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DEPRESSEUR DE L'INHIBITEUR DE L'α2-PLASMINE.
La présente invention concerne une composition thrombolytique,'etc. comprenant comme ingrédient principal un composé choisi dans le groupe constitué des composés (l) à (4) décrits ci-dessous : (l) un composé représenté par la formule qénérale (II) suivante et un de ses sels d'addition aux acides physiologiquement acceptables ainsi qu'un de ses sels quaternaires ; (2) la nojirimycine et un de ses sels d'addition aux acides physiologiquement acceptables ;
(3) le l, 4-bis (3-moranolino-l-propényl) benzène et un de ses sels d'addition aux acides physiologiquement acceptables ; et (4) la castanospermine ;
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EMI2.2
2 dans laquelle R2 représente un atome d'hydrogène, un grou- pe alkyle, carboxyalkyle, alkyloxycarbonylalkyle, hydroxyalkyle, cycloalkylalkyle, arylalkyle substitué ou non substitué, aryloxyalkyle substitué ou non substitué, alcényle, hydroxyalcényle, arylalcényle substitué ou non substitué, aryloxyalcényle ou alkylcarbamoylalkyle.
(Art antérieur)
Pour la formation du thrombus hémostatique apparaissant dans le cas d'un dommage physique à un vaisseau sanguin, l'agrégation plaquettaire et la précipitation ultérieure de fibrine sont absolument nécessaires. D'autre part, le thrombus inhibe le courant sanguin dans le vaisseau sanguin, provoquant l'ischémie ou la nécrose des tissus, conduisant à l'infarctus du myocarde ou à un infarctus cérébral. Par conséquent, l'organisme vivant est doté d'un mécanisme pour éliminer un excès de thrombus dans le vaisseau sanguin, dans lequel la fibrinolyse par le système plasminogène-plamine joue un grand rôle.
Le plasminogène est activé par l'activateur du plasmingène pour le transformer en plasmine et la plasmine décom- pose la fibrine (fibrinolyse). Une anomalie de ce mécanisme provoque des maladies telles qu'infarctus du myocarde, infarctus cérébral, etc.
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Pour ces maladies modernes, diverses causes sont envisagées, mais lors du traitement de ces maladies, un traitement fibrinolytique dans lequel le thrombus formé est lysé pour améliorer l'état ischémique du tissu est efficace. A cet effet, on a administré des activateurs du plasminogène tels que l'urokinase, la strptokinase, etc.
Par conséquent, il existe une possibilité qu'une substance destinée à accélérer la sécrétion d'urokinase soit un bon médicament dans le traitement de la thrombolyse décrit ci- essus.
L'organisme vivant est également doté d'un mé- canisme pour le protéger d'une fibrinolyse excessive. Il est connu par exemple que l'inhibiteur de jasmine (désigné ci-après par"a-Pl") qui est un inhibiteur de la plasmine, inhibe instantanément l'activité de la plasmine pour inhiber la fibrinolyse Par conséquent, l'a-PI agit comme un inhibiteur du traitement dans le traitement de la fibrinolyse et il revêt également la forme d'une sorte de protéine dans la phase aiguë en devenant une des causes du thrombus post-opératoire.
(Problèmes à résoudre par la présente invention)
Compte-tenu de ce qui précède, on suggère qu'un médicament pour abaisser l'activité de l'a 2-PI améliorerait l'effet dans le traitement de la fibrinolyse et servirait à éviter le thrombus ou la thrombose post-opératoires.
Un des buts de la présente invention est de fournir un excellent inhibiteur de l'api pour fabriquer des médicaments efficaces pour les traitements de l'infarctus du myocarde et de l'infarctus cérébral.
Un but important de la présente invention est également de fournir une substance pour accélérer la sécrétion de l'urokinase, car l'urokinase est un activateur du plasminogène.
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(Moyens pour résoudre les problèmes)
Pour atteindre les buts ci-dessus, la demanderesse a sélectionné de nombreux groupes de composés et, à la suite de hasards extrêmement heureux, elle a établi que les composés conformes à l'invention possèdent une excellente activité dépressive de l'api et une excellente activité d'accélération de la sécrétion d'urokinase, et elle a trouvé en même temps que les composés ont aussi un effet d'accélération de la fibrinolyse en présentant l'effet fibrinolytique, et elle a pu aboutir à la présente invention.
Comme il sera indiqué plus loin, les composés de la présente invention présentent une excellente activité dépressive de l'api et une excellente activité d'accélération de la sécrétion d'urokinase et ils peuvent être utilisés comme médicaments pour traiter l'infarctus du myocarde ou l'infarctus cérébral en tant qu'agents fibrinolytiques, de telle sorte que les composés sont extrêmement utiles.
Les composés de la présente invention ont les caractéristiques structurales indiquées dans les revendications.
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12 Comme RI et R2 dans les formules générales (I) et (II), on peut citer les constituants décrits ci-dessus, etc.
Le terme alkyle désigne ici un groupe alkyle en C-, à C ; on préfère un groupe alkyle inférieur, par exemple un groupe méthyle, éthyle, etc.
Comme groupe carboxyalkyle, on peut citer par exemple un groupe carboxyméthyle, carboxyéthyle, carboxypropyle, etc. Les groupes alkyle ayant un nombre plus élevé d'atomes de carbone sont également inclus dans les composés de la présente invention.
Comme groupe alkyloxycarbonylalkyle, on peut citer par exemple les groupes méthoxycarbonylméthyle,
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méthoxycarbonyléthyle, méthoxycarbonylpropyle, méthoxycarbonyl- butyle, éthoxycarbonylméthyle, éthoxycarbonyléthyle, éthoxycarbonylpropyle, éthoxycarbonylbutyle, etc. Les groupesalkyloxycarbonylalkyle ayant un nombre d'atomes de carbone supérieur dans le groupe alkyle sont également inclus dans les composés de la présente invention.
Comme groupe hydroxyalkyle, on peut citer par exemple les groupes hydroxyméthyle, hydroxyéthyle, hydroxypropyle, hydroxybutyle, etc. Les groupes hydroxyalkyle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé dans le groupe alkyle sont également inclus dans la présente invention.
Comme groupe cycloalkylalkyle, on peut citer par exemple les groupes cyclopropylméthyle, cyclobutylméthyle, cyclopentylméthyle, etc. Les groupes cycloalkylalkyle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé dans le groupe alkyle sont également inclus dans la présente invention.
Comme groupe arylalkyle on peut citer par exemple les groupes benzyle, phénéthyle, phénylpropyle, phénylbutyle, phénylpentyle, naphtylméthyle, naphtyléthyle, naphtylpropyle, naphtylbutyle, etc. Les groupes arylalkyle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé dans le groupe alkyle sont également inclus dans la présente invention.
Comme groupe aryloxyalkyle, on peut citer par exemple les groupes phénoxyméthyle, phénoxyéthyle, phénoxypropyle, phénoxybutyle, naphtyloxyméthyle, naphtyloxyéthyle, naphtyloxypropyle, naphtyloxybutyle, etc.
Les groupes aryloxyalkyle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé dans la partie alkyle sont également inclus dans la présente invention.
Comme groupe alcényle, on peut citer-par exemple les groupes vinyle, propényle, butényle, etc. Les groupes alcényle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé sont également inclus dans la présente
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invention.
Comme groupe hydroxyalcényle, on peut citer par exemple les groupes hydroxyvinyle, hydroxypropényle, hydroxybutényle, etc. Les groupes hydroxyalcényle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé sont également inclus dans la présente invention.
Comme groupe arylalcényle, on peut citer par exer-. ple les groupes phénylvinyle, phénylpropényle, phénylbutényle, naphtylvinyle, naphtylpropényle, naphtylbutényle, etc. Les groupes arylalcényle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé sont également inclus dans la présente invention.
Comme composés de la présente invention, on peut citer, en plus de ceux décrits ci-dessus, la nojirimycir. e, obtenue en remplaçant l'hydroxyle à la position 1 de la structure de base de la moranoline et de ses dérivés (par exemple des dérivés N-substitués). Un groupe de ces composés présente également des activités similaires à celles des dérivés de la moranoline (dérivés N-substitués) et sont inclus dans les composés de la présente invention.
Les composés ayant la structure de base de la moranoline sous forme bis sont également inclus dans la présente invention. Ces composés présentent eux aussi un effet pharmacologique similaire à celui des autres composés de la présente invention.
Des exemples représentatifs de ces composés conformes à la présente invention comprennent la nojirimycine et ses sels pharmacologiquement acceptables, le l, 4-bis- (3-moranolino-I-propényl} benzène et ses sels
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pharc. acologiquement acceptables. Ces composés présentent eux aussi une excellente activité d'abaissement de l'api et une excellente activité d'accélération de la sécrétion d'urokinase, comme pour les autres composés de la présente invention.
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Les com e Les composés de la présente invention peuvent
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être préparés d'une manière classique. On donnera cidessous à titre d'exemple un procédé de préparation de la N-butylmoranoline.
(EXEMPLE DE PREPARATION 1)
On ajoute de la moranoline, 50 g, 126 g de bromure de-n-butyle et 170 g de carbonate de potassium à 1300 ml de diméthylformamide. On agite le mélange à la température ambiante pendant 7 jours pour achever la réaction. Après avoir éliminé les impuretés par filtration, on élimine le solvant par distillation sous pression réduite et on fait passer à travers 1000 ml une résine échangeuse d'ions fortement acide Dowex 50W x 2 (H+). Après avoir lavé soigneusement à l'eau, on effectue l'élution avec de l'ammoniaque IN. On concentre l'éluat sous pression réduite. On ajoute ensuite au concentré 50 ml de méthanol. On laisse reposer le mélange à la température ambiante et on recueille les cristaux forcés (47 g).
Après avoir dissous les cristaux dans 500 ml de méthanol en chauffant, on refroidit la solution à la température ambiante, puis on la traite par du charbon activé. Après avoir concentré à environ 100 ml, on laisse reposer le concentré à la température ambiante et l'on recueille 40 g de cristaux qui ont précipité.
Après avoir dissous les cristaux dans 200 ml de méthanol en chauffant, on concentre doucement la solution. On laisse reposer le concentré à la température ambiante et on recueille les cristaux qui précipitent. On sèche à fond les cristaux à 70 C sous pression réduite, ce qui donne 34 g de la N- (n-butyl) moranoline recherchée.
Rendement 50,6 % ; point de fusion, 128-129 C.
Composition élémentaire :
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Calculé (%) : C : 54, 78 H : 9, 65 N : 6, 39 Trouvé (%) : C : 54, 57 H : 9, 65 N : 6, 60 24 [a]4=-14, 59 (1 %, eau)
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RMN H : 0, 88 (3H, t, J=7, 2Hz, CH-CH CHCH-), 1, 16-1, 56 (4H, m, J=7, 2Hz, CHCHCH CH-), 2,17-2, 36 (2H, m, J=7,2Hz, CH3CH2CH2CH2-), 2,48-2, 82 (2H, m, H-la, H-5), 3,02 (lH, dd, J=5, 1, ll, 4Hz, H-4), 3,22 (lH, t, J=9, OHz,
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H-4), 3, 66 (lH, t, J=9, 4Hz, H-4), 3, 44-3, 6 (lH, m, H-2), 3,74-3, 96 (H x 2, dd, x 2, H,H).
(EXEMPLE DE PREPARATION 2)
On ajoute de la moranoline, 5 g, 13 g de bromure de n-butyle et 17 g de carbonate de potassium à 130 ml de ciméthylformamide. On fait réagir le mélange à 100 C pendant 5 heures. Puis, on traite le mélange réactionnel d'une manière similaire à l'Exemple de Préparation l, ce qui donne 5, 1 g de N- (n-butyl) moranoline. Rendement : 75, 8 %.
(EXEMPLE DE PREPARATION 3)
A 100 ml de méthanol, on ajoute 5 g de moranoline.
Tout en agitant à la température ambiante, on ajoute au mélange une solution de 20 ml de n-butylaldéhyde dans 50 ml de méthanol contenant en dissolution 0,7 g d'acide chlohydrique et 3 g de NaCNCH3. On effectue la réaction pendant une nuit. Lorsque celle-ci est terminée, on élimine le solvant sous pression réduite. On dissout le résidu, après quoi on le partage avec du chloroforme. On fait passer la phase aqueuse à travers une colonne de 200 ml de résine Diaion SA-11A du type (OH-) après quoi on lave soigneusement à l'eau. On réunit le liquide ayant traversé avec le liquide de lavage. On fait passer le mélange à travers une colonne de 200 ml de résine Dowex 50W x 28
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type (H+). Après lavage soigné, on effectue l'élution avec de l'ammoniaque lN.
Après avoir éliminé le solvant par distillation sous pression réduite, on fait cristallisé l'éluat dans de l'éthanol. La recristallisation dans de l'éthanol donne 5, 1 g de N- (n-butyl) moranoline.
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Rendement : 75,8 X.
Des exemples typiques des composés conformes à la présente invention comprennent les composés suivants. composé n 1 Moranoline composé n 2 N-méthylmoranoline
Composé nO 2a N- (n-butyl) moranoline
Composé n 3 Tosylate de N-5-méthoxycarbonyl- pentylmoranoline
Composé n 4 N-hydroxyéthylmoranoline
Composé nO 5 (N-méthoxycarbonylbutyl) morano- line
Composé n 6 Bisulfite de nojirimycine
Composé n 7 Dichlorhydrate de l, 4-bis- (3- moranolino-l-propényl) benzène
Composé n 8 Tosylate de n-hexylmoranoline
Composé n 9 N-isoprénylmoranoline
Composé n 10 Tosylate de N-(2-hydroxydécyl)
moranoline
Composé n 11 Sel de sodium de la N-10-carboxy- décylmoranoline
Composé n 12 Tosylate de N- (3-phénylpropyl) moranoline
Composé n 13 Tosylate de N-benzylmoranoline
Composé n 14 Chlorhydrate de N-cinnamylmora- noline Composé-no 15 Tosylate de N-4-phénylbutylmo- ranoline
Composé n 16 N-(2-phénoxyéthyl)moranoline
Composé n 17 Tosylate de N- (3-phénoxypropyl) moranoline
Composé n 18 Tosylate de N-(5-(phénylpentyl) moranoline
Composé ne 19 Tosylate de N-(2-cyclopentyléthyl) moranoline
Composé n 20 N-[3-(3-méthoxyéthoxyphényl)-2-
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butényl] moranoline Composé n 21 Iodure de N,
N-diméthylmoranoline ammonium Composé nO 22 N-éthylmoranoline
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Composé nO 23 N-cinnamylmoranoline Composé nO 24 Tosylate de N-géranylmoranoline Composé n 25 Tosylate de N- (2-hydroxy-3-phéno- xypropyl) moranoline Composé n 26 Tosylate de N-farnésylmoranoline Composé nO 27 N-10-(N-méthylcarbamoyl)décyl- moranoline Composé nO 28 Tosylate de N- (4-phényl-3-butényl) moranoline Composé n 29 N- (3-phényl-2-méthyl-2-propényl) moranoline Composé nO 30 N- (3-o-chlorophénoxypropyl) mora- noline
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Composé nO 31 N- (y-méthyl-4-bromocinnayl) moranoline Composé nO 32 N-[4-(3-fluoro-4-méthylphényl) butyl]-moranoline composé n 33 N- (p-éthoxycinnamyl) moranoline
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Composé nO 34 N- (p-isopropoxycinnamyl) moranoline Composé nO 35 N- (y-méthyl-m-méthylcinnamyl)
moranoline Composé'nO 36 N-(4-m-méthoxyphényl-3-pentényl)- moranoline
Composé n 37 N-(p-éthoxycarbonylphénoxyéthyl)- moranoline [émiglitate]
Composé nO 38 Castanospermine
En plus de ceux décrits, ci-dessus, les composés conformes à la présente invention contiennent en outre les suivants.
Tosylate de N-isobutylmoranoline
Tosylate de N-hydroxyéthylmoranoline
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Bromhydrate de N-aminomoranoline Tosylate de N-méthoxyéthylmoranoline Tosylate de N-méthoxyéthoxyéthylmoranoline Tosylate de N-décylmoranoline Tosylate de N-(2-hydroxyhexadécyl)moranoline Tosylate de N-(2-hydroxy-3-p-tolyloxypropyl) moranoline Tosylate de N- (2-hydroxy-3-p-méthoxyphényloxy- propyl) moranoline Tosylate de N- (2-hydroxy-3-p-chlorophényloxypropyl) moranoline N-3-carbamoylpropylmoranoline Tosylate de N-nonylmoranoline Tosylate de N-undécylmoranoline Tosylate de N- {2-hydroxytétradécyl) moranoline N-(4,4-diphényl-3-butényl)
moranoline N-5-carboxypentylmoranoline N-farnésylmoranoline
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N- (y-méthyl-4-chlorocinnamyl) moranoline N- (Y-méthyl-4-méthylcinnamyl) moranoline N- (4-p-chlorophényl-3-pentényl) moranoline N- (4-m-chlorophényl-3-pentényl) moranoline N- (4-o-chlorophényl-3-pentényl) moranolíne N- (4-p-phénoxyphényl-3-pentényl) moranoline N- (4-p-éthoxyphényl-3-pentényl) moranoline N- (m-méthoxycinnamyl) moranoline N- [3- (3-chlorophényl)-2-butënyloranoline N-[4- {4-chlorophényl) -3-butényl]moranoline N- {4-carboxylcinnamyl) moranoline chlorhydrate N- (3-carboxy-2-propényl) moranoline Dipicrate de N-(m-triéthylammonioéthoxycinnamyl) moranoline N-isopropylmoranoline Chlorhydrate du chlorure de N- {p-triméthylammo- nioéthoxycinnamyl)
moranoline
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Dans le cas où les composés de la présente invention sont administrés comme médicaments, ils sont administrés aux animaux et à l'homme tels quels ou sous forme de compositions médicales contenant par exemple 0,1 à 99,5 %, de préférence 0,5 à 90 % de composé actif dans un support pharmaceutiquement acceptable, non toxique et inerte.
Comme support, on utilise au moins un diluant solide, semi-solide ou liquide, une charge et d'autres adjuvants de formulation. La composition pharmaceutique est avantageusement administrée sous forme de dose unitaire. La composition pharmaceutique peut être administrée par voie orale, ou dans les tissus. par exemple par voie intraveineuse, etc., localement (par voie sous- cutanée, etc. ) ou par voie intra-rectale, etc. Il va sans dire que la composition pharmaceutique est administrée sous une forme appropriée à ces modes d'administration.
L'administration orale est particulièrement préférée.
La posologie comme agent fibrinolytique est réglée avantageusement en fonction de l'âge, du poids corporel, etc. du malade, de la voie d'administration, des caractéristiques et du degré de la maladie, etc., mais la composition est'généralement administrée aux adultes en tant qu'ingrédient actif de la présente invention à une dose quotidienne allant de 50 à 3000 mg/ personne, de préférence de 500 à 1000 mg/personne. Suivant le cas, une dose inférieure est également efficace et inversement, une dose supérieure peut être nécessaire. On souhaite également administrer par portions deux à trois fois par jour.
(EXEMPLES)
Ci-après l'activité d'abaissement de l'a 2-Pi, l'activité d'accélération de la sécrétion d'urokinase ainsi que la toxicité des composés de la présente invention sont décrites en détail et la présente invention est
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décrite ci-dessous de manière plus détaillée.
EXEMPLE D'ESSAI 1
Activité in vitro
Il est connu que les cellules HepG2 provenant du cancer hépatique humain synthétisent et secrètent l'inhibiteur de l'a-plamine (a-PI). Des cellules hepG2, 2 x 10, ont été inoculées sur une boîte de cultu- re plastique (diamètre 100 mm) fabriquée par la société Falcon Inc. et cultivées dans du milieu minimum d'Eagle contenant 10 % de sérum de foetus de bovin.
Trois jours après, les cellules adhérant au fond de la boite sont lavées deux fois avec du tampon phosphate de Dulbecco puis cultivées dans 8 ml de milieu d'Eagle exempt de sérum (ne contenant pas de Rouge de Phénol), contenant 200 ug/ml d'un échantillon du composé de la présente invention pendant 3 à 4 jours supplémentaires. Après culture, on recueille 7 ml du milieu et on les concentre à environ 1 ml en utilisant un Centriflow (CF25) fabriqué par Falcon Inc. On lyophilise ensuite le concentré.
A l'échantillon lyophilisé, on ajoute 0,7 ml de tampon Tris 50 mM contenant 8,1 mg/ml de chlorhydrate de monométhylamine pour le dissoudre, de sorte que la solution est concentrée à 10 fois.
A 100 pi de l'échantillon concentré, on ajoute 50 cl de la solution de plasmine à 15 mCU et on y ajoute encore 50 ul d'une solution de 0,25 pmole de solution de substrat chromogène synthétique S-2251, après quoi on fait réagir à 370C pendant 10 minutes. En ajoutant 1 ml de solution de citrate à 2 %, on arrête la réaction. Le p-nitranilide libéré par le substrat S-2251 est dosé à une longueur d'onde de 405 nm.
Un échantillon dans lequel la décomposition du substrat S-2251 a été mesurée en utilisant le tampon Tris ci-dessus à la place de l'échantillon concentré a joué
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le rôle d'un témoin présentant une activité de plasmine de 100 % et l'échantillon concentré cultivé sans ajouter de composé d'essai a joué le rôle de témoin présentant une activité d'a2-PI de 100 %. Les résultats ont été calculés par l'équation suivante :
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A.-A Activité de l'api (%) = Al - A2 x 100 1 3
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dans laquelle Al'A2 et A3 représentent l'absorbance dans le témoin à 100 %, l'absorbance lorsqu'on a utilisé l'échan- tillon concentré et l'absorbance dans le témoin ayant une activité d'a2-PI de 100 %, respectivement. Le nombre des échantillons était de 3 dans chaque cas.
Les résultats sont donnés dans le Tableau 1. Il est évident que les composés de la présente invention peuvent abaisser l'activité de 1 a2 PI.
TABLEAU 1
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<tb>
<tb> Echantillon <SEP> Activité <SEP> de <SEP> Echantillon <SEP> Activité <SEP> de
<tb> Composé <SEP> n <SEP> $1'α2-PI <SEP> Composé <SEP> n <SEP> 1'α2-PI
<tb> (%) <SEP> (%)
<tb> Témoin <SEP> 100 <SEP> 11 <SEP> 88
<tb> 1 <SEP> 63 <SEP> 12 <SEP> 50
<tb> 2 <SEP> 62 <SEP> 13 <SEP> 80
<tb> 2a <SEP> 59
<tb> 3 <SEP> 70 <SEP> 14 <SEP> 51
<tb> 4 <SEP> 70 <SEP> 15 <SEP> 39
<tb> 5 <SEP> 79 <SEP> 16 <SEP> 74
<tb> 6 <SEP> 67 <SEP> 17 <SEP> 65
<tb> 7 <SEP> 86 <SEP> 18 <SEP> 20
<tb> 8 <SEP> 56 <SEP> 19 <SEP> 63
<tb> 9 <SEP> 55 <SEP> 20 <SEP> 37
<tb>
EXEMPLE D'ESSAI 2
Activité in vivo
Comme animaux auxquels ont été administrés les composés de l'invention, on a utilisé trois chiens Beagle
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mâles pour le groupe témoin et pour le groupe ayant reçu l'administration, respectivement.
Un échantillon d'essai (Composé n 2) a été dissous à une concentration de 10 mg/O, l ml, en utilisant un tampon phosphate 0, 1 M (pH 7,2). Après dissolution, la solution a été stérilisée par filtration à travers un filtre stérile (taille de pores, O, 2 um) puis on a administré 0,3 ml de la solution par kg de poids corporel (30 mg/ kg). L'administration a été effectuée par la veine de la patte de devant pendant 7 jours consécutifs. Le sang recueilli a été mélangé avec du citrate de sodium à 3,8 % dans un rapport de 1 : 9 en volume. Par centrifugation à 300 tours/minute pendant 15 minutes, on a isolé le plasma.
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L'activité de l'a e L'activité de l'a2-PI a été mesurée en tant qu'activité d'inhibition contre la décomposition de la plasmine par le substrat chomogène synthétique S-2251.
Les résultats de la mesure sont exprimés en modification de l'activité d'inhibition après administration sur la base de 100 % d'activité d'inhibition de la plasmine avant l'administration de l'échantillon d'essai (Tableau 2).
Le nombre d'échantillons dans chaque groupe était de 3 échantillons.
L'activité de l'a 2-PI a été manifestement déprimée par administration ultérieure du composé d'essai à une dose de 30 mg/kg.
TABLEAU 2 (Activité de l'a-PI)
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<tb>
<tb> Jour <SEP> 0 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7
<tb> c <SEP> 100 <SEP> 98 <SEP> 92 <SEP> 94 <SEP> 96 <SEP> 98 <SEP> 100 <SEP> 106
<tb> Echantillon <SEP> 100 <SEP> 95 <SEP> 83 <SEP> 84 <SEP> 76 <SEP> 75 <SEP> 86 <SEP> 89
<tb>
C. témoin Echantillon : échantillon d'essai
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EXEMPLE D'ESSAI 3
Essai sur une fibrinolyse in vitro
Un échantillon d'essai (Composé no 2) a été administré à des chiens Beagle à la dose de 30 mg/kg une fois par jour. Le plasma a été isolé avant l'administration et 4 jours après. L'activité de l'a2-PI dans le plasma a été mesurée et en même temps, on a formé un caillot de fibrine in vitro en utilisant le plasma.
En faisant agir l'urokinase comme agent thrombolytique sur le caillot de fibrine, on a comparé le degré de lyse entre le plasma avant l'administration et le plasma 4 jours après l'administration.
A 300 ul du plasma isolé, on a ajouté 40 p1
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125 d'un fibrinogène 1 (0, 1 mCi/ml) et on a introduit 50 pi de mélange dans un tube à essai. 5 jl d'un mélange en solution de 25 U/ml de thrombine et de chlorure de calcium 0,5 M ont été ajoutés dans chaque tube à essai, que l'on a fait incuber à 370C pendant 30 minutes pour préparer des caillots de fibrine. Des solutions à 15 et 30 U/ml d'urokinase dans une solution d'albumine à 2 % et la solution obtenue ont été introduites dans chaque tube à essai à raison d'l ml chacune.
EMI16.2
Après avoir fait incuber à 370C pendant 12 heures, on a recueilli 25 ni du liquide surnageant dans un tube d'iode radio-actif et les produits de décomposi- 125 tioncb la fibrine-125I isolés dans le liquide surna- geant ont été mesurés avec un compteur de rayons y.
Le nombre d'échantillons était de 3 dans chaque groupe.
Comme le montre le Tableau 3, il est clair que lorsqu'on utilisait le plasma ayant une activité d'api abaissée, la lyse des caillots de fibrine était accélérée par administration du composé d'essai, par comparaison avec le plasma avant l'administration.
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TABLEAU 3 Vitesse de lyse du caillot fibrineux (%)
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<tb>
<tb> Activité <SEP> de <SEP> Avant <SEP> l'adminis-4 <SEP> jours <SEP> après
<tb> l'urokinase <SEP> tration <SEP> l'administration
<tb> 0 <SEP> U <SEP> 18,1 <SEP> 21,5
<tb> 15 <SEP> U <SEP> 37,4 <SEP> 63,8
<tb> 30 <SEP> U <SEP> 70,0 <SEP> 93,7
<tb>
EXEMPLE D'ESSAI 4
Essai thrombolytique in vitro
La capacité d'induire l'activité thrombolytique dans un système de culture de cellules endothélialesvasculai- resa été examinée en utilisant des endothéliwrsdiartère pulmonaire de veau (CPAE).
Les cellules CPAE ont été achetées à la société Dainippon Pharmaceutical Ltd., Department of Laboratory Products. Les cellules CPAE ont été sous-cultivées dans un milieu MEM sérum de foetus de veau-Eagle à
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2 10 % introduit dans un flacon de culture de 25 cm2. De la suspension cellulaire fractionnée après sous-culture, on a fait passer 0,1 ml dans un tube à essai avec une pipettre stérilisée. Puis on a dilué la suspension cellulaire à 10 fois avec 0,9 ml de solution de Bleu Trypan et on a compté les cellules avec un compteur à cellule.
Après dilution avec du milieu MEM sérum de foetus de veau-Eagle à
10 % de manière à avoir un nombre de cellules de 2 x 105 cellules/ml, on à dispensé avec une micropipettre dans une plaque de microtitrage à 96 puits (fabriquée par la société Corning) 100 ! de chaque/puits, c'est-à-dire 2 x 104 cellules/puits, de la dilution. La plaque a été mise à incuber à 37 ! C dans du C02 à 5 %.
Le composé de la présente invention. a été dis- sous dans le milieu à raison de 0,2 mg/ml. Le composé qui était insoluble dans le milieu était dissous dans 5 du sulfoxyde de diméthyle à moins de 1% et la solution obtenue
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était filtrée aseptiquement à travers un filtre. 5 cl de la solution ont été ajoutés dans le puits avec un micropipette stérilisée 24 heures après le début de l'incubation. Après avoir cultivé à 370C pendant 72 heures dans du C02 à 5 X, le liquide surnageant de la culture recuillie a été soumis à la mesure.
La mesure a été effectuée comme suit. Du plasminogène, 5 pi, a été introduit dans un puits d'une plaque de fibrine (fabriquée par l'Institut Kitazato) que l'on a laissée reposer jusqu'à ce que la diffusion soit terminée. Après diffusion, on a introduit 5 ni du liquide surnageant, puis on l'a placé dans un incubateur à gaz carbonique à 37OC. Quatre heures après, on a effectué une évaluation par formation d'un cercle de lyse transparent du à la fibrinolyse. Dans ce cas, il a été confirmé qu'un cercle transparent se formait simultanément par fibrinolyse dans un puits dans lequel on avait introduit du t-PA comme témoin positif. Le diamètre du cercle transparent était de 9 à 10 mm.
Dans le cas du liquide surnageant additionné du composé de la présente invention, on a noté également un cercle transparent dû à la fibrinolyse présentant un diamètre de 4,5 à 8,5 mm. Cependant, dans le cas du liquide surnageant non additionné de composé de la présente invention (témoin) on n'a observé aucune modification. Dans le cas de la formation d'un cercle de 4 mm ou davantage dû à la fibrinolyse, une capacité thrombolytique des cellules CPAE a été considérée comme induite.
Après avoir vérifié l'activité fibrinolytique, le puits a été fixé avec 2,5 % de glutaraldéhyde dans une concentration finale. Puis, la solution a été jetée et le système a été lavé avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Après lavage, on a éliminé l'humidité. Après coloration avec 100 pi de violet cristal à 0,1 % et après avoir laissé reposer 2 à 3 minutes,
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on a lavé le système à l'eau courante. Après avoir éliminé l'excès de solution de coloration, on a éliminé l'humidité et le colorant lié aux cellules a été élué avec 100 ni de méthanol.
En utilisant un balayage multiple (Titertech), on a effectué des mesures à une longueur d'onde de 580 nm conformément à la méthode ABS et à la méthode de la matri- ce pour confirmer que les cellules n'étaient pas lésées.
Le diamètre en mm du cercle dû à la fibrinolyse est indiqué dans le tableau 4. On voit clairement que les composés de la présente invention présentent une activité thrombolytique.
TABLEAU 4
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<tb>
<tb> Composé <SEP> ne <SEP> Diamètre <SEP> (mm) <SEP> Composé <SEP> nO <SEP> Diamètre <SEP> (mm)
<tb> 2 <SEP> 7,9 <SEP> 25 <SEP> 4,1
<tb> 8 <SEP> 6,3 <SEP> 26 <SEP> 5,7
<tb> 9 <SEP> 8,2 <SEP> 27 <SEP> 8,5
<tb> 10 <SEP> 4, <SEP> 5 <SEP> 28 <SEP> 8,3
<tb> 12 <SEP> " <SEP> 5,9 <SEP> 29 <SEP> 7,1
<tb> 14 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP> 30 <SEP> 7,6
<tb> 15 <SEP> 6,3 <SEP> 31 <SEP> 7,9
<tb> 17 <SEP> 7,5 <SEP> 32 <SEP> 7,5
<tb> 18 <SEP> 6,8 <SEP> 33 <SEP> 7,8
<tb> 19 <SEP> 5,8 <SEP> 34 <SEP> 7,6
<tb> 20 <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> 35 <SEP> 7,8
<tb> 21 <SEP> 5,6 <SEP> 36 <SEP> 7,6
<tb> 22 <SEP> 6,5 <SEP> 37 <SEP> 6,9
<tb> 23 <SEP> 8,4 <SEP> 38 <SEP> 6, <SEP> 9
<tb> 24 <SEP> 7, <SEP> 6 <SEP> 2a <SEP> 7,
<SEP> 5
<tb>
EXEMPLE D'ESSAI 5
Activité thrombolytique in vitro
Il a été établi que les composés de la présente invention sont capables d'induire une activité fibrinolytique dans les cellules CPAE. Pour vérifier par quelle substance cette activité fibrinolytique est induite en plus de l'activité d'abaissement de l'a 2-PI, on a effectué une
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analyse sur la solution de culture additionnée du composé nO 2, parmi les composés de la présente invention, par autographie de la fibrine.
Cette solution de culture et du t-PA (activateur du plasminogène des tissus) et de l'urokinase ont été soumis à une électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide en utilisant 10 % de gel. Après l'électrophorèse, le gel a été traité par du Triton X-100 à 2,5 %, on l'a inoculé sur une boite de gélose additionnée de fibrinogène, de thrombine et de plasminogène. Dans un incubateur à 370C dans
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du C02 à 5 %, on a confirmé l'existence d'un emplacement de 2 la fibrine qui provoquait la lyse.
Comme résultat, on a observé une fibrinolyse importante dans le liquide surnageant de la culture additionné du composé de la présente invention, à l'emplacement de masse moléculaire de l'activateur du plasminogène du type urokinase. Il a été établi que le composé de la présente. invention induisait fortement la production d'activateur de plasminogène du type urokinase dans les CPAE.
Essai de toxicité aiguë :
On a utilisé pour chaque groupe d'échantillons d'essai quatre souris mâles de souche ddY âgées de 6 semaines.
Méthode :
Pour l'administration intraveineuse, chacun des échantillons a été dissous dans du sérum physiologique à 0, 9 % et la solution a été administrée par la veine de la queue. Pour l'administration intrapéritonéale, chaque échantillon a été mis en suspension dans du sérum physiologique contenant 0,5 % de CMC et on a administré par voie intrapéritonéale 0, 1 ml de la suspension pour 10 mg de poids corporel des souris. Pour l'administration orale, chacun des échantillons a été mis en suspension dans une solution de CMC à 0,5 % dans du sérum physiologique et on a administré par voie orale 0,2 ml de la suspension pour
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10 mg de poids corporel des souris.
On a effectué l'observation immédiatement après l'administration. Après observation pendant 1 semaine après l'administration, on a sacrifié les souris avec du chloroforme et on les a autopsiées.
La DL50 de chaque échantillon est résumée dans le tableau suivant. La sécurité des composés de la présente invention est clairement établie. administration intraveineuse :
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(Composé n ) c, n (9/9) 1 3235 2 5091 administration intrapéritonéale : (Composé n ) n (mg/kg)
1 5 000
2 10 000 administration orale : (Composé n ) DL50 (mg/kg)
1 7 500
2 10 000
EXEMPLE 1
Pour un comprimé, on a ajouté les composés suivants au composé (Composé n 2) de la présente invention, et on a préparé des comprimés de la manière classique.
Par comprimé (dans 300 mg)
Composé de la présente invention (Composé n 2) 200 mg
Lactose 50 mg
Amidon de mais 20 mg
Hydroxypropylcellulose à bas degré de substitution 15 mg
Hydroxypropylcellulose 5 mg
Stéarate de magnésium 10 mg
300 mg
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EXEMPLE 2
Pour 1 ampoule, on a ajouté les composés suivants au composé (Composé nO 2) de la présente invention et on a obtenu des ampoules pour injection d'une manière classique.
Par ampoule (dans 10 ml)
Composé de la présente invention (Composé n 2) 200 mg
Chlorure de sodium 90 mg
Eau distillée pour injection. s.
10 ml
La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaîtront à l'homme de l'art.