CN102702300A - 一种预防或治疗自身免疫性糖尿病的化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防或治疗自身免疫性糖尿病的化合物，其结构如通式1所示。本发明还公开了该化合物的制备方法和用途。本发明提供的薯蓣皂苷元与布洛芬或阿司匹林的孪药化合物，不仅能够有效预防或治疗因胰岛β细胞受损而导致的自身免疫性糖尿病，还具有更为良好的抗炎、镇痛等作用，为临床用药提供了新的选择。

Description

一种预防或治疗自身免疫性糖尿病的化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种预防或治疗自身免疫性糖尿病的化合物及其制备方法和用途，属药物领域。

背景技术

自身免疫性糖尿病，主要包括1型糖尿病(type 1diabetes mellitus,T1DM)和成人隐匿性自身免疫性糖尿病(latent autoimmune diabetes of adults,LADA)。其中，1型糖尿病，是T细胞介导的自身免疫性疾病，以遗传为基础,在某些环境因素的作用下,诱发以胰岛炎为病理特征的胰岛β细胞自身免疫反应,损伤β细胞使其丧失合成和分泌胰岛素的功能,引起糖代谢紊乱。成人隐匿性自身免疫性糖尿病，其临床初期表现与2型糖尿病相似，但发病机制和转归与T1DM相同，与T1DM不同之处在于LADA的胰岛β细胞所受免疫损害呈缓慢型发展，在诊断后13～45个月不依赖胰岛素治疗，但后期则与1型糖尿病相同。

目前，糖尿病的治疗主要是结合饮食和运动治疗以及药物治疗控制血糖的浓度。现在普遍使用的降血糖药物以西药降糖药为主，也有一些中药降糖药。西药降糖药主要有非胰岛素类和胰岛素类药物。非胰岛素类药物主要有促胰岛素分泌剂类（以及相关的促胰岛素分泌剂），可以促进胰岛细胞释放胰岛素；双胍类，能够减少肝脏葡萄糖的生成；过氧化物酶体增殖物激活受体-G（PPARG）激活剂（噻唑烷二酮），增强胰岛素的作用；α-葡萄糖苷酶抑制剂和小肠酯酶抑制剂，抑制肠道对葡萄糖的吸收。

然而，多数自身免疫性糖尿病患者，为胰岛素依赖型，因此，当前治疗还是以胰岛素治疗为主，但胰岛素多需注射给药，患者需要长期承受注射带来的创伤和疼痛。随着细胞移植技术的不断发展，也出现了移植β细胞这一新治疗手段。然而，无论是注射胰岛素或是移植β细胞，都会为患者带来极大的经济负担。因此，若能提供一种预防或治疗自身免疫性糖尿病的口服药物，将会为患者带来福音。

目前，还未见将薯蓣皂苷元、布洛芬或阿司匹林制备成孪药，并用于治疗自身免疫性糖尿病的报道。

发明内容

本发明的技术方案在于提供一种能够有效预防或治疗自身免疫性糖尿病的化合物。本发明还提供了该化合物的制备方法和用途。

具体地，本发明提供了一种预防或治疗自身免疫性糖尿病的化合物，其结构如通式1所示：

其中，R₁为-O-、

R为氨基酸侧链基团，n=1~5；

R₂为

上述化合物，是薯蓣皂苷元与阿司匹林/布洛芬制备得到的孪药，孪药（Twin Drug）是指将两个相同或不同的先导化合物或药物经共价键连接，缀合成的新分子。

其中，所述化合物中，R为氢或-(CH₂)₄NH₂。

进一步地，所述化合物的结构如下：

进一步地，所述化合物的结构如下：

本发明还提供了上述化合物的制备方法，它包括如下步骤：

（1）取阿司匹林或布洛芬，与薯蓣皂苷元发生酯化反应，即得目标化合物；或

（2）取阿司匹林或布洛芬，通过酰氯化反应后，制备得到阿司匹林酰氯化物或布洛芬酰氯化物；取氨基酸或带氨基的直链有机酸,与薯蓣皂苷元制备得到氨基酸薯蓣皂苷元酯或有机酸薯蓣皂苷元酯；再将阿司匹林酰氯化物或布洛芬酰氯化物，与氨基酸薯蓣皂苷元酯或有机酸薯蓣皂苷元酯发生酰胺化反应后，即得目标化合物。

进一步地，步骤（1）的具体操作如下：

A、取阿司匹林或布洛芬，直接与薯蓣皂苷元发生酯化反应，即得目标化合物；或

B、取阿司匹林或布洛芬，经酰氯化反应后，再与薯蓣皂苷元发生酯化反应，即得目标化合物。

进一步地，步骤A或B中，以N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）、对甲苯磺酸（TsOH）作为催化剂。

进一步地，步骤（2）的具体操作如下：

a、取阿司匹林或布洛芬，通过酰氯化反应，制备得到阿司匹林酰氯化物或布洛芬酰氯化物；

b、取氨基酸或带氨基的直链有机酸，引入氨基保护基团后，与薯蓣皂苷元制备得到带有保护基的氨基酸薯蓣皂苷元酯或有机酸薯蓣皂苷元酯，再脱除氨基保护基团，得到氨基酸薯蓣皂苷元酯或有机酸薯蓣皂苷元酯；

c、取步骤a制备得到阿司匹林酰氯化物或布洛芬酰氯化物，与步骤b制备得到的氨基酸薯蓣皂苷元酯或有机酸薯蓣皂苷元酯，进行酰胺化反应后，制备得到目标化合物。

本发明还提供了上述的化合物在制备抗炎、镇痛或治疗自身免疫性糖尿病的药物中用途。

所述自身免疫性糖尿病是由胰岛β细胞受损而导致的糖尿病。

其中，所述自身免疫性糖尿病为1型糖尿病或成人隐匿性自身免疫性糖尿病。

本发明还提供了一种预防或治疗自身免疫性糖尿病的药物组合物，它是以上述的化合物为活性成分，加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

本发明提供的薯蓣皂苷元与布洛芬或阿司匹林的孪药化合物，不仅能够有效预防或治疗因胰岛β细胞受损而导致的自身免疫性糖尿病，还具有更为良好的抗炎、镇痛等作用，为临床用药提供了新的选择。

附图说明

图1化合物4对小鼠体重的影响

图2化合物4对小鼠葡萄糖耐受量的影响

图3化合物4抑制1型糖尿病的作用

图4布洛芬、薯蓣皂苷元单体及本发明化合物4、5、6对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞产生的NO的抑制作用

具体实施方式

实施例12-乙酰氧基苯甲酸薯蓣皂苷元酯（化合物2）的制备：

（1）2-乙酰氧基苯甲酰氯的制备:

在50ml反应瓶中，加入阿司匹林（4.50g，25mmol)、2滴N,N’-二甲基甲酰胺（DMF）和3ml二氯亚砜SOCl₂（36mmol)，迅速接上球形冷凝管(顶端装有氯化钙干燥管),并将尾气导入氢氧化钠溶液中吸收。搅拌下缓慢升温至70°C,维持此温度不变，直至尾气端无气泡冒出。减压抽滤除去过量的二氯亚砜,得淡黄色油状液体，即2-乙酰氧基苯甲酰氯。（TLC：氯仿：甲醇=9:1，R_f＝0.83）；将2-乙酰氧基苯甲酰氯溶于四氢呋喃THF中，配成25ml液体，密闭备用。

（2）2-乙酰氧基苯甲酸薯蓣皂苷元酯的制备:

150ml三口烧瓶中，依次加入薯蓣皂苷元4.14g（10mmol）、4-二甲氨基吡啶DMAP 0.24g (2mmol)、四氢呋喃THF 40ml、吡啶10ml，冰浴下搅拌，缓慢滴加步骤（1）中制备的2-乙酰氧基苯甲酰氯。滴加完毕，冰浴下继续反应，TLC点板检测。约1h后，停止反应，过滤，将滤液倒入500ml冰水中，搅拌，有淡黄色固体析出，过滤。将固体重新溶于150ml二氯甲烷CH₂Cl₂中，经冰水洗涤，无水硫酸钠Na₂SO₄干燥，硅胶柱分离，乙醇重结晶，得白色鳞片状2-乙酰氧基苯甲酸薯蓣皂苷元酯，3.52g。（石油醚：乙酸乙酯=4:1，Rf＝0.48）1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.37(d,J=4.5Hz,1H),4.60(tt,J=10.5,5.2Hz,1H),4.41(dd,J=14.9,7.5Hz,1H),3.47(dd,J=10.0,3.2Hz,1H),3.37(t,J=10.9Hz,1H),2.30(dd,J=14.5,9.4Hz,2H).ESI-MS Cacld forC₃₆H₄₈O₆[M+Na]:599.58.

实施例2N-（2-乙酰氧基苯甲酰基）-甘氨酸薯蓣皂苷元酯（化合物3）的制备

（1）2-乙酰氧基苯甲酰氯的制备:

在50ml反应瓶中，加入阿司匹林4.50g（25mmol）、N,N’-二甲基甲酰胺DMF2滴和3ml二氯亚砜SOCl₂（36mmol)，迅速接上球形冷凝管(顶端装有氯化钙干燥管),并将尾气导入氢氧化钠溶液中吸收。搅拌下缓慢升温至70°C,维持此温度不变，直至尾气端无气泡冒出。减压抽滤除去过量的二氯亚砜,得油状液体2-乙酰氧基苯甲酰氯。（氯仿：甲醇=9:1，Rf=0.83；将2-乙酰氧基苯甲酰氯溶于四氢呋喃THF中，配成25ml液体，密闭备用）

（2）N-叔丁氧羰基甘氨酸薯蓣皂苷元酯的制备

在50ml反应瓶中，依次加入薯蓣皂苷元414mg（1mmol）、N-叔丁氧基甘氨酸175mg（1mmol）、4-二甲氨基吡啶DMAP 24mg（0.2mmol）、对甲苯磺酸TsOH 34mg（0.2mmol），溶解在20ml干燥二氯甲烷CH₂Cl₂中，室温下滴加N,N’-二环己基碳二亚胺DCC 309mg（1.5mmol，溶于5ml二氯甲烷CH₂Cl₂）。4小时后，停止反应。过滤，滤液经水、饱和碳酸氢钠NaHCO₃、水洗涤，无水硫酸钠Na₂SO₄干燥，得无色澄清透明液体。硅胶柱分离，得白色固体N-叔丁氧羰基甘氨酸薯蓣皂苷元酯.（石油醚：乙酸乙酯=3:1，Rf＝0.49）

（3）甘氨酸薯蓣皂苷元酯的制备

取N-叔丁氧羰基甘氨酸薯蓣皂苷元酯343mg（0.6mmol）溶于5ml二氯甲烷CH₂Cl₂中，冰浴下，滴加三氟乙酸/二氯甲烷混合液（CF₃COOH/CH₂Cl₂v:v=1:1）1.8ml（以三氟乙酸计，12mmol），滴加完毕，自然升至室温。1小时后，冰浴下，缓慢滴加三乙胺2ml（约14mmol）中和反应液。反应液经水、饱和碳酸氢钠、水洗涤，无水硫酸钠Na₂SO₄干燥，硅胶柱分离，得淡黄色固体甘氨酸薯蓣皂苷元酯。（二氯甲烷：丙酮=4:1，Rf＝0.17）

（4）N-（2-乙酰氧基-苯甲酰基）甘氨酸薯蓣皂苷元酯的制备

在反应瓶中加入甘氨酸薯蓣皂苷元酯236mg（0.5mmol）、二氯甲烷CH₂Cl₂5ml、三乙胺2ml，冰浴下滴加2-乙酰氧基苯甲酰氯（以阿司匹林计算，3mmol）。滴加完毕后升至室温下，TLC检测反应至完全。待反应结束后，用0.1%盐酸液调pH至中性，旋蒸除去溶剂，将残留固体重新溶于20ml二氯甲烷CH₂Cl₂中，经水、反应液经水、饱和碳酸氢钠、水洗涤，无水硫酸钠Na₂SO₄干燥，硅胶柱分离，得白色固体化合物，即N-（2-乙酰氧基-苯甲酰基）甘氨酸薯蓣皂苷元酯。

实施例32-（4-异丁基苯基）丙酸薯蓣皂苷元酯（化合物4）的制备：

250ml烧瓶中依次加入布洛芬1.03g（5mmol）、薯蓣皂苷元2.07g（5mmol）、4A分子筛1g、4-二甲氨基吡啶DMAP 122mg（1mmol）、对甲苯磺酸TsOH 172mg（0.2mmol）、100ml无水二氯甲烷，室温搅拌下滴加N,N'-二环已基碳二亚胺DCC 1.55g (7.5mmol，溶于50ml无水二氯甲烷)，TLC检测反应进度至反应不再进行，过滤。滤液依次用10g/L柠檬酸溶液、饱和氯化钠溶液洗涤数次后，经无水硫酸钠Na₂SO₄干燥，硅胶柱分离，得白色固体2-（4-异丁基苯基）丙酸薯蓣皂苷元酯，2.14g。（石油醚：乙酸乙酯=4:1，Rf＝0.68）1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.20(d,J=7.8Hz,2H),7.08(d,J=7.7Hz,2H),5.34(dd,J=15.8,4.2Hz,1H),4.72–4.50(m,1H),4.40(dd,J=14.8,7.4Hz,1H),3.65(q,J=7.0Hz,1H),3.55–3.42(m,1H),3.37(t,J=10.9Hz,1H),2.44(d,J=7.1Hz,2H),2.36-2.25(m,1H),2.25-2.12(m,1H),2.08-1.91(m,2H),0.07(s,1H).ESI-MS Cacld for C₄₀H₅₈O₆₄[M+Na]:625.44.

实施例42-（4-异丁基苯基）丙酸薯蓣皂苷元酯（化合物4）的制备

取薯蓣皂苷元（829mg，2mmol），4-二甲氨基吡啶（DMAP，2.4mg,0.02mmol），于无水二氯甲烷（20ml）溶液中，室温下，边搅拌边滴加化合物1储备液（3ml）。TLC检测反应进度，约1h后停止反应。反应液依次经5%氯化钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液、水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析纯化得白色固体，即目标化合物，布洛芬-薯蓣皂苷元酯(93%,1.12g).R_f(乙酸乙酯/石油醚1:9)0.42.

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):7.20(d,J=7.8Hz,2H);7.08(d,J=7.7Hz,2H);5.34(dd,J=15.8,4.2Hz,1H);4.63-4.55(m,1H);4.40(dd,J=14.8,7.4Hz,1H);3.67-3.62(q,J=7.0Hz,1H);3.48-3.45(m,1H);3.37(t,J=10.9Hz,1H);2.44(d,J=7.1Hz,2H).

¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):174.19;140.35;139.77;139.69;138.01;129.25;127.10;122.30;109.27;80.81;74.02;66.85;62.09;56.44;49.92;45.33;45.06;41.62;40.26;39.74;38.03;37.79;36.73;32.05;31.85;31.40;30.32;30.19;28.82;27.69;27.49;22.41;20.82;19.36;18.64;17.16;16.29;14.54.

HR-MS:625.4233(C₄₀H₅₈Na⁺O₄;calc.625.4257).

实施例5布洛芬-甘氨酸-薯蓣皂苷酯（化合物5）的制备

（1）布洛芬酰氯的制备

取布洛芬（5.00g,24mmol)、N，N’-二甲基甲酰胺（DMF,100μl）和二氯亚砜(SOCl₂,3ml,36mmol)于50ml单口瓶中，迅速接上球形冷凝管(顶端装有氯化钙干燥管),并将尾气导入稀氢氧化钠溶液中。搅拌下缓慢升温至70°C,维持温度70-75°C，直至尾气端无气泡冒出。将所得油状液体溶于无水二氯甲烷中，总体积24ml，密闭备用。

（2）N-叔丁氧羰基-甘氨酸薯蓣皂苷元酯的制备

取薯蓣皂苷元（415mg,1mmol）、N-叔丁氧羰基-甘氨酸（210mg,1.2mmol）、4-二甲氨基吡啶（DMAP,24.4mg,0.2mmol）于无水二氯甲烷中，室温下边搅拌边滴加N，N’-二环己基碳二亚胺溶液（DCC,309mg,1.5mmol，溶于5ml无水二氯甲烷中）。反应基本完全后，过滤，得淡黄色澄清液。滤液依次经5%氯化钠溶液、饱和碳酸氢钠溶液、水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离得白色固体(92.5%,528.18mg)。R_f(乙酸乙酯/石油醚1:9)0.31.

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):7.27(s,1H);5.38(d,J=3.9Hz,1H);5.01(s,1H);4.71–4.63(m,1H);4.41(dd,J=14.9,7.4Hz,1H);3.88(d,J=5.0Hz,2H);3.49–3.46(m,1H);3.37(t,J=10.9Hz,1H);2.34(d,J=7.6Hz,2H).

¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):169.75;155.69;139.40;122.65;109.28;80.79;79.90;75.06;66.84;62.08;56.42;49.91;42.66;41.61;40.25;39.71;37.99;36.87;36.70;32.04;31.83;31.39;30.30;28.80;28.33;27.67;20.82;19.31;17.15;16.28;14.53.

HR-MS:594.3793(C₃₄H₅₃NNa⁺O₆;calc.594.3771).

（3）甘氨酸薯蓣皂苷元酯的制备

N-叔丁氧羰基-甘氨酸薯蓣皂苷元酯（457mg,0.8mmol）溶于二氯甲烷（10ml）中，室温下缓慢滴加三氟乙酸（CF₃COOH,0.6ml,8mmol）溶液，点板检测，3h后反应基本完全。置反应于冰水浴下冷却，向其中滴加三乙胺（Et₃N,约1ml）终止反应，pH 7-8，得棕黄色澄清液。真空旋蒸溶剂，将残余物重新溶解于二氯甲烷溶液中，依次经水、饱和碳酸氢钠、水洗涤，有机层用无水硫酸钠干燥，硅胶柱分离纯化，得淡黄色固体(83.0%,312.744mg)。R_f(乙酸乙酯/石油醚1:9)0.44.

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):7.27(s,1H);5.38(d,J=4.1Hz,1H);4.67–4.62(m,1H);4.41(dd,J=14.9,7.4Hz,1H);3.48–3.46(m,1H);3.40–3.30(m,3H);2.33(d,J=6.9Hz,2H);2.02–1.92(m,2H).

¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):173.66;139.51;122.56;109.27;80.79;74.51;66.84;62.08;56.43;49.93;44.20;41.61;40.25;39.71;38.09;36.91;36.72;32.04;31.84;31.39;30.29;28.80;27.75;20.81;19.32;17.15;16.29;14.53.

HR-MS:494.3248(C₂₉H₄₅NNa⁺O₄;calc.494.3247).

（4）布洛芬-甘氨酸-薯蓣皂苷酯的制备

取甘氨酸-薯蓣皂苷元（1mmol）于二氯甲烷（50ml）溶液中，加入三乙胺（Et₃N,500μl），冰水浴下冷却10min，滴加布洛芬酰氯储备液（1.5ml）。1h后，反应液依次经冷的5%氯化钠溶液、饱和碳酸氢钠、水洗涤，无水硫酸钠干燥，硅胶柱纯化，得白色化合物(82.0%,540.38mg).R_f(乙酸乙酯/石油醚1:2)0.21.

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):7.26(s,1H);7.22(d,J=7.7Hz,2H);7.12(d,J=7.7Hz,2H);5.88(s,1H);5.36(s,1H);4.66–4.58(m,1H);4.41(dd,J=14.8,7.3Hz,1H);4.02–3.87(m,2H);3.62-3.57(q,J=7.1Hz,1H);3.48–3.45(m,1H);3.37(t,J=10.9Hz,1H);2.45(d,J=7.1Hz,2H);2.29(d,J=7.8Hz,2H).

¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):174.56;169.30;140.84;139.33;138.08;129.66;127.34;122.68;109.30;80.80;66.85;62.08;56.43;49.91;46.55;45.04;41.67;40.26;39.71;37.95;36.77;31.93;31.38;31.73;31.38;30.24;29.71;29.38;28.81;27.64;22.71;22.41;20.81;19.30;18.43;17.15;16.29;14.53;14.14;1.03.

HR-MS:682.4462(C₄₂H₆₁NNa⁺O₅;calc.682.4448).

实施例6布洛芬-氨基己酸-薯蓣皂苷酯（化合物6）的制备

（1）N-叔丁氧羰基-氨基己酸薯蓣皂苷元酯的制备

按照合成化合物7的方法用薯蓣皂苷元(2,415mg,1mmol),N-叔丁氧羰基-氨基己酸(277mg,1.2mmol)合成化合物8(82.0%,514.14mg)。R_f(乙酸乙酯/石油醚1:9)0.40.

¹H-NMR(400MHz,CDCl3):7.27(s,1H);5.37(d,J=4.3Hz,1H);4.64–4.54(m,2H);4.41(dd,J=15.0,7.4Hz,1H);3.49–3.46(m,1H);3.37(t,J=10.9Hz,1H);3.11(d,J=6.3Hz,2H);2.33–2.26(m,4H).

¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):172.99;155.96;139.70;122.34;109.26;80.80;79.03;73.70;66.83;62.08;56.43;49.93;41.60;40.25;39.72;38.12;36.95;36.73;34.51;33.93;32.04;31.83;31.39;30.29;29.77;28.80;28.42;27.77;26.29;24.66;20.81;19.34;17.14;16.28;14.53.

HR-MS:650.4396(C₃₉H₆₁NNa⁺O₆;cal c.650.4397).

（2）氨基己酸薯蓣皂苷元酯的制备

N-叔丁氧羰基-氨基己酸薯蓣皂苷元酯(8,520mg,0.8mmo l),脱保护得到10(81%,343.44mg).White solid.R_f(乙酸乙酯/石油醚1:2)0.32.

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):7.28(s,1H);5.56(s,1H);5.37(d,J=3.5Hz,1H);4.61–4.53(m,1H);4.41(dd,J=14.8,7.3Hz,1H);3.58-3.53(q,J=7.2Hz,2H);3.46–3.42(m,1H);3.37(t,J=10.9Hz,1H);2.99–2.96(m,2H);2.29(t,J=7.8Hz,4H).

¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):172.94;122.31;109.25;80.78;73.79;66.81;62.07;56.42;52.95;49.92;41.59;40.24;39.69;38.08;36.94;36.71;34.32;32.03;31.83;31.38;30.27;28.79;27.74;27.19;26.08;24.37;20.80;19.34;17.13;16.28;14.52;8.18.

HR-MS:528.4072(C₃₃H₅₄NO₄ ⁺;calc.528.4054).

（3）布洛芬-氨基己酸-薯蓣皂苷酯的制备

氨基己酸薯蓣皂苷元酯(528mg,1mmol)和布洛芬酰氯储备液(参照实施例5制备，3ml)得到白色化合物(84.2%,589.6mg)。R_f(乙酸乙酯/石油醚1:2)0.32.

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):7.27(s,1H);7.18(d,J=7.9Hz,1H);7.11(d,J=7.9Hz,1H);5.37(d,J=4.2Hz,2H);4.63–4.55(m,1H);4.41(dd,J=15.0,7.4Hz,1H);3.54-3.46(m,J=17.6,5.2Hz,2H);3.37(t,J=10.9Hz,1H);3.18(dd,J=13.2,6.7Hz,2H);2.45(d,J=7.2Hz,2H);2.30(d,J=6.7Hz,2H);2.22(t,J=7.4Hz,2H).

¹³C-NMR(100MHz,CDCl₃):174.40;172.99;140.69;139.70;138.67;129.62;127.36;122.37;109.28;80.81;73.73;66.85;62.08;56.44;49.94;46.80;45.02;41.62;40.26;39.73;39.32;38.13;36.96;36.74;34.42;32.05;31.85;31.40;30.30;30.18;29.14;28.81;27.78;26.21;24.51;22.39;20.82;19.35;18.45;17.15;16.29;14.53.

HR-MS:738.5085(C₄₆H₆₉NNa⁺O₅;cal c.738.5074).

通过以下试验例说明本发明的有益效果。

试验例1本发明化合物抗自身免疫性糖尿病活性

NOD小鼠是自发1型糖尿病、成人隐匿性自身免疫性糖尿病以及其他多种自身免疫疾病鼠，是研究自身免疫性糖尿病较为有用的动物模型，其发病机制与人类1型糖尿病类似。

通过病理学观察发现，NOD小鼠自身免疫性胰岛炎最早在4周龄时发生。NOD小鼠发病后，会出现尿频、多饮、高血糖等糖尿病患者表现出的典型症状：患鼠饮水量剧增；血糖呈先迅速上升，后逐步下降，但仍维持高于正常值的状态；大量地排尿，在这个过程中体重直线下降，最后昏迷而死亡。

因此，本发明通过体内实验，研究了2-（4-异丁基苯基）丙酸薯蓣皂苷元酯（化合物4）的抗糖尿病活性。

实验方法：

将NOD小鼠随机等量分成三组，即溶剂空白对照组，化合物4低剂量（50mg/kg）干预组，化合物4高剂量(100mg/kg)干预组；每次实验口服给药8周后，监测小鼠状况的至32周龄，并通过血糖监测，体重监测及葡萄糖萄糖耐受量实验分析化合物的体内抗糖尿病活性。实验过程中观察指标有：

1、血糖监测：给药前和给药后每周1次空腹血糖检测，以连续2周血糖高于11.1mM为糖尿病判断标准，比较糖尿病发生率；

2、体重监测：给药前和给药后每周测量一次小鼠的体重；

3、葡萄糖耐受量：将16周龄的实验小鼠禁食16小后，用血糖仪测定其血糖浓度作为0分钟的血糖值，然后静脉注射2kg/g的葡萄糖，分别测定其5、10、15、30、60、90分钟时的血糖值，实验重复三次，准确记录实验结果，并进行研究分析。

实验结果：

其活性结果如图1-3，其中：

（1）图1是化合物4对小鼠体重的影响。每周给药前和给药后分别测一次小鼠的体重，给药周期结束后继续监测小鼠的体重至第21周。空白对照组用（●）表示；低剂量控制组用（▲）表示；高剂量控制组用（■）表示。每次测量重复三次，测量结果为三次的平均值，每一次的误差均小于0.05。据实验结果可知：虽然随着年龄的增长，三个组小鼠的体重都有增加，但是化合物4干预组小鼠的体重增加量更大，且高剂量组比低剂量组的体重增加量大。化合物4干预组小鼠的体重增长较平稳，而空白对照组的小鼠一种则在17-18周时由26.53±0.13g垂直下降到21.52±0.21g。

（2）图2显示的是葡萄糖耐量试验的结果。糖耐量试验的目的是测定化合物4控制血糖浓度的药理作用。对16周龄小鼠禁食16小时后，腹腔注射葡萄糖2g/kg。然后在5分钟，10分钟，15分钟，20分钟，30分钟，45分钟，60分钟，90分钟时测定血糖浓度值。空白对照组用（●）表示；低剂量控制组用（▲）表示；高剂量控制组用（■）表示。实验重复三次，测量结果为三次的平均值，每一次测量值的误差均小于0.05。当注射2g/kg的葡萄糖后，空白对照组的小鼠的血糖浓度急剧的上升至22.5±0.07mmol/L，然后缓慢的降低，血糖的浓度有较长的一段时间在很高的水平；低剂量组则缓慢的上升至15±0.6mmol/L，然后迅速的降低至10mmol/L以下；而高剂量组仅上升至10±0.04mmol/L，而后降低至注射前的血糖水平。因此可以的得出：化合物4对血糖的浓度有较好的控制作用。

（3）图3为小鼠发病率的实验结果。连续两次测量的血糖浓度高于11.1毫摩尔每升，即诊断为糖尿病患者。空白对照组用（●）表示；低剂量控制组用（▲）表示；高剂量控制组用（■）表示。实验重复三次，测量结果为三次的平均值，每一次测量值的误差均小于0.05。到第13周时，空白组小鼠的患病率为25%，低剂量组达到20%，而高剂量组的则为0%，到第20周时，空白组小鼠的患病率已高达50%，低剂量组达到40%，而高剂量组的则为18%。因此可以的得出：化合物4可以防止自身免疫性糖尿病的发生。

上述实验表明，化合物4可以有效的控制血糖浓度，防止体重下降，预防糖尿病的发生，证明化合物4可以预防和治疗自身免疫性糖尿病，尤其是1型糖尿病和成人隐匿性自身免疫性糖尿病。

试验例2布洛芬-薯蓣皂苷元孪药的体外抗炎试验

本实验中，以化合物布洛芬，薯蓣皂苷元作为对照组，测定布洛芬-薯蓣皂苷元酯（化合物4），布洛芬-甘氨酸-薯蓣皂苷酯（化合物5）布洛芬-己氨酸-薯蓣皂苷酯（化合物6）对LPS诱导的巨噬细胞产生的NO的抑制作用。

实验方法：

用含10％胎牛血清，100单位/ml青霉素，100皮克/毫升链霉素的培养基，在95％的加湿空气，5％CO₂，37°C的条件下的培养箱中培养RAW264.7小鼠巨噬细胞。然后，把处于对数生长期的RAW264.7细胞接种到96孔板上，每个孔2×10⁴个细胞，在培养基中继续培养24小时，待细胞贴壁后，把上述各种化合物配成三种不同浓度（1.25μM，5μM，10μM）分别对细胞进行前处理。用LPS（1微克/毫升）诱导后，采用Griess Reagent检测上清液中的NO，在自动酶标仪测定540nm处的吸光度。实验重复三次，通过对实验结果的综合分析比较化合物的药理活性，筛选出活性较好的化合物。实验结果如图4。

实验结果：

结果表明，Con为空白对照组即正常的巨噬细胞组，其产生的亚硝酸盐的量为9.2±0.83μM，当用LPS诱导后其产生的亚硝酸盐的量增加到14.9±1.2μM；经浓度为1.25μM，5μM，10μM的各种化合物处理过的RAW264.7巨噬细胞生成的亚硝酸盐的量分别为布洛芬（13.4±1.30μM，9.2±1.30μM，9.1±1.00μM)，薯蓣皂苷元（11.4±1.23μM，11.5±0.88μM，9.9±1.85μM)，化合物4（9.2±1.23μM，9.0±1.16μM，8.1±0.95μM），化合物5（9.2±1.27μM，9.3±1.38μM，11.6±1.23μM），化合物6（13.1±1.19μM，13.3±1.27μM，11.4±1.03μM)。

由以上结果可以得到：

（1）与正常RAW264.7巨噬细胞组生成的NO的量相比，化合物4处理组生成的NO更少，说明化合物4对巨噬细胞生成过量的NO的量具有很好的抑制作用，化合物4的浓度越高其药理作用越强。并且，化合物4比布洛芬和薯蓣皂苷元处理组的细胞生成更少的NO，可以看出，由布洛芬和薯蓣皂苷元经过化学结合生成的化合物4比单用布洛芬或薯蓣皂苷元的抑制作用更强。

（2）由布洛芬和薯蓣皂苷元经过甘氨酸桥连结生成的化合物5的抑制作用比单用薯蓣皂苷元的稍强，但比布洛芬的抑制作用弱。

（3）由布洛芬和薯蓣皂苷元经过氨基己酸桥连结生成的化合物6的抑制作用比单用布洛芬、薯蓣皂苷元的抑制作用弱。

综上，本发明化合物4比化合物5、6具有更强的抗炎活性。

试验例32-乙酰氧基苯甲酸薯蓣皂苷元酯（化合物2）的抗炎镇痛活性

(1)化合物2对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的抑制作用

实验方法：取健康昆明小白鼠60只，体重(20±2)g，每组12只，雌雄各半，随机分为5组，即空白对照组；阳性对照阿司匹林组(30mg/kg)；薯蓣总皂苷组(63、126、252mg/kg)。室温(24±4)℃,湿度40%～70%,保持昼夜节律,饲养1周适应环境。以上各组在溶媒（0.5%吐温-80）中，分别按20ml/kg灌喂给予药液，空白对照组给溶媒液，连续给药7d，每天一次。末次给药后1h，以50μL二甲苯涂于小鼠右耳廓内外两面致炎，左耳不涂，致炎后30min拉颈处死小鼠，沿耳廓线剪下左右耳朵，用80mm的打孔器冲下相同体积的圆形耳片，然后称重，以左右两耳的重量差作为肿胀度。各组数据以

表示,组间差异的显著性采用SPSS统计软件进行单因素方差分析(one-wayANOVA)。

肿胀度(mg)=右耳耳片重(mg)－左耳耳片重(mg)                  (1)

抑制率(%)=[(对照组肿胀度—药物组肿胀度)/对照组肿胀度]×100%(2)

实验结果：

表1.化合物2对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响(n=12,

)

注:与空白组比较,P<0.05.

表1表明，薯蓣皂苷元高、中剂量组均能有效地抑制二甲苯所致的小鼠耳廓肿胀，与空白组比较，小鼠耳廓肿胀度差异均为P<0.05，低剂量不显著；而与阿司匹林组比较，小鼠耳廓肿胀度差异也较明显，说明薯蓣皂苷元具有一定的抗炎作用，但效果不如阿司匹林。

从抗炎结果看,化合物2能抑制二甲苯诱发的小鼠耳廓肿胀,当化合物2给药剂量为21.9mg/kg，43.8mg/kg，87.6mg/kg时与给药剂量为6.9mg/kg，13.7mg/kg，27.4mg/kg阿司匹林组的各浓度梯度比较无统计学意义,表明其作用强度相近，化合物2各浓度梯度均分别稍强于阿司匹林各组。因此化合物2具有较好的抗炎作用。

（2）化合物2对小鼠腹腔疼痛的抑制作用

实验方法：取18～20g健康昆明种小鼠60只,每组12只，雌雄各半，随机分为5组，即空白对照组；阳性对照阿司匹林组(30mg/kg)；薯蓣总皂苷组(63、126、252mg/kg)。给药方法同上。末次给药后1h，各组小鼠均腹腔注射0.6%醋酸0.2ml/只。5min后，计数小鼠在10min内的扭体次数作为疼痛指标，求疼痛抑制率。各组数据以

表示，组间差异比较用t检验，由SPSS 13.0系统完成。抑制率(%)=[(对照组扭体次数—药物组扭体次数)/对照组扭体次数]×100%

(3)实验结果：

表2.对醋酸所致小鼠扭体反应的影响(n=12,

)

注:与空白组比较,P<0.05.

经统计分析，表2结果显示：薯蓣皂苷元与空白组比较差异有显著性(P<0.05),中、低剂量差异不显著(P>0.05)。63.0mg/kg薯蓣皂苷元对醋酸诱发的小鼠扭体反应次数有一定抑制作用。阿司匹林与空白组比较其差异具有非常显著意义(P<0.01)，对醋酸诱发的小鼠扭体反应次数有抑制作用，其作用强度与剂量有关，剂量越大作用越明显。在同等物质量浓度灌胃情况下，即63.0mg/kg薯蓣皂苷元与27.4mg/kg阿司匹林，阿司匹林的抑制作用大于薯蓣皂苷元。

化合物2的低、中、高剂量与空白组比较有显著性差异(P<0.05)，抑制率分别为18.03%，25.51%，33.48%。说明化合物2对醋酸诱发的小鼠扭体反应次数有抑制作用，镇痛效果与其剂量呈现一个良好的线性关系，其镇痛效果随剂量的增加而增强。

通过二甲苯致小鼠耳廓肿胀和醋酸扭体法实验表明，化合物2具有较强的抑制急性非特异性炎症作用，抗炎活性接近阳性对照组药物地塞米松。且其镇痛作用与阿司匹林相当，但是减少了阿司匹林对胃粘膜的损伤。

综上所述，本发明提供的薯蓣皂苷元与布洛芬或阿司匹林的孪药化合物，不仅能够有效预防或治疗因胰岛β细胞受损而导致的自身免疫性糖尿病，还具有更为良好的抗炎、镇痛等作用，为临床用药提供了新的选择。

Claims (11)

1.一种预防或治疗自身免疫性糖尿病的化合物，其结构如通式1所示：

其中，R₁为-O-、

R为氨基酸侧链基团，n=1~5；

R₂为

2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：所述化合物中，R为氢或-（CH₂）₄NH₂。

3.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：所述化合物的结构如下：

4.根据权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：所述化合物的结构如下：

5.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：

（1）取阿司匹林或布洛芬，与薯蓣皂苷元发生酯化反应，即得目标化合物；或

（2）取阿司匹林或布洛芬，通过酰氯化反应后，制备得到阿司匹林酰氯化物或布洛芬酰氯化物；取氨基酸或带氨基的直链有机酸,与薯蓣皂苷元制备得到氨基酸薯蓣皂苷元酯或有机酸薯蓣皂苷元酯；再将阿司匹林酰氯化物或布洛芬酰氯化物，与氨基酸薯蓣皂苷元酯或有机酸薯蓣皂苷元酯发生酰胺化反应后，即得目标化合物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）的具体操作如下：

A、取阿司匹林或布洛芬，直接与薯蓣皂苷元发生酯化反应，即得目标化合物；或

B、取阿司匹林或布洛芬，经酰氯化反应后，再与薯蓣皂苷元发生酯化反应，即得目标化合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤A或B中，以N,N’-二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶、对甲苯磺酸作为催化剂。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）的具体操作如下：

a、取阿司匹林或布洛芬，通过酰氯化反应，制备得到阿司匹林酰氯化物或布洛芬酰氯化物；

b、取氨基酸或带氨基的直链有机酸，引入氨基保护基团后，与薯蓣皂苷元制备得到带有保护基的氨基酸薯蓣皂苷元酯或有机酸薯蓣皂苷元酯，再脱除氨基保护基团，得到氨基酸薯蓣皂苷元酯或有机酸薯蓣皂苷元酯；

c、取步骤a制备得到阿司匹林酰氯化物或布洛芬酰氯化物，与步骤b制备得到的氨基酸薯蓣皂苷元酯或有机酸薯蓣皂苷元酯，进行酰胺化反应后，制备得到目标化合物。

9.权利要求1-4任意一项所述的化合物在制备抗炎、镇痛或治疗自身免疫性糖尿病的药物中用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述自身免疫性糖尿病为1型糖尿病或成人隐匿性自身免疫性糖尿病。

11.一种预防或治疗自身免疫性糖尿病的药物组合物，其特征在于：它是以权利要求1-4任意一项所述的化合物为活性成分，加上药学上常用的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

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