JP5224334B2 - トリプレニルフェノール化合物及び血栓溶解促進剤 - Google Patents

Description

本発明は、トリプレニルフェノール化合物及び血栓溶解促進剤に関する。

トリプレニルフェノール骨格を有する微生物代謝産物には、重要な生理活性を有するものがある。例えば、糸状菌から得られた特定のトリプレニルフェノール化合物は、血栓溶解促進作用や、血管新生抑制作用といった生体に重要な現象に対する生理活性作用を有することが知られている（特許文献１〜３）。
また、上記トリプレニルフェノール化合物とは立体構造が異なる他のトリプレニルフェノール化合物として、特許文献４には、育毛活性を有するトリプレニルフェノール化合物が開示されている。また、非特許文献１には、抗菌活性及び抗真菌活性を有するトリプレニルフェノール化合物が開示されている。

糸状菌を用いた培養によって得られるトリプレニルフェノール化合物は、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）のコンフォメーション変化を導き、この結果、プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ）による活性化の感受性とプラスミノーゲンのフィブリン結合能を増加させ、その結果血栓溶解を促進することが示唆されている（非特許文献２）。アミノ酸としてオルニチンを添加したときに得られるトリプレニルフェノール骨格を２つ有する化合物（以下、オルニプラビンという）は、特にこのような血栓溶解促進作用が顕著に強いことが知られている（特許文献２）。
このように、トリプレニルフェノール骨格を有する化合物は、その立体構造や置換基によって多様な活性を発揮するため、その利用価値が高い。

これら多様な活性型のトリプレニルフェノール化合物は、複雑な構造を有しているためより効率よく得ることが要請されている。このような製造方法としては、微生物を培養することによって製造する方法が開発されている（特許文献１〜３）。
その一方で非特許文献３及び特許文献５には、クロマンラクタム中のラクタム窒素原子に結合する側鎖を有しないトリプレニルフェノール化合物類縁体を開示している。この類縁体は、血栓溶解促進作用を示さず、抗菌活性を有するものであり、クロマンラクタム窒素原子に側鎖を有する化合物を合成する際に中間体として利用可能であると示されている。

特開２００２−６５２８８号公報 特開２００４−２２４７３７号公報 特開２００４−２２４７３８号公報 国際公開９８／５６９４０号パンフレット 国際公開２００７／１１１２０３号パンフレット J. Org. Chem., (1992), Vol.57, pp.6700-6703 FEBS Letter, (1997) Vol.418, pp.58-62 J. Antibiot., (2007) 60(7), pp.463-468

一般に、血栓溶解剤や凝固阻害剤の副作用は出血傾向をもたらすことである。ｔＰＡなどの血栓溶解剤に関しては、フィブリン親和性を高めることでこの解決が図られている。一方、上述のトリプレニルフェノール化合物はプラスミノーゲンの活性化を促進する作用と、プラスミノーゲンのフィブリンへの結合の両者を促進する活性を併せもつ。しかしながら、従来のトリプレニルフェノール化合物は相対的活性の比較において、プラスミノーゲンのフィブリンへの結合を促進する活性に対して、プラスミノーゲンの活性化を促進する活性に優れるものであった。血栓溶解を適切に発揮させるには、この相対的活性の比較において、プラスミノーゲンのフィブリンへの結合を促進する活性を高めて、局所的に血栓溶解を生じさせることが必要であった。

従って、本発明の目的は、相対的活性の比較において、プラスミノーゲンの活性化を促進する活性に対してプラスミノーゲンのフィブリンへの結合を促進する活性に優れた新規なトリプレニルフェノール化合物を提供すること、及びこれを含む血栓溶解促進剤を提供することである。

本発明のトリプレニルフェノール化合物は、下記式（Ｉ）（式中、Ｘは−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ_３）_２Ｚであり、Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ又は−ＯＨであるか、一緒になって単結合を形成し、Ｌ^１はカルボキシル基を有する炭素数１〜４のアルキレン基である連結基を表し、Ｌ^２は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−で示される連結基を表し、Ｒは下記の式（II）で示される多複素環基を表す。）で表されるトリプレニルフェノール化合物。

上記式中Ｌ^１の炭素数が４であることが好ましい。
本発明のトリプレニルフェノール化合物は、好ましくは、下記式（Ｉ−Ａ）又は（Ｉ−Ｂ）で表されるものである。

本発明の血栓溶解剤は、上記トリプレニルフェノール化合物を有効成分として含むものである。

本発明によれば、相対的活性の比較において、プラスミノーゲンの活性化を促進する活性に対してプラスミノーゲンのフィブリンへの結合を促進する作用を高めた新規なトリプレニルフェノール化合物、及びこれを含む血栓溶解促進剤を提供することができる。

本発明のトリプレニルフェノール化合物は、上記式（Ｉ）（式中、Ｘは−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ_３）_２Ｚであり、Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ又は−ＯＨであるか、一緒になって単結合を形成し、Ｌ^１はカルボキシル基を有する炭素数１〜４のアルキレン基である連結基を表し、Ｌ^２は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−で示される連結基を表し、Ｒは上記式（II）で示される多複素環基を表す。）で表されるトリプレニルフェノール化合物である。

本発明のトリプレニルフェノール化合物は、従来のトリプレニルフェノール化合物と異なり、相対的活性の比較において、プラスミノーゲンの活性化を促進する活性に対してプラスミノーゲンのフィブリンへの結合を促進する作用が強く、その結果、組織に沈着したフィブリン上にプラスミノーゲンが濃縮され、局所的に効果を発揮することができる。

また、本発明のトリプレニルフェノール化合物では、Ｒで表される多複素環基を有するので、この多環複素環に基づく蛍光発光が可能であり、この結果、トリプレニルフェノール化合物全体を蛍光色素として作用の解析や薬剤の吸収、動態、代謝の研究に利用することができる。

一般式（Ｉ）中、Ｙ及びＺは、得られるトリプレニルフェノール化合物の活性の観点から、一緒になって単結合を表すものであることが好ましい。
また一般式（Ｉ）中、Ｌ^１で表される連結基におけるアルキレン基の炭素数は、トリプレニルフェノール化合物の活性の観点から、２以上であることが好ましく、４であることがより好ましい。またＬ^１中のカルボキシル基は、少なくとも１つ存在していればよく、２つ以上が存在していてもよく、またアルキレン基のどの部位に存在していてもよいが、トリプレニルフェノール化合物の活性の観点から、カルボキシル基を１つ有するものであることが好ましく、トリプレニルフェノール骨格のクロマンラクタム窒素原子から遠い部位にあることが更に好ましい。
一般式（Ｉ）中、Ｌ^２で表される連結基は、トリプレニルフェノール化合物の活性の観点から、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−である。

本発明のトリプレニルフェノール化合物においてクロマンラクタム窒素原子に連結する好ましい側鎖の具体例としては、以下のものを挙げることができる。

本発明のトリプレニルフェノール化合物としては、活性の観点から以下に示す、式（Ｉ−Ａ）又は（Ｉ−Ｂ）で表される化合物であることが特に好ましい。本発明において下記式（Ｉ−Ａ）の化合物をＳＭＴＰ−４８、式（Ｉ−Ｂ）の化合物をＳＭＴＰ−４９と称する場合がある。

本発明のトリプレニルフェノール化合物は、化学合成による化学的製造方法と生物を利用した生物学的製造方法のいずれによっても得ることができる。
化学合成で本発明のトリプレニルフェノール化合物を製造する場合には、製造効率の観点から、トリプレニルフェノール骨格におけるクロマンラクタム窒素原子に側鎖を有しない中間体を利用することが好ましい。このような中間体としては、例えばＷＯ２００７／１１１２０３号に開示されているものを挙げることができる。

生物学的製造方法により本発明のトリプレニルフェノール化合物を製造するには、生物として糸状菌を利用することができ、製造効率の観点から好ましくは、スタキボトリス属の糸状菌であり、スタキボトリス・ミクロスポラ（Stachybotrys microspora）であることが更に好ましく、より好ましくはスタキボトリス・ミクロスポラ（S. microspora）ＩＦＯ３００１８株が挙げられる。

生物学的製造方法では、上記糸状菌に特定の窒素化合物を添加した培地で培養することを含む方法であることが、製造効率の観点からより、容易に得ることができる。このような製造方法としては前述のＷＯ２００７／１１１２０３号に開示されているものを挙げることができる。
この製造方法を簡単に説明すれば、後述する特定の添加アミン化合物を含む培養液中で糸状菌を培養する培養工程と、培養工程後の培養物から、上記トリプレニルフェノール化合物を分離する分離工程とを含むものである。
この添加アミン化合物は、糸状菌の培養工程中に存在していればよく、培養初期から存在させてもいが、生産効率の観点から、培養中期に添加されることが好ましい。

培養中期に添加アミン化合物を添加する場合には、前記糸状菌の培養工程が、アミン化合物の含有量が０．５質量％以下の制限培地による第１の培養工程と添加アミン化合物を含有している生産用培地による第２の培養工程と、を含むことが好ましい。
第１の培養工程で使用する培地として、アミン化合物の含有量が０．５質量％に制限された制限培地を用いた場合、第２の培養工程に移る培養中期以降に、従来よりも大量の中間体化合物を得ることができる。またこのように中間体化合物を大量に生成してから、アミノ安息香酸又はそれら誘導体を含む生産用培地による第２の培養工程を実行することにより、効率よく且つ選択性よく目的とするトリプレニルフェノール化合物を得ることができる。なお、本明細書において「アミン化合物」とは、特に断らないかぎり、添加アミン化合物も包含する。

制限培地中に含有可能なアミン化合物は、制限培地での糸状菌成育のための窒素源、成育促進因子、あるいはトリプレニルフェノール化合物前駆体の生産促進因子として作用する。添加の形態としては、酵母エキス、ブイヨン、ペプトン、トリプトン、ソイビーンミール、ファーマメディア、コーンスティープリカー、魚肉エキス等の天然の混合物として、あるいは精製化合物として利用することができる。天然の混合物は多種のアミン化合物を含有するため、制限培地ではその量を制限することが好ましい。
この場合、アミン化合物は、制限培地の全容量に対して０．５質量％以下、菌の生育、生産量及び生産の選択性の観点から好ましくは、０．０１〜０．５質量％、更に好ましくは０．１質量％〜０．３質量％とすることができる。０．５質量％を超える場合には、目的とする化合物以外のものが同時に生成されて選択性に劣り、生産効率も下がる場合があり、好ましくない。一方、０．０１質量％未満では、糸状菌の活性に劣る場合があり好ましくない。また、精製化合物をアミン化合物として添加する場合は、生産に用いる糸状菌の成育とトリプレニルフェノール化合物前駆体の生産が良好に起こる範囲の量と種類が用いられる。

培養中期以降の第２の培養工程では、添加アミン化合物を含有している生産用培地が用いられる。ここで「培養中期」とは、第１の培養工程を確実に継続させるための培養開始からの所定期間、好ましくは培養開始後２日目以降、更に好ましくは４日目以降とすることができる。この期間が短すぎる、例えば培養開始直後に生産用培地による培養を開始すると、目的とするトリプレニルフェノール化合物を得るために必要な中間体化合物の量が不充分となることがあり、効率よくトリプレニルフェノール化合物を生成することができない場合がある。

第２の培養工程で用いられる生産用培地は、目的のトリプレニルフェノール化合物を得るための添加アミン化合物を含有する以外は、制限培地と同一の組成で構成することができる。このため、第２の培養工程における培養は、第１の培養工程で使用した制限培地に、添加アミン化合物を添加することによって実施してもよく、改めて調製した添加アミン化合物含有培地をそのまま添加してもよい。

目的のトリプレニルフェノール化合物を得るための添加アミン化合物としては、Ｎ_δ−ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−５−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ、Ｎ_α−ＦＩＴＣ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ等を挙げることができる。このＮ_δ−ＦＩＴＣ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ等を生産用培地に添加することにより、糸状菌がクロマンラクタム窒素原子の側鎖として取込み、本発明のトリプレニルフェノール化合物が生成される。
第２の培養工程での生産用培地に含有可能な添加アミン化合物は、目的とするトリプレニルフェノール化合物を得るために必要な量で培地中に存在していればよく、培地の全容量の５質量％以下、生産量の観点から好ましくは０．０１質量％〜１質量％、更に好ましくは０．１質量％〜０．５質量％で用いられる。

制限培地及び生産用培地には、上記成分に加えて、微生物による化合物の生成を促進するためなどを目的として、上記微生物の培養に通常用いられている合成培地の添加成分を含む。本制限培地に添加可能な添加成分としては、例えばグルコース、シュークロース、デキストリン、動物油、植物油などの栄養源、ビタミン類、例えば塩素、硝酸、硫酸、リン酸、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、及びその他のイオンを生成しうる無機塩類を挙げることができる。

無機塩類のうち、特に金属イオンを生成しうる無機塩類、生成物の生産量の増大や生産効率の観点から、好ましく制限培地に添加することができる。このような金属イオンとしては、マグネシウムイオン、コバルトイオン、鉄イオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン等を挙げることができる。
これらの金属イオンの添加量は、生成物の生産量や菌の生育の観点からそれぞれ培地の全容量に対して、マグネシウムイオンの場合には硫酸マグネシウム７水和物として０．００１質量％〜０．５質量％（より好ましくは０．０１質量％〜０．１質量％）、コバルトイオンの場合には塩化コバルト６水和物として０．００００１質量％〜０．０１質量％（より好ましくは０．０００１質量％〜０．００５質量％）、鉄イオンの場合には硫酸鉄（II）７水和物として０．０００１質量％〜０．１質量％（より好ましくは０．０００５質量％〜０．０５質量％）、カルシウムイオンの場合には塩化カルシウム２水和物として０．００００１質量％〜０．１質量％（より好ましくは０．０００１質量％〜０．０５質量％）、カリウムイオンの場合にはリン酸二カリウムあるいは硝酸カリウムとして０．００２質量％〜２質量％（より好ましくは０．０５質量％〜０．５質量％）、ナトウムイオンの場合にはリン酸二ナトウムあるいは硝酸ナトウムとして０．００２質量％〜２質量％（より好ましくは０．０５質量％〜０．５質量％）、とすることができる。
上記無機塩類及び金属イオンは、これらを単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

制限培地による第１の培養工程は、効率よく目的とするトリプレニルフェノール化合物を得るために充分な量の中間体化合物が得られる培養中期まで継続する。トリプレニルフェノール化合物の効率的な製造の観点から、生産用培地による第２の培養工程は、好ましくは糸状菌の培養開始後２日以降、更に好ましくは培養開始後４日から実施される。
第２の培養工程は、生成されたトリプレニルフェノール化合物の量が最大のときに培養を停止することによって終了する。第２の培養工程の期間は、微生物の状態及び培養系の大きさによって異なるが、一般に１日〜５日、生産量の観点から好ましくは１〜３日間である。

本製造方法における第１及び第２の培養工程は、通常、上記培地を用いて静置培養または振盪培養による。振盪培養を適用する場合には、真菌の培養で通常適用される速度で行えばよく、例えば高崎科学社製、ＴＢ−２５Ｓ（振幅７０ｍｍ）のロータリーシェイカーであれば、５００ｍｌ容のフラスコ中１００ｍｌの培地量とした場合に３０ｒｐｍ〜２４０ｒｐｍ、好ましくは１６０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍとすることができる。
また第１及び第２の培養工程における培養温度は、種々の温度における真菌の生育条件に応じて適宜設定することができるが、一般に４〜５０℃、好ましくは１５〜３７℃、より好ましくは２０〜３０℃、最も好ましくは室温（２５℃）である。この範囲外では、効率よくトリプレニルフェノール化合物を生成することができない。またそれぞれ用いられる培地のｐＨは、一般に３〜９、好ましくは５〜６とすることができる。

なお、第１及び第２の培養工程よりも前に、微生物による生成能を安定化させるために、予備培養工程を設けてもよい。予備培養工程で用いられる培地は、微生物を維持するために用いられる通常の生育培地であってもよい。

得られたトリプレニルフェノール化合物は、培養物から回収・精製することによって得ることができる。回収・精製方法としては、培地中に放出されたトリプレニルフェノール化合物を回収・精製できる手段であればいずれであってもよく、液体クロマトグラフィー、溶媒抽出、結晶化等を挙げることができる。生成物の回収・精製は、回収効率の観点から２段階以上の多段階で行うことが好ましい。
これらの回収・精製方法においては、トリプレニルフェノール化合物が脂溶性であることを利用して、溶媒等を選択することが好ましい。
トリプレニルフェノール化合物を培養物から回収・精製する際には、予め培養物から菌体を除去することが好ましい。その際には、培養物にメタノールなどの溶媒を加えて菌体内のトリプレニルフェノール化合物を抽出し、その後の菌体の除去には、濾過等を用いればよい。

＜血栓溶解促進剤＞
本発明の血栓溶解促進剤は、上記トリプレニルフェノール化合物を有効成分として含むことを特徴とするものである。ここで上記トリプレニルフェノール化合物は、上述したものを単独で又は組み合わせて用いてもよい。
上記トリプレニルフェノール化合物は、本血栓溶解剤中では、遊離形態、薬学的に許容可能な塩又はエステルなど、医薬として通常適用可能な形態で本血栓溶解剤に含有されることができる。

また本血栓溶解剤は、各種投与形態に応じて適宜剤型を変更することができる。経口投与形態としては、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤又はシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与形態としては、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、貼付剤等を挙げることができる。
これらの形態を維持するために、これらの用途に使用可能な周知の溶媒、賦形剤等の添加剤を含むことができる。

本発明の血栓溶解剤は、年齢、体重、症状に応じて適切な投与量で投与することができ、例えば静脈内投与の場合には、成人１日あたり有効成分量として、１から２５ｍｇ／ｋｇの投与、経口投与の場合には、成人１日あたり有効成分量として、２から２００ｍｇ／ｋｇの投与が好ましく、投与期間は、年齢、症状に応じて任意に定めることができる。

また本発明の上記トリプレニルフェノール化合物は、側鎖として上記式（ＩＩ）で示される多環複素環を有する。この多環複素環は、フルオレセイン誘導体の残基であり、この多環複素環に基づく蛍光を発光することができる。これにより、本トリプレニルフェノール化合物をプラスミノーゲンに対する標識化合物として使用し、プラスミノーゲンの局在及び挙動を光学的に検出することができる。また薬剤の吸収、動態、代謝の研究用試薬としても使用することができる。
このような標識化合物として使用する場合には、当業者であれば使用濃度や使用形態を適宜選択することができるが、一般に、本発明のトリプレニルフェノール化合物を０．０１μＭ〜１ｍＭの使用濃度とすることができる。

以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、質量／容量基準である。

［実施例１］
化合物ＳＭＴＰ−４８の合成
添加するアミンは以下の方法により合成した。Ｎ_δ−ＦＩＴＣ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ及びＮ_α−ＦＩＴＣ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅは、ＦＩＴＣの１０当量にあたるＬ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅを０．４Ｍ ホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ１１）４ｍｌに溶解し、そこに同緩衝液に溶解した５０ｍｇ／ｍｌ ＦＩＴＣを１２ｍｌ滴下することで作製した。３０分攪拌し、十分反応させた。反応産物は逆相ＨＰＬＣを用いて次の条件で精製した。カラム；Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＰＲＥＰ−ＯＤＳ（直径３０×２５０ｍｍ）（ジーエルサイエンス株式会社，東京，日本）、温度；４０℃、流速；２５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長；２６０ｎｍ、展開溶媒；０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸とメタノールで行い、メタノール濃度を４０分で０−６０％までｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ、保持時間２７．７分と３１．７分のピークを分取した。保持時間２７．７分の画分を濃縮乾固後、４９０ｍｇのＮ_α−ＦＩＴＣ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅを得た。また、保持時間３１．７分の画分をピークを濃縮乾固後１２０ｍｇのＮ_δ−ＦＩＴＣ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅを得た。

Stachybotrys microspora ＩＦＯ３００１８株（財団法人発酵研究所）の胞子を種培養用培地１００ｍｌの入った５００ｍｌ容三角フラスコに接種し、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で４日間にわたり種培養を行った。種培養用培地は、グルコース（４％）、大豆ミール（０．５％）、乾燥ブイヨン（０．３％）、粉末酵母エキス（０．３％）を水に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調製し、消泡剤ＣＢ４４２（０．０１％）（０．１ｇ／ｍｌアセトン溶液を１ｍｌ／Ｌ添加）（日本油脂化学，日本）を加え、培養器に１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ（１２１℃，１５ｍｉｎ）を行ったものを使用した。

この培養液５ｍｌを、本培養培地１００ｍｌの入った５００ｍ１容三角フラスコに接種し、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で５日間にわたり本培養を行った。
本培養用培地（制限培地）は、スクロース（５％），粉末酵母エキス（０．１％），ＮａＮＯ_３（０．３％）、Ｋ_２ＨＰＯ_４（０．１％）、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（０．０５％）、ＫＣ１（０．０５％）、ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ（０．０００２５％）、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ（０．００１５％）、ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ（０．０００６５％）を水に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調製し、消泡剤ＣＢ４４２（０．０１％）（０．１ｇ／ｍｌアセトン溶液を１ｍｌ／Ｌ添加）（日本油脂化学，日本）を加え培養器に１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ（１２１℃，１５ｍｉｎ）を行ったものを使用した。

接種した日を培養０日目とし、培養４日目（９６時間後）に１００ｍｇのＮ_δ−ＦＩＴＣ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅを１ｍｌのＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）に溶解させ培地に添加して生産用培地とし、培養を継続した。それから約２４時間後にメタノールを２００ｍｌ添加して、培養を終了した。その後、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で約３時間にわたり振盪して抽出を行った。

得られた培養抽出液３００ｍｌから、ブフナーロートを用いて菌体を除去し、培養上清を得た。水流ポンプによる減圧下、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮を行った。得られた培養抽出液３００ｍｌから、ブフナーロートを用いて菌体を除去し、培養上清を得た。水流ポンプによる減圧下、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮を行った。これにＭｅＯＨを加え、溶解した画分をLichrolut（登録商標）ＲＰ−１８（１００ｍｇ）（MERCK KGaA、Darmstadt，Germany）にて前処理を行った。逆相ＨＰＬＣはカラム；Inertsil PREP-ODS（直径３０×２５０ｍｍ）（ジーエルサイエンス株式会社，東京，日本）、温度；４０℃、流速；２５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長；２６０ｎｍ、展開溶媒；０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ギ酸を含む７５％メタノールで行い、保持時間１２．４分のピークを分取した。ロータリーエバポレーターを用いてメタノールを留去した後、凍結乾燥した。乾燥物にｎ−ヘキサンを加えて撹拌後遠心し、不溶物を回収した。この操作を３回行い、不溶物をメタノールで溶解後ろ過し、これを濃縮、乾固して化合物ＳＭＴＰ−４８の精製物１５．４ｍｇを得た。

化合物ＳＭＴＰ−４８の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、Voyager-DE STR（Applied Biosystem社）を用い、positive ion modeでα−シアノ−４−ヒドロキシケイヒ酸をマトリックスとして測定した。
ＵＶは、メタノール中で３２０ spectrophotometer（Hitachi）を用いて測定した。
ＦＴ−ＩＲは、ＪＩＲ−ＷＩＮＳＰＥＣ５０（ＪＥＯＬ）を用いた。アセトンに溶解した試料を岩塩に塗布して測定した。ＮＭＲは、Ａｌｐｈａ６００（ＪＥＯＬ）を用い、^１Ｈ ６００ＭＨｚ，^１３Ｃ １５０ＭＨｚで測定した。サンプルは約１０ｍｇ／ｍｌのａｃｅｔｏｎｅ−ｄ_６溶液とした。

化合物ＳＭＴＰ−４８の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ_４９Ｈ_５１Ｎ_３Ｏ_１１Ｓ
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 890.332
Calculated: 890.3323 for Ｃ_４９Ｈ_５２Ｎ_３Ｏ_１１Ｓ
ＵＶ λ_ｍａｘ nm (ε) 217 (101,560), 252 (sh) (36,640), 275 (sh) (28,103), 309 (sh) (6,759)
IR ν_ｍａｘ(NaCl) cm^−１ 3304, 2976, 2926, 2868, 1705, 1662, 1608, 1543, 1460, 1362, 1252, 1211, 1176, 1113, 1076, 999, 908, 850, 775, 680, 534

［実施例２］
化合物ＳＭＴＰ−４９の合成
添加するアミンは実施例１と同様に合成、精製した。
実施例１と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、Ｎ_α−ＦＩＴＣ−Ｌ−ｏｒｎｉｔｈｉｎｅとした以外は、実施例１と同様に本培養を行った。
得られた培養抽出液３００ｍｌから、ブフナーロートを用いて菌体を除去し、培養上清を得た。水流ポンプによる減圧下、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮を行った得られた培養抽出液３００ｍｌから、ブフナーロートを用いて菌体を除去し、培養上清を得た。水流ポンプによる減圧下、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮を行った。これにＭｅＯＨを加え、溶解した画分をLichrolut ＲＰ−１８（１００ｍｇ）にて前処理を行った。逆相ＨＰＬＣはカラム；Inertsil PREP-ODS（直径３０×２５０ｍｍ）、温度４０℃、流速；２５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２６０ｎｍ、展開溶媒；０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ギ酸を含む６５％メタノールで行い、保持時間９．４分のピークを分取した。ロータリーエバポレーターを用いてメタノールを留去した後、凍結乾燥した。乾燥物にｎ−ヘキサンを加えて撹拌後遠心し、不溶物を回収した。この操作を３回行い、不溶物をメタノールで溶解後ろ過し、これを濃縮、乾固して化合物ＳＭＴＰ−４９の精製物１９．６ｍｇを得た。

化合物ＳＭＴＰ−４９の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、及びＦＴ−ＩＲは、実施例１と同様に測定した。ＮＭＲは、Ａｌｐｈａ６００（ＪＥＯＬ）を用い、^１Ｈ ６００ＭＨｚ，^１３Ｃ １５０ＭＨｚで測定した。サンプルは約１０ｍｇ／ｍｌのａｃｅｔｏｎｅ−ｄ_６溶液とした。
化合物ＳＭＴＰ−４９の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ_４９Ｈ_５１Ｎ_３Ｏ_１１Ｓ
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 890.3320
Calculated: 890.3323 for Ｃ_４９Ｈ_５２Ｎ_３Ｏ_１１Ｓ
ＵＶ λ_ｍａｘ nm (ε) 216 (111,165), 253 (sh) (36,462), 275 (sh) (28,103), 309 (sh) (6,759)
IR ν_ｍａｘ(NaCl) cm^−１ 3288, 2970, 2926, 2862, 1705, 1612, 1458, 1367, 1333, 1244, 1180, 1113, 1076, 997, 904, 852, 773, 683, 540

［実施例３］
実施例１及び実施例２で得られたトリプレニルフェノール化合物ＳＭＴＰ−４８及びＳＭＴＰ−４９について、プラスミノーゲンのフィブリンに対する結合活性を以下のように行って性能を評価した。
なお、比較例としては、下記のＳＭＴＰ−１９（ＷＯ２００７／１１２０３号参照）を用いた。

ヨウ素ラベルプラスミノーゲン（^１２５Ｉ−プラスミノーゲン）は次のように調製した。ｉｏｄｅｇｅｎをコートしたポリプロピレンチューブに１０μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１．５μｌのＮａ^１２５Ｉ（１００ｍＣｉ／ｍｌ）および５０μｌの−プラスミノーゲン（４６．７４μＭ）を加え、１０分間氷上で反応させた。その後、０．５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）を５０μｌ加え、室温にて１５分間静置して反応を停止した。未反応のＮａ^１２５Ｉは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を用いて除いた。１ｍｌ容プラスチックシリンジに０．９ｍｌ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を充填（平衡化緩衝液はＰＢＳ／０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ）し、１６００ｇで４分間遠心し、^１２５Ｉ−プラスミノーゲンを回収した。比放射活性は約２５０ｃｐｍ／ｎｇであった。

プラスミノーゲンのフィブリンに対する結合は次のように評価した。ＰＢＳ（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解したフィブリノーゲンを２μｇ／ｗｅｌｌとなるように９６穴平底マイクロプレートに加え、３７℃下で３日間以上乾燥した。０．６８Ｕ／ｍｌ トロンビンのＰＢＳ溶液を７５μｌ加え、３７℃下で３時間〜２４時間反応させフィブリンプレートとした。１００μｌＰＢＳ／Ｔ（ＰＢＳ／０．０１％ Ｔｗｅｅｎ８０）で２回、２００μｌ ＰＢＳで１回洗浄し、５ｍｇ／ｍｌ ゼラチンを含むＰＢＳを２００μｌ加え、３７℃、１時間静置した。５０μｌの反応系に１００ｎＭ プラスミノーゲン（プラスミノーゲン中の^１２５Ｉ−プラスミノーゲンの割合は５０％）とサンプルを加え、３７℃、１時間インキュベートした。２００μｌ ＰＢＳで２回、１００μｌ ＰＢＳで１回洗浄した。０．２Ｍ ＮａＯＨ、２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム溶液５０μｌを加え３７℃、１５分間処理し、上清４０μｌの放射活性をγ−カウンターにより測定し、定量した。フィブリンとプラスミノーゲンの特異的結合は２００ｍＭ ６−アミノヘキサン酸存在下での測定値を減算することで算出した。

「２倍促進活性」は、ＳＭＴＰ化合物を含まない反応液（対照）を用いたときのフィブリンとプラスミノーゲンとの特異的結合の値を１とした場合にＳＭＴＰ化合物によるフィブリンとプラスミノーゲンとの特異的結合が２倍となる濃度を表す。また、「１０倍促進活性」は、ＳＭＴＰ化合物によるフィブリンとプラスミノーゲンとの特異的結合が１０倍となる濃度を表す。
結果を表３に示す。

表３に示されるように、ＳＭＴＰ−４８及びＳＭＴＰ−４９、これらの化合物のいずれも、プラスミノーゲンのフィブリンへの結合を促進する作用は、ＳＭＴＰ−１９と比較して強く、生体内でフィブリンへのプラスミノーゲンの結合を促進することにより、局所的な反応を導くことが示唆された。

［実施例４］
実施例１及び実施例２で得られたトリプレニルフェノール化合物ＳＭＴＰ−４８及びＳＭＴＰ−４９について、ウロキナーゼ触媒によるプラスミノーゲン活性化を促進する活性として、血栓溶解活性を、プラスミンへのプラスミノーゲンの変換率に基づいて以下のように評価した。
なお、比較例としてはＳＭＴＰ−１９（ＷＯ２００７／１１２０３号参照）を用いた。

反応系１５μｌにプラスミノーゲン１．５μＭ、ｕ−ＰＡ１００ Ｕｎｉｔ／ｍｌ、ａｐｒｏｔｉｎｉｎ １００ Ｕｎｉｔ／ｍｌとサンプルを加え、３７℃、１０分間反応した。サンプルバッファー（０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８、８％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、４０％ （ｗ／ｖ）ｓｕｃｒｏｓｅ、０．０４％（ｗ／ｖ）ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ、２０％（ｖ／ｖ）２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を５mｌ加え反応を停止し、９５℃下で２分間ボイルしたものをサンプルとし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。サンプル１５μｌを１０％ｇｅｌにアプライし、２５ｍＡ／ｇｅｌにて泳動した。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０により染色し、プラスミンのＡ鎖、Ｂ鎖及びプラスミノーゲンをＳｃｉｏｎ Ｉｍａｇｅ（Ｓｃｉｏｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて評価した。

結果を表４に示す。ここで、変換率は以下のように計算されている。
変換率＝（Ａ鎖＋Ｂ鎖）／（Ａ鎖＋Ｂ鎖＋プラスミノーゲン）。

表４に示すように、ＳＭＴＰ−４８及びＳＭＴＰ−４９には、プラスミノーゲン活性化促進活性が認められた。この活性はＳＭＴＰ−１９と同等か若干弱いものの血栓溶解剤として利用可能であることも示唆された。

このように、本実施例の化合物は、相対的活性の比較において、プラスミノーゲンの活性化を促進する活性に対してプラスミノーゲンのフィブリンへの結合を促進する活性に優れるため、生体内でフィブリンへのプラスミノーゲンの結合を上昇させ、その部位でプラスミノーゲンの活性化を促進することにより、局所的に血栓溶解を生じさせる効果的な血栓溶解剤として利用可能なことは明らかである。

Claims (4)

1. 下記式（Ｉ）（式中、Ｘは−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ_３）_２Ｚであり、Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ又は−ＯＨであるか、一緒になって単結合を形成し、Ｌ^１はカルボキシル基を有する炭素数１〜４のアルキレン基である連結基を表し、Ｌ^２は−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ−で示される連結基を表し、Ｒは下記の式（II）で示される多複素環基を表す。）で表されるトリプレニルフェノール化合物。
   
   
2. 前記式中Ｌ^１の炭素数が４である請求項１記載のトリプレニルフェノール化合物。
3. 下記式（Ｉ−Ａ）又は（Ｉ−Ｂ）で表されるトリプレニルフェノール化合物である請求項１記載のトリプレニルフェノール化合物。
   
4. 請求項１〜請求項３のいずれか１項記載のトリプレニルフェノール化合物を有効成分として含む血栓溶解促進剤。