KR20070051855A - 종양 세포의 전이를 저해하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 류코트리엔 C4 또는 D4 길항제를 이용하여 종양 세포의 내피세포에 대한 부착을 억제함으로써 종양 세포의 혈관 밖 유출을 방지할 수 있다.
암, 전이, 모세혈관 투과성, 억제제

Description

종양 세포의 전이를 저해하는 방법{METHOD FOR INHIBITING TUMOR METASTASIS}
본 특허 출원은 종양 세포 전이를 저해하는 방법, 종양 세포의 내피 세포 조직으로의 부착을 저해하는 방법 및/또는 내피세포 사이를 통과하는 형태의 종양 세포 모세혈관 투과를 저해하는 방법에 관한 발명이다.
아라키돈산(arachidonic acid, AA)은 기계적, 열, 화학적, 세균성 손상과 같은 다양한 손상에 대응하여 세포막의 인지질로부터 세포질로 방출되는데, 그 대사 산물들(아이코사노이드(eicosanoid)계 화합물, 프로스타글란딘(prostaglandin)과 류코트리엔(leukotriene)류)은 여러 분야에서 생물학적으로 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다. 대부분의 아이코사노이드계 화합물은 염증, 통증, 발열 반응을 심화시키는데, 따라서 소염제와 진통제 분야의 연구에서는 이들 화합물에 대한 광범위한 연구가 진행되어 왔다. 예를 들어 코르티손(cortisone)과 같은 스테로이드성 소염제는 막 인지질로부터 아라키돈산을 생성하는 인지질 분해 효소 (phospholipase)를 억제함으로써 효과를 나타낸다. 아스피린이나 이부프로 펜(ibuprofen)과 같은 진통제는 아라키돈산을 아이코사노이드계 화합물, 프로스타글란딘류, 프로스타사이클린(prostacyclin)류와 트롬복산(thromboxane)류로 변환하는 효소인 사이클로옥시제나아제(cyclooxygenase)를 억제함으로써 작용한다.
한편 프로스타글란딘류와 류코트리엔류는 말초신경계와 중추신경계 양쪽에서 염증이 일어나는데 이바지한다는 것이 알려져 있다. 지난 30년간의 연구에도 불과하고 정확히 프로스타글란딘류 화합물이 어떻게 염증 발생에 관여하는지는 아직 명확하지 않다. 이와는 대조적으로 류코트리엔 수용체 길항제를 이용한 최근의 연구결과는 이러한 염증 발생 과정에서 류코트리엔이 중요한 역할을 한다는 것을 가리키고 있다.
류코트리엔은 강력한 지질성 매개 인자로서 시스테인 작용기의 존재 여부에 따라 두 부류로 나뉜다. 류코트리엔 B4는 시스테인기를 가지지 않지만 류코트리엔 C4, D4, E4와 F4는 이 작용기를 지닌다. 이 화합물들은 1980년대 초반부터 염증 이자로 인식되어 왔다 (von Sprecher 외, 1993과 Piper, 1984).
1990년대에 류코트리엔 길항제로 알려진 수많은 약물이 발견되었는데, 이들은 체내 류코트리엔의 활성을 억제하고 저해할 수 있는 분자들이었다. 본 명세서에서 "류코트리엔 길항제"는 의학계에서 흔히 쓰이는 의미대로, 자연계에 존재하는 류코트리엔의 한 유형 또는 그 이상의 유형에 대하여 그 농도, 활성 또는 작용을 억제하거나, 차단하거나 감소시키는 약물을 가리킨다. 그러나 이러한 류코트리엔 길항제는 그 작용 기전에 따라 두 가지 부류로 나눌 수 있는데, 한 부류는 5-지질산화효소 (5-lipoxygenase)를 억제하고 다른 부류는 류코트리엔 수용체를 경쟁적으로 길항(competitively antagonise)한다. 류코트리엔 길항제의 일종인 프란루카스트(pranlukast)는 오로지 류코트리엔 C4와 D4의 수용체에 대하여 작용한다.
뇌 염증을 치료하는데 류코트리엔 수용체 길항제를 사용하는 방법이 몇 가지 공지되어 있는데, (예를 들어 J63258-879-A, JO2-169583-A, WO9959964-A1, EP-287-471-A) 이들 공지는 길항제 모두는 혈뇌장벽(blood-brain barrier)을 통과할 것이라고 전제하고 있는 실정이다. 왜냐하면 뇌 염증을 감소시키거나, 저해하거나 또는 뇌 염증에서 오는 뇌 질환을 치료하려면 치료제 분자가 혈뇌장벽을 통과하여야만 한다는 것이 의료계의 상식이기 때문이다(Wilkinson 외, 2001). 현재까지 알려진 사실에 따르는 한, 류코트리엔 C4와 D4의 수용체 길항제들은 혈뇌장벽을 지나갈 수 없으므로 이들 길항제는 뇌 염증을 치료하거나 예방하는데 사용된 적이 없는데, 다만 예외로서 래트(rat) (Zhang 외, 2002)와 마우스(Zeng 외, 2001)의 국소 대뇌 허혈(focal cerebral ischemia)에서 류코트리엔 수용체 길항제인 프란루카스트(ONO-1078)가 신경 보호 효과를 나타낸 결과가 있다. 그러나 류코트리엔 C4 수용체 길항제와 D4 수용체 길항제는 천식 치료에 널리 쓰인다. 류코트리엔 C4, D4 수 용체 길항제 프란루카스트는 항천식제로 임상에서 쓰이며 부작용이 거의 없다고 알려져 있다. 프란루카스트는, 자피어루카스트(zafirlukast)와 몬테루카스트(montelukast)와 같은 다른 길항제들처럼 혈뇌장벽을 통과하지 않거나 하더라도 최소한의 수준에서 통과한다.
이들 길항제에 대하여 인가받지 않은 다른 치료 용도도 제시된 바 있는데, 알레르기 질환의 치료(Shih의 미국 특허 제6,221,880호)와 편두통 및 군발 두통(群發頭痛, cluster headache)의 치료(Sheftell 외 미국 특허 제 6,194,432호)가 대표적이다. Demopulos 등의 미국 특허 제 6,492,332호도 암세포 부착, 통증과 염증을 억제하기 위한 방법과 그를 위한 조성물의 발명에서 류코트리엔 수용체 길항제를 소염제로 사용한 바 있는데, 이 발명에서는 이 길항제 외에 암세포 부착 및/또는 조직 침투 및/또는 국부적 전이를 방지하는 약물을 포함하는 다른 약물을 조합하여 종양 제거 수술을 받는 환자에게 투여하였다.
급성 또는 만성 염증 부위로 백혈구가 이동하는 과정에서는 백혈구와 내피세포 사이에 부착성 상호작용과 백혈구의 이동이 관련되어 있다. 이 특이적 세포 부착은 염증성 손상에 의하여 일어나는 연속단계의 첫 단계이고, 그렇기 때문에 개체의 조절 방어 과정에 있어서 특히 중요하다. 염증 반응 과정 속의 백혈구와 내피세포 사이의 상호작용에 관련된 세포 부착 분자(cell adhesion molecule)는 현재 네 종류가 있다. (1) 셀렉틴(selectin)류 (2)셀렉틴에 대한 리간드(탄수화물과 당 단백질) (3)인테그린(integrin)류와 (4)면역글로불린 유전자 슈퍼패밀리(gene superfamily)의 일원인 인테그린 리간드들이다.
셀렉틴류 분자들은 세포 표면의 탄수화물과 결합하는 단백질로서 백혈구와 혈관 내피조직 표면의 부착을 매개한다. 예컨대 e-셀렉틴이 순환하는 중성구(neutrophil) 세포 표면에 발현된, 자신의 리간드와 결합하게 되면 구르기(rolling) 단계가 개시되는데, 구르기는 상처나 염증 부위로 이들 세포를 데려오는 과정의 초기 단계이다.
암은 선진국의 주요 사망 원인 중 하나이다. 전이(metastasis)란, 원발성 종양 (原發性腫瘍, primary neoplasm)으로부터 세포가 먼 곳으로 옮겨서 그 곳에서 생장하는 현상으로서, 암에 있어서 가장 무서운 측면이고 이러한 두려움에는 충분한 근거가 있다. 암의 초기 진단, 수술 방법, 종합적인 환자 간호, 국소적 또는 전신 보조요법에 있어서 중요한 발달이 있었음에도 불구하고 암이 사망 원인인 경우, 대부분은 통상적인 항암요법에 내성을 가지는 전이 암세포들에 의해 환자가 사망한다. 탄수화물의 매개작용에 의하여 혈관내피 표면의 셀렉틴에 종양 세포가 부착(adhesion)하는 현상이 광범위한 상피 유래 암(epithelial cancer)의 전이과정에 관여하다는 증거가 점점 나오고 있고, 이들 상피 유래 암에는 위암, 결장직장암(colorectal cancer), 췌장암, 간암, 난소암, 두경부암(頭頸部癌 head and neck cancer) 및 유방암 등이 있다.
이러한 암세포 전이 과정은 도 1에 나타내었는바,
1) 최초의 암세포 전환 이후, 이 신생 전환 세포에서 단세포적 또는 다세포적인 생장이 진행되어야 한다.
2) 종양 지름이 2 mm보다 커지려면 새로운 혈관의 형성이 광범위하게 일어나야만 한다.
3) 다양한 혈관신생인자가 합성되고 분비되면 주변 숙주조직으로부터 새로운 모세혈관망을 갖추는 데에 핵심적인 역할을 한다.
4) 서로 배타적이 아닌 여러 가지 메커니즘에 따라 일부 종양 세포가 숙주조직의 버팀질(stroma)에 국소 침투할 수 있다. 세정맥(細靜脈, venule)과 유사한 박막 림프관은 종양 세포의 침투에 대한 저항력이 거의 없고 따라서 종양 세포가 순환계로 진입하는 가장 흔한 경로를 제공한다.
5) 작은 종양 세포 덩어리들이 떨어져 나와 색전(塞栓, embolization)을 형성한다.
6) 순환계에서 종양 세포가 살아남으려면 기관의 모세혈관계 위에 달라붙어야 한다. E-셀렉틴과 P-셀렉틴은 활성화된 내피세포의 표면에 존재하고, 시알릴루이스x(sialyl-Lewisx)와 시알릴루이스a(sialyl-Lewisa) 항원을 통하여 종양 세포와 상호작용한다.
7) 혈관 밖 유출(extravasation)이 일어나고,
8) 기관 실질(實質, parenchyma)내에서 세포 증식이 일어나며 전이 과정이 완료된다.
악성 세포가 혈관내피 표면에 부착하는 데에는 염증 세포를 염증 부위로 인도하는 데 관련된 인자들과 비슷한 세포 부착 인자군이 관여한다. 셀렉틴은 내피세포 활성화(EC activation)를 시작으로 일어나는 분자 수준의 연속단계 과정에 개입한다. 셀렉틴은 구조적으로도 기능적으로도 통합된 세포 부착 분자들이다. 구조적으로 셀렉틴은 칼슘 의존성 렉틴(calcium-dependent lectin, C-lectin)과 상동성이 있는 단백질 영역(protein domain)과, 유사 표피성장인자(EGF) 단백질 영역 EGR-like domain) 및 몇 종류의 유사 보체결합 단백질 영역(complement-binding-like domain)을 지닌다 (Bevilacqua 외 1989, Johnson 외 1989, Lasky 외 1989, Siegalman 외 1989, Stoolman 1989). 기능적으로 셀렉틴은 자신의 렉틴 영역과 세포 표면의 탄수화물 리간드 사이에 일어나는 상호작용을 바탕으로 세포 결합을 매개하는 공통된 능력을 갖추고 있다 (Brandley 외 1990, Springer와 Lasky 1991, Bevilacqua와 Nelson 1993, Tedder 외 1989).
세포 부착 분자 중 셀렉틴 단백질 가족에는 현재까지 세 종류의 단백질이 밝혀져 있다. L-셀렉틴(말초림프절 인도 수용체(peripheral lymph node homing receptor, pnHR)로도 불림, LEC-CAM-1, LAM-1, gp90MEL, gp100MEL, gp110MEL, MEL-14 항원, Leu-8 항원, TQ-1 항원, DREG 항원)과 E-셀렉틴(LEC-CAM-2, LECAM-2, ELAM-1), 그리고 P-셀렉틴 (LEC-CAM-3, LECAM-3, GMP-140, PADGEM)이 있다.
탄수화물 결정 인자인 시알릴루이스a(SLea)와 시알릴루이스x(SLex)는 사람 암세포 표면에 발현되는 일이 잦은데, 이들은 혈관내피 세포 표면에 발현되는 e-셀렉틴의 리간드 구실을 한다. 이들 탄수화물 결정 인자들은 암세포가 혈관내피에 부착하는데 관여하므로 암의 전이에 이바지한다. 셀렉틴은 내피에 발현되는 세포 부착 분자로서 유도성 발현을 하며 혈구를 동원하는 데 관여한다. 이 분자들에 의한 초기 세포부착을 계기로 몇 종의 사이토킨(cytokine)의 작용을 거쳐 인테그린(integrin) 분자가 활성화된다. 암세포 표면에 이 탄수화물 리간드가 발혀된 정도와 암전이 빈도 사이에는 높은 상관 관계가 존재한다. SLex와 SLea 항원에 대한 단일클론항체는 종양 세포(백혈병, 결장암종, 조직구 림프종)가 내피세포와 혈소판에 부착하는 것을 방지하며, 유방암종의 내피조직에서 종종 셀렉틴 발현이 향상된다.
GMP-140 또는 PADGEM으로도 알려진 p-셀렉틴은 정지(비활성) 혈소판의 분비 과립(secretory granule)과 내피조직에 자리잡은 막 당단백질이다. 매개 인자가 이 세포들을 활성화시키면, p-셀렉틴은 세포질막으로 신속하게 재분배된다. 이들 셀렉틴은 구조적으로, 또 기능적으로 연관된 단백질 가족을 이루는 분자들이다. 셀렉틴 분자에 공통된 구조적 모티프(motif)에는 N-말단 유사 렉틴 영역과 그에 이 어지는 유사 EGF 영역, 보체 결합 단백질에 존재하는 것과 유연 관계에 있는 일치 반복부(consensus repeat) 무리, 막 횡단 영역과 짧은 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)가 포함된다. P-셀렉틴은 활성 혈소판과 내피세포층에 발현되었을 때 중성구와 단핵구의 수용체가 되는데, 이러한 성질은 내피세포층에 손상이 일어난 부위에 백혈구가 신속하게 부착하게 함은 물론 염증이나 출혈부위에서 혈소판-백혈구가 상호작용하도록 촉진한다. 또 연구 결과에 따르면, p-셀렉틴은 다양한 종류의 조직 절편 속 암세포와 결합하고 또 암종으로부터 유래된 많은 종류의 세포주의 표면에 결합한다. 다른 세포 부착 분자와 협동으로 p-셀렉틴은 암 전이 과정에 참여하고 따라서 세포 부착 수용체의 기능을 차단하는 약물을 개발에 있어서 표적이 된다.
암 전이에서 셀렉틴이 주요한 역할을 맡는다는 것을 뒷받침하는 연구들은 사람 결장암종의 세포주가 셀렉틴에 부착하는 것을 시험관내 유동 모델(in vitro flow model)에 입각하여 분석한 결과에 따른 것들이다. 재조합 p-셀렉틴 분자와 p-셀렉틴을 발현하는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)는 KM12-L4 결장암종 세포의 부착과 구르기(rolling)를 지원하였고 이러한 효과는 KM12-L4 세포를 뉴라민 분해 효소(neuraminidase)로 전처리하자 사라졌다. KM12-L4 세포는 PSGL-1과 무관한 세포 부착 경로를 거쳐 p-셀렉틴과 상호작용한다. 한 e-셀렉틴-IgG 키메라 역시 시알릴화된 부위에 의존하여 유동액 속에서 결장암종 세포의 부착을 지원하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 시알릴화된 부위는 유동액 조건하에서 사람 암세포가 IL-1에 의하여 활성된 내피세포층에 부착하는 과정에 관여한다. 게다가 e-셀렉틴이 매개하 는, 사람 결장암종 세포의 사람과 마우스 내피세포에 대한 부착 효율은 해당 암세포의 전이 능력과 상관 관계가 있음이 밝혀졌다.
최근 연구 결과, 시험관내에서 두 종류의 사람 결장암 세포주 HT-29와 COLO 201이 사람 탯줄 내피세포(human umbilical cord endothelial cell, HUVEC)에 부착하는 것을 매개하는데 e-셀렉틴과 시알릴루이스a(SLea) 또는 시알릴루이스x(SLex)의 상호작용이 차지하는 비중이 밝혀졌다. 결장암 세포주는 탄수화물 성분의 항원결정부위를 매우 많이 발현하였고 아울러 HT-29와 COLO 201 세포가 IL-1에 의하여 자극받은 HUVEC에 부착하는 과정을 e-셀렉틴에 대한 단일클론항체가 억제할 수 있다는 점을 확고히 하였다. SLex에 대한 두 가지 종류의 항체와 그에 관련된 항원인 Lex와 Lea에 대한 항체를 가지고 미리 세포를 배양하여도 세포 부착에는 유의미한 영향이 없었다. SLea에 대한 세 종류의 항체는 HT-29와 COLO 201 세포의 부착을 억제하는 능력에 있어서 차이를 보였다. 그러므로 SLea 항원은 e-셀렉틴이 주된 매개체로 작용하는 결장암 세포의 부착 과정에 있어서 중요하다.
한편 다른 연구 결과에서 HUVEC 세포를 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-alpha)로 전처리하면 COLO 205 암종 세포주의 결합이 증강됨이 밝혀졌다. 이 부착 증강 효과는 농도와 시간에 모두 의존하였는데, 암세포 부착 효 과의 최대값에는 4 시간째에 도달하였다. 이 결과는 부착 분자 e-셀렉틴의 내피세포층 표면 발현이 증가한 것과 일관된다. TNF로 자극받은 HUVEC을 COLO 205를 첨가하기 전에 항-e-셀렉틴 단일클론항체 BB11과 함께 배양하면 이 암세포의 부착이 완전하게 억제되었다. 이러한 연구 결과는 e-셀렉틴 특이적 항체가 암세포의 내피세포층에 대한 부착을 억제하는 데 가질 수 있는 효용성을 입증한다. 항-p-셀렉틴 또는 항-l-셀렉틴 단일클론항체(즉 MAb PB 1.3과 MAb DREG-200) 또는 시알릴루이스x 함유 올리고당(Slex-OS)이세포 부착을 억제하는 데 효과가 있다는 다른 연구 결과도 있다.
시험관내와 생체내 유사한 연구 결과에서도 사람 췌장 악성 종양 유래 SW1990 세포의 전이 과정에서 셀렉틴이 맡는 역할을 확립한 바 있다. SW1990 세포 또한 Slex와 Slea 항원, CD44H와 β1 인테그린을 다량으로 발현한다. 이 세포는 IL-1 활성화된 HUVEC와 사람 복막 중피세포(peritoneal mesothelial cell)에 대하여 결합하는 활성이 있다. 내피세포에 대한 암세포의 이식으로 이어지는 세포 부착은 Slea 항원과 β1 인테그린에 특이적인 항체의 배양 처리에 의하여 억제된다. 동물 실험에서 Slea 항원과 β1 인테그린에 대한 상기 각각의 항체는 배양시 누드 마우스(nude mouse)에서 SW1990 세포가 간으로 전이하는 과정을 억제하여 마우스의 수명을 연장하였다.
본 명세서에서 인용한 어떠한 문헌도 그 문헌이 관련된 선행기술 또는 어느 청구항의 특허성에 관련된 것으로 해석해서는 아니 되며, 명세서 중 어느 문헌의 날짜나 내용에 대한 진술 역시 본 발명의 출원인이 출원시 구할 수 있었던 정보에 바탕을 둔 것이며 그러한 진술이 정확하다고 자인하다고 언급하는 것이 아님을 밝혀 둔다.
본 발명은 유효한 양의 류코트리엔(leukotriene) 길항제를 투여함으로써 조양 세포의 전이를 저해하는 방법을 제공한다. 본 발명의 종양 전이 저해 방법에서 류코트리엔을 투여할 대상은 종양 전이를 저해할 필요가 있는 대상 중에서 현재 투여시 수술 절차를 밟고 있는 경우가 아니거나, 종양 세포의 부착, 조직 침투, 전이를 막는 다른 약물을 투여받고 있는 경우가 아닌 환자를 대상으로 한다.
본 발명은 한편 내피세포에 암세포가 부착하는 것을 저해하는 방법 및/또는 종양 세포가 내피세포 조직을 통과하여 이동하는 형태의 모세혈관 투과성(capillary permeability)을 방지하는 방법을 제공한다.
본 발명은 나아가 종양 세포의 모세혈관 투과를 억제하는 물질을 선별하는 방법 을 제공한다.
본 발명은 종양 세포 전이를 저해하는 방법을 제공하는바, 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제, 바람직하게는 프란루카스트(pranlukast) 혹은 약제학적으로 허용되는 그 염(鹽)을, 그러한 약제의 투여를 요하며 현재 종양 제거와 같은 수술 절차가 진행 중이지 않은 환자에게, 또는 그러한 약제의 투여를 요하며 종양세포 부착 억제, 암세포 침투 억제 및 전이 방지와 같은 특성을 지니는 다른 화합물, 예컨대 미국 특허 제 492,332호로 공지된 화합물을 투여받고 있지 않은 환자에게 유효한 양으로 투여하는 방법에 대한 것이다.
본 명세서에서 "류코트리엔 길항제"란 일반적인 의학적 의미에서 자연적으로 존재하는 류코트리엔 화합물들의 한 가지 또는 여러 가지의 유형의 농도, 활성 또는 효과를 억제하고, 차단하고 감소시키거나 방해하는 약물을 가리킨다. 류코트리엔 길항제는 전형적으로는 수용체 수준에서 류코트리엔의 작용을 길항하며, 본 명세서에서 "류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제"라고 지칭하는 것이 더 바람직하다.
본 명세서에서 "종양"이란 악성전환된 세포 덩어리로서 적어도 일부분에 혈관신생이 일어난 혈관 구조를 갖추고 있는 점으로 특징을 삼는다. "종양"이란 용어는 실질 조직(parenchyma)의 종양세포와 이 실질 조직의 세포 덩어리에 파고 든 신생 혈관을 포함하여 실질 조직을 지원하는 버팀질(stroma)까지 넓게 가리킨다. 비록 종양이라고 하면 일반적으로 악성 종양, 즉 전이할 수 있는 능력을 지니는 암종이지만, 또한 종양은 신생혈관 형성이 그 종양에 일어난 것을 전제로 악성이 아닌 종양도 포함한다. 본 명세서에서 다루는 종양 세포는 전이성 종양에서 유래된 것이다. 본 명세서에서 "전이"라는 용어는 원발종양(primary tumor)와 떨어져서 생장하며 부착되어 있지 않고 다른 곳으로 이동한 세포로부터 자라난 제2차 종양(secondary tumor)을 가리킨다.
본 발명자는 과거에 류코트리엔 C4와 D4 수용체 길항제들, 특히 프란루카스트를 이용하여 염증 메커니즘을 연구한 바 있다. 일반적으로 염증 반응이 일어나면 다양한 사이토킨과 다른 염증 반응 매개인자들이 반응 부위의 혈관에 작용하여 내피세포 부착 분자(cell adhesion molecule, CAM)의 발현을 늘린다. 이들 친염증pro-inflammatory) 사이토킨과 염증 매개 인자는 모세혈관 내피세포 표면의 p-셀렉틴과 e-셀렉틴을 활성화하고 그 다음에 백혈구의 혈관 밖 유출 과정을 개시하는데 이 과정은 (1) 구르기(rolling) (2) 유발(triggering) (3) 정지/부착 (arrest/adhesion) 그리고 (4) 내피세포층 횡단 이동의 순서로 이루어진다고 여기고 있다.
염증 과정은 다음과 같이 이해하고 있다.
1) 통각 자극에 의하여 활성화되는 포식세포(macrophage)는 TNF-α, 인터류킨-1β와 인터류킨-6을 조직으로 분비한다.
2) 혈관 내피세포는 모세혈관 내에서, e-셀렉틴의 발현을 TNF-α와 인터류킨-1β로, p-셀렉틴의 발현을 히스타민과 트롬빈을 통하여 증가시킨다.
3) 순환중인 백혈구는 PSGL-1과 같은 뮤신(mucin) 류, 또는 e-셀렉틴과 p-셀렉틴에 결합하는 시알릴루이스, 시알릴루이스a, 시알릴루이스x와 같은 4당류 화합물을 발현한다. 이러한 결합은 백혈구를 혈관 내피에 부착시키거나 붙들어 두도록 매개하여, 백혈구를 피가 흐르는 방향으로 굴러 갈 수 있게 한다(구르기). 비록 래트(rat)의 공장(空腸) 가운데 부위(mid-jejunum)에서 류코트리엔 C4 또는 D4가 p-셀렉틴과 시알릴루이스에 의존하는 변형을 유발하지만, 류코트리엔 수용체 길항제는 효과가 없었다. 그 때로부터 역가가 뛰어난 셀렉틴 억제제가 개발되었다.
4) 백혈구가 굴러가면서 케모킨(인터류킨 8, MIP-1α/β와 MCP-1), 보체 조각인 PAF (C5a, C3a, C5b67)와 여러 가지 N-포르밀화 펩티드가 생겨난다. 이들 화학 유인물질이 백혈구 세포막 겉의 수용체에 결합하면 그 수용체에 연결된 G-단백질이 매개하는 활성화 신호가 발생한다. 이 신호는 백혈구 세포막의 인테그린 분자의 형태 변화를 불러일으키는데, 그에 따라 인테그린 분자가 내피세포층 표면의 면역글로불린 단백질 초가족 부착 분자에 대하여 가지는 친화도가 증가한다 (유발).
(5) 인테그린과 면역글로불린 단백질 초가족 부착 분자 사이의 후속 상호작용에 따라 백혈구의 내피세포에 대한 부착이 강화되어 백혈구가 내피세포에 단단히 매여 있을 수 있게 된다(정지/부착).
이 백혈구는 이제 혈관 벽을 뚫고 조직으로 이동한다. 내피세포층 횡단 이동의 각 단계와 그들이 어떻게 이루어지는지는 여전히 대부분 미지의 영역이다. 그러한 단계는 백혈구 표면과 모세혈관 내피세포 표면의 CD31 사이에서 결합하는 분자들에 의하여 매개되거나, 혹은 백혈구 표면의 LFA-1과 모세혈관 내피세포 표면의 JAM에 대하여 결합하는 분자들에 의하여 매개될 것이다 (내피세포층 횡단 이동).
따라서 백혈구의 혈관 밖 유출은 모세혈관 내피세포, 모세혈관 내피세포 표면의 분자들, 케모킨과 부착 분자들(셀렉틴 단백질 가족, 인테그린 가족, 면역글로불린 초가족) 사이의 상호작용에 의하여 일어나며 순서를 가지는 반응이다. 그러나 전에는 류코트리엔 C4와 D4가 중추신경계 모세혈관 밖 백혈구의 유출에서 어떠한 역할을 하는지 여부가 전혀 알려져 있지 않았다.
류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제인 프란루카스트는 본 발명자에 의하여 류코트리엔 C4 수용체와 D4 수용체를 경쟁억제하며 뇌의 염증(중추계 염증)과 패혈증(전신 염증)을 효과적으로 억제함이 밝혀졌다.
본 발명자는 전에 덱스트란에 의하여 쥐(rat)의 발에 생기는 부종을 프란루카스트가 농도 의존적으로 방지함을 발견하였다. 약 490 mg/kg의 투약량으로 복막내 투여하면 프란루카스트는 덱스트란-유발 부종을 완전히 억제하였다. 이러한 사실은 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제들이 모세혈관의 내피세포에 작용하며 덱스트란에 의하여 유발되는 투과성의 증대를 억제할 것이라는 점을 시사하였다.
류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제인 프란루카스트가 작용하는 부위는 모세혈관 내강(lumen) 쪽(모세혈관 내피세포에 관련된다)에 자리잡고 있다. 프란루카스트가 혈뇌장벽을 통과하지 못하거나 최소한의 정도로 통과하기 때문에, 프란루카스트의 항염증 효과는 (증대된) 모세혈관 투과성의 방지와 백혈구의 모세혈관 세포에 대한 부착과 뒤 이은 내피세포층 횡단 이동으로 이루어지는, 백혈구의 모세혈관 내강 밖 유출을 저해하는 데에서 말미암은 것이다. 따라서 프란루카스트는 혈뇌장벽을 통과하지 않고 뇌 염증을 저해한다. 혈뇌장벽의 투과성을 증가시킨 뇌 염증의 경우에는 세포질 속 프란루카스트가 투과도가 늘어난 혈뇌장벽을 통과하여 염증 부위로 전달될 수 있다.
일반적인 모세혈관에서도 프란루카스트의 작용 부위는 중추계 모세혈관의 경우와 기본적으로 동일한데, 즉 프란루카스트의 항염증 효과는 모세혈관 투과성의 저해와 백혈구의 모세혈관 세포에 대한 부착과 뒤 이은 내피세포층 횡단 이동으로 이루어지는, 백혈구의 모세혈관 내강 밖 유출을 저해하는 데에서 발생한다. 그러나 말초 조직 속에 더 널리 프란루카스트가 분포할 터인데, 그 이유는 중추계 모세혈관과 비교하여 일반 모세혈관의 구조에는 세포 내 틈새(intracellular cleft), 세포흡수 작용(pinocytosis). 모세혈관 창(fenestra)와 같은 구멍이 더 많기 때문이다.
아래 데이터에서 설명하는 바와 같이, 프란루카스트의 작용 메커니즘에서 모세혈관 이후 세정맥(post-capillary venula)에 있는 내피세포는 중추신경계와 말초 조직에서 똑같이 안정되며 염증 발생의 첫 단계에서 투과가 억제된다. 염증 반응은 뚜렷이 구별되는 세 반응기에 걸쳐서 일어나는데 각 단계는 명백하게 매개하는 메커니즘이 서로 다르다.
1. 급성이고 과도기인 제1기 - 혈관 확장과 모세혈관이 투과성 증가가 일어난다.
2. 지연성이며 아급성(亞急性)인 제2기 - 백혈구와 포식세포의 침투가 일어난다(백혈구의 혈관 밖 유출).
3. 만성 증식성의 제3기 - 조직 변성(degeneration)과 섬유화(fibrosis)
지연성이며 아급성인 제2기에는 순서대로 서로 겹치는 네 개의 단계가 존재한다. (1) e-셀렉틴과 p-셀렉틴이 활성화된 내피세포 표면에 나타나서 시알릴루이스a와 시알릴루이스x 항원을 통하여 백혈구와 상호작용하는 구르기(rolling) 단계, (2) 활성화, (3) 정지/부착과 (4) 내피세포층 횡단 이동의 네 단계이다. e-셀렉틴과 p-셀렉틴은 암전이 과정 속에서 종양 세포와 앞의 발명이 속하는 기술 분야 및 종래 기술란에서 기재한 대로 상호작용할 수 있다. 본 발명자는 염증 반응의 백혈구의 혈관 밖 유출과 전이 과정의 종양 세포의 혈관 밖 유출에는 메커니즘이 공통될 것이라고 예상하고 있으므로, 백혈구의 혈관 밖 유출을 억제하는 류코트리엔 길항제, 바람직하게는 류코트리엔 C4 수용체와 D4 수용체 길항제를 암전이 과정 중의 종양 세포 혈관 밖 유출을 저해하는 데에도 사용할 수 있을 것이다.
류코트리엔 길항제, 바람직하게는 류코트리엔 C4 수용체와 D4 수용체 길항제, 더욱 바람직하게는 프란루카스트는 본 방법 발명에서 종양을 가지고 있거나 혹은 장래에 종양 제거 수술을 받을 환자로서 암전이를 막을 필요가 있는 환자 몸 속에서 종양의 전이를 막는데 쓰일 수 있다. 본 발명은 또한 내피세포, 바람직하게는 모세혈관 내피세포에 대한 세포 부착을 억제하거나/억제하고 류코트리엔 길항제와 내피세포의 접촉을 통하여 종양세포의 내피세포에 대한 부착을 막음으로써 종양세포가 내피세포층을 횡단하여 모세혈관을 투과하는 것을 차단한다.
본 방법 발명에서 바람직한 류코트리엔 C4 수용체와 D4 수용체 길항제로는 프란루카스트(ONO-1078, 일본 오오사카 소재 오노 제약), 자피어루카스트 (zafirlukast), 몬테루카스트(montelukast) 또는 약제학적으로 허용되는 그 염이나 수화물 등을 들 수 있다. 프란루카스트, 몬테루카스트와 자피어루카스트의 화학적 구조는 아래 그림에 나타내었다.
Figure 112007013210356-PCT00001
약제학적으로 허용되는 염에는 리튬, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘, 칼슘 등의 알칼리 토금속과 알루미늄 염이 포함된다. 다른 적절한 류코트리엔 C4와 D4 수용체 길항제에는 다음과 같은 분자들이 포함되는데, 이러한 목록은 제한적인 것이 아니다: 8-[2-(E)-[4-(4-플루오로페닐)부틸옥시]페닐]비닐]-4-옥소-2-[5-1H-테트라조일)-14H-1-벤조피란 나트륨염 (8-[2-(E)-[4-(4-fluorophenyl) butyloxy]phenyl]vinyl]-4-oxo-2-[5-1H-tetrazolyl)-14H-1-benzopyran sodium salt) (MEN-91507; 메나리니社), CR-3465 (로타팜社), KP-496 (카켄 제약), 4-[6-아세틸-3-[3-[(4-아세틸-3-히드록시-2-프로필페닐)티오]프로폭시]-2-프로필펜옥시]부탄산(4-[6-acetyl-3-[3-[(4-acetyl-3-hydroxy-2-propylphenyl)thio]propoxy]-2-propylphenoxy]butanoic acid) (MN-002, 쿄린 제약, 미국 특허 제 4,985,585호)와 (R)-3-메톡시-4-[1-메틸-5-[N-(2-메틸-4, 4, 4-트리플루오로부틸)카바모일]인돌-3-일메틸]N-(2-메틸-페닐술포닐)벤즈아미드 ((R)-3-methoxy-4-[1-methyl- 5-[N-(2-methyl-4,4,4-trifluorobutyl)carbamoyl]indol-3-ylmethyl]N-(2-methyl-phenyl sufonyl)benzamide) (MCC-847; 아스트라 제네카社, 유럽 특허 제531078).
류코트리엔 C4 및 D4 수용체 길항제 프란루카스트가 본 발명의 방법에 쓰기에 가장 바람직한 류코트리엔 길항제이긴 하지만, 프란루카스트와 비슷한 구조를 가지고 종양 세포의 내피세포에 대한 부착을 억제하거나/억제하고, 모세혈관 투과를 막아 종양 세포의 내피세포층 횡단 이동을 방지하는 성질을 지녀 본 발명에 사용될 수 있는 바람직한 다른 류코트리엔 C4와 D4 수용체 길항제군을 제시하겠다. 이 길항제군은 하기 일반식 (I)을 가지는 화합물이다.
Figure 112007013210356-PCT00002
상기 식에서, R1, R2, R3, R4와 R5는 동일하거나 다른 작용기로서 수소, 할로겐, 히드록시, 아미노, 카르복시, 니트로, 시안, 저급 (lower)알킬, 저급 알콕시, 저급 알칸오일(alkanoyl), 저급 알칸오일옥시(alkanoyloxy), 저급 알콕시카르보닐, 저급 모노 또는 디알킬 치환된 아미노, 아랄킬(aralkyl), 아릴 및 헤테로아릴 작용기이고,
Q는 카르복시, 저급 알콕시카르보닐 또는 테트라조일(tetrazoyl) 작용기이고,
X는 산소, 황 또는 -NR-(여기서 R은 수소이거나 저급 알킬이다) 작용기이며,
Z는 수소 또는 저급 알킬이고,
m은 1 부터 6까지의 정수이다.
(I) 식에 따른 화합물들 중에서 R1, R2, R3, R4와 R5가 수소이고 Q가 테트라조일 작용기이며 X와 Y가 산소, Z가 수소이고 m이 4인 프란루카스트를 아래에 도시한다.
Figure 112007013210356-PCT00003
화학식 (I)의 치환기들을 이하 정의한다. 할로겐이란 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드이다. "저급 알킬", "저급 알콕시", "저급 알콕시카르보닐", "저급 모노 또는 디알킬 치환된 아미노"에서 적절한 "저급 알킬"이란 곧은 사슬 또는 가지친 사슬 알킬기로서 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 아이소프로필, 부틸, 아이소부틸, 3급부틸(tert-butyl), 펜틸, 헥실, 아이소헥실, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 2-메틸사이클로프로필, 사이클로프로필메틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실기가 있다. "저급 알칸오일(alkanoyl)"과 "저급 알칸오일옥시" 작용기에서 적절한 "저급 알칸오일" 작용기란 곧은 사슬 또는 가지친 사슬 또는 고리가 있는 알칸오일 작용기로서 포르밀, 아세틸, 프로피온산, 부티르산, 아이소부티르산, 발레르산(valeryl), 아이소발레르산, 피발산(pivaloyl), 헥산산(hexanoyl), 사이클로프로필카르보닐, 사이클로부틸카르보닐, 2-메틸사이클로프로필카르보닐, 사이클로헥실카르보닐 등을 들 수 있다.
아랄킬 작용기란 탄소 수 7~20의 아랄킬 작용기로서 예를 들어, 벤질, 페네틸(phenethyl), α-메틸벤질, 벤즈히드릴 트리틸(benzhydryl trityl), 나프틸메틸 등이다. 아릴은 탄소 수 6~14인 아릴 작용기로서, 예를 들어, 페닐과 나프틸이며, 헤테로아릴이란 탄소 수 3~8이고 단일 탄소 고리이거나 다수의 탄소 고리 또는 융합된 고리를 가지고, 질소, 산소 또는 황 원자를 하나 내지 네 개 동일하거나 다르게 가지고 있는 헤테로아릴 작용기로서 , 예를 들어 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-퀴놀릴(2-quinolyl), 3-퀴놀릴, 4-퀴놀릴, 5-퀴놀릴, 6-퀴놀릴, 7-퀴놀릴, 8-퀴놀릴, 2-인돌릴, 3-인돌릴, 4-인돌릴, 5-인돌릴, 6-인돌릴, 7-인돌릴, 2-퓨릴(2-furyl), 3-퓨릴, 2-티에릴(2-tieril), 3-티에릴, 2-피롤리딜(2-pyrrolidyl), 3-피롤리딜, 2-이미다조일, 4-이미다조일, 5-이미다조일, 2-옥사졸릴(2-oxazolyl), 4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 2-티아졸릴(2-thiazolyl), 4-티아졸릴, 5-티아졸릴 등이다.
상기 바람직한 류코트리엔 C4와 D4 수용체 길항제 외 류코트리엔 길항제/억제제로서 제한적이지 않은 예를 들어보면, 류코트리엔 D4와 H1 길항제로서 테트라졸(tetrazole) 유도체(유럽 특허 0905133 A1), 티아졸릴벤조퓨란(thiazolylbenzofuran) 유도체(유럽 특허 0528337 A1), 류코트리엔 D4 길항제로서 퀴놀린 유도체, 류코트리엔 D4 길항제로서 리폭신(lipoxin) A4와 그 유도체(미국 특허 제 5,079,216호), 류코트리엔 길항제로서 에키네시아(echinacea) (국제 특허출원 99/21007), 16-수산화아이코사테트라엔산(hydroxyeicosatetraenoic acid) (국제 특허 출원 99/59964)과 5-지질산화 효소(5-lipoxygenase)를억제하는 길항제가 있다.
류코트리엔 C4와 D4 수용체 길항제인 프란루카스트는 안전하다고 알려져 있다(마우스와 래트에서 경구와 피하 LD50 > 2000 mg/kg). 프란루카스트를 1회 경구 투여(30 mg/kg, 100 mg/kg, 300 mg/kg, 1000 mg/kg)하거나 3개월 또는 6개월 동안 반복 경구 투여(30 mg/kg/일, 300 mg/kg/일, 1000 mg/kg/일)한 쥐(rat)는 대조군과 비교할 때 정상적인 행동, 체중 변화, 먹이 섭취를 보였다. 요검사와 조직병리학 검사 결과 역시 프란루카스트의 1회 투여와 반복 투여 모두에서 정상이었다. 혈중 프란루카스트의 최고 농도(투여량 20 mg/kg)는 경구 투여 후 1시간 내에 도달하였고, 적어도 5시간 지속되었다. 그러나 상기와 같이 적은 투여양에서는 투여 후 24시간이 지나서는 프란루카스트가 검출되지 않았다(오노 제약(Ono pharmaceutical company)의 데이터).
앞서 언급했듯이 프란루카스트의 항염증 효과에 의하여 내피세포 표면에 p-셀렉틴 및/또는 e-셀렉틴과 백혈구 특이적 세포부착 분자의 발현이 억제되거나 백혈구가 모세혈관 내강 밖으로 유출하는데 중요한 역할을 하는 류코트리엔 C4와 D4 수용체가 길항을 받는다.
본 발명의 방법에서 종양의 전이를 방지하기 위한 류코트리엔 길항제의 유효 1회 투약량은 치료할 증상의 심한 정도와 투약 경로에 따라 달라질 수 있는데, 투약 경로로는 경구 투약이 바람직하고, 또한 따라서 전신 투여가 가장 바람직하다. 1회 투여량, 그리고 때로는 투여 빈도까지도 환자의 나이, 체중, 투약에 대한 반응에 따라서 달라질 수 있다. 일반적으로 당업자는 류코트리엔 길항제의 적절한 하루 경구 투여량을 쉽게 정할 수 있다. 예를 들어 Medical Economics社의 제54판(2000) "Physician's Desk Reference"를 보면 현재 천식 치료용으로 알려져 있는 류코트리엔 길항제의 적정 투여량이 나와 있다. 류코트리엔 C4와 D4 수용체 길항제에 대해서도 적절하게 1일 경구 투여량을 정할 수 있다. 특별히 프란루카스트의 예를 들면, 적절한 1회 투여량은 100 mg/일~2000 mg/일이며, 바람직하게는 200 mg/일~1000 mg/일이고 가장 바람직하게는 400 mg/일~800 mg/일이다. 몬테루카스트의 경우, 투여량이 바람직하게는 5 mg/일~100 mg/일이고, 더욱 바람직하게는 5 mg/일~50 mg/일이고, 가장 바람직하게는 10 mg/일~20 mg/일이다. 자피어루카스트의 경우, 투여량이 바람직하게는 10 mg/일~300 mg/일이고, 더욱 바람직하게는 20 mg/일~150 mg/일이고, 가장 바람직하게는 40 mg/일~80 mg/일이다.
나아가 어린이, 65 세 이상의 환자, 신장 또는 간 기능이 손상된 환자들은 처음에 적은 투여량으로 시작하였다가 환자의 반응과 혈중 잔여량에 따라 투여량을 높일 것을 권장한다. 당업자에게 자명하겠지만, 때로는 위에 적은 투여량의 범위를 넘는 양을 사용할 필요도 있을 것이다. 또한 각 환자의 투약 반응에 따라 치료를 조절하거나, 중지하거나, 마칠 때를 치료사나 의사나 판단할 수 있는 것이 중요하다.
현재 구할 수 있는 류코트리엔 길항제들의 가장 흔한 제형은 경구복용약인데, 이는 위산에 용해되어야 하기 때문이다. 투여형태는 알약, 트로키(troche), 캅셀(capsule), 겔 캅셀(gel cap), 로진지(lozenge) 등이 있다. 투여하기 편리한 점 때문에, 고형의 약학적 부형제를 사용하는 알약과 캅셀이 가장 바람직한 경우 투약 형태이다. 환자가 의식을 잃은 경우 투약은 위로 통하는 삽입관을 사용하는 바람직할 수 있다. 필요한 경우, 알약은 표준적인 수성 혹은 비수성 피복법으로 피복할 수 있다. 현재 구할 수 있는 류코트리엔 C4와 D4 수용체 길항제 중 적어도 하나, 즉 싱귤레어(singulair, 몬테루카스트)는 정맥 투여가 가능하다. 투여는 하루 한 번 이루어질 수 있다.
본 발명은 나아가 종양 세포가 내피세포층을 횡단하여 뇌 척수액으로 이동함으로써 모세혈관을 투과하는 것에 대한 억제제 약물을 선별하는 방법을 제공한다. 이 선별 방법은 먼저 래트(rat), 마우스, 거빌 쥐(gerbil), 개, 고양이, 토끼, 원숭이 등의 사람 아닌 포유동물에 억제제 후보 물질을 투약한 뒤 곧 이어 그 동물의 정맥에 종양 세포를 주입한 다음, 거미막 밑 공간(subarachnoid space)으로 모세혈관 투과성을 증가시키는 염증 유발물질을 상기 동물의 경질막(硬質膜, dura mater)에 꽂힌 삽입관을 통하여 투여하는 방식이다. 이 염증 유발물질의 투여 후에 거미막 밑 공간에서 뇌 척수액을 채집하여 모세혈관 밖으로 유출된 종양 세포 수를 센 다음 이 숫자와 억제제 후보 물질을 투여하지 않은 대조군의 세포 수를 비교하여 해당 후보 물질이 종양세포의 모세혈관 투과를 억제하는지 판단한다. 이 방법은 채집한 뇌 척수액의 양(부피)을 측정하는 단계를 선택적으로 포함할 수 있는데, 이때 뇌 척수액의 양이 많을수록 모세혈관의 투과성이 높은 것이다. 사람이 아닌 포유동물 중 바람직한 동물은 래트이다.
염증 유발물질에는 아라키돈산, 프로스타글란딘, 트롬복산(thromboxane), 히스타민, 효모, LPS, 덱스트란, 브래디키닌(bradykinin), 카라기난(carrageenan), 류코트리엔, TNF-α, 인터류킨-1β 또는 인터류킨이 포함된다. 이 중에서 아라키돈산 같이 분자량이 작은 물질이 선호된다.
사람 아닌 포유동물에 억제제 후보 물질을 투여하는 방법은 어느 특정한 방식에 얽매이지 않으며 알려진 투여법, 예를 들어 경구 투여, 피하 투여, 복막내 투여, 정맥하 투여, 근육 투여, 비강(鼻腔, nasal) 투여, 흡입, 혀밑 투여, 좌약 등을 적절히 선택할 수 있고, 해당 후보 물질의 화학적 특성(예를 들어 지질에 대한 용해도)을 고려하여 정한다. 어느 억제제 후보 물질이 모세혈관 내강을 덮고 있는 내피세포층에 작용하여 모세혈관 투과를 억제하고 종양세포가 모세혈관을 투과하여 조직으로 침투하는 것을 막을 수 있는지 여부는 종양 세포 수를 세거나/세고 채집한 뇌 척수액의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 하지만 뇌 척수액의 양 측정과 더불어 뇌 척수액 내 종양 세포 수를 함께 세어 주는 것이 바람직하다. 덧붙여 뇌 척수액은 시간을 두고 채집하는 것, 예를 들어 매 30분 또는 시간마다 채집하는 것이 더 나으며, 측정값을 대조군과 비교(후보 물질을 투여하지 않은 경우)하는 것이 바람직하다. 억제제 후보 물질의 투여가 뇌 척수액의 삼출(渗出 exudation)을 막고 대조군에서처럼 뇌 척수액 속 백혈구의 관측을 방지한다면 그 후보 물질은 모세혈관 투과성의 증가를 억제하는 물질이라고 여길 수 있고(특히 종양 세포의 내피세포층 횡단 이동에 대한 억제) 염증 유발물질을 주입하기 전에 투여되었을 때 모세혈관 투과성의 증가를 방지할 수 있는 예방제로서 유용하다.
도 1은 암세포의 전이 과정에 대한 모식도이다.
도 2는 덱스트란 유도 부종에 대한 ONO-1078(pranlukast)의 작용을 나타낸 그래프이다.
도 3은 래트(rat)에 대한 패혈증 실험에서 래트의 뇌 척수액(cerebrospinal fluid, CSF)의 변화 측정시 삽입관의 위치가 바뀌는 것을 나타낸 모식도이다.
도 4a와 4b는 아라키돈산의 투여 (3.25 μg/2 μL)가 두 마리의 래트(rat)에게서 중추신경계 염증을 일으키는 것을 나타내는 그래프이다. 도 4a는 1번 래트이 고 4b는 2번 래트이다.
도 5는 프란루카스트 (pranlukast 490 mg/kg, 복강내 투여)가 아라키돈산 투여(3.25 μg/2 μL)로 래트(rat)의 중추신경계에서 일어나는 염증을 억제하는 효과를 지닌다는 것을 보여주는 그래프이다. 이 데이터는 네 마리의 쥐로부터 얻었다.
도 6은 혈뇌장벽을 이루는 한 부분인 별 아교세포(astrocite)들 사이로 수많은 도랑(ditch 흰색 화살표)이 파여 있는 중추신경계 모세혈관의 겉면을 나타낸 그림이다. 이러한 도랑들은 열리면서 모세관 투과성을 높이고 백혈구와 암세포의 혈관 밖 유출에서 중요한 역할을 맡는다.
도 7a부터 7c는 혈관 밖 유출 과정에서 암세포의 모양이 변하는 것을 나타낸다. 도 7a와 7b는 동일한데, 7b에서는 형광 표지 물질인 PKH67로 염색한 일부 암세포, 즉 암세포 1, 2, 3번의 윤곽을 흰 선으로 표시하였다는 점만이 다르다. 7b에서 윤곽으로 나타낸 1번 암세포와 2번 암세포는 중추신경계 모세혈관으로부터 뇌 척수액으로 흘러나오는 세포들의 일부로서 관측된다. 3번 암세포는 이제 혈뇌장벽을 중간 부분까지 관통하여 뇌 척수액으로 나아가는 중이며 아직 그 모양이 네모지지 않았다. 검고 작은 네모 모양으로 보이는 것은 중성구로서 내피세포 표면의 p-셀렉틴, 인테그린 및/또는 Ig 단백질 초가족 세포 부착 분자(Ig superfamily cell adhesion molecule, CAM)에 부착하고 있다. 암세포의 내피세포층 횡단은 거미막 밑 공간(subarachnoid space)에 아라키돈산을 투여한 즉시 시작되었다. 백혈구의 내피세포층 횡단은 아라키돈산의 투여 이후 시간이 지나서 일어나는데 암세포와 비교할 때 뒤처진다. 도 7c는 세포의 모양이 납작해져서 혈뇌장벽의 가장 작은 틈새로도 비집고 들어갈 수 있게끔 되는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 8은 표 1에 기재한 실험 조건에 따라 해당 동물에 증류수 또는 PBS 또는 식염수를 투여한 뒤 각각 종양 세포 수 또는 백혈구 세포 수(WBC) 혹은 뇌 척수액의 부피(μL)를 나타낸 시간 작용(time action) 그래프이다.
도 9는 아라키돈산(816 ng/2 μL)을 거미막 밑 공간(subarachnoid space)에 투여한 후의 백혈구 세포 수와 뇌 척수액의 부피(μL) 사이의 시간 작용 곡선이다.
도 10a부터 10c는 종양 세포 수(도 10a), 뇌 척수액 부피(도 10b), 백혈구 세포 수(도 10c)를 거미막 밑 공간에서 증류수 또는 종양세포(정맥하) 또는 아라키돈산(816 ng/2 μL)을 투여하고 나서 측정한 시간 작용 곡선들이다.
도 11은 프란루카스트(490 mg/kg) 또는 PBS 또는 아라키돈산(816 ng/2 μL)을 투여하고 나서 종양세포 수를 측정한 시간 작용 그래프이다.
도 12a에서 12c는 각각 종양 세포의 혈관 밖 유출시 그 시간 작용 곡선 아래 의 넓이(도 12a), 아라키돈산이 야기하는, 암세포의 척수액 부피(μL)에 대한 영향(도 12b), 그리고 아라키돈산이 야기하는, 암세포의 백혈구 세포 수에 대한 영향(도 12c)을 나타낸 그래프이다. 별 표시는 0.05>p 유의 수준에서 ANOVA로 분석했을 때 통계학적으로 유의함을 나타낸다.
여태까지 본 발명을 개괄하여 설명하였는바, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 다음 실험예를 제공한다. 본 명세서의 실시예는 예시를 위한 것이지 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니다. 실시예 1 내지 4는 류코트리엔 C4와 D4 수용체 길항제가 가지는 항염증 효과의 작용 메커니즘이 모세혈관 내피세포층을 포함하는 모세혈관 내강에서 백혈구가 혈관 밖으로 유출하는 것을 막고 모세혈관 투과성의 증가를 억제하는 능력에서 말미암았다는 점을 보이기 위함이다.
실험예 1: 말초 조직에 대한 실험
본 발명자는 덱스트란-유도성 래트 앞발 부종을 프란루카스트가 농도 의존적으로 억제할 수 있음을 발견하였다. 약 490 mg/kg의 경구 투여로 프란루카스트는 덱스트란-유도성 앞발 부종을 완전히 저해하였다(도 2). 이러한 결과는 류코트리엔 길항제가 말초조직의 모세혈관에 있는 내피세포에 작용하여 덱스트란이 유도하는 모세혈관 투과성의 증대를 억제할 수도 있을 것이라는 점을 시사하였다. 세포 내 틈새(intracellular cleft), 세포흡수 소낭(pinocytic vesicle). 모세혈관 창(fenestra)과 같은 많은 구멍에도 불구하고 프란루카스트는 모세혈관의 투과성을 억제하였다. 뇌 모세혈관의 내피세포들은 밀착결합(tight junction)이 존재하기 때문에 다른 모세혈관보다 구멍이 적으므로, 프란루카스트는 다른 모세혈관보다 뇌 모세혈관의 투과성을 저해하는데 더 효과가 뛰어날 수 있다. 그러므로 위와 같은 메커니즘이 중추신경계 수준에서도 작용할 것이라고 예측할 수 있다.
실험예 2: 염증 과정에서 일어나는 변화의 측정
염증 치료에서 류코트리엔 길항제가 하는 역할을 조사하기 위하여 중추신경의 염증을 높은 감도로 정량 측정할 수 있는 방법을 개발하였다. 동일한 실험 동물에서 아라키돈산의 투과로 인하여 시간이 지남에 따라 일어나는 혈뇌장벽의 투과성의 변화와 뇌 척수액으로의 백혈구 침투를 모두 측정할 수 있기 때문에 염증 과정에서 발생하는 중요한 변화를 감지할 수 있다. 특히, 류코트리엔 C4와 D4 길항제인 프란루카스트가 가지는 효과를 이 방법을 써서 조사하였다. 염증 과정의 양 측면인 장벽의 투과성과 통증 자극으로서 아라키돈산을 투여하는 것에 의하여 백혈구가 침투하는 현상에서 일어나는 변화를 측정하였다.
실험방법과 재료
펜토바비탈나트륨을 50 mg/kg으로 복막내 투여하여 체중 약 350~400 g의 수 컷 쥐(rat)를 마취시킨 뒤 쥐들을 정위장치(定位裝置, sterotaxic unit) 위에 올려 놓았다. 머리 위부터 목까지의 털을 밀어버린 다음 조사할 부위를 70% 에탄올로 씻은 뒤 10% 포비돈-요오드(povidone-iodine) 용액으로 소독하였다. 경부 척수(脛部脊髓, cervical cord) 위의 피부와 근육을 목뼈가 드러날 때까지 절개하였다. 23G3/4 탐침으로 대수조(大髓槽, cisterna magna)를 지나 경질막(dura mater)을 관통하는 구멍을 뚫었다. 2~3 mm PE10 삽입관(두께 0.011 "I.D., 0.007", 길이 0.024" O.D., 6.5 cm)의 한쪽 끝을 경부 척수와 만나는 거미막 밑 공간에 집어 넣어 신경 조직의 손상을 피했다 (도 3). 이 삽입관을 시안아크릴 접착제 (cyanoacrylic glue)로 말초 조직에 고정시켰다. PE10의 다른 쪽 끝은 아라키돈산(도 3에서 AA로 표시 3.25 μg/2 μL) 과 같은 통각 자극을 주는 데 사용하였고 나중에는 11시간 동안의 실험에서 그 후 매 30분마다 뇌 척수액(CSF로 표시)을 채집하는데 사용하였다. 삽입관은 삽입 후 곧바로 뇌 척수액으로 가득찼다.
공기를 주입하여 아라키돈산을 거미막 밑 공간으로 주사해 넣었다. 수술용 "ㄷ" 자 못(staple)으로 피부와 근육을 봉합한 뒤 쥐를 정위 장치로부터 발열 패드로 옮긴 다음 계속하여 관찰하였다.
상호작용 조사에서 류코트리엔 C4와 D4 길항제 프란루카스트는 아라키돈산 투여 30 분 전에 490 mg/kg으로 복막내 투여하였다. 마취가 풀리는 것처럼 보일 때 는 추가로 0.05~0.1 mL의 펜토바비탈(50 mg/mL)을 복막내 투여하였다. 실험 도중 어느 때라도 쥐가 통증을 느끼거나 괴로워하는 것처럼 보일 때에는 실험을 멈추고 쥐를 안락사시켰다.
실험이 끝난 뒤 쥐들은 화학 후드 속 밀폐된 용기 속에서 고농도 할로탄(halothane) 기체에 노출시켜 안락사시켰다.
실험 결과
거미막 밑 공간의 뇌 척수액 양은 아라키돈산 투여(3.25μg/2 μL) 후 곧바로 늘어났다. 뇌 척수액의 양은 3.5 시간째에 최대가 되었다(도 4a와 4b). 아라키돈산 투여 이후 4~5 시간째부터 뇌 척수액 양이 점차 줄어들었지만 실험 조건의 투여량하에서 11시간의 관찰 기간 동안 꾸준한 수준을 유지하였다.
백혈구의 침투는 첫 30분 동안은 관측되지 않았는데, 이는 뇌 염증 과정에서 급성인 과도기를 시사하는 것일 수 있다. 하지만 그 후로 서서히 증가하였다(도 4a와 4b). 총 백혈구 세포 수의 변화와 뇌 척수액 양은 그 뒤로는 나란히 늘어나고 줄어든다. 이는 지연된 아급성기의 존재를 시사하는데, 이 아급성기의 가장 큰 특징은 백혈구와 포식 세포의 침투이다. 대조군 쥐에서는 뇌 척수액의 증가나 백혈구 수의 증가가 나타나지 않았다. 이것이 정상 상태인데, 중추신경계의 압력이 매우 낮고(6~10 mmHg), 보통 중추신경계에 백혈구가 존재하지 않기 때문이다.
류코트리엔 C4와 D4 수용체 길항제 프란루카스트(490 mg/kg)를 아라키돈산 투여(3.25 μg/2 μL) 30분 전에 복막내 전처리한 결과 뇌 척수액 양의 증가가 철저하게 저해되었다(n=4, 도 5 참조). 이는 프란루카스트가 뇌 모세혈관 내피세포의 투과성 증대를 억제할 뿐 아니라 백혈구의 침투도 방지함을 보여준다.
실험예 3: 류코트리엔 수용체 길항제 프란루카스트의 효과 연구
염증 과정 속에서 뇌 모세혈관 내피세포의 투과성 증대와 백혈구의 뇌 척수액 침투에 대한 측정
앞서 기술한 방법을 쓰면 한 동물에서 시간이 지남에 따라 투과성이 바뀌는 것을 측정할 수 있다. 다른 어떤 방법도 같은 동물을 써서 시간의 경과에 따른 염증 현상을 측정할 수 없었기 때문에, (통계적 유의성을 위하여) 적절한 실험 시점마다 적어도 네 마리 이상의 동물을 희생하지 않으면 안 되었다. 예를 들어 10시간 동안 매 30분마다 염증의 경과를 조사하고자 했다면 쥐 80 마리(매 30분마다 n=4)를 희생하여야 했다. 본 실험 방법이 뇌 모세혈관의 투과성 변화뿐만 아니라 백혈구의 뇌 척수액 침투에 대한 정보도 제공한다는 것을 주목할 필요가 있다.
이 방법을 사용하여 백혈구의 중추신경계 침투에 관한 데이터를 얻으려면, 단지 래트(rat) 네 마리가 필요할 뿐이어서, 실험 시간이 다르고 실험 동물이 다르기 때문에 오는 차이를 없앨 수 있다. 오로지 본 실험 방법만이 뇌 모세혈관의 투과성과 백혈구의 중추신경계 침투를 정량적으로 측정할 수 있을 뿐 아니라 염증 과정을 더욱 철저하게 관찰할 수 있게끔 하여준다.
본 명세서에서 뇌 척수액의 양(μL)과 척수액 내 백혈구 세포 수는 매 30분마다 같은 쥐로부터 11시간 동안 측정하였다. 펜토바비탈 마취하에서 삽입관(PE10)의 한쪽 끝을 거미막 밑 공간에 꽂아 신경 손상을 피하였다(도 3). 뇌 조직이 손상될 경우 뇌 척수액 양과 백혈구 수는 아라키돈산의 투여 없이도 급격히 늘어난다. 정상 쥐에서는 뇌 척수액 속에 백혈구가 없기 때문에 관 삽입 직후 백혈구가 뇌 척수액 속에 존재하지 않는 쥐만을 실험 대상으로 삼았다. 삽입관의 다른 쪽 끝은 열린 채로 통각 자극(아라키돈산, LPS, 덱스트란 등)을 주는 데 쓰이거나, 그 후에는 30분마다 뇌 척수액을 채집하는데 사용하였다. 뇌 척수액 양은 마이크로피펫을 이용하여 측정하였고, 뇌 척수액 속 백혈구 수는 혈구계를 써서 세었다.
아라키돈산(3.2 μg/2 μL)은 투여 후 곧바로 뇌 척수액 양을 늘렸는데, 3.5 시간만에 최대량인 100~120 μL에 이르렀다. 비록 양이 그 뒤로 줄어들었지만, 뇌 척수액 양은 투여 후 4.0~5.0 시간 동안 매 30분마다 60~80 μL로 유지되었다. 아라키돈산 투여 후 첫 30분 동안 백혈구는 보이지 않았지만 그 이후로는 점차 그 수가 늘어났다. 백혈구 수의 증가하거나 감소하면 뇌 척수액 양의 변화가 그 뒤를 따랐다.
프란루카스트(490 mg/kg)는 아라키돈산을 거미막 밑 공간에 투여하기 30분 전에 복막내 투여하였다. 프란루카스트는 뇌 척수액 양의 증가와 백혈구 침투로 나타나는 뇌 모세혈관 투과성의 증가를 철저히 저해하였다.
이 방법으로 앞서 언급한 염증 반응기의 특성을 분석하였는데, 이들은 국소적 혈관 확장과 늘어난 모세혈관 투과성이 특징인 급성 과도기(제1기)와 백혈구와 포식 세포의 침투가 가장 특징적인 지연성 아급성기(제2기)이다.
뇌 모세혈관에는 상대적으로 세포 흡수 작용 소낭은 적으나 미토콘드리아의 수는 매우 많으며 세포 틈새(cleft)와 모세혈관 창과 수많은 세포 흡수 소낭을 가지는 일반적인 모세혈관과 달리 밀착결합이 존재한다. 류코트리엔 수용체 길항제들은 혈뇌장벽을 통과하지 못하거나 하더라도 최소한도 수준에서 통과한다는 것이 알려져 있다. 이러한 연구 결과는 류코트리엔 수용체 길항제가 뇌 모세혈관 내피세포의 투과성을 말초억제할 것이라고 시사한다. 이 내피세포들은 서로 밀접하여 있어서 밀착결합을 이룬다. 이 내피세포 중 뇌 모세혈관 "안"에 놓이는 것들은 일반 모세혈관에 놓이는 것들보다 유출의 가능성이 훨씬 적은데, 그 이유는 일반 모세혈관에는 틈새와 창문이 고 수많은 세포 흡수 소낭이 있기 때문이다.
뇌 염증을 류코트리엔 C4와 D4 수용체 길항제로 치료하는 것은 모세혈관 내강과 혈뇌장벽 사이에 놓이느 내피세포의 투과성을 말초억제하기 때문에 가능한 것인지도 모른다. 따라서 뇌 모세혈관의 투과성을 억제하고 백혈구의 중추신경계 침투를 막을 수 있는 이러한 능력은 치료면에 있어서 약제가 혈뇌장벽을 통과할 수 있거나 혈뇌장벽을 열어 뇌 염증 부위로 접근할 수 있게 하는 능력보다 더 소중할 수 있다. 혈뇌장벽이 일단 열리면 뇌 모세혈관의 혈압이 두개강내 압력(intracranial pressure)보다 높기 때문에 투과성은 더 높아져 뇌 부종이 생기게 된다. 더우기 중추신경계로 혈액 성분이 침투하면 뇌 염증을 더욱 심화시킨다.
본 출원의 방법으로 다음과 같은 새로운 사실을 발견할 수 있었다.
1) 염증 과정(제1기와 제2기)을 위 방법에 의하여 정량적으로 측정할 수 있다. 2) 프란루카스트는 2차적 두뇌 손상 역시 억제한다.
실험예 4: 외상에 따른 쥐의 두뇌 손상 모델에 대한 프란루카스트와 다른 항염증 약물의 효과
양쪽 목동맥을 30분 동안 막은 다음 다시 관류시키는 가역적 쥐(rat)의 허혈증 모델에서 프란루카스트로 전처리한 쥐는 그 수명이 늘어남을 발견하였다. 이 목동맥 폐색 30분 전에 프란루카스트(450 mg/kg)를 복막내 투여한 경우 4~5 마리 중 한 마리의 쥐는 1주일 동안 살아남았다.
또한 개에 있어서 인터류킨-6에 의하여 백혈구의 뇌 척수액 침투가 증가하는 것을 프란루카스트 전처리(세 가지 다른 투여량)가 억제함도 밝혀졌다.
본 발명자는 류코트리엔 C4와 D4 길항제 프란루카스트(450 mg/kg)를 복막내 투여하면 아라키돈산(3.25 μg/2 μL)이 일으키는 염증을 완전하게 억제함을 발견한 바 있다. 이 염증은 혈뇌장벽의 투과성 증가와 백혈구의 뇌 척수액 침투의 바탕이 된다. 따라서 류코트리엔 C4와 D4 길항제(프란루카스트)는 염증 치료제로서 유용하다.
실험예 5: 쥐의 암 전이 억제에 대한 생체내 연구
본 실험예에서 사용한 실험적 모델에서는 뇌 척수액의 양, 거미막 밑 공간에서 삽입관을 타고 흘러 나오는 백혈구와 암세포의 수를 측정한다. 이 실험 모델은 암전이의 새로운 실험적 모델로 삼을 수 있다.
암 전이의 억제를 시험하여 보기 위하여, 암세포의 정맥 주사하기 전에 프란루카스트를 (실험예 2에서처럼 복막내 투여하지 않고) 경구 투여하였다. 그 다음 아라키돈산을 프란루카스트 투여 2시간 후에 거미막 밑 공간으로 투여하였다. 뇌 척수액의 부피와 백혈구의 수, 암세포의 수는 매 30분마다 측정하였다. 본 암전이 실험 모델의 뇌 척수액에서 암세포의 부재는 프란루카스트의 암전이 억제 능력을 증명한다.
실험방법과 재료
세포와 세포 배양 조건
세포 배양된 사람 암세포주 Colo 201(결장암)과 MKN74(폐암) 그리고 쥐(rat) 암세포주 RCN9는 보건학 연구 자원 은행(일본 오오사카부 센난시 린쿠-미나미하마 2-11 우편번호 590-0535)에서 구입하였다. 사람 폐암 세포주 QG56은 일본 후쿠오카 큐우슈우 암센터 실험의학과 이치노세 유키토 박사가 제공하였다. 세포는 5% 소 태아 혈청, 2 mM L-글루타민(깁코社), 100 단위의 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신(미국 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재 깁코인비트로젠社)를 첨가한 RPMI-1640 배양액(미국 미주리주 시그마社)으로 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
실험 동물
Fischer 344 수컷 쥐(체중 400±50g)와 이들로부터 유래한 결장암 세포주 RCN-9는 산쿄오 실험실 서비스社에서 구입하였다.
화학 약품
미국 애봇 연구소社(미국 일리노이주 애봇파크)의 펜토바비탈나트륨(넴부탈 nembutal 주사)과 자이낵시스 세포 과학社의 PKH67그린 형광 세포 연결 키트는 다이니폰 제약社(일본 오오사카)에서 구입하였다. 돼지 간 유래의 아라키돈산(나트륨 염)은 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재 캘바이오켐社에서 구입하였다. 캅셀 당 112.5 mg의 프란루카스트를 함유하는 오논(ONON)은 오노 제약(일본 오오사카)에서 구입하였다.
기타
폴리에틸렌 튜브(SP10, 안지름 0.28 mm, 바깥지름 0.61 mm)는 나츠메세이사쿠쇼社에서 얻었고, 헤파린 나트륨(5000 단위/5 mL)은 시미즈 제약에서 구입하였다.
세포 형태 분석
암세포는 PKH 연결 키트로 염색하였다. 시험관내 실험에서는 형광 현미경(자이스社 액시오버트 S 100)을 이용하여 관찰한 암세포의 형태를 광학 현미경(올림푸스社 CX21-22S-D)으로 관찰한 형태와 비교하였다. 배율은 63 X 0.5 X 215/11이었다.
쥐는 펜토바비탈나트륨(50 mg/kg 복막내 투여)으로 마취하였다. 실험 동물이 마취에서 깨어났을 때(그 동물에서 아무런 자발적 움직임이라도 보였을 때) 펜 토바비탈나트륨을 조금씩 투영하여 실험하는 동안 깊은 상태의 마취를 유지하였다.
쥐의 넙다리정맥을 열고 0.002% 헤파린 식염수로 채운 폴리에틸렌 튜브를 삽입하였다. 폴리에틸렌 튜브의 다른 쪽 끝은 암세포를 정맥 주사하기 위하여 3로 콕밸브에 연결하였다. 쥐를 그 다음에 정위 장치(나리시게 과학 장비 연구소가 생산한느 SRS-6 타입)에 놓았다. 머리 꼭대기부터 목까지 털을 면도한 다음 실험할 부위를 70% 에탄올로 소독하였다. 목뼈 위의 피부와 근육을 잘라내었다. 18Gx1 1/2 탐침으로 대수막을 지나 경질막을 뚫는 구멍을 만들었다. SP10 튜브(길이 5~6 cm)의 한쪽 끝(2~3 mm)을 거미막 밑 공간에 삽입하였다. 삽입관을 시안아크릴 접착제(cyanoacrylic glue)로 말초 조직에 고정하였다. SP10 튜브의 다른 쪽 끝은 아라키돈산(식염수 2 μL당 8.16 ng)을 투여하는데 사용하였고 그 후에는 생체내 형태 관측 실험에서 뇌 척수액을 1~2시간 동안 30분마다 채집하는 데에 사용했고 상호작용 실험에서 8 시간 동안 채집하는데 사용하였다.
상호작용 실험
이 실험은 류코트리엔 C4와 D4 수용체 길항제의 일종인 프란루카스트가 백혈구의 모세혈관 밖 유출을 억제하는지를 밝히기 위하여 고안하였다.
시료 준비
ONON 한 캅셀에 112.5 mg의 프란루카스트가 존재하므로 두 캅셀 분량의 분말을 탈이온수 2.295 mL로 경구 투여 직전에 전기 믹서를 이용하여 교반하였다. 이 용액의 투여량은 5 mL/kg(1회 프란루카스트 투여량은 490 mg/kg)이다.
PBS를 이용하여 암세포의 수를 각각의 쥐 속에 있는 중성구 수의 1/100로 맞추었다. 체중의 범위가 400±50g이므로 암세포의 수는 1.88X104에서 2.43X104이었고 쥐마다 해당하는 수의 암세포가 1 mL에 투여하도록 맞추었다.
아라키돈산은 식염수에 용해시켜서 쥐마다 816.25 ng/2 μL을 투여하였다.
세 가지의 서로 다른 처치를 아래와 같이 행하였다.
첫 번째 처치에서는 490 mg/kg의 프란루카스트 또는 탈이온수를 경구 투여하였고,
두 번째 처치에서는 암세포 또는 PBS를 투여하였고
세 번째 처치에서는 아라키돈산 또는 식염수를 투여하였다.
첫 번째 처치는 아라키돈산 투여 2시간 전에 이루어졌다. 두 번째 처치(암세포 정맥 투여)는 아라키돈산 투여 2~3분 전에 이루어졌다. 쥐 한 마리당 두 개의 삽입관을 첫 번째와 두 번째 처치 사이에 하나는 넙다리정맥으로 다른 하나는 거미막 밑 공간으로 삽입하였다.
실험 스케줄은 아래 표 1과 같이 정하였다. 표 오른쪽의 숫자는 해당되는 도면의 번호를 나타낸다. 각 실험마다 쥐 네 마리를 사용하였다.
첫 번째 처치 (경구 투여) 두 번째 처치 (정맥내 투여) 세 번째 처치 (거미막 밑 공간) 해당 도면 번호
증류수 PBS 식염수 8
증류수 암세포 -
1) COLO 201 식염수 8
2) MKN74 식염수 8
3) QG56 식염수 8
4) RCN9 식염수 8
증류수 PBS 아라키돈산 9
증류수 암세포 -
1) COLO 201 아라키돈산 10
2) MKN74 아라키돈산 10
3) QG56 아라키돈산 10
4) RCN9 아라키돈산 10
프란루카스트 PBS 식염수 8
프란루카스트 암세포 -
1) COLO 201 식염수 8
2) MKN74 식염수 8
3) QG56 식염수 8
4) RCN9 식염수 8
프란루카스트 PBS 아라키돈산 8
프란루카스트 암세포 -
1) COLO 201 아라키돈산 8
2) MKN74 아라키돈산 8
3) QG56 아라키돈산 8
4) RCN9 아라키돈산 8
측정
뇌 척수액의 부피(μL)와, 백혈구 수, 암세포의 수는 세 번째 처치 후 8시간에 걸쳐 측정하였다.
통계
아라키돈산 투여 후 8시간 동안의 작용 곡선 아래의 면적은 각각의 쥐에 대하여 계산하였다. 프란루카스트(490 mg/kg)의 암세포 수, 백혈구 수와 뇌 척수액 양에 대한 억제 효과데이터는 非파라미터 분석법인 만-휘트니(Mann-Whitney) U 검사법으로 분석하였는데, 이는 프란루카스트에 의한 억제가 완전(곡선 아래의 면적이 0)하기 때문이다. 사람 암세포가 외래 물질로서 쥐의 면역계에 영향을 주는지 여부를 분석하기 위하여 시간 작용 곡선 아래의 넓이와 분산값(Dunnet)의 분석을 통하여 쥐 암세포주 RCN9의 각각의 파라미터, 즉 백혈구 수, 암세포 수와 뇌 척수액 부피를 COLO 201, MKN74와 QG56 세포주의 상응하는 파라미터와 비교하였다. 확률은 p<0.05 수준에서 유의하였다.
결과
형태 분석
뇌에 있는 중추계 모세혈관 표면에는 혈뇌장벽 구실을 하는 수많은 도랑(ditch)이 있다. 백혈구 역시 암세포처럼 이러한 도랑을 통하여 혈뇌장벽을 뚫고 나올 수 있었다.
시험관내 실험에서 모든 암세포주, 즉 Colo 201, MKN74, QG56와 RCN9에서 염색체를 관찰할 수 있었다. 그러나 생체내 실험에서 아라키돈산을 투여하자 이 세포들은 모세혈관에서 조직(이 경우는 뇌 척수액)으로 이동하고 나서는 더 이상 염색체를 보이지 않았다. 혈관 밖으로 유출하는 도중에 암세포의 형태는 구형에서 납작한 네모로 바뀌었다(도 7a~7c). 암세포들은 아라키돈산 투여 후 곧바로 이동하였고, 백혈구의 이동이 그 뒤를 따랐다. 백혈구 역시 모세혈관에 세포 부착시 네모난 형태를 하는 것으로 관측되었지만 내피세포층 횡단 이동 후에는 그렇지 않았다(도 7a~7c). 도 7c에 나타나 있는 것처럼 암세포는 내피세포층 횡단 이동을 시작하기 전에는 내피세포 표면의 세포 부착 분자에 달라붙어 있는 듯이 보인다. 이러한 현상은 세포 부착 분자 또는 내피세포에 부착한 중성구의 형태가 네모로 나타난다는 점(도 7a와 7b)에서 백혈구(중성구)에서도 암세포와 마찬가지일 것으로 생각된다. 네모 형태의 외관을 가지게 하는 네 곳의 부착점이 있다.
상호작용 실험
물, PBS, 식염수 모두 (증류수-PBS-식염수) 아무런 효과를 가지지 못했다(도 8). 비록 암세포들이 혈관 속에 존재하고 있었지만 아라키돈산의 투여 없이 모세혈관 투과성 도는 백혈구나 암세포의 이동이 증가하지는 않았다. 즉 PBS 대신 암세포를 투여한 경우인 Colo201(증류수-Colo201-식염수), MKN74(증류수-MKN74-식염수), QG56(증류수-QG56-식염수), RCN9(증류수-RCN9-식염수)에서도 PBS의 경우(효과 없음)와 동일한 반응을 나타냈다(도 8).
모세혈관 투과성은 아라키돈산의 투여 후 곧바로 증가하였고 백혈구의 혈관 밖 유출은 아라키돈산 처치 후 30분 지나서 시작되었다(증류수-PBS-아라키돈산, 도 9). 이러한 현상은 8시간의 관찰 시간 동안 볼 수 있었는데, 시간 작용 곡선 아래의 넓이는 대조군(증류수-PBS-식염수)의 모세혈관 투과성과 비교하였을 때 통계적으로 의미 있었다.
증류수-Colo201-아라키돈산, 증류수-MKN74-아라키돈산, 증류수-QG56-아라키돈산과 증류수-RCN9-아라키돈산의 투여가 암세포의 혈관 밖 유출(도 10a)과 모세혈관의 투과성(도 10b)과 백혈구 세포 수의 증가(도 10c)를 유발하였다.
프란루카스트 자체로는 아무런 효과가 없었다. 그래프는 증류수 대신 프란루카스트가 들어간 점을 빼고는 도 8과 같다. 프란루카스트는 또한 암세포가 아라키돈산 없이 존재하고 있을 때에는 아무런 효과가 없었는데(도 8의 그래프와 동일한 반응), 이는 프란루카스트-Colo201-식염수, 프란루카스트-MKN74-식염수, 프란루카스트-QG56-식염수, 그리고 프란루카스트-RCN9-식염수 실험에 해당한다.
하지만 프란루카스트 투여는 아라키돈산의 투여로 일어나는 모세혈관의 투과성 증가와 백혈구의 혈관 밖 유출 증가를 억제하였다(도 11). 게다가 암세포가 존재하고 있는 경우, 프란루카스트는 아라키돈산 투여에 의한 모세혈관의 투과성 증가 뿐만 아니라 종양 세포의 혈관 밖 유출 역시 억제하였는데, 이는 도 11과 같은 반응을 나타낸 Colo201(프란루카스트-Colo201-아라키돈산), MKN74(프란루카스트-MKN74-아라키돈산), QG56(프란루카스트-QG56-아라키돈산), RCN9(프란루카스트-RCN9-아라키돈산) 실험에 해당된다.
세 종류의 사람 암세포에 대하여 이들이 쥐 면역계에 외래 물질로서 영향을 끼치는지 분석을 행하였다. RCN9에 대한 암세포 유출(도 12a), 뇌 척수액 부피(도 12b) 그리고 백혈구 수(도 12c) 실험 결과를 Colo201(증류수-Colo201-아라키돈산), MKN74(증류수-MKN74-아라키돈산)와 QG56(증류수-QG56-아라키돈산)에 대한 실험 결과와 비교하였다. RCN9의 결과와 비교하였을 때, Colo201 암세포의 내피세포층 횡단 이동은 유의하게 증가한 것(도 12a)으로 나타났으나, 다른 두 암세포의 경우는 그렇지 않았다. 그러나 RCN9(증류수-RCN9-아라키돈산)에서 나타난 모세혈관 투과성과 백혈구 세포 수의 증가는 Colo201(증류수-Colo201-아라키돈산), MKN74(증류수-MKN74-아라키돈산)와 QG56(증류수-QG56-아라키돈산)의 경우에 비교하여 유의하게 다르지는 않은 것으로 관측되었다(도 12b와 12c). MKN74(증류수-MKN74-아라키돈산)의 경우 백혈구의 유출은 암세포 없이 백혈구가 유출하는 경우(증류수-PBS-아라키돈산, 도 9)보다 더 일찍(아라키돈산 후 30분 이내) 일어났다.
토의
혈뇌장벽을 관통하지 못하는, 류코트리엔 C4와 D4 수용체 길항제 프란루카스트는 모세혈관 투과성과 백혈구의 혈관 밖 유출을 억제한다. 이러한 사실은 프란루카스트의 작용 방식은 말초적이고 내피세포와 모세혈관 내강을 포함하는 혈관 내부로부터 일어난다는 점을 시사한다.
형태 분석 연구 결과는 종양 세포와 백혈구 모두 중추계 모세혈관에 있는 혈뇌장벽의 구멍을 통해서 뿐만 아니라 말초 모세혈관에 존재하는 내피세포 사이의 틈을 통해서도 이동한다는 것을 시사한다.
암세포가 스스로의 형태를 바꿀 수 있는 능력, 예를 들어 얇고 네모난 형태로 바꾸는 능력은 모세혈관에서 조직으로 이동하는데 도움이 된다. 얇은 모양의 암세포는 아주 좁은 틈새라도 빠져나갈 수 있는데 그 까닭은 편평해진 암세포의 네모만 귀퉁이가 좁은 틈새 사이로 내피세포층을 횡단하는데 유리하기 때문이다.
프란루카스트가 종양 세포 이동을 억제하는 원리는 그러한 틈새가 막혀 있도록 하는 데 달려 있을 수 있다. 실제로 도 7a와 7b에 나타난 결과는 암세포가 내피세포층에 여전히 부착하고 있는 백혈구보다 더 일찍 이동하기 시작한다는 것을 시사한다. 백혈구의 혈관 밖 유출이 시작하는 시점은 일부 종양 세포, 예를 들어 본 실험예에서 보인 MKN74가 존재하면 그 영향을 받을 수 있다(도 10c).
본 실험예에서는 세 종류의 사람 암세포와 한 종류의 쥐 암세포를 사용하였다. 이 네 가지 암세포 모두에게서 모세혈관 밖 유출이 관측되었는데, 사람 암세포 Colo201의 세포 수가 8시간째(=면적)에 유의하게 늘어났지만 다른 두 사람 암세포, 즉, MKN74와 QG56의 세포 수는 RCN9의 경우와 유의하게 다르지 않았다.
쥐 암세포 RCN9에서 일어난 모세혈관 투과성과 백혈구 세포 수의 증대는 다른 세 종류의 사람 종양 세포에서 얻은 모세혈관 투과성과 백혈구 수 증가와 유의하게 다르지 않았다. 이는 사람 암세포가 쥐 면역계에 외래 물질로서 미치는 영향이 작다는 것을 시사한다. 그러나 MKN74의 존재 하(증류수-MKN74-아라키돈산, 도 10c)에서는 백혈구의 혈관 밖 유출 시작에 걸리는 시간이 MKN74가 부재하였던 경우(증류수-PBS-아라키돈산)와 비교했을 때 짧았던 점을 고려하면, 아라키돈산 투여 직후에 모세혈관의 투과성이 늘어나고 백혈구의 유출이 아라키돈산 투여 30분 후에 일어났다는 사실(도 9)로부터 쥐 면역계에 영향을 미쳤다는 점을 미루어 짐작할 수 있다. 이렇게 유출 시작까지 걸리는 시간이 줄어든 것은 MKN74의 유출로 혈뇌장벽의 틈새가 벌어져 백혈구의 내피세포층 횡단 이동을 가능하게 한 것에 힘입었을 수 있다. 그러나 시간 작용 곡선 아래의 넓이를 8시간 동안 합산하여 전체적인 효과를 분석한 결과 통계적으로 유의한 수치는 아니었다(도 12c).
종양 세포를 혈관으로 투여하기 위하여 삽입관을 정맥에 꽂거나, 중추계 모세혈관으로부터 이동한 종양 세포와 같은 시료를 얻기 위하여 거미막 밑 공간으로 삽입관을 투입하는 방법은 간 종양 세포 전이를 연구하는 데에 있어서 하나의 수단이 될 수 있다. 현재 알려져 있는 한도에서 거미막 밑 공간 같이 모세혈관으로부터 이동해 나온 백혈구나 종양 세포의 수를 셀 수 있는 부위는 존재하지 않는다.
암세포와 백혈구 세포 모두 그 겉면이 시알릴루이스 단백질로 덮여 있다는 것이 알려져 있는데, 이 시알릴루이스 단백질은 종마다 구별되며, 내피세포 표면의 e-셀렉틴과 p-셀렉틴의 리간드 구실을 하는 당단백질이다. 사람 암세포의 시알릴루이스 단백질이 내피세포층 표면의 이 셀렉틴들을 인식하지 못할 수 있기 때문에, 사람 암세포는 내피세포층에 부착하지 않을 것이고 따라서 모세혈관을 관통하여 이동하기는 어려울 것이라고 생각해 왔다.
본 발명에서 내피세포층 횡단 이동이 아라키돈산 투여 후에 세 종류의 사람 암세포 모두에서 관측되었고, 이러한 이동이 프란루카스트로 전처리한 쥐에서 저해되었다. 따라서 쥐를 이용하여 사람 종양 세포의 전이를 생체내 연구 연구할 수 있다.
결론적으로 본 발명자는
1) 프란루카스트가 모세혈관 투과성을 저해하여 종양 세포와 백혈구의 혈관 밖 유출을 저해한다는 점
2) 안정성과 약효 지속성이 있는 프란루카스트를 항종양세포전이제로 사용할 수 있다는 것
3) 모세혈관 투과성의 증가를 저해하는 것이 항암전이 과정에서 필수적이라는 점
4) 사람 암세포가 쥐 모세혈관에서 조직으로 이동할 수 있으므로 이러한 쥐 모델을 약물의 항암전이성을 검정하는 방법으로 이용할 수 있다는 점을 발견하였다.
본 발명을 충분히 설명한 만큼, 당업자는 과도한 시행 착오 없이 본 발명의 기술 사상과 기술 범위를 벗어나지 않고도 실질적으로 동일한 파라미터, 농도와 실험 조건의 넓은 범위에 걸쳐서 동일한 효과를 가지게끔 발명을 실시할 수다는 점을 잘 이해할 수 있을 것이다.
비록 본 발명을 구체적인 실험예와 실시예를 통하여 설명하였지만, 나아가 발명을 변경하여 실시할 수 있다는 것은 잘 알 수 있을 것이다. 본 발명의 이러한 구체적인 적용에는 포괄적으로 본 발명의 원리를 따라 발명을 변화시키거나 특정 용도로 사용하거나, 적절히 변형하는 경우가 포함되며, 아울러 본 명세서에서 개시한 내용을 이 발명이 속하는 분야에서 공지된 방식으로 변형하는 것까지 포함된다. 이러한 변형을 본 명세서 하기의 청구범위에서 발명의 필수적이라고 기재하는 구성 요소에 적용하는 것도 발명의 범위에 속함은 물론이다.
학술 논문과 초록, 공개되거나 교신 중에 있는 미국 또는 다른 나라의 특허 출원, 등록된 미국 또는 다른 나라의 특허 또는 다른 모든 참고 문헌을 포함하여 본 명세서에서 인용하는 모든 참고문헌은 앞서 발명의 기술 분야에서 제시한 인용 문헌 목록 등에 상술하였으며, 이는 인용된 모든 데이터, 표, 도면과 해당 참고 문헌의 기재에 다 적용되는 바이다. 또한 본 명세서에서 인용하는 참고 문헌에서 다른 참고 문헌을 인용하는 경우에도 본 명세서에서 인용 문헌으로 표시하였다.
공지 기술의 방법, 통상적인 방법 수단에 대하여 언급한 것은 어떠한 경우에도 본 발명의 한 측면이나 내용의 기재 또는 실시예가 관련 기술에서 공지되었거나 예측되었거나 시사되었다고 자인하는 것이 아님을 밝혀 둔다.
본 발명의 구체적인 실시예에 대한 상기 기술에서 본 발명의 기술적 사상을 완전히 밝히고 있으므로, 과도한 시행착오 없이도 본 발명의 기술 사상의 범위를 벗어나지 않는 범위에서 이 분야의 공지 기술(본 명세서에서 인용한 문헌의 내용을 포함하여)을 이용하여 본 발명을 쉽게 변경하거나/변경하고 다양한 용도와 구체적 실시예에 적절히 적용할 수 있을 것이다. 따라서 그러한 적용과 변경은 본 명세서에서 개시하고 제시한 내용을 바탕으로 하여 본 발명이 개시하는 실시예들의 균등물에 포함된다. 본 명세서에서 사용된 용어나 술어는 내용을 기술하기 위한 것이지 범위를 제한하기 위한 것이 아니며, 본 명세서의 용어나 술어는 당업자가 본 명세서에서 개시하고 제시한 내용을 참조하여 해당 업계의 통상적인 지식을 가지고 해석하여야 함을 밝혀 둔다.
따라서 "…하기 위한 수단"과 "…하는 수단" 또는 방법발명의 단계에 대한 기재와 같이 기능에 대한 기재가 뒤따르고 상기 명세서에서 설명하였거나 아래 청구범위에서 발견할 수 있는 표현에는 현재 존재하거나 장래에 그러한 기능을 수행할 수 있는 모든 구조적, 물리적, 화학적 또는 전기적 구성 요소나 구조 또는 방법 발명의 단계가 정의되거나 포함되며 이는 그러한 구조나 발명이 본 명세서에서 개시한 실시예와 정확하게 균등하지 않은 경우에도 해당되는데, 다시 말하면 다른 수단 또는 방법을 써서 동일한 과제를 수행할 수 있다는 의미이다. 따라서 상기의 표현을 해석할 때는 가장 넓은 의미로 해석하라는 취지이다.
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Claims (24)

  1. 유효량의 류코트리엔 길항제(leukotriene antagonist) 또는 약제학적으로 허용되는 그 염(鹽)을, 항종양세포부착(anti-tumor cell adhesion), 항조직침투(anti-invasion) 또는 항암세포전이(anti-metastasis)의 특성을 가지는 다른 화합물의 부존재하에, 암세포의 전이를 막을 필요가 있는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 세포 전이 저해 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 류코트리엔 길항제 또는 약제학적으로 허용되는 그 염을 경구 투여하는 것을 특징으로 하는 종양 세포 전이 저해 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 류코트리엔 길항제는 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제인 것을 특징으로 하는 종양 세포 전이 저해 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제는 하기 화학식 (I)의 화합물인 것을 특징으로 하는 종양 세포 전이 저해 방법:
    화학식 (I)
    Figure 112007013210356-PCT00004
    상기 식에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 동일하거나 다른 작용기로서 수소, 할로겐, 히드록시, 아미노, 카르복시, 니트로, 시안, 저급(lower) 알킬, 저급 알콕시, 저급 알칸오일(alkanoyl), 저급 알칸오일옥시(alkanoyloxy), 저급 알콕시카르보닐, 저급 모노 또는 디알킬 치환된 아미노, 아랄킬(aralkyl), 아릴 또는 헤테로아릴 작용기이고,
    Q는 카르복시, 저급 알콕시카르보닐 또는 테트라조일(tetrazoyl) 작용기이고,
    X는 산소, 황 또는 -NR-(여기서 R은 수소이거나 저급 알킬이다) 작용기이며,
    Z는 수소 또는 저급 알킬이고,
    m은 1 부터 6까지의 정수이다.
  5. 제4항에 있어서, 상기 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제는 프란루카스트(pranlukast)인 것을 특징으로 하는 종양 세포 전이 저해 방법.
  6. 유효량의 류코트리엔 길항제 또는 약제학적으로 허용되는 그 염을, 전이를 막을 필요가 있으며 현재 수술 절차를 진행 중이 아닌 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양 세포 전이 저해 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 류코트리엔 길항제 또는 약제학적으로 허용되는 그 염을 경구 투여하는 것을 특징으로 하는 종양 세포 전이 저해 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 류코트리엔 길항제는 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제인 것을 특징으로 하는 종양 세포 전이 저해 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제는 하기 화학식 (I)의 화합물인 것을 특징으로 하는 종양 세포 전이 저해 방법:
    화학식 (I)
    Figure 112007013210356-PCT00005
    상기 식에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 동일하거나 다른 작용기로서 수소, 할로겐, 히드록시, 아미노, 카르복시, 니트로, 시안, 저급(lower) 알킬, 저급 알콕시, 저급 알칸오일(alkanoyl), 저급 알칸오일옥시(alkanoyloxy), 저급 알콕시카르보닐, 저급 모노 또는 디알킬 치환된 아미노, 아랄킬(aralkyl), 아릴 또는 헤테로아릴 작용기이고,
    Q는 카르복시, 저급 알콕시카르보닐 또는 테트라조일(tetrazoyl) 작용기이고,
    X는 산소, 황 또는 -NR-(여기서 R은 수소이거나 저급 알킬이다) 작용기이며,
    Z는 수소 또는 저급 알킬이고,
    m은 1 부터 6까지의 정수이다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제는 프란루카스트인 것을 특징으로 하는 종양 세포 전이 저해 방법.
  11. 유효량의 류코트리엔 길항제 또는 약제학적으로 허용되는 그 염을 내피세포에 접촉시켜 모세혈관 투과성을 저해하고/저해하거나, 상기 길항제를 접촉한 내피세포에 대한 종양 세포 부착을 억제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    종양 세포의 내피세포에 대한 부착 및/또는 종양 세포의 내피세포층 횡단 이동의 형태로 나타나는 모세혈관 투과성의 저해 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 류코트리엔 길항제 또는 약제학적으로 허용되는 그 염을 경구 투여하는 것을 특징으로 하는, 종양 세포 부착 및 모세혈관 투과성의 저해 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 류코트리엔 길항제는 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제인 것을 특징으로 하는, 종양 세포 부착 및 모세혈관 투과성의 저해 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제는 하기 화학식 (I)의 화학물인 것을 특징으로 하는,
    종양 세포 부착 및 모세혈관 투과성의 저해 방법:
    화학식 (I)
    Figure 112007013210356-PCT00006
    상기 식에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 동일하거나 다른 작용기로서 수소, 할로겐, 히드록시, 아미노, 카르복시, 니트로, 시안, 저급(lower) 알킬, 저급 알콕시, 저급 알칸오일(alkanoyl), 저급 알칸오일옥시(alkanoyloxy), 저급 알콕시카르보닐, 저급 모노 또는 디알킬 치환된 아미노, 아랄킬(aralkyl), 아릴 또는 헤테로아릴 작용기이고,
    Q는 카르복시, 저급 알콕시카르보닐 또는 테트라조일(tetrazoyl) 작용기이고,
    X는 산소, 황 또는 -NR-(여기서 R은 수소이거나 저급 알킬이다) 작용기이며,
    Z는 수소 또는 저급 알킬이고,
    m은 1 부터 6까지의 정수이다.
  15. 제14항에 있어서, 상기 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제는 프란루카스트인 것을 특징으로 하는, 종양 세포 부착 및 모세혈관 투과성의 저해 방법.
  16. 1) 저해제(inhibitor) 후보 물질을 사람이 아닌 포유동물에게 투여하는 단계;
    2) 상기 1)의 저해제 후보 물질 투여 직후에 상기 사람이 아닌 포유동물에 종양 세포를 정맥내 투여하는 단계;
    3) 뇌 경질막(硬質膜, dura mater)을 관통하여 상기 사람이 아닌 포유동물의 거미막 밑 공간(subarachnoid space)에 삽입된 삽입관을 통하여, 모세혈관의 투과성을 증가시키는 염증 유발 물질을 투여하는 단계;
    4) 뇌 척수액을 채집하는 단계; 및
    5) 상기 채집한 뇌 척수액에서 모세혈관 밖으로 유출된 종양 세포의 수를 세어 상기 저해제 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 후보 물질이 종양 세포의 모세혈관 투과성의 억제제인지 판별하는 단계를
    포함하는 것이 특징인 종양 세포 모세혈관 투과 저해제의 선별 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 염증 유발 물질은 아라키돈산(arachidonic acid), 프 로스타글란딘(prostaglandin), 트롬복산(thromboxane), 히스타민(histamine), 지질다당류(lipopolysaccharide), 덱스트란(dextran), 브래디키닌(bradykinin), 카라기난(carrageenan), 류코트리엔, 종양 괴사인자 α(tumor necrosis factor α, TNFα), 인터류킨-1β(interleukin-1β, IL-1β)과 인터류킨-6(IL-6)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것이 특징인 저해제의 선별 방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 염증 유발 물질은 아라키돈산인 것을 특징으로 하는 저해제의 선별 방법.
  19. 제16항에 있어서, 채집한 뇌 척수액의 양을 측정하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 저해제의 선별 방법.
  20. 제16항에 있어서, 상기 사람이 아닌 포유동물이 래트(rat)인 것을 특징으로 하는 저해제의 선별 방법.
  21. 항종양세포부착성, 항조직침투성 또는 항전이성을 갖춘 물질의 부존재하에 종양 세포 전이를 저해하기 위한 약제의 제조를 위한 류코트리엔 길항제 또는 약학적으로 허용되는 그 염의 용도.
  22. 제21항에 있어서, 상기 류코트리엔 길항제는 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제인 것이 특징인 류코트리엔 길항제 또는 약학적으로 허용되는 그 염의 용도.
  23. 제18항에 있어서, 상기 류코트리엔 길항제는 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제는 하기 화학식 (I)의 화합물인 것이 특징인 류코트리엔 길항제 또는 약학적으로 허용되는 그 염의 용도.
    화학식 (I)
    Figure 112007013210356-PCT00007
    상기 식에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 동일하거나 다른 작용기로서 수소, 할로겐, 히드록시, 아미노, 카르복시, 니트로, 시안, 저급(lower) 알킬, 저급 알콕시, 저급 알칸오일(alkanoyl), 저급 알칸오일옥시(alkanoyloxy), 저급 알콕시카르보닐, 저급 모노 또는 디알킬 치환된 아미노, 아랄킬(aralkyl), 아릴 또는 헤테로아릴 작용기이고,
    Q는 카르복시, 저급 알콕시카르보닐 또는 테트라조일(tetrazoyl) 작용기이고,
    X는 산소, 황 또는 -NR-(여기서 R은 수소이거나 저급 알킬이다) 작용기이며,
    Z는 수소 또는 저급 알킬이고,
    m은 1 부터 6까지의 정수이다.
  24. 제23항에 있어서, 상기 류코트리엔 C4 또는 D4 수용체 길항제는 프란루카스트인 것을 특징으로 하는 류코트리엔 길항제 또는 약학적으로 허용되는 그 염의 용도.
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