CN106539795A - 一种利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物 - Google Patents

一种利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物，包括：取新鲜钩吻藤茎和/或根和/或(下同)叶或干燥饮片，浸泡提取，减压回收乙醇，浓缩至无醇味，加酸溶解并调节pH，取上清液；加碱调节pH为9～10，溶液萃取，回收有机溶剂，获得钩吻总碱浸膏；用甲醇等溶解浸膏，与硅胶混匀、干燥、粉碎、上硅胶制备柱，有机溶剂梯度洗脱，得常绿钩吻碱粗制部位；再进行中高压反相硅胶柱制备。本发明钩吻总碱在给药后4h开始对肿瘤细胞的活性产生影响，肿瘤细胞增殖的速度与空白组相比有所降低；常绿钩吻碱给药5h后开始对肿瘤细胞的活性产生影响，低剂量的常绿钩吻碱可以降低肿瘤细胞增殖的速度，高剂量的常绿钩吻碱可以导致肿瘤细胞的死亡。

Description

一种利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物技术领域，尤其涉及一种利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物。
背景技术
钩吻是著名的毒性中药，在止痛与抗肿瘤方面有肯定的疗效，但因其毒性巨大，其原药材与粗提物的临床应用受到较大的制约。近些年，从钩吻药材中提取分离纯化了诸多的钩吻化学成分如钩吻素子、钩吻碱甲、胡蔓藤碱甲等40多个单体，其中诸如钩吻素子、钩吻碱甲、1-甲氧基钩吻碱等化学成分的止痛、抗肿瘤作用与制剂己见报道。
常绿钩吻碱(sempervirine)是从钩吻中分离得到的一个吲哚类生物碱，常绿钩吻碱的抗肿瘤活性药物属于技术空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物，旨在解决钩吻原药材与粗提物临床应用受到较大制约的问题。
本发明是这样实现的，一种利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物，所述利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物为含常绿钩吻碱1％～99.99％的钩吻总碱或常绿钩吻碱单体化合物。
本发明的另一目的在于提供一种所述利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物的制备方法，所述利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物的制备方法包括以下步骤：
步骤一，取钩吻藤茎、根、叶新鲜或干燥饮片，加钩吻藤茎、根、叶新鲜或干燥饮片质量6倍～12倍的乙醇或者甲醇、丙酮、乙酸乙酯；浸泡提取，提取液抽滤，用真空旋转蒸发仪减压回收乙醇或者甲醇、丙酮、乙酸乙酯，提取1次～3次，合并滤液，浓缩；浓缩后的滤液加盐酸或者硫酸溶液溶解并调节pH至1～5，操作3～6次，至上清液生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，合并上清液；
步骤二，加氢氧化钠或氢氧化钾、氨水调节上清液PH至8～13；碱化后的溶液用2倍～6倍量的氯仿或二氯甲烷石油醚、乙酸乙酯、苯进行萃取3～6次，至碱化后的液体生物碱试验呈阴性或弱阳性，减压回收氯仿或二氯甲烷石油醚、乙酸乙酯、苯，获得钩吻总碱浸膏；
步骤三，常绿钩吻碱的制备：
将上述获得的钩吻总碱浸膏用甲醇或丙酮等有机溶剂溶解，与0.5-2倍量的硅胶均匀混合，干燥，粉碎后上常压、中压或高压硅胶制备柱，用10-90％的甲醇或乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿有机溶剂+0.05-1％的甲酸或乙酸进行梯度洗脱，获得不同浓度的洗脱部位；
经TLC或HPLC检测跟踪，获得常绿钩吻碱部位，合并同一部位洗脱液，回收有机溶剂，获得常绿钩吻碱粗制部位。再对此粗制部位进行中、高压反相硅胶柱制备，以甲醇、乙睛等溶剂洗脱，可获得纯度高达99.99％的常绿钩吻碱单体化合物。
进一步，所述步骤一中，加6倍～12倍量的乙醇浓度为50％～95％。
进一步，所述乙醇浓度为70％。
本发明的另一目的在于提供一种由所述利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物的制备方法制备的常绿钩吻碱。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述常绿钩吻碱制备的抗肿瘤针剂。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述常绿钩吻碱制备的抗肿瘤片剂。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述常绿钩吻碱制备的抗肿瘤缓释剂。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述常绿钩吻碱制备的抗肿瘤胶囊剂。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述常绿钩吻碱制备的抗肿瘤外用擦剂。
本发明提供的利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物，使用xCELLigence细胞检测系统检测钩吻总碱及常绿钩吻碱对人结肠癌HT-29细胞株，人结肠癌HCT-8细胞株，人肝癌HepG2细胞株，人肝癌Bel-7402细胞株，人肺癌A549细胞株的细胞毒性效应进行了评价。发现钩吻总碱在给药后4h开始对细胞的活性产生影响，细胞增殖的速度与空白组相比有所降低。常绿钩吻碱给药5h后开始对细胞的活性产生影响，低剂量的常绿钩吻碱可以降低细胞增殖的速度，高剂量的常绿钩吻碱可以导致细胞的死亡。本发明将常绿钩吻碱粗制部位用甲醇或丙酮等有机溶剂溶解，与0.5-2倍量的反相硅胶获得均匀混合，干燥，粉碎后上中压或高压反相硅胶制备柱，用30-70％的甲醇或乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂+0.05-1％的甲酸或乙酸等进行等度或梯度洗脱，获得目标成分常绿钩吻碱，其纯度按HPLC法计算可达85-99％。
附图说明
图1是本发明实施例提供的利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物的制备方法流程图。
图2是本发明实施例提供的不同浓度的钩吻总碱(Total Alkloid,TAs)和常绿钩吻碱(Sempervirine,Semp)对神经胶质瘤干细胞(human glioma stem cell lines,456+GSC，Cleveland)进行给药示意图。
图3是本发明实施例提供的钩吻总碱和常绿钩吻碱对HepG2细胞的增殖抑制作用示意图。
图4是本发明实施例提供的钩吻总碱和常绿钩吻碱对Bel7402细胞的增殖抑制作用示意图。
图5是本发明实施例提供的钩吻总碱和常绿钩吻碱对A549细胞的增殖抑制作用示意图。
图6是本发明实施例提供的钩吻总碱和常绿钩吻碱对HT-29细胞的增殖抑制作用示意图。
图7是本发明实施例提供的钩吻总碱和常绿钩吻碱对HCT-8细胞的增殖抑制作用示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
本发明实施例的利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物为含常绿钩吻碱1％～99.99％的钩吻总碱或常绿钩吻碱单体化合物。
如图1所示，本发明实施例的利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物的制备方法包括以下步骤：
S101：取钩吻藤茎、根、叶新鲜或干燥饮片，加钩吻藤茎、根、叶新鲜或干燥饮片质量6～12倍量的乙醇(乙醇浓度50～95％，优选70％)或者甲醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，浸泡提取，提取液趁热抽滤，用真空旋转蒸发仪减压回收乙醇等有机溶剂，提取1～3次，合并滤液，浓缩至无醇味，加一定量盐酸或者硫酸等酸溶液溶解并调节pH至酸性1～5，如此操作3～6次至上清液生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，合并上清液。
S102：加氢氧化钠或氢氧化钾、氨水等碱调节pH至碱性8～13，碱化后的溶液用2～6倍量的氯仿或二氯甲烷石油醚、乙酸乙酯、苯等有机溶剂进行萃取3～6次至碱化后的液体生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，减压回收有机溶剂，获得钩吻总碱浸膏，备用。
S103：常绿钩吻碱的制备。
将上述获得的钩吻总碱浸膏用甲醇或丙酮等有机溶剂溶解，与0.5-2倍量的硅胶获得均匀混合，干燥，粉碎后上常压、中压或高压硅胶制备柱，用10-90％的甲醇或乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿有机溶剂+0.05-1％的甲酸或乙酸进行梯度洗脱，获得不同浓度的洗脱部位；
经TLC或HPLC检测跟踪，获得常绿钩吻碱部位，合并同一部位洗脱液，回收有机溶剂，获得常绿钩吻碱粗制部位。再对此粗制部位进行中、高压反相硅胶柱制备，以甲醇、乙睛等溶剂洗脱，可获得纯度高达99.99％的常绿钩吻碱单体化合物。
本发明实施例的基于常绿钩吻碱抗肿瘤药物可以制备成治疗神经胶质瘤的针剂；治疗肝癌的片剂；治疗结肠癌的胶囊剂；治疗胃癌的缓释剂。
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1：
(1)取钩吻藤茎新鲜或干燥饮片，加钩吻藤茎新鲜或干燥饮片质量6～12倍量的乙醇(乙醇浓度50～95％，优选70％)或者甲醇，浸泡提取，提取液趁热抽滤，用真空旋转蒸发仪减压回收乙醇等有机溶剂，提取1～3次，合并滤液，浓缩至无醇味，加一定量盐酸的酸溶液溶解并调节pH至酸性1～5，如此操作3～6次至上清液生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，合并上清液。
(2)加氢氧化钠调节pH至碱性8～13，碱化后的溶液用2～6倍量的氯仿进行萃取3～6次至碱化后的液体生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，减压回收有机溶剂，获得钩吻总碱浸膏，备用。
(3)常绿钩吻碱的制备。
将上述获得的钩吻总碱浸膏用甲醇溶解，与0.5-2倍量的硅胶获得均匀混合，干燥，粉碎后上常压、中压或高压硅胶制备柱，用10-90％的甲醇有机溶剂+0.05-1％的甲酸进行梯度洗脱，获得不同浓度的洗脱部位；
经HPLC检测跟踪，获得常绿钩吻碱部位，合并同一部位洗脱液，回收有机溶剂，获得常绿钩吻碱粗制部位。再对此粗制部位进行高压反相硅胶C18柱制备，以甲醇水溶剂洗脱，获得纯度高达99.0％的常绿钩吻碱单体化合物。
实施例2：
(1)取新鲜或干燥的钩吻叶新鲜或干燥饮片，加钩吻叶新鲜或干燥饮片质量6～12倍量的乙醇(乙醇浓度50～95％，优选70％)或者丙酮，浸泡提取，提取液趁热抽滤，用真空旋转蒸发仪减压回收乙醇等有机溶剂，提取1～3次，合并滤液，浓缩至无醇味，加一定量硫酸的酸溶液溶解并调节pH至酸性1～5，如此操作3～6次至上清液生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，合并上清液。
(2)加氢氧化钾调节pH至碱性8～13，碱化后的溶液用2～6倍量的二氯甲烷石油醚有机溶剂进行萃取3～6次至碱化后的液体生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，减压回收有机溶剂，获得钩吻总碱浸膏，备用。
(3)常绿钩吻碱的制备。
将上述获得的钩吻总碱浸膏用乙醇溶解，与0.5-2倍量的硅胶获得均匀混合，干燥，粉碎后上常压、中压或高压硅胶制备柱，用10-90％的乙醇+0.05-1％的乙酸进行梯度洗脱，获得不同浓度的洗脱部位；
经HPLC检测跟踪，获得常绿钩吻碱部位，合并同一部位洗脱液，回收有机溶剂，获得常绿钩吻碱粗制部位。再对此粗制部位进行高压反相硅胶C8柱制备，以乙睛水溶剂洗脱，获得纯度高达99.99％的常绿钩吻碱单体化合物。
实施例3：
(1)取钩吻根新鲜或干燥饮片，加钩吻根新鲜或干燥饮片质量6～12倍量的乙醇(乙醇浓度50～95％，优选70％)或者乙酸乙酯，浸泡提取，提取液趁热抽滤，用真空旋转蒸发仪减压回收乙醇等有机溶剂，提取1～3次，合并滤液，浓缩至无醇味，加一定量盐酸的酸溶液溶解并调节pH至酸性1～5，如此操作3～6次至上清液生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，合并上清液。
(2)加氨水调节pH至碱性8～13，碱化后的溶液用2～6倍量的乙酸乙酯进行萃取3～6次至碱化后的液体生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，减压回收有机溶剂，获得钩吻总碱浸膏，备用。
(3)常绿钩吻碱的制备。
将上述获得的钩吻总碱浸膏用丙酮溶解，与0.5-2倍量的硅胶获得均匀混合，干燥，粉碎后上常压、中压或高压硅胶制备柱，用10-90％的丙酮+0.05-1％的甲酸进行梯度洗脱，获得不同浓度的洗脱部位；
经TLC检测跟踪，获得常绿钩吻碱部位，合并同一部位洗脱液，回收有机溶剂，获得常绿钩吻碱粗制部位。再对此粗制部位进行中压反相硅胶C18柱制备，以甲醇水溶剂洗脱，获得纯度88.9％的常绿钩吻碱单体化合物。
实施例4：
(1)取钩吻藤茎、根、叶混合的新鲜或干燥饮片，加钩吻藤茎、根、叶混合新鲜或干燥饮片质量6～12倍量的乙醇(乙醇浓度50～95％，优选70％)或者丙酮，浸泡提取，提取液趁热抽滤，用真空旋转蒸发仪减压回收乙醇等有机溶剂，提取1～3次，合并滤液，浓缩至无醇味，加一定量硫酸的酸溶液溶解并调节pH至酸性1～5，如此操作3～6次至上清液生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，合并上清液。
(2)加氢氧化钾调节pH至碱性8～13，碱化后的溶液用2～6倍量的苯进行萃取3～6次至碱化后的液体生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，减压回收有机溶剂，获得钩吻总碱浸膏，备用。
(3)常绿钩吻碱的制备。
将上述获得的钩吻总碱浸膏用乙酸乙酯溶解，与0.5-2倍量的硅胶获得均匀混合，干燥，粉碎后上常压、中压或高压硅胶制备柱，用10-90％的乙酸乙酯+0.05-1％的乙酸进行梯度洗脱，获得不同浓度的洗脱部位；
经TLC检测跟踪，获得常绿钩吻碱部位，合并同一部位洗脱液，回收有机溶剂，获得常绿钩吻碱粗制部位。再对此粗制部位进行中压反相硅胶C18柱制备，以乙睛水溶剂洗脱，获得纯度达90.6％的常绿钩吻碱单体化合物。
实施例5：
(1)取钩吻藤叶新鲜或干燥饮片，加钩吻藤茎、根、叶新鲜或干燥饮片质量6～12倍量的乙醇(乙醇浓度50～95％，优选70％)或者乙酸乙酯，浸泡提取，提取液趁热抽滤，用真空旋转蒸发仪减压回收乙醇等有机溶剂，提取1～3次，合并滤液，浓缩至无醇味，加一定量硫酸的酸溶液溶解并调节pH至酸性1～5，如此操作3～6次至上清液生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，合并上清液。
(2)加氢氧化钠调节pH至碱性8～13，碱化后的溶液用2～6倍量的氯仿进行萃取3～6次至碱化后的液体生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，减压回收有机溶剂，获得钩吻总碱浸膏，备用。
(3)常绿钩吻碱的制备。
将上述获得的钩吻总碱浸膏用氯仿溶解，与0.5-2倍量的硅胶获得均匀混合，干燥，粉碎后上常压、中压或高压硅胶制备柱，用10-90％的氯仿+0.05-1％的甲酸进行梯度洗脱，获得不同浓度的洗脱部位；
经HPLC检测跟踪，获得常绿钩吻碱部位，合并同一部位洗脱液，回收有机溶剂，获得常绿钩吻碱粗制部位。再对此粗制部位进行高压反相硅胶C18柱制备，以乙睛水溶剂洗脱，获得纯度达98.6％的常绿钩吻碱单体化合物。
下面结合实验对本发明的应用效果作详细的描述。
(1)使用不同浓度的钩吻总碱(Total Alkloid,TAs)和常绿钩吻碱(Sempervirine,Semp)对神经胶质瘤干细胞(human glioma stem cell lines,456+GSC，Cleveland)进行给药。随着药物浓度的增加与培养天数的增加，对神经胶质瘤干细胞的增殖抑制率明显提高，如图2所示。
(2)钩吻总碱和常绿钩吻碱对HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用
使用不同浓度的钩吻总碱和常绿钩吻碱对HepG2肝癌细胞进行给药。随着药物浓度的增加，对细胞的增殖抑制率明显提高，钩吻总碱IC50值为184.21±2.7μg/mL，常绿钩吻碱的IC50值为50.53±1.89μmol/L(即13.74±0.51μg/mL)。如图3所示，当钩吻总碱的药物浓度大于100μg/mL时HepG2肝癌细胞的存活率明显降低，当常绿钩吻碱的浓度大于50μmol/L时对HepG2肝癌细胞均具有较强的生长抑制作用。
钩吻总碱和常绿钩吻碱对Bel7402肝癌细胞增殖的抑制作用
不同浓度的钩吻总碱和常绿钩吻碱作用于Bel7402肝癌细胞48h。随着药物浓度的增加，对Bel7402肝癌细胞生长抑制率明显提高，其钩吻总碱的IC50值为173.53±4.53μg/mL，常绿钩吻碱的IC50值为74.28±6.11μmol/L(即20.2±1.66μg/mL)。如图4提示钩吻总碱和常绿钩吻碱对Bel7402肝癌细胞均具有很强的增殖抑制作用并且具有一定的量效关系。
钩吻总碱和常绿钩吻碱对A549肺癌细胞增殖的抑制作用
不同浓度的钩吻总碱和常绿钩吻碱作用于A549肺癌细胞48h。随着药物浓度的增加，对A549肺癌细胞的抑制率明显提高，其钩吻总碱的IC50值为208.76±11.2μg/mL，常绿钩吻碱的IC50值为50.73±1.81μmol/L(即13.8±0.49μg/mL)。如图5所示钩吻总碱，常绿钩吻碱对A549肺癌细胞的增殖具有很强抑制作用。
钩吻总碱和常绿钩吻碱对HT-29结肠癌细胞增殖的抑制作用
使用不同浓度的钩吻总碱和常绿钩吻碱对HT-29结肠癌细胞进行给药。随着给药浓度的改变，对HT-29结肠癌细胞的抑制作用明显提高，其钩吻总碱的IC50值为105.96±18.78μg/mL，常绿钩吻碱的IC50值为39.56±2.09μmol/L(即10.76±0.57μg/mL)。如图6所示钩吻总碱，常绿钩吻碱对HT-29结肠癌细胞的增殖具有很强的抑制作用。
钩吻总碱和常绿钩吻碱对HCT-8结肠癌细胞增殖的抑制作用
使用不同浓度的钩吻总碱和常绿钩吻碱对HCT-8结肠癌细胞进行给药48h。随着给药浓度的增加，对HCT-8结肠癌细胞的抑制率明显提高，钩吻总碱的IC50值为175.41±2.99μg/mL，常绿钩吻碱的IC50值为55.94±2.07μmol/L(即15.21±0.56μg/mL)。如图7提示钩吻总碱，常绿钩吻碱对HCT-8结肠癌细胞具有很强的抑制增殖作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物，其特征在于，所述利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物为含常绿钩吻碱1％～99.99％的钩吻总碱或常绿钩吻碱单体化合物。
2.一种如权利要求1所述利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于，所述利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物的制备方法包括以下步骤：
步骤一，取钩吻藤茎、根、叶新鲜或干燥饮片，加钩吻藤茎、根、叶新鲜或干燥饮片质量6倍～12倍的乙醇或者甲醇、丙酮、乙酸乙酯；浸泡提取，提取液抽滤，用真空旋转蒸发仪减压回收乙醇或者甲醇、丙酮、乙酸乙酯，提取1次～3次，合并滤液，浓缩；浓缩后的滤液加盐酸或者硫酸溶液溶解并调节pH至1～5，操作3～6次，至上清液生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，合并上清液；
步骤二，加氢氧化钠或氢氧化钾、氨水调节上清液PH至8～13；碱化后的溶液用2倍～6倍量的氯仿或二氯甲烷石油醚、乙酸乙酯、苯进行萃取3～6次，至碱化后的液体生物碱试验呈阴性或弱阳性为止，减压回收氯仿或二氯甲烷石油醚、乙酸乙酯、苯，获得钩吻总碱浸膏；
步骤三，常绿钩吻碱的制备：将上述获得的钩吻总碱浸膏用甲醇或丙酮溶解，与0.5-2倍量的硅胶均匀混合，干燥，粉碎后上常压、中压或高压硅胶制备柱，用10-90％的甲醇或乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿有机溶剂+0.05-1％的甲酸或乙酸进行梯度洗脱，获得不同浓度的洗脱部位；经TLC或HPLC检测跟踪，获得常绿钩吻碱部位，合并同一部位洗脱液，回收有机溶剂，获得常绿钩吻碱粗制部位；再对此粗制部位进行中、高压反相硅胶柱制备，以甲醇、乙睛洗脱，获得纯度高达99.99％的常绿钩吻碱单体化合物。
3.如权利要求2所述的利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，加6倍～12倍量的乙醇或者甲醇、丙酮、乙酸乙酯浓度为50％～95％。
4.一种由权利要求2～3任意一项所述利用钩吻药材制备的抗肿瘤药物的制备方法制备的常绿钩吻碱，浓度1％-99.9％。
5.一种利用权利要求4所述常绿钩吻碱制备的抗肿瘤针剂。
6.一种利用权利要求4所述常绿钩吻碱制备的抗肿瘤片剂。
7.一种利用权利要求4所述常绿钩吻碱制备的抗肿瘤缓释剂。
8.一种利用权利要求4所述常绿钩吻碱制备的抗肿瘤胶囊剂。
9.一种利用权利要求4所述常绿钩吻碱制备的抗肿瘤外用擦剂。
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