EP 0528337A1)，喹啉衍生物作为白三烯D4拮抗剂，lipoxinA4和衍生物作为白三烯D4拮抗剂(美国专利5,079,261)，echinacea作为白三烯拮抗剂(WO 99/21007)，16羟甘碳四烯酸(WO 99/59964)的类似物，和抑制5-脂加氧酶的拮抗剂。
已经发现白三烯C4和D4受体拮抗剂普仑司特是安全的(LD50＞2000mg/kg(p.o.)和(s.c.)在大鼠和小鼠二者中)。单次施用普仑司特(30mg/kg，100mg/kg，300mg/kg，1000mg/kg；p.o.)，以及重复施用普仑司特(30mg/kg/天，100mg/kg/天，300mg/kg/天，1000mg/kg/天；p.o.)持续三个月和六个月之后，与对照组的那些相比，大鼠显示正常的行为，体重变化，和食物摄入。单次施用和重复施用普仑司特的尿检和组织病理学检查的结果也是正常的。在施用(p.o.)后一小时达到普仑司特(以20mg/kg施用)的最大血液浓度并且保持至少5小时。不过，在施用这样低剂量的普仑司特之后24小时没有观察到普仑司特(数据来自Ono Pharmaceutical Company)。
如上所述，普仑司特的抗炎作用抑制p-选择蛋白和/或e-选择蛋白，内皮细胞上的白细胞特异性细胞黏附分子(CAMs)的表达或对抗在毛细血管内腔中白血细胞外渗期间发挥重要作用的白三烯C4和D4受体。
根据本发明的方法，抑制肿瘤转移的白三烯拮抗剂的有效剂量的大小可以随着要治疗的病症严重性和给药途径而变化，所述给药途径优选是口服的。因此，给药最优选全身给药。剂量，或许是给药频率，也将根据年龄，体重，和个体患者的反应而变化。通常，合适的白三烯拮抗剂口服每日剂量范围可以由本领域技术人员轻易确定。例如，对于目前用于治疗哮喘的已知白三烯抑制剂的合适剂量，见Physician′s Desk Reference，54thEdition，Medical Economics Company Inc.(2000)。对于白三烯C4和D4受体拮抗剂，可以适当地选择口服每日剂量范围。具体地对于普仑司特来说，可接受的剂量优选100mg/天-2000mg/天，更加优选200mg/天-1000mg/天，最优选400mg/天-800mg/天。对于孟鲁司特来说，剂量范围优选5mg/天-100mg/天，更加优选5mg/天-50mg/天，最优选10mg/天-20mg/天。对于扎鲁司特来说，剂量范围优选10mg/天-300mg/天，更加优选20mg/天-150mg/天，最优选40mg/天-80mg/天。
另外推荐儿童，年龄65岁或更大的患者，以及有肾或肝功能损害的患者一开始接受低剂量，并且随后基于个体反应或血液中的剂量水平来逐步提高用量。对于本领域技术人员来说，显而易见，在一些情况下使用这些范围之外的剂量可能是必需的。另外，将要理解的是临床医师或治疗医师结合个体患者反应将会知道如何以及何时调节，中断，或终止治疗。
对于大多数当前已有的白三烯拮抗剂来说，目前最常用的剂型是口服剂型，因为需要溶于胃酸。剂型可以包括片剂，药片，胶囊，软胶囊，锭剂等。由于它们施用的便易性，片剂和胶囊代表了最有利的口服剂量单位形式，其中采用固体药物载体。在患者无意识的情况下，给药可以优选通过向胃中加套管。如果需要，可以通过标准的水性或非水性技术给片剂加包衣。至少一种当前已有的白三烯C4和D4受体拮抗剂，即，顺尔宁(孟鲁司特)，可以进行静脉内给药。给药可以一天进行一次。
本发明进一步提供了筛选毛细管通透性抑制剂的方法，其中抑制肿瘤细胞由毛细血管到脑脊髓液的经内皮迁移。这种筛选方法包括首先向非人哺乳动物如大鼠，小鼠，沙鼠，狗，猫，兔，猴等施用潜在的候选抑制剂化合物，短时间之后向非人哺乳动物静脉内施用肿瘤细胞，以及后来通过穿过脑硬脑膜实质的套管向非人哺乳动物蛛网膜下隙施用引发毛细管通透性提高的炎症诱导剂。施用炎症诱导剂后，收集脑脊髓液并将收集自蛛网膜下隙的从毛细血管中外渗入脑脊髓液中的肿瘤细胞量与对照相比较，所述对照没有施用潜在的抑制剂化合物，以确定潜在的抑制剂化合物是否是肿瘤细胞毛细管通透性的抑制剂。这种方法任选地包括测量收集的脑脊髓液的量(体积)，其中收集的脑脊髓液体积越大，毛细血管越有浸透性。优选的非人哺乳动物是大鼠。
炎症诱导剂的实例包括花生四烯酸，前列腺素，血栓烷，组胺，酵母，LPS，葡聚糖，缓激肽，角叉藻聚糖，白三烯，TNF-α，白介素-1β或白介素-6。其中，优选低分子量化合物如花生四烯酸。
向非人动物施用潜在候选抑制剂化合物的方法并不特别受限，并且考虑例如，潜在候选抑制剂化合物的化学特性(如脂溶性等)，可以适当地选自已知的给药方法，如口服给药，皮下给药，腹膜内给药，静脉内给药，肌内给药，鼻(滴鼻剂)给药，吸入，舌下给药，栓剂给药等。评估潜在候选抑制剂化合物是否能够作用于覆盖在毛细血管内腔上的内皮细胞以抑制提高的毛细管通透性，并且通过测量肿瘤细胞计数和/或收集的脑脊髓液的量可以指导肿瘤细胞从毛细血管渗透到组织中。不过，优选将脑脊髓液中的肿瘤细胞计数与脑脊髓液的量一起测量。此外，优选随时间收集脑脊髓液，例如，每30分钟或一小时，并且相对于对照(没有施用潜在候选抑制剂化合物)评估所述值。当施用潜在候选抑制剂化合物抑制脑脊髓液的外渗并抑制如在对照中观察到的脑脊髓液中白血细胞的存在时，则潜在候选抑制剂化合物可以被视为提高的毛细管通透性(特别是以肿瘤细胞的经内皮迁移形式)的抑制剂并且当在导入炎症诱导剂之前施用抑制剂化合物时，可以用作抑制提高的毛细管通透性的预防剂。
现在已经一般性介绍了本发明，通过参照下列实施例可以更加容易地理解它，所述实施例是通过例示的方式提供的并且并不意欲成为本发明的限制。给出实施例1-4以显示白三烯C4和D4受体拮抗剂的抗炎效应的作用模式是归因于它的抑制毛细管通透性的提高以及毛细血管内腔中白血细胞外渗的能力，所述毛细血管内腔包括毛细血管内皮细胞。
实施例1：外周研究
本发明人发现葡聚糖诱导的大鼠爪部水肿由普仑司特以剂量依赖型的方式抑制。以大约490mg/kg的剂量，腹内给药普仑司特完全抑制葡聚糖诱导的爪部水肿(图2)。
这提示LT拮抗剂可以作用于外周毛细血管中的内皮细胞上并抑制由葡聚糖诱导的毛细血管通透性提高。尽管在毛细血管里内皮细胞之间有许多开口如裂隙，窗状开口和胞饮囊泡，普仑司特抑制毛细血管的通透性。由于脑毛细血管里的内皮细胞因为紧密连接的存在而比其它毛细血管具有更少的开口，普仑司特可以比抑制一般性毛细血管的通透性更有效地抑制脑毛细血管的通透性。所以，预计这种机制也可以在CNS水平上发挥作用。
实施例2：测量炎症过程中的变化的测量
为了研究白三烯拮抗剂在治疗炎症中的作用，发展了一种敏感和定量的方法来测量中枢神经系统的炎症。可以监测炎症过程中的重要变化，因为由花生四烯酸引发的血脑屏障(BBB)的通透性和白血细胞(WBC)渗透到脑脊髓液(CSF)中都可以由相同的实验动物进行测量。特别地，利用这种方法研究白三烯C4和D4拮抗剂，普仑司特的作用。观察到在炎症过程中BBB的通透性以及由施用花生四烯酸作为伤害性刺激引发的白血细胞(WBC)的渗透的变化。
材料和方法
以50mg/kg的剂量戊巴比妥钠腹膜内(i.p.)麻醉雄性大鼠，大约350-400g。随后将动物置于立体定位装置中。剃刮从头到颈的顶部的毛。用70％乙醇然后用10％providone-碘溶液对研究区域消毒。切开颈索上的皮肤和肌肉直到暴露颈椎。利用23G3/4针经由小脑延髓池穿过硬脑膜制造一个孔。将2-3mm PE10套管(0.011″I.D.，0.007″厚，0.024″O.D.，6.5cm长)的一端插入颈索上的蛛网膜下隙从而避免损伤神经组织(图3)。用氰基丙烯酸胶将套管固定到外周组织上。用PE10的另一端来施用伤害性刺激，如花生四烯酸(AA；3.25μg/2μl)，并且随后在11小时的实验期间此后每三十分钟收集脑脊髓液(CSF)。在插入套管后所述套管立即充满了CSF。
灌注空气以便将AA注入蛛网膜下隙。用外科手术针缝合肌肉和皮肤。随后将大鼠从立体定位装置上移除并放在加热垫上，持续监测。
在相互作用研究中，在施用花生四烯酸(AA)前三十分钟，施用白三烯C4和D4拮抗剂，普仑司特(490mg/kg，i.p.)。如果麻醉的效应看起来减弱了，则施用另外的0.05-0.1ml戊巴比妥(50mg/ml，i.p.)剂量。如果在实验期间任何时候，动物看起来疼痛或痛苦，立即停止研究并将动物安乐死。
在实验后，通过在化学通风橱中于密封的瓶中暴露于高浓度的氟烷气体而将动物安乐死。
结果
在向蛛网膜下隙施用花生四烯酸(3.25μg/2μl)后CSF的体积立即增加。CSF体积在3.5小时内达到峰值(图4A和图4B)。在施用AA后4-5小时，它逐渐降低，但是观察到它在11个小时的观察期间于这一剂量水平上保持持续的水平。
在最初30分钟内未见到WBC渗透，这可能暗示了脑炎的急性短暂阶段，但是随后开始缓慢增强(图4A和4B)。此后总的WBC计数和CSF的体积的变化平行起落。这提示延迟的亚急性阶段，最大的特征是白细胞和吞噬细胞的渗透。在对照动物中既没有观察到提高的CSF也没有观察到提高的WBC计数。这是正常的状态，因为中枢神经系统的压力极低(6-10mm Hg)并且在CSF中通常没有WBCs。
在AA施用(3.25μg/2μl)前三十分钟用白三烯C4和D4受体拮抗剂，普仑司特(490mg/kg i.p.)进行预处理完全抑制了CSF体积的提高(n＝4)(图5)。这显示普仑司特阻抑脑毛细血管中内皮细胞通透性，以及白血细胞渗透的提高。
实施例3.白三烯受体拮抗剂，普仑司特的效应的研究
在炎症期间评估脑毛细血管中内皮细胞通透性，以及白血细胞渗透的提高
利用上述方法，有可能在相同动物中测量随着时间通透性的变化。没有其它方法能够利用这种相同动物随时间测量炎症，并且作为结果，必须在某一时期处死至少四只动物(以取得统计学显著性)。例如，如果必须在10小时内每30分钟研究炎症的过程(每30分钟n＝4)，那么将需要处死80只大鼠。注意到这种方法不仅提供了关于脑毛细血管通透性变化，还关于WBC渗透入CNS中的变化的信息是重要的。
为了利用这种方法获得WBC渗透入CNS中的数据，只需要四只大鼠，避免了不同时期在个体动物之间的差异。只有这种方法可以定量地测量脑毛细血管的通透性，以及WBC渗透入CNS，并且可以提供炎症过程的更加完全的描绘。
在本研究中，由同一大鼠在11小时内每30分钟测量脑脊髓液(CSF)的体积(μl)和CSF中白血细胞(WBC)计数。在戊巴比妥麻醉下将套管(PE10)的一侧插入蛛网膜下隙，避免了神经损伤(图3)。如果脑组织受到损伤，则CSF的体积和WBC立即升高，而无需施用花生四烯酸。由于在正常大鼠的CSF中没有WBC，只使用在插入套管后即刻在CSF中没有WBC的大鼠。套管的另一侧保持开放并且用于施用伤害性刺激(花生四烯酸，LPS，葡聚糖，等)并随后在实验过程中每30分钟收集CSF。利用微量吸液管测量CSF体积并通过血球计的方法计数CSF中的WBC。
花生四烯酸(32μg/2μl)在施用后立即提高了CSF体积，其中在3.5小时内达到最大体积100-120μl。尽管此后体积减小，但在施用后4.0-5.0小时期间每30分钟保持60-80μl的CSF体积。在施用花生四烯酸的最初三十分钟不能检测WBC，但是随后观察到逐渐升高。WBC的升高或降低后接着CSF体积随着时间的变化。
在将花生四烯酸应用到蛛网膜下隙中之前三十分钟腹膜内施用普仑司特(490mg/kg)。普仑司特完全抑制了CSF体积和脑毛细血管通透性的提高，其标志是WBC渗透。
该方法表征了如上所述的第一和第二炎症阶段，特征为局部血管舒张和毛细管通透性提高的急性短暂阶段(第一阶段)和延迟的亚急性阶段，其最主要的特征为白细胞和吞噬细胞的渗透(第二阶段)。
不像具有裂口，窗状开口和突出的胞饮囊泡的一般性毛细血管，脑毛细血管具有胞饮囊泡的相对缺失，线粒体数目的极大提高，和毛细血管中紧密连接的存在。已知白三烯受体拮抗剂以极小的水平穿过BBB，如果有的话。这些研究的发现提示白三烯受体拮抗剂在外周抑制脑毛细血管中内皮细胞的通透性。内皮细胞彼此紧密并列并形成紧密连接。与一般性毛细血管上的内皮细胞相比，在“内侧”脑毛细血管上的这些内皮细胞不太可能渗漏，因为一般性毛细血管具有裂口通道，窗状开口和突出的胞饮囊泡。
通过白三烯C4和D4受体拮抗剂治疗脑炎症可能归因于在毛细血管内腔和BBB之间的内皮细胞的通透性的外周抑制。所以，这种降低脑毛细管通透性和抑制WBC渗透入中枢神经系统的能力在治疗上可能比能够穿过BBB或打开BBB以便让药物接近脑炎的药物更加重要。一旦打开，BBB通透性将提高并有助于形成脑水肿，因为脑毛细血管的压力高于颅内压。另外，血液成分渗透到中枢神经系统恶化了脑炎症。
这些方法提供了如下的新发现：
(1)通过这些方法可以随着时间定量测量炎症过程(阶段1和阶段2)；和
(2)普仑司特抑制二次脑损伤等。
实施例4：普仑司特和其它抗炎药物对于大鼠中外伤性脑损伤模型的 影响
已经发现普仑司特的预处理导致大鼠局部缺血模型的更长存活，所述模型利用可逆的两侧颈动脉的30分钟闭塞后接再灌注。当在闭塞之间30分钟施用普仑司特(450mg/kg i.p.)时4-5只大鼠的其中之一存活一周。
此外，通过在未经阉割的狗中，用普仑司特预处理(以三种不同的剂量施用)来抑制由白介素-6引发的WBC向CSF的增加的渗透。
本发明人已经发现白三烯C4和D4拮抗剂，普仑司特(450mg/kg.i.p.)完全抑制由花生四烯酸(3.25μg/2μl)导致的炎症。这种炎症是BBB的增加的通透性和WBC向CSF的增加的渗透的基础。因此，白三烯C4和D4拮抗剂(普仑司特)有效用于治疗炎症。
实施例5：在大鼠中对转移的抑制的体内研究
在用在该研究中的实验模型中，测量通过套管从来自蛛网膜下隙的CSF，白血细胞和癌细胞的体积。该实验模型充当转移的新的实验模型。
为了测试对于转移的抑制，在静脉内注射癌细胞之前，口服施用普仑司特(取代如在实施例2中进行的腹膜内抑制)。接着，在普仑司特施用后2小时，接着将花生四烯酸(AA)施用到蛛网膜下隙。每30分钟测量CSF的体积，在CSF中的白血细胞计数和癌细胞计数。使用这种新的转移实验模型，在CSF中癌细胞的不存在证实普仑司特抑制转移。
材料和方法
细胞和培养条件
培养的人癌细胞系，Colo 201(结肠癌)和MKN74(肺癌)，和培养的大鼠癌细胞系RCN9购自Health Science Research Resources Bank(Rinku-minamihama 2-11，Sennan-shi，Osaka，590-0535，Japan)。人肺癌细胞系QG56由Dr.Yukito Ichinose，Department of Laboratory Medicine，KyusyuCancer Center，Hukuoka，Japan惠赠。将细胞在37℃和5％CO2，培养于添加了5％胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，100单位青霉素，100μg/ml链霉素(Gibco Invitrogen Corp.，Grand Island，N.Y.，USA)的RPMI-1640(SIGMA，MO，USA)中。
动物
RCN-9，一种来自Fisher 344雄性大鼠(体重400±50g)的结肠癌细胞系和Fisher 344雄性大鼠购自Sankyou Lab-Service Co。
化学品
戊巴比妥钠(Nembutal注射剂)，一种Abbott Laboratories(Abbott Park，IL，USA)的产物，和PKH67绿色荧光细胞连接试剂盒，一种Zynaxis CellScience Inc的产物购自Dainippon Pharmaceutical Co.(Osaka，Japan)。来自猪肝的花生四烯酸(钠盐)获自Calbiochem(San Diego，CA，USA)。包含112.5mg/胶囊的普仑司特购自Ono Pharmaceutical Co.(Osaka，Japan)。
混杂的
由Natsume Seisakusyo Co.，供应的聚乙烯管(SP10，I.D.0.28mm，O.D.0.61mm)，肝素钠(5000单位/5ml)购自Shimizu Pharmaceutical Co.。
形态学研究
用PKH连接试剂盒对癌细胞进行染色。在体外研究中，使用荧光显微镜(Axiovert S 100；Zeiss)的癌细胞的形态外观与用光学显微镜(OlympusCX21-22S-D)的癌细胞的形态外观进行比较。放大是63x 0.5x 215/11。
用戊巴比妥钠(50mg/kg i.p.)对大鼠进行麻醉。无论动物何时从麻醉中恢复(如果动物显示任何种类的自发移动)，在实验阶段中，逐渐施用另外的戊巴比妥钠来保持深度麻醉。
暴露股静脉并且插入填充了0.002％的在盐水中的肝素的聚乙烯管。聚乙烯管的另一端与三路活栓阀连接以进行癌细胞的静脉内注射。接着，将动物置于立体定位装置(由Narishige Scientific Instrument Lab生产的SRS-6型)中。剃刮从头到颈的顶部的毛。用70％的乙醇对研究区域进行消毒。暴露在颈椎上的皮肤和肌肉。使用18Gx1 1/2针，通过大池穿过硬脑膜造成一个洞。将SP10管(5-6cm长)的一端(2-3mm)插入蛛网膜下隙。用氰基丙烯酸胶粘剂将套管固定于外周组织。使用SP10管的另一端来施用花生四烯酸(8.16ng/2μl盐水)并且随后每30分钟收集脑脊髓液(CSF)，在体内形态学研究中进行1-2小时并且在相互作用研究中进行8小时。
相互作用研究
下面，设计这种研究来阐明普仑司特，白三烯C4和D4受体拮抗剂是否抑制肿瘤细胞从毛细血管外渗。
制备
因为Onon的胶囊包含112.5mg的普仑司特，在口服施用前，立即用电动混合器将来自两个胶囊的粉末搅拌在2.295ml的去离子水中。普仑司特的施用体积是5ml/kg(剂量＝490mg/kg)。
使用PBS将癌细胞的数量制备成在每只大鼠中嗜中性粒细胞数量的1/100。因为体重(400±50g)，癌细胞的数量在1.88x104和2.43x104之间，并且将对于每只大鼠施用的癌细胞的体积调整为1ml。
将花生四烯酸溶解在盐水中，并且每只大鼠施用816.25ng/2μl。如下施用三种不同的处理；
第一次处理是普仑司特(490mg/kg p.o.)或去离子水(p.o.)。
第二次处理是用癌细胞或PBS。
第三次处理是用花生四烯酸或盐水。
第一次处理在花生四烯酸前2小时施用。第二次处理(癌细胞i.v.)在花生四烯酸前2-3分钟施用。在第一次处理和第二次处理之间，将到股静脉和到蛛网膜下隙的两个套管插入在每只动物中。
在下面的表1中显示实验计划。表的右侧的数量对应于表示结果的图的数量。每组使用四只大鼠。
表1
Figure BDA00002181402400231
测量
在第三次处理后，测量CSF的体积(μl)，WBC计数和癌细胞计数，进行8小时。
对于每只动物，计算在花生四烯酸后8小时的时间作用曲线下的面积并且使用非参数测试，Mann-Whiteney U-测试来分析普仑司特(490mg/kg)对肿瘤细胞计数，白血细胞计数和CSF的抑制作用，普仑司特(490mg/kg)抑制完全(面积为0)。为了分析作为外源物质的人癌细胞是否影响大鼠中的免疫系统，使用在时间作用曲线下的面积和变量分析(Dunnet)，将每个参数，即白血细胞计数，肿瘤细胞计数和CSF体积分别与大鼠癌细胞(RCN9)与COLO201，MKN74，和QG56的相应的参数进行比较。概率值p＜0.05是显著的。
结果
形态学研究
在脑的中枢毛细血管的表面，存在充当血脑屏障的许多沟(图6)。白血细胞，以及癌细胞能够来自血脑屏障的这些开口。
在体外研究中，在所有的癌细胞，即Colo201，MKN74，QG56，和RCN9中，可以通过细胞膜观察到染色体。然而，在体内研究中施用花生四烯酸后，在从毛细血管转移到组织中后(在CSF的情况中)，那些细胞并没有显示任何染色体。在外渗过程中，癌细胞的形状从球形改变为平方形(图7A-7C)。癌细胞在花生四烯酸处理后立即迁移，随后是白血细胞的转移。还观察到白血细胞在它们附着在毛细血管上，但是不是在经内皮迁移后具有正方形(图7A-7C)。如在图7C中所显示，似乎在开始它们的经内皮迁移之前，癌细胞黏附于在内皮细胞上的CAM。这种现象可能对于癌细胞与对于白血细胞(嗜中性粒细胞)是相同的，如通过附着于CAM或内皮细胞的嗜中性粒细胞的正方形所观察到的(图7A和7B)。存在四个粘着位点，给出正方形外观。
相互作用研究
无论是蒸馏水，PBS还是盐水(蒸馏水-PBS-盐水)都不具有任何效果(图8)。尽管癌细胞存在于血管中，在没有用花生四烯酸处理的情况下，在毛细管通透性或在白血细胞或癌细胞，即，Colo201(蒸馏水-Colo201-盐水)，MKN74(蒸馏水-MKN74-盐水)，QG56(蒸馏水-QG56-盐水)和RCN9(蒸馏水-RCN9-盐水)的转移中没有发生增加，其中癌细胞被施用来取代PBS，但是具有在图8中显示的与PBS相同的反应(没有影响)。
毛细管通透性在花生四烯酸后立即增加并且白血细胞的外渗在花生四烯酸处理(蒸馏水-PBS-花生四烯酸；图9)后30分钟立即开始。在8小时的观察阶段中观察到这些现象，并且在时间作用曲线下的面积与对照的毛细管通透性比较具有统计学上的显著性(蒸馏水-PBS-盐水)。
蒸馏水-Colo201-花生四烯酸；蒸馏水-MKN74-花生四烯酸；蒸馏水-QG56-花生四烯酸；和蒸馏水-RCN9-花生四烯酸的施用诱导肿瘤细胞外渗(图10A)，毛细管通透性(图10B)，和白血细胞(图10C)的增加。
关于普仑司特本身，不存在任何作用。所述图表与图8相同，除了普仑司特取代蒸馏水。当癌细胞在没有花生四烯酸的情况下存在于血管中时，即普仑司特-Colo201-盐水，普仑司特-MKN74-盐水，普仑司特-QG56-盐水，和普仑司特-RCN9-盐水，普仑司特也不具有任何作用(与在图8的图表中相同的反应)。
然而，普仑司特的施用抑制由花生四烯酸的施用引发的增加的毛细管通透性和白血细胞的外渗(图11)。此外，当存在肿瘤细胞时，普仑司特在施用花生四烯酸后，明显地不仅抑制增加的毛细管通透性，还抑制肿瘤细胞的外渗，即，Colo201(普仑司特-Colo201-花生四烯酸)，MKN74(普仑司特-MKN74-花生四烯酸)QG56(普仑司特-QG56-花生四烯酸)和RCN9(普仑司特-RCN9-花生四烯酸)，它们都显示如在图11中的反应。
分析三种人癌细胞作为外源物质对大鼠免疫系统的影响。分析RCN9关于肿瘤细胞外渗(图12A)，CSF体积(图12B)和WBC计数(图12C)的结果，并且与来自Colo201(蒸馏水-Colo201-花生四烯酸)，MKN74(蒸馏水-MKN74-花生四烯酸)和QG56(蒸馏水-QG56-花生四烯酸)的结果进行比较。发现Colo201癌细胞而不是其它两种类型的癌细胞的经内皮迁移与RCN9的经内皮迁移比较具有显著的增加(图12A)。然而，没有观察到关于RCN9(蒸馏水-RCN9-花生四烯酸)获得的增加的毛细管通透性和白血细胞计数分别与关于Colo201(蒸馏水-Colo201-花生四烯酸)，MKN74(蒸馏水-MKN74-花生四烯酸)和QG56(蒸馏水-QG56-花生四烯酸)获得的那些具有显著不同(图12B和12C)。在MKN74(蒸馏水-MKN74-花生四烯酸)的情况中，与无癌细胞情况下的白血细胞的外渗(蒸馏水-PBS-花生四烯酸；图9)相比，更早的观察到白血细胞的外渗(在花生四烯酸后的30分钟内；图10C)。
讨论
普仑司特，一种白三烯C4和D4受体拮抗剂，不穿过血脑屏障抑制了毛细管通透性和白血细胞的外渗。这显示普仑司特的作用方式是外周的并且来自包括内皮细胞和毛细血管内腔的血管的内部。
形态学研究显示两种肿瘤细胞和白血细胞通过在中枢毛细血管中的血脑屏障的开口迁移和通过介于外周毛细血管的内皮细胞之间的开口迁移。
癌细胞改变它们形状，诸如形成纤细形状和方形的形状的能力对于它们从毛细血管向组织中的转移是有益的。癌细胞的纤细形状可以容易地通过开口，甚至即使所述开口实际上很窄，因为平伸的癌细胞的内方角在起始通过窄开口的经内皮迁移中是有利的。
普仑司特抑制肿瘤细胞转移的原理可能是由于保持所述开口闭合。事实上，在图7A和7B中的观察显示，与仍旧附着于内皮细胞的白血细胞相比，癌细胞开始迁移得更早。白血细胞开始外渗的起始时间可能被一些肿瘤细胞的存在所影响，如在本研究中的MKN74(图10C)。
在本研究中，使用三种不同种类的人癌细胞和一种大鼠癌细胞。观察到所有的四种不同的癌细胞从毛细血管的外渗，其中在8小时的人癌细胞Colo201的计数(＝面积)显著增加，而其它两种人癌细胞，即，MKN74和QG56的计数与RCN9没有明显不同。
由大鼠癌细胞(RCN9)获得的增加的毛细管通透性和增加的白血细胞计数与关于其它三种人肿瘤细胞获得的毛细管通透性和白血细胞计数相比，没有明显不同。这显示作为外源物质的人癌细胞可能仅对大鼠的免疫系统具有极少影响。然而，关于与在无MKN74(蒸馏水-PBS-花生四烯酸)情况下的起始时间相比，在存在MKN74(蒸馏水-MKN74-花生四烯酸；图10C)的情况下，白血细胞的外渗的起始时间间隔缩短，在用花生四烯酸处理后毛细管通透性立即增加和在花生四烯酸后30分钟白血细胞的外渗的开始图9，提示对大鼠免疫系统的影响。这种缩短的时间间隔可能是受MKN74的外渗影响，其可能在血脑屏障中造成足够大的开口以起始白血细胞的经内皮迁移。然而，分析在8小时内如通过测量在时间作用曲线下的面积所显示的总的效果，并未发现具有统计学上的显著性(图12C)。
将套管插入静脉中以将肿瘤细胞施用到血管中或施用到蛛网膜下隙中从而获得从中枢毛细血管迁移的样品诸如肿瘤细胞提供了研究肝肿瘤细胞转移的方式。就目前所知，不存在位点诸如蛛网膜下隙，其中可以计数从毛细血管中迁移出来的白血细胞或肿瘤细胞的数量。
已知癌细胞和白血细胞的表面被唾液酸Lewis所覆盖，所述唾液酸Lewis是一种糖蛋白，其在物种之间具有差异，并且是对于内皮细胞上的p-选择蛋白和e-选择蛋白的配体。因为在人癌细胞中的唾液酸Lewis可能不识别在内皮细胞上的这些选择蛋白，认为人癌细胞可能不附着于内皮细胞，并且因此，对于癌细胞难以迁移穿过毛细血管。
在本研究中，在用花生四烯酸处理后，对于所有的三种人癌细胞观察到经内皮迁移，并且所述经内皮迁移通过在大鼠中用普仑司特预处理后被抑制。因此，可以研究人肿瘤细胞在大鼠中的体内转移。
作为结论，本发明人发现：
1)普仑司特由于抑制毛细血管通透性而抑制了肿瘤细胞和白血细胞的外渗。
2)普仑司特由于其安全性和延长的作用而被用作抗-肿瘤转移剂/药物。
3)对于抗-癌转移，抑制增加的毛细管通透性是必须的。
4)因为人癌细胞可以从大鼠毛细血管迁移到组织中，可以将该动物模型用作药物的抗-癌转移性质的测定。
现在已经充分描述了本发明，对于本领域技术人员而言，可以在不背离本发明的精神和范围的前提和无过度实验下，在较宽范围的等价参数、浓度和条件范围内进行相同的发明操作。
尽管本发明已经结合其具体的实施方案进行了描述，要理解的是其可以作出进一步的修改。本申请意欲包括任何改变，应用或修改，它们通常遵循本发明的原理，并且包括与本发明公开内容不同的这样的改变，如来自与本发明领域相关的已知或习惯实践，并且可以应用于在后附的权利要求范围内提出的上文的必要技术特征。
将本文引用的所有的参考文献，包括定期刊物文章或摘要，公开的或相应的美国或外国专利申请，授权的美国或外国专利，或任何其它参考文献完全并入本文作为参考，在引用的文献中包括所有的数据、表、图和正文。此外，在本文引用的参考文献中引用的参考文献的全部内容也被并入本文作为参考。
对已知方法步骤、常规方法步骤、已知的方法或常规方法的参考决不以任何方式承认本发明的任何方面、描述或实施方案在相关领域中被公开、教导或提示。
前述具体实施方案的描述是这样充分地揭示了本发明的一般性质，从而使其它人可以通过应用本领域中的知识(包括本文引用的参考文献的内容)在不背离本发明的一般概念和不需过度实验的情况下，容易地改进和/或修改这些具体实施方案的各种应用。因此，这些修改和改进意欲基于本文提出的教导和指导，在公开的实施方案的等价物的含义和范围内。要理解的是，本文的措词或术语是出于描述的目的而不进行限制，因此本说明书的术语或措词将由本领域技术人员根据本文提出的教导和指导，结合本领域技术人员的知识来解释。
因此，如可以在上面的说明书和/或在下面的权利要求中发现的，后接功能陈述的表示方式“意味着”和“表示”或任何方法步骤语言意欲定义和覆盖任何结合、物理、化学或电学组件或结构，或任何方法步骤，其可以在目前或在未来存在，进行列举的功能，不管是否正好等价于上面的说明书公开的一种或多种实施方案，即，可以使用进行相同功能的其它方式或步骤；并且这样的表达方式将给出它们最宽泛的解释。
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Claims (15)

1.白三烯C4和D4受体拮抗剂或其药用盐用于制备或生产药物的应用，所述药物用于在不存在具有抗-肿瘤细胞黏附，抗-侵入或抗转移性质的任何其它化合物的情况下抑制肿瘤转移。
2.权利要求1的应用，其中所述白三烯C4和D4受体拮抗剂，或其药用盐用于口服施用。
3.权利要求1的应用，其中所述白三烯C4和D4受体拮抗剂是式(I)的化合物：
Figure FDA00002181402300011
其中：
R1，R2，R3，R4和R5是相同或不同的，并且是氢，卤素，羟基，氨基，羧基，硝基，氰基，低级烷基，低级烷氧基，低级烷酰基，低级烷酰氧基，低级烷氧基羰基，单或二低级烷基取代的氨基，芳烷基，芳基，或杂芳基；
Q是羧基，低级烷氧基羰基，或四唑基；
X是氧、硫或-NR-(其中R是氢或低级烷基)；
Z是氢或低级烷基；和
m是1-6的整数。
4.权利要求3的应用，其中所述白三烯C4和D4受体拮抗剂是普仑司特。
5.权利要求1的应用，其中所述白三烯C4和D4受体拮抗剂是孟鲁斯特。
6.白三烯C4和D4受体拮抗剂或其药用盐用于制备或生产药物的应用，所述药物用于抑制没有同时进行外科手术操作的需要其的受试者的肿瘤转移。
7.权利要求6的应用，其中所述白三烯C4和D4受体拮抗剂，或其药用盐用于口服施用。
8.权利要求6的应用，其中所述白三烯C4和D4受体拮抗剂是式(I)的化合物：
Figure FDA00002181402300021
其中：
R1，R2，R3，R4和R5是相同或不同的，并且是氢，卤素，羟基，氨基，羧基，硝基，氰基，低级烷基，低级烷氧基，低级烷酰基，低级烷酰氧基，低级烷氧基羰基，单或二低级烷基取代的氨基，芳烷基，芳基，或杂芳基；
Q是羧基，低级烷氧基羰基，或四唑基；
X是氧、硫或-NR-(其中R是氢或低级烷基)；
Z是氢或低级烷基；和
m是1-6的整数。
9.权利要求8的应用，其中所述白三烯C4和D4受体拮抗剂是普仑司特。
10.权利要求6的应用，其中所述白三烯C4和D4受体拮抗剂是孟鲁斯特。
11.白三烯C4和D4受体拮抗剂或其药用盐用于制备或生产药物的应用，所述药物用于抑制肿瘤细胞黏附到内皮细胞和/或抑制以肿瘤细胞的经内皮迁移形式的毛细管渗透性，所述C4和D4白三烯拮抗剂，或其药用盐与内皮细胞接触从而抑制毛细管渗透性和/或肿瘤细胞黏附到与白三烯C4和D4受体拮抗剂接触的内皮细胞上。
12.权利要求11的应用，其中所述白三烯C4和D4受体拮抗剂，或其药用盐用于口服施用。
13.权利要求11的应用，其中所述白三烯C4和D4受体拮抗剂是式(I)的化合物：
Figure FDA00002181402300031
其中：
R1，R2，R3，R4和R5是相同或不同的，并且是氢，卤素，羟基，氨基，羧基，硝基，氰基，低级烷基，低级烷氧基，低级烷酰基，低级烷酰氧基，低级烷氧基羰基，单或二低级烷基取代的氨基，芳烷基，芳基，或杂芳基；
Q是羧基，低级烷氧基羰基，或四唑基；
X是氧、硫或-NR-(其中R是氢或低级烷基)；
Z是氢或低级烷基；和
m是1-6的整数。
14.权利要求13的应用，其中所述白三烯C4和D4受体拮抗剂是普仑司特。
15.权利要求11的应用，其中所述白三烯C4和D4受体拮抗剂是孟鲁斯特。
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