KR960009417B1 - 순환기용제 - Google Patents

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닛본 신야쿠 가부시기가이샤
아만 히데아키
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Abstract

내용없음

Description

순환기용제
본 발명은 하기 ①-④로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 주성분으로 하는 혈전 용해제등에 관한 것이다:
① 하기 일반식(II)로 표시되는 화합물, 그 생리학적 허용 산부가염, 및 그 4급염,
② 노지리마이신 및 그 생리학적 허용 산부가염,
③ 1,4-비스(3-모라놀리노-1-프로페닐)벤젠 및 그 생리학적 허용 산부가염,
④ 카스타노스페르민 :
Figure kpo00001
상기 식에서, R2수소, 알킬, 카르복시알킬, 알킬옥시카르보닐알킬, 히드록시알킬, 시클로알킬알킬, 치환 아릴알킬, 무치환 아릴알킬, 치환아릴옥시알킬, 무치환 아릴옥시알킬, 알케닐, 히드록시알케닐, 치환아릴알케닐, 무치환 알릴알케닐, 아릴옥시알케닐 또는 알킬카르바모일알킬을 나타낸다.
혈관에 물리적 손상이 생겼을 경우에 생기는 지혈전의 생성하는 혈소판의 응집에 이어지는 피브린의 석출이 없어서는 안된다. 한편, 지혈전은 혈관내에서 혈류를 저해하여 조직의 허혈이나 괴사를 초래하여 심근경색, 뇌경색의 원인으로 되기 때문에, 생체는 혈관내의 과잉의 혈전을 제거하는 기구를 구비하고 있지만, 상기 기구의 큰 역할을 담당하는 것이 플라스미노겐 플라스민계에 의한 피브린 분해 작용이다.
플라스미노겐은 플라스미노겐 활성화 인자에 의해 활성화되어 플라스민으로 되고, 플라스민이 피브린을 분해하다[선용(線溶)]. 상기 기구에 이상이 생기는 것에 의해 심근경색, 뇌경색등의 병폐가 발생한다.
이들 현대병의 원인은 가지각색이지만, 그 치료에 있어서는 생성된 혈전을 용해하고 조직의 허혈 상태를 개선하는 혈전 용해 요법이 유효하며, 그 때문에 우로키나제나 스트렙토키나제등의 플라스미노겐 활성화 인자를 투여하는 것이 행해지고 있다. 따라서, 우로키나제의 분비를 촉진하는 물질은 상기 혈전용해 요법을 수행함으로서 양호한 의약품으로될 가능성이 있었다.
생체내에는 과잉의 선용에 대해서도 그것을 저해하는 기구가 구비되어 있어서, 예를들면, 플라스민 저해 물질인 α2-플라스민 저해제(이하 α2-PI라고 함)는 플라스민 작용을 순식간에 저해하여 피브린 분해를 저지하는 것으로 판단된다. 따라서 α2-PI는 혈전 용해 요법시에는 치료 저지 인자로서 작용하며, 또 일종의 급성기 단백질로서 수술후에 발생하여 수술후 혈전의 원인의 하나로도 되어있다.
싱가와 같은 것으로해서 α2-PI의 활성을 저하시키는 약제가 있으면, 혈전 용해 요법의 효과를 더욱 높이고, 또 수술후 혈전이나 혈전중의 예방에도 이바지하고 있는 것이 시사되고 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 심근경색, 뇌경색 치료에 유효한 의약품을 제조하기 위해, 뛰어난 α2-PI 저해제를 제공하는데 있었다.
또한, 우로키나제가 플라스미노겐 활성화 인자인 것으로 해서, 우로키나제의 분비를 촉진하는 물질을 제공하는 것도 본 발명의 중요한 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명자들은 많은 화합물군을 스크리닝하고 있지만, 매우 특이한 요행으로 본 발명에 의한 화합물이 뛰어난 α2-PI 활성 저하 작용 및 우로키나제 분비촉진 작용을 갖고 있는 것을 알아냈고, 또 이들 화합물이 α2-PI 활성 저하 작용과 동시에 우로키나제에 의한 혈전 용해 효과시에 그 용해 촉진 효과를 갖는 것도 발견되어, 본 발명에 도달할 수 있었다.
본 발명 화합물은 이후에 상세히 기술하는 바와 같이, 뛰어난 α2-PI 저하작용 및 우로키나제 분비 촉진 작용을 가지며, 혈전 용해 치료제로서 심근 경색, 뇌경색의 치료를 위한 의약품으로 되기 때문에 매우 중요하다.
본 발명 화합물은 특허청구의 범위에 기재한 구조상의 특징을 가지고 있다.
일반식(I), (II)의 R1, R2로서는 상기 치환기등을 들 수 있다.
이때, 알킬이란 탄소수 1-10정도의 것을 들 수 있지만, 예를들어, 메틸, 에틸등의 저급알킬이 바람직하다.
카르복시알킬로서는 예를들어, 카르복시메틸, 카르복시에틸, 카르복시프로필등을 들 수 있지만, 알킬의 탄수소가 보다 큰 것도 본 발명 화합물에 포함되는 것이다.
알킬옥시카르보닐알키로서는, 예를들어, 메톡시 카르보닐메틸, 메톡시카르보닐에틸, 메톡시 카르보닐프로필, 메톡시 카르보닐부틸, 에톡시카르보닐메틸, 에톡시 카르보닐에틸, 에톡시 카르보닐프로필, 에톡시카르보닐부틸 등을 들 수 있지만, 알킬의 탄소수가 보다 큰 것도 본 발명 화합물에 포함되는 것이다.
히드록시알킬로서는, 예를들어, 히드록시메틸, 히드록시에틸, 히드록시프로필, 히드록시부틸 등을 들 수 있지만, 알킬의 탄소수가 보다 큰 것도 본 발명 화합물에 포함되는 것이다.
시클로알킬알킬로서는, 예를들어, 시클로프로필메틸, 시클로부틸메틸, 시클로펜틸메틸 등을 들 수 있지만, 알킬의 탄소수가 보다 큰 것도 본 발명 화합물에 포함되는 것이다.
아릴알킬로서는, 예를들어, 벤질, 펜에틸, 페닐프로필, 페닐부틸, 페닐펜틸, 나프틸메틸, 나프틸에틸, 나프틸프로필, 나프틸부틸 등을 들 수 있지만, 알킬의 탄소수가 보다 큰 것도 본 발명 화합물에 포함되는 것이다.
아릴옥시알킬로서는, 예를들어, 펜옥시메틸, 펜옥시에틸, 펜옥시프로필, 펜옥시부틸, 나프틸옥시메틸, 나프틸옥시에틸, 나프틸옥시프로필, 나프틸옥시부틸 등을 들 수 있지만, 알킬의 탄소수가 보다 큰 것도 본 발명 화합물에 포함되는 것이다.
알케닐로서는, 예를들어, 비닐, 프로페닐, 부테닐 등을 들 수 있지만, 탄소수가 보다 큰 것도 본 발명 화합물에 포함되는 것이다.
히드록시알케닐로서는, 예를들어, 히드록시비닐,히드록시프로페닐, 히드록시부테닐 등을 들 수 있지만, 탄소수가 보다 큰 것도 본 발명 화합물에 포함되는 것이다.
아릴알케닐로서는, 예를들어, 페닐비닐, 페닐프로페닐, 페닐부테닐, 나프틸비닐, 나프틸프로페닐, 나프틸부테닐 등을 들 수 있지만, 탄소수가 보다 큰 것도 본 발명 화합물에 포함되는 것이다.
아릴옥시알케닐로서는, 예를들면, 펜옥시비닐, 펜옥시프로페닐, 펜옥시부테닐, 나프틸옥시비닐, 나프틸옥시프로페닐, 나프틸옥시부테닐 등을 들 수 있지만, 탄소수가 보다 큰 것도 본 발명 화합물에 포함되는 것이다.
알킬카르바모일알킬로서는, 예를들어, 메틸카르바모일메틸, 메틸카르바모일에틸, 메틸카르바모일프로필등을 들 수 있지만, 탄소수가 보다 큰 것도 본 발명 화합물에 포함되는 것이다.
본 발명 화합물로서는 상기한 것외에 모라놀린 기본골격에서 1위치가 OH로 치환된 노지리마이신 및 그 유도체(예를들면, N치환체)를 들 수 있다. 이들 화합물군도 역시 모라놀린의 유도체(N 치환체)와 같은 작용을 가지며, 본 발명 화합물에 포함되는 것이다.
본 발명 화합물에는 또한 모라놀린 기본 골격을 비스체로 하여 갖는 화합물도 포함된다. 이들도 역시 다른 본 발명 화합물과 같은 약리효과를 가지고 있다.
이들 화합물의 대표예로서, 본 발명 화합물에는 노지리마이신 및 그 생리학적으로 허용되는 염, 및 1,4-비스(3-모라놀리노-1-프로페닐)벤젠 및 그 생리학적으로 허용되는 염이 포함된다. 이들도 역시 그 밖의 본 발명 화합물과 같이, 뛰어난 α2-PI 저하 작용 및 우로키나제 분비 촉진작용을 갖는 것이다.
본 발명 화합물은 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를들어, N-부틸모라놀린의 제조예를 하기에 기술한다.
[제조예 1]
모라놀린 50g, n-부틸브로마이드 126g, 탄산칼륨 170g을 디메틸포름아미드 1300ml 중에 가하고, 실온에서 7일간 교반하여 반응을 완결시켰다. 여과에 의해 불순물을 제거한 후 용매를 감압하에 증류제거하여 강산성 이온 교환 수지 도웩스 50W×2(H+) 1000ml를 통과시키고, 충분히 수세한 다음, 1N 암모니아수로 용출했다. 용출액을 감압하에 농축한 다음, 메탄올 50ml을 가하여 실온에 방치해서 생긴 결정(47g)을 모았다.
이것을 메탄올 500ml에 열용해시킨 후, 실온까지 냉각시킨 다음, 활성탄으로 처리하여, 약 100ml까지 농축시킨 다음, 실온으로 방치하여 석출한 결정 40g을 모았다. 이것을 메탄올 200ml에 열용해시킨 후, 가볍게 농축하여 실온으로 방치해서 석출한 결정을 모아, 70℃, 감압하에 충분히 건조시켜 목적물인 N-(n-부틸)모라놀린 34g을 얻었다.
수율 50.6%, 융점 128-129℃
원소분석치
계산치(%) : C : 54.78, H : 9.65, N : 6.39
실측치(%) : C : 54.57, H : 9.65, N : 6.60
[α]
Figure kpo00002
= -14.59°(1%, 물)
1H-NMR : 0.88(3H,t,J=7.2Hz, CH3CH2CH2CH2-), 1.16-1.56(4H,m,J=7.2Hz, CH3CH2CH2CH2-), 2.17-2.36(2H,m,J=7.2Hz, CH3CH2CH2CH2-), 2.48-2.82(2H,m,H-1a,H-5), 3.02(1H,dd,J=5.1,11.4Hz,H-4), 3.22(1H,t,J= 9.0Hz,H-4), 3.66(1H,t,J=9.4Hz,H-4), 3.44-3.60(1H,m,H-2), 3.74-3.96(H×2, dd×2, H6, H6,-)
[제조예 2]
모라놀린 5g, n-부틸브로마이드 13g, 탄산칼륨 17g을 디메틸포름아미드 130ml 중에 가하고, 100℃에서 5시간 반응시켰다. 제조예 1과 같이 처리하여, N-(n-부틸)모라놀린 5.1g을 얻었다. 수율 75.8%
[제조예 3]
5g의 모라놀린을 100ml의 메탄올중에 가하고, 실온에서 교반하면서 0.7g의 염화수소를 녹인 메탄올 50ml에 20ml의 n-부틸알데히드를 녹인 용액과 3g의 NaCNBH3를 가하여 밤새 반응시켰다. 반응 후, 감압하에 용매를 제거하고, 녹여서 클로로포름으로 분해했다. 수층을 200ml의 다이아이온 SA-11A(OH-)형의 컬럼에 통과시켜 충분히 수세했다. 통과액과 세액을 합쳐 200ml의 도웩스 50W×28H+의 컬럼에 통과시켜 충분히 수세한 다음 1N 암모니아수로 용출했다. 용출액을 감압하에서 용매를 증류제거한 다음, 에탄올로 결정화시키고, 에탄올로 재결정하여 5.1g의 N-(n-부틸)모라놀린을 얻었다. 수율 75.8%
본 발명 화합물의 전형적인 예로서 다음의 화합물을 들 수 있다.
화합물 번호 1
모라놀린
화합물 번호 2
N-메틸모라놀린
화합물 번호 2a
N-(n-부틸)모라놀린
화합물 번호 3
N-5-메톡시카르보닐펜틸모라놀린 토실레이트
화합물 번호 4
N-히드록시에틸모라놀린
화합물 번호 5
(N-메톡시카르보닐부틸)모라놀린
화합물 번호 6
노지리마이신 비설파이트
화합물 번호 7
1,4-비스(3-모라놀리노-1-프로페닐)벤젠 이염산염
화합물 번호 8
N-헥실모라놀린 토실레이트
화합물 번호 9
N-이소프레닐모라놀린
화합물 번호 10
N-(2-히드록시데실)모라놀린 토실레이트
화합물 번호 11
N-10-카르복시데실모라놀린 나트륨염
화합물 번호 12
N-(3-페닐프로필)모라놀린 토실레이트
화합물 번호 13
N-벤질모라놀린 토실레이트
화합물 번호 14
N-신아밀모라놀린 염산염
화합물 번호 15
N-(4-페닐부틸)모라놀린 토실레이트
화합물 번호 16
N-(2-펜옥시에틸)모라놀린
화합물 번호 17
N-(3-펜옥시프로필)모라놀린 토실레이트
화합물 번호 18
N-(5-페닐펜틸)모라놀린 토실레이트
화합물 번호 19
N-(2-시클로펜틸에틸)모라놀린 토실레이트
화합물 번호 20
N-[3-(3-메톡시에톡시페닐)-2-부테닐]모라놀린
화합물 번호 21
N,N-디메틸모라놀린 암모늄 요오드화물
화합물 번호 22
N-에틸모라놀린
화합물 번호 23
N-신아밀모라놀린
화합물 번호 24
N-게라닐모라놀린 토실레이트
화합물 번호 25
N-(2-히드록시-3-펜옥시프로필)모라놀린 토실레이트)
화합물 번호 26
n-팔네실모라놀린 토실레이트
화합물 번호 27
N-10-(N-메틸카르바모일)데실모라놀린
화합물 번호 28
N-(4-페닐-3-부테닐)모라놀린 토실레이트
화합물 번호 29
N-(3-페닐-2-메틸-2-프로페닐)모라놀린
화합물 번호 30
N-(3-o-클로로펜옥시프로필)모라놀린
화합물 번호 31
n-(γ-메틸-4-브로모신아밀)모라놀린
화합물 번호 32
N-[4-(3-플루오로-4-메틸페닐)부틸]모라놀린
화합물 번호 33
N-(p-에톡시신아밀)모라놀린
화합물 번호 34
N-(p-이소프로폭시신아밀)모라놀린
화합물 번호 35
N-(γ-메틸-m-메틸신아밀)모라놀린
화합물 번호 36
N-(4-m-메톡시페닐-3-펜테닐)모라놀린
화합물 번호 37
N-(p-에톡시카르보닐펜옥시에틸)모라놀린[에미글리테이트(emiglitate)]
화합물 번호 38
카스타노스페르민
본 발명에 의한 화합물로서는 상기에 게재한 것 외에 예를들면 다음의 것을 들 수 있다.
N-이소부틸모나놀린 토실레이트
N-히드록시에틸모나놀린 토실레이트
N-아미노모라놀린 히드로브로마이드
N-메톡시에틸모라놀린 토실레이트
N-메톡시에톡시에틸모라놀린 토실레이트
N-데실모라놀린 토실레이트
N-(2-히드록시헥사데실)모라놀린 토실레이트
N-(2-히드록시-3-9-톨릴옥시프로필)모라놀린 토실레이트
N-(2-히드록시-3-p-메톡시페닐옥시프로필)모라놀린 토실레이트
N-(2-히드록시-3-p-클로로페닐옥시프로필)모라놀린 토실레이트
N-3-카르바모일프로필모라놀린
N-노닐모라놀린 토실레이트
N-운데실모라놀린 토실레이트
N-(2-히드록시테트라데실)모라놀린 토실레이트
N-(4,4-디페닐-3-부테닐)모라놀린
N-5-카르복시펜틸모라놀린
N-팔네실모라놀린
N-(γ-메틸-4-클로로신아밀)모라놀린
N-(γ-메틸-4-메틸신아밀)모라놀린
N-(4-p-클로로페닐-3-펜테닐)모라놀린
N-(4-m-클로로페닐-3-펜테닐)모라놀린
N-(4-o-클로로페닐-3--펜테닐)모라놀린
N-(4-p-펜옥시페닐-3-펜테닐)모라놀린
N-(4-p-에톡시페닐-3-펜테닐)모라놀린
N-(m-메톡시신아밀)모라놀린
N-[3-(3-클로로페닐)-2-부테닐]모라놀린
N-[4-(4-클로로로페닐-3-부테닐]모라놀린
N-(4-카르복시신아밀)모라놀린 염산염
N-(3-카르복시-2-프로페닐)모라놀린
N-(m-트리에틸암모니오에톡시신아밀)모라놀린 디피클레이트
N-이소프로필모라놀린
N-(p-트리메틸암모니아에톡시신아밀)모라놀린 클로라이드 염산염
본 발명 화합물을 의약으로서 투여할 경우, 본 발명 화합물은 그대로 또는 의약적으로 허용되는 무독성 또한 불활성 담체중에, 예를들면, 0.1%-99.5%, 바람직하게는 0.5%-90% 함유하는 의약 조성물로서 사람을 포함하는 동물에 투여된다.
담체로서는 고형, 반고형, 또는 액상의 희석제, 충전제 및 그 밖의 처방용의 조제 1종 이상이 사용된다. 의약 조성물은 투여단위 형태로 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명 의약조성물은 경구투여, 정맥내투여 등의 조직내 투여, 국소투여(경피투여 등) 또는 경직장적으로 투여할 수 있다. 이들의 투여방법에 적합한 제형으로 투여되는 것은 물론이다. 예를들면, 경구투여가 특히 바람직하다.
혈전 용해치료제로서의 용량은 연령, 체중등의 환자의 상태, 투여경로, 질병의 성질과 정도등을 고려한 다음 조제하는 것이 바람직하지만, 보통은 성인에 대해 본 발명의 유효성분량으로서 1일당 50-3000mg/사람의 범위, 바람직하게는 500mg-1000mg/사람의 범위가 일반적이다. 경우에 따라서는 이 이하로도 족하며, 또한, 반대로 이 이상의 용량을 필요로 하는 일도 있다.
또한, 1일 2-3회로 분할하여 투여하는 것이 바람직하다.
[실시예]
다음에 본 발명 화합물 α2-PI 저하작용, 우로키나제 분비 촉진 작용 및 독성에 대해 상세히 기술하고, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
시험예 1
시험관내에서의 활성
사람의 간암에서 유래한 HepG 2 세포는 α2-플라스민 저해제(α2-PI)를 합성하고, 분비하는 것이 알려져 있다. 이 HepG2 세포 2×106개를 팔콘 제품의 플라스틱 배양 플레이트(직경 100mm)에 뿌리고, 10%의 소 태아 혈청을 포함하는 이글 최소 배지를 사용하여 배양했다.
3일후, 플레이트 바닥면에 부착한 세포를 다루벡코 인산 완충액으로 2회 세정한 다음, 본 발명 화합물 피험검체를 200㎍/ml 포함하는 무혈청 이글배지(페놀레드 포함자히 않음) 8ml을 사용하여 다시 3-4일간 배양했다. 배양후, 배지 7ml을 채취하여, 아미콘 제품의 센트리플로(CF 25)를 사용하여 약 1ml로 농축하고, 다시 동결건조했다.
동결건조한 샘플에 염산 모노메틸아민 8.1mg/ml을 포함하는 50mM 트리스 완충액 0.7ml을 가하여 용해함으로써 약 10배로 농축했다. 농축한 샘플 100μl에 50μl의 15mCU 플라스민액을 가하고, 다시 50μl의 0.25몰 S-2251 합성 발색 기질액을 가하고, 37℃에서 10분간 반응시켰다. 2% 구연산 용액 1ml을 가함으로써 반응을 정지시키고, O.D. 405nm로 S-2251기질에서 유리되는 p-니트로아닐리드를 측정했다.
농축 샘플대신 상술한 트리스 완충액을 사용하여, S-2251 기질의 분해를 측정한 것을 플라스민 활성 100%의 대조용으로 한 다음, 피험검체를 가하지 않고 배양한 농축샘플을 α2-PI활성 100%의 대조용으로 했다. 얻어진 결과는 다음식에 따라 계산했다.
α2-PI활성(%) =
Figure kpo00003
×100
A1는 100% 대조용의 흡광도를, A2는 농축샘플을 사용했을때의 흡광도를, 또한 A3는 α2-PI 활성 100% 대조용의 흡광도를 각기 나타낸다. 샘플수는 각기 3개였다. 결과를 표 1에 나타냈다. 본 발명 화합물이 α2-PI활성을 저하시키는 것은 명백하다.
[표 1]
Figure kpo00004
시험예 2
생체내에서의 활성
투여대상 동물로서 수컷 비글견을, 대조용군, 투여군 각기 3마리씩 사용했다.
피험검체(화합물 번호 2)는 0.1몰 인산완충액(pH 7.2)을 사용하여 0.1ml당 100mg이 되도록 용해했다. 용해후, 멸균 필터(공극 크기 0.2 μm)를 사용하여 여과 멸균시킨 다음에, 체중 1kg당 0.3ml 투여했다.(30mg/kg). 투여는 우전지 정맥으로 7일간 실시했다. 채취한 혈액은 3.8% 구연산나트륨 1부피에 대해 혈액 9부피가 되도록 혼합하고, 3000rpm, 15분간 원심분리하여 혈장을 분리했다.
α2-PI 활성은 합성 발색 기질 S-2251의 플라스민 분해에 대한 저해작용으로서 측정했다. 측정결과는 피험검체 투여전의 플라스민 저해활성을 100%로 하여 그것에 대한 투여후의 저해활성의 변화로서 나타냈다(표 2).
각 샘플수는 3개였다.
α2-PI 활성은 피험검체의 300mg/kg 연속 투여에 의해 명백히 저하됐다.
[표 2]
Figure kpo00005
C는 대조용을 나타내며, 검체는 피험검체를 나타낸다.
시험예 3
시험관내에서의 혈전 용해 시험
피험검체(화합물 번호 2)를, 30mg/kg의 용량으로 비글견에 대해 1일 1회 연속투여하고, 투여전, 투여 4일째에 혈장을 상술한 바와 같이 분리했다. 혈장중의 α2-PI 활성을 측정하는 동시에 그 혈장을 사용하여 시험관내에서의 피브린 덩어리를 제작하고, 혈전용해제인 우로키나제를 작용시켰을때의 용해도를, 투여전 혈장과 투여 4일 후 혈장과의 사이에서 비교했다.
분리한 혈장 300μl에125I-피브리노겐(0.1mCi/ml)을 40μl 가하여 혼합하고, 이것을 50μl씩 시험관에 나누어 주입했다. 25U/ml 트롬빈, 0.5M 염화칼슘 혼합용액을 각 시험관에 5μl씩 가하고, 37℃에서 분간 배양하여 피브린 덩어리를 제작했다. 2% 알부민 용액 및 이 액에 우로키나제를 15, 30U/ml가 되도록 용해한 것을, 각기 시험관에 1ml씩 가했다.
37℃로 12시간 배양시키고, 상청액 25μl를 RAI용 튜브에서 채취하고, γ-카운터로 상청액중에 유리되는125I-피브린 분해물을 측정했다. 샘플수는 각기 3개였다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 피험검체의 투여에 의해 α2-PI 활성이 저하된 혈장을 사용했을 경우, 투여전 혈장에서 피브린 덩어리의 용해가 항진된 것을 명백하다.
[표 3]
Figure kpo00006
시험예 4
시험관내에서의 혈전 용해 시험
수립 혈관내피 세포 배양계에 있어서의 혈전 용해 활성 유도 능력을 CPAE(소 폐동맥 혈관 내피 세포 Endothelia)를 사용하여 검토했다.
CPAE 세포는 다이닛뽄 세이야꾸 러보러토리 프로덕츠부에서 구입했다. CPAE 세포는 25cm2의 배양 플라스크에 10% FCS-이글 MEM 배지를 사용하여 계하고, 계대대시에 분취한 세포 현탁액에서 0.1ml를 멸균시킨 피펫으로 시험관에 옮긴다음, 트리판블루 용액 0.9ml로 10배 희석하여 혈구 계산쟁반으로 세포수를 계측하고, 세포수가 2×105세포/ml가 되도록 10% FCS-이글 MEM 배지에서 희석한 다음, 96웰의 마이크로 타이터플레이트(코닝 제품)에 각 웰 100μl씩, 즉, 2×104세포/웰이 되도록 마이크로피펫으로 주입했다. 플레이트는 37℃, 5% CO2중에서 배양을 개시했다.
배양개시후 24시간째에 본 발명 화합물을 0.2mg/ml가 되도록 배지에서 용해하고, 용해되지 않는 것은 1% 이하의 DMSO에 용해한 용액을 필터를 사용하여 무균여과해서, 이의 5μl를 멸균시킨 마이크로피펫으로 웰에 가하여 37℃, 5% CO2중에서 72시간 배양한 다음, 채취한 배양상청을 측정에 제공했다.
측정은 피브린플레이트(北里硏究所제품)의 웰에 플라스미노겐을 5μl주입하여 확산할때까지 방치한다. 확산후 배양 상청액을 5μl주입한 다음, 37℃의 탄산가스 배양기중에 넣어, 4시간 후에 선용에 의한 투명한 용해원의 형성을 가지고 판정한다. 이때 동시에 포지티브 대조용으로서 t-PA를 넣어 웰에서 선용에 의한 투명한 원이 생기는 것을 확인했다. 이의 투명한 원의 직경은 9-10mm였다.
본 발명 화합물을 첨가한 배양 상청액의 경우에도 4.5-8.5mm의 투명한 용해원을 볼 수 있었지만, 본 발명 화합물을 첨가하지 않는 세포의 배양상청액의 경우(대조용)에는 아무런 변화도 볼 수 없었다. 4mm이상의 용해원을 형성했을 경우, CPAE 세포의 혈전 용해능력을 유도한 것으로 판정했다.
선용활성의 체크를 종료한 다음, 웰을 최종농도 2.5% 글루타르알데히드로 고정시킨 다음, 액을 버리고 PBS로 세정한 다음, 물기를 없애기 0.1% 크리스탈바이올렛을 100μl 넣어 염색하고, 2-3분간 방치후, 흐르는 물에 흐르게 한다.
여분의 염색액을 증류 제거한 다음, 물기를 없애고 100μl의 메탄올로 세포에 결합하고 있는 색소를 용출하여, 멀티스캔(타이터 텍)을 사용하여 ABS법과 매트릭스 법에 의한 측정을 파장 580nm으로 하여 세포가 장해를 받지 않았음을 확인했다.
표 4에 용해원의 직경(mm)을 나타냈다. 본 발명 화합물의 혈전 용해 작용이 명백하다.
[표 4]
Figure kpo00007
시험예 5
시험관내에서의 혈전 용해 시험
본 발명 화합물이 CPAE 세포에서 선용 활성의 유도능력을 갖는 것으로 판명되었지만, 상기 선용활성이 α2-PI 저하작용 외에 어떤 물질에 의해 생기고 있는지를 확인하기 위해, 본 발명 화합물중 화합물 번호 2를 가한 배양액에 대해 피브린오토그래피의 수법을 사용하여 해석했다.
10% 겔을 사용한 SDS-폴리아크릴 아미드겔로 상기 배양액과 t-PA(조직형 플라스미노겐 액티베이터)와 우로키나제를 전기 영동시킨다. 영동후, 이 겔을 2.5% 트리톤 X-100으로 처리하고 피브리노겐, 트론빈, 및 플라스미노겐을 가한 한천평판상에 올려놓고, 37℃, 5% CO2의 배양기에 넣어 피브린의 용해위치를 확인했다.
그 결과, 본 발명 화합물 첨가 배양 상청액에서는 우로키나제형의 플라스미노겐 액티베이터의 분자량 위치에서 커다란 피브린의 용해를 볼 수 있었고, 본 발명 화합물을 CPAE에서 우로키나제형의 플라스미노겐 액티베이터의 생성을 강력하게 유도하고 있다는 것이 명백해졌다.
급성 독성시험
ddY계 수컷 마우스, 6주령을 피험검체당4마리씩 사용했다.
실험 방법
정맥내 투여에서는 각 검체를 0.9% 생리식염수에 용해한 후, 꼬리 정맥으로 투여했다. 복강내 투여에서는 각 검체를 0.5% CMC-생리식염수로 현탁시키고, 마우스 체중 10kg당, 0.1ml를 복강내 투여했다. 경구 투여에서는 각 검체를 0.5% CMC-생리식염수로 현탁시켜 마우스 체중 10kg당 0.2ml를 경구투여했다.
투여 직후부터 관찰을 하고, 투여후 1주일간 관찰한 다음 클로로포름으로 도살하여 부검했다.
각 피험검체의 LD50을 다음 표에 정리했다. 본 발명 화합물의 안전성이 명백하다.
정맥내 투여
Figure kpo00008
복강내 투여
Figure kpo00009
경구 투여
Figure kpo00010
실시예 1
본 발명 화합물(화합물 번호 2)에 1개의 정제당 하기의 물질을 가하여 보통의 방법으로 정제를 얻었다.
1개의 정제중에서(300mg 중)
Figure kpo00011
실시예 2
본 발명 화합물(화합물 번호 2)에 1개의 관당 하기의 물질을 가하고, 보통의 방법으로 주사제를 얻었다.
Figure kpo00012

Claims (3)

  1. 하기 ①-④로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 주성분으로 하는 α2-플라스민 저해제의 활성 저하제 :
    ① 하기 일반식(I)로 표시되는 화합물, 그 생리학적 허용 산 부가염, 및 그 4급 염,
    ② 노지리마이신 및 그 생리학적 허용 산 부가염,
    ③ 1,4-비스(3-모라놀리노-1-프로페닐)벤젠 및 그 생리학적 허용 산 부가염,
    ④ 카스타노스페르민 :
    Figure kpo00013
    상기 식에서, R1은 수소, 알킬, 카르복시알킬, 알킬옥시 카르보닐알킬, 히드록시알킬, 시클로알킬알킬, 아릴알킬, 아릴옥시알킬, 알케닐, 치환아릴알케닐 또는 무치환 아릴알케닐을 나타낸다.
  2. 하기 ①-④로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 주성물으로 하는 우로키나제 분비 촉진제 :
    ① 하기 일반식(II)로 표시되는 화합물, 그 생리학적 허용 산 부가염, 및 그 4급 염,
    ② 노지리마이신 및 그 생리학적 허용 산 부가염,
    ③ 1,4-비스(3-모라놀리노-1-프로페닐)벤젠 및 그 생리학적 허용 산 부가염,
    ④ 카스타노스페르민 :
    Figure kpo00014
    상기 식에서, R2는 수소, 알킬, 카르복시알킬, 알킬옥시 카르보닐알킬, 히드록시알킬, 시클로알킬알킬, 치환 아릴알킬, 무치환 아릴알킬, 치환아릴옥시알킬, 무치환 아릴옥시알킬, 알케닐 히드록시알케닐, 치환 아릴알케닐, 무치환 아릴알케닐, 아릴옥시알케닐 또는 알킬카르바모일알킬을 나타낸다.
  3. 하기 ①-④로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물을 주성분으로 하는 혈전용해제 :
    ① 하기 일반식(II)로 표시되는 화합물, 그 생리학적 허용 산 부가염, 및 그 4급 염,
    ② 노지리마이신 및 그 생리학적 허용 산 부가염,
    ③ 1,4-비스(3-모라놀리노-1-프로페닐)벤젠 및 그 생리학적 허용 산 부가염,
    ④ 카스타노스페르민 :
    Figure kpo00015
    상기 식에서, R2는 수소, 알킬, 카르복시알킬, 알킬옥시 카르보닐알킬, 히드록시 알킬, 시클로알킬알킬, 치환 아릴알킬, 무치환 아릴알킬, 치환 아릴옥시알킬, 무치환 아릴옥시알킬, 알케닐 히드록시알케닐, 치환 아릴알케닐, 무치환 아릴알케닐, 아릴옥시알케닐 또는 알킬카르바모일알킬을 나타낸다.
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