JP6630285B2 - Ｅｒｇ発癌遺伝子陽性癌のための新規阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、ＥＲＧ腫瘍性タンパク質の小分子阻害剤、及び前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ：ＣａＰ）などのＥＲＧ陽性癌を治療するための候補治療法としてのかかる化合物の使用に関する。ＣａＰは、最も頻繁に診断される非皮膚悪性腫瘍であり、西欧諸国における男性の癌による死亡原因の第２位である。ＰＳＡスクリーニングによって早期に検出されたＣａＰは、手術または放射線によって有効に処置されるものの、有意なＣａＰ患者のサブセット（２０％〜４０％）は、決定的治療を受けた後に疾患の再発を経験するため、ホルモン除去療法を必要とする。治療に対する初期反応にも関わらず、転移性ＣａＰ腫瘍は、最終的にホルモン除去療法に対する抵抗性を示すようになる。このような患者のサブセットの場合、すなわち、転移性ホルモン抵抗性癌を有するサブセットについては、有効な治療法が存在しない。

ＥＲＧ癌原遺伝子は、遺伝子発現の正負双方の調節因子であるＥＴＳ転写因子の大きなファミリーに属する（Ｗａｔｓｏｎら、２０１０）。これらの転写因子は、細胞増殖、細胞分化、発生、転換、アポトーシス及び免疫制御に関わる分裂促進シグナル導入経路の下流エフェクターである（Ｗａｔｓｏｎら、２０１０、Ｓｒｅｅｎａｔｈら、２０１１）。ＥＲＧ遺伝子は、前立腺癌において遺伝子変異が最も頻繁に認められる。再発性のＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ遺伝子融合は、西欧諸国における全てのＣａＰ患者のほぼ半数に存在する。この遺伝子融合により、切断型ＥＲＧタンパク質（３２アミノ末端残基の欠失）が、男性ホルモン依存性となり、かつ腫瘍細胞特異的に発現する。従って、ＥＲＧの変異及びＥＲＧタンパク質の過剰発現は、ＣａＰの発生及び進行に関連する。

ＣａＰにおけるＥＲＧ発現はＡＲ依存性である。ＣａＰを治療するための治療法としては、多くのアンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＡＲ）シグナル阻害剤が既に使用されているものの、本発明者らは、これまで、ＥＲＧ発現を選択的に阻害することができる化合物を認識していなかった。従って、本発明は、ＥＲＧ発現を選択的に阻害する小有機分子について記載する。

本発明は、ＥＲＧ腫瘍性タンパク質の選択的阻害剤、及びＥＲＧ陽性癌を治療するための治療薬としてのかかる阻害剤の使用について記載する。一実施形態では、本発明は、治療上有効量のＥＲＧ発現阻害剤を単独で、または他の療法と組み合わせて患者に投与することにより、当該患者における野生型ＥＲＧタンパク質の過剰発現、変異ＥＲＧタンパク質の過剰発現、ＥＲＧ遺伝子転写の亢進、またはＥＲＧ ｍＲＮＡ翻訳の亢進に関連した癌の治療方法または予防方法を提供する。本発明の方法の一実施形態に従い、阻害剤は、ＥＲＧ ｍＲＮＡ遺伝子転写またはＥＲＧ ｍＲＮＡ翻訳を選択的に阻害する。本発明の方法の別の実施形態によれば、阻害剤は、野生型ＥＲＧタンパク質若しくは変異ＥＲＧタンパク質の過剰発現、またはＥＲＧ陽性腫瘍細胞の成長を選択的に阻害する。

本発明の方法に従って使用されるＥＲＧ阻害剤は、ＥＲＧタンパク質発現を選択的に阻害する。ＥＲＧ発現を阻害する例示的な小分子化合物は、
からなる群から選択されるもの、またはその薬学的に許容される塩である。

一実施形態によれば、本明細書に記載された任意の他の実施形態と任意に組み合わせて、ＥＲＧタンパク質の過剰発現に対する阻害剤として以下に示される小分子１−（チアゾール−２−イルジアゼニル）ナフタレン−２−オル
を投与することによって治療が行われる。

ＥＲＧタンパク質の過剰発現に対する上記阻害剤を１種以上用いた本発明の方法は、癌、特に、前立腺癌、大腸癌、ユーイング肉腫、血管腫瘍及び白血病からなる群から選択されるＥＲＧ陽性癌の治療に使用することができる。一実施形態に従い、本明細書に記載された任意の他の実施形態と任意に組み合わせて、本発明の方法は、前立腺癌と診断された患者を治療するために使用される。

本発明は、ＥＲＧ腫瘍性タンパク質発現の阻害剤、及びＥＲＧ腫瘍性タンパク質の過剰発現に関連した癌を治療または予防するためのかかる化合物の使用も提供する。ＥＲＧ腫瘍性タンパク質の過剰発現に関連した癌を治療または予防するための薬剤の製造におけるＥＲＧ発現の阻害剤の使用も提供される。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載された任意の他の実施形態と任意に組み合わせて、本発明は、癌に罹患している患者における野生型ＥＲＧタンパク質の過剰発現、変異ＥＲＧタンパク質の過剰発現、ＥＲＧ遺伝子転写の亢進、またはＥＲＧ ｍＲＮＡ翻訳の亢進に関連した当該癌の治療または予防に使用するためのＥＲＧ発現の阻害剤を提供する。ＥＲＧ遺伝子の転写及び／または翻訳が被検体において亢進し得るプロセスには、遺伝子融合、突然変異、複製または他の機序が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＥＲＧ発現の阻害剤は、ＥＲＧ陽性腫瘍細胞の成長を阻害する。

他の実施形態では、本明細書に記載されたその任意の実施形態と任意に組み合わせて、本発明は、癌に罹患している患者における野生型ＥＲＧタンパク質の過剰発現、変異ＥＲＧタンパク質の過剰発現、ＥＲＧ遺伝子転写の亢進、またはＥＲＧ ｍＲＮＡ翻訳の亢進に関連した当該癌を治療または予防するためのＥＲＧ発現の阻害剤の使用を提供する。

なお他の実施形態では、本明細書に記載された任意の他の実施形態と任意に組み合わせて、本発明は、癌に罹患している患者における野生型ＥＲＧタンパク質の過剰発現、変異ＥＲＧタンパク質の過剰発現、ＥＲＧ遺伝子転写の亢進、またはＥＲＧ ｍＲＮＡ翻訳の亢進に関連した当該癌を治療または予防するための薬剤の製造におけるＥＲＧ発現の阻害剤の使用を提供する。一実施形態では、ＥＲＧ腫瘍性タンパク質の阻害剤は、ＥＲＧ陽性の腫瘍細胞の成長を阻害する。

ＥＲＧｉ−ＵＳＵ（１３９０２１）及びＮＣＳ−６６９２９による、ＶＣａＰ細胞におけるＥＲＧ、ＡＲ及びＰＳＡタンパク質レベルの阻害を示す図である。 ＥＲＧ陽性のＣａＰ細胞及びＥＲＧ陰性のＣａＰ細胞におけるＡＲ発現に対するＥＲＧｉ−ＵＳＵの効果を示す図である。 ＥＲＧ陽性の腫瘍細胞系及び正常内皮細胞におけるＥＲＧタンパク質発現に対するＥＲＧｉ−ＵＳＵの効果を示す図である。 小分子ＥＲＧｉ−ＵＳＵによる、ＥＲＧ陰性の腫瘍細胞または正常細胞に対するＥＲＧ陽性の腫瘍細胞線系の成長の選択的阻害を示す図である。 （Ａ）は、ＥＲＧｉ−ＵＳＵの類似体によるＥＲＧ発現の阻害を示す図であり、（Ｂ）は、ＥＲＧｉ−ＵＳＵの類似体の細胞成長阻害活性を示す図である。 （Ａ）は、ＥＲＧ陽性腫瘍成長の異種移植モデルの阻害を示すグラフである。対照動物（一番上の曲線）は、検査を通じて最大の腫瘍容積を呈したのに対し、最大用量のＥＧｉ−ＵＳＵを受けたマウス（一番下の曲線）は、最小の容積を呈した。（Ｂ）は、対照動物（０ｍｇ／ｋｇ）から収集された異種移植腫瘍の写真である。（Ｃ）は、１００ｍｇ／ｋｇを受けた動物から収集された異種移植腫瘍の写真である。（Ｄ）は、１５０ｍｇ／ｋｇを受けた動物から収集された異種移植腫瘍の写真である。

定義
「薬学的に許容される塩（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔ）」は、本発明の化合物の薬学的に許容される有機または無機の酸性塩または塩基塩である。薬学的に許容される代表的な塩類としては、例えば、酢酸塩、アムソネート（ａｍｓｏｎａｔｅ）（４，４−ジアミノスチルベン−２，２−ジスルホネート）、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、酪酸塩、カルシウム、エデト酸カルシウム、カンシラート（ｃａｍｓｙｌａｔｅ）、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩（ｃｌａｖｕｌａｒｉａｔｅ）、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート（ｅｓｔｏｌａｔｅ）、エシレート（ｅｓｙｌａｔｅ）、フマル酸塩、グルセプテート（ｇｌｕｃｅｐｔａｔｅ）、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニレート（ｇｌｙｃｏｌｌｙｌａｒｓａｎｉｌａｔｅ）、ヘキサフルオロリン酸塩、ヘキシルレゾルシネート（ｈｅｘｙｌｒｅｓｏｒｃｉｎａｔｅ）、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエート（ｈｙｄｒｏｘｙｎａｐｈｔｈｏａｔｅ）、ヨウ化物、イソチオネート（ｉｓｏｔｈｉｏｎａｔｅ）、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシレート（ｍｅｓｙｌａｔｅ）、臭化メチル、硝酸メチル、硫酸メチル、ムケート（ｍｕｃａｔｅ）、ナプシレート（ｎａｐｓｙｌａｔｅ）、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、３−ヒドロキシ−２−ナフトエート、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩（１，１−メテン−ビス−２−ヒドロキシ−３−ナフトエート、エインボネート（ｅｉｎｂｏｎａｔｅ））、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ピクリン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリチル酸塩、スラメート（ｓｕｒａｍａｔｅ）、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシラート（ｔｏｓｙｌａｔｅ）、トリエチオジド、及び吉草酸塩などの、アルカリ金属塩類、アルカリ土類塩類、アンモニウム塩類、水溶性塩類及び水不溶性塩類が挙げられる。薬学的に許容される塩は、その構造内に複数の帯電原子を有することができる。この場合、薬学的に許容される塩は、複数の対イオンを有することができる。従って、薬学的に許容される塩は、１つ以上の帯電原子及び／または１つ以上の対イオンを有することができる。

用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、疾患または疾患に伴う症状を改善または根絶することを指す。ある実施形態では、かかる用語は、このような疾患を有する患者に１つ以上の予防薬または治療薬を投与することから生じる当該疾患の拡大または悪化を最小限にすることを指す。

用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防している（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」及び「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、予防薬または治療薬の投与から生じる患者の疾患の発症、再発または拡大を予防することを指す。

用語「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、疾患の治療若しくは予防における治療的若しくは予防的な利点を提供するか、または疾患に伴う症状を遅延させるか若しくは最小限に抑えるのに十分な本発明の化合物または他の活性成分の量を指す。さらに、本発明の化合物に関する治療上有効量は、単独で、または他の治療法と組み合わせて、疾患の治療または予防における治療的な利点を提供する治療薬の量を意味する。本発明の化合物に関連して使用されるとき、当該用語は、全体的な治療効果を改善するか、または疾患の症状若しくは原因を低減若しくは回避する量、あるいは、別の治療薬の治療効果またはその薬との相乗効果を強化する量を含むことができる。

「患者」には、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、仔ヒツジ、ブタ、トリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ネズミ、ウサギまたはモルモットなどの動物が含まれる。動物は、非霊長類及び霊長類（例えば、サルやヒト）などの哺乳類とすることができる。一実施形態では、患者は、ヒトの乳児、子供、青年または成人などのヒトである。

化合物及び方法
本発明は、選択的なＥＲＧ阻害剤化合物、及び患者におけるＥＴＳ関連遺伝子（ＥＴＳ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ：ＥＲＧ）、野生型ＥＲＧタンパク質または変異ＥＲＧタンパク質の過剰発現に関わる癌を治療または予防するためのかかる化合物の使用方法に関する。より具体的には、本発明のＥＲＧ阻害剤は、試験された大部分のアンドロゲン受容体（ａｎｄｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＡＲ）陽性のＣａＰ細胞系においてＡＲシグナリングを減弱しなくても阻害しなくても良く、従って、前立腺癌を治療するための発症機序としてＡＲシグナリングを阻害する治療薬と比較して中毒性副作用が少ない。加えて、本発明に係るＥＲＧ阻害剤は、ＡＲを発現しない腫瘍細胞系においてＥＲＧタンパク質を阻害する。

ＥＲＧ特異的な小分子阻害剤を特定するために、本発明者らは、ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合陽性前立腺癌（ＶＣａＰ）細胞系を小分子ライブラリ内の一定濃度の各化合物と接触させることにより、小分子化合物のライブラリをスクリーニングした。ＥＲＧタンパク質の発現は、検出用の非常に特異的なＥＲＧモノクローナル抗体（ＣＰＤＲ ＥＲＧ−ｍＡｂ；９ＦＹ）を用いたＩｎ−ｃｅｌｌウエスタンブロット分析（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ネブラスカ州）を用いて監視された。Ｆｕｒｕｓａｔｏら、Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓ．，１３：２２８−３７２（２０１０）；Ｍｏｈａｍｅｄら、Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ，１：１９７−２０８，（２０１０）；Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ Ｐａｔｈｏｌ．，３５：４３２−４１（２０１１）；及び米国特許公開第２０１２／０１３５０１８Ａ１号を参照のこと。

この予備スクリーンでは、小分子阻害剤のサブセットが特定された。さらに、これらの阻害剤はそれぞれ、ＥＲＧ ｍＲＮＡ及びＥＲＧタンパク質の発現を阻害する能力の有無を見るために定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びウエスタンブロット解析によって評価された。ＥＲＧ ｍＲＮＡ及びＥＲＧタンパク質の発現の継続的な阻害を基準として、生化学的検査及び細胞成長阻害検査をさらに行うために２つの小分子ＮＳＣ１３９０２１（ＥＲＧｉ−ＵＳＵ）及びＮＳＣ９９６２９が選択された。

前立腺癌の治療向けに承認された方針では常に、前立腺の癌細胞におけるＡＲ活性を減弱または阻害する治療薬が必要とされる。ＶＣａＰ前立腺癌細胞におけるＥＲＧの発現はＡＲによって調節されているため、本発明者らは、観察されたＥＲＧ阻害活性がＥＲＧｉ−ＵＳＵ及びＮＳＣ９９６２９によるＡＲ阻害に起因するものであったかどうかについて評価し続けた。図１に示す、かつ以下でさらに説明するように、ＮＳＣ９９６２９ではなくＥＲＧｉ−ＵＳＵが、ＶＣａＰ前立腺癌細胞においてＡＲの発現及び前立腺特異抗原（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＳＡ）を阻害した。

ＥＲＧｉ−ＵＳＵがＥＲＧタンパク質発現の選択的阻害剤であるかどうかを調べるために、ＡＲ（野生型）陽性及びＥＲＧ陰性であるＬＡＰＣ４細胞に加えて、ＡＲ陽性／ＥＲＧ陰性の前立腺癌細胞系、すなわちＬＮＣａＰ及びＭＤＡ ＰＣａ２ｂ（ＡＲ陽性及びＥＲＧ陰性の変異体）において、当該化合物のＡＲ活性及びＰＳＡ活性を阻害する能力の有無をさらに試験した。

ゲル電気泳動分析によって示され（図２を参照）、かつ以下でさらに説明するように、ＥＲＧｉ−ＵＳＵによるＡＲの阻害は、ＶＣａＰ細胞に特異的である。ＡＲ阻害は、このスクリーンで使用された他のＡｒ陽性／ＥＲＧ陰性細胞系では観察されなかった。

従って、一実施形態では、本発明は、治療上有効量のＥＲＧ発現阻害剤を患者に投与することにより、当該患者におけるＥ−２６関連遺伝子（Ｅ−ｔｗｅｎｔｙ ｓｉｘ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅ：ＥＲＧ）の野生型ＥＲＧタンパク質生成物または変異ＥＲＧタンパク質生成物の過剰発現に関わる癌の治療方法または予防方法を提供する。本発明の阻害剤は、ＥＲＧ発現を選択的に阻害する。ＥＲＧ発現を低減または阻害する正確な機序は不明であるが、本発明の化合物は、細胞成長にとって不可欠である遺伝子の調節を変化させることにより、ＥＲＧ ｍＲＮＡ遺伝子翻訳、ＥＲＧ ｍＲＮＡ転写に影響を与えてＥＲＧタンパク質がその機能的に活性な三次構造を獲得することを防ぎ得るか、またはＥＲＧ陽性腫瘍の成長を阻害し得る。

本発明者らによる検査は、ＥＲＧｉ−ＵＳＵが、正常内皮細胞においてＥＲＧの発現を阻害せず、癌細胞においてＥＲＧ発現を選択的に阻害することを示している。図３に示すように、ＥＲＧｉ−ＵＳＵは、ＥＲＧ陽性の癌細胞系においてＥＲＧの発現を用量依存的に阻害する。しかしながら、正常ＨＵＶＥＣ細胞では、ＥＲＧタンパク質発現の阻害を観察することができなかった。

癌細胞におけるＥＲＧの過剰発現は、癌遺伝子中毒（一部のＥＲＧ陽性癌細胞が、それらの成長及び生存のためにＥＲＧタンパク質の活性に依存している状態）の発生に影響を及ぼすと考えられている。従って、ＥＲＧ陽性癌細胞におけるＥＲＧタンパク質発現の阻害または減弱により、癌細胞の成長及び生存が阻止され得る。細胞成長阻害検査の結果によって示されるように（図４を参照）、ＥＲＧ発現の阻害により、ＥＲＧ陽性癌細胞の成長が妨げられる。しかしながら、ＥＲＧ陰性の前立腺癌細胞系、ＥＲＧ陰性の不死化良性前立腺細胞系（ＢＰＨ１）、及びＥＲＧ陽性の正常細胞では、細胞成長阻害効果は観察されなかった。これらの結果により、前立腺癌などのＥＲＧ陽性癌に対する選択的治療のための候補治療薬としてＥＲＧｉ−ＵＳＵを使用することが支持される。従って、小分子ＥＲＧｉ−ＵＳＵを用いたＥＲＧ陽性癌の治療方法は、ＡＲ活性を減弱若しくは阻害し、かつ／またはホルモン活性を除去する薬剤を用いた治療に反応を示さない転移型ホルモン抵抗性前立腺癌を治療するための新規手法を提供する。本発明に係るＥＲＧ過剰発現阻害剤はまた、癌の治療が可能な１種以上の他の治療薬と組み合わせて使用される。このような組み合わせ治療レジメンの一態様によれば、本発明のＥＲＧ過剰発現阻害剤は、前立腺癌の治療のために、特にＡＲ活性が増幅しているか、または過度に活性化された前立腺癌であると診断された患者のために、周知のＡＲ活性阻害剤と組み合わせて使用される。

本発明のいくつかの実施形態は、ＥＤ−１、ＥＤ−２及びＥＤ−３としてそれぞれ識別される追加の化合物を提供する。これらの化合物も、ＥＲＧ陽性癌細胞においてＥＲＧタンパク質の発現を選択的に阻害する。

各化合物を、ＥＲＧ陽性癌を有する患者を治療するための候補治療薬としてさらに評価した。ＥＲＧ陽性のＶＣａＰ前立腺癌細胞及びＥＲＧ陰性のＬＮＣａＰ細胞の分離培養を用いて、ＥＲＧ発現の選択的阻害及び各化合物の細胞成長阻害活性を試験した。以下でさらに説明し、かつ図５Ａ及び図５Ｂで示すように、ＥＤ−１、ＥＤ−２及びＥＤ−３は、ＥＲＧ発現及びＥＲＧ陽性癌細胞の成長の選択的阻害剤である。

上記の観察及び癌細胞成長におけるＥＲＧの役割により、前立腺癌、大腸癌、ユーイング肉腫、血管腫瘍及び白血病などの癌を治療するための治療法としてＥＲＧ特異的な阻害剤を使用することが支持されている。一実施形態では、本発明の方法に従って癌の治療を受けている被検体は哺乳類である。例えば、本明細書に記載された方法及び使用は、ヒトにおける癌の治療に好適である。あるいは、本発明の方法及び使用は、獣医学分野において好適となり得るが、この場合、被検体には、イヌ、ネコ、ウマ及びウシが含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明の選択された実施形態では、ＥＲＧ阻害剤は、少なくとも１種の抗癌治療薬と同時投与される。本明細書で使用される場合、「同時投与する（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」は、少なくとも２種の各成分を、それぞれの生物学的な活性または効果の期間が重複する時間帯に投与することを示す。従って、用語「同時投与する（ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）」は、本発明の個々の成分を同一時間に投与することのみならず、逐次投与することも含む。従って、本発明のいくつかの方法に従って成分の組み合わせを「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」は、本発明の個々の成分を同一時間に投与することのみならず、逐次投与することも含む。同様に、「化合物の組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」または「成分の組み合わせ（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）」などの語句は、個々の成分が同時投与されることを示しており、これらの語句は、各化合物が同期間に、または同一時間に投与されなければならないことを必ずしも意味するとは限らない。加えて、個々の成分の投与経路が同一である必要はない。一実施形態では、本発明の成分は、同じ組成で投与される。

具体的な実施形態では、本発明の少なくとも１種のＥＲＧ阻害剤を前立腺療法と同時投与することができる。より具体的な実施形態では、ＥＲＧ阻害剤を、リュープロリド（Ｌｕｐｒｏｎ（登録商標）、Ｅｌｉｇａｒｄ（登録商標））、ゴセレリン（Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標））、トリプトレリン（Ｔｒｅｌｓｔａｒ（登録商標））、デガレリクス（Ｆｉｒｍａｇｏｎ（登録商標））、アビラテロン（Ｚｙｔｉｇａ（登録商標））、及びヒストレリン（Ｖａｎｔａｓ（登録商標））などの（ただし、これらに限定されない）黄体形成ホルモン放出ホルモン（ｌｕｔｅｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ：ＬＨＲＨ）類似体の１種以上と同時投与する。他の具体的な実施形態では、ＥＲＧ阻害剤を、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、エンザルタミド（Ｘｔａｎｄｉ（登録商標））及びニルタミド（Ｎｉｌａｎｄｒｏｎ（登録商標））などの（ただし、これらに限定されない）抗男性ホルモン受容体の１種以上と同時投与する。他の具体的な実施形態では、ＥＲＧ阻害剤を、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、カバジタキセル（Ｊｅｖｔａｎａ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、エストラムスチン（Ｅｍｃｙｔ（登録商標））、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、エトポシド（ＶＰ−１６）、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））及びビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））などの（ただし、これらに限定されない）１種以上の化学療法薬と同時投与する。

一実施形態では、ＥＲＧ阻害剤を第１選択療法として投与した。他の実施形態では、ＥＲＧ阻害剤を第２選択療法または第３選択療法として投与した。さらに他の実施形態では、ＥＲＧ阻害剤を第３選択療法よりも後に投与した。本明細書で使用される場合、第１選択療法は、前立腺癌などの（ただし、これに限定されない）、ＥＲＧ阻害剤の使用を正当化する状態が診断された時に最初に処方または採用される治療レジメンである。第２選択療法は、前立腺癌などの（ただし、これに限定されない）、ＥＲＧ阻害剤の使用を正当化する状態の再発または転移が診断された時に処方または採用される治療レジメンである。同様に、第３選択療法は、前立腺癌などの（ただし、これに限定されない）、ＥＲＧ阻害剤の使用を正当化する状態の２回目の再発または転移が診断された時に処方または採用される治療レジメンである。本明細書で使用されるいずれの「選択」療法とするかを決定する目的で、療法を薬物療法とする必要はない。例えば、本明細書で使用される場合、第１選択療法は、外科的除去または放射線治療であっても良い。腫瘍または症状を除去、縮小または切除するように計画された療法はいずれも、１つの「選択」療法であると考えることができる。

他の実施形態では、「維持」療法として、本明細書中のＥＲＧ阻害剤を投与することができる。本明細書で使用される場合、維持療法は、例えば、腫瘍が被検体から外科的に除去された後、処置を必要とする任意の発見可能な症状が当該被検体に見られない間に処方または採用される治療レジメンである。これらの実施形態では、例えば、外科的切除の後、指定期間中、ＥＲＧ阻害剤を使用することができる。この期間は、腫瘍または癌の除去または消滅後、少なくとも約６ヵ月、１年、２年、３年、４年または５年などとされるが、これらに限定されることはない。

医薬製剤、投与経路及び投与レジメン ＥＲＧ発現と癌細胞の成長とを全体的に関連付ける証拠があるにも関わらず、本発明者らは、癌細胞におけるＥＲＧの発現を選択的に阻害する化合物のいずれにも気付かず、または抗悪性腫瘍剤として選択的ＥＲＧ阻害剤を使用することに気付いていなかった。本発明は、より一般的に上述したように、ＥＲＧ陽性癌に罹患している被検体を治療するのに有用である化合物及びそれらの医薬組成物を提供する。

本発明の化合物または組成物は、前述のように配合することができ、いくつもの方法で治療上有効量を被検体に投与するのに適している。本明細書に記載された化合物の治療上有効量は、使用される賦形剤の量及び種類、剤形における活性成分の量及び具体的な種類、ならびに当該化合物が患者に投与される際の経路に依存する。しかしながら、本発明の典型的な剤形には、化合物または当該化合物の薬学的に許容される塩が含まれる。

本発明の化合物の典型的な投与レベルは通常、１日につき、患者の体重の１ｋｇ当たり約０．００１〜約１００ｍｇの範囲であり、これを単回投与または複数回投与で投与することができる。例示的な用量は、１日約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇまたは１日約０．０５〜約１０ｍｇ／ｋｇである。他の実施態様では、投与レベルは、１日約０．０１〜約２５ｍｇ／ｋｇ、１日約０．０５〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または１日約０．１〜約５ｍｇ／ｋｇである。

用量は、典型的には１日約０．１ｍｇ〜約２０００ｍｇの範囲とすることができ、１日１回の単回投与、あるいは１日を通した分割投与として与えられ、任意には食品と共に服用される。一実施形態では、１日用量は、等しい分割用量で１日２回投与される。１日用量の範囲は、１日約５ｍｇ〜約５００ｍｇ（例えば、１日約１０ｍｇ〜約３００ｍｇなど）とすることができる。患者を管理する際、おそらくは約１ｍｇ〜約２５ｍｇの低めの用量で治療を開始することが可能であり、必要であれば、患者の全体的な反応に応じて、単回投与または分割投与として１日約２００ｍｇ〜約２０００ｍｇまで用量を増加させることができる。

本発明に係るＥＲＧ阻害剤化合物は、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹腔内、静脈内、ＩＣＶ、嚢内注射若しくは注入、皮下注射若しくは皮下移植）、吸入、経鼻、膣、直腸、舌下または（例えば、経皮的、局部的な）局所による投与経路によって投与されても良い。阻害剤は、各投与経路に適切である、従来の無毒の薬学的に許容される担体、アジュバント及び賦形薬を含有する好適な単位用量製剤において、単独で、または合わせて配合することができる。

例えば、本発明に係る好適な経口組成物としては、錠剤、トローチ、薬用ドロップ、水性懸濁液若しくは油性懸濁液、分散性粉末若しくは分散性顆粒、エマルジョン、硬カプセル若しくは軟カプセル、シロップ若しくはエリキシルが挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物製造業界では既知である任意の方法に従って、経口使用に適した本発明の組成物を調製しても良い。例えば、本発明の化合物の液状製剤は、製薬上洗練され、かつ口当たりの良いＥＲＧ阻害剤の調合剤を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤及び保存剤からなる群から選択された１種以上の薬剤を含むことができる。

錠剤組成物の場合、無毒の薬学的に許容される典型的な賦形剤としては、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、造粒剤及び崩壊剤（例えば、コーンスターチまたはアルギン酸）、結合剤（例えば、澱粉、ゼラチンまたは平滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク））が挙げられるが、これらに限定されない。錠剤は、コーティングされなくても良く、あるいは、消化管での壊変及び吸収を遅らせ、それによって所望の期間にわたって持続した治療作用を提供するために既知のコーティング技術によってコーティングされても良い。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延物質を使用しても良い。

経口使用の製剤は、有効成分を不活性固体希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム若しくはカオリン）と混合させた硬ゼラチンカプセルとして、または有効成分を水若しくは油性媒体（例えば、落花生油、流動パラフィン若しくはオリーブ油）と混合させた柔ゼラチンカプセルとして提供されても良い。

水性懸濁液の場合、本発明の化合物を、安定な懸濁液を維持するのに適した賦形剤と混合させる。このような賦形剤の例としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ハイドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアラビアゴムが挙げられるが、これらに限定されない。

経口懸濁液には、天然に存在するリン脂質（例えば、レシチン）、または酸化アルキレンと脂肪酸の縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、または酸化エチレンと長鎖脂肪族アルコールの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールなどの、酸化エチレンと脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合物、または酸化エチレンと脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合物（例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタン）などの分散剤または湿潤剤を含めることもできる。水性懸濁液には、１種以上の保存剤（例えば、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸）、１種以上の着色剤、１種以上の香味剤、及びスクロースまたはサッカリンなどの１種以上の甘味剤が含まれても良い。

上述したものなどの甘味剤、及び香味材を添加して、口当たりの良い経口調製剤を提供しても良い。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤の添加によって保存することができる。

水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末及び分散性顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤及び１種以上の保存剤と混合して有効成分を提供することができる。好適な分散剤または湿潤剤、及び懸濁剤は、既に上述したものによって例示される。追加の賦形剤（例えば、甘味剤、香味及び着色剤）が存在しても良い。

シロップ及びエリキシルを、甘味剤（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロース）と共に配合しても良い。このような配合物には、緩和剤、保存剤、ならびに香味剤及び着色剤が含まれても良い。

非経口投与用の組成物は、静脈内、筋肉内または髄腔内の輸送に適した無菌媒体に配合される。本発明の化合物の無菌注射可能な調合剤は、無菌注射可能な溶液または無菌注射可能な懸濁液の形態であっても良い。非経口的に許容可能な無毒の希釈液または溶媒（例えば、１，３−ブタンジオール）を使用して、非経口組成物を配合することができる。使用され得る許容可能な賦形薬及び溶媒には、水、リンガー溶液及び等張性塩化ナトリウム溶液がある。加えて、溶媒または懸濁媒体として無菌油も使用することができる。この目的で、合成モノグリセリドまたは合成ジグリセリドを含む無菌の不揮発性油を使用しても良い。加えて、オレイン酸などの脂肪酸を、注射可能な調製剤に使用することができる。

使用される賦形薬及び製剤中の薬物濃度に応じて、局所麻酔薬、保存剤及び緩衝剤などの他のアジュバントを非経口製剤に含めることができる。

細胞系
腫瘍細胞系ＶＣａＰ、ＣＯＬＯ３２０、ＫＧ−１、ＭＯＬＴ４、ＬＮＣａＰ及びＭＤＡ Ｐｃａ２ｂを、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、マナサス、バージニア州）から得た。供給元によって推奨されている細胞成長の促進条件下において、ＡＴＣＣ推奨の細胞培地内で細胞を成長させた。ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈内皮細胞の初代培養物）及び、ヒトパピローマウイルス１８によって不死化された正常な成人前立腺上皮細胞から確立されたＲＷＰＥ１細胞系などの正常細胞もＡＴＣＣから得た。ＳＶ４０大型Ｔ抗原によって不死化された初代上皮細胞の培養物から誘導されたＢＰＨ１細胞系は、Ｓｉｍｏｎ Ｈａｙｗａｒｄ博士（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）からの贈呈物であった。ＬＡＰＣ４、すなわち転移性前立腺癌細胞系は、（当時ＵＣＬＡの）Ｃｈａｒｌｅｓ Ｓａｗｙｅｒ博士からの贈呈物であった。

試薬
ＥＲＧモノクローナル抗体（ＣＰＤＲ ＥＲＧ−ＭＡｂ、９ＦＹ）は、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈにおいて開発され、特徴付けられた。アンドロゲン受容体の抗体（ＡＲ、ｓｃ−８１６）、グリセルアルデヒドリン酸塩脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ、ｓｃ−２５７７８）、及びα−チューブリン（ｓｃ−５２８６）を、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（サンタクルーズ、カリフォルニア州）から購入した。前立腺特異抗原の抗体（ＰＳＡ、Ａ０５６２０１２）を、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（カーピンテリア、カリフォルニア州）から得た。アポトーシスのための抗体（９９１５Ｓ）及び細胞周期調節物質（９９３２）サンプルキットを、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ダンバース、マサチューセッツ州）から購入した。ヒツジ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（ＮＸＡ９３１）及びロバ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（ＮＸＡ９３４Ｖ）を、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ（バッキンガムシャー、英国）から得た。小分子ライブラリを、国立癌研究所のＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＤＴＰ）から得た。

ＥＲＧ腫瘍性タンパク質発現の阻害剤をスクリーニングするための概略手順
ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合陽性前立腺癌細胞系、すなわちＶＣａＰ（ＡＴＣＣ）を用いて、ＥＲＧ発現の小分子阻害剤を特定した。ＶＣａＰ細胞を、適切な用量の試験化合物で４８時間処理した。さらに後述するように、ＥＲＧ発現の阻害を、ＥＲＧ特異的なＣＰＤＲ ＥＲＧ−ＭＡｂを用いたＩｎ−Ｃｅｌｌウエスタンブロット分析（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ネブラスカ州）によって評価した。

陽性対照としてのＥＲＧ ｓｉＲＮＡの選択
ヒトＥＲＧ遺伝子（遺伝子ＩＤ：２０７８、アクセッション：ＮＭ＿００４４４９）に対抗する低分子干渉ＲＮＡ（Ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ：ｓｉＲＮＡ）オリゴ二本鎖（５’ ＣＧＡ ＣＡＵ ＣＣＵ ＵＣＵ ＣＵＣ ＡＣＡ ＵＡＵ ３’、ｓｉ−１、及び５’ ＵＧＡ ＵＧＵ ＵＧＡ ＵＡＡ ＡＧＣ ＣＵＵ Ａ ３’：ｓｉ−２）を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（ラファイエット、コロラド州）から購入し、ＥＲＧ発現阻害スクリーンに使用される陽性対照として評価した。２つのｓｉＲＮＡを、主としてオフターゲットまたは非特異的効果を除外するために選択した。双方のｓｉＲＮＡが同一結果を示したため、後述されるＥＲＧ発現抑制検査においてｓｉ−１を使用した。非ターゲティング（ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：ＮＴ）の二本鎖ｓｉＲＮＡを、陰性対照（Ｄ−００１２０６−１３−２０、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ラファイエット、コロラド州）として使用した。５０ｎＭ濃度のＮＴ ｓｉＲＮＡまたはＥＲＧ ｓｉＲＮＡを用いたトランスフェクションの前に、細胞をそれぞれの成長培地で４８時間培養した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）をトランスフェクションに使用した。
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ウエスタンブロット解析によって試験化合物の阻害効果を評価するための概略プロトコル
培養細胞を、試験ＥＲＧ阻害剤のそれぞれを用いて特定用量で処理した。処理済み細胞を指定時間インキュベートした後、プロテアーゼ阻害剤カクテル及びホスファターゼ阻害剤カクテルＩ＆ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を含むＭａｍｍａｌｉａｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍ−ＰＥＲ、Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州）を用いて細胞を溶解させた。５０μｇの総タンパク質を含む細胞溶解物を４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）を通じて電気泳動にかけ、細胞タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州）に転写した。ＡＲ、ＰＳＡ、ＧＡＰＤＨ、α−チューブリン、アポトーシス標識及び細胞周期調節物質の一次抗体と共に膜を４℃で１２時間インキュベートした。一次抗体に暴露した後、当該膜をバッファで洗浄し（室温で３回、各５分）、その後、２４℃で１時間、関連二次抗体と共にインキュベートした。最後に、当該膜をバッファで洗浄し、ＥＣＬウエスタンブロット検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ、バッキンガムシャー、英国）を用いて培養させた。

細胞成長検査及び腫瘍成長阻害検査の概略プロトコル
適切なＥＲＧ陽性癌細胞、対照ＥＲＧ陰性細胞またはＥＲＧ陽性正常細胞を、ベンダーによって提案された適切な成長培地を用いて組織培養皿内で粘着性単層または懸濁液として成長させた。細胞の播種後４８時間、適切な試験化合物を所定濃度で組織培養皿の各ウェルに添加する。細胞成長阻害分析の指定期間中、同一の試験化合物を同一濃度で含む新たな成長培地を用いて２４時間毎に培地を補充した。組織培養皿の各試験ウェル内の細胞密度を推定するための血球計数器、ならびに各試験ウェル内の生菌の割合を推定するためのトリパンブルー染料除外顕微鏡法及び写真撮影術を用いて細胞成長阻害率を算出した。

週齢６〜８で体重２７〜３０ｇの雄の無胸腺ヌードマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ＥＲＧを含む前立腺癌細胞（ＶＣａＰ）を、トリプシン処理して氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、無血清ＤＭＥＭ培地を用いて氷冷５０％マトリゲル中に再懸濁させた。合計４ｘ１０^６個の細胞／０．１ｍｌ／マウスを、マウスの下部右背面脇腹に皮下注射した。注射の前に、吸入麻酔（イソフルラン）によってマウスを麻酔した。注射後、腫瘍の成長を毎週監視した。３週後腫瘍が触知可能となったとき、マウスを２つの実験群と１つの対照群（各群マウス７匹）に無作為に分けた。治療群では、マウスの腹腔内（Ｉ．Ｐ）に１００ｍｇ／ｋｇのＥＲＧｉ−ＵＳＵまたは１５０ｍｇ／ｋｇのＥＲＧｉ−ＵＳＵを注射したのに対し、対照群には、賦形薬（１：１［ｖ／ｖ］、ＤＭＳＯ／ＰＥＧ３００）のみを注射した。デジタルノギス測定値、及び式１／２（Ｌ×Ｗ^２）（式中、Ｌ＝腫瘍長、及びＷ＝幅）を用いて算出された腫瘍容積により、腫瘍容積の増加を毎週記録した。反復測定値、ならびにスチューデントのｔ検定及び算出されたｐ値を用いて計算された各群間の結果の統計的有意性により、治療群と対照群の間で腫瘍容積を比較した。

実施例１：ＥＲＧ特異的な小分子阻害剤の特定
ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合陽性前立腺癌細胞系、すなわちＶＣａＰをＡＴＣＣから購入した。ベンダーによって規定された条件を用いて細胞を培地で成長させた。対数増殖中のＶＣａＰ細胞を、１ウェル当たり細胞２０，０００個の細胞密度で組織培養皿に播種した。播種後の細胞を終夜回収した後、小分子ライブラリ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ、Ａｐｐｒｏｖｅｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｄｒｕｇｓ Ｓｅｔ ＩＩ、Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｅｔ ＩＩ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ Ｓｅｔ、及びＮａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｓｅｔ、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＮＣＩ））に存在する各化合物及び商業ベンダーのＳｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから選択された化合物の１μＭの単一用量に当該細胞を４８時間暴露した。

試験化合物によるＥＲＧ発現の阻害を、Ｉｎ−ｃｅｌｌウエスタン分析（ＬＩ−ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、リンカーン、ネブラスカ州）によって求めた。ＥＲＧ特異的なモノクローナル抗体ＣＰＤＲ ＥＲＧ−ＭＡｂを一次抗体として使用した。簡単に言えば、洗浄後の細胞をパラホルムアルデヒドで固定することによってＩｎ−ｃｅｌｌウエスタン分析を行い、その後、固定細胞に透過処理及び一次抗体を用いて免疫標識を行った。免疫標識された細胞を、Ｓａｐｐｈｉｒｅ７００、ＤＲＡＱ５及び二次ＩＲＤｙｅ ８００を用いて洗浄して染色した。

組織培養プレートをＬｉ−ＣｏｒのＯｄｙｓｓｅｙ赤外線イメージングシステム上に画像化して赤外線信号を測定し、ＤＮＡ染色によるＥＲＧ発現及び細胞数の値を得た。これらの値を、９６ウェルのプレート上のウェル位置によって視差補正した。補正後のＥＲＧ発現シグナル値と細胞数シグナル値との比を使用して、細胞数によって正規化されたＥＲＧ発現の単一値を生成することにより、一次スクリーニング中に得られた全ての正規化値の平均を下回る２．５未満の標準偏差を有するウェルを検出した。スクリーンを二度行い、個々のスクリーンの双方において正規化ＥＲＧ発現を減少させた化合物を陽性ヒットとして特定した。この検査により、ＥＲＧタンパク質発現の阻害剤としてＥＲＧｉ−ＵＳＵを含む１０個のリード化合物が特定された。

実施例２：ＥＲＧ転写の定量分析によるリード化合物のＥＲＧ発現阻害活性の確認
一次スクリーンによって特定されたＥＲＧ阻害剤を定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析に使用して、ＥＲＧ ｍＲＮＡ発現を阻害する能力を評価した。簡単に言えば、ＶＣａＰ細胞を、１０個の各化合物を用いて１μＭの濃度で２４時間処理した。試験化合物とのインキュベーション後、細胞を溶解し、全ＲＮＡを単離させた。２００ｎｇの全ＲＮＡを、分析用のｔＥＲＧのコード配列に特異的な一対のＥＲＧプライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲによってＥＲＧ転写を分析するのに使用した。このスクリーンは、以下の３種類の試験化合物、ＮＳＣ１３９０２１（ＥＲＧｉ−ＵＳＵ）、ＮＳＣ７２２９２及びＮＳＣ９９６２９をＥＲＧ−ｍＲＮＡ発現の阻害剤として特定した。

図１は、ＮＳＣ１３９０２１（ＥＲＧｉ−ＵＳＵ）及びＮＳＣ９９６２９による、ＶＣａＰ細胞におけるＥＲＧタンパク質発現の用量依存性阻害を示している。図１の２種類のゲルによって示されるように、陽性対照として使用されたＥＲＧ ｓｉＲＮＡ（ｓｉ−１）は、対照ｓｉＲＮＡ（非ターゲットｓｉＲＮＡ、ＮＴ）と比較してＥＲＧタンパク質の発現を強力に阻害している。小分子ＥＲＧｉ−ＵＳＵも、用量依存的（０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、５μＭ及び１０μＭ）にＶＣａＰ細胞においてＥＲＧの発現を阻害した。このとき、１μＭ以上の容量でより高いレベルのＥＲＧ阻害が観察された。ＥＲＧｉ−ＵＳＵは、特に０．５μＭよりも多い用量で、ＰＳＡ及びＡＲタンパク質の発現も阻害した。

しかしながら、ＮＳＣ９９６２９で処理されたＶＣａＰ細胞では、ＥＲＧ、ＡＲまたはＰＳＡの明らかな発現の阻害を観察することができなかった。これらを総合すると、上記のタンパク質阻害検査は、ＥＲＧｉ−ＵＳＵが腫瘍性タンパク質ＥＲＧの阻害剤であることを証明している。

実施例３：ＥＲＧｉ−ＵＳＵは、ＥＲＧ発現の選択的阻害剤である
（上記の）ＶＣａＰ細胞を用いたＥＲＧタンパク質阻害検査は、ＥＲＧｉ−ＵＳＵが、この癌細胞系においてＥＲＧに加えてＡＲ及びＰＳＡタンパク質も阻害することを示している。ＶＣａＰ前立腺癌細胞におけるＥＲＧの発現はＡＲによって調節されているため、ＡＲ陽性／ＥＲＧ陰性のＬＮＣａＰ細胞、ＭＤＡ ＰＣａ２ｂ細胞及びＬＡＰＣ４細胞を用いたさらなる検査に着手して、ＶＣａＰ細胞において観察されたＥＲＧ発現の阻害がＥＲＧｉ−ＵＳＵによるＡＲ特異的な阻害の結果によるものではないことを確認した。

簡単に言えば、対数増殖中のＥＲＧ陽性のＶＣａＰ細胞ならびにＥＲＧ陰性のＬＮＣａＰ細胞、ＭＤＡ ＰＣａ２ｂ細胞及びＬＡＰＣ４細胞を、１皿当たり細胞２×１０^６個の細胞密度で１０ｃｍの組織培養皿に播種した。播種後の細胞を、０、０．１、０．５、１．０、５．０及び１０μＭ濃度のＥＲＧｉ−ＵＳＵと４８時間接触させた。次いで、各皿からの細胞をウエスタンブロット解析用に処理し、ＥＲＧタンパク質の発現における変異を監視した。

ゲル電気泳動分析によって示されるように（図２を参照）、０．１μＭ〜１０μＭの範囲でＥＲＧｉ−ＵＳＵの用量を増加させても、前述したＡＲ陽性／ＥＲＧ陰性の細胞系においてＡＲまたはＰＳＡタンパク質の発現は阻害されない。しかしながら、ＶＣａＰ細胞ではＡＲ発現とＰＳＡ発現の両方が阻害され、このとき、ＥＲＧｉ−ＵＳＵの濃度をより高くするとより強力な阻害が観察された。ＶＣａＰにおけるＥＲＧ発現はＡＲによって調節されているため、本発明者らは、ＶＣａＰ細胞のＥＲＧと並行するＡＲの阻害が、この前立腺癌細胞系の状況に特異的である可能性が最も高いと仮定した。

本発明者らによる検査は、ＥＲＧｉ−ＵＳＵが、正常内皮細胞においてＥＲＧの発現を阻害せず、癌細胞においてＥＲＧ発現を選択的に阻害することも示している。例えば、ＥＲＧｉ−ＵＳＵが、次のＥＲＧ陽性の癌細胞系、すなわち、ＣＯＬＯ３２０（大腸癌）、ＫＧ−１及びＭＯＬＴ４（白血病細胞系）、ならびにＶＣａＰ（前立腺癌）において用量依存的にＥＲＧ発現を阻害することを観察した。しかしながら、ＥＲＧ発現の阻害は、正常内皮ＨＵＶＥＣ細胞では観察されなかった。図３を参照のこと。この結果は、小分子ＥＲＧｉ−ＵＳＵが癌細胞におけるＥＲＧ発現の選択的阻害剤であるという観察をさらに裏付けるものである。

実施例４：ＥＲＧｉ−ＵＳＵは、ＥＲＧ陽性腫瘍の成長を選択的に阻害する
上記のタンパク質阻害検査は、ＥＲＧｉ−ＵＳＵがＥＲＧ発現の選択的阻害剤であることを示している。ＥＲＧｉ−ＵＳＵがＥＲＧ陰性癌細胞の成長を阻止せずにＥＲＧ陽性癌細胞の成長を選択的に阻止したかどうかを調べるために、細胞成長阻害検査を、次の癌細胞系及び正常細胞系、すなわち、ＥＲＧ陽性癌細胞（ＶＣａＰ、ＣＯＬＯ３２０、ＭＯＬＴ−４及びＫＧ−１）癌細胞、ＥＲＧ陰性癌細胞（ＬＮＣａＰ、ＭＤＡ ＰＣａ２ｂ及びＬＡＰＣ４）癌細胞、正常前立腺ＲＷＰＥ−１細胞及びＢＰＨ−１細胞、ならびに正常内皮ＨＵＶＥＣ細胞を用いて実施した。各細胞系を培養して対数増殖中の細胞を得て、次いで、これらの細胞を、１ウェル当たり細胞２×１０^６個の細胞密度で組織培養皿の１０ｃｍウェルに播種した。播種後の細胞を、０、０．１、０．５、１．０、５．０及び１０μＭ濃度のＥＲＧｉ−ＵＳＵと２、４、６及び８日間接触させた。各期間の終了時、細胞を試験プレートから回収して洗浄し、血球計数器及びトリパンブルー染料染色法を用いて細胞密度及び細胞生存度を測定する。細胞数とＥＲＧｉ−ＵＳＵの濃度とを相関させるグラフとして細胞成長の阻害を表した。

図４は、前述した細胞の成長の５０％を阻害するのに必要なＥＲＧｉ−ＵＳＵの濃度（ＩＣ_５０）を算出するために用いた細胞成長阻害検査の結果を示している。本図で示すように、ＥＲＧｉ−ＵＳＵは、培養下のＥＲＧ陽性癌細胞の成長に対する強力な阻害剤であった。対照的に、ＥＲＧｉ−ＵＳＵは、ＥＲＧ陰性癌細胞、正常前立腺細胞及び正常内皮細胞の成長に対しては最小の阻害効果を示した。

表１は、腫瘍または正常組織に由来するＥＲＧ陽性細胞及びＥＲＧ陰性細胞に対するＥＲＧｉ−ＵＳＵの細胞成長阻害活性を要約したものである。ＩＣ_５０値によれば、ＥＲＧｉ−ＵＳＵは、低ナノモル範囲（例えば、５０ｎＭ〜３００ｎＭのＩＣ_５０値）でＥＲＧ陽性癌細胞の成長を阻害している。細胞成長の阻害は、ＥＲＧ陰性癌細胞、ＥＲＧ陰性の正常細胞及びＥＲＧ陽性の正常ＨＵＶＥＣ細胞では、１０μＭよりも高い阻害剤濃度でも観察されなかった。ＥＲＧ陽性癌細胞のみで細胞成長の阻止が観察されたため、表１の結果は、ＥＲＧｉ−ＵＳＵが、ＥＲＧ陽性癌を治療するための（例えば、転移性ホルモン抵抗性前立腺癌を治療するための）治療薬であることを証明している。

ＥＲＧｉ−ＵＳＵの３種類の類似体ＥＤ−１、ＥＤ−２及びＥＤ−３によるＥＲＧタンパク質発現の阻害及び細胞成長阻害活性も確認された。これらの化合物によるＥＲＧタンパク質の阻害を、２×１０^６個のＶＣａＰ細胞と、１μＭ及び１０μＭ濃度の適切な阻害剤化合物とを２４時間接触させた後、細胞の溶解及び細胞溶解物のゲル電気泳動分析を行ってＥＲＧタンパク質発現の阻害率を定量化することによって評価した。図５Ａに示すように、ＥＤ−１、ＥＤ−２及びＥＤ−３のそれぞれは、ＶＣａＰ細胞におけるＥＲＧの発現を阻害している。ＥＤ−１及びＥＤ−２は、ＥＤ−３よりも強力なＥＲＧ発現阻害剤である。図５Ａはさらに、ＥＤ−１及びＥＤ−２の阻害活性が共にＥＲＧｉ−ＵＳＵと同等であったことを示している。

ＥＤ−１、ＥＤ−２及びＥＤ−３も、培養下のＶＣａＰ前立腺癌細胞の成長を阻害したが、ＥＲＧ陰性のＬＮＣａＰ細胞の成長に対しては、１μＭ及び１０μＭの用量でも測定可能な阻害効果を示さなかった。図５Ｂを参照のこと。本図では、ＥＤ−１がＥＤ−２及びＥＤ−３よりも強力なＶＣａＰ癌細胞阻害剤であることが棒グラフによって示されている。しかしながら、試験化合物はいずれも、培養下にあるＥＲＧ陰性のＬＮＣａＰ前立腺癌細胞の成長を阻害しなかった。全体として、これらの結果は、ＥＲＧｉ−ＵＳＵに類似したＥＤ−１、ＥＤ−２及びＥＤ−３が、ＥＲＧ陽性癌細胞におけるＥＲＧ発現を選択的に阻害すること、及びこのようなＥＲＧ発現に対する阻害が、培養下のＥＲＧ陽性癌細胞を抑える役割を果たす可能性が最も高いことを示している。従って、ＥＲＧｉ−ＵＳＵ、その類似体ＥＤ−１、ＥＤ−２及びＥＤ−３、ならびにそれらの薬学的に許容される塩類は、本発明の方法に従ってＥＲＧ陽性癌を治療するための治療薬として有用である。

実施例５：ＥＲＧｉ−ＵＳＵは、生体内ＥＲＧ陽性腫瘍の成長を阻害する
雄のヌードマウスに約４×１０^６個のＶＣａＰ細胞を注射し、腫瘍成長を監視した。注射後４〜５週間の間に腫瘍が現れ始め、その時、マウスを２つの実験群と１つの対照群とに無作為化した。治療群には、１５０ｍｇ／ｋｇのＥＲＧｉ−ＵＳＵまたは１００ｍｇ／ｋｇのＥＲＧｉ−ＵＳＵを１週当たり３回腹腔内に注射した。対照動物には、賦形薬のみを同様に１週当たり３回注射した。腫瘍成長を毎週監視した。図６Ａは、対照動物（一番上の曲線）が検査を通じて最大の腫瘍容積を呈したのに対し、最大用量のＥＲＧｉ−ＵＳＵを受けたマウス（一番下の曲線）が最小の容積を呈したことを示している。

Claims (8)

1. からなる群から選択される化合物、または前記化合物の薬学的に許容される塩であるＥＲＧ発現阻害剤を含む、野生型ＥＲＧタンパク質の過剰発現、変異ＥＲＧタンパク質、ＥＲＧ遺伝子転写の亢進、またはＥＲＧ ｍＲＮＡ翻訳の亢進に関連したＥＲＧ陽性癌の治療または予防用医薬組成物。
2. 前記阻害剤が、前記変異ＥＲＧタンパク質の発現を選択的に阻害する、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記阻害剤が、ＥＲＧ遺伝子転写またはＥＲＧ ｍＲＮＡ翻訳を選択的に阻害する、請求項１に記載の医薬組成物。
4. 前記阻害剤がさらに、ＥＲＧ陽性癌細胞の成長を阻害する、請求項１に記載の医薬組成物。
5. 前記阻害剤が、
   である、請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
6. 前記ＥＲＧ陽性癌が、前立腺癌、大腸癌、ユーイング肉腫、血管腫瘍及び白血病からなる群から選択される、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
7. 前記ＥＲＧ陽性癌が前立腺癌である、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
8. 抗癌治療薬と同時投与されることによって特徴づけられる、請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の医薬組成物。