KR20080112184A - 트리프레닐페놀화합물과 트리프레닐페놀화합물의 제조방법,및 혈전용해촉진제 - Google Patents

트리프레닐페놀화합물과 트리프레닐페놀화합물의 제조방법,및 혈전용해촉진제 Download PDF

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요시카즈 기타노
히데오 오히시
하루키 코이데
게이코 하세가와
리츠코 나라사키
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노우코우다이 티엘오 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 혈전용해촉진활성을 가지는 아래의 트리프레닐페놀화합물 및 트리프레닐페놀화합물의 효율적인 제조방법을 제공한다.
하기의 일반식 (II) 및 (III)으로 표시되는 트리프레닐페놀화합물.
〔화학식 1〕
Figure 112008016243244-PCT00064
(식 중 R1은, 카르복시기, 수산기, 설폰산기 및 제2 아미노기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 치환기로서 혹은 치환기의 일부로서 가지는 방향족기, 또는 제2 아미노기를 포함하며 또한 질소를 포함할 수 있는 방향족기를 나타낸다. 상기의 일반식 (III) 중 R4은, 하기의 일반식 (III-1)로 표시되는 방향족 아미노산 잔기를 나타내고, X는 -CHY-(CH3)2Z이며, Y 및 Z는, 각각 -H 또는 -OH이거나, 함께 단일결합을 형성한다:
〔화학식 2〕
Figure 112008016243244-PCT00065
식 중 R5은 있어도 되고 없어도 되는 수산기를 나타내며, n은 0 또는 1의 정수를 나타낸다.)

Description

트리프레닐페놀화합물과 트리프레닐페놀화합물의 제조방법, 및 혈전용해촉진제{TRIPRENYL PHENOL COMPOUNDS, PROCESS FOR PRODUCTION OF TRIPRENYL PHENOL COMPOUNDS AND THROMBOLYSIS ENHANCER}
본 발명은, 트리프레닐페놀화합물과 트리프레닐페놀화합물의 제조방법, 및 혈전용해촉진제에 관한 것이다.
트리프레닐페놀 골격을 가지는 미생물 대사산물에는, 중요한 생리활성을 가지는 것이 있다. 예를 들면, 사상균으로부터 얻어진 특정한 트리프레닐페놀화합물은, 혈전용해촉진작용이나, 혈관신생억제작용과 같은 생체에 중요한 현상에 대한 생리활성작용을 가지는 것으로 알려져 있다(특허문헌 1~3).
또한, 상기 트리프레닐페놀화합물과는 입체구조가 상이한 다른 트리프레닐페놀화합물로서, 특허문헌 4에는, 육모활성을 가지는 트리프레닐페놀화합물이 개시되어 있다. 또한, 비특허문헌 1에는, 항균활성 및 항진균활성을 가지는 트리프레닐페놀화합물이 개시되어 있다.
사상균을 이용한 배양에 의해 얻어지는 트리프레닐페놀화합물은, 플라스미노겐(Plg)의 형태(conformation)변화를 유도하고, 그 결과, 플라스미노겐 액티베이터(PA)에 의한 활성화의 감수성과 플라스미노겐의 섬유소(fibrin) 결합능을 증가시 켜, 결과적으로 혈전용해를 촉진시킨다는 것이 시사되어 있다(비특허문헌 2). 아미노산으로서 오르니틴을 첨가했을 때 얻어지는 트리프레닐페놀 골격을 2개 가지는 화합물(이하, '오르니플라빈'이라 함)은, 특히 이러한 혈전용해촉진작용이 현저히 강한 것으로 알려져 있다(특허문헌 2).
이와 같이, 트리프레닐페놀 골격을 가지는 화합물은, 그 입체구조나 치환기에 의해 다양한 활성을 발휘하기 때문에, 그 이용가치가 높다.
이러한 다양한 활성형의 트리프레닐페놀화합물은, 복잡한 구조를 가지고 있기 때문에 보다 효율적으로 얻는 것이 요망되고 있다. 이러한 제조방법으로서는, 미생물을 배양함으로써 제조하는 방법이 개발된 바 있다. 그러나 미생물을 이용하는 방법에서는, 통상 수많은 유사체와 함께 생산되기 때문에, 효율적 및 대량으로 얻기 위해 여러 가지로 연구가 이루어지고 있다. 특히, 혈전용해촉진작용이나 혈관신생저해작용과 같은 생리활성을 가지는 활성형 트리프레닐페놀화합물을 제조하기 위해, 특허문헌 1~3에서는, 배양 개시 직후 등의 사상균 배양초기에 치환기에 따른 아미노산 또는 아미노알코올을 첨가하는 배양시스템이 개시되어 있다.
[특허문헌 1] 일본 특허공개공보 제 2002-65288호
[특허문헌 2] 일본 특허공개공보 제2004-224737호
[특허문헌 3] 일본 특허공개공보 제2004-224738호
[특허문헌 4] 국제공개 98/56940호 팜플렛
[비특허문헌 1] J. Org. Chem., (1992), Vol.57, pp.6700-6703
[비특허문헌 2] FEBS Letter, (1997) Vol.418, pp.58-62
그러나, 오르니플라빈은 분자량 800을 초과하는 이량체이기 때문에, 생체로의 흡수라는 관점에서는 불리한 것으로 여겨지고 있다.
또한, 종래의 사상균을 이용한 배양방법에서는, 첨가가능한 아미노산 및 아미노알코올의 종류에 따라, 얻어지는 생성물의 종류가 한정된다. 또한, 생성량도 충분하다고 할 수 없다. 또한, 활성형 트리프레닐페놀화합물은 복잡한 구조를 하고 있기 때문에, 전체공정을 화학합성하는 것은 대단히 비효율적이다.
따라서, 본 발명의 목적은, 저분자량으로 높은 혈전용해촉진작용을 발휘할 수 있는 신규한 트리프레닐페놀화합물의 제공, 및 이를 포함하는 혈전용해촉진제의 제공에 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 생리활성이 높은 활성형 트리프레닐페놀화합물을 효율적으로 제조하는데 있다.
본 발명의 제 1의 트리프레닐페놀화합물은, 하기의 식(I)로 표시되며, 선광도(旋光度; rotatory power)가 (-)인 트리프레닐페놀화합물이다. 하기의 식(I) 중, X는 -CHY-(CH3)2Z이며, Y 및 Z는, 각각 -H 또는 -OH이거나, 함께 단일결합을 형성한다.
바람직하게는, 상기 제 1의 트리프레닐페놀화합물은, 하기의 식 (I-A)로 표시되는 것이다.
Figure 112008016243244-PCT00001
또한, 본 발명의 제 2의 트리프레닐페놀화합물은, 하기의 일반식 (II)로 표시되는 트리프레닐페놀화합물이다. 하기의 일반식(II) 중 R1은, 카르복시기, 수산기, 설폰산기 및 제2 아미노기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 치환기로서 혹은 치환기의 일부로서 가지는 방향족기, 또는 제2 아미노기를 포함하며 또한 질소를 포함할 수 있는 방향족기를 나타낸다. X는 -CHY-(CH3)2Z이며, Y 및 Z는, 각각 -H 또는 -OH이거나, 함께 단일결합을 형성한다.
Figure 112008016243244-PCT00002
본 발명의 제 3의 트리프레닐페놀화합물은, 하기의 일반식 (III)으로 표시되는 트리프레닐페놀화합물이다. 하기의 일반식 (III) 중 R4는, 하기의 일반식 (III- 1)로 표시되는 방향족 아미노산 잔기(殘基)를 나타내고, 하기의 일반식 (III-1) 중 R5는, 있어도 되고 없어도 되는 수산기를 나타내며, n은 0 또는 1의 정수를 나타낸다. X는 -CHY-(CH3)2Z이며, Y 및 Z는, 각각 -H 또는 -OH이거나, 함께 단일결합을 형성한다.
Figure 112008016243244-PCT00003
Figure 112008016243244-PCT00004
본 발명의 혈전용해촉진제는, 상기 일반식 (II) 또는 (III)로 표시되는 트리프레닐페놀화합물을 유효성분으로서 포함하는 혈전용해촉진제이다.
본 발명의 상기 제 2의 트리프레닐페놀화합물의 제조방법은, 아미노페놀, 아미노안식향산, 아데닌, 아데노신, 아미노디히드로프탈라진디온, 아미노나프톨설폰산, 설파닐산 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 첨가 아민화합물을 포함하는 배양액 중에서 사상균을 배양하는 배양공정과, 배양공정 후의 배양물로부 터 상기 트리프레닐페놀화합물을 분리하는 분리공정을 포함하는 것이다.
본 발명의 상기 제 3의 트리프레닐페놀화합물을 제조하는 제조방법은, 방향족 아미노산 또는 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 첨가 아민화합물을 포함하는 배양액 중에서 사상균을 배양하는 배양공정과, 배양공정 후의 배양물로부터 상기 트리프레닐페놀화합물을 분리하는 분리공정을 포함하는 것이다.
또한, 본 발명의 상기 제 2 및 제 3의 트리프레닐페놀화합물은, 상기 사상균의 배양공정이, 아민화합물의 함유량이 0.5질량%이하인 제한배지에 의한 제 1 배양공정과, 배양중기 이후의, 첨가 아민화합물을 함유하고 있는 생산용 배지에 의한 제 2 배양공정을 포함하는 상기 제조방법에 의해 제조해도 된다.
본 발명의 트리프레닐페놀화합물을 제조하는 제조방법은, 사상균을, 아민화합물의 종류 및 양 중 적어도 한 쪽이 제한된 제한배지에 의한 제 1 배양공정에서 배양하고, 배양중기 이후에, 아민화합물을 함유하고 있는 생산용 배지에 의한 제 2 배양공정에서 배양하는 것과, 상기 제 2 배양공정 후의 배양물로부터 트리프레닐페놀화합물을 얻는 것을 포함하는 것이다.
여기서, 상기 제 1 배양공정에서 사용되는 제한배지가 0.5질량%이하의 아민화합물을 포함하고, 상기 생산용 배지가 유기 아민화합물을 포함하는 것이어도 된다.
또한, 본 발명의 제 1의 트리프레닐페놀화합물은, 본 제조방법에 있어서, 상기 제 1 배양공정에서 사용되는 제한배지가 0.5질량%이하의 유기 아민화합물을 포함하고, 상기 제 2 배양공정에서 사용되는 생산용 배지가 무기 제1아민화합물을 포 함하는 방법에 의해 제조되는 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 어느 하나의 제조방법에 있어서, 상기 제한배지 및 생산용 배지는, 마그네슘, 코발트, 철, 칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종류의 금속이온을 더 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 상기 어느 하나의 제조방법에 있어서, 상기 사상균은, 스타치보트리스·마이크로스포라 IFO30018인 것이 바람직하다.
(발명의 효과)
본 발명에 따르면, 저분자량으로 높은 혈전용해촉진작용을 발휘할 수 있는 신규한 트리프레닐페놀화합물을 제공하는 것과, 이를 포함하는 혈전용해촉진제를 제공하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명에 따르면, 생리활성이 높은 활성형 트리프레닐페놀화합물을 효율적으로 제조하는 것이 가능하다.
도 1은 본 발명에 관련된 각종 SMTP화합물의 구조일람이다.
도 2는 본 발명의 제 1 실시예에 관련된 크로마토그래피의 차트이다.
도 3은 본 발명의 제 5 실시예에 관련된 SMTP-0 및 오르니플라빈(SMTP-7)의 플라스미노겐 활성화에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다(범례의 농도의 단위는 μM).
도 4는 본 발명의 제 5 실시예에 관련된 SMTP-0 및 오르니플라빈(SMTP-7)의 플라스미노겐 단편의 생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다(농도의 단위는 μ M).
<트리프레닐페놀화합물의 제조방법 및 제 1의 트리프레닐페놀화합물>
본 발명의 트리프레닐페놀화합물을 제조하는 제조방법은, 사상균을, 아민화합물의 종류 및 양 중 적어도 한 쪽이 제한된 제한배지에 의한 제 1 배양공정에서 배양하고, 배양중기 이후에, 아민화합물을 함유하고 있는 생산용 배지에 의한 제 2 배양공정에서 배양하는 것과, 상기 제 2 배양공정 후의 배양물로부터 트리프레닐페놀화합물을 얻는 것을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.
상기 제조방법에서는, 제 1 배양공정에서 사용하는 배지로서, 아민화합물의 종류 및 양 중 적어도 한 쪽이 제한된 제한배지를 이용하므로, 제 2 배양공정으로 이동하는 배양중기 이후에, 종래보다 대량의 중간체화합물을 얻을 수 있다. 이후, 아민화합물을 포함하는 생산용 배지에 의한 제 2 배양공정을 실행함으로써, 효율적이면서 선택성이 양호하게 목적으로 하는 트리프레닐페놀화합물을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명의 제 1의 트리프레닐페놀화합물은, 하기의 식 (I)로 표시되며, 선광도가 (-)인 화합물이다. 식 중 X는, -CHY-(CH3)2Z이며, Y 및 Z는, 각각 -H 또는 -OH이거나, 함께 단일결합을 형성한다.
Figure 112008016243244-PCT00005
상기 식(I)로 표시되는 트리프레닐페놀화합물은, 1번 위치의 질소원자가 제2 아민이며, 8번 위치 및 9번 위치가 함께 (S)의 절대배치를 가지는 동시에 전체적으로 (-)의 선광도를 나타낸다. 이와 같은 광학활성 및 절대배치는, 혈전용해촉진 등의 생리활성을 가지는 활성형 트리프레닐페놀화합물과 동일한 것이기 때문에, 본 화합물에서의 1번 위치의 치환기를 적당히 변경함으로써, 다양한 트리프레닐페놀화합물을 용이하게 얻을 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 트리프레닐페놀화합물의 제조방법에 대해 설명한다.
본 발명의 제조방법에서, 트리프레닐페놀화합물을 얻기 위해 사용되는 사상균으로는, 스타치보트리스속(屬)의 사상균이 선택된다. 특히 바람직한 생산균은, 스타치보트리스 마이크로스포라(Stachybotrys microspora) 등이고, 보다 바람직한 것은 스타치보트리스 마이크로스포라(S. microspora) IFO30018주(株)이나, 본 발명은, 상기한 균에 한정되는 것이 아니다.
본 발명의 제조방법에서는, 상기 사상균을, 제한배지를 이용한 제 1 배양공정과, 배양중기 이후의 생산용 배지를 이용한 제 2 배양공정의 2단계의 배양공정에 의해 배양한다.
제 1 배양공정에서는, 아민화합물의 종류 및 양 중 적어도 한 쪽이 제한된 제한배지가 이용된다. 여기서 말하는 「종류 및 양 중 적어도 한 쪽이 제한된」이란, 선택된 아민화합물의 종류에 따라 제한배지로의 첨가량이 결정됨을 의미한다. 아민화합물의 종류 및 양 중 적어도 한 쪽을 제한한 이러한 제한배지를 이용함으로써, 배양중기 이후의 제 2 배양공정에서, 효율적이면서 선택성이 양호하게 트리프레닐페놀화합물을 생성할 수 있다.
배양중기 이후의 제 2 배양공정에서는, 아민화합물을 함유하고 있는 생산용 배지가 이용된다. 여기서 「배양중기」란, 제 1 배양공정을 확실히 계속시키기 위한 배양 개시로부터의 소정기간, 바람직하게는 배양 개시후 2일째이후이며, 더욱 바람직하게는 4일째이후라고 할 수 있다. 이 기간이 지나치게 짧은, 예컨대 배양 개시 직후에 생산용 배지에 의한 배양을 개시하면, 목적으로 하는 트리프레닐페놀화합물을 얻는데 필요한 중간체화합물의 양이 불충분해져, 효율적으로 트리프레닐페놀화합물을 생성할 수 없다.
본 발명의 제조방법에서는, 제 1 배양공정에서 사용되는 제한배지가 0.5질량%이하의 아민화합물을 포함하고, 제 2 배양공정에서 사용되는 생산용 배지가 유기 아민화합물을 포함하는 것으로 할 수 있다(이하, 본 명세서에서는 「본 발명의 제 1의 제조방법」이라 함).
이에 따라, 제한배지 중에 있어서의 사상균의 화합물 생성능을 손상시키지 않으면서, 생산용 배지에 포함되는 유기 아민화합물에 대응한 관능기를 포함하는 중간체화합물, 예를 들면, 하기의 일반식 (I-B)로 표시되는 화합물을 얻을 수 있 다. 일반식 (I-B) 중, X는 상기와 동일하며, 식 중 #은 생산용 배지에 포함되는 아민화합물에 대응한 소정의 관능기를 나타낸다.
Figure 112008016243244-PCT00006
본 발명의 제 1의 제조방법에 있어서, 제한배지 중의 아민화합물은, 후술하는 유기 및 무기 아민화합물이 모두 해당된다. 이 아민화합물은, 제한배지에서의 사상균 생육을 위한 질소원, 생육촉진인자, 혹은 트리프레닐페놀화합물 전구체의 생산촉진인자로서 작용한다. 첨가의 형태로서는, 효모 엑기스, 부용(bouillon), 펩톤, 트립톤, 소이빈 밀, 파마미디아(Pharmamedia), 콘 스팁 리커(corn steep liquor), 어육 엑기스 등의 천연 혼합물로서, 혹은 정제 화합물로서 이용할 수 있다. 천연 혼합물은 여러 종류의 아민화합물을 함유하기 때문에, 제한배지에서는 그 양을 제한할 필요가 있다. 이 경우, 제한배지의 전체용량에 대해 0.5질량%이하로 제한하는데, 균의 생육, 생산량 및 생산의 선택성의 관점에서 0.01~0.5질량%인 것이 바람직하며, 0.1질량%~0.3질량%이면 더욱 바람직하다. 0.5질량%를 초과할 경우에는, 중간체화합물 이외의 화합물이 동시에 생성되어 선택성이 저하되고, 생산효율도 떨어지는 경우가 있어, 바람직하지 못하다. 한편, 0.01질량%미만이면, 사상균의 활성이 저하되는 경우가 있어 바람직하지 못하다. 또한, 정제 화합물을 아 민화합물로서 첨가하는 경우에는, 생산에 이용하는 사상균의 생육과 트리프레닐페놀화합물 전구체의 생산이 양호하게 일어나는 범위의 양과 종류가 이용된다.
제한배지 중에서 배양된 사상균은, 배양중기 이후에, 유기 아민화합물을 함유하는 생산용 배지에 의한 제 2 배양공정에서의 배양에 제공된다.
제 2 배양공정에서 이용되는 생산용 배지는, 유기 아민화합물을 함유하는 것 이외에는, 제한배지와 동일한 조성으로 구성할 수 있다. 이 때문에, 제 2 배양공정에서의 배양은, 제 1 배양공정에서 사용한 제한배지에, 유기 아민화합물을 첨가함으로써 실시해도 되고, 새롭게 조제한 아민화합물 함유 배지를 그대로 첨가해도 된다.
제 2 배양공정에서의 생산용 배지에 함유가능한 유기 아민화합물은, 목적으로 하는 트리프레닐페놀화합물을 얻는데 필요한 양으로 배지 중에 존재하고 있으면 되며, 배지의 전체용량의 5질량%이하, 생산량의 관점에서 바람직하게는 0.01질량%~1질량%, 더욱 바람직하게는 0.1질량%~0.5질량%로 이용된다.
본 발명의 제 1의 제조방법에 있어서의 유기 아민화합물로서는, 합성품 또는 천연유래의 아민화합물을 들 수 있다. 천연유래의 아민화합물성분으로서는, 예컨대 효모 엑기스, 부용, 펩톤, 트립톤, 소이빈 밀, 파마미디아, 콘 스팁 리커, 어육 엑기스 등의 주로 단백질이나 천연 아미노산을 배지에 첨가하기 위해 종래부터 사용되고 있는 성분을 들 수 있으며, 생산량의 관점에서 효모 엑기스나 펩톤이 바람직하다.
또한, 생성되는 트리프레닐페놀화합물의 종류 및 생산량을 고려할 때, 생산 용 배지에 첨가되는 유기 아민화합물에는, 제1 아민화합물이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 제1 아민화합물로서는 천연 아미노산과 합성 아미노산을 포함하며, 예컨대 α-아미노산으로서, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 트립토판, 시스틴, 리신, 오르니틴, 그리고, 천연 아미노산에 있어서의 카르복시기를 수소, 히드록시기 또는 히드록시메틸기로 치환한 것, 예컨대 2-아미노에탄올 등의 아미노알코올 등을 들 수 있다.
이들 중, 제 2 배양공정에서의 생산용 배지에 함유되는 아민화합물의 종류는, 목적으로 하는 트리프레닐페놀화합물의 종류에 따라서 적당히 선택할 수 있다.
예컨대, 혈전용해촉진작용을 가지는 활성형 트리프레닐페놀화합물을 얻으려면, D-리신, D-페닐알라닌, D-류신, D-트립토판, D-오르니틴 등의 아미노산을 함유하는 생산용 배지로 하면 좋다.
구체적으로는, SMTP-3D는 D-세린을, SMTP-4D는 D-페닐알라닌을, SMTP-5D는 D-류신을, SMTP-6D는 D-트립토판을, SMTP-7D는 D-오르니틴을, SMTP-8D는 D-리신을, SMTP-3은 L-세린을, SMTP-4는 L-페닐알라닌을, SMTP-5는 L-류신을, SMTP-6은 L-트립토판을, SMTP-7은 L-오르니틴을, SMTP-8은 L-리신을, SMTP-9L은 L-시스틴을, SMTP-10L은 L-이소류신을, SMTP-11L은 L-발린을, 각각 함유하는 생산용 배지를 이용함으로써, 목적으로 하는 트리프레닐페놀화합물을 선택적으로 생산할 수 있다(도 1 참조).
제 2 배양공정에서의 생산용 배지에 있어서의 아미노산의 함유량은, 생산배지의 용량에 대하여 0.03질량%~0.3질량%인 것이 바람직하다.
또한, 본 제조방법에 있어서의 무기 아민화합물로서는, 무기염류로서 함유되는 질산, 무기 제1아민화합물 등을 들 수 있다. 무기 제1아민화합물에 대해서는 후술하기로 한다.
제한배지 및 생산용 배지에는, 상기 성분에 더하여, 미생물에 의한 화합물의 생성촉진 등을 목적으로 하여, 상기 미생물의 배양에 통상 이용되고 있는 합성배지의 첨가성분을 포함한다. 본 제한배지에 첨가가능한 첨가성분으로는, 예컨대 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 동물성 유지, 식물성 유지 등의 영양원, 비타민류, 예컨대 염소, 질산, 황산, 인산, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 및 기타의 이온을 생성할 수 있는 무기염류를 들 수 있다.
무기염류 중에서도, 특히 금속이온을 생성할 수 있는 무기염류 는 , 생성물의 생산량 증대나 생산효율의 관점에서, 바람직하게 제한배지에 첨가할 수 있다. 이와 같은 금속이온으로는, 마그네슘 이온, 코발트 이온, 철 이온, 칼슘 이온, 칼륨 이온, 나트륨 이온 등을 들 수 있다.
이러한 금속이온의 첨가량은, 생성물의 생산량이나 균의 생육의 관점에서 각각 배지의 전체용량에 대해, 마그네슘 이온의 경우에는 황산마그네슘7수화물로서 0.001질량%~0.5질량%(보다 바람직하게는 0.01질량%~0.1질량%), 코발트 이온의 경우에는 염화코발트6수화물로서 0.00001질량%~0.01질량%(보다 바람직하게는 0.0001질량%~0.005질량%), 철 이온의 경우에는 황산철(II)7수화물로서 0.0001질량%~0.1질량%(보다 바람직하게는 0.0005질량%~0.05질량%), 칼슘 이온의 경우에는 염화칼슘2수화물로서 0.00001질량%~0.1질량%(보다 바람직하게는 0.0001질량%~0.05질량%), 칼 륨 이온의 경우에는 인산이칼륨 혹은 질산칼륨으로서 0.002질량%~2질량%(보다 바람직하게는 0.05질량%~0.5질량%), 나트륨 이온의 경우에는 인산이나트륨 혹은 질산나트륨으로서 0.002질량%~2질량%(보다 바람직하게는 0.05질량%~0.5질량%)로 할 수 있다.
상기 무기염류 및 금속이온은, 이들을 단독으로 사용해도 되고, 2종류 이상을 조합하여 사용해도 된다.
제한배지에 의한 제 1 배양공정은, 효율적으로 목적으로 하는 트리프레닐페놀화합물을 얻는데 충분한 양의 중간체화합물이 얻어지는 배양중기까지 계속한다. 트리프레닐페놀화합물의 효율적인 제조의 관점에서, 생산용 배지에 의한 제 2 배양공정은, 바람직하게는 사상균의 배양 개시로부터 2일이후, 더욱 바람직하게는 배양 개시후 4일부터 실시된다.
제 2 배양공정은, 생성된 트리프레닐페놀화합물의 양이 최대일 때 배양을 정지함으로써 종료된다. 제 2 배양공정의 기간은, 미생물의 상태 및 배양시스템의 크기에 따라 달라지지만, 일반적으로는 1일~5일이며, 생산량의 관점에서는 1~3일간인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 제조방법에서는, 제 1 배양공정에서 사용되는 제한배지가 0.5질량%이하의 유기 아민화합물을 포함하고, 제 2 배양공정에서 사용되는 생산용 배지가 무기 제1아민화합물을 포함하는 것으로 할 수 있다(이하, 본 명세서에서는 「본 발명의 제 2의 제조방법」이라 함).
이에 따라, 제한배지 중에 있어서의 사상균의 화합물 생성능을 손상시키지 않으면서, 생산용 배지에 포함되는 무기 제1아민화합물에 대응하여 제2 아민을 포함하는 하기의 식 (I)로 표시되며, 선광도가 (-)인 화합물을 얻을 수 있다. 식 중 X는, -CHY-(CH3)2Z이며, Y 및 Z는, 각각 -H 또는 -OH이거나, 함께 단일결합을 형성한다.
Figure 112008016243244-PCT00007
본 발명의 제 2의 제조방법에 있어서, 제한배지는 0.5질량%이하의 유기 아민화합물을 포함한다. 여기서의 유기 아민화합물은, 제 1의 제조방법에 대해 전술한 것과 동일한 것을 들 수 있으며, 바람직하게는 천연유래의 아민화합물 성분을 들 수 있다. 이에 따라, 사상균의 생산능을 손상시키지 않으면서, 중간체화합물을 얻을 수 있다. 제한배지에 있어서의 유기 아민화합물의 함유량은, 제한배지의 전체용량에 대하여 0.5질량%이하인데, 균의 생육, 생산량 및 생산의 선택성의 관점에서 0.01~0.5질량%인 것이 바람직하고, 0.1질량%~0.3질량%이면 더욱 바람직하다. 0.5질량%를 초과하는 유기 아민화합물을 함유하면, 상기 식 (I)의 화합물에 대응한 중간체화합물 이외의 화합물이 동시에 생성되어 선택성이 저하되고, 생산효율도 떨어지는 경우가 있어, 바람직하지 못하다.
또한, 본 제조방법의 제한배지는, 무기 아민화합물을 함유해도 된다. 상기 무기 아민화합물은, 무기염류로서 함유되는 질산 외에, 다른 무기 아민이어도 되며, 얻어지는 트리프레닐페놀화합물의 구조의 관점에서 무기 제1아민화합물이 바람직하게 포함된다. 제한배지에 함유가능한 무기 아민화합물의 함유량은, 목적으로 하는 트리프레닐페놀화합물의 종류 및 양에 따라 달라지지만, 균의 생육, 생산량 및 생산의 선택성의 관점에서, 제한배지의 용량에 대해 1질량%이하인 것이 바람직하고, 생산성의 관점에서 보면 0.5질량%이하인 것이 더욱 바람직하며, 0.3질량%이하이면 더더욱 바람직하다.
본 발명의 제 2의 제조방법에 있어서, 생산용 배지는 무기 제1아민화합물을 포함한다. 이에 따라, 상기 식 (I)의 화합물을 효율적으로 얻을 수 있다.
제한배지 및 생산용 배지에 함유되는 무기 제1아민화합물로서는, 예컨대, 염화암모늄, 초산암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염을 들 수 있다. 그 중에서도, 생성물의 생산량의 관점에서, 염화암모늄이 바람직하다.
제 2 배양공정에서의 생산용 배지에 함유가능한 무기 아민화합물은, 목적으로 하는 트리프레닐페놀화합물을 얻는데 필요한 양으로 배지 중에 존재하고 있으면 되며, 배지의 전체용량의 5질량%이하, 생산량의 관점에서 바람직하게는 0.01질량%~1질량%, 더욱 바람직하게는 0.1질량%~0.5질량%로 이용된다.
본 발명의 제 2의 제조방법에서의 제한배지 및 생산용 배지에 대해서는, 본 발명의 제 1의 제조방법과 마찬가지로, 사상균의 생육 및 생산되는 화합물의 생산량의 관점에서, 무기염류를 함유하는 것이 바람직하다. 함유가능한 무기염류 및 금속이온에 관해서는 상기한 내용을 그대로 적용할 수 있다.
본 발명의 제 1 및 제 2의 제조방법에서의 제 1 및 제 2 배양공정은, 통상, 상기 배지를 이용하며 정치배양 또는 진탕배양에 따른다. 진탕배양을 적용할 경우에는, 진균의 배양에서 통상 적용되는 속도로 하면 되는데, 예컨대 타카사키 가가쿠 기카이(주)에서 제조한, TB-25S(진폭 70㎜)의 회전진탕기(rotary shaker)의 경우라면, 용적이 500㎖인 플라스크 속에 배지량을 100㎖로 한 경우에 30rpm~240rpm, 바람직하게는 160rpm~200rpm으로 할 수 있다.
또한, 제 1 및 제 2 배양공정에서의 배양온도는, 다양한 온도에 있어서의 진균의 생육조건에 따라서 적당히 설정할 수 있는데, 일반적으로는 4~50℃이며, 15~37℃인 것이 바람직하고, 20~30℃이면 더욱 바람직하고, 실온(25℃)이면 가장 바람직하다. 상기 범위 이외에서는, 효율적으로 트리프레닐페놀화합물을 생성할 수 없다. 또한 각각 이용되는 배지의 pH는, 일반적으로 3~9, 바람직하게는 5~6으로 할 수 있다.
또한, 제 1 및 제 2 배양공정보다 이전에, 미생물에 의한 생성능을 안정화시키기 위해, 예비배양공정을 마련해도 좋다. 예비배양공정에서 이용되는 배지는, 미생물을 유지시키기 위해 이용되는 통상의 생육배지여도 좋다.
얻어진 트리프레닐페놀화합물은, 배양물로부터 회수·정제함으로써 얻을 수 있다. 회수·정제방법으로서는, 배지 중으로 방출된 트리프레닐페놀화합물을 회수·정제할 수 있는 수단이라면 무엇이든 상관없으며, 액체 크로마토그래피, 용매추출, 결정화 등을 들 수 있다. 생성물의 회수·정제는, 회수효율의 관점에서 2단계이상의 다단계로 하는 것이 바람직하다.
이러한 회수·정제방법에서는, 트리프레닐페놀화합물이 지용성임을 이용하여, 용매 등을 선택하는 것이 바람직하다.
트리프레닐페놀화합물을 배양물로부터 회수·정제할 때에는, 미리 배양물로부터 균체를 제거하는 것이 바람직하다. 이때에는, 배양물에 메탄올 등의 용매를 첨가하여 균체내의 트리프레닐페놀화합물을 추출하고, 그 후의 균체 제거에는, 여과 등을 이용하면 된다.
다음으로, 본 발명의 제 1의 트리프레닐페놀화합물, 즉 전구체 트리프레닐페놀화합물에 대해 설명한다.
하기의 식 (I)로 표시되는 전구체 트리프레닐페놀화합물(식 (I)중, X는 -CHY-(CH3)2Z이며, Y 및 Z는, 각각 -H 또는 -OH이거나, 함께 단일결합을 형성한다)은, 전술한 바와 같이, 혈전용해촉진 등의 생리활성을 가지는 활성형 트리프레닐페놀화합물과 동일한 광학활성 및 절대배치를 가지기 때문에, 화합물 중 1번 위치의 치환기를 다른 치환기로 적당히 변경함으로써, 다양한 트리프레닐페놀화합물을 용이하게 얻을 수 있다. 이것은, 1번 위치가 2차 아민으로 되어 있으므로, 1번 위치의 제2 아민을 생리활성 치환기로 수식(修飾)할 수 있기 때문이다. 이에 따라, 혈전용해촉진 등의 생리활성을 가지는 활성형 트리프레닐페놀화합물로 유도할 수 있다. 이 때, 수식에 이용하는 생리활성 치환기는, 목적으로 하는 활성에 따라, 기지(旣知)의 치환기로부터 적당히 선택할 수 있다.
또한, 트리프레닐페놀화합물은, 항암작용이나 신장장애치료작용, 그리고 후 술하는 바와 같이 혈전용해촉진작용 등을 가지며, 또한, 이러한 목적에 적응한 체내동태나 흡수특성을 가지므로, 이러한 트리프레닐페놀화합물의 유도체의 합성에도, 본 발명의 전구체 트리프레닐페놀화합물을 이용할 수 있다.
Figure 112008016243244-PCT00008
일반적으로 생리활성 물질에서는 평면구조가 동일하더라도 광학활성 등에 따라 성질이 크게 다르다는 것이 알려져 있다. 상기 트리프레닐페놀화합물에 있어서도, 8(R), 9(R)의 절대배치를 가지고 (+)의 선광도를 나타내는 것은, 8(S), 9(S)이며 (-)의 선광도를 나타내는 것과는 다른 작용을 나타낸다. 본 발명의 트리프레닐페놀화합물은, 8(S), 9(S)이며 (-)의 선광도를 나타내고, 생체에 있어서 유용한 생리활성을 가지는 활성형 트리프레닐페놀화합물을 효율적으로 얻는데 있어서 유용한 것이다.
여기서 8번 위치 및 9번 위치의 절대배치 및 선광도에 대해서는, 화합물의 입체구조를 확인하기 위해 당업계에서 통상 이용되고 있는 주지의 수단, 예컨대, C-NMR, H-NMR, 질량분석, IR, X선 결정구조해석, 비선광도(比旋光度) 등을 이용하여, 확인할 수 있다.
생리활성의 관점에서 특히 바람직하게는, Y 및 Z는, 각각 함께 단일결합을 형성한 하기의 식 (I-A)로 표시되며, 선광도가 (-)인 트리프레닐페놀화합물이다.
Figure 112008016243244-PCT00009
본 발명의 제 1의 트리프레닐페놀화합물은, 화학합성이나 미생물을 이용한 제조방법에 의해 얻을 수 있으나, 본 발명의 제 2의 제조방법을 이용하는 것이, 본 화합물을 효율적으로 얻을 수 있으므로 특히 바람직하다.
<제 2의 트리프레닐페놀화합물>
본 발명의 제 2의 트리프레닐페놀화합물은, 하기의 일반식 (II)로 표시되는 화합물이다.
제 2의 트리프레닐페놀화합물은, 트리프레닐페놀 골격에 더하여, 후술하는 소정의 치환기를 가지는 방향족기가 1번 위치의 질소원자에 직접 결합되어 있는 단량체이면서 저분자량인 화합물이며, 저농도라도 높은 플라스미노겐 활성화 촉진작용을 나타낼 수 있다.
Figure 112008016243244-PCT00010
식 중 R1은, 카르복시기, 수산기, 설폰산기 및 제2 아미노기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 치환기로서 혹은 치환기의 일부로서 가지는 방향족기, 또는 제2 아미노기를 포함하며 또한 질소를 포함할 수 있는 방향족기를 나타낸다. 즉, 본 화합물은, 트리프레닐페놀 골격 중의 질소원자에 방향족기가 직접 연결되어 있다. 방향족기의 치환기가 복수 존재할 경우, 이들은 서로 동일해도 되고 상이해도 된다. 이러한 치환기는, 흡수성의 관점에서 치환기 전체로서 분자량이 200이하인 방향족기인 것이 바람직하며, 160이하이면 더욱 바람직하고, 140이하이면 특히 바람직하다. 또한, 방향족기의 치환기 위치는, 트리프레닐페놀 골격의 질소원자에 대해 파라위치, 메타위치, 오르토위치 중 어느 위치여도 좋다.
본 화합물에 있어서의 방향족기는, 카르복시기, 수산기, 설폰산기 및 제2 아미노기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 치환기로서 혹은 치환기의 일부로서 가지거나, 혹은 제2 아미노기를 포함하며 또한 질소를 포함할 수 있는 방향족이면 되며, 다른 치환기를 추가의 치환기로서 더 가지고 있어도 된다. 이러한 추가의 치환기로서는, 저급 알킬기, 예컨대 탄소수 1~5의 알킬기를 들 수 있다.
방향족기로서는, 혈전용해작용의 관점에서, 하기의 일반식 (II-1)로 표시되는 것이 바람직하다. 하기의 일반식 (II-1) 중 R2 및 R3는 각각 수소원자, 카르복시기, 수산기 혹은 설폰산기, 또는 서로 결합하여 제2 아미노기를 포함하는 환상 구조기를 나타내나, 동시에 수소원자가 되는 경우는 없다.
Figure 112008016243244-PCT00011
이와 같은 방향족기로서는, 하기로부터 선택된 것이 혈전용해작용의 관점에서 더욱 바람직하다.
Figure 112008016243244-PCT00012
이러한 방향족기는, 후술하는 바와 같이 아미노페놀, 아미노안식향산, 아데닌, 아데노신, 아미노디히드로프탈라진디온, 아미노나프톨설폰산, 설파닐산 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 첨가 아민화합물로부터 유도될 수 있다.
또한, 식 중 X는, -CHY-(CH3)2Z이며, Y 및 Z는, 각각 -H 또는 -OH이거나, 함께 단일결합을 형성한다. 생리활성의 관점에서, Y 및 Z는 각각 함께 단일결합을 형성하는 것이 바람직하다.
이러한 제 2의 트리프레닐페놀화합물로서는, 이하와 같은 것을 들 수 있다.
Figure 112008016243244-PCT00013
Figure 112008016243244-PCT00014
Figure 112008016243244-PCT00015
Figure 112008016243244-PCT00016
Figure 112008016243244-PCT00017
Figure 112008016243244-PCT00018
상기한 본 발명의 제 2의 트리프레닐페놀화합물은, 화학합성에 의해 제조할 수도 있으나, 사상균을 이용하여 효율적으로 제조할 수 있다.
즉, 본 발명의 제 2의 트리프레닐페놀화합물을 제조하는 제조방법은, 후술하는 첨가 아민화합물을 포함하는 배양액 중에서 사상균을 배양하는 배양공정과, 배양공정 후의 배양물로부터, 상기 트리프레닐페놀화합물을 분리하는 분리공정을 포 함하는 것이다.
본 제조방법에서는, 사상균이, 배양액 중의 아미노페놀, 아미노안식향산, 아데닌, 아데노신, 아미노디히드로프탈라진디온, 아미노나프톨설폰산, 설파닐산 또는 이들의 유도체인 첨가 아민화합물을, 트리프레닐페놀 골격에 직접 연결되는 방향족기로서 취한다. 이에 따라, 효율적으로 제 2의 트리프레닐페놀화합물을 얻을 수 있다.
본 발명의 트리프레닐페놀화합물을 얻기 위해 사용되는 사상균으로서는, 스타치보트리스속의 사상균이 선택된다. 특히 바람직한 생산균은, 스타치보트리스 마이크로스포라(Stachybotrys microspora) 등이며, 보다 바람직한 것은 스타치보트리스 마이크로스포라(S. microspora) IFO30018주이나, 본 발명은, 이러한 균에 한정되는 것은 아니다.
본 제조방법에서는, 본 제조방법에 관련된 첨가 아민화합물은, 사상균의 배양공정 중에 존재하고 있으면 되며, 배양초기부터 존재시켜도 되지만, 생산효율의 관점에서, 배양중기에 첨가되는 것이 바람직하다.
배양중기에 첨가 아민화합물을 첨가하는 경우에는, 상기 사상균의 배양공정이, 아민화합물의 함유량이 0.5질량%이하인 제한배지에 의한 제 1 배양공정과, 배양중기 이후의 첨가 아민화합물을 함유하고 있는 생산용 배지에 의한 제 2 배양공정을 포함하는 것이 바람직하다.
제 1 배양공정에서 사용하는 배지로서, 아민화합물의 함유량이 0.5질량%로 제한된 제한배지를 이용하므로, 제 2 배양공정으로 이동하는 배양중기 이후에, 종 래보다 대량의 중간체화합물을 얻을 수 있다. 또한 이와 같이 중간체화합물을 대량으로 생성하고 나서, 제 2의 트리프레닐페놀화합물을 얻기 위한 첨가 아민화합물을 포함하는 생산용 배지에 의한 제 2 배양공정을 실행함으로써, 효율적이면서 선택성이 양호하게 목적으로 하는 제 2의 트리프레닐페놀화합물을 얻을 수 있다. 또한, 본 명세서에서 「아민화합물」이란, 특별히 언급하지 않는 한, 첨가 아민화합물도 포함한다.
제 2의 트리프레닐페놀화합물을 제조하기 위한 제조방법은, 첨가 아민화합물의 종류 이외에는, 전술한 본 발명의 트리프레닐페놀화합물의 제조방법에 있어서의 제 1의 제조방법에 대해 기술한 바와 동일하므로, 전술한 기재를 그대로 적용할 수 있다.
첨가 아민화합물로서는, 카르복시기, 수산기, 설폰산기 및 제2 아미노기 이외에 치환기를 가지고 있어도 되며, 저급 알킬기, 예컨대 탄소수가 1~5인 알킬기를 가지고 있어도 된다. 또한, 첨가 아민화합물은 복수의 아미노기를 가지고 있어도 되나, 제조효율의 관점에서, 하나의 아미노기를 가지는 것이 바람직하다.
이와 같은 첨가가능한 아민화합물은, 혈전용해촉진작용의 관점에서, 카르복시기와 수산기를 함께 가지는 모노아민화합물임이 바람직하다.
첨가 아민화합물로서는, 아미노페놀, 아미노안식향산, 아데닌, 아데노신, 아미노디히드로프탈라진디온, 아미노나프톨설폰산, 설파닐산 및 이들의 유도체를 들 수 있다. 이러한 첨가 아민화합물로서는, 예컨대, 아미노페놀, 메틸아미노페놀, 아미노안식향산, 아미노살리실산, 아미노히드록시안식향산, 히드록시안트라닐산, 아데닌, 아데노신, 아미노디히드로프탈라진디온, 아미노나프톨설폰산, 설파닐산을 들 수 있고, 예컨대, p-아미노안식향산, 3-아미노살리실산, o-아미노안식향산, 4-아미노-3-히드록시안식향산, 3-히드록시안트라닐산, 5-히드록시안트라닐산, 4-아미노살리실산, 5-아미노살리실산, 3-아미노-4-히드록시안식향산, 4-아미노-3-메틸살리실산, 아데닌, 아데노신, 5-아미노-2,3-디히드로-1,4-프탈라진디온, 1-아미노-2-나프톨-4-설폰산, p-설파닐산 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다. 이들 첨가 아민화합물은, 하나 또는 복수를 조합시켜서 사용할 수 있다.
그 중에서도, 혈전용해촉진작용의 관점에서, p-아미노안식향산, o-아미노안식향산, 3-아미노살리실산, 4-아미노-3-히드록시안식향산, 3-히드록시안트라닐산, 5-히드록시안트라닐산, 3-아미노-4-히드록시안식향산, 4-아미노살리실산, 5-아미노-2,3-디히드로-1,4-프탈라진디온, 1-아미노-2-나프톨-4-설폰산이 바람직하다.
제 2 배양공정에서의 생산용 배지에 함유가능한 첨가 아민화합물은, 목적으로 하는 트리프레닐페놀화합물을 얻는데 필요한 양으로 배지 중에 존재하고 있으면 되며, 배지의 전체용량의 5질량%이하, 생산량의 관점에서 바람직하게는 0.01질량%~1질량%, 더욱 바람직하게는 0.1질량%~0.5질량%로 이용된다.
<제 3의 트리프레닐페놀화합물>
본 발명의 제 3의 트리프레닐페놀화합물은, 하기의 일반식 (III)로 표시되는 트리프레닐페놀화합물이다.
제 3의 트리프레닐페놀화합물은, 트리프레닐페놀 골격에, α-방향족 아미노산에서 유래하는 치환기가 1번 위치의 질소원자에 직접 결합되어 있다. 이때문에, 제 2의 트리프레닐페놀화합물은, 상기 1번 위치의 질소원자와 방향고리와의 사이에 1개 또는 2개의 메틸기만이 개재된다. 그 결과, 제 2의 트리프레닐페놀화합물은 단량체이면서 저분자량인 화합물로서, 저농도라도 높은 플라스미노겐 활성화 촉진작용을 나타낼 수 있다.
Figure 112008016243244-PCT00019
식 중 R4는, 하기의 일반식 (III-1)로 표시되는 방향족 아미노산 잔기를 나타낸다. 하기의 일반식 (III-1) 중 R5는 있어도 되고 없어도 되는 수산기를 나타내며, n은 0 또는 1의 정수를 나타낸다.
Figure 112008016243244-PCT00020
본 화합물에 있어서의 방향족 아미노산 잔기는, 흡수성의 관점에서 치환기 전체로서 분자량이 200이하인 것이 바람직하고, 160이하이면 더욱 바람직하며, 140이하이면 특히 바람직하다. 본 방향족 아미노산 잔기는, α위치의 카르복시기 이 외의 다른 치환기를 추가의 치환기로서 더 가지고 있어도 된다. 이러한 추가의 치환기로서는, 수산기, 카르복시기나, 예컨대 탄소수 1~5의 알킬기를 들 수 있다. 또한, 방향족 아미노산 잔기에 있어서의 방향고리에 연결된 치환기의 위치는, 파라위치, 메타위치, 오르토위치 중 어느 위치여도 좋다.
이러한 방향족 아미노산 잔기로서는, 혈전용해작용의 관점에서, 페닐글리신, 티로신 또는 이들의 유도체인 것이 바람직하다. 또한, 티로신 잔기의 경우, 방향고리에 연결된 수산기, 카르복시기, 저급 알킬기 등의 위치는 파라위치, 메타위치, 오르토위치 중 어느 위치여도 좋다. 이러한 방향족 아미노산 잔기로서는, 특히 이하에 예로 든 것이 더욱 바람직하다.
Figure 112008016243244-PCT00021
이러한 방향족 아미노산 잔기는, 후술하는 바와 같이 페닐글리신, 티로신 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 첨가 아민화합물로부터 유도할 수 있다.
또한, 식 중 X는, -CHY-(CH3)2Z이며, Y 및 Z는, 각각 -H 또는 -OH이거나, 함께 단일결합을 형성한다. 생리활성의 관점에서, Y 및 Z는 각각 함께 단일결합을 형성하는 것이 바람직하다.
이와 같은 제 3의 트리프레닐페놀화합물로서는, 이하와 같은 것을 들 수 있다.
Figure 112008016243244-PCT00022
Figure 112008016243244-PCT00023
Figure 112008016243244-PCT00024
상기한 본 발명의 제 3의 트리프레닐페놀화합물은, 화학합성에 의해 제조할 수도 있으나, 사상균을 이용하여 효율적으로 제조할 수 있다.
즉, 본 발명의 제 3의 트리프레닐페놀화합물을 제조하는 제조방법은, 후술하는 첨가 아민화합물을 포함하는 배양액 중에서 사상균을 배양하는 배양공정과, 배 양공정 후의 배양물로부터 상기 트리프레닐페놀화합물을 분리하는 분리공정을 포함하는 것이다.
본 제조방법에서는, 사상균이, 배양액 중의 방향족 아미노산 또는 그 유도체인 첨가 아민화합물을, 트리프레닐페놀 골격 중의 질소원자에 직접 연결되는 α-방향족 아미노산 잔기로서 취한다. 이에 따라, 효율적으로 제 3의 트리프레닐페놀화합물을 얻을 수 있다.
본 발명의 제 3의 트리프레닐페놀화합물을 얻기 위해 사용되는 사상균으로서는, 상기 제조방법과 마찬가지로 스타치보트리스속의 사상균이 선택된다. 특히 바람직한 생산균은, 스타치보트리스 마이크로스포라(Stachybotrys microspora) 등이며, 보다 바람직한 것은 스타치보트리스 마이크로스포라(S. microspora) IFO30018주이나, 본 발명은, 이러한 균에 한정되는 것이 아니다.
제 3의 트리프레닐페놀화합물의 제조방법에서는, 방향족 아미노산 및 그 유도체인 첨가 아민화합물은, 사상균의 배양공정 중에 존재하고 있으면 되며, 배양초기부터 존재시켜도 되지만, 생산효율의 관점에서, 배양중기에 첨가되는 것이 바람직하다.
배양중기에 첨가 아민화합물을 첨가할 경우에는, 상기 사상균의 배양공정이, 아민화합물의 함유량이 0.5질량%이하인 제한배지에 의한 제 1 배양공정과, 배양중기 이후의 첨가 아민화합물을 함유하고 있는 생산용 배지에 의한 제 2 배양공정을 포함하는 것이 바람직하다.
제 1 배양공정에서 사용하는 배지로서, 아민화합물의 함유량이 0.5질량%로 제한된 제한배지를 이용하므로, 제 2 배양공정으로 이동하는 배양중기 이후에, 종래보다 대량의 중간체화합물을 얻을 수 있다. 또한 이와 같이 중간체화합물을 대량으로 생성하고 나서, 제 3의 트리프레닐페놀화합물을 얻기 위한 첨가 아민화합물을 포함하는 생산용 배지에 의한 제 2 배양공정을 실행함으로써, 효율적이면서 선택성이 양호하게 목적으로 하는 제 3의 트리프레닐페놀화합물을 얻을 수 있다.
또한, 본 명세서에서 「아민화합물」이란, 특별히 언급하지 않는 한, 첨가 아민화합물도 포함한다.
제 3의 트리프레닐페놀화합물을 제조하기 위한 제조방법은, 첨가 아민화합물의 종류 이외에는, 전술한 본 발명의 트리프레닐페놀화합물의 제조방법에 있어서의 제 1의 제조방법에 대해 기술한 바와 동일하므로, 전술한 기재를 그대로 적용할 수 있다.
첨가 아민화합물로서는, 아미노기, 카르복시기 이외에 치환기를 가지고 있어도 되며, 수산기나, 예컨대 탄소수 1~5의 저급 알킬기를 가지고 있어도 된다. 또한, 첨가 아민화합물 중에 복수의 아미노기가 있어도 되지만, 제조효율의 관점에서, 하나의 아미노기를 가지는 것이 바람직하다.
첨가 아민화합물로서는, 페닐글리신, 히드록시페닐글리신, 티로신 및 이들의 유도체를 들 수 있다. 이러한 첨가 아민화합물로서는, 예컨대, L-페닐글리신, D-페닐글리신, L-히드록시페닐글리신, D-히드록시페닐글리신, L-티로신, D-티로신, L-히드록시메틸페닐글리신, D-히드록시메틸페닐글리신, L-히드록시에틸페닐글리신, D-히드록시에틸페닐글리신, L-카르복시페닐글리신, D-카르복시페닐글리신, L-카르 복시메틸페닐글리신, D-카르복시메틸페닐글리신, L-카르복시에틸페닐글리신, D-카르복시에틸페닐글리신, L-메틸티로신, D-메틸티로신, L-에틸티로신, D-에틸티로신, L-카르복시페닐알라닌, D-카르복시페닐알라닌, L-카르복시메틸페닐알라닌, D-카르복시메틸페닐알라닌, L-카르복시에틸페닐알라닌, D-카르복시에틸페닐알라닌 등을 들 수 있다. 구체예로서는, 예컨대, L-페닐글리신, D-페닐글리신, L-3-히드록시페닐글리신, D-3-히드록시페닐글리신, L-4-히드록시페닐글리신, D-4-히드록시페닐글리신, L-p-티로신, D-p-티로신, L-2-히드록시페닐글리신, D-2-히드록시페닐글리신, L(또는 D)-2(또는 3 또는 4)-히드록시-3(2 또는 4 또는 5 또는 6)-메틸(또는 에틸)-페닐글리신, L(또는 D)-2(또는 3 또는 4)-카르복시-페닐글리신, L(또는 D)-2(또는 3 또는 4)-카르복시-3(2 또는 3 또는 4 또는 5 또는 6)-메틸(또는 에틸)-페닐글리신, L(또는 D)-o-티로신, L(또는 D)-m-티로신, L(또는 D)-2(또는 3 또는 4 또는 5 또는 6)-메틸(또는 에틸)-p(또는 o 또는 m)-티로신, L(또는 D)-2(또는 3 또는 4)-카르복시페닐알라닌, L(또는 D)-2(또는 3 또는 4)-카르복시-3(2 또는 4 또는 5 또는 6)-메틸(또는 에틸)페닐알라닌 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다. 이들 첨가 아민 화합물은, 하나 또는 복수를 조합시켜서 사용할 수 있다.
그 중에서도, 혈전용해촉진작용의 관점에서, L-페닐글리신, D-페닐글리신, L-3-히드록시페닐글리신, D-3-히드록시페닐글리신, L-p-티로신이 바람직하다.
제 2 배양공정에서의 생산용 배지에 함유가능한 첨가 아민화합물은, 목적으로 하는 트리프레닐페놀화합물을 얻는데 필요한 양으로 배지 중에 존재하고 있으면 되며, 배지의 전체용량의 5질량%이하, 생산량의 관점에서 바람직하게는 0.01질량 %~1질량%, 더욱 바람직하게는 0.1질량%~0.5질량%로 이용된다.
<혈전용해촉진제>
본 발명의 혈전용해촉진제는, 상기 제 2 및 제 3의 트리프레닐페놀화합물 중 적어도 하나를 유효성분으로서 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.
상술한 제 2 및 제 3의 트리프레닐페놀화합물은, 저분자량으로 효과적인 혈전용해촉진작용을 가진다.
상기 트리프레닐페놀화합물은, 본 혈전용해제 중에서는, 유리(遊離)형태, 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 등, 의약으로서 통상 적용가능한 형태로 본 혈전용해제에 함유될 수 있다.
또한 본 혈전용해제는, 각종 투여형태에 따라 적절히 제형을 변경할 수 있다. 경구투여형태로는, 정제, 캡슐제, 산제(散劑), 세립제, 과립제, 액제 또는 시럽제 등을 들 수 있고, 비경구투여형태로는, 주사제, 점적제(點滴劑), 좌제(座劑), 흡입제, 패치제 등을 들 수 있다.
이러한 것들의 형태를 유지시키기 위해, 각각의 용도에 사용가능한 주지의 용매, 부형제(賦形劑) 등의 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 혈전용해제는, 연령, 체중 및 증상에 따라 적절한 투여량으로 투여할 수 있는데, 예컨대 정맥내 투여의 경우에는 성인 1일당 유효성분량으로서 1~25㎎/㎏의 투여가 바람직하고, 경구투여의 경우에는 성인 1일당 유효성분량으로서 2~200㎎/㎏의 투여가 바람직하며, 투여기간은, 연령이나 증상에 따라 임의로 정할 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 실시예에 대해 설명하겠으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 실시예 중의 %는, 특별히 언급하지 않는 한, 질량/용량 기준이다.
[제 1 실시예]
스타치보트리스 마이크로스포라(Stachybotrys microspora) IFO30018주의 포자를 100㎖의 종자배양용 배지가 들어간 용적이 500㎖인 삼각 플라스크에 접종하고, 회전진탕기를 이용하여 180rpm 및 25℃로 4일간에 걸쳐 종자배양을 하였다. 종자배양용 배지는, 글루코오스(4%), 대두 밀(0.5%), 건조 부용(0.3%), 분말 효모 엑기스(0.3%)를 물에 녹이고, HCl을 이용하여 pH 5.8로 조제한 다음, 소포제 CB442(0.01%)(닛뽄유시가가쿠(日本油脂化學), 일본)를 첨가하여, 배양기에 100㎖씩 나누어 따른 후, 오토클레이브(121℃, 15분)를 행한 것을 사용하였다.
상기 배양액 5㎖를, 100㎖의 본배양 배지가 들어간 용적이 500㎖인 삼각 플라스크에 접종하고, 회전진탕기를 이용하여 180rpm 및 25℃로 4일간에 걸쳐 본배양을 하였다. 본배양용 배지(제한배지)는, 수크로오스(5%), 분말 효모 엑기스(0.1%), NaNO3(0.3%), K2HPO4(0.1%), MgSO4·7H2O(0.05%), KCl(0.05%), CoCl2·6H2O(0.00025%), FeSO4·7H2O(0.0015%), CaCl2·2H2O(0.00065%)를 물에 녹이고, HCl을 이용하여 pH 5.8로 조제한 다음, 소포제 CB442(0.01%)(닛뽄유시가가쿠, 일본)를 첨가하여 배양기에 100㎖씩 나누어 따른 후, 오토클레이브(121℃, 15분)를 행한 것을 사용하였다.
접종한 날을 배양 0일째로 하고, 배양 4일째(96시간후)에 100㎎의 염화암모 늄을 배지(생산용 배지)에 첨가하여 배양을 계속하였다. 배양 5일째에 메탄올 200㎖를 첨가하고, 배양을 종료하였다. 이후, 회전진탕기를 이용하여 180rpm 및 25℃로 약 3시간에 걸쳐 진탕하여 추출을 하였다.
[제 2 실시예]
제 1 실시예의 배양 추출액 300㎖로부터, 흡인여과기(Buchner funnel)를 이용하여 균체를 제거하고, 배양 상청액을 얻었다. 수류 펌프에 의한 감압 하에, 회전식 증발기(rotary evaporator)를 이용하여 농축하였다. 잔량이 약 50㎖가 된 시점에서 농축을 멈추었다. 등량(等量)의 초산에틸로 3회 추출하고, 무수황산나트륨으로 탈수한 후, 여과하고 농축하여 건고(乾固)시켰다. 건고물을 약 3㎖의 MeOH에 용해시킨 후, 여과하였다.
그리고 이것을 3000rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. HPLC에서 분취를 하기 전에, 상기 상청액을 Lichrolut(등록상표) RP-18(100㎎)(MERCK KGaA, Darmstadt, Germany)에 의해 전(前)처리하였다. 역상 HPLC는 컬럼;Inertsil PREP-ODS(직경 30×250㎜)(지엘사이언스가부시키가이샤, 도쿄, 일본), 온도; 40℃, 유속; 25㎖/분, 검출파장; 260㎚, 전개용매; 50mM의 초산암모늄을 포함하는 75% 메탄올로 수행하고, 유지시간 11.5분의 피크를 분취하였다(도 2 참조). 회전식 증발기를 이용하여 메탄올을 제거(留去)한 후, 등량의 초산에틸로 3회 추출하고, 무수황산나트륨으로 탈수한 후 여과하여 농축하였다. 이것을 메탄올에 용해시켜 여과하고, 농축한 후 건고시켜 정제물 33.23㎎을 얻었다. 수율 약 30질량/질량%.
[제 3 실시예]
제 2 실시예에서 얻어진 백색 고체 화합물(SMTP-0라 함)의 물리화학적 성상을 조사하였다.
또한, 본 실시예의 화합물의 대조물로서는, 하기 스타치보트린(Stachybotrin)B(선광도는 (+))를 이용하였다. 스타치보트린B의 구조는, J. Org. Chem., (1992), Vol.57, pp.6700-6703을 참조한 것이다.(단, 절대입체구조가 아직 결정되지 않았기 때문에, 하기의 구조는 상대입체배치이다.)
Figure 112008016243244-PCT00025
NMR은, Alpha600(JEOL)을 이용하여, 1H 600MHz, 13C 150MHz, 50℃에서 측정하였다. 샘플은 약 10㎎/㎖의 DMSO-d6용액으로 하였다.
MALDI-TOF-MS는, Voyager-DE STR(Applied Biosystem사)을 이용하고, 포지티브 이온 모드에서 α-시아노-4-히드록시계피산을 매트릭스로 하여 측정하였다.
UV는, 320 스펙트로포토미터(Hitachi)를 이용하였다. 시료는 MeOH에 용해하였다(5μg/㎖).
FT-IR은, JIR-WINSPEC50(JEOL)을 이용하였다. MeOH에 용해한 시료 750μg을 암염에 도포하여 측정하였다.
선광도는, DIP-360(JASCO)을 이용하였다(27℃, Na). 시료는 MeOH에 용해하였다(10㎎/㎖).
결과를 도 2 및 표 1에 나타내었다.
제 2 실시예에서 얻어진 SMTP-0의 물리화학적 성상은, 아래와 같았다.
외관 : 백색 고체
분자식 : C23H31NO4
MALDI-TOF-MS(M+H)+ : 386.2599
이론치 : 386.2331(C23H32NO4)
UV λmax(ε)MeOH :
215 (ε55,769), 251(ε10,615), 300(ε4,000)
IR스펙트럼 ν(㎝-1) :
3259.15, 2917.81, 1666.22, 1612.22, 1469.51, 1359.59, 1166.74, 1081.88, 850.46, 773.32, 723.18, 674.97, 566.98
비선광도[α]D 27 = -2.23°(c 1.0, MeOH)
Figure 112008016243244-PCT00026
이러한 결과로부터, 제 2 실시예에서 얻어진 SMTP-0은, 스타치보트린B(전술한 비특허문헌 1 참조)와 동일한 평면구조를 가진다는 것이 시사되었다. 그러나, SMTP-0은 (-)의 선광도를 가지는 데 반해, 스타치보트린B의 선광도는 (+)였다. 이와 같이, 하기에 나타낸 본 실시예의 SMTP-0은 확실히 스타치보트린B와는 다른 입체구조를 가지고 있다.
Figure 112008016243244-PCT00027
[제 4 실시예]
제 3 실시예에서 밝혀진 SMTP-0과 스타치보트린B의 입체구조에 있어서의 차이를 상세히 밝히기 위해, 개변 모셔(Mosher)법을 이용한 해석을 하였다.
SMTP-0(50㎎, 78μmol)을 아세트니트릴(2mL)에 용해하고, N,N-디이소프로필에틸아민(50μl)과 트리메틸실릴디아조메탄(2.0M, 헥산용액)(150μl)을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응액을 농축시킴으로써 SMTP-0의 메틸에테르(SMTP-0-OMe)(44㎎)를 얻었다.
SMTP-0-OMe(20㎎, 50μmol)을 N,N-디메틸포름아미드(1㎖)에 용해하고, R-(-)-α-메톡시-α-(트리플루오로메틸)페닐아세틸클로라이드(25㎎), 트리에틸아민(30μl), 4-디메틸아미노피리딘(2㎎)을 첨가하여 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응액에 물(10mL)을 첨가하고, 초산에틸(50mL)로 추출하였다. 유기층은, 1N HCl, 포화 탄산수소나트륨 수용액, 및 포화 식염수로 세정한 후, 무수황산마그네슘을 이용하여 건조하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 박층 크로마토그래피(헥산-초산에틸)에 의해 정제하고, S-α-메톡시-α-(트리플루오로메틸)페닐아세틸초산의 SMTP-0-OMe 에스테르(S-MTPA-SMTP-0-OMe)(18㎎)를 얻었다.
R-(-)-α-메톡시-α-(트리플루오로메틸)페닐아세틸클로라이드 대신에, S-(+)-α-메톡시-α-(트리플루오로메틸)페닐아세틸클로라이드를 이용한 상기와 동일한 반응을 수행함으로써, SMTP-0-OMe(20㎎, 50μmol)로부터 R-α-메톡시-α-(트리플루오로메틸)페닐아세틸초산의 SMTP-OMe 에스테르(R-MTPA-SMTP-0-OMe)(17㎎)를 얻었다.
상기의 방법에 의해 얻어진 R-MTPA-SMTP-0-OMe, S-MTPA-SMTP-0-OMe에 대해 각종 핵자기 공명 스펙트럼을 측정하고, 각각의 화합물의 프로톤(proton)의 귀속을 행하였다. 결과를 표 2에 나타내었다.
S-MTPA-SMTP-0-OMe의 화학 변위(chemical shift)δS와 R-MTPA-SMTP-0-OMe의 화학 변위 δR의 차이(Δδ=δS-δR)를 계산한 결과, 7번 위치의 축방향 위치 프로톤의 Δδ이 마이너스의 값이 되고(Δδ=-0.12), 25번 위치의 메틸기 프로톤의 Δδ이 플러스의 값(Δδ=+0.03)이 되었으므로, 본 발명의 SMTP-0의 절대입체배치는, 상기 제 3 실시예에서 나타낸 바와 같은 절대입체배치(8번 위치 및 9번 위치의 입체는 모두 S)로 결정하였다.
Figure 112008016243244-PCT00028
[제 5 실시예]
제 2 실시예에서 얻어진 SMTP-0(50μM, 100μM, 200μM)의 선용(線溶)촉진활성을, 우로키나아제 촉매에 의한 플라스미노겐 활성화를 촉진하는 활성으로서 아래와 같이 하여 평가하였다.
30mM의 SMTP용액(DMSO용액)을 TBS/T(50mM Tris-HCl, 100mM NaCl 및 0.01% Tween80, pH 7.4)로 희석하여 1.5mM(in 5% DMSO·TBS/T)용액을 조제하였다. 이 용액을 5% DMSO in TBS/T으로 희석하여 상기 농도의 SMTP용액을 조제하였다.
(1) 플라스미노겐 단편 생성 활성의 측정
SMTP용액(60μl)을 240μl의 1.25배 농도 반응액(VLK-pNA(Val-Leu-Lys-p-니트로아닐리드)를 포함하지 않음)과 혼합하여 37℃에서 60분간 반응시켰다. 이후, 75μl의 50% 트리클로로초산(TCA)을 첨가하여 반응을 정지시키고 얼음 위에서 60분간 방치하였다. TCA 불용성 물질을 원심분리에 의해 침전시키고, 이것을 아세톤으로 2회 세정하였다. 얻어진 침전물을 건조시킨 후, 11μl의 SDS 샘플 버퍼(0.125M Tris-Cl, pH 6.8, 4% SDS, 20% 글리세롤, 0.02% 브로모페놀블루)를 첨가하여 용해하고, 그 10μl를 이용하여 SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동을 행하였다(10% 겔). 결과를 도 3에 나타내었다.
(2) 플라스미노겐 활성화의 측정
10μl의 SMTP용액(10μl)을 40μl의 1.25배 농도 반응액(0.0625μM의 플라스미노겐, 62.5U/㎖의 우로키나아제, 0.125mM의 VLK-pNA)과 96-웰 마이크로 플레이트 내에서 혼합하고, 즉시 마이크로 플레이트 리더에 의해 경시적(經時的)으로 VLK-pNA의 가수분해를 405㎚에서의 흡수를 모니터함으로써 측정하였다. 측정은 37℃에서, 2분 간격으로 60분까지 행하였다. 결과를 도 4에 나타내었다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 결과적으로, 어떠한 농도에서도 플라스미노겐 활성화를 촉진하는 작용은 나타나지 않았다(도 3 참조). 또한, 혈관신생저해활성을 가지는 플라스미노겐 단편의 생성에 대해서도 작용을 나타내지 않았다(도 4 참조).
이와 같은 SMTP-0의 2차 아민을 D-트립토판 등의 아미노산으로 수식함으로써, 강한 플라스미노겐 활성화 촉진작용을 나타내는 활성형 트리프레닐페놀화합물을 얻을 수 있다.
본 실시예에서는, 활성화 트리프레닐페놀화합물을 용이하게 유도할 수 있는 중간체 트리프레닐페놀화합물을 제공할 수 있었다.
이에 따라, 발효법에서는 생산할 수 없는 양태인 활성화 트리프레닐페놀화합물을 안정적으로 얻을 수 있다.
[제 6 실시예]
아민화합물의 첨가시기에 대해 아래와 같이 검토하였다.
본배양용 배지(제한배지)는, 수크로오스(5%), NaNO3(0.3%), K2HPO4(0.1%), MgSO4·7H2O(0.05%), KCl(0.05%)을 물에 녹이고, HCl을 이용하여 pH 5.8로 조제한 다음, 소포제 CB442(0.01%)(닛뽄유시가가쿠, 일본)를 첨가하고 배양기에 100㎖씩 나누어 따른 후, 오토클레이브(121℃, 15분)를 행한 것을 사용하고, 제 1 실시예와 동일하게 배양을 하였다.
배양 개시후, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간에 각각, 아민화합물로서의 L-시스틴(0.3%)을 첨가하고, 이후, 24시간 배양하여, 생산량을 측정하였다. 생산량의 측정에는, 배양액에 2배량의 메탄올을 첨가한 후 1시간 동안 진탕하여 SMTP화합물을 추출하고, 10,000rpm으로 원심분리에 의해 상청액을 분리하여, 이것을 이용하였다. 상기 상청액의 0.01㎖를, 실리카 ODS 컬럼을 이용한 고속 액체 크로마토그래피에 제공하고, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 80% 메탄올로 1㎖/분의 유속으로 전개하여, 260㎚에서의 흡광도를 모니터하였다. 표준샘플의 유지시간과 일치하는 샘플의 피크 면적을 표준샘플의 피크 면적과 비교함으로써 정량(定量)을 행하였다.
결과를 표 3에 나타내었다.
Figure 112008016243244-PCT00029
표 3에 나타낸 바와 같이, 아민화합물을 함유하지 않은 제한배지에 의한 배양 개시 직후가 아니라, 일정기간 후에, 아미노산을 함유하는 생산용 배지에 의한 배양을 함으로써, SMTP-9의 생산량이 증가하였다. 특히, 제한배지에 의한 배양 개시후의 배양초기가 아니라, 72시간 이후, 즉, 배양중기 이후에 아미노산을 첨가한 경우에, SMTP-9의 생산량이 대폭적으로 증가하였다.
또한 비교예로서, 배양초기(배양과 동시~4일째 이내)에, 아민화합물의 양과 종류를 제한하지 않은 배지에 L-시스틴을 첨가함으로써, SMTP-9를 얻었으나(일본 특허공개공보 제2002-65288호 및 일본 특허공개공보 제2004-224737호 참조), 본 실시예에 의한 제조방법에 비해, 생산량이 최대 0.1㎎/㎖ 정도로, 본 방법의 15%이하였다. 또한, 상기한 종래의 방법에서는 특히, 아미노산 또는 아미노알코올을 배양 개시로부터 5일 이후에 첨가하면, 생성물의 생산이 격감하였으나, 본 실시예에서는 5일후에 첨가하더라도 높은 생성량을 유지할 수 있었다.
따라서, 본 실시예의 제조방법은, SMTP화합물을 효율적으로 제조할 수 있다.
[제 7 실시예]
다음으로, 제한배지 및 생산용 배지에 첨가가능한 무기염류에 대해, 아래와 같이 검토하였다.
본배양용 배지(제한배지)는, 글루코오스(2%), NaNO3(0.3%), K2HPO4(0.1%), MgSO4·7H2O(0.05%), KCl(0.05%), FeSO4·7H2O(0.001%)를 물에 녹이고, HCl을 이용하여 pH 5.8로 조제한 다음, 소포제 CB442(0.01%)(닛뽄유시가가쿠, 일본)를 첨가하고 배양기에 100㎖씩 나누어 따른 후, 오토클레이브(121℃, 15분)를 행한 배지(D배지)를 기본배지로 하여, 표 4에 기재된 성분 및 농도를 변경하였다. 이러한 배지를 사용하여, 제 1 실시예와 동일하게 배양하였다.
배양 개시후, 72시간에 아민화합물로서의 Ｌ-시스틴(0.1%)을 첨가하고, 이후 48시간 동안 배양하여, 생산량을 제 6 실시예에 기재된 방법으로 측정하였다.
결과를 표 4에 나타내었다.
Figure 112008016243244-PCT00030
[제 8 실시예]
또한, 금속염, 탄소원, 질산나트륨, 첨가하는 아민(이하의 실시예에서는 L-시스틴)의 농도를 아래와 같이 검토하였다.
본배양용 배지(제한배지)는, 수크로오스(5%), 펩톤(0.1%), NaNO3(0.3%), K2HPO4(0.1%), MgSO4·7H2O(0.05%), KCl(0.05%)을 물에 녹이고, HCl을 이용하여 pH 5.8로 조제한 다음, 소포제 CB442(0.01%)(닛뽄유시가가쿠, 일본)를 첨가하고 배양기에 100㎖씩 나누어 따른 후, 오토클레이브(121℃, 15분)를 행한 배지(F배지)를 기본배지로 하여, 표 5에 기재된 성분 및 농도를 변경하였다. 이러한 배지를 사용하여, 제 1 실시예와 동일하게 배양을 하였다.
배양 개시로부터 72시간 후에 아민화합물로서의 Ｌ-시스틴(표 5에 기재된 양)을 첨가하고, 이후 24시간, 48시간 및 72시간 배양하여, 생산량을 제 6 실시예에 기재된 방법으로 측정하였다.
결과를 표 5에 나타내었다.
Figure 112008016243244-PCT00031
이러한 결과로부터 알 수 있듯이, 탄소원으로서 수크로오스, 질소원으로서 효모 엑기스 및 질산나트륨, 무기염류로서 인산이칼륨, 황산마그네슘, 염화칼륨, 황산제일철, 염화칼슘, 염화코발트를 포함하는 배지를 이용함으로써, SMTP-9의 생산량이, 일본 특허공개공보 제2004-224737호에 기재된 방법(2%의 글루코오스, 0.5%의 펩톤, 0.3%의 효모 엑기스, 0.3%의 K2HPO4, 0.01%의 MgSO4·7H2O와, L-시스틴 100㎎을 포함하는 배지 100㎖ 중에서 배양을 개시한다)에 비해 10배이상(0.08㎎/㎖로부터 1㎎/㎖이상)으로 증가하였다. 또한, 상기 제한배지(F배지)에서 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간 배양한 후에 각각, 아민화합물로서의 Ｌ-시스틴(0.5%)을 첨가하고, 이후 48시간 동안 배양하여 생산량을 측정한 경우, SMTP-9의 생산량은 각각 0.55, 0.70, 0.92, 1.21, 1.15㎎/㎖가 되었다.
SMTP-9 이외의 화합물의 생산을 검토하기 위해, 오르니틴 1㎎/㎖를 이용하여, SMTP-7을, 제 1 실시예에서 이용한 제한배지 및 생산용 배지를 이용하여 배양한 경우(오르니틴의 첨가시기는 배양 4일째)와, 비교예로서 일본 특허공개공보 제 2002-65288호에 기재된 기본배지(글루코오스(2%), 펩톤 0.5%, 효모 엑기스 0.3%, K2HPO4(0.3%), MgSO4·7H2O(0.01%)을 물에 녹이고, HCl 또는 NaOH를 이용하여 pH 5.5로 조정한 것) 및 오르니틴 1㎎/㎖를 포함하는 배지를 이용하여 배양한 경우에 있어서의 생산량을 비교하였다. 그 결과, SMTP-7의 생산량은, 약 5배(0.3㎎/㎖로부터 1.5㎎/㎖)로 증가하였다.
이러한 결과로부터, SMTP화합물을 효율적으로 얻기 위해서는, 제한배지에 의한 배양 개시 중기 이후에, 아민화합물을 함유하는 생산용 배지에 의한 배양을 하여 생성할 때에, 소정의 무기염류를 제한배지 및 생산용 배지에 함유하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.
[제 9 실시예]
화합물 I-1의 합성
스타치보트리스 마이크로스포라(Stachybotrys microspora) IFO30018주 (자이단호진 핫코겡큐쇼[財團法人醱酵硏究所])의 포자를 100㎖의 종자배양용 배지가 들어간 용적이 500㎖인 삼각 플라스크에 접종하고, 회전진탕기를 이용하여 180rpm 및 25℃로 4일간에 걸쳐 종자배양을 하였다. 종자배양용 배지는, 글루코오스(4%), 대두 밀(0.5%), 건조 부용(0.3%), 분말 효모 엑기스(0.3%)를 물에 녹이고, HCl을 이용하여 pH 5.8로 조제한 다음, 소포제 CB442(0.01%)(0.1g/㎖의 아세톤 용액을 1㎖/L첨가)(닛뽄유시가가쿠, 일본)를 첨가하고, 배양기에 100㎖씩 나누어 따른 후, 오토클레이브(121℃, 15분)를 행한 것을 사용하였다.
상기의 배양액 5㎖를, 100㎖의 본배양 배지가 들어간 용적이 500㎖인 삼각 플라스크에 접종하고, 회전진탕기를 이용하여 180rpm 및 25℃로 5일간에 걸쳐 본배양을 하였다.
본배양용 배지(제한배지)는, 수크로오스(5%), 분말 효모 엑기스(0.1%), NaNO3(0.3%), K2HPO4(0.1%), MgSO4·7H2O(0.05%), KCl(0.05%), CoCl2·6H2O(0.00025%), FeSO4·7H2O(0.0015%), CaCl2·2H2O(0.00065%)를 물에 녹이고, HCl을 이용하여 pH 5.8로 조제한 다음, 소포제 CB442(0.01%)(0.1g/㎖의 아세톤 용액을 1㎖/L첨가)(닛뽄유시가가쿠, 일본)를 첨가하고 배양기에 100㎖씩 나누어 따른 후, 오토클레이브(121℃, 15분)를 행한 것을 사용하였다.
접종한 날을 배양 0일째로 하고, 배양 4일째(96시간 후)에 100㎎의 p-아미노페놀을 배지에 첨가하여 생산용 배지로 하고 배양을 계속하였다. 그로부터 약 24시간 후에 메탄올 200㎖를 첨가하고, 배양을 종료하였다. 이후, 회전진탕기를 이용해서 180rpm 및 25℃로 약 3시간에 걸쳐 진탕하여 추출을 하였다.
얻어진 배양 추출액 300㎖로부터, 흡인여과기를 이용하여 균체를 제거하고, 배양 상청액을 얻었다. 수류 펌프에 의한 감압 하에, 회전식 증발기를 사용하여 농축하였다. 잔량이 약 100㎖ 이하가 된 시점에서 농축을 멈추고, 인산으로 pH를 2로 조제하여 저온실에 하룻밤 동안 방치하였다. 발생된 침전물을 원심분리에 의해 분리하고, 이것을 아세톤에 용해하였다. 상기 아세톤 현탁액을 원심분리하여 상청액을 분리한 다음 농축하고 건고시켜 324.1㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 다음 3000rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. HPLC에서 분취를 하기 전에, 상기 상청액을 Lichrolut(등록상표) RP-18(100㎎)(MERCK KGaA, Darmstadt, Germany)에 의해 전처리하였다. 역상 HPLC는 컬럼;Inertsil PREP-ODS(직경 30×250㎜)(지엘사이언스가부시키가이샤, 도쿄, 일본), 온도;40℃, 유속;25㎖/분, 검출파장;260㎚, 전개용매;50mM의 초산암모늄을 포함하는 80% 메탄올로 수행하고, 유지시간 16~17분의 피크를 분취하였다. 회전식 증발기를 이용하여 메탄올을 제거한 후, 등량의 초산에틸로 3회 추출하고, 무수황산나트륨으로 탈수한 후 여과하고, 농축하였다. 이것을 메탄올에 용해하여 여과한 다음, 농축하고 건고시켜 화합물 I-1의 정제물 99.33㎎을 얻었다.
화합물 I-1의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS는, Voyager-DE STR(Applied Biosystem사)을 이용하고, 포지티브 이온 모드에서 α-시아노-4-히드록시계피산을 매트릭스로 하여 측정하였다.
UV는, 메탄올 중에서 320 스펙트로포토미터(Hitachi)를 이용하여 측정하였다.
FT-IR은, JIR-WINSPEC50(JEOL)을 이용하였다. 아세톤에 용해한 시료를 암염에 도포하여 측정하였다.
화합물 I-1의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C29H35NO5
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 478.4473
계산치 : C29H36NO5에 대해 478.2593
UV λmax㎚(ε) 214(sh)(84,000), 260(sh)(21,500), 291(30,000)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3855, 3747, 3309, 2971, 2919, 2863, 1664, 1618, 1513, 1461, 1373, 1247, 1168, 1074, 943, 835, 765, 684
[제 10 실시예]
화합물 I-2의 합성
제 9 실시예와 동일하게 전(前)배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, p-아미노안식향산으로 한 것 이외에는, 제 9 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
얻어진 배양 추출액 300㎖로부터, 흡인여과기를 이용하여 균체를 제거하고, 배양 상청액을 얻었다. 수류 펌프에 의한 감압 하에, 회전식 증발기를 이용하여 농축하였다. 잔량이 약 100㎖이하가 된 시점에서 농축을 멈추고, 인산으로 pH를 2로 조제하여 저온실에 하룻밤 동안 방치하였다. 발생된 침전물을 원심분리에 의해 분리하고, 이것을 아세톤에 용해시켰다. 상기 아세톤 현탁액을 원심분리하여 상청액을 분리하고 농축하여 건고시켜 603.3㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에 3000rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. HPLC에서 분취를 하기 전에, 상기 상청액을 Lichrolut RP-18(100㎎)에 의해 전처리하였다. 역상 HPLC는 컬럼;Inertsil PREP-ODS(직경 30×250㎜), 온도 40℃, 유속;25㎖/분, 검출파장;260㎚, 전개용매;50mM의 초산암모늄을 포함하는 70% 메탄올로 행하고, 유지시간 21~22분의 피크를 분취하였다. 회전식 증발기를 이용하여 메탄올을 제거한 후, 등량의 초산에틸로 3회 추출하고, 무수황산나트륨으로 탈수한 후 여과하고, 농축하였다. 이것을 메탄올에 용해하여 여과한 다음, 농축하고 건고시켜 화합물 I-2의 정제물 52.44㎎을 얻었다.
화합물 I-2의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, 및 FT-IR은, 제 9 실시예와 동일하게 측정하였다. NMR은, Alpha600(JEOL)을 이용하여, 1H 600MHz, 13C 150MHz, 60℃에서 측정하였다. 샘플은 약 10㎎/㎖의 DMSO-d6용액으로 하였다.
화합물 I-2의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C30H35NO6
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 506.2778
계산치 : C30H36NO6에 대해 506.2543
UV λmax㎚(ε) 296(29,300)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3853, 3739, 3392, 2969, 2915, 2858, 1691, 1610, 1513, 1463, 1429, 1365, 1303, 1267, 1187, 1076, 939, 848, 779, 676, 551
NMR
Figure 112008016243244-PCT00032
[제 11 실시예]
화합물 I-3의 합성
제 10 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
상기 배양액 5㎖를, 100㎖의 본배양 배지가 들어간 용적이 500㎖인 삼각 플라스크에 접종하고, 회전진탕기를 이용하여 180rpm 및 25℃로 6일간에 걸쳐 본배양을 하였다.
본배양용 배지(제한배지)는, 수크로오스(5%), 분말 효모 엑기스(0.1%), KNO3(0.7%), K2HPO4(1.5%), MgSO4·7H2O(0.05%), KCl(0.05%), CoCl2·6H2O(0.00025%), FeSO4·7H2O(0.0015%), CaCl2·2H2O(0.00065%)를 물에 녹이고, HCl을 이용하여 pH 5.8로 조제한 다음, 소포제 CB442(0.01%)(0.1g/㎖의 아세톤 용액을 1㎖/L첨가)(닛뽄유시가가쿠, 일본)를 첨가하고 배양기에 100㎖씩 나누어 따른 후, 오토클레이브(121℃, 15분)를 행한 것을 사용하였다.
접종한 날을 배양 0일째로 하고, 배양 4일째(96시간후)에 100㎎의 ｍ-아미노안식향산을 배지에 첨가하여 생산용 배지로 하고 배양을 계속하였다. 그로부터 약 40시간후에 메탄올 200㎖를 첨가하고, 배양을 종료하였다. 이후, 회전진탕기를 이용하여 180rpm 및 25℃로 약 2시간에 걸쳐 진탕하여 추출을 하였다.
제 10 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 223.1㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 10 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 10 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 70%로부터 90%로, 30분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시켰다. 유지시간 17.5~18.5분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분(劃分)을 제 10 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-3의 정제물 40.36㎎을 얻었다.
화합물 I-3의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, 및 FT-IR은, 제 10 실시예와 동일하게 측정하였다. NMR은, Alpha600(JEOL)을 이용하여, 1H 600MHz, 13C 150MHz, 25℃에서 측정하였다. 샘플은 약 10㎎/㎖의 아세톤-d6용액으로 하였다.
화합물 I-3의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C30H35NO6
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 506.2573
계산치 : C30H36NO6에 대해 506.2543
UV λmax㎚(ε) 217(46,786), 281(17,583)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3352, 2970, 2920, 2858, 2634, 2540, 1693, 1616, 1593, 1462, 1367, 1290, 1244, 1155, 1072
NMR
Figure 112008016243244-PCT00033
[제 12 실시예]
화합물 I-4의 합성
제 10 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, o-아미노안식향산으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 10 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 120㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 10 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 10 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 70%로부터 90%로, 40분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시켰다. 유지시간 22.8~23.8분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 10 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-4의 정제물 14.58㎎을 얻었다.
화합물 I-4의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, 및 FT-IR은, 제 9 실시예와 동일하게 측정하였다. NMR은, 40℃에서 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-4의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C30H35NO6
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 506.2573
계산치 : C30H36NO6에 대해 506.2543
UV λmax㎚(ε) 215(sh)(48,908), 260(13,440), 301(sh)(5,255)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3398, 2970, 2920, 2860, 2630, 2488, 1707, 1612, 1466, 1369, 1240, 1159, 1078, 1036
NMR
Figure 112008016243244-PCT00034
[제 13 실시예]
화합물 I-5의 합성
제 10 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, 4-아미노살리실산으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 10 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 408㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 150㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 10 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 10 실시예와 동일하게 수행하였다. 검출파장은 290㎚로 하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 70% 메탄올을 이용하고, 유지시간 12.7~15분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 10 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-5의 정제물 18.50㎎을 얻었다.
화합물 I-5의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
FAB-MS는 JEOL SX-102A를 이용하고, 글리세롤을 매트릭스로 하여 포지티브 이온 모드에서 측정하였다. UV, FT-IR 및 NMR은, 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-5의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C30H35NO7
FAB-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 522
계산치 : C30H36NO7에 대해 522.2492
UV λmax㎚(ε) 212(sh)(47,641), 288(18,973), 306(18,243)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3396, 2968, 2922, 2860, 2553, 1689, 1622, 1462, 1362, 1253, 1218, 1157, 1074
NMR
Figure 112008016243244-PCT00035
[제 14 실시예]
화합물 I-6의 합성
제 10 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, 4-아미노-3-히드록시안식향산으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 10 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 170㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 10 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 10 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 70%로부터 100%로, 40분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시켰다. 유지시간 14.3~15.3분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 10 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-6의 정제물 9.54㎎을 얻었다.
화합물 I-6의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, FT-IR, 및 NMR은, 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-6의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C30H35NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 522.2533
계산치 : C30H36NO7에 대해 522.2492
UV λmax㎚(ε) 206(66,823), 263(16,471), 297(13,865)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3388, 2968, 2922, 2858, 2578, 1697, 1614, 1466, 1371, 1215, 1076
NMR
Figure 112008016243244-PCT00036
[제 15 실시예]
화합물 I-7의 합성
제 10 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, 3-히드록시안트라닐산으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 10 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 200㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 10 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 10 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 70%로부터 80%로, 10분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시킨 후에 80%를 10분간 유지하였다. 유지시간 12.4~13.5분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 10 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-7의 정제물 31.1㎎을 얻었다.
화합물 I-7의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, FT-IR, 및 NMR은, 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-7의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C30H35NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 522.2327
계산치 : C30H36NO7에 대해 522.2492
UV λmax㎚(ε) 213(57,753), 255(11,155), 290(7,714)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3356, 2968, 2920, 2858, 1697, 1616, 1470, 1294, 1159, 1076, 762
NMR
Figure 112008016243244-PCT00037
[제 16 실시예]
화합물 I-8의 합성
제 10 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, 3-아미노살리실산으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 10 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 280㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 10 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 10 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 75% 메탄올을 이용하고, 유지시간 16.0~18.6분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 10 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-8의 정제물 23.29㎎을 얻었다.
화합물 I-8의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, FT-IR, 및 NMR은, 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-8의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C30H35NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 522.2537
계산치 : C30H36NO7에 대해 2492
UV λmax㎚(ε) 4(57,962), 256(10,633), 304(11,676)
IR νmax(NaCl)㎝-1 221, 2850, 2918, 2976, 1678, 1616, 1464, 1240, 1157, 1074
NMR
Figure 112008016243244-PCT00038
[제 17 실시예]
화합물 I-9의 합성
제 10 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, 5-아미노살리실산으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 10 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 502㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 200㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 10 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 10 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 70% 메탄올을 이용하고, 유지시간 22.0~25.5분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 10 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-9의 정제물 66.34㎎을 얻었다.
화합물 I-9의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, FT-IR, 및 NMR은, 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-9의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C30H35NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 522.2505
계산치 : C30H36NO7에 대해 522.2492
UV λmax㎚(ε) 214(50,665), 259(sh)(9,591), 295(14,490)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3394, 2970, 2920, 2858, 1676, 1618, 1489, 1464, 1370, 1203, 1161, 1076
NMR
Figure 112008016243244-PCT00039
[제 18 실시예]
화합물 I-10의 합성
제 10 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, 3-아미노-4-히드록시안식향산으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 10 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 420㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 150㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 10 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 10 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 65%로 25분간 유지한 후에, 65%로부터 100%로, 5분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시킨 후에 100%를 10분간 유지하였다. 유지시간 28.7~32.5분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 10 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-10의 정제물 78.94㎎을 얻었다.
화합물 I-10의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, FT-IR, 및 NMR은, 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-10의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C30H35NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 522.2550
계산치 : C30H36NO7에 대해 522.2492
UV λmax㎚(ε) 215(52,124), 252(22,205), 308(sh)(6,255)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3803, 3429, 3068, 2970, 2924, 2860, 2549, 2517, 1691, 1601, 1464, 1302, 1076, 1036
NMR
Figure 112008016243244-PCT00040
[제 19 실시예]
화합물 I-11의 합성
제 10 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, 5-히드록시안트라닐산으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 10 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 305㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 10 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 검출방법 및 전개조건 이외에는 제 10 실시예와 동일하게 수행하였다. 검출은 다이오드 어레이 검출기를 이용하여 260~350㎚를 모니터하였다. 전개용매로서는, 0.1%(vol/vol) 포름산을 포함하는 80% 메탄올을 이용하고, 유지시간 16.7~17.7분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 회전식 증발기로 농축하여 메탄올을 제거한 후에 동결건조하였다. 건조물에 n-헥산을 첨가하고 교반한 후 원심분리하여, 불용물(不溶物)을 회수하였다. 이 조작을 3회 수행하고, 불용물을 메탄올로 용해시킨 후 여과하여, 이것을 농축하고 건고시켜서, 화합물 I-11의 정제물 43.37㎎을 얻었다.
화합물 I-11의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, FT-IR, 및 NMR은, 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-11의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C30H35NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 522.2516
계산치 : C30H36NO7에 대해 522.2492
UV λmax㎚(ε) 214(66,614), 260(16,471), 297(sh)(9,695)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3373, 3329, 2970, 2920, 2860, 1705, 1660, 1610, 1504, 1464, 1338, 1296, 1219, 1074, 1032
NMR
Figure 112008016243244-PCT00041
[제 20 실시예]
화합물 I-16의 합성
제 9 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, 아데닌으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 9 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 123㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 9 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 9 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 70%로부터 100%로, 30분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시켰다. 유지시간 17.5~18분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 9 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-16의 정제물 1.66㎎을 얻었다.
화합물 I-16의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV 는, 제 9 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-16의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C28H33N5O4
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 504.2665
계산치 : C28H34N5O4에 대해 504.2611
UV λmax ㎚(ε) 212(43,984), 258(9,260), 301(3,422)
[제 21 실시예]
화합물 I-17의 합성
제 9 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, 5-아미노-2,3-디히드로-1,4-프탈라진디온으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 9 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 130㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 9 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 9 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 75% 메탄올로 행하고, 유지시간 16.5~17.5분의 피크를 분취하였다. 분취된 획분을 제 9 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-17의 정제물 10.20㎎을 얻었다.
화합물 I-17의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, 및 FT-IR은, 제 9 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-17의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C31H35N3O6
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 546.2742
계산치 : C31H36N3O6에 대해 546.2604
UV λmax㎚(ε) 208(85,822), 260(14,722), 306(11,668)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3408, 3259, 2968, 2918, 2858, 1659, 1605, 1473, 1333, 1159, 1076, 1041
[제 22 실시예]
화합물 I-18의 합성
제 9 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, 1-아미노-2-나프톨-4-설폰산으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 9 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 199㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 9 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 9 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 70%로부터 100%로, 30분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시켰다. 유지시간 14.5~15.5분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 9 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-18의 정제물 18.40㎎을 얻었다.
화합물 I-18의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, 및 FT-IR은, 제 9 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-18의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C33H37NO8S
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 608.2346
계산치 : C33H38NO8S에 대해 608.2318
UV λmax㎚(ε) 217(63,880), 234(sh)(49,185), 260(12,144), 285(11,173), 296(11,051), 326(5,586), 338(60,72)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3452, 3242, 2968, 2916, 2856, 2146, 1670, 1616, 1464, 1425, 1358, 1171, 1051
[제 23 실시예]
화합물 I-19의 합성
제 9 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, p-설파닐산으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 9 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 316㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 9 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 9 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 65%로부터 100%까지 35분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시켰다. 유지시간 18~18.5분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 19 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-19의 정제물 12.33㎎을 얻었다.
화합물 I-19의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, FT-IR 및 NMR은, 제 12 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-19의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C29H35NO7S
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 542.2233
계산치 : C29H36NO7S에 대해 542.2212
UV λmax㎚(ε) 224(sh)(25,112), 286(19,484)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3188, 3057, 2972, 2918, 2856, 1697, 1606, 1460, 1367, 1174, 1132, 1080, 1036
NMR
Figure 112008016243244-PCT00042
[제 24 실시예]
화합물 I-20의 합성
제 9 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, L-페닐글리신으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 9 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 270㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 9 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 9 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 75%로부터 90%로, 40분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시켰다. 유지시간 15~18.5분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 9 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-20의 정제물 37.85㎎을 얻었다.
화합물 I-20의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, FT-IR 및 NMR은, 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-20의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C31H37NO6
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 520.2662
계산치 : C31H38NO6에 대해 520.2699
UV λmax㎚(ε) 214(46,214), 259(11,112), 300(3,012)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3423, 2968, 2920, 2864, 1726, 1660, 1620, 1464, 1350, 1205, 1169, 1074
NMR
Figure 112008016243244-PCT00043
[제 25 실시예]
화합물 I-21의 합성
제 9 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, D-페닐글리신으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 9 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 150㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 75㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 9 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 9 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 50mM의 초산암모늄을 포함하는 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 70%로부터 100%로, 30분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시켰다. 유지시간 19~20.5분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 9 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-21의 정제물 17.59㎎을 얻었다.
화합물 I-21의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, FT-IR, 및 NMR은, 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-21의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C31H37NO6
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 520.2747
계산치 : C31H38NO6에 대해 520.2699
UV λmax㎚(ε) 215(44,864), 259(11,008), 300(3,012)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3354, 2968, 2922, 2862, 1714, 1664, 1620, 1466, 1356, 1207, 1167, 1074
NMR
Figure 112008016243244-PCT00044
[제 26 실시예]
화합물 I-22의 합성
제 9 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, L-4-히드록시페닐글리신으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 9 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 365㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 150㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 9 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 19 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 0.1%(vol/vol) 포름산과 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 75%로부터 90%로, 30분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시켰다. 유지시간 13~14분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 19 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-22의 정제물 69.68㎎을 얻었다.
화합물 I-22의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, FT-IR, 및 NMR은, 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-22의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C31H37NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 536.2656
계산치 : C31H38NO7에 대해 536.2648
UV λmax㎚(ε) 216(42,714), 262(11,026), 300(2,783)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3348, 2974, 2922, 2856, 1718, 1660, 1612, 1514, 1464, 1365, 1211, 1173, 1072
NMR
Figure 112008016243244-PCT00045
[제 27 실시예]
화합물 I-23의 합성
제 9 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, D-4-히드록시페닐글리신으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 9 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 510㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 200㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 9 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 19 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 0.1%(vol/vol) 포름산과 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 75%로부터 90%로, 30분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시켰다. 유지시간 13.5~15분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 19 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-23의 정제물 150.39㎎을 얻었다.
화합물 I-23의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, FT-IR, 및 NMR은, 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-23의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C31H37NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 536.2671
계산치 : C31H38NO7에 대해 536.2648
UV λmax㎚(ε) 215(52,563), 261(13,274), 300(5,353)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3325, 2970, 2922, 2858, 1711, 1662, 1612, 1512, 1464, 1365, 1217, 1173, 1074
NMR
Figure 112008016243244-PCT00046
[제 28 실시예]
화합물 I-24의 합성 및 화합물 I-25의 합성
제 9 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, 50㎎의 DL-3-히드록시페닐글리신으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 9 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 230㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 70㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 9 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 19 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 0.1%(vol/vol) 포름산과 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 75%로부터 90%로, 30분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시켰다. 유지시간 16~17분의 피크(화합물 I-24)와, 유지시간 17.5~19분의 피크(화합물 I-25)를 분취하였다. 얻어진 각각의 획분을 제 19 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-24의 정제물 16.43㎎과, 화합물 I-25의 정제물 22.98㎎을 얻었다.
화합물 I-24의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV 및 FT-IR은, 제 9 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-24의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C31H37NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 536.2716
계산치 : C31H38NO7에 대해 536.2648
UV λmax㎚(ε) 215(47,531), 261(11,348), 299(3,212)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3294, 2970, 2926, 2858, 1703, 1662, 1605, 1464, 1367, 1219, 1161, 1076
화합물 I-25의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV, FT-IR, 및 NMR은, 제 11 실시예와 동일하게 측정하였다.
화합물 I-25의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C31H37NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 536.2723
계산치 : C31H38NO7에 대해 536.2648
UV λmax㎚(ε) 215(57,915), 261(13,703), 300(3,747)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3309, 2974, 2924, 2864, 1707, 1662, 1603, 1464, 1365, 1224, 1163, 1076
NMR
Figure 112008016243244-PCT00047
[제 29 실시예]
화합물 I-26의 합성
제 9 실시예와 동일하게 전배양을 하였다.
본배양 4일째에 첨가한 유기 아민화합물을, L-티로신으로 한 것 이외에는, 제 11 실시예와 동일하게 본배양을 하였다.
제 9 실시예와 같이 조(粗)정제를 행하여, 310㎎의 건고물을 얻었다. 이것에 MeOH를 첨가하여 100㎎/㎖의 용액으로 만든 후에, 제 9 실시예와 동일하게 전처리를 하였다. 역상 HPLC는, 전개조건 이외에는 제 19 실시예와 동일하게 수행하였다. 전개용매로서는, 0.1% 포름산과 메탄올을 이용하고, 메탄올 농도를 70%로부터 80%로, 30분간에 걸쳐서 직선적으로 증가시켰다. 유지시간 21~23분의 피크를 분취하였다. 얻어진 획분을 제 19 실시예와 동일하게 정제하여, 화합물 I-26의 정제물 53.94㎎을 얻었다.
화합물 I-26의 특성을 아래와 같이 하여 확인하였다.
MALDI-TOF-MS, UV 및 FT-IR은, 제 9 실시예와 동일하게 측정하였다.
NMR은, Alpha600(JEOL)을 이용하여, 1H 600MHz, 13C 150MHz, 40℃에서 측정하였다. 샘플은 약 30㎎/㎖의 DMSO-d6용액으로 하였다.
화합물 I-26의 물리화학적 성질을 아래에 나타내었다.
분자식 C32H39NO7
MALDI-TOF-MS(m/z)
실측치(M+H)+ : 550.4594
계산치 : C32H40NO7에 대해 550.2805
UV λmax㎚(ε) 215(39,050), 261(8,690), 297(sh)(2,530)
IR νmax(NaCl)㎝-1 3379, 2922, 2854, 1707, 1664, 1514, 1464, 1363, 1221, 1167, 1074
NMR
Figure 112008016243244-PCT00048
[제 30 실시예]
상기와 같이 하여 얻어진 각종 트리프레닐페놀화합물에 대해, 우로키나아제 촉매에 의한 플라스미노겐(plg) 활성화를 촉진하는 활성으로서, 혈전용해활성에 대해 아래와 같이 하여 성능을 평가하였다.
또한, 비교예로서는 오르니플라빈(SMTP-7)을 이용하였다. 각 화합물은 아래와 같다.
화합물 No. 첨가 아민 비고
I-1 p-아미노페놀 SMTP-18
I-2 p-아미노안식향산 SMTP-19
I-3 ｍ-아미노안식향산 SMTP-20
I-4 o-아미노안식향산 SMTP-21
I-5 4-아미노살리실산 SMTP-22
I-6 4-아미노-3-히드록시안식향산 SMTP-23
I-7 3-히드록시안트라닐산 SMTP-24
I-8 3-아미노살리실산 SMTP-25
I-9 5-아미노살리실산 SMTP-26
I-10 3-아미노-4-히드록시안식향산 SMTP-27
I-11 5-히드록시안트라닐산 SMTP-28
I-16 아데닌 SMTP-32
I-17 5-아미노-2,3-디히드로-1,4-프탈라진디온 SMTP-36
I-18 1-아미노-2-나프톨-4-설폰산 SMTP-37
I-19 p-설파닐산 SMTP-42
I-20 L-페닐글리신 SMTP-43
I-21 D-페닐글리신 SMTP-43D
I-22 L-4-히드록시-페닐글리신 SMTP-44
I-23 D-4-히드록시-페닐글리신 SMTP-44D
I-24 DL-3-히드록시-페닐글리신 SMTP-45-I
I-25 DL-3-히드록시-페닐글리신 SMTP-45-II
I-26 L-티로신 SMTP-14
오르니플라빈 오르니틴 비교예
X-1 세린 비교예
X-2 페닐알라닌메틸에스테르 비교예
Figure 112008016243244-PCT00049
Figure 112008016243244-PCT00050
Figure 112008016243244-PCT00051
Figure 112008016243244-PCT00052
Figure 112008016243244-PCT00053
Figure 112008016243244-PCT00054
플라스민이 합성발색기질 VLK-pNA(Val-Leu-Lys-p-니트로아닐리드)의 펩티드 결합을 절단하고, p-니트로아닐린(pNA)을 생성하는 것을 이용하여, pNA의 405㎚에서 흡수되는 노란색의 발색을 측정함으로써, 샘플의 플라스미노겐 활성화 촉진 활성을 측정한다. 측정기로서는 MTP-500형 마이크로 플레이트 리더(코로나 전기)를 이용하고, 96-웰의 둥근 바닥 마이크로 플레이트에서 측정을 하였다.
측정조건은 카이네틱 측정 37℃, 듀얼 파장 405㎚(activity)-595㎚(bac㎏round)에서 1분마다 60회 측정하였다.
정제한 샘플은, DMSO용액 혹은 나트륨염의 수용액으로 하였다. 이것을 TBS/T(50mM Tris-HCl, 100mM NaCl 및 0.01% Tween 80, pH 7.4)로 희석하여 측정샘플로 하였다. 샘플 15μl에, 반응액(TBS/T에 의해 각각 최종농도가 0.1mM VLK-pNA, 50nM Glu-plg, 50U/㎖ u-PA가 되도록 조제된 것)을 각각 35μl 첨가하여, 50μl/웰이 되게 하고, 각 농도를 3회 연속하여 측정하였다.
또한, 블랭크로서 u-PA를 포함하지 않는 반응액을 이용하여 반응을 행하고, 그 값을 상기의 반응에서 얻어진 값으로부터 뺐다. 시간의 제곱에 대한 흡광도를 플롯팅하여, 그 기울기를 반응 초속도(初速度)로 하고, 각종 트리프레닐페놀화합물을 첨가하지 않은 것과 대조하여 비교함으로써, 각 화합물의 활성의 정도로 삼았다.
「10배 촉진 활성농도」는, SMTP화합물을 포함하지 않는 반응액(대조)을 이용했을 때의 값을 1이라 하였을 경우에 10배의 촉진 활성이 되는 농도를 나타낸다. 또한, 「최대 촉진 활성」은, SMTP화합물에 의한 플라스미노겐 활성화의 촉진이 최 대가 되는 농도를 나타낸다.
결과를 표 24에 나타내었다.
Figure 112008016243244-PCT00055
I-1~I-11, I-16~I-19의 트리프레닐페놀화합물은, 아미노페놀 혹은 아미노안식향산, 아데닌, 아데노신, 아미노디히드로프탈라진디온, 아미노나프톨설폰산, 설파닐산 또는 이들의 유도체를 첨가함으로써 얻어진 것이다. 이들 화합물에서는, 카르복시기 또는 수산기 등을 치환기로서 가지는 방향족기가, 트리프레닐페놀 골격에 직접 연결되어 있다.
또한 I-20~I-26의 트리프레닐페놀화합물은, 페닐글리신, 티로신을 첨가함으로써 얻어진 것이다. 이들 화합물에서는, 방향고리와 트리프레닐페놀 골격과의 사이에 메틸기가 1개 또는 2개로 되어 있다.
표 24에 나타낸 바와 같이, 이들 화합물은 모두, 플라스미노겐 활성화 촉진 활성이 인정되어, 오르니플라빈과 마찬가지로 혈전용해제로서 이용가능하며, 또한, 이들 화합물은 모두 저분자량의 화합물이기 때문에, 오르니플라빈보다 양호한 흡수성이 기대된다.
또한, 특히 화합물 I-2, I-5, I-8, I-20, I-24, I-26은, 오르니플라빈과 동등하거나 또는 그 이상의 높은 플라스미노겐 활성화 촉진 활성을 나타내고 있으며, 이는, 이들 화합물이 흡수성의 관점에서 오르니플라빈보다 양호한 혈전용해제로서 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이에 따라 본 실시예의 화합물은, 흡수가 잘 되고 높은 활성을 가지는 효과적인 혈전용해제로서 이용가능함이 명백하다.

Claims (20)

  1. 하기의 식 (I)로 표시되며, 선광도가 (-)인 트리프레닐페놀화합물:
    〔화학식 1〕
    Figure 112008016243244-PCT00056
    (식 중, X는 -CHY-(CH3)2Z이며, Y 및 Z는, 각각 -H 또는 -OH이거나, 함께 단일결합을 형성한다.)
  2. 제 1항에 있어서,
    하기의 식 (I-A)로 표시되는 트리프레닐페놀화합물:
    〔화학식 2〕
    Figure 112008016243244-PCT00057
  3. 하기의 일반식 (II)로 표시되는 트리프레닐페놀화합물:
    〔화학식 3〕
    Figure 112008016243244-PCT00058
    (식 중 R1은, 카르복시기, 수산기, 설폰산기 및 제2 아미노기로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나를 치환기로서 혹은 치환기의 일부로서 가지는 방향족기, 또는 제2 아미노기를 포함하며 또한 질소를 포함할 수 있는 방향족기를 나타낸다. X는 -CHY-(CH3)2Z이며, Y 및 Z는, 각각 -H 또는 -OH이거나, 함께 단일결합을 형성한다.)
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 방향족기가, 하기의 일반식 (II-1)으로 표시되는 트리프레닐페놀화합물:
    〔화학식 4〕
    Figure 112008016243244-PCT00059
    (식 중 R2 및 R3는 각각 수소원자, 카르복시기, 수산기 혹은 설폰산기, 또는 서로 결합하여 제2 아미노기를 포함하는 환상 구조기를 나타내나, 동시에 수소원자가 되는 경우는 없다.)
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서,
    상기 방향족기가, 하기로부터 선택되는 트리프레닐페놀화합물:
    〔화학식 5〕
    Figure 112008016243244-PCT00060
  6. 하기의 일반식 (III)으로 표시되는 트리프레닐페놀화합물:
    〔화학식 6〕
    Figure 112008016243244-PCT00061
    (식 중 R4는, 하기의 일반식 (III-1)으로 표시되는 방향족 아미노산 잔기를 나타내고, X는 -CHY-(CH3)2Z이며, Y 및 Z는, 각각 -H 또는 -OH이거나, 함께 단일결합을 형성한다:
    〔화학식 7〕
    Figure 112008016243244-PCT00062
    식 중 R5는 있어도 되고 없어도 되는 수산기를 나타내며, n은 0 또는 1의 정수를 나타낸다.)
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 식 중 R4가, 페닐글리신, 티로신 또는 이들의 유도체의 잔기인 트리프레닐페놀화합물.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 식 중 R4가, 하기로부터 선택되는 트리프레닐페놀화합물:
    〔화학식 8〕
    Figure 112008016243244-PCT00063
  9. 제 3항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 기재된 트리프레닐페놀화합물을 유효성분으로서 포함하는 혈전용해촉진제.
  10. 제 3항에 기재된 트리프레닐페놀화합물을 제조하는 제조방법으로서,
    아미노페놀, 아미노안식향산, 아데닌, 아데노신, 아미노디히드로프탈라진디온, 아미노나프톨설폰산, 설파닐산 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 첨가 아민화합물을 포함하는 배양액 중에서 사상균을 배양하는 배양공정과,
    배양공정 후의 배양물로부터, 제 6항에 기재된 트리프레닐페놀화합물을 분리하는 분리공정을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 첨가 아민화합물이, 아미노안식향산, 아미노살리실산, 아미노히드록시안식향산, 히드록시안트라닐산, 아미노디히드로프탈라진디온, 아미노나프톨설폰산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나임을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제 6항에 기재된 트리프레닐페놀화합물을 제조하는 제조방법으로서,
    방향족 아미노산 또는 그 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 첨가 아민화합물을 포함하는 배양액 중에서 사상균을 배양하는 배양공정과,
    배양공정 후의 배양물로부터, 제 6항에 기재된 트리프레닐페놀화합물을 분리하는 분리공정을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 첨가 아민화합물이, 페닐글리신, 티로신 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나임을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제 9항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사상균의 배양공정이,
    아민화합물의 함유량이 0.5질량%이하인 제한배지에 의한 제 1 배양공정과,
    배양중기 이후의, 첨가 아민화합물을 함유하고 있는 생산용 배지에 의한 제 2 배양공정을 포함하는 제조방법.
  15. 트리프레닐페놀화합물을 제조하는 제조방법으로서,
    사상균을, 아민화합물의 종류 및 양 중 적어도 한 쪽이 제한된 제한배지에 의한 제 1 배양공정에서 배양하고, 배양중기 이후에, 아민화합물을 함유하고 있는 생산용 배지에 의한 제 2 배양공정에서 배양하는 단계, 및
    상기 제 2 배양공정 후의 배양물로부터 트리프레닐페놀화합물을 얻는 단계를 포함하는 트리프레닐페놀화합물의 제조방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 제 1 배양공정에서 사용되는 제한배지가 0.5질량%이하의 아민화합물을 포함하며, 상기 생산용 배지가 유기 아민화합물을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 제 1 배양공정에서 사용되는 제한배지가 0.5질량%이하의 유기 아민화합물을 포함하고, 상기 제 2 배양공정에서 사용되는 생산용 배지가 무기 제1아민화합물을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
  18. 제 17항에 있어서,
    상기 제한배지가 무기 제1아민화합물을 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
  19. 제 9항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제한배지 및 생산용 배지가, 마그네슘, 코발트, 철, 칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종류의 금속이온을 더 포함함을 특징으로 하는 제조방법.
  20. 제 9항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사상균이, 스타치보트리스 마이크로스포라(Stachybotrys microspora) IFO30018임을 특징으로 하는 제조방법.
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