CN110294763B - 一种吡咯里西啶类生物碱的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种以见血青为原料制备吡咯里西啶类生物碱的方法，并提供了前述生物碱在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。本发明的制备方法得率高，适合大规模生产。本发明的生物碱具有良好的抗动脉粥样硬化的活性，直接使用它们中的至少一种可以制备成为治疗动脉粥样硬化的药物，以它们为前体或先导药物，对其进行各种修饰，能得到更多的治疗动脉粥样硬化的药物。本发明为制备抗动脉粥样硬化药物提供了新的选择，具有十分优良的应用前景。

Description

一种吡咯里西啶类生物碱的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种吡咯里西啶类生物碱的制备方法及其在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
背景技术
动脉粥样硬化是一种难治性疾病，其导致的心血管疾病死亡率极高。其特征是血管壁的脂蛋白沉积及炎症细胞浸润的慢性炎症。血管内皮细胞损伤被认为是诱导炎症细胞趋化浸润及促炎因子释放的重要始动因素，最终导致血管壁不可逆性结构功能改变，从而导致动脉粥样硬化的病理过程。
见血青(Liparis nervosa Thunb.Lindl)，为兰科植物脉羊耳兰的全草。产浙江南部、江西、福建、中国 台湾省 、湖南南部、广东、广西、四川南部、贵州、云南和西藏东南部(墨脱)。生于林下、溪谷旁、草丛阴处或岩石覆土上，海拔1000-2100米。广泛分布于全世界热带与亚热带地区。具有凉血止血，清热解毒之功效。常用于胃热吐血，肺热咯血，肠风下血，崩漏，手术出血，创伤出血，疮疡肿毒，毒蛇咬伤，跌打损伤等功效。
已有研究报道，见血青具有抗炎、止血活性。兰科羊耳蒜属植物中的化学成分含有吡咯里西啶类生物碱、倍半萜、黄酮类、鞣质类等成分。但对见血青中化学成分及其生物活性研究还不充分，目前还没有将见血青中的化学成分用于治疗抗动脉粥样硬化的报道，亟需对见血青化学成分进行深入研究，为临床上筛选和/或制备抗动脉粥样硬化药物提供了一种新的选择。
吡咯里西啶类生物碱(Pyrrolizidine alkaloids，PAs)是中药见血青中特征性成分。吡咯里西啶类生物碱具有抗心律失常、抗肿瘤、抗炎、解热、镇痛及作用于平滑肌痉挛等显著而多样的生理活性，代表性化合物如：盐酸吡西卡尼为抗心律失常药，于1991年日本上市；酮咯酸氨丁三醇为非甾体抗炎药，1989年在美国上市，具有强力止痛和抗炎作用；阔叶千里光碱具有平滑肌解痉作用，临床上用于肠绞痛、支气管哮喘、痉挛性结肠炎等，目前还未见有吡咯里西啶抗动脉动脉粥样硬化的研究报道。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了式I所示吡咯里西啶类生物碱的制备方法，包括如下步骤：
(1)生物碱混合物的提取：见血青药材粉碎，使用5～10倍体积的低级醇浸提，减压浓缩得浓缩液；
(2)生物碱混合物的富集：将步骤(1)的浓缩液用45～55℃水悬浮，调节pH为1～2，使用乙酸乙酯萃取；取水层调pH至11～12，再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，减压浓缩得见血青总生物碱浸膏；
(3)水解：将步骤(2)的浸膏用有机溶剂溶解，加入酸的水溶液进行回流水解；
(4)纯化：将步骤(2)、(3)的产物用湿法柱层析纯化，采用湿法柱层析，以体积比为100∶(1～5)的石油醚和二乙胺作为流动相，正向硅胶为固定相进行反复柱层析分离纯化，得到式I所示化合物；
所述式I为：
Figure BDA0002140870940000021
步骤(1)所述低级醇是每分子含有1～4个碳原子的醇。
如权利要求1所述的制备方法，步骤(1)中所述的低级醇溶液为甲醇、乙醇的一种或一种以上的混合物。
如权利要求1所述的制备方法，步骤(3)中所述有机溶剂为四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯，甲醇中的一种或一种以上的混合物，所用的酸为盐酸、硫酸、三氟乙酸中的一种或一种以上的混合物。
本发明还提供了另一种吡咯里西啶类生物碱，其结构如式II所示：
Figure BDA0002140870940000022
本发明还提供了式II所示化合物的制备方法，包括如下步骤：
(a)反应：将式I所示化合物用二氯甲烷溶解，使用三氯化铝为催化剂，回流反应；
(b)浓缩：将步骤(a)的产物减压浓缩；
(c)纯化：以体积比为100∶(2～8)的氯仿和甲醇作为流动相，正向硅胶为固定相进行反复柱层析分离纯化，即得。
如前述式II所示化合物的制备方法，步骤(a)所述的三氯化铝的用量为：每1g式I所示化合物对应50mg三氯化铝。
如前述式II所示化合物的制备方法，步骤(c)所述的氯仿和甲醇的体积比是100∶5。
本发明还提供了式III和式IV所示的化合物在制备治疗或缓解动脉粥样硬化的药物中的用途，所述式III为
Figure BDA0002140870940000031
式中所述R1为H或烷基，R2、R3为亚烷基，X为N或者N+-R4，R4为卤素取代的烷基。
进一步地，式III所示化合物的结构如式I和/或式II所示；
式I为
Figure BDA0002140870940000032
式II为
Figure BDA0002140870940000033
本发明还提供了一种治疗或缓解动脉粥样硬化的药物，其特征在于，所述药物是以式 I和/或式II所示的化合物作为活性成分，加上药学上可接受的辅料和/或载体制备得到。
前述的药物可以为适用于口服应用的形式，例如，可为片剂、药片、锭剂、含水或者含油混悬剂、可分散性粉剂或者粒剂、乳剂、液剂、硬胶囊或者软胶囊、或者糖装剂或者酿剂。
前述的药物还可以是注射制剂。
本发明的方法可以有效制备得到式I和/或式II所示的化合物，其中式II所示化合物的制备得率极高，可到90％。
式I和/或式II所示的化合物具有较强的抗动脉粥样硬化的活性。
式I和/或式II所示的化合物还具有较强的诱导巨噬细胞自噬的活性。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是式I或II所示化合物抗动脉斑块形成的外观图。
图2是式I或II所示化合物抗动脉斑块形成的统计图。
图3是式I或II所示化合物诱导自噬的实验结果附图。
具体实施方式
实施例1式I所示的吡咯里西啶类生物碱的制备
步骤一、生物碱混合物的提取
将干燥见血青5kg药材粉碎至20-40目，提取溶剂用体积分数为95％的乙醇对见血青药材粉末进行冷浸提取2～33次，每次5天，液料比为1∶5，合并浸提液，弃药渣，浸提液减压浓缩得浓缩液，浓缩液的体积为浸提液的1/5～1/4，得到见血青生物碱混合物；
步骤二、生物碱混合物的富集
将步骤一所得的生物碱混合物总浸膏用1L 50℃热水悬浮。用10％的稀HCl调节pH为1-2，依次用乙酸乙酯分别进行3次萃取。水层再用0.5％的NaOH碱化至pH＝11～12，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，减压回收，得见血青总生物碱。
步骤三、含糖吡咯里西啶类生物碱的水解
将乙酸乙酯层浸膏用有甲醇溶解，加入10％盐酸水溶液进行回流水解，反映用TLC进行检测。反应完成后，得到式I所示的吡咯里西啶类生物碱1g，反应式如下：
Figure BDA0002140870940000041
步骤四、式I所示的吡咯里西啶类生物碱的纯化
将步骤二、三所得含有式I所示的吡咯里西啶类生物碱浸膏，采用湿法柱层析，以石油醚-二乙胺系统(体积比为100∶5)作为流动相，正向硅胶为固定相进行反复柱层析分离纯化得到高纯度的化合物，经NMR、HRMS、IR等光谱法鉴定为式I所示化合物：
Figure BDA0002140870940000051
表1为式I所示化合物的1H-NMR、13C-NMR数据归属。
表1式I所示化合物的1H-NMR、13C-NMR数据
Figure BDA0002140870940000052
实施例2式II所示的吡咯里西啶类生物碱的制备
式II所示的吡咯里西啶生物碱1g，二氯甲烷溶解，以50mg无水三氯化铝为催化剂，回流4小时，减压浓缩，采用湿法柱层析，以氯仿-甲醇系统(100∶5)作为流动相，正向硅胶为固定相进行反复柱层析分离纯化得到高纯度的化合物900mg，经NMR、HRMS、IR等光谱法鉴定为式II所示化合物：
Figure BDA0002140870940000061
表2为式II所示化合物的1H-NMR、13C-NMR数据归属。
表2式II所示化合物的1H-NMR、13C-NMR数据
No. δ<sub>H</sub> δ<sub>C</sub> No. δ<sub>H</sub> δ<sub>C</sub>
1β 3.08m 41.3 3′ - 129.6
2α α2.30m 27.7 4′ - 158.9
2β β2.18m 5′ - 129.6
3α α3.78m 64.1 6′ 7.60s 130.0
3β β3.78m 7′ - 167.9
5α α4.10m 65.7 1″ 3.32d(7.2) 29.3
5β β3.51m 2″ 5.30t(7.2) 122.9
6α α2.19m 27.2 3″ - 134.3
6β β2.19m 4″ 1.72s 17.9
7α α2.19m 25.4 5″ 1.77s 26.0
7β β2.19m 1″′ 3.32d(7.2) 29.3
8β 3.60m 80.8 2″′ 5.30t(7.2) 122.9
9 4.36dd(6.4，10.8) 63.1 3″′ - 134.3
4.47dd(6.0，10.8) 4″′ 1.72s 17.9
10 5.33br.s 69.4 5″′ 1.77s 26.0
1′ - 121.6
2′ 7.60s 130.0
实施例3式I和式II所示化合物抗动脉粥样硬化作用
1.方法
1.1小鼠模型
ApoE-/-小鼠(8周龄)适应性喂养1周，为空白小鼠；然后继续高脂喂养12周，构建小鼠晚期斑块的模型小鼠。
1.2分组处理
(1)空白组：空白小鼠；
(2)对照组：小鼠晚期斑块模型小鼠，每天给与腹腔注射生理盐水组处理；
(3)化合物I组：小鼠晚期斑块模型小鼠，每天腹腔注射含20mg的式I所示化合物的生理盐水，共10周；
(4)化合物II组：小鼠晚期斑块模型小鼠，每天腹腔注射含20mg的式II所示化合物的生理盐水，共10周；。
1.3检测
取各组小鼠主动脉，油红O染色。
2.结果
除空白组外其余实验小鼠的主动脉根部都有典型的斑块形成(图1)，对其斑块面积进行统计，发现化合物I组和化合物II组的斑块面积显著小于对照组(图2)。
3.结论
本发明的化合物可以有效抑制动脉斑块形成，具备有效治疗动脉粥样硬化的能力。
实施例4式I所示化合物诱导自噬
1.材料与试剂
小鼠巨噬细胞为Raw264.7细胞株，由ACTT提供。
2.实验方法
对数生长期Raw264.7小鼠巨噬细胞接种于25cm2细胞培养瓶中，每瓶约5×104个细胞.不同浓度的式I和式II所示化合物进行给药处理，培养24h，收集各培养瓶细胞，离心，PBS漂洗，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白.经BCA法测定蛋白浓度及变性后，进行SDS-PAGE电泳，转膜，5％脱脂奶粉或BSA封闭，分别加入LC3I/II、 p62、Beclin 1和GAPDH抗体，4℃孵育过夜.次日，TBST洗膜3次，加入HRP标记的二抗室温孵育90min，TBST洗膜3次后用化学发光法显影，采用Image J软件进行条带分析。
3.结果
免疫印迹法分析显示，式I所示化合物可以明显诱导自噬标志蛋白LC3-II的表达(图 3)。
4.结论
式I所示化合物能够有效诱导巨噬细胞自噬。
综上，本发明以见血青为原料，依次采用95％乙醇提取，酸提碱沉、酸水解，通过运用硅胶柱色谱，简便、快捷的制备一种吡咯里西啶类生物碱(式I和式II所示化合物)的方法。所述吡咯里西啶类生物碱具有抗动脉粥样硬化活性，直接使用它们中的至少一种可以制备成为治疗动脉粥样硬化的药物，以它们为前体或先导药物，对其进行各种修饰，能得到更多的治疗动脉粥样硬化的药物。本发明为制备抗动脉粥样硬化药物提供了新的选择，具有十分优良的应用前景。

Claims (6)

1.式II所示化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)反应：将式I所示化合物用二氯甲烷溶解，使用三氯化铝为催化剂，回流反应；
(b)浓缩：将步骤(a)的产物减压浓缩；
(c)纯化：以体积比为100∶(2～8)的氯仿和甲醇作为流动相，正向硅胶为固定相进行反复柱层析分离纯化，即得；
所述式I化合物为：
Figure FDA0003150448560000011
所述式II化合物为：
Figure FDA0003150448560000012
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)所述的三氯化铝的用量为：每1g式I所示化合物对应50mg三氯化铝。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(c)所述的氯仿和甲醇的体积比是100:5。
4.式III所示的化合物在制备治疗或缓解动脉粥样硬化的药物中的用途，所述式III化合物为：
Figure FDA0003150448560000021
其中，R1为H，R2、R3为亚甲基，X为N或者N+-R4，R4为氯甲基。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，式III所示化合物的结构如式IV和/或式V所示；
式IV为
Figure FDA0003150448560000022
式V为
Figure FDA0003150448560000023
6.一种治疗或缓解动脉粥样硬化的药物，其特征在于，所述药物是以式I和/或式II所示的化合物作为活性成分，加上药学上可接受的辅料和/或载体制备得到；
所述式I化合物为：
Figure FDA0003150448560000031
所述式II化合物为：
Figure FDA0003150448560000032
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