JPH093070A - 線溶活性化物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記の式（式中、R¹, R², 及びR³はそれぞれ
独立に水素原子又は水酸基の保護基、例えばC_1-6アルキ
ル基を示す）で示される化合物及びその塩。 【化１】 【効果】 フィブリンに対するプラスミノゲンの結合を
促進する作用を有し、血栓溶解剤の有効成分として有用
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、フィブリンに対するプ
ラスミノゲンの結合を促進する作用を有し、血栓溶解剤
として有用な物質、並びに、その化合物の血栓溶解剤及
び血栓症の治療・予防剤としての用途に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】心筋梗塞や狭心症、脳梗塞などの虚血性
疾患の患者には非常に高率に血栓の形成が認められる。
血栓形成は Virchowの三原則、すなわち1)血管壁の変
化; 2)血流の変化; 及び3)血液性状の変化の３つの要素
により引き起こされると考えられている。血液および血
管壁を構成している血管内皮細胞は、通常は抗血栓性を
保っているが、何らかの刺激により血管内皮細胞が損傷
するとその部位が血栓性に傾き血栓が形成される。その
主たる原因として、粥状動脈硬化巣（粥腫）の関与が示
唆されており (Davis, M.J., and Thomas, A., Br. Hea
rt J., 53, pp.363-373, 1985)、粥腫部位での血管狭搾
や閉塞、及びそれに伴う血流の停滞や変化によって粥腫
に亀裂が入り血栓が形成されると考えられている。血管
内皮細胞が損傷すると、まずその部位で血小板の沈着及
び凝集が起こり、続いて内皮下組織と血液との接触によ
って開始される血液凝固系でスロンビンがフィブリノゲ
ンを限定分解してフィブリンが形成される。そして、フ
ィブリンが血小板を取り囲んで血栓が形成される。

【０００３】一方、形成されたフィブリンを分解する酵
素としてプラスミンの存在が知られている。プラスミン
は、tPA(組織プラスミノゲンアクティベーター）やuPA
(ウロキナーゼ）などのプラスミノゲンアクティベータ
ーなどの作用により、血液中に存在するプラスミノゲン
(PLG) のArg₅₆₀-Val₅₆₁ 部位が限定分解されて生成する
(Henkin, J. et al., Prog. Cardiovas. Diseases, 34,
pp.135-164, 1991)。通常、血液中ではプラスミンはほ
とんど生成せず、また、生成してもプラスミンの阻害剤
であるα₂-プラスミンインヒビターにより速やかに中和
される。しかしながら、血栓上では、tPA とプラスミノ
ゲンとが基質であるフィブリンに対して特異的な結合部
位で結合して濃縮されるので、みかけのKm値が低下して
血液中の数百倍の速度でプラスミンが生成することが知
られている (坂田 洋一, 最新医学, 45, pp.1342-134
6, 1990) 。

【０００４】現在、血栓症の治療にはuPA 、SK（ストレ
プトキナーゼ) 、tPA などのプラスミノーゲンアクティ
ベターが用いられている。しかしながら、uPA やSKは血
栓に対する親和性が低く(Hanaway, J., et al., Lance
t, 78, pp.886-889, 1986) 、循環血中のプラスミノゲ
ンを活性化してプラスミンに変換するために、生成した
プラスミンがα₂-アンチプラスミンによって失活しない
ように大量に投与する必要があり、また、大量投与した
場合には全身性出血を引き起こす場合がある。一方、tP
A は血栓に特異的に結合するため全身の線溶系に対する
影響が少ないことが報告されているが(Goldhaber, S.
Z., et al., Lancet, 78, pp.886-889, 1986) 、血中の
半減期が非常に短く（約５分: Bounameaux, H., et a
l., Thrombolysis, pp.86-91, 1985; M. Verstraete, e
t al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 235, pp.506-512,
1985) 、また、再閉塞率が高く過剰な投与は出血傾向を
招くことが知られている。

【０００５】従って、新たな作用機序に基づく血栓溶解
薬の開発が求められている。上記のような線溶系では、
フィブリンに対するプラスミノゲンの結合が上記の線溶
系の律速段階になっている可能性があり、フィブリンに
対するプラスミノゲンの結合を高めることによって、プ
ラスミンの生成を促進できる可能性がある。しかしなが
ら、従来、このような作用機序を有する血栓溶解剤は知
られていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、フィ
ブリンに対するプラスミノゲンの結合を促進することに
より線溶系を活性化させる作用を有する物質を提供する
ことにある。また、本発明の別の目的は、上記の物質を
有効成分として含む血栓溶解剤、及び血栓症の治療・予
防剤を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決すべき手段】本発明者らは上記の課題を解
決すべく鋭意努力した結果、Stachybotrys microspora
IFO 30018 株により生産される物質が上記の作用を有す
ること、並びに、この物質が血栓溶解剤や血栓症の治療
・予防剤の有効成分として極めて有用であることを見出
した。本発明は上記の知見を基にして完成されたもので
ある。すなわち本発明は、下記の式：

【化２】 （式中、R¹, R², 及びR³はそれぞれ独立に水素原子又は
水酸基の保護基を示し、化学式中の炭素原子に付された
数字は炭素番号を示す）で示される化合物を提供するも
のである。

【０００８】上記発明の好ましい態様によれば、R¹,
R², 及びR³がそれぞれ独立に水素原子又はC_1-6アルキル
基である上記化合物；及び、R¹, R², 及びR³が同時に水
素原子である化合物；R¹, R², 及びR³がそれぞれ独立に
アルキル基である化合物；R¹,R², 及びR³が同時にメチ
ル基である化合物が提供される。また、本発明の別の態
様によれば、上記の化合物を有効成分として含む血栓溶
解剤；上記の化合物を有効成分として含む血栓症の治療
及び／又は予防剤；上記の化合物を含むフィブリンに対
するプラスミノゲンの結合促進剤；並びに、上記の化合
物を含む線溶活性化剤が提供される。また、スタキボト
リス属に属しR¹, R², 及びR³が同時に水素原子である上
記化合物を産生する微生物を培養し、得られた培養物か
ら該化合物を分離・採取することを特徴とする、R¹,
R², 及びR³が同時に水素原子である上記化合物の製造方
法も提供される。

【０００９】上記式において、R¹, R², 及びR³はそれぞ
れ独立に水素原子又は水酸基の保護基を示す。水酸基の
保護基は特に限定されず、例えば、メチル基やエチル基
などのアルキル基；トリメチルシリル基、tert- ブチル
ジメチルシリル基などのアルキルシリル基；アセチル基
などのアルキルカルボニル基；トリフルオロアセチル基
などのハロゲン化アルキルカルボニル基；ベンゾイル
基、パラメトキシベンゾイル基などの置換若しくは無置
換のアリールカルボニル基；メトキシカルボニル基、エ
トキシカルボニル基などのアルコキシカルボニル基；ベ
ンジル基、パラメトキシベンジル基などのアラルキル基
など、当業者に利用可能ないかなる保護基を用いてもよ
い。

【００１０】これらのうち、好ましくはアルキル基、よ
り好ましくは炭素数 1〜6(C_1-6) のアルキル基を用いる
ことができる。アルキル基としては、直鎖, 環状, 若し
くは分枝を有するもののうちいずれを用いてもよい。例
えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピ
ル基、n-ブチル基、sec-ブチル基、tert- ブチル基、n-
ペンチル基、ネオペンチル基、n-ヘキシル基などは好ま
しいアルキル基である。本発明の化合物としては、R¹,
R², 及びR³が同時に水素原子を示す化合物、並びにR¹,
R², 及びR³がそれぞれ独立にC_1-6アルキル基である化合
物が好ましい化合物であり、より好ましい化合物は、
R¹, R², 及びR³が同時に水素原子を示す化合物、並びに
R¹, R², 及びR³が同時にメチル基を示す化合物であり、
特に好ましい化合物は、R¹, R², 及びR³が同時に水素原
子を示す化合物である。

【００１１】R³が水素原子を示す場合、本発明の化合物
はカルボキシル基を有しており、塩基付加塩を形成する
ことができる。従って、このような塩基付加塩も本発明
の範囲に包含される。このような塩基付加塩としては、
例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシ
ウム、リチウム等の金属塩やアンモニウム塩の他、メチ
ルアミン、ジメチルアミン、トリエチルアミンなどの有
機アミンの塩を挙げることができる。

【００１２】また、本発明の化合物は骨格中に２個の不
斉炭素を有しており、R¹, R², R³の種類によってはこれ
らに加えて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合
がある。従って、本発明の化合物には、これらの不斉炭
素に基づく光学異性体またはジアステレオ異性体が存在
するが、このようないかなる異性体も本発明の範囲に包
含されることはいうまでもない。例えば、純粋な形態の
光学異性体又はジアステレオ異性体、２以上の光学異性
体の任意の割合の混合物、ラセミ体、２以上のジアステ
レオ異性体の任意の割合の混合物などは、すべて本発明
の範囲に包含される。また、本発明の範囲には、遊離形
態または塩の形態の上記化合物と水若しくは任意の溶媒
により形成された任意の水和物若しくは溶媒和物が含ま
れる。

【００１３】本発明の化合物は、下記の実施例に詳細に
記載された方法により、スタキボトリス・ミクロスポラ
(Stachybotrys microspora) IFO 30018株から分離・採
取することができる。この株は、財団法人発酵学研究所
から何人も分譲を受けることが可能である。従って、本
発明の化合物は、実施例の方法を参照しつつ、あるいは
それらに適宜の修飾・改変を加えることにより、上記の
株から当業者が容易に製造することができる。もっと
も、本発明の化合物の製造方法は上記の株を用いた方法
に限定されることはなく、本発明の製造方法、すなわ
ち、スタキボトリス属に属し上記の化合物を産生するこ
とができる微生物を培養し、培養物から上記の化合物を
分離・採取する方法によっても製造可能である。例え
ば、培養によりR¹, R², 及びR³がいずれも水素原子の化
合物を製造し、３個の水酸基のうち１または２以上の任
意の水酸基を化学的にアルキル化してもよい。また、全
工程を化学的に合成することによっても製造可能であ
る。

【００１４】本発明の化合物は、フィブリンに対するプ
ラスミノゲンの結合力を高めることによって線溶系を活
性化させる作用を有する。従って、本発明の化合物は、
脳血栓や急性心筋梗塞などの血栓の形成により惹起され
る種々の血栓症の治療のために用いる血栓溶解剤、並び
に、種々の血栓症の治療及び／又は予防剤の有効成分と
して有用である。本発明の医薬の有効成分である上記化
合物、その薬学的に許容される塩、またはそれらの溶媒
和物若しくは水和物は、それ自体を医薬として患者に投
与してもよいが、一般には、これらの有効成分の１種又
は２種以上を含む医薬組成物を製造して患者に投与する
ことが好適である。このような医薬組成物として、錠
剤、カプセル剤、細粒剤、散剤、丸剤、トローチ、舌下
剤、または液剤などの経口投与用の製剤、あるいは、注
射剤、点滴剤、座剤、軟膏、貼付剤などの非経口投与用
の製剤を例示することができる。急性期の血栓症の治療
に用いるためには、注射剤や点滴剤を用いることが好ま
しい場合がある。

【００１５】薬理学的、製剤学的に許容しうる添加物と
しては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結
合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、
溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、pH調節剤、安定化
剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。経口
投与、あるいは経皮又は経粘膜投与に適する製剤には、
薬理学的、製剤学的に許容しうる添加物として、例え
ば、ブドウ糖、乳糖、D-マンニトール、デンプン、又は
結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロー
ス、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシ
ウム等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセ
ルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリ
ビニルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリ
ン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプ
ロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコー
ル又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動
パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオ
リン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基
剤を用いることができる。

【００１６】また、フロン，ジエチルエーテル、又は圧
縮ガス等の噴射剤；ポリアクリル酸ナトリウム、ポリビ
ニルアルコール、メチルセルロース、ポリイソブチレ
ン、ポリブテン等の粘着剤；木綿布又はプラスチックシ
ート等の基布等の製剤用添加物を用いて製剤を製造して
もよい。注射あるいは点滴用に適する製剤には、注射用
蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あ
るいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補
助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、D-マンニトール、グ
リセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は
有機塩基等のpH調節剤等の製剤用添加物を添加してもよ
い。

【００１７】本発明の医薬の投与量は、治療及び／又は
予防の対象となる疾患の種類、患者の状態や年齢、治療
及び／又は予防の目的などに応じて適宜増減することが
望ましい。例えば、成人一日あたり 5〜500 mg程度を経
口投与することができるが、投与量はこれらに限定され
ることはない。また、本発明の医薬は一日あたり一回あ
るいは数回に分割して投与することができ、急性期の血
栓症の治療の目的には、一時に大量投与することも可能
である。

【００１８】以下、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定され
ることはない。 例１：本発明の化合物（化合物１：R¹=R²=R³=H）の製造 100 mlの液体培養用培地(glucose 3%, soybean meal 1
%, peptone 0.3%, meatextract 0.3%, yeast extract
0.3%, KH₂PO₄ 0.05%, MgSO₄ ^.7H₂O 0.05%^, 消泡剤 CB44
2 0.01%) を含む 500 ml の三角フラスコに財団法人発
酵学研究所から分譲を受けた Stachybotrys microspora
IFO 30018株を植菌後、ロータリーシェイカーで 180 r
pm, 25℃で３日間にわたり種培養を行った。この培養液
1 ml を同培地を含む 500 ml 三角フラスコに１% の割
合で接種し、同様の条件で９日間培養した。

【００１９】上記の培養液 (1.1 リットル) を 1,600×
g で10分間遠心分離し、固体を除去した。得られた上清
(1.0 リットル) をpH 3.0に調整した後、1.0 リットル
のn-ブタノールで１回、0.5 リットルのn-ブタノールで
２回抽出した。n-ブタノール相をロータリーエンポレー
ターで濃縮乾固し、4.80 gの油状物質を得た。この油状
物質を少量のメタノールに溶解し、シリカゲル(Wakogel
C-200) 9.6 g を加えてサンプルゲルとした。96 gのシ
リカゲルをクロロホルム／メタノール(95:5)混液に懸濁
し、ガラス製カラム（内径 40 mm、長さ 300 mm)に充填
した後、クロロホルム／メタノール（95:5) 混液を 5 m
l/min の割合で約40分間流してカラムを安定化させた。
その後、カラムゲルの上にサンプルゲルをのせて 750 m
l のクロロホルム／メタノール（95:5) 混液で洗浄した
後、750 mlのクロロホルム／メタノール（9:1)で溶出し
た。この画分を濃縮乾固して 664 mg の乾固物を得た。

【００２０】メタノールに懸濁した Sephadex LH-20 7
8.5 ml をガラス製カラム（内径 20mm、長さ 300 mm)に
充填した後、メタノールを 240 ml 流してカラムを安定
化させた。その後、上記の乾固物を 5.0 ml のメタノー
ルに溶解してカラムゲルの上にのせ、180 mlのメタノー
ルで溶出し、SF-2120 フラクションコレクター(ADVANTE
C 社) で 650 drop(約 7.0 ml)ずつ22フラクションに分
画した。このフラクションについてアッセイを行い、活
性の認められたNo.7〜10フラクションを集めて乾固し、
559 mgの乾固物を得た。ついで、この乾固物をメタノー
ル／水（3:1)混液 1.5 ml に懸濁した後、900 ×g で５
分間遠心分離して上清を得た。メタノール／水（1:1)混
液 240 ml で安定化させた Sephadex LH-20 カラムにこ
の上清をのせ、メタノール／水（3:1)混液 240 ml で溶
出して 650 drop ずつ27のフラクションに分画した。な
お、アッセイは、被検フィブリンプレートへの¹²⁵I-PLG
の結合を測定することにより行った（下記参照）。

【００２１】この各フラクションについてアッセイを行
った結果、No.6〜10フラクションに活性が認められた。
このフラクションをあわせて濃縮乾固し、乾固物 298 m
g を得た。つぎに、逆相系 Inertsil PREP ODS (30×25
0 mm) カラムを用いてこの乾固物を HPLC で精製した。
アセトニトリル／水（60:40)混液を溶離液として用いて
流速 25 ml/minで溶出し、リテンションタイム15分のピ
ークを分取した。分取液をロータリーエバポレーターで
濃縮後、凍結乾燥を行い、本発明の化合物 24.1 mg
(R¹, R², 及びR³がいずれも水素の化合物：以下、実施
例においてこの化合物を「化合物１」という。）を得
た。化合物１の物理化学的性状は以下のとおりである
（表１中の数値は DMSO-d₆中 20 ℃で測定したNMR スペ
クトルのケミカルシフトδを示し、m ^* はオーバーラッ
プしたマルチプレットを示し、炭素番号は上記の化学式
中のものに対応している) 。

【００２２】 外観 淡褐色油状物 分子式 C₂₈H₃₉NO₆ HRFAB-MS(m/z) Calcd. 486.2859 for C₂₈H₄₀NO₆ (M+H)⁺ Found 486.2862 (M+H)⁺ UVλ_max (ε), MeOH 216(33,500), 258(7,300), 300(2,500) IR(KBr) cm^-1 3146, 2916, 1698, 1652, 1610, 1464, 1372, 1334, 1243, 1201, 1073, 1043, 896, 836, 770, 比旋光度 [α]²⁰ _D -11.0 °(c 0.1, CHCl₃)

【００２３】

【表１】

【００２４】例２：本発明の化合物（化合物２：R¹=R²=
R³=CH₃）の製造 上記の化合物１を Hakomori の方法(Hakomori, S., J.
Biochem., 55, pp.205-208, 1964) に準じて行った。Na
H 1.2 g に無水 DMSO 24 ml を加え、暗緑色になるまで
約２時間 55 ℃で反応させた。この試薬を冷所で保存
し、DMSOカルボアニオン試薬として以後の実験に用い
た。窒素置換したビルダール管中で、化合物１ 20 mgに
DMSO 1.2 ml、DMSOカルボアニオン試薬 300μl を加え
た。４時間室温で反応させた後、160 μl のヨウ化メチ
ルを加えて、さらに 17 時間室温で反応させた。反応混
合物に水 7.5 ml を加え、水相をクロロホルム 7.5 ml
で１回、3.75 ml で２回抽出し、クロロホルム相を水
7.5 ml で洗浄した。このクロロホルム相をHPLCに付し
て精製した。カラムとして逆相系 Inertsii PREP ODS(6
0×250 mm) を用い、アセトニトリル／水（87.5:12.5)
混液を溶離液として流速 1ml/min で溶出した。リテン
ションタイム16分のピークを分取し、分取液をロータリ
ーエバポレーターで濃縮した後、凍結乾燥を行い、トリ
メチル化された本発明の化合物 (R¹, R², 及びR³がいず
れもメチル基の化合物：化合物２）7.5mg を得た。

【００２５】化合物２の物理化学的性状は以下のとおり
である。 外観 :淡褐色油状物 FAB-MS m/z 528 (M+H)^{+ 1} H-NMR(270 MHz, DMSO-d₆)δ_H 1.22(3H,s), 1.46(2H,
m), 1.51(3H,s), 1.52(3H,s), 〜1.6(2H,m), 〜1.6(2
H,m), 1.60(3H,s), 1.93(2H,m), 1.98(2H,m), 2.07(2H,
m), 2.34(2H,t,J=7.3Hz), 2.59(1H,dd,J=6.1 and 17.7H
z), 2.91(1H,dd,J=5.0 and 20.0Hz), 3.33(3H,s), 3.49
(2H,m), 3.51(1H,m), 3.56(3H,s), 3.84(3H,s), 4.25(2
H,s), 5.03(1H,t,J=6.8Hz), 5.10(1H,t,J=6.9Hz), 6.79
(1H,s)

【００２６】例３：本発明化合物の生物活性 例１で得た化合物１を用いて、以下の方法で生物活性の
試験を行った。 (1) 試薬及び材料 ヒトGlu-PLG(プラスミノゲン）はエンザイム・リサーチ
社より購入した。ヒト・フィブリノーゲンおよびヒト・
スロンビンはシグマ(Sigma) 社から購入したものを用い
た。¹²⁵I-Nalはアムシャム(Amersham)社より購入した。
ヒトリンパ腫由来単球細胞 U937 は国立衛生試験所変異
遺伝部細胞バンクより購入した。U937細胞培養用 RPM-1
640 培地はギブコ(Gibco) 社より購入した。牛胎児血清
(FBS, Irvine scientific社より購入したもの) は、56
℃で30分間非働化した後、１リットル中 100 mg となる
ようにカナマイシンを添加したものを使用した。ハンク
ス平衡塩類溶液(HBSS)は、蒸留水にNaCl 8 g, KCl 0.4
g, Na₂HPO₄ ^. 12H₂O 0.121g, KH₂PO₄ 0.06 g, MgSO₄ ^. 7
H₂O 0.2 g, CaCl₂ 0.14 g, glucose 1 g, HEPES[N-(2-H
ydroxyetyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid)]
11.915 g を加え、1N NaCl でpH 7.4に調整した後、1 g
のBSA を加えて精製水で１リットルとしたものを用い
た。

【００２７】Glu-PLG の放射性ヨウ素ラベルは、Miles
らの方法(Miles, L.A. and Plow, E.F., J. Biol. Che
m., 260, pp.4303-4311, 1985) に準じて行った。369
μg のGlu-PLG を600 μl のPBS に溶解してガラス製ス
ピッツ管に加えた後、37 MBqの¹²⁵I-NaI(643.8 GBq/mg)
を加えた。つぎに、4 mg/ml のクロラミン-T溶液を10μ
l 加えて室温で反応を開始した。５分間インキュベート
した後、100 μl の1% KI を加えて反応を停止した。一
方、最終濃度で5 mMのDFP(diisopropyl fluorophosphat
e)を含むBSA の100mg/ml水溶液を調製して十分撹はんし
た。この溶液を透析チューブに移し、精製水で透析した
後、透析内液をLowry 法(Lowry, O.H., etal., J. Bio
l. Chem., 193, pp.265-269, 1951)によりタンパク定量
した。反応を終えたスピッツ管に、このDFP 処理したBS
A 溶液を最終濃度で10 mg/mlとなるように加えた。

【００２８】ゲル濾過用セファデックスG-25カラムを H
BSS 溶液に懸濁した後、プラスチック製カラムに充填し
た。次に、BSA を除いた HBSS 溶液でカラムを洗浄後、
ヨウ素化したPLG をカラムに乗せて、BSA を除いたHBSS
溶液で溶出して500 μl づつ分画した。13% トリクロロ
酢酸の添加により 97.3%以上が沈殿した画分を¹²⁵I-PLG
画分とした。¹²⁵I-PLG画分の一部を使用し、Lowry 法に
よるタンパク定量および放射活性の測定を行い、比放射
能を調べてから実験に使用した。残りの¹²⁵I-PLG溶液
は、最終濃度で0.01% となるようにEDTA・2Na 溶液(pH
7.4) を加えて-80℃で保存した。

【００２９】フィブリンプレートの作製法は、McConahe
y らの方法(Berg, K., Acta. Pathol. Microbial. Scan
d., 59, 369, 1963)に準じて行った。96穴の組織培養用
ディッシュ(CORNING社製) の各々のウェルにPBS に溶解
したフィブリノーゲン溶液(200μg/ml) 100 μl 加え
た。37℃のインキュベーターで 3〜5 日間静置後、PBS
に溶解したスロンビン溶液(0.675 unit/ml) 75μl 加え
た。37℃のインキュベーター中で３時間放置してフィブ
リンプレートを作成した。このプレートの各ウェルを10
0 μl のPBA で３回洗浄し、さらに37℃のインキュベー
ター中で１時間静置して以下の実験に用いた。

【００３０】(2) ¹²⁵I-PLGのフィブリン結合に対する化
合物１の作用 フィブリンプレートへの¹²⁵I-PLG結合の測定は、以下の
ように行った。被検試料を HBSS に溶解させた溶液 25
μl を上記のウェルに添加した。つぎに、最終濃度で 5
0 nMになるように HBSS で希釈した¹²⁵I-PLG液 25 μl
を加えて反応を開始した。37℃のインキュベーター中で
１時間静置した後、200 μl のPBS で２回、100 μl で
１回ウェルを洗浄し、遊離の¹²⁵I-PLGを除いた。0.2 M
の NaOH溶液および 2 (w/v)% のSDS を含む溶液50μl
を加えて37℃で30分間放置してフィブリン・クロットを
溶解した後、その40μl の放射活性をγ- カウンターで
測定した。¹²⁵I-PLGのフィブリン表面レセプターの特異
的結合（レセプター依存結合）は、リジン誘導体である
EACA（ε−アミノカプロン酸）により阻害されるため、
特異的結合は最終濃度で200mM となるように EACA を加
えて同様の操作を行ったときの放射活性を減算して評価
した。

【００３１】化合物１は濃度依存的にフィブリンに対す
る¹²⁵I-PLGの結合を促進し、300 μM で約２倍の結合
量、600 μM で約６倍の結合量を与えた（図１) 。この
結合はリジン誘導体であるEACAの添加によりほぼ完全に
阻害されることから、化合物１はフィブリン表面の特異
的PLG レセプターへの¹²⁵I-PLGの結合を促進しているこ
と明らかである。図２は、¹²⁵I-PLGのフィブリン結合の
タイムコースに及ぼす化合物１の影響を示す図である。
化合物１(200μg/ml: 412 μM)は¹²⁵I-PLGのフィブリン
への結合を15分で3.7 倍、30分で3.8 倍、45分以降は約
４倍促進した。¹²⁵I-PLGのフィブリンへの結合のスキャ
ッチャード・プロットを図３に示す。化合物１(200μg/
ml: 412 μM)添加により B_max は0.99μg/mgから4.15μ
g/mgに上昇し、Kd値は3.36μM から3.79μM に上昇し
た。これらの結果から、化合物１が血液中で血栓特異的
に線溶系を促進する作用を有することが明らかである。

【００３２】(3) ¹²⁵I-PLGのU937細胞に対する結合に及
ぼす本発明の化合物の作用 U937細胞に対する¹²⁵I-PLGの結合実験は、Miles らの方
法(Miles, L.A., et al., Nature, 339, pp.301-303, 1
989)を一部改変して行った。最終濃度で12.3 nM となる
ように調製した¹²⁵I-PLG(Bq/mg) を HBSS で希釈した
後、この溶液 60μl を500 μl のマイクロチューブに
加えた。対数増殖期のU937細胞をシャーレから遠心管に
移し、415 ×g で３分間遠心分離した後に培地を捨て
た。HBSS 10mlを加えて細胞を懸濁した後、同様に遠心
分離してHBSSを捨てた。この操作を２回繰り返した後、
細胞をHBSSに 2.1×10⁷ cells/mlとなるように懸濁し
た。この懸濁液 10 μl をマイクロチューブに加え、37
℃で反応を開始した。１時間インキュベートした後、チ
ューブを氷上に移し、遠心チューブ内で反応液 50 μl
を20% ショ糖を含むHBSS 300μl に重層した。 4,900×
g で2.5 分遠心分離した後、チューブの底に沈澱した細
胞の放射活性をγ- カウンターで測定した。特異的結合
は最終濃度で 200 mM のEACAを加えて補正した。

【００３３】化合物１は濃度依存的にu937細胞に対する
¹²⁵I-PLGの結合を促進し、260 μMで約２倍、310 μM
で約4.3 倍の結合量を与えた（図４）。また、この結合
はリジン誘導体であるEACAによりほぼ完全に阻害され
た。U937細胞は、ヒト血管内皮細胞と同様にuPA(ウロキ
ナーゼ) 、tPA(組織プラスミノーゲン・アクティベータ
ー）、及びPAI(プラスミノーゲン・アクティベーター・
インヒビター) を合成・分泌する細胞であり(Hart, P.
H., et al., J. Exp. Med., 169, pp.1509-1514,1989)
、また、tPA 及び Glu-PLGに対する結合部位を有して
いるので(Hajjar, K.A., et al., J. Biol. Chem., 26
1, pp.11656-11662, 1986) 、その生物学的性質は血管
内皮細胞に非常に類似している。従って、化合物１が生
体の血管内において細胞表面の線溶を促進する作用を有
することが明らかである。

【００３４】

【発明の効果】本発明によりフィブリンに対するプラス
ミノゲンの結合を促進することにより線溶系を活性化さ
せる作用を有する物質が提供される。上記の物質は、血
栓溶解剤及び血栓症の治療・予防剤の有効成分として有
用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ¹²⁵I-PLGのフィブリン結合を促進する本発明
化合物の作用を示す図である。図中、△は総結合量を示
し、●は特異的結合量を示し、○は非特異的結合量を示
す。

【図２】 ¹²⁵I-PLGのフィブリン結合のタイムコースに
及ぼす本発明化合物の結合促進作用を示す図である。図
中、○は化合物１の非存在下、●は化合物１(200μg/m
l: 412 μM)の存在下の結果を示す。

【図３】 ¹²⁵I-PLGのフィブリン結合のスキャッチャー
ド・プロットを示す図である。○は化合物１(200μg/m
l: 412 μM)添加時、●はコントロールの結果を示す。

【図４】 ¹²⁵I-PLGのu937細胞に対する結合を促進する
本発明化合物の作用を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の式： 【化１】 （式中、R¹, R², 及びR³はそれぞれ独立に水素原子又は
   水酸基の保護基を示す）で示される化合物及びその塩。
2. 【請求項２】 R¹, R², 及びR³はそれぞれ独立に水素原
   子又はC_1-6アルキル基を示す請求項１に記載の化合物及
   びその塩。
3. 【請求項３】 R¹, R², 及びR³が同時に水素原子である
   請求項１に記載の化合物及びその塩。
4. 【請求項４】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
   の化合物を有効成分として含む血栓溶解剤。
5. 【請求項５】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
   の化合物を有効成分として含む血栓症の治療及び／又は
   予防剤。
6. 【請求項６】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
   の化合物を含むフィブリンに対するプラスミノゲンの結
   合促進剤。
7. 【請求項７】 請求項１ないし３のいずれか１項に記載
   の化合物を含む線溶活性化剤。
8. 【請求項８】 スタキボトリス属に属し請求項３に記載
   の化合物を産生する微生物を培養し、得られた培養物か
   ら該化合物を分離・採取することを特徴とする、請求項
   ３に記載の化合物の製造方法。