CN102786575B

CN102786575B - 2-氨基-1,5-戊二酸二薯蓣皂苷元酯新化合物及其制备方法

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Publication number: CN102786575B
Application number: CN201210303318.8A
Authority: CN
Inventors: 黄文�; 何杨; 陈谦明
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2012-08-24
Filing date: 2012-08-24
Publication date: 2015-08-19
Anticipated expiration: 2032-08-24
Also published as: CN102786575A

Abstract

本发明涉及2-氨基-1，5-戊二酸二薯蓣皂苷元酯新化合物及其制备方法，该化合物即化合物7，

Description

2-氨基-1,5-戊二酸二薯蓣皂苷元酯新化合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物领域，具体地说是涉及2-氨基-1，5-戊二酸二薯蓣皂苷元酯新化合物及其制备方法。

薯蓣皂苷元（diosgenin）为目前已知的重要甾体皂苷苷元之一，广泛存在于薯蓣科、百合科、蔷薇科、石竹科等多种植物中,是多种中(成)药的有效成分之一,也是生产甾体激素类药物的重要基础原料。

现代研究表明，薯蓣皂苷元具有抗炎、抗血栓、抑制肿瘤细胞生长等多种药理活性，同时还可以提高T-细胞免疫力，诱导人红白血病细胞向巨噬细胞分化。多种甾体皂苷，如薯蓣皂苷、重楼皂苷、三角叶皂苷等，都可明显的抑制肿瘤细胞生长。近年来，薯蓣皂苷元酯的研究也越来越受到人们的关注。Kvasnica等人设计和合成了一系列甾体苷元-组氨酸和甲硫氨酸的铂衍生物，发现其中部分化合物对肿瘤细胞CEM cell lines具有较好的抑制作用，抑制率IC₅₀值在14-25μM。

为改善薯蓣皂苷元的溶解性，本文设计和合成了一系列端基为-NH₂的3-薯蓣皂苷元衍生物，以期筛选出具有较高抗炎活性或抗肿瘤活性的甾体化合物。

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足之处，而提供了一种2-氨基-1，5-戊二酸二薯蓣皂苷元酯新化合物及其制备方法。

本发明的技术方案如下：薯蓣皂苷元-3-位衍生物，该衍生物即通式（1）化合物：

其中：R为氨基酸基，如甘氨酸基、丙氨酸基、4-氨基丁酸基、2-氨基戊二酸基(即D-谷氨酸基)、6-氨基己酸基；其中衍生物72-氨基-1，5-戊二酸二薯蓣皂苷元酯是新化合物。薯蓣皂苷元-3-位衍生物的制备方法，步骤是：

a、氨基酸与二碳酸二叔丁酯(Boc)₂O作用，得到N-boc保护的氨基酸；

b、取N-boc保护的氨基酸与薯蓣皂苷元在催化剂和缩合剂作用下，通过酯化反应，制备得到N-boc-氨基酸薯蓣皂苷元酯；

c、步骤b制备得到的N-boc-氨基酸薯蓣皂苷元酯，在酸性环境下，脱除N-Boc保护基团，得到化合物氨基酸薯蓣皂苷元酯。

氨基酸以6-氨基己酸为例，合成路线如下：

所述的步骤a以丙酮-水做溶剂，三乙胺做催化剂，丙酮与水体积比为1：1。

所述的步骤b酯化过程中，以N，N’-二环己基碳二亚胺DCC为缩合剂，以4-二甲氨基吡啶DMAP、对甲基苯磺酸TsOH为促进剂进行酯化反应。

所述的步骤c，化合物反应所需的酸性环境为三氟乙酸CF₃COOH。

薯蓣皂苷元-3-位衍生物的用途，主要用于治疗抗炎、抗肿瘤方面，药理实验结果表明，对二甲苯致鼠耳肿胀急性炎症模型中，化合物4 6-氨基己酸薯蓣皂苷元酯，灌胃给药剂量100mg/Kg，对鼠耳肿胀抑制率38.6%，抗急性炎症作用优于同等剂量的薯蓣皂苷元；化合物4对人乳腺癌细胞MDA-MB-231 IC₅₀ 7.6μM、小鼠结肠癌细胞C26 IC₅₀ 4.7μM、人肝癌细胞Hep G2 IC₅₀ 14.6μM三种肿瘤细胞均具有较强的抑制作用。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：原料来源丰富，合成路线简便，产率高，适合规模化生产；该类化合物在弱酸环境下稳定，易于成盐，提高了薯蓣皂苷元的溶解性；与薯蓣皂苷元相比，抗炎和抗肿瘤活性优于薯蓣皂苷元。设计和制备了一系列氨基酸薯蓣皂苷元酯，端基带有-NH₂的化合物或者其对应的盐酸盐、磷酸盐，与薯蓣皂苷元比较，成盐化合物水溶性有所提高：6-氨基己酸薯蓣皂苷元酯水中溶解度大于20μM，薯蓣皂苷元水中溶解度小于5μM；首次合成化合物4 6-氨基己酸薯蓣皂苷元酯和化合物7 2-氨基-1，5-戊二酸二薯蓣皂苷元酯，本发明化合物用于抗炎、抗肿瘤方面。

具体实施方式

下面列举4个实施例，对本发明加以进一步说明，但本发明不只限于这些实施例。

实施例16-氨基己酸薯蓣皂苷元酯的制备，即化合物4。

a、N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸

烧瓶中加入化合物1（1.30g）、二碳酸二叔丁酯（(Boc)₂O，2.52ml）和适量三乙胺（Et₃N），丙酮-水（v:v1:1）做溶剂，室温下直至反应完全。旋蒸部分有机溶剂，剩余液用稀盐酸调PH至酸性，乙酸乙酯萃取，合并有机相，经饱和氯化钠溶液洗涤、无水硫酸钠干燥、真空旋蒸去除溶剂，置于5℃冰箱中过夜，得白色固体2N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸（2.28g，98%）。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.61(s,1H),3.12(d,J=5.9Hz,2H),2.35(t,J=7.4Hz,2H),1.72–1.57(m,2H),1.56–1.41(m,12H),1.41–1.29(m,2H)。

b、N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸薯蓣皂苷元酯

薯蓣皂苷元（1.25g）、化合物2（694mg）、DMAP（92mg）于无水二氯甲烷中，室温下加DCC（1.17g）反应过夜，过滤。滤液依次经稀氯化钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液、水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离（石油醚/乙酸乙酯12:1），得白色固体化合物3N-叔丁氧羰基-6-氨基己酸薯蓣皂苷元酯（1.48,80%）。¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.37(d,J=4.3Hz,1H),4.67–4.50(m,2H),4.41(dd,J=15.0,7.4Hz,1H),3.67(s,1H),3.53–3.43(m,1H),3.37(t,J=10.9Hz,1H),3.11(d,J=6.3Hz,2H),2.38–2.21(m,4H),2.08–1.91(m,2H),1.04(s,3H),0.97(d,J=6.9Hz,3H),0.79(d,J=3.5Hz,6H)。

c、6-氨基己酸薯蓣皂苷元酯

化合物3（1.00g）溶于二氯甲烷中，室温下缓慢滴加三氟乙酸溶液（CF₃COOH,2.5ml）。反应基本完全后，向其中滴加三乙胺调节至弱碱性，。反应液依次经水、饱和碳酸氢钠、水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离纯化，得淡黄色固体新化合物46-氨基己酸薯蓣皂苷元酯（678mg,78%）。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.56(s,1H),5.37(d,J=3.5Hz,1H),4.65-4.49(m,1H),4.41(dd,J=14.8,7.3Hz,1H),3.55(q,J=7.2Hz,2H),3.51-3.43(m,1H),3.37(t,J=10.9Hz,1H),3.07-2.89(m,2H),2.29(t,J=7.8Hz,4H),2.07-1.93(m,2H),1.02(d,J=9.4Hz,3H),0.97(d,J=6.7Hz,3H),0.79(s,6H)。

实施例2甘氨酸薯蓣皂苷元酯的制备

制备方法同实施例1，得黄色固体化合物5甘氨酸薯蓣皂苷元酯。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.38(d,J＝4.1Hz,1H),4.75-4.59(m,1H),4.41(dd,J＝14.9,7.4Hz,1H),4.41(dd,J＝14.9,7.4Hz,1H),3.53-3.43(m,1H),3.44-3.32(m,3H),2.39-2.28(m,2H),2.07-1.93(m,2H),1.91-1.82(m,3H),1.03(d,J＝8.4Hz,3H),0.97(d,J＝6.9Hz,3H),0.79(s,6H)。

实施例3丙氨酸薯蓣皂苷元酯的制备

制备方法同实施例1，得黄色固体化合物6丙氨酸薯蓣皂苷元酯。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.38(d,J=4.1Hz,1H),4.62(dd,J=12.0,7.9Hz,1H),4.41(dd,J=14.9,7.4Hz,1H),3.58–3.44(m,1H),3.37(t,J=10.9Hz,1H),2.32(d,J=7.8Hz,1H),2.06–1.94(m,1H),1.04(s,1H),0.97(d,J=6.9Hz,1H),0.79(s,1H)

实施例4 2-氨基-1，5-戊二酸二薯蓣皂苷元酯的制备

制备方法同实施例1，用2-氨基戊二酸（即D-谷氨酸）为原料，得黄色固体新化合物7 2-氨基-1，5-戊二酸二薯蓣皂苷元酯。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.38(s,2H),4.76–4.51(m,2H),4.41(dd,J=14.8,7.3Hz,2H),3.52–3.32(m,5H),2.49–2.39(m,2H),2.30(d,J=20.8Hz,4H),1.02(d,J=9.9Hz,6H),0.97(d,J=6.8Hz,6H),0.79(s,12H)。

药理实验

1）对二甲苯致鼠耳肿胀急性炎症实验

昆明小鼠（20±2g，雄性）50只，随机分为5组，每组10只。按表1所列药物及剂量灌胃给药，空白组给以相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。连续给药3d，每天1次，末次给药2h后，于小鼠右耳前后两面中央各点涂15μl致炎剂对二甲苯，任其自由浸润扩散，左耳不涂二甲苯作为对照。1h后将小鼠脱颈椎处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径8mmYLS-Q4小鼠耳肿打耳器冲裁两耳同一部位耳片，于电子天平上称重，计算耳肿胀度（mg）和耳肿胀抑制率（%）。计算公式如下：

耳肿胀度/（mg）=右耳片重量（mg）-左耳片重量（mg）

耳肿胀抑制率/（%）=[1-（对照组平均肿胀度/给药组平均肿胀度）]*100%

各化合物对二甲苯致小鼠耳肿胀的实验结果，见表1。

实验结果表明，薯蓣皂苷元（100mg/Kg）对二甲苯致小鼠耳肿胀模型引起的鼠耳肿胀抑制率32.2%，与阿司匹林（50mg/Kg）对二甲苯致小鼠耳肿胀模型引起的鼠耳肿胀抑制率31.9%相当。化合物4 6-氨基己酸薯蓣皂苷元酯（100mg/Kg）对鼠耳肿胀抑制率38.6%，优于同等剂量的薯蓣皂苷元。化合物5和6与薯蓣皂苷元相比，对鼠耳肿胀抑制率无明显变化。同时化合物7，溶解性最差，对鼠耳肿胀抑制率也最低，仅有19.1%。

表1薯蓣皂苷元衍生物对二甲苯所致耳肿胀的影响

说明：

1、给药化合物：溶于0.5%CMC溶液中；给药剂量：阿司匹林50mg/Kg，其余组100mg/Kg。

2、数据以mean±SD表示，每组实验动物n=10。

3、与空白组比较，p<0.05。

4、与空白组比较，p<0.01。

2）细胞毒性实验

实验中使用的人乳腺癌细胞MDA-MB-231，小鼠结肠癌细胞C26，人肝癌细胞Hep G2由四川大学纳米生物医学技术与膜生物学研究所提供。肿瘤细胞培养条件按照American Type Culture Collection(ATCC)要求进行培养。

按照文献报道，采用MTT法检测薯蓣皂苷元-3-位衍生物4，5，6，7对人乳腺癌细胞MDA-MB-231，小鼠结肠癌细胞C26，人肝癌细胞Hep G2三种肿瘤细胞培养48h的生长抑制活性。

实验发现化合物4对人乳腺癌细胞MDA-MB-231（IC₅₀ 7.6μM）、小鼠结肠癌细胞C26（IC₅₀ 4.7μM）、人肝癌细胞Hep G2（IC₅₀ 14.6μM）三种肿瘤细胞均具有较强的抑制作用，尤其是对乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞C26。

表2薯蓣皂苷元衍生物对肿瘤细胞的MTT实验IC₅₀(μM)

说明：1、96孔板细胞铺板浓度：2000-5000个/孔，培养箱孵育48h后加入MTT检测。

2、三角叶皂苷，本实验提取，作为阳性对照组。

Claims

1.2-氨基-1，5-戊二酸二薯蓣皂苷元酯新化合物的制备方法，其特征在于：所述新化合物即化合物7：

，所述方法为：

c、步骤b制备得到的N-boc-氨基酸薯蓣酯，在酸性环境下，脱除N-Boc保护基团，得到化合物氨基酸薯蓣皂苷元酯；其中，步骤a以丙酮-水做溶剂，三乙胺做催化剂，丙酮与水体积比为1：1；步骤b酯化过程中，以N,N’-二环己基碳二亚胺DCC为缩合剂，以4-二甲氨基吡啶DMAP、对甲基苯磺酸TsOH为促进剂进行酯化反应；步骤c，化合物反应所需的酸性环境为三氟乙酸CF₃COOH。