CN102321092A - 三异戊二烯基酚化合物、三异戊二烯基酚化合物的制造方法和血栓溶解促进剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具有血栓溶解促进活性的下述三异戊二烯基酚化合物和三异戊二烯基酚化合物的高效制造方法。该化合物为下述通式(II)和(III)表示的三异戊二烯基酚化合物：[化学式1]
其中，R1表示具有以选自羧基、羟基、磺酸基和仲氨基中的至少1种作为取代基或取代基的一部分的芳基，或含有仲氨基并且还可以含有氮的芳基。通式(III)中的R4表示下述通式(III-1)所示的芳族氨基酸残基，X表示-CHY-(CH3)2Z；Y和Z各自为-H或-OH，或一起形成单键，[化学式2]
其中R5表示可有可无的羟基，n表示0或1的整数。
Description
本申请为分案申请，原申请的申请日为2007年3月20日，申请号为200780000925.4(PCT/JP2007/055749)，发明名称为“三异戊二烯基酚化合物、三异戊二烯基酚化合物的制造方法和血栓溶解促进剂”。
技术领域
本发明涉及三异戊二烯基酚(トリプレニルフエノ一ル，triprenylphenol)化合物和三异戊二烯基酚化合物的制造方法、以及血栓溶解促进剂。
背景技术
在具有三异戊二烯基酚骨架的微生物代谢产物中，存在着具有重要生理活性的物质。例如，已知由霉菌(糸状菌)得到的特定的三异戊二烯基酚化合物，具有血栓溶解促进作用和血管新生抑制作用之类的针对生物中重要现象的生理活性作用(专利文献1～3)。
另外，作为与上述三异戊二烯基酚化合物的立体结构不同的其它三异戊二烯基酚化合物，在专利文献4中，公开了具有生发活性的三异戊二烯基酚化合物。另外，在非专利文献1中，公开了具有抗菌活性和抗真菌活性的三异戊二烯基酚化合物。
使用霉菌的培养得到的三异戊二烯基酚化合物，指导纤维蛋白溶酶原(Plg)的构象变化，其结果是，增加纤溶酶原激活物(PA)带来的活化的敏感性和纤维蛋白溶酶原的纤维蛋白结合能，其结果表明促进血栓溶解(非专利文献2)。已知添加作为氨基酸的鸟氨酸时得到的具有2个三异戊二烯基酚骨架的化合物(下文称为(オルニプラビン(orniplabin))，这种血栓溶解促进作用特别地明显强(专利文献2)。
这样，由于具有三异戊二烯基酚骨架的化合物通过其立体结构和取代基表现出多样的活性，所以其利用价值高。
由于这些多样的活性型三异戊二烯基酚化合物具有复杂的结构，因此要求以更高效率得到。作为这样的制造方法，开发出通过培养微生物进行制造的方法。但是，在使用微生物的方法中，通常，一起生产数量繁多的类似物，因此，为了高效和大量地得到而进行了各种工作。特别地，为了制造具有血栓溶解促进作用和血管新生抑制作用的生理活性的活性型三异戊二烯基酚化合物，在专利文献1～3中，公开了在培养开始后不久等的霉菌培养初期，添加与取代基相应的氨基酸或氨基醇的培养体系。
专利文献1：日本特开2002-65288号公报
专利文献2：日本特开2004-224737号公报
专利文献3：日本特开2004-224738号公报
专利文献4：国际公开98/56940号小册子
非专利文献1：J.Org.Chem.，(1992)，Vol.57，第6700～6703页
非专利文献2：FEBS Letter，(1997)Vol.418，第58～62页
发明内容
发明要解决的问题
但是，由于オルニプラビン(orniplabin)是分子量超过800的二聚体，因此从被生物体吸收的角度而言，被认为是不利的。
另外，在现有的利用霉菌的培养方法中，相应于可添加的氨基酸和氨基醇的种类，所得到的生成物的种类受到限制。另外，生成量也不能说是充分的。进一步地，由于活性型三异戊二烯基酚化合物具有复杂的结构，因此，化学合成全部步骤的效率非常差。
因此，本发明的目的是，提供低分子量并能够发挥出高血栓溶解促进作用的新颖的三异戊二烯基酚化合物，和提供含有该化合物的血栓溶解促进剂。
另外，本发明的另一目的是，高效地制造生理活性高的活性型三异戊二烯基酚化合物。
解决问题的方案
本发明的第一三异戊二烯基酚化合物，是下述式(I)表示的旋光度(-)的三异戊二烯基酚化合物。在下述式(I)中，X为-CHY-C(CH3)2Z，Y和Z各自为-H或-OH，或一起形成单键。
优选的是，第一三异戊二烯基酚化合物，为下述式(I-A)表示的化合物。
[化学式1]
另外，本发明第二三异戊二烯基酚化合物，是下述通式(II)表示的三异戊二烯基酚化合物。下述通式(II)中的R1表示具有选自羧基、羟基、磺酸基和仲氨基的至少1种作为取代基或作为取代基的一部分的芳基，或含有仲氨基并且还可以含有氮的芳基。X为-CHY-C(CH3)2Z，Y和Z各自为-H或-OH，或一起形成单键。
[化学式2]
本发明的第三三异戊二烯基酚化合物，是下述通式(III)表示的三异戊二烯基酚化合物。下述通式(III)中的R4表示下述通式(III-1)所示的芳族氨基酸残基(但在本发明的一些实施方式中，酪氨酸残基和苯丙氨酸残基除外)，下述通式(III-1)中的R5表示可有可无的羟基，n表示0或1的整数。X为-CHY-C(CH3)2Z，Y和Z各自为-H或-OH，或一起形成单键。
[化学式3]
[化学式4]
本发明的血栓溶解促进剂是包含上述通式(II)或(III)表示的三异戊二烯基酚化合物作为有效成分的血栓溶解促进剂。
本发明的上述第二三异戊二烯基酚化合物的制造方法是这样的制造方法，其包括：在含有选自氨基苯酚、氨基苯甲酸、腺嘌呤、腺苷、氨基二氢2，3-二氮杂萘二酮(アミノジヒドロフタラジンジオン)、氨基萘酚磺酸、磺胺酸及其衍生物的胺加入化合物(添加アミン化合物)的培养液中培养霉菌的培养步骤；和从培养步骤后的培养物中，分离该三异戊二烯基酚化合物的分离步骤。
本发明的制造上述第三三异戊二烯基酚化合物的制造方法是这样的制造方法，其包括：在含有选自芳族氨基酸或其衍生物的胺加入化合物的培养液中培养霉菌的培养步骤；和从培养步骤后的培养物中，分离该三异戊二烯基酚化合物的分离步骤。
另外，本发明的上述第二和第三三异戊二烯基酚化合物也可通过上述制造方法制造，其中所述霉菌的培养步骤包括：利用胺化合物的含量为按质量计0.5％以下的限制性培养基(制限培地)的第1培养步骤；和在培养中期以后，利用含有胺加入化合物的生产用培养基的第2培养步骤。
本发明的制造三异戊二烯基酚化合物的制造方法是这样的制造方法，其包括：在利用胺化合物的种类和含量中的至少一个受限的限制性培养基的第1培养步骤中培养霉菌；在培养中期以后，在利用含有胺化合物的生产用培养基的第2培养步骤中培养霉菌；和从所述第2培养步骤后的培养物得到三异戊二烯基酚化合物。
在此，也可以是所述第1培养步骤中使用的限制性培养基含有按质量计0.5％以下的胺化合物，所述生产用培养基含有有机胺化合物。
另外，本发明的第一三异戊二烯基酚化合物优选通过下述方法制造：在本制造方法中，所述第1培养步骤中使用的限制性培养基含有按质量计0.5％以下的有机胺化合物，所述第2培养步骤中使用的生产用培养基含有无机伯胺化合物。
在本发明的上述任一制造方法中，优选所述限制性培养基和生产用培养基是还含有选自镁、钴、铁、钙的至少1种金属离子的培养基。
另外，在本发明的上述任一制造方法中，所述霉菌优选为球状小孢葡萄穗霉(スタキボトリス·ミクロスポラ，Stachybotrys microspora)IFO30018。
发明的效果
按照本发明，可以提供低分子量并且能够发挥出高血栓溶解促进作用的新型三异戊二烯基酚化合物，和可以提供含有该化合物的血栓溶解促进剂。
另外，按照本发明，能够高效制造生理活性高的活性型三异戊二烯基酚化合物。
附图说明
图1是本发明相关的各种SMTP化合物的结构概略。
图2是本实施例1的色谱法的谱图。
图3是表示本实施例5的SMTP-0和オルニブラビン(orniplabin)(SMTP-7)对纤维蛋白溶酶原活化的影响的图示(图例的浓度单位为μM)。
图4是表示本实施例5的SMTP-0和オルニブラビン(SMTP-7)对纤维蛋白溶酶原片段生成的影响的图示(浓度单位为μM)。
具体实施方式
<三异戊二烯基酚化合物的制造方法和第一三异戊二烯基酚化合物>
本发明的制造三异戊二烯基酚的制造方法的特征在于，包括：在利用胺化合物的种类和含量中的至少一个受限的限制性培养基的第1培养步骤中培养霉菌；在培养中期以后，在利用含有胺化合物的生产用培养基的第2培养步骤中培养霉菌；和从所述第2培养步骤后的培养物得到三异戊二烯基酚化合物。
在上述制造方法中，由于第1培养步骤中使用的培养基应用胺化合物的种类和含量中的至少一个受限的限制性培养基，因此，在转移到第2培养步骤的培养中期以后，能够得到比以前的量多的中间体化合物。此后，通过施行利用含有胺化合物的生产用培养基的第2培养步骤，可高效并且以良好的选择性得到目标产物三异戊二烯基酚化合物。
另外，本发明的第一三异戊二烯基酚化合物，是下述式(I)表示的旋光度(-)的化合物。式中X为-CHY-C(CH3)2Z，Y和Z各自为-H或-OH，或一起形成单键。
[化学式5]
该式(I)示出的三异戊二烯基酚化合物的1位氮原子为仲胺，8位和9位均具有(S)的绝对构型，共同作为整体，显示出(-)的旋光度。由于这样的光学活性性和绝对构型与具有促进血栓溶解等生理活性的活性型三异戊二烯基酚化合物相同，因此通过适当改变本化合物中的1位的取代基，就可容易地得到多种三异戊二烯基酚化合物。
下面，对本发明的三异戊二烯基酚化合物的制造方法进行说明。
在本发明的制造方法中，为得到三异戊二烯基酚化合物使用的霉菌，选择葡萄穗霉(スタキボトリス)属的霉菌。特别优选的生产菌为球状小孢葡萄穗霉(スタキボトリス·ミクロスポラ，Stachybotrys microspora)等，更优选为球状小孢葡萄穗霉(スタキボトリス·ミクロスポラ；S.microspora)IFO30018菌株，但本发明并不限于该菌。
在本发明的制造方法中，上述霉菌由使用限制性培养基的第1培养步骤和培养中期以后使用生产用培养基的第2培养步骤的2阶段培养步骤培养。
在第1培养步骤中，使用胺化合物的种类和含量中的至少一个受到限制的限制性培养基。本文所述的“种类和含量中的至少一个受到限制”意味着，相应于所选择的胺化合物的种类，决定向限制性培养基的添加量。通过使用限制胺化合物的种类和含量中的至少一个的这种限制性培养基，在培养中期以后的第2培养步骤中，可以高效并以良好的选择性产生三异戊二烯基酚化合物。
在培养中期以后的第2培养步骤中，使用含有胺化合物的生产用培养基。在此，“培养中期”是，为使第1培养步骤确实地继续进行的从培养开始的预定期间，优选为培养开始后的第2天以后，更优选为第4天以后。当该期间过短时，例如，当在培养开始后立刻开始用生产用培养基培养时，为得到目标三异戊二烯基酚所需的中间体化合物的量就会不足，不能高效生成三异戊二烯基酚化合物。
在本发明的制造方法中，可使第1培养步骤中使用的限制性培养基含有按质量计0.5％以下的胺化合物，第2培养步骤中使用的生产用培养基含有有机胺化合物(在本说明书中下文中称为“本发明的第一制造方法”)。
这样，可以无损于限制性培养基中的霉菌的化合物生成能，得到含有与生产用培养基中所含的有机胺化合物对应的官能团的中间体化合物，例如，下述通式(I-B)表示的化合物。在通式(I-B)中，X与上述同样，式中#表示与生产用培养基所含胺化合物对应的预定的官能团。
[化学式6]
在本发明的第一制造方法中，限制性培养基中的胺化合物相当于下述有机和无机胺化合物中的任一。该胺化合物作为限制性培养基中的用于霉菌生长的氮源、生长促进因子、或三异戊二烯基酚化合物母体的生产促进因子发生作用。添加的形态可以利用酵母提取物、肉汤、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粕(ソイビ一ンミ一ル)、药用培养基(フア一マメデイア)、玉米浆(コ一ンステイ一プリカ一)、鱼肉提取物等天然的混合物，或精制化合物。由于天然的混合物含有多种胺化合物，所以在限制性培养基中，需要限制其含量。在这种情况下，相对于限制性培养基的总容量为按质量计0.5％以下，从菌的生长繁殖、生产量和生产的选择性的角度，优选为按质量计0.01～0.5％，更优选为按质量计0.1％～0.3％。当超过按质量计0.5％时，存在中间体化合物以外的化合物同时生成并且选择性差、生产效率也降低的情况，这不是优选的。另一方面，按质量计低于0.01％时，存在霉菌的活性差的情况，这不是优选的。并且，将精制化合物作为胺化合物添加时，采用使生产所用的霉菌的生长和三异戊二烯基酚化合物母体的生产发生良好的范围的量和种类。
在限制性培养基中培养的霉菌在培养中期以后，被提供给利用含有有机胺化合物的生产用培养基的第2培养步骤中进行培养。
第2培养步骤中使用的生产用培养基，除了含有有机胺化合物以外，可由与限制性培养基同样的组分构成。为此，第2培养步骤中的培养，可通过在第1培养步骤中使用的限制性培养基中添加有机胺化合物实施，也可直接添加重新配制的含有胺化合物的培养基。
第2培养步骤中的生产用培养基中可能含有的有机胺化合物，只要以用于得到作为目标的三异戊二烯基酚化合物的必要量在培养基中存在即可，用量为培养基的总容量的按质量计5％以下，从生产量的角度，优选为按质量计0.01～1％，更优选为按质量计0.1％～0.5％。
作为本发明的第一制造方法中的有机胺化合物，可举出合成物或来自天然的胺化合物。来自天然的胺化合物成分，可以举出主要是为了在培养基中添加蛋白质和天然氨基酸而被一直以来使用的成分，例如，酵母提取物、肉汤、蛋白胨、胰蛋白胨、大豆粕、药用培养基、玉米浆、鱼肉提取物等，从生产量的角度，优选为酵母提取物、蛋白胨。
另外，基于生成的三异戊二烯基酚化合物的种类和生产量，添加到生产用培养基中的有机胺化合物，优选含有伯胺化合物。伯胺化合物包括天然氨基酸、合成氨基酸，例如，作为α-氨基酸，可举出缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、胱氨酸、赖氨酸、鸟氨酸，另外，可举出天然氨基酸中的羧基被氢、羟基或羟甲基取代的物质，例如，2-氨基乙醇等氨基醇等。
其中，第2培养步骤中的生产用培养基中含有的胺化合物的种类，可根据目标三异戊二烯基酚化合物的种类适当选择。
例如，在得到具有血栓溶解促进作用的活性型三异戊二烯基酚化合物时，可使用含有D-赖氨酸、D-苯丙氨酸、D-亮氨酸、D-色氨酸、D-鸟氨酸等氨基酸的生产用培养基。
具体而言，通过SMTP-3D使用含有D-丝氨酸，SMTP-4D使用含有D-苯丙氨酸、SMTP-5D使用含有D-亮氨酸、SMTP-6D使用含有D-色氨酸、SMTP-7D使用含有D-鸟氨酸、SMTP-8D使用含有D-赖氨酸、SMTP-3使用含有L-丝氨酸、SMTP-4使用含有L-苯丙氨酸、SMTP-5使用含有L-亮氨酸、SMTP-6使用含有L-色氨酸、SMTP-7使用含有L-鸟氨酸、SMTP-8使用含有L-赖氨酸、SMTP-9L使用含有L-胱氨酸、SMTP-10L使用含有L-异亮氨酸、SMTP-11L使用含有L-缬氨酸的各生产用培养基，可选择性地生产目标三异戊二烯基酚化合物(参照图1)。
第2培养步骤中的生产用培养基中的氨基酸含量，理想的是，相对于生产培养基的容量，为按质量计0.03％～0.3％。
另外，作为本制造方法中的无机胺化合物，可以举出作为无机盐类被包含的硝酸、无机伯胺化合物等。关于无机伯胺化合物，在下文说明。
在限制性培养基和生产用培养基中，除了上述成分以外，以促进利用微生物的化合物的生成等为目的，还含有上述微生物的培养中通常使用的合成培养基的添加成分。作为本限制性培养基中可添加的添加成分，可举出营养源例如，葡萄糖、蔗糖、糊精、动物油、植物油等，维生素类，无机盐类例如可生成氯、硝酸、硫酸、磷酸、钠、钾、钙、镁、钴及其它离子的无机盐类。
在无机盐类中，尤其是可生成金属离子的无机盐类，从生成物的生产量的增加和生产效率的角度，优选地可添加到限制性培养基中。作为这样的金属离子，可举出镁离子、钴离子、铁离子、钙离子、钾离子、钠离子等。
这些金属离子的添加量为，从生成物的生产量和菌的生长的角度，相对于培养基的总容量可以分别为：在镁离子的情况下，作为硫酸镁7水合物，是按质量计0.001％～0.5％(更优选为按质量计0.01％～0.1％)；在钴离子的情况下，作为氯化钴6水合物，是按质量计0.00001％～0.01％(更优选为按质量计0.0001％～0.005％)；在铁离子的情况下，作为硫酸铁(II)7水合物，是按质量计0.0001％～0.1％(更优选为按质量计0.0005％～0.05％)；在钙离子的情况下，作为氯化钙2水合物，是按质量计0.00001％～0.1％(更优选为按质量计0.0001％～0.05％)；在钾离子的情况下，作为磷酸氢二钾或硝酸钾，是按质量计0.002％～2％(更优选为按质量计0.05％～0.5％)；在钠离子的情况下，作为磷酸氢二钠或硝酸钠，是按质量计0.002％～2％(更优选为按质量计0.05％～0.5％)。
上述无机盐类和金属离子可被单独使用，也可2种以上组合使用。
为高效得到作为目标的三异戊二烯基酚化合物，利用限制性培养基的第1培养步骤一直持续到得到充分量的中间体化合物的培养中期。从有效制造三异戊二烯基酚化合物的角度而言，利用生产用培养基的第2培养步骤，优选在霉菌的培养开始后2天以后，更优选为从培养开始后4天起实施。
第2培养步骤通过在生成的三异戊二烯基酚化合物的量为最大时停止培养而终止。第2培养步骤的期间因微生物的状态和培养体系的大小而不同，一般为1天～5天，从生产量的角度，优选为1～3天。
另外，在本发明的制造方法中，可使第1培养步骤中使用的限制性培养基含有按质量计0.5％以下的有机胺化合物，第2培养步骤中使用的生产用培养基含有无机伯胺化合物(本说明书下文中，称为“本发明的第二制造方法”)。
这样，可以不破坏限制性培养基中的霉菌的化合物生成能，得到含有与生产用培养基中含有的无机伯胺化合物对应的仲胺的下述式(I)表示的旋光度(-)的化合物。式中，X为-CHY-C(CH3)2Z，Y和Z各自为-H或-OH，或一起形成单键。
[化学式7]
在本发明的第二制造方法中，限制性培养基含有按质量计0.5％以下的有机胺化合物。这里的有机胺化合物，可举出与第一制造方法有关的上述化合物同样的化合物，优选地，可举出来自天然的胺化合物成分。这样，就可在不破坏霉菌的生成能的情况下，得到中间体化合物。限制性培养基中的有机胺化合物的含量相对于限制性培养基的总容量为按质量计0.5％以下，从菌的生长、生产量和生产的选择性的角度，优选为按质量计0.01～0.5％，更优选为按质量计0.1％～0.3％。当含有超过按质量计0.5％的有机胺化合物时，存在同时生成与上述式(I)的化合物对应的中间体化合物以外的化合物、选择性差、生产效率也降低的情况，不是优选的。
另外，本制造方法的限制性培养基，也可以含有无机胺化合物。该无机胺化合物除了作为无机盐类含有的硝酸以外，也可以是其它无机胺，从所得三异戊二烯基酚化合物的结构的角度，优选含有无机伯胺化合物。限制性培养基中可能含有的无机胺化合物的含量因目标三异戊二烯基酚化合物的种类和含量而不同，但从菌的生长、生产量和生产的选择性的角度，相对于限制性培养基的容量，优选为按质量计1％以下，从生产率的角度，更优选为按质量计0.5％以下，进一步优选为按质量计0.3％以下。
在本发明的第二制造方法中，生产用培养基含有无机伯胺化合物。这样，可高效得到上述式(I)的化合物。
作为限制性培养基和生产性培养基中所含的无机伯胺化合物，例如，可举出氯化铵、乙酸铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐。其中，从生成物的生产量的角度，优选为氯化铵。
第2培养步骤中的生产用培养基中可能含有的无机胺化合物，只要以用于得到作为目标的三异戊二烯基酚化合物的必要量在培养基中存在即可，用量为相对于培养基的总容量为按质量计5％以下，从生产量的角度优选为按质量计0.01％～1％，更优选为按质量计0.1％～0.5％。
关于本发明的第二制造方法中的限制性培养基和生产用培养基，与本发明的第一制造方法同样，从霉菌的生长和被生产化合物的生产量的角度，优选含有无机盐类。关于可能含有的无机盐类和金属离子，可直接适用前述内容。
本发明的第一和第二制造方法中的第1和第2培养步骤，通常使用上述培养基进行静置培养或振荡培养。在适用振荡培养时，可在通常适用于真菌培养的速度下进行，例如，当为高崎科学社制TB-25S(振幅70mm)的旋转振荡器，在500ml容积的烧瓶中，形成100ml的培养基量时，采用30rpm～240rpm，优选为160rpm～200rpm。
另外，第1和第2培养步骤中的培养温度，可根据各种温度下的真菌的生长条件适当设定，一般为4～50℃，优选为15～37℃，更优选为20～30℃，最优选为室温(25℃)。当在该范围外时，不能高效生成三异戊二烯基酚化合物。并且各个使用的培养基的pH值一般可以为3～9，优选为5～6。
另外，在第1和第2培养步骤之前，为稳定利用微生物的生成能，还可设置预培养步骤。预培养步骤中使用的培养基，可以是为维持微生物而使用的通常的生长培养基。
所得的三异戊二烯基酚化合物，可通过由培养物回收-精制得到。作为回收-精制方法，只要是可回收-精制释放到培养基中的三异戊二烯基酚化合物的方法，任一方法均可，可举出液相色谱法、溶剂提取、结晶等。从回收效率的角度，生成物的回收-精制优选以2步骤以上的多步骤进行。
在这些回收-精制方法中，优选利用三异戊二烯基酚为脂溶性来选择溶剂等。
在将三异戊二烯基酚化合物从培养物回收-精制时，优选预先由培养物中除去菌体。此时，可以向培养物中添加甲醇等溶剂，提取菌体内的三异戊二烯基酚化合物，在此后的菌体除去中，采用过滤等技术。
下面说明本发明的第一三异戊二烯基酚化合物，即，母体三异戊二烯基酚化合物。
如上所述，下述式(I)表示的母体三异戊二烯基酚化合物(式(I)中，X为-CHY-C(CH3)2Z，Y和Z分别为-H或-OH，或一起形成单键)，由于与具有血栓溶解促进等生理活性的活性型三异戊二烯基酚化合物有同样的光学活性和绝对构型，因此，通过将化合物中的1位取代基适当改变为其它取代基，就可容易地得到多样的三异戊二烯基酚化合物。这是因为在1位形成仲胺，可用生理活性取代基改性1位的仲胺。这样，就可以衍生出具有血栓溶解促进等生理活性的活性型三异戊二烯基酚化合物。此时，可以根据目标活性从已知取代基中适当选择改性所用的生理活性取代基。
另外，由于三异戊二烯基酚化合物具有抗癌作用和肾障碍治疗作用，以及如后所述具有血栓溶解促进作用等，另外，其具有适应这些目的的体内动态和吸收特性，因此，在这样的三异戊二烯基酚化合物的衍生物的合成中，可以利用本发明的母体三异戊二烯基酚化合物。
[化学式8]
已知，一般在生理活性物质中，即使平面结构相同，因光学活性等，性质也会有很大差异。在上述三异戊二烯基酚化合物中，具有8(R)、9(R)的绝对构型、显示(+)旋光度的化合物，与8(S)、9(S)的显示(-)旋光度的化合物也表现出不同的作用。本发明的三异戊二烯基酚化合物是8(S)、9(S)、显示(-)旋光度，对高效得到在生物体中具有有效的生理活性的活性型三异戊二烯基酚化合物是有用的。
在此，关于8位和9位的绝对构型和旋光度，可以采用用于确认化合物的立体结构而在本领域通常使用的公知方法进行确认，例如C-NMR、H-NMR、质量分析、IR、X射线结晶结构分析、比旋光度等。
从生理活性的角度，特别优选为，Y和Z分别一起形成单键的下述式(I-A)表示的旋光度(-)的三异戊二烯基酚化合物。
[化学式9]
本发明的第一三异戊二烯基酚化合物，可由化学合成和使用微生物的制造方法得到，但由于采用本发明第二制造方法可以高效得到本发明化合物，所以其特别优选。
<第二三异戊二烯基酚化合物>
本发明的第二三异戊二烯基酚化合物，是下述通式(II)表示的化合物。
本第二三异戊二烯基酚化合物，是除了三异戊二烯基酚骨架以外，具有下述预定取代基的芳基与1位的氮原子直接结合的单体并且为低分子量的化合物，即使在低浓度下，也可显示出高的纤维蛋白溶酶原活化促进作用。
[化学式10]
式中R1表示具有选自羧基、羟基、磺酸基和仲氨基的至少1种作为取代基或作为取代基的一部分的芳基，或含有仲氨基并且还可以含有氮的芳基。即，本化合物的三异戊二烯基酚骨架中的氮原子与芳基直接连接。当芳基存在多个取代基时，它们可以彼此相同，也可以不相同。这样的取代基，从吸收性的角度，优选为取代基整体分子量为200以下的芳基，更优选为160以下，特别优选为140以下。另外，芳基的取代基的位置，可以是相对于三异戊二烯基酚骨架的氮原子的对位、间位、邻位中的任一种。
本化合物中的芳基，只要是具有选自羧基、羟基、磺酸基和仲氨基的至少1种作为取代基或作为取代基的一部分，或含有仲氨基并且还可以含有氮的芳基即可，还可以具有其它取代基作为追加的取代基。作为这样的追加的取代基，可举出低碳烷基，例如碳原子数为1～5的烷基。
从血栓溶解作用的角度，芳基优选为下述通式(II-1)表示的芳基。下述通式(II-1)中，R2和R3分别表示氢原子、羧基、羟基或磺酸基、或互相结合含有仲氨基的环状结构基，它们不同时为氢原子。
[化学式11]
从血栓溶解作用的角度而言，这样的芳基更优选选自下述的基团。
[化学式12]
这样的芳基，如下文所述，可由选自氨基苯酚、氨基苯甲酸、腺嘌呤、腺苷、氨基二氢2，3-二氮杂萘二酮、氨基萘酚磺酸、磺胺酸及其衍生物的胺加入化合物衍生。
并且，式中X为-CHY-C(CH3)2Z，Y和Z各自为-H或-OH，或一起形成单键。从生理活性的角度，优选为Y和Z分别一起形成单键。
这样的第二三异戊二烯基酚化合物可以列举下述化合物。
[化学式13]
[化学式14]
[化学式15]
[化学式16]
[化学式17]
[化学式18]
上述本发明的第二三异戊二烯基酚化合物，可通过化学合成制造，但使用霉菌可以高效制造。
即，制造本发明的第二三异戊二烯基酚化合物的制造方法是下述方法：其包括在含有胺加入化合物的培养液中培养霉菌的培养步骤；和从培养步骤后的培养物中分离上述三异戊二烯基酚化合物的分离步骤。
在本制造方法中，霉菌将培养液中的氨基苯酚、氨基苯甲酸、腺嘌呤、腺苷、氨基二氢2，3-二氮杂萘二酮、氨基萘酚磺酸、磺胺酸或作为其衍生物的胺加入化合物，作为与三异戊二烯基酚骨架直接连接的芳基引入。这样，就可以高效得到第二三异戊二烯基酚化合物。
用于得到本发明的三异戊二烯基酚化合物使用的霉菌，选择葡萄穗霉属的霉菌。特别优选的生产菌为球状小孢葡萄穗霉(スタキボトリス·ミクロスポラ：Stachybotrys microspora)等，更优选为球状小孢葡萄穗霉(スタキボトリス·ミクロスポラ：S.microspora)IFO30018菌株，但本发明并不限于该菌。
在本制造方法中，与本制造方法相关的胺加入化合物，可以在霉菌培养步骤中存在，也可以从培养初期就存在，从生产效率角度，优选在培养中期添加。
在培养中期添加胺加入化合物时，优选上述霉菌的培养步骤包括：利用胺化合物的含量在按质量计0.5％以下的限制性培养基的第1培养步骤，和培养中期以后的、利用含有胺加入化合物的生产用培养基的第2培养步骤。
由于第1培养步骤中使用的培养基使用胺化合物的含量限制在按质量计0.5％的限制性培养基，因此，在转向第2培养步骤的培养中期以后，可得到比以前的量大的中间体化合物。并且，这样大量生成中间体化合物以后，通过施行用于得到第二三异戊二烯基酚化合物的利用含有胺加入化合物的生产用培养基的第2培养步骤，可高效且选择性良好地得到目标第二三异戊二烯基酚化合物。另外，本说明书中的“胺化合物”，如无特别声明，也包括胺加入化合物。
用于制造第二三异戊二烯基酚化合物的制造方法，除了胺加入化合物的种类以外，与上述本发明的三异戊二烯基酚化合物的制造方法中的第一制造方法所述同样，可直接适用上述说明。
作为胺加入化合物，除了羧基、羟基、磺酸基和仲氨基之外，也可具有其它取代基，也可具有低碳烷基，例如碳原子数1～5的烷基。另外，胺加入化合物也可具有多个氨基，从制造效率的角度，优选为具有1个氨基。
这样的可添加胺化合物，从血栓溶解促进作用的角度，优选为同时具有羧基和羟基的一元胺化合物。
作为胺加入化合物，可举出氨基苯酚、氨基苯甲酸、腺嘌呤、腺苷、氨基二氢2，3-二氮杂萘二酮、氨基萘酚磺酸、磺胺酸及其衍生物。作为这样的胺加入化合物，例如，可举出氨基苯酚、甲基氨基苯酚、氨基苯甲酸、氨基水杨酸、氨基羟基苯甲酸、羟基邻氨基苯甲酸(ヒドロキシアントラニル酸)、腺嘌呤、腺苷、氨基二氢2，3-二氮杂萘二酮、氨基萘酚磺酸、磺胺酸，例如，可举出对氨基苯甲酸、3-氨基水杨酸、邻氨基苯甲酸、4-氨基-3-羟基苯甲酸、3-羟基-2-氨基苯甲酸、5-羟基-2-氨基苯甲酸、4-氨基水杨酸、5-氨基水杨酸、3-氨基-4-羟基苯甲酸、4-氨基-3-甲基水杨酸、腺嘌呤、腺苷、5-氨基-2，3-二氢-1，4-二酮2，3-二氮杂萘(5-アミノ-2，3-ジヒドロ-1，4-フタラジンジオン，5-Amino-2，3-dihydro-1，4-phthalazinedione)、1-氨基-2-萘酚-4-磺酸、对氨基苯磺酸及其衍生物等。这些胺加入化合物，可使用1种或多种组合使用。
其中，从血栓溶解促进作用的角度，优选对氨基苯甲酸、邻氨基苯甲酸、3-氨基水杨酸、4-氨基-3-羟基苯甲酸、3-羟基-2-氨基苯甲酸、5-羟基-2-氨基苯甲酸、3-氨基-4-羟基苯甲酸、4-氨基水杨酸、5-氨基-2，3-二氢-1，4-二酮2，3-二氮杂萘、1-氨基-2-萘酚-4-磺酸。
第2培养步骤中的生产用培养基中可能含有的胺加入化合物，只要以用于得到作为目标的三异戊二烯基酚化合物的必要量在培养基中存在即可，用量为相对于培养基的总容量为按质量计5％以下，从生产量的角度，优选使用按质量计0.01％～按质量计1％，更优选为按质量计0.1％～按质量计0.5％。
<第三三异戊二烯基酚化合物>
本发明的第三三异戊二烯基酚化合物，是下述通式(III)表示的三异戊二烯基酚化合物。
该第三三异戊二烯基酚化合物，是在三异戊二烯基酚骨架上，使来自α-芳族氨基酸的取代基与1位的氮原子直接结合。为此，第二三异戊二烯基酚化合物，在该1位的氮原子和芳环之间，仅插入1个或2个甲基。其结果是，第二三异戊二烯基酚化合物为单体，且为低分子量化合物，即使在低浓度下，也可以显示出高纤维蛋白溶酶原活化促进作用。
[化学式19]
式中R4表示下述通式(III-1)所示的芳族氨基酸残基(但在本发明的一些实施方式中，酪氨酸残基和苯丙氨酸残基除外)，下述通式(III-1)中的R5表示可有可无的羟基，n表示0或1的整数。
[化学式20]
本化合物中的芳族氨基酸残基，从吸收性的角度，优选取代基整体分子量在200以下，更优选为160以下，特别优选为140以下。本芳族氨基酸残基，还可以具有α位的羧基以外的其它取代基作为追加的取代基。这样的追加的取代基可举出羟基、羧基，和例如碳原子数为1～5的烷基。另外，与芳族氨基酸残基中的芳环连接的取代基的位置，可以是对位、间位、邻位中的任一种。
从血栓溶解作用的角度，这样的芳族氨基酸残基优选为苯基甘氨酸、酪氨酸或它们的衍生物。另外，在酪氨酸残基的情况下，连接于芳环的羟基、羧基、低碳烷基等的位置，可以是对位、间位、邻位中的任一种。在这样的芳族氨基酸残基中，更优选下面列举的残基。
[化学式21]
这样的芳香族氨基酸残基，如下文所述，可由选自苯基甘氨酸、酪氨酸和它们的衍生物的胺加入化合物衍生。
另外，式中X为-CHY-C(CH3)2Z，Y和Z各自为-H或-OH，或一起形成单键。从生理活性的角度，优选为Y和Z分别一起形成单键。
这样的第三三异戊二烯基酚化合物可列举出下述化合物。
[化学式22]
[化学式23]
[化学式24]
上述本发明的第三三异戊二烯基酚化合物，可通过化学合成制造，但使用霉菌可高效制造。
即，制造本发明的第三三异戊二烯基酚化合物的制造方法是下述制造方法：其包括在含有胺加入化合物的培养液中培养霉菌的培养步骤；和从培养步骤后的培养物中分离上述三异戊二烯基酚化合物的分离步骤。
在本制造方法中，霉菌将培养液中的芳族氨基酸或为其衍生物的胺加入化合物，作为与三异戊二烯基酚骨架中的氮原子直接连接的α-芳族氨基酸残基引入。这样，就可以高效得到第三三异戊二烯基酚化合物。
作为用于得到本发明的第三三异戊二烯基酚化合物而使用的霉菌，与上述制造方法同样，选择葡萄穗霉属的霉菌。特别优选的生产菌为球状小孢葡萄穗霉(スタキボトリス·ミクロスポラ：Stachybotrys microspora)等，更优选为球状小孢葡萄穗霉(スタキボトリス·ミクロスポラ：S.microspora)IFO30018菌株，但本发明并不限于该菌。
在第三三异戊二烯基酚化合物的制造方法中，芳族氨基酸和为其衍生物的胺加入化合物，只要在霉菌培养步骤中存在即可，也可从培养初期就存在，从生产效率的角度，优选在培养中期添加。
在培养中期添加胺加入化合物时，上述霉菌的培养步骤优选包括：利用胺化合物的含量在按质量计0.5％以下的限制性培养基的第1培养步骤，和培养中期以后的、利用含有胺加入化合物的生产用培养基的第2培养步骤。
由于第1培养步骤中使用的培养基使用胺化合物的含量限制在按质量计0.5％的限制性培养基，因此，在转向第2培养步骤的培养中期以后，可得到比以前的量多的中间体化合物。并且这样大量生成中间体以后，通过施行用于得到第三三异戊二烯基酚化合物的利用含有胺加入化合物的生产用培养基的第2培养步骤，可高效且选择性良好地得到目标第三三异戊二烯基酚化合物。
另外，本说明书中的“胺化合物”，如无特别声明，也包括胺加入化合物。
用于制造第三三异戊二烯基酚化合物的制造方法，除了胺加入化合物的种类以外，与上述本发明的三异戊二烯基酚化合物的制造方法中的第一制造方法所述同样，可直接适用上述说明。
作为胺加入化合物，除了氨基、羧基之外，也可具有其它取代基，也可具有羟基，和例如碳原子数为1～5的低碳烷基。另外，胺加入化合物中也可具有多个氨基，从制造效率的角度，优选为具有1个氨基。
作为胺加入化合物，可举出苯基甘氨酸、羟基苯基甘氨酸、酪氨酸及其衍生物。这样的胺加入化合物，例如，可举出L-苯基甘氨酸、D-苯基甘氨酸、L-羟基苯基甘氨酸、D-羟基苯基甘氨酸、L-酪氨酸、D-酪氨酸、L-羟甲基苯基甘氨酸、D-羟甲基苯基甘氨酸、L-羟乙基苯基甘氨酸、D-羟乙基苯基甘氨酸、L-羧苯基甘氨酸、D-羧苯基甘氨酸、L-羧甲基苯基甘氨酸、D-羧甲基苯基甘氨酸、L-羧乙基苯基甘氨酸、D-羧乙基苯基甘氨酸、L-甲基酪氨酸、D-甲基酪氨酸、L-乙基酪氨酸、D-乙基酪氨酸、L-羧苯基丙氨酸、D-羧苯基丙氨酸、L-羧甲基苯基丙氨酸、D-羧甲基苯基丙氨酸、L-羧乙基苯基丙氨酸、D-羧乙基苯基丙氨酸等。作为具体示例，例如，可举出L-苯基甘氨酸、D-苯基甘氨酸、L-3-羟基苯基甘氨酸、D-3-羟基苯基甘氨酸、L-4-羟基苯基甘氨酸、D-4-羟基苯基甘氨酸、L-对-酪氨酸、D-对-酪氨酸、L-2-羟基苯基甘氨酸、D-2-羟基苯基甘氨酸、L(或D)-2(或3、4)-羟基-3(或2、4、5、6)-甲基(或乙基)-苯基甘氨酸、L(或D)-2(或3、4)-羧基-苯基甘氨酸、L(或D)-2(或3、4)-羧基-3(或2、3、4、5、6)-甲基(或乙基)-苯基甘氨酸、L(或D)-邻-酪氨酸、L(或D)-间-酪氨酸、L(或D)-2(或3、4、5、6)-甲基(或乙基)-对(或邻、间)-酪氨酸、L(或D)-2(或3、4)-羧苯基丙氨酸、L(或D)-2(或3、4)-羧基-3(或2、4、5、6)-甲基(或乙基)苯基丙氨酸及其衍生物等。这些胺加入化合物，可使用1种或多种组合使用。
其中，从血栓溶解促进作用的角度，优选为L-苯基甘氨酸、D-苯基甘氨酸、L-3-羟基苯基甘氨酸、D-3-羟基苯基甘氨酸、L-对-酪氨酸。
第2培养步骤中的生产用培养基中可含有的胺加入化合物，只要以用于得到作为目标的三异戊二烯基酚化合物的必要量在培养基中存在即可，用量为相对于培养基的总容量为按质量计5％以下，从生产量的角度，优选为按质量计0.01％～按质量计1％，更优选为按质量计0.1％～按质量计0.5％。
<血栓溶解促进剂>
本发明的血栓溶解促进剂，其特征在于，含有上述第二和第三三异戊二烯基酚化合物中的至少一种作为有效成分。
上述第二和第三三异戊二烯基酚化合物，为低分子量并且具有有效的血栓溶解促进作用。
上述三异戊二烯基酚化合物，在本血栓溶解剂中，可以以游离形式、药学上可容许的盐或酯等作为医药所通常可适用形式包含在本血栓溶解剂中。
另外，本血栓溶解剂，可根据各种给药形式改变为适当剂型。作为口服给药形式，可列举出片剂、胶囊、散剂、细粒剂、颗粒剂、液体制剂或糖浆等；作为非口服给药形式，可列举出注射剂、点滴剂、栓剂、吸入剂、贴剂等。
为维持这些形式，可以含有可用于这些用途的公知的溶剂、赋形剂等添加剂。
本发明的血栓溶解剂，可根据年龄、体重、症状，以适当给药量施用，例如，在静脉内给药时，成人每1天的有效成分量优选为施用1～25mg/kg；在口服给药时，成人每1天的有效成分量优选为施用2～200mg/kg，给药期间可根据年龄、症状任意决定。
实施例
下面说明本发明的实施例，但本发明并不限定于此。另外，实施例中的“％”，如无特别声明，为质量/容量基准。
[实施例1]
将球状小孢葡萄穗霉IFO30018菌株的孢子在加入了菌种培养用培养基100ml的500ml容量的锥形瓶中接种，使用旋转振荡器，在180rpm、25℃下，进行为期4天的菌种培养(種培養)。菌种培养用培养基使用这样的培养基：将葡萄糖(4％)、大豆粕(0.5％)、干燥肉汤(0.3％)、粉末酵母提取物(0.3％)溶于水，使用HCl调节到pH5.8，添加消泡剂CB442(0.01％)(日本油脂化学，日本)，每次100ml分配到培养器中后，进行高压灭菌(121℃，15min)。
将该培养液5ml，在加入了主培养培养基(本培養培地)100ml的500ml容量的锥形瓶中接种，使用旋转振荡器，在180rpm、25℃下，进行为期4天的主培养。主培养用培养基(本培養用培地)(限制性培养基)使用这样的培养基：将蔗糖(5％)、粉末酵母提取物(0.1％)、NaNO3(0.3％)、K2HPO4(0.1％)、MgSO4·7H2O(0.05％)、KCl(0.05％)、CoCl2·6H2O(0.00025％)、FeSO4·7H2O(0.0015％)、CaCl2·2H2O(0.00065％)溶于水，使用HCl调节到pH5.8，添加消泡剂CB442(0.01％)(日本油脂化学，日本)，每此100ml分配到培养器中后，进行高压灭菌(121℃，15min)。
以接种当日为培养第0日，在培养第4日(96小时后)，将100mg的氯化铵添加到培养基(生产用培养基)中继续培养。在培养第5天，添加甲醇200ml，结束培养。然后，使用旋转振荡器，在180rpm、25℃下，振荡约3小时后进行提取。
[实施例2]
从实施例1的培养提取液300ml中，使用瓷漏斗(布氏漏斗)除去菌体，得到培养上清。在利用水流泵的减压下，使用旋转蒸发器进行浓缩。在残量约为50ml时，停止浓缩。用等量的乙酸乙酯提取3次，用无水硫酸钠脱水后，过滤、浓缩、干燥固化。将干燥固化物溶解在约3ml的MeOH中后进行过滤。
再将其在3000rpm下离心10分钟。在用HPLC进行制备前，将该上清用Lichrolut(注册商标)RP-18(100mg)(MERCK KGaA，Darmstadt，德国)进行预处理。反相HPLC的柱子为Inertsil PREP-ODS(直径30×250mm)(GL科学株式会社(ジ一エルサイエンス株式会社)，东京，日本)、温度为40℃、流速为25ml/min、检测波长为260nm、展开溶剂为含有50mM乙酸铵的75％甲醇，制备保留时间11.5分钟的峰(参照图2)。使用旋转蒸发器蒸馏除去甲醇后，用等量的乙酸乙酯提取3次，用无水硫酸钠脱水后，过滤、浓缩。将其溶解在甲醇中过滤、浓缩、干燥固化，得到精制物33.23mg。收率约为按质量计30％。
[实施例3]
研究实施例2所得白色固体化合物(称为SMTP-0)的物理化学性状。
另外，作为本实施例化合物的对照物，使用下述スタキボトリン(Stachybot n)B(旋光度(+))。Stachybotrin B的结构参照J.Org.Chem.，(1992)，Vol.57，第6700～6703页(但是，由于绝对立体结构未确定，下述结构为相对立体构型)。
[化学式25]
NMR使用Alpha 600(JEOL)，在1H 600MHz、13C 150MHz、50℃下测定。样品为约10mg/ml的DMSO-d6溶液。
MALDI-TOF-MS使用Voyager-DE STR(Applied Biosystem公司)，在正离子模式(positive ion mode)下，以α-氰基-4-羟基肉桂酸为基质测量。
UV使用320分光光度计(Hitachi，日立公司)。试样溶解在MeOH中(5μg/ml)。
FT-IR使用JIR-WINSPEC50(JEOL)。将溶解在MeOH中的试样750μg涂敷在岩盐上测量。
旋光度使用DIP-360(JASCO)(27℃，Na)。试样溶解在MeOH中(10mg/ml)。
结果示于图2和表1中。
实施例2得到的SMTP-0的物理化学性状如下所示。
外观：白色固体
分子式：C23H31NO4
MALDI-TOF-MS(M+H)+：386.2599
理论值：386.2331(C23H32NO4)
UV：λmax(ε)MeOH：
215(ε55,769)，251(ε10,615)，300(ε4,000)
IR光谱v(cm-1)：
3259.15，2917.81，1666.22，1612.22，1469.51，1359.59，1166.74，1081.88，850.46，773.32，723.18，674.97，566.98
比旋光度[α]D 27＝-2.23°(c 1.0，MeOH)
表1
这些结果表明，实施例2所得的SMTP-0，具有与Stachybotrin B(参照上述非专利文献1)同样的平面结构。但是，相对于SMTP-0具有(-)旋光度，Stachybotrin B的旋光度为(+)。这样，下述所示本实施例的SMTP-0明显具有与Stachybotrin B不同的立体结构。
[化学式26]
[实施例4]
为明确实施例3中已表明的SMTP-0和Stachybotrin B的立体结构的具体差异，采用改进モツシヤ一法(Mosher′s法)进行分析。
将SMTP-0(50mg，78μmol)溶解在乙腈(2ml)中，添加N，N-二异丙基乙基胺(50μl)和三甲基甲硅烷基重氮甲烷(2.0M，己烷溶液)(150μl)，在室温下搅拌24小时。通过将反应液浓缩，得到SMTP-0的甲基醚(SMTP-0-OMe)(44mg)。
将SMTP-0-OMe(20mg，50μmol)溶解在N，N-二甲基甲酰胺(1mL)中，添加R-(-)-α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯乙酰氯(25mg)、三乙胺(30μl)、4-二甲基氨基吡啶(2mg)，在室温下搅拌24小时。在反应液中加水(10mL)，用乙酸乙酯(50mL)提取。有机层用1N HCl、饱和碳酸氢钠水溶液、和饱和盐水洗净后，使用无水硫酸镁干燥，在减压下浓缩。将残留物用薄层色谱法(己烷-乙酸乙酯)精制，得到S-α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯基乙酰乙酸的SMTP-0-OMe 酯(S-MTPA-SMTP-0-OME)(18mg)。
通过使用S-(+)-α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯乙酰氯代替R-(-)-α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯乙酰氯，实施与上述同样的反应，由SMTP-0-OMe(20mg，50μmol)得到R-α-甲氧基-α-(三氟甲基)苯基乙酰乙酸的SMTP-OMe酯(R-MTPA-SMTP-0-OMe)(17mg)。
对由上述方法得到的R-MTPA-SMTP-0-OMe、S-MTPA-SMTP-0-OMe进行各种核磁共振光谱测定，判定各化合物的质子归属。结果示于表2。
S-MTPA-SMTP-0-OMe的化学位移δS和R-MTPA-SMTP-0-OME的化学位移δR之差(Δδ＝δS-δR)的计算结果为，7位的轴向位质子的Δδ呈负值(Δδ＝-0.12)，25位甲基质子的Δδ呈正值(Δδ＝+0.03)，因此，本发明的SMTP-0的绝对立体构型被确定为如上述实施例3所示的绝对立体构型(8位和9位的立体构型均为S)。
表2
SMTP-0-OMe、R-MTPA-SMTP-0-OMe、和S-MTPA-SMTP-0-OMe的NMR光谱归属
[实施例5]
对实施例2所得SMTP-0(50μM、100μM、200μM)的纤溶促进活性，以促进利用尿激酶催化剂的纤维蛋白溶酶原活化的活性，如下所述进行评价。
将30mM的SMTP溶液(DMSO溶液)用TBS/T(50mM Tris-HCl，100mM NaCl和0.01％Tween 80，pH7.4)稀释，配制1.5mM(以5％DMSO·TBS/T)溶液。将该溶液是将5％DMSO用TBS/T稀释，调制上述浓度的SMTP溶液。
(1)纤维蛋白溶酶原片段生成活性的测定
将SMTP溶液(60μl)与240μl的1.25倍浓度反应液(不含VLK-pNA(Val-Leu-Lys-对硝基苯胺：缬氨酰-亮氨酰-赖氨酰-对硝基苯胺))混合，在37℃下反应60分钟。然后，添加75μl的50％三氯乙酸(TCA)，停止反应，在冰上放置60分钟。将不溶于TCA的物质通过离心操作沉淀，将其用丙酮清洗2次。将所得沉淀干燥后，添加11μl的SDS样品缓冲液(0.125M Tris-Cl，pH6.8，4％SDS，20％甘油，0.02％溴酚蓝)溶解，使用其中的10μl，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(10％凝胶)。结果示于图3。
(2)纤维蛋白溶酶原活化的测定
将10μl的SMTP溶液(10μl)与40μl的1.25倍浓度反应液(0.0625μM的纤维蛋白溶酶原，62.5U/ml的尿激酶，0.125mM的VLK-pNA)在96孔微量培养板中混合，立刻用酶标仪监测405nm的吸收，测定随时间变化的VLK-pNA的加水水解。测量在37℃下，以2分钟的间隔进行60分钟。结果示于图4。
如图3和图4所示，其结果表明，在任一浓度下，都未显示促进纤维蛋白溶酶原活化的作用(参照图3)。另外，对于具有血管新生阻碍活性的纤维蛋白溶酶原片段的生成，也未显示出作用(参照图4)。
通过用D-色氨酸等氨基酸改性这样的SMTP-0的仲胺，可得到显示出强纤维蛋白溶酶原活化促进作用的活性型三异戊二烯基酚化合物。
在本实施例中，可提供能够容易地衍生出活化三异戊二烯基酚化合物的中间体三异戊二烯基酚化合物。
这样，可稳定地得到发酵法不能生产的形式的活化三异戊二烯基酚化合物。
[实施例6]
对胺化合物的添加时间如下所述进行了研究。
主培养用培养基(限制性培养基)使用下述物质：将蔗糖(5％)、NaNO3(0.3％)、K2HPO4(0.1％)、MgSO4·7H2O(0.05％)、KCl(0.05％)溶于水，使用HCl调节到pH5.8，添加消泡剂CB442(0.01％)(日本油脂化学，日本)，每次100ml分配到培养器中后，进行高压灭菌(121℃，15min)，与实施例1同样进行培养。
培养开始后，分别在24小时、48小时、72小时、96小时、120小时添加作为胺化合物的L-胱氨酸(0.3％)，然后培养24小时，测定生产量。在生产量的测定中，在培养液中添加2倍量的甲醇后，振荡1小时，提取SMTP化合物，在10,000rpm下离心，分离上清，使用该上清。将该上清的0.01ml提供给使用二氧化硅ODS柱的高效液相色谱，用含有50mM的乙酸铵的80％甲醇，以1ml/min的流速展开，监测260nm的吸光度。将与标准样品的保留时间一致的样品的峰面积与标准样品的峰面积比较，进行定量。
结果示于表3。
表3
如表3所示，不是在利用不含胺化合物的限制性培养基进行的培养开始后即刻，而是在一定期间后，进行利用含有氨基酸的生产用培养基的培养，由此增加SMTP-9的生产量。尤其是，不是在利用限制性培养基的培养开始后的培养初期，而是在72小时以后，即，在培养中期以后添加氨基酸时，会大幅度增加SMTP-9的生产量。
另外，作为比较性实施例，在培养初期(与培养同时～第4天以内)，通过在对胺化合物的量和种类没有限制的培养基中添加L-胱氨酸，得到SMTP-9(参照日本特开2002-65288号和日本特开2004-224737号)，与本实施例的制造方法比较，生产量最大为0.1mg/ml左右，为本方法的15％以下。并且，在该现有方法中，尤其是在培养开始后5天以后添加氨基酸或氨基醇，则生成物的生产就会剧减，但在本实施例下，即使5日后添加，也可以维持高生成量。
因此，本实施例的制造方法可以高效制造SMTP化合物。
[实施例7]
接着，对限制性培养基和生产用培养基中可添加的无机盐类如下进行了研究。
主培养用培养基(限制性培养基)以使用葡萄糖(2％)、NaNO3(0.3％)、K2HPO4(0.1％)、MgSO4·7H2O(0.05％)、KCl(0.05％)、FeSO4·7H2O(0.001％)溶于水，使用HCl调节到pH5.8，添加消泡剂CB442(0.01％)(日本油脂化学，日本)，每次100ml分配到培养器中后，进行高压灭菌(121℃，15min)的培养基(D培养基)为基本培养基，改变表4所述成分和浓度。使用该培养基，与实施例1同样进行培养。
培养开始后，在72小时时添加作为胺化合物的L-胱氨酸(0.1％)，然后培养48小时，按照实施例6所述方法测定生产量。
结果示于表4。
表4
[实施例8]
另外，对金属盐、碳源、硝酸钠、添加的胺(在下述实施例中为L-胱氨酸)的浓度的如下进行研究。
主培养用培养基(限制性培养基)以使用蔗糖(5％)、蛋白胨(0.1％)、NaNO3(0.3％)、K2HPO4(0.1％)、MgSO4·7H2O(0.05％)、KCl(0.05％)溶于水，使用HCl调节到pH5.8，添加消泡剂CB442(0.01％)(日本油脂化学，日本)，每次100ml分配到培养器中后，进行高压灭菌(121℃，15min)的培养基(F培养基)为基本培养基，改变表5所述成分和浓度。使用该培养基，与实施例1同样进行培养。
培养开始后，在72小时时添加作为胺化合物的L-胱氨酸(表5所述量)，然后培养24小时、48小时和72小时，按照实施例6所述方法测定生产量。
结果示于表5。
表5
由这些结果可知，通过使用含有作为碳源的蔗糖、作为氮源的酵母提取物和硝酸钠、作为无机盐类的磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、氯化钙、氯化钴的培养基，SMTP-9的生产量与日本特开2004-224737号记载的方法(在含有2％的葡萄糖、0.5％的蛋白胨、0.3％的酵母提取物、0.3％的K2HPO4、0.01％的MgSO4·7H2O、和L-胱氨酸100mg的培养基100ml中开始培养)比较，增加到10倍以上(从0.08mg/ml到1mg/ml以上)。另外，利用上述限制性培养基(F培养基)分别在培养24小时、48小时、72小时、96小时、120小时后，添加作为胺化合物的L-胱氨酸(0.5％)，然后培养48小时，测定生产量时，SMTP-9的生产量分别为0.55、0.70、0.92、1.21、1.15mg/ml。
为研究SMTP-9以外的化合物的生产，使用鸟氨酸1mg/ml，使用实施例1所用限制性培养基和生产用培养基培养SMTP-7(鸟氨酸的添加时期为培养第4天)，与作为比较性实施例的日本特开2002-65288号所述的使用含有基本培养基(将葡萄糖(2％)、蛋白胨0.5％、酵母提取物0.3％、K2HPO4(0.3％)、MgSO4·7H2O(0.01％)溶于水，使用HCl或NaOH调节到pH5.5的培养基)和鸟氨酸1mg/ml的培养基的培养进行生产量比较，其结果是，SMTP-7的生产量增加到约5倍(从0.3mg/ml到1.5mg/ml)。
由这些结果可知，为高效得到SMTP化合物，在利用限制性培养基的培养开始中期以后，进行利用含有胺化合物的生产用培养基的培养生成时，优选使预定的无机盐类包含在限制性培养基和生产用培养基中。
[实施例9]
化合物I-1的合成
将球状小孢葡萄穗霉(Stachybotrys microspora)IFO30018菌株(财团法人发酵研究所)的孢子在加入了菌种培养用培养基100ml的500ml容量的锥形瓶中接种，使用旋转振荡器，在180rpm、25℃下，进行为期4天的菌种培养。菌种培养用培养基使用下述培养基：将葡萄糖(4％)、大豆粕(0.5％)、干燥肉汤(0.3％)、粉末酵母提取物(0.3％)溶于水，使用HCl调节到pH5.8，添加消泡剂CB442(0.01％)(添加0.1g/ml丙酮溶液1ml/L)(日本油脂化学，日本)，每次100ml分配到培养器中后，进行高压灭菌(121℃，15min)。
将该培养液5ml，在加入了主培养培养基100ml的500ml容量的锥形瓶中接种，使用旋转振荡器，在180rpm、25℃下，进行为期5天的主培养。
主培养用培养基(限制性培养基)使用下述培养基：将蔗糖(5％)、粉末酵母提取物(0.1％)、NaNO3(0.3％)、K2HPO4(0.1％)、MgSO4·7H2O(0.05％)、KCl(0.05％)、CoCl2·6H2O(0.00025％)、FeSO4·7H2O(0.0015％)、CaCl2·2H2O(0.00065％)溶于水，使用HCl调节到pH5.8，添加消泡剂CB442(0.01％)(添加0.1g/ml丙酮溶液1ml/L)(日本油脂化学，日本)，每次100ml分配到培养器中后，进行高压灭菌(121℃，15min)。
以接种当日为培养第0日，在培养第4日(96小时后)，将100mg的对氨基苯酚添加到培养基中作为生产用培养基继续培养。在此后约24小时后，添加甲醇200ml，结束培养。然后，使用旋转振荡器，在180rpm、25℃下，经振荡约3小时后进行提取。
由所得培养提取液300ml中，使用瓷漏斗，除去菌体，得到培养上清。在利用水流泵的减压下，使用旋转蒸发器进行浓缩。在残余量约为100ml以下时，停止浓缩，用磷酸将pH调至2，在低温室中放置一夜。将生成的沉淀通过离心分离，将其溶解在丙酮中。将该丙酮悬浊液离心，分离上清，浓缩干燥固化，得到324.1mg的干燥固化物。向其中加入MeOH，配成100mg/ml的溶液后，在3000rpm下离心10分钟。在用HPLC进行制备前，将该上清用Lichrolut(注册商标)RP-18(100mg)(MERCK KGaA，Darmstadt，德国)进行预处理。反相HPLC在柱子为Inertsil PREP-ODS(直径30×250mm)(GL科学株式会社，东京，日本)、温度40℃、流速25ml/min、检测波长260nm、展开溶剂为含有50mM乙酸铵的80％甲醇下进行，制备保留时间16～17分钟的峰。使用旋转蒸发器蒸馏除去甲醇后，用等量的乙酸乙酯提取3次，用无水硫酸钠脱水后，过滤、浓缩。将浓缩物溶解在甲醇中过滤，浓缩、干燥固化，得到化合物I-1的精制物99.33mg。
化合物I-1的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS使用Voyager-DE STR(Applied Biosystem公司)，在正离子模式(positive ion mode)下，以α-氰基-4-羟基肉桂酸为基质测量。
UV在甲醇中使用320分光光度计(spectrophotometer，Hitachi)测量。
FT-IR使用JIR-WINSPEC50(JEOL)。将溶解在丙酮中的试样涂敷在岩盐上测量。
化合物I-1的物理化学性质如下所示。
分子式：C29H35NO5
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(found)(M+H)+：478.4473
理论值(caculated)：478.2593，C29H36NO5
UV：λmax nm(ε)214(sh)(84,000)，260(sh)(21,500)，291(30,000)
IR vmax(NaCl)cm-1 3855，3747，3309，2971，2919，2863，1664，1618，1513，1461，1373，1247，1168，1074，943，835，765，684
[实施例10]
化合物I-2的合成
与实施例9同样实施预培养。
除了在主培养第4天添加的有机胺化合物为对氨基苯甲酸以外，与实施例9同样实施主培养。
从所得培养提取液300ml中，使用瓷漏斗除去菌体，得到培养上清。在利用水流泵的减压下，使用旋转蒸发器进行浓缩。在残量约为100ml以下的时刻，停止浓缩，用磷酸将pH调节到2，在低温室放置一晚。生成的沉淀通过离心操作进行分离，将分离物溶解在丙酮中。将该丙酮悬浊液进行离心，分离上清，浓缩干燥固化，得到603.3mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，在3000rpm下离心10分钟。在用HPLC进行制备前，将该上清用Lichrolut RP-18(100mg)进行预处理。反相HPLC在柱子为Inertsil PREP-ODS(直径30×250mm)、温度40℃、流速25ml/min、检测波长260nm、展开溶剂为含有50mM乙酸铵的70％甲醇下进行，制备保留时间21～22分钟的峰。使用旋转蒸发器蒸馏除去甲醇后，用等量的乙酸乙酯提取3次，用无水硫酸钠脱水后，过滤、浓缩。将浓缩物溶解在甲醇中过滤、浓缩、干燥固化，得到化合物I-2的精制物52.44mg。
化合物I-2的特性如下所述确认。
MALDI-TOF-MS、UV和FT-IR与实施例9同样进行测定。NMR使用Alpha 600(JEOL)，在1H 600MHz、13C 150MHz、60℃下测定。样品为约10mg/ml的DMSO-d6溶液。
化合物I-2的物理化学性质如下所示。
分子式：C30H35NO6
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：506.2778
理论值：506.2543，C30H36NO6
UVλmax nm(ε)296(29,300)
IRvmax(NaCl)cm-13853，3739，3392，2969，2915，2858，1691，1610，1513，1463，1429，1365，1303，1267，1187，1076，939，848，779，676，551
NMR
[表6]
化学位移与DMSO-d6(δC 39.5ppm，δH 2.49ppm)相关。
偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例11]
化合物I-3的合成
与实施例10同样实施预培养。
将该培养液5ml，在加入了主培养培养基100ml的500ml容量的锥形瓶中接种，使用旋转振荡器，在180rpm、25℃下，进行为期6天的主培养。
主培养用培养基(限制性培养基)使用下述培养基：将蔗糖(5％)、粉末酵母提取物(0.1％)、KNO3(0.7％)、K2HPO4(1.5％)、MgSO4·7H2O(0.05％)、KCl(0.05％)、CoCl2·6H2O(0.00025％)、FeSO4·7H2O(0.0015％)、CaCl2·2H2O(0.00065％)溶于水，使用HCl调节到pH5.8，添加消泡剂CB442(0.01％)(添加0.1g/ml丙酮溶液1ml/L)(日本油脂化学，日本)，每次100ml分配到培养器中后，进行高压灭菌(121℃，15min)。
以接种当日为培养第0日，在培养第4日(96小时后)，将100mg的间氨基苯甲酸添加到培养基中作为生产用培养基，继续培养。然后，在约40小时后，添加甲醇200ml，结束培养。然后，使用旋转振荡器，在180rpm、25℃下，经振荡约2小时后进行提取。
与实施例10同样实行粗精制，得到223.1mg的干燥固化物。向其中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，与实施例10同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例10同样实施。作为展开溶剂，使用含有50mM乙酸铵的甲醇，使甲醇浓度从70％到90％，在30分钟内线性增加。制备保留时间17.5～18.5分钟的峰。所得组分与实施例10同样精制，得到化合物I-3的精制物40.36mg。
化合物I-3的特性如下所述确认。
MALDI-TOF-MS、UV和FT-IR与实施例10同样进行测定。NMR使用Alpha600(JEOL)，在1H 600MHz、13C 150MHz、25℃下测量。样品为约10mg/ml的丙酮-d6溶液。
化合物I-3的物理化学性质如下所示。
分子式：C30H35NO6
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：506.2573
理论值：506.2543，C30H36NO6
UVλmax nm(ε)217(46,786)，281(17,583)
IRvmax(NaCl)cm-13352，2970，2920，2858，2634，2540，1693，1616，1593，1462，1367，1290，1244，1155，1072
NMR
[表7]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例12]
化合物I-4的合成
与实施例10同样实施预培养。
除了在主培养第4天添加的有机胺化合物为邻氨基苯甲酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例10同样实行粗精制，得到120mg的干燥固化物。向其中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，与实施例10同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例10同样实施。作为展开溶剂，使用含有50mM乙酸铵的甲醇，使甲醇浓度从70％到90％，在40分钟期间线性增加。制备保留时间22.8～23.8分钟的峰。所得组分与实施例10同样精制，得到化合物I-4的精制物14.58mg。
化合物I-4的特性如下所述确认。
MALDI-TOF-MS、UV和FT-IR与实施例9同样进行测定。NMR在40℃下与实施例11同样测定。
化合物I-4的物理化学性质如下所示。
分子式：C30H35NO6
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：506.2573
理论值：506.2543C30H36NO6
UVλmax nm(ε)215(sh)(48,908)，260(13,440)，301(sh)(5,255)IR vmax(NaCl)cm-1 3398，2970，2920，2860，2630，2488，1707，1612，1466，1369，1240，1159，1078，1036
NMR
[表8]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例13]
化合物I-5的合成
与实施例10同样实施预培养。
除了在主培养第4天添加的有机胺化合物为4-氨基水杨酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例10同样实行粗精制，得到408mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成150mg/ml的溶液后，与实施例10同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例10同样实施。检测波长为290nm。展开溶剂使用含有50mM乙酸铵的70％甲醇，制备保留时间12.7～15分钟的峰。所得组分与实施例10同样精制，得到化合物I-5的精制物18.50mg。
化合物I-5的特性如下所述确认。
FAB-MS使用JEOL SX-102A，以甘油为基质，在正离子模式下测定。UV、FT-IR和NMR与实施例11同样进行测定。
化合物I-5的物理化学性质如下所示。
分子式：C30H35NO7
FAB-MS(m/z)
测定值(M+H)+：522
理论值：522.2492C30H36NO7
UVλmax nm(ε)212(sh)(47,641)，288(18,973)，306(18,243)
IR vmax(NaCl)cm-13396，2968，2922，2860，2553，1689，1622，1462，1362，1253，1218，1157，1074
NMR
[表9]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例14]
化合物I-6的合成
与实施例10同样实施预培养。
除了在主培养第4天添加的有机胺化合物为4-氨基-3-羟基苯甲酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例10同样实行粗精制，得到170mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，与实施例10同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例10同样实施。作为展开溶剂，使用含有50mM乙酸铵的甲醇，甲醇浓度从70％到100％，在40分钟期间线性增加。制备保留时间14.3～15.3分钟的峰。所得级分与实施例10同样精制，得到化合物I-6的精制物9.54mg。
化合物I-6的特性如下所述确认。
MALDI-TOF-MS、UV、FT-IR和NMR与实施例11同样进行测定。
化合物I-6的物理化学性质如下所示。
分子式：C30H35NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：522.2533
理论值：522.2492C30H36NO7
UV λmax nm(ε)206(66,823)，263(16,471)，297(13,865)
IR vmax(NaCl)cm-13388，2968，2922，2858，2578，1697，1614，1466，1371，1215，1076
NMR
[表10]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例15]
化合物I-7的合成
与实施例10同样实施预培养。
除了在主培养第4天添加的有机胺化合物为3-羟基-2-氨基苯甲酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例10同样实行粗精制，得到200mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，与实施例10同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例10同样实施。作为展开溶剂，使用含有50mM乙酸铵的甲醇，甲醇浓度从70％到80％，在10分钟期间线性增加后保持在80％10分钟。制备保留时间12.4～13.5分钟的峰。所得组分与实施例10同样精制，得到化合物I-7的精制物31.1mg。
化合物I-7的特性如下所述确认。
MALDI-TOF-MS、UV、FT-IR和NMR与实施例11同样进行测定。
化合物I-7的物理化学性质如下所示。
分子式：C30H35NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：522.2327
理论值：522.2492C30H36NO6
UVλmax nm(ε)213(57,753)，255(11,155)，290(7,714)
IR vmax(NaCl)cm-13356，2968，2920，2858，1697，1616，1470，1294，1159，1076，762
NMR
[表11]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例16]
化合物I-8的合成
与实施例10同样实施预培养。
除了在主培养第4天添加的有机胺化合物为3-氨基水杨酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例10同样实行粗精制，得到280mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，与实施例10同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例10同样实施。展开溶剂使用含有50mM乙酸铵的75％甲醇，制备保留时间16.0～18.6分钟的峰。所得组分与实施例10同样精制，得到化合物I-8的精制物23.29mg。
化合物I-8的特性如下所述确认。
MALDI-TOF-MS、UV、FT-IR和NMR与实施例11同样进行测定。
化合物I-8的物理化学性质如下所示。
分子式：C30H35NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：522.2537
理论值：2492C30H36NO7
UVλmax nm(ε)4(57,962)，256(10,633)，304(11,676)
IRvmax(NaCl)cm-1221，2850，2918，2976，1678，1616，1464，1240，1157，1074
NMR
[表12]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例17]
化合物I-9的合成
与实施例10同样实施预培养。
除了在主培养第4天添加的有机胺化合物为5-氨基水杨酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例10同样实行粗精制，得到502mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成200mg/ml的溶液后，与实施例10同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例10同样实施。作为展开溶剂，使用含有50mM乙酸铵的70％甲醇，制备保留时间22.0～25.5分钟的峰。所得组分与实施例10同样精制，得到化合物I-9的精制物66.34mg。
化合物I-9的特性如下所述确认。
MALDI-TOF-MS、UV、FT-IR和NMR与实施例11同样进行测定。
化合物I-9的物理化学性质如下所示。
分子式：C30H35NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：522.2505
理论值：522.2492C30H36NO7
UV λmax nm(ε)214(50,665)，259(sh)(9,591)，295(14,490)
IR vmax(NaCl)cm-13394，2970，2920，2858，1676，1618，1489，1464，1370，1203，1161，1076
NMR
[表13]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例18]
化合物I-10的合成
与实施例10同样进行预培养。
除了在主培养的第4天添加的有机胺化合物为3-氨基-4-羟基苯甲酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例10同样实行粗精制，得到420mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成150mg/ml的溶液后，与实施例10同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例10同样实施。作为展开溶剂，使用含有50mM乙酸铵的甲醇，甲醇浓度在65％下维持25分钟以后，从65％到100％，用5分钟线性增加后，维持在100％10分钟。制备保留时间28.7～32.5分钟的峰。所得组分与实施例10同样精制，得到化合物I-10的精制物78.94mg。
化合物I-10的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV、FT-IR和NMR与实施例11同样进行测定。
化合物I-10的物理化学性质如下所示。
分子式：C30H35NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：522.2550
理论值：522.2492C30H36NO7
UV：λmax nm(ε)215(52,124)，252(22,205)，308(sh)(6,255)
IR vmax(NaCl)cm-13803，3429，3068，2970，2924，2860，2549，2517，1691，1601，1464，1302，1076，1036
NMR
[表14]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例19]
化合物I-11的合成
与实施例10同样进行预培养。
除了在主培养的第4天添加的有机胺化合物为5-羟基-2-氨基苯甲酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例10同样实行粗精制，得到305mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，与实施例10同样实施预处理。反相HPLC除检测方法和展开条件以外，与实施例10同样实施。检测使用二极管阵列检测器，监测260～350nm。作为展开溶剂，使用含有0.1％(vol/vol)甲酸的80％甲醇，制备保留时间16.7～17.7分钟的峰。所得组分用旋转蒸发器浓缩，除去甲醇后，冷冻干燥。在干燥物中添加正己烷，搅拌后进行离心操作，回收不溶物。实施该操作3次，用甲醇溶解不溶物后过滤，将其浓缩干燥固化，得到化合物I-11的精制物43.37mg。
化合物I-11的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV、FT-IR和NMR与实施例11同样进行测定。
化合物I-11的物理化学性质如下所示。
分子式：C30H35NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：522.2516
理论值：522.2492C30H36NO7
UV：λmax nm(ε)214(66,614)，260(16,471)，297(sh)(9,695)
IR vmax(NaCl)cm-1 3373，3329，2970，2920，2860，1705，1660，1610，1504，1464，1338，1296，1219，1074，1032
NMR
[表15]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例20]
化合物I-16的合成
与实施例9同样进行预培养。
除了在主培养的第4天添加的有机胺化合物为腺嘌呤以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例9同样实行粗精制，得到123mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，与实施例9同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例9同样实施。作为展开溶剂，使用含有50mM乙酸铵的甲醇，甲醇浓度从70％到100％，用30分钟线性增加。制备保留时间17.5～18分钟的峰。所得组分与实施例9同样精制，得到化合物I-16的精制物1.66mg。
化合物I-16的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV与实施例9同样进行测定。
化合物I-16的物理化学性质如下所示。
分子式：C28H33N5O4
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：504.2665
理论值：504.2611C28H34N5O4
UV：λmax nm(ε)212(43,984)，258(9,260)，301(3,422)
[实施例21]
化合物I-17的合成
与实施例9同样进行预培养。
除了在主培养的第4天添加的有机胺化合物为5-氨基-2，3-二氢-1，4-二酮2，3-二氮杂萘以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例9同样实行粗精制，得到130mg的干燥固体。在固体中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，与实施例9同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例9同样实施。作为展开溶剂，使用含有50mM乙酸铵的75％甲醇，制备保留时间16.5～17.5分钟的峰。制备组分与实施例9同样精制，得到化合物I-17的精制物10.20mg。
化合物I-17的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV和FT-IR与实施例9同样进行测定。
化合物I-17的物理化学性质如下所示。
分子式：C31H35N3O6
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：546.2742
理论值：546.2604C31H36N3O6
UV：λmax nm(ε)208(85,822)，260(14,722)，306(11,668)
IR vmax(NaCl)cm-13408，3259，2968，2918，2858，1659，1605，1473，1333，1159，1076，1041
[实施例22]
化合物I-18的合成
与实施例9同样进行预培养。
除了在主培养的第4天添加的有机胺化合物为1-氨基-2-萘酚-4-磺酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例9同样实行粗精制，得到199mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，与实施例9同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例9同样实施。作为展开溶剂，使用含有50mM乙酸铵的甲醇，甲醇浓度从70％到100％，用30分钟线性增加。制备保留时间14.5～15.5分钟的峰。所得组分与实施例9同样精制，得到化合物I-18的精制物18.40mg。
化合物I-18的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV和FT-IR与实施例9同样进行测定。
化合物I-18的物理化学性质如下所示。
分子式：C33H37NO8S
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：608.2346
理论值：608.2318C33H38NO8S
UV：λmax nm(ε)217(63,880)，234(sh)(49,185)，260(12,144)，285(11,173)，296(11,051)，326(5,586)，338(60,72)
IR vmax(NaCl)cm-1 3452，3242，2968，2916，2856，2146，1670，1616，1464，1425，1358，1171，1051
[实施例23]
化合物I-19的合成
与实施例9同样进行预培养。
除了在主培养的第4天添加的有机胺化合物为对氨基苯磺酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例9同样实行粗精制，得到316mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，与实施例9同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例9同样实施。作为展开溶剂，使用含有50mM乙酸铵的甲醇，甲醇浓度从65％％到100％，用35分钟线性增加。制备保留时间18～18.5分钟的峰。所得组分与实施例19同样精制，得到化合物I-19的精制物12.33mg。
化合物I-19的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV、FT-IR和NMR与实施例12同样进行测定。
化合物I-19的物理化学性质如下所示。
分子式：C29H35NO7S
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：542.2233
理论值：542.2212C29H36NO7S
UV：λmax nm(ε)224(sh)(25,112)，286(19,484)
IR vmax(NaCl)cm-13188，3057，2972，2918，2856，1697，1606，1460，1367，1174，1132，1080，1036
NMR
[表16]
化学位移与二甲基-d6-亚砜(δC 39.5ppm[甲基碳原子]，δH2.49ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例24]
化合物I-20的合成
与实施例9同样进行预培养。
除了在主培养的第4天添加的有机胺化合物为L-苯基甘氨酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例9同样实行粗精制，得到270mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，与实施例9同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例9同样实施。作为展开溶剂，使用含有50mM乙酸铵的甲醇，甲醇浓度从75％到90％，用40分钟线性增加。制备保留时间15～18.5分钟的峰。所得组分与实施例9同样精制，得到化合物I-20的精制物37.85mg。
化合物I-20的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV、FT-IR和NMR与实施例11同样进行测定。
化合物I-20的物理化学性质如下所示。
分子式：C31H37NO6
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：520.2662
理论值：520.2699C31H38NO6
UV：λmax nm(ε)214(46,214)，259(11,112)，300(3,012)
IR vmax(NaCl)cm-13423，2968，2920，2864，1726，1660，1620，1464，1350，1205，1169，1074
NMR
[表17]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例25]
化合物I-21的合成
与实施例9同样进行预培养。
除了在主培养的第4天添加的有机胺化合物为D-苯基甘氨酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例9同样实行粗精制，得到150mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成75mg/ml的溶液后，与实施例9同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例9同样实施。作为展开溶剂，使用含有50mM乙酸铵的甲醇，甲醇浓度从70％到100％，用30分钟线性增加。制备保留时间19～20.5分钟的峰。所得组分与实施例9同样精制，得到化合物I-21的精制物17.59mg。
化合物I-21的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV、FT-IR和NMR与实施例11同样进行测定。
化合物I-21的物理化学性质如下所示。
分子式：C31H37NO6
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：520.2747
理论值：520.2699C31H38NO6
UV：λmax nm(ε)215(44,864)，259(11,008)，300(3,012)
IR vmax(NaCl)cm-13354，2968，2922，2862，1714，1664，1620，1466，1356，1207，1167，1074
NMR
[表18]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例26]
化合物I-22的合成
与实施例9同样进行预培养。
除了在主培养的第4天添加的有机胺化合物为L-4-羟基苯基甘氨酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例9同样实行粗精制，得到365mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成150mg/ml的溶液后，与实施例9同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例19同样实施。作为展开溶剂，使用0.1％(vol/vol)甲酸和甲醇，甲醇浓度从75％到90％，用30分钟线性增加。制备保留时间13～14分钟的峰。所得组分与实施例19同样精制，得到化合物I-22的精制物69.68mg。
化合物I-22的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV、FT-IR和NMR与实施例11同样进行测定。
化合物I-22的物理化学性质如下所示。
分子式：C31H37NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：536.2656
理论值：536.2648C31H38NO7
UV：λmax nm(ε)216(42,714)，262(11,026)，300(2,783)
IR vmax(NaCl)cm-13348，2974，2922，2856，1718，1660，1612，1514，1464，1365，1211，1173，1072
NMR
[表19]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例27]
化合物I-23的合成
与实施例9同样进行预培养。
除了在主培养的第4天添加的有机胺化合物为D-4-羟基苯基甘氨酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例9同样实行粗精制，得到510mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成200mg/ml的溶液后，与实施例9同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例19同样实施。作为展开溶剂，使用0.1％(vol/vol)甲酸和甲醇，甲醇浓度从75％到90％，用30分钟线性增加。制备保留时间13.5～15分钟的峰。所得组分与实施例19同样精制，得到化合物I-23的精制物150.39mg。
化合物I-23的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV、FT-IR和NMR与实施例11同样进行测定。
化合物I-23的物理化学性质如下所示。
分子式：C31H37NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：536.2671
理论值：536.2648C31H38NO7
UV：λmax nm(ε)215(52,563)，261(13,274)，300(5,353)
IR vmax(NaCl)cm-1 3325，2970，2922，2858，1711，1662，1612，1512，1464，1365，1217，1173，1074
NMR
[表20]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例28]
化合物I-24的合成和化合物I-25的合成
与实施例9同样进行预培养。
除了在主培养的第4天添加的有机胺化合物为50mg的DL-3-羟基苯基甘氨酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例9同样实行粗精制，得到230mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成70mg/ml的溶液后，与实施例9同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例19同样实施。作为展开溶剂，使用0.1％(vol/vol)甲酸和甲醇，甲醇浓度从75％到90％，用30分钟线性增加。制备保留时间16～17分钟的峰(化合物I-24)和保留时间17.5～19分钟的峰(化合物I-25)。所得各组分与实施例19同样精制，得到化合物I-24的精制物16.34mg，化合物I-25的精制物22.98mg。
化合物I-24的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV和FT-IR与实施例9同样进行测定
化合物I-24的物理化学性质如下所示。
分子式：C31H37NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：536.2716
理论值：536.2648C31H38NO7
UV：λmax nm(ε)215(47,531)，261(11,348)，299(3,212)
IR vmax(NaCl)cm-13294，2970，2926，2858，1703，1662，1605，1464，1367，1219，1161，1076
化合物I-25的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV、FT-IR和NMR与实施例11同样进行测定。
化合物I-25的物理化学性质如下所示。
分子式：C31H37NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：536.2723
理论值：536.2648C31H38NO7
UV：λmax nm(ε)215(57,915)，261(13,703)，300(3,747)
IR vmax(NaCl)cm-13309，2974，2924，2864，1707，1662，1603，1464，1365，1224，1163，1076
NMR
[表21]
化学位移与丙酮-d6(δC 29.8ppm[甲基碳原子]，δH 2.04ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例29]
化合物I-26的合成
与实施例9同样进行预培养。
除了在主培养的第4天添加的有机胺化合物为L-酪氨酸以外，与实施例11同样实施主培养。
与实施例9同样实行粗精制，得到310mg的干燥固体。向其中添加MeOH，形成100mg/ml的溶液后，与实施例9同样实施预处理。反相HPLC除展开条件以外，与实施例19同样实施。作为展开溶剂，使用0.1％甲酸和甲醇，甲醇浓度从70％到80％，用30分钟线性增加。制备保留时间21～23分钟的峰。所得组分与实施例19同样精制，得到化合物I-26的精制物53.94mg。
化合物I-26的特性如下所述进行确认。
MALDI-TOF-MS、UV和FT-IR与实施例9同样进行测定。
NMR使用Alpha 600(JEOL)，在1H 600MHz、13C 150MHz、40℃下测量。样品为约30mg/ml的DMSO-d6溶液。
化合物I-26的物理化学性质如下所示。
分子式：C32H39NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
测定值(M+H)+：550.4594
理论值：550.2805C32H40NO7
UV：λmax nm(ε)215(39,050)，261(8,690)，297(sh)(2,530)
IR vmax(NaCl)cm-13379，2922，2854，1707，1664，1514，1464，1363，1221，1167，1074
NMR
[表22]
化学位移与二甲基-d6-亚砜(δC 39.5ppm[甲基碳原子]，δH2.49ppm)相关。偶合常数(J)的单位为Hz。
[实施例30]
对如上所述得到的各种三异戊二烯基酚化合物，以促进利用尿激酶催化剂的纤维蛋白溶酶原(Plg)活化的活性，用如下所述性能评价血栓溶解活性。
另外，作为比较性实施例，使用オルニプラビン(SMTP-7)。各化合物如下所述。
[表23]
| 化合物编号 | 添加胺 | 备注 |
| I-1 | 对氨基苯酚 | SMTP-18 |
| I-2 | 对氨基苯甲酸 | SMTP-19 |
| I-3 | 间氨基苯甲酸 | SMTP-20 |
| I-4 | 邻氨基苯甲酸 | SMTP-21 |
| I-5 | 4-氨基水杨酸 | SMTP-22 |
| I-6 | 4-氨基-3-羟基苯甲酸 | SMTP-23 |
| I-7 | 3-羟基-2-氨基苯甲酸 | SMTP-24 |
| I-8 | 3-氨基水杨酸 | SMTP-25 |
| I-9 | 5-氨基水杨酸 | SMTP-26 |
| I-10 | 3-氨基-4-羟基苯甲酸 | SMTP-27 |
| I-11 | 5-羟基-2-氨基苯甲酸 | SMTP-28 |
| I-16 | 腺嘌呤 | SMTP-32 |
| I-17 | 5-氨基-2，3-二氢-1，4-二酮2，3-二氮杂萘 | SMTP-36 |
| I-18 | 1-氨基-2-萘酚-4-磺酸 | SMTP-37 |
| I-19 | 对氨基苯磺酸 | SMTP-42 |
| I-20 | L-苯基甘氨酸 | SMTP-43 |
| I-21 | D-苯基甘氨酸 | SMTP-43D |
| I-22 | L-4-羟基-苯基甘氨酸 | SMTP-44 |
| I-23 | D-4-羟基-苯基甘氨酸 | SMTP-44D |
| I-24 | DL-3-羟基-苯基甘氨酸 | SMTP-45-I |
| I-25 | DL-3-羟基-苯基甘氨酸 | SMTP-45-II |
| I-26 | L-酪氨酸 | SMTP-14 |
| オルニプラビン | 鸟氨酸 | 比较性实施例 |
| X-1 | 丝氨酸 | 比较性实施例 |
| X-2 | 苯丙氨酸甲酯 | 比较性实施例 |
[化学式27]
[化学式28]
[化学式29]
[化学式30]
[化学式31]
[化学式32]
利用纤维蛋白溶酶切断合成显色基质VLK-pNA(Val-Leu-Lys-对硝基苯胺)的肽键生成对硝基苯胺(p-ニトロアリニン)(pNA)，通过测定pNA在405nm吸收的黄色的显色，测量样品的纤维蛋白溶酶原活化促进活性。测量仪使用MTP-500型酶标仪(コロナ电气)，在96孔圆底微量培养板上测定。
测定条件为动态测定37℃，双波长405nm(活性)-595nm(背景)下，每1分钟测定60次。
精制的样品制成DMSO溶液或钠盐水溶液。将其用TBS/T(50mM Tris-HCl，100mM NaCl和0.01％Tween80，pH7.4)稀释，制成测定样品。在样品15μl中，加入反应液(由TBS/T，调制为最终浓度分别为0.1mM VLK-pNA、50nm Glu-plg，50U/mlu-PA)各35μl，以50μl/孔，各浓度连测3次。
另外，作为空白试剂，使用不含u-PA的反应液进行反应，将其值从按照上述反应得到的值减去。绘制相对于时间的平方的吸光度，以其斜率为反应初速度，以未加入各种三异戊二烯基酚化合物的制品为对照进行比较，作为各化合物的活性程度。
“10倍的促进活性浓度”表示以使用不含SMTP化合物的反应液(对照)时的值为1时，成为10倍促进活性的浓度。另外，“最大促进活性”表示SMTP化合物带来的纤维蛋白溶酶原活性促进达到最大的浓度。
结果示于表24。
表24
*由于溶解性低或活性低而不能测定
**：由于无促进活性所以不能测定
I-1～I-11、I-16～I-19的三异戊二烯基酚化合物是通过添加氨基苯酚或氨基苯甲酸、腺嘌呤、腺苷、氨基二氢2，3-二氮杂萘二酮、氨基萘酚磺酸、磺胺酸或其衍生物得到的。这些化合物中，具有羧基或羟基等作为取代基的芳基与三异戊二烯基酚骨架直接连接。
另外，I-20～I-26的三异戊二烯基酚化合物是通过添加苯基甘氨酸、酪氨酸得到的。这些化合物中，芳环和三异戊二烯基酚骨架之间，形成1或2个甲基。
如表24所示，这些化合物中的任一化合物均被确认具有纤维蛋白溶酶原活化促进活性，可与オルニブラビン(orniplabin)同样作为血栓溶解剂利用，另外，由于这些化合物中的任一化合物均是低分子量化合物，因此可望具有比オルニブラビン好的吸收性。
另外，尤其是化合物I-2、I-5、I-8、I-20、I-24、I-26显示出与オルニブラビン同等或在其之上的高的纤维蛋白溶酶原活化促进活性，这些化合物从吸收性的角度，表明可作为比オルニブラビン好的血栓溶解剂使用。
由此可知，本实施例的化合物可作为吸收性好、具有高活性的有效的血栓溶解剂利用。
Claims (9)
1.下述通式(II)表示的三异戊二烯基酚化合物，
其中，R1表示具有以选自羧基、羟基、磺酸基和仲氨基的至少1种作为取代基或作为取代基的一部分的芳基，含有仲氨基并且还可以含有氮的芳基，或由下述通式(III-1)所示的芳族氨基酸残基；X为CHY-(CH3)2Z，Y和Z各自为-H或-OH，或一起形成单键：
其中，R5表示至少一种选自羟基、羧基和具有1至5个碳原子的烷基的取代基，并且其中所述取代基可以存在或不存在；以及n表示0的整数。
2.如权利要求1所述的三异戊二烯基酚化合物，其中上述通式中的R1表示下述通式(II-1)表示的芳基，
其中，R2和R3分别表示氢原子、羧基、羟基或磺酸基、或互相结合以表示含有仲氨基的环状基团，但R2和R3不同时表示氢原子。
3.如权利要求1所述的三异戊二烯基酚化合物，其中上述式中的R1为苯基甘氨酸或它的衍生物的残基。
4.如权利要求1所述的三异戊二烯基酚化合物，其中上述通式中的R1选自如下：
5.血栓溶解促进剂，其含有权利要求1～4中的任一项所述的三异戊二烯基酚化合物作为有效成分。
6.制造权利要求1～4中的任一项所述的三异戊二烯基酚化合物的制造方法，其特征在于包括：
在含有选自氨基苯酚、氨基苯甲酸、腺嘌呤、腺苷、氨基二氢2，3-二氮杂萘二酮、氨基萘酚磺酸、磺胺酸及其衍生物以及芳族氨基酸及其衍生物的胺加入化合物的培养液中，培养霉菌；和
从培养后的培养物中分离三异戊二烯基酚化合物。
7.如权利要求6所述的制造方法，其中所述胺加入化合物为选自氨基苯甲酸、氨基水杨酸、氨基羟基苯甲酸、羟基邻氨基苯甲酸、氨基二氢2，3-二氮杂萘二酮、氨基萘酚磺酸的至少一种。
8.如权利要求6所述的制造方法，其中所述胺加入化合物为选自苯基甘氨酸和它的衍生物的至少一种。
9.如权利要求6～8任一项所述的制造方法，其中所述霉菌的培养包括：
利用胺化合物的含量为按质量计0.5％以下的限制性培养基的第一培养步骤；和
利用含有胺加入化合物的生产用培养基的第二培养步骤，所述第二培养步骤在培养中期开始。
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