CH677610A5

CH677610A5 -

Info

Publication number: CH677610A5
Application number: CH4527/88A
Authority: CH
Inventors: Yoshiaku Yoshikuni; Nobutoshi Ojima; Kazuya Mori
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1987-12-09
Filing date: 1988-12-07
Publication date: 1991-06-14
Also published as: EP0319986A2; BE1004874A4; GB2213374B; GB2213374A; FR2626470A1; GB8827701D0; KR960009417B1; EP0319986B1; KR890009399A; DE3855824T2; ATE149836T1; DE3855824D1; IL88573A; GB8827927D0; FR2626470B1; EP0319986A3; CA1316831C; SE8804436D0; SE502110C2; SE8804436L

Description

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Cil Oïï 010 AS

Description

La présente invention concerne une composition thrombolytique, comprenant comme ingrédient principal un composé choisi dans le groupe constitué des composés ci-dessous:

a) un composé représenté par la formule générale (II) ou un de ses sels d'addition aux acides physiolo-giquement acceptables, ainsi qu'un de ses sels d'ammonium quaternaire

OH

CH^-OH

R

dans laquelle

R2 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, carboxyalkyle, alkyloxycarbonylalkyle, hy-droxylkyle, cycloalkylalkyle, arylalkyle substitué ou non substitué, aryloxyalkyle substitué ou non substitué, atcényle, hydroxyalcényle, arylalcényle substitué ou non substitué, aryloxyalcényle ou aikylcarba-moylaikyle, le groupe R2 pouvant, lorsqu'il est le groupe éthyle, être combiné avec le groupe GHaOH adjacent, de façon à former un hétérocycle pentagonal;

b) la npjirimycine ou un de ses sels d'addition aux acides pharmaceutiquement acceptables; et e) le composé de formule:

CH2L~CH=CH

- CH = CH - cnt-M

C^Otf

HOC Ht OH

ou un de ses sels d'addition aux acides physiologiquement acceptables.

Pour la formation du thrombus hémostatique apparaissant dans le cas d'un dommage physique à un vaisseau sanguin, l'agrégation piaquettaire et la précipitation ultérieure de fibrine sont absolument nécessaires. D'autre part, le thrombus inhibe le courant sanguin dans le vaisseau sanguin, provoquant l'ischémie ou la nécrose de tissus, conduisant à l'infarctus du myocarde ou à un infarctus cérébral. Par conséquent, l'organisme vivant est doté d'un mécanisme pour éliminer un excès de thrombus dans le vaisseau sanguin, dans lequel la fibrinolyse par le système plasminogène-plamlne joue un grand rôle.

Le plasminogène est activé par l'activateur du plasminogène pour le transformer en plasmine et la plasmine décompose la fibrine (fibrinolyse). Une anomalie de ce mécanisme provoque des maladies telles qu'infarctus du myocarde, infarctus cérébral, etc.

Pour ces maladies modernes, diverses causes sont envisagées, mais lors du traitement de ces maladies, un traitement fibrinolytique dans lequel le thrombus formé est lysé pour améliorer l'état ischémique du tissu est efficace. A cet effet, on a administré des activateurs du plasminogène tels que l'urokinase, la Streptokinase, etc. Par conséquent, il existe une possibilité qu'une substance destinée à accélérer la sécrétion d'urokinase soit un bon médicament dans le traitement de la thrombolyse décrit ci-dessus.

L'organisme vivant est également doté d'un mécanisme pour le protéger d'une fibrinolyse excessive. Il est connu par exemple que l'inhibiteur de l'oc^-piasmine (désigné ci-après par ««2-PI») qui est un inhibiteur de la plasmine, inhibe instantanément l'activité de la plasmine pour inhiber la fibrinolyse. Par conséquent, l'as-Pi agît comme un inhibiteur du traitement dans le traitement de la fibrinolyse et il revêt également la forme d'une sorte de protéine dans la phase aiguë en devenant une des causes du thrombus postopératoire.

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Compte-tenu de ce qui précède, on suggère qu'un médicament pour abaisser l'activité de I'<x2-PI améliorerait l'effet dans le traitement de la fibrinolyse et servirait à éviter le thrombus ou la thrombose postopératoires.

Un des buts de la présente invention est ce fournir un excellent inhibiteur de l'<x2-PI pour fabriquer des médicaments efficaces pour les traitements de l'infarctus du myocarde et de l'infarctus cérébral.

Un but important de la présente invention est également de fournir une substance pour accélérer la sécrétion de l'urokinase, car l'urokinase est un activateurdu plasminogène.

Pour atteindre les buts ci-dessus, la titulaire a sélectionné de nombreux groupes de composés et, à la suite ce hasards extrêmement heureux, elle a établi que les composés conformes à l'invêntion.possèdent une excellente activité dépressive de I'a2-Pl et une excellente activité d'accélération de la sécrétion d'urokinase, et elle a trouvé en même temps que les composés ont aussi un effet d'accélération de la fibrinolyse en présentant l'effet fibrinolytique, et elle a pu aboutir à la présente invention.

Comme il sera indiqué plus loin, les composés de la présentent invention une excellente activité dépressive de I't*2—PI et une excellente activité d'accélération de la sécrétion d'urokinase et ils peuvent être utilisés comme médicaments pour traiter l'infarctus du myocarde ou l'infarctus cérébral en tant qu'agents fibrinolytiques, de telle sorte que les composés sont extrêmement utiles.

Les composés de ia présente invention ont les caractéristiques structurales indiquées dans les revendications.

Comme R1 et R2 dans les formules générales (I) et (II), ont peut citer les constituants décrits ci-dessus, etc.

Le terme alkyle désigne ici un groupe alkyle en Ci à Cio; on préfère un groupe alkyle inférieur, par exemple un groupe méthyle, éthyle, etc.

Comme groupe carboxyalkyle, ont peut citer par exemple un groupe carboxyméthyle, carboxyéthyle, carboxypropyle, etc. Les groupes alkyle ayant un nombre plus élevé d'atomes de carbone sont également inclus dans les composés de la présente invention.

Comme groupe alkyloxycarbonylalkyle, on peut citer par exemple les groupes méthoxycarbonylmé-thyle, méthoxycarbonyléthyle, méthoxycarbonylpropyle, méthoxycarbonylbutyle, éthoxycarbonylmé-thyle, éthoxycarbonyléthyle, éthoxycarbonylpropyle, éthoxycarbonylbutyle, etc. Les groupes alkyloxycarbonylalkyle ayant un nombre d'atomes de carbone supérieur dans le groupe alkyle sont également inclus dans les composés de la présente invention.

Comme groupe hydroxyalkyle, on peut citer par exemple les groupes hydroxyméthyle, hydroxyéthyle, hydroxypropyle, hydroxybutyle, etc. Les groupes hydroxyalkyle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé dans le groupe alkyle sont également inclus dans la présente invention.

Comme groupe cycloalkylalkyle, on peut citer par exemple les groupes cyclopropylméthyle, cyclobutyl-méthyle, cyclopentylméthyle, etc. Les groupes cycloalkylalkyle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé dans le groupe alkyle sont également inclus dans la présente invention.

Comme groupe arylalkyie on peut citer par exemple les groupes benzyle, phénéthyle, phénylpropylë, phénylbutyle, phénylpentyle, naphtylméthyle, naphtyléthyle, naphtylpropyle, naphtylbutyle, etc. Les groupes arylalkyie ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé dans le groupe alkyle sont également inclus dans la présente invention.

Comme groupe aryloxyalkyle, on peut citer par exemple les groupes phénoxyméthyle, phénoxyéthyle, phénoxypropyle, phénoxybutyie, naphtyloxyméthyie, naphtyloxyéthyle, naphtyloxypropyle, naphtyloxybu-tyle, etc. Les groupes aryloxyalkyle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé dans la partie alkyle sont également inclus dans la présente invention.

Comme groupe alcényle, on peut citer par exempte les groupes vinyle, propényle, butényle, etc. Les groupes alcényle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé sont également inclus dans la présente invention.

Comme groupe hydroxyalcényle, on peut citer par exemple les groupes hydroxyvinyle, hydroxypropé-nyle, hydroxybutényle, etc. Les groupes hydroxyalcényle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé sont également inclus dans la présente invention.

Comme groupe arylalcényle, on peut citer par exemple les groupes phénylvinyle, phénylpropényle, phénylbutényle, naphtylvinyle, naphtyipropényle, naphtylbutényle, etc. Les groupes arylalcényle ayant un nombre d'atomes de carbone plus élevé sont également inclus dans la présente invention.

Comme composés de la présente invention, on peut citer, en plus de ceux décrits ci-dessus, la nojiri-mycine, obtenue en remplaçant l'hydroxyle à la position 1 de la structure de base de la moranoline et de ses dérivés (par exemple des dérivés N-substitués). Un groupe de ces composés présente également des activités similaires à celles des dérivés de la moranoline (dérivés N-substitués) et sont inclus dans les composés de la présente invention.

Les composés ayant la structure de base de la moranoline sous forme bis sont également inclus dans la présente invention. Ces composés présentent eux aussi un effet pharmacologîque similaire à celui des autres composés de la présente invention.

Des exemples représentatifs de ces composés conformes à la présente invention comprennent la noji-rîmycine et ses sels pharmacologiquement acceptables, le 1,4-bis-(3-moranoIino-1-propényl)benzène et ses sels pharmacologiquement acceptables. Ces composés présentent eux aussi une excellente activité

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d'abaissement de l'az-PI et une excellente activité d'accélération de la sécrétion d'urokinase, comme pour les autres composés de la présente invention.

Les composés de la présente invention peuvent être préparés d'une manière classique. On donnera ci-dessous à titre d'exemple un procédé de préparation de la N-butylmoranoline.

EXEMPLE DE PRÉPARATION i)

On ajoute de la moranoline, 50 g, 126 g de bromure de n-butyle et 170 g de carbonate de potassium à 1300 ml de dîméthylformamîde. On agite le mélange à la température ambiante pendant 7 jours pour achever la réaction. Après avoir éliminé les impuretés par filtration, on élimine le solvant par distillation sous pression réduite et on fait passer à travers 1000 ml une résine échangeuse d'ions fortement acide Dowex 50W x 2 (H+). Après avoir lavé soigneusement à l'eau, on effectue l'élution avec de l'ammoniaque 1N. On concentre l'éluat sous pression réduite. On ajoute ensuite au concentré 50 ml de méthanoi. On laisse reposer le mélange à la température ambiante et on recueille les cristaux formés (47 g).

Après avoir dissous les cristaux dans 500 ml de méthanoi en chauffant, on refroidit la solution à la température ambiante, puis on la traite par du charbon activé. Après avoir concentré à environ 100 ml, on laisse reposer le concentré à la température ambiante et l'on recueille 40 g de cristaux qui ont précipité. Après avoir dissous les cristaux dans 200 ml de méthanoi en chauffant, on concentre doucement la solution. On laisse reposer le concentré à la température ambiante et on recueille les cristaux qui précipitent. On sèche à fond les cristaux à 70°C sous pression réduite, ce qui donne 34 g de la N-(n-bu-tyljmoranoline recherchée.

Rendement 50,6%; point de fusion, 128-129°C.

Composition éfémentaire:

Calculé (%) : C : 54,78 H : 9,65 N : 6,39 Trouvé (%) : C ; 54,57 H : 9,65 N : 6,60 [cc]|4 =-14,59 (1%, eau)

RMN1H : 0,88 (3H, t, J=7,2Hz, CH3CH2CH2CH2-), 1,16-1,56 (4H, m, J=7,2Hz, CH3ÇH2ÇHCH2-), 2,17-2,36 (2H, m J=7,2Hz, CH3CH2CH2ÇH2-), 2,48-2,82 (2H, m, H=1a, H-5), 3,02 (1H, dd, J=5,1, 11>14Hz, H-le), 3,22 (1H, t, J=9,Ohz, H-4), 3,66 (1H, t, J=9,4Hz, H-3), 3,44-3,60 (1H, m, H-2), 3,74-3,96 (H x 2, dd, x 2, He, He").

(EXEMPLE DE PREPARATION 2)

On ajoute de la moranoline, 5 g, 13 g de bromure de n-butyle et 17 g de carbonate de potassium à 130 ml de dîméthylformamîde. On fait réagir le mélange à 100°C pendant 5 heures. Puis, on traite le mélange réactîonnel d'une manière similaire à l'Exemple de Préparation 1, ce qui donne 5,1 g de N-(n-bu-tyl)moranoline.

Rendement: 75,8%,

(EXEMPLE DE PREPARATION 3)

A100 ml de méthanoi, on ajoute 5 g de moranoline. Tout en agitant à la température ambiante, on ajoute au mélange une solution de 20 mi de n-butylaldéhyde dans 50 ml de méthanoi contenant en dissolution 0,7 g d'acide chiorhydrique et 3 g de NaCNCHta. On effectue la réaction pendant une nuit. Lorsque celle-ci est terminée, on élimine le solvant sous pression réduite. On dissout le résidu, après quoi on le partage avec du chloroforme. On fait passer la phase aqueuse à travers une colonne de 200 ml de résine Diaion SA-11A du type (OH-) après quoi on lave soigneusement à l'eau. On réunit le liquide ayant traversé avec le liquide de lavage. On fait passer le mélange à travers une colonne de 200 ml de résine Dowex 50W x 28 type (H+). Après lavage soigné, on effectue l'élution avec de l'ammoniaque 1N, Après avoir éliminé le solvant par distillation sous pression réduite, on fait cristallisé l'éluat dans de l'éthanol. La recristallisa-tîon dans de l'éthanol donne 5,1 g de N-(n-butyl)moranoline.

Rendement: 75,8%.

Des exemples typiques des composés conformes à la présente invention comprennent les composés suivants.

Composé n° 1 Moranoline Composé n° 2 N-méthylmoranoline Composé n° 2a N-(n-butyl)moranoline

Composé n°3 Tosylate de N-5-méthoxycarbonyl-pentylmoranoline Composé n° 4 N-hydroxyéthylmoranoline Composé n° 5 (N-méthoxycarbonylbutyi)moranoiine Composé n° 6 Bisulfite de nojirimycine

Composé n°7 Dichlorhydrate de !,4-bis-(3-n-moranolino-1-propenyl ) benzène Composé n° 8 Tosylate de N-hexylmoranoline Composé n° 9 N-isoprénylmoranoline

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Composé n° 10 Tosylate de N-(2-hydroxydécyl)moranoline

Composé n° 11 Sel de sodium de la N-10-carboxydécylmoranoline

Composé n° 12 Tosylate de N-(3-phénylpropyle) moranoline

Composé n° 13 Tosylate de N-benzylmoranoline

Composé n° 14 Chlorhydrate de N-cînnamylmoranolîne

Composé n° 15 Tosylate de N-4-phénylbutylmoranoline

Composé n° 16 N-(2-phénoxyéthyl)moranoline

Composé no 17 Tosylate de N-(3-phénoxypropyl)moranoline

Composé n° 18 Tosylate de N-(5-(phénylpentyle)moranoline

Composé n° 19 Tosylate de N-(2-cyclopentyIéthyl)moranoIine

Composé n° 20 N-[3-(3-méthoxyethoxyphényl)-2-butényl]moranoline

Composé n° 21 lodure de N,N-diméthylmoranoline ammonium

Composé n° 22 N-éthylmoranoline

Composé n° 23 N-cinnamylmoranoline

Composé n° 24 Tosylate de N-géranylmoranoline

Composé n° 25 Tosylate de N-(2-hydroxy-3-phénoxypropyl)moranoline

Composé n° 26 Tosylate de N-farnésylmoranoline

Composé n° 27 N-10-(N-méthylcarbamoyI)décylmoranoIine

Composé n° 28 Tosylate de N-(4-phényl-3-butényl)moranoline

Composé n° 29 N-(3-phényl-2-méthyl-2-propényl)moranoline

Composé n° 30 N-(3-o-chlorophénoxypropyl)moranoline

Composé n° 31 N-(fméthyl-4-bromocinnamyl)moranolîne

Composé n° 32 N-[4-(3-fluoro-4-méthylphényI)butyll-moranoline

Composé n° 33 N-(p-éthoxyoinnamyI)moranoline

Composé n° 34 N-(p-isopropoxycinnamyl)moranoIine

Composé n° 35 N-(rméthyl-m-méthylcinnamyl)moranoline

Composé n° 36 N-(4-m-méthoxyphényl-3-pentényl)-moranoline

Composé n° 37 N-(p-éthoxycarbonylphénoxyéthyl)-moranoline[émiglitate]

Composé n° 38 Castanospermine

En plus de ceux décrits, ci-dessus, les composés conformes à la présente invention contiennent en outre les suivants.

Tosylate de N-isobutylmoranoline Tosylate de N-hydroxyéthylmoranoline Bromhydrate de N-aminomoranoline Tosylate de N-méthoxyéthylmoranoline Tosylate de N-méthoxyéthoxyéthylmoranolîne Tosylate de N-décylmoranoline Tosylate de N-(2-hydroxyhexadécyl)moranoline Tosylate de N-(2-hydroxy-3-p-tolyloxypropyl)moranoline Tosylate de N-(2-hydroxy-3-p-méthoxyphényloxypropyl)moranoline Tosylate de N-(2-hydroxy-3-p-chIorophényioxypropyl)moranoline N-3-carbamoylpropylmoranoline Tosylate de N-nonylmoranoline Tosylate de N-undécylmoranoline Tosylate de N-(2-hydroxytétradécyl)moranoline N-(4,4-diphényl-3-butényl) moranoline N-5-carboxypentylmoranoline N-farnésylmoranoline N-(Y-méthyl-4-chlorocinnamyl)moranoline N-(r-méthyl-4-méthylcinnamyl)moranoline N-(4-p-chlorophényl-3-pentényl)moranoline N-(4-m-chlorophényl-3-pentényl)moranoline N-(4-o-chlorophényl-3-pentényl)moranoIine N-(4-p-phénoxyphényI-3-pentényl)moranoline N-(4-p-éthoxyphényl-3-pentényl)moranoIine N-(m-méthoxycinnamyl)moranoline N-t3-(3-chlorophényI)-2-butényl]moranoline N-[4-(4-chlorophényl)-3-butényljmoranoline N-(4-carboxylcinnamyl)moranoline chlorhydrate N-(3-carboxy-2-propény!)moranoline

Dipicrate de N-(m-triéthylammonioéthoxycinnamyl)moranoline N-isopropylmoranoline

Chlorhydrate du chlorure de N-(p-triméthylammonioéthoxycinnamyl)moranolîne

Dans le cas où les composés de la présente invention sont administrés comme médicaments, ils sont administrés aux animaux et à l'homme tels quels ou sous forme de compositions médicales contenant par

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exemple 0,1 à 93,5%, de préférence 0,5 à 90% de composé actif dans un support pharmaceutiquement acceptable, non toxique et inerte.

Comme support, on utilise au moins un diluant solide, semi-solide ou liquide, une charge et d'autres adjuvants de formulation. La composition pharmaceutique est avantageusement administrée sous forme de dose unitaire. La composition pharmaceutique peut être administrée par voie orale, ou dans les tissus, par exemple par voie intraveineuse, etc., localement (par voie sous-cutanée, etc.) ou par voie intra-rec-tale, etc. If va sans dire que la composition pharmaceutique est administrée sous une forme appropriée à ces modes d'administration. L'administration orale est particulièrement préférée.

La posologie comme agent fibrinolytique est réglée avantageusement en fonction de l'âge, du poids corporel, etc. du malade, de la voie d'administration, des caractéristiques et du degré de la maladie, etc., mais la composition est généralement administrée aux adultes en tant qu'Ingrédient actif de la présente invention à une dose quotidienne allant de 50 à 3000 mg/personne, de préférence de 500 à 1000 mg/personne. Suivant le cas, une dose inférieure est également efficace et inversement, une dose supérieure peut être nécessaire. On souhaite également administrer par portions deux à trois fois par jour.

(EXEMPLES!

Ci-après l'activité d'abaissement de l'aa—PI, l'activité d'accélération de la sécrétion d'urokinase ainsi que la toxicité des composés de la présente invention sont décrites en détail et la présente invention est décrite ci-dessous de manière plus détaillée.

EXEMPLE D' ESSA11

Activité in vitro

Il est connu que les cellules HepG2 provenant du cancer hépatique humain synthétisent et secrètent l'inhibiteur de l'cca-plamine (a2-PI). Des cellules HepG2, 2 x 106, ont été inoculées sur une boîte de culture plastique (diamètre 100 mm) fabriquée par la société Faicon Inc. et cultivées dans du milieu minimum d'Eagle contenant 10% de sérum de fœtus de bovin.

Trois jours après, les cellules adhérant au fond de la boîte sont lavées deux fois avec du tampon phosphate de Dulbecco puis cultivées dans 8 ml de milieu d'Eagle exempt de sérum (ne contenant pas de Rouge de Phénol), contenant 200 ug/ml d'un échantillon du composé de la présente invention perdant 3 à 4 jours supplémentaires. Après culture, on recueille 7 ml du milieu et on les concentre à environ 1 ml en utilisant un Centriflow (CF25) fabriqué par Faicon Inc. On lyophilise ensuite le concentré.

A l'échantillon lyophilisé, on ajoute 0,7 ml de tampon Tris 50 mM contenant 8,1 mg/ml de chlorhydrate de monométhylamine pour Je dissoudre, de sorte que la solution est concentrée à 10 fois.

A100 fil de l'échantillon concentré, on ajoute 50 jil de la solution de plasmine à 15 mCU et on y ajoute encore 50 jxl d'une solution de 0,25 jimole de solution de substrat chromogène synthétique S-2251, après quoi on fait réagir à 37°C pendant 10 minutes. En ajoutant 1 ml de solution d'acide citrique à 2%, on arrête la réaction. Le p-nitranilide libéré par le substrat S-2251 est dosé à une longueur d'onde de 405 nm.

Un échantillon dans lequel la décomposition du substrat S-2251 a été mesurée en utilisant le tampon Tris ci-dessus à la place de l'échantillon concentré a joué le rôle d'un témoin présentant une activité de plasmine de 100% et l'échantillon concentré cultivé sans ajouter de composé d'essai a joué le rôle de témoin présentant une activité d'az-PI de 100%. Les résultats ont été calculés par l'équation suivante:

A- — A£

Activité de I'<x2-Pl (%) = T— r- x 100

Ä1 ~ 3

dans laquelle Ai, As et A3 représentent l'absorbance dans le témoin à 100%, l'absorbance lorsqu'on a utilisé l'échantillon concentré et l'absorbance dans Je témoin ayant une activité d'oc2-PI de 100%, respectivement. Le nombre des échantillons était de 3 dans chaque cas. Les résultats sont donnés dans le Tableau 1. Il est évident que les composés de la présente invention peuvent abaisser l'activité de foe-PI.

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Tableau 1

Echantillon

Activité de I'cç2-PI

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Activité de l'<X2-PI

Composé n°

(%)

Composé n°

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Témoin

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EXEMPLE D'ESSAI A2 Activité in vivo

Comme animaux auxquels ont été administrés les composés de l'invention, on a utilisé trois chiens Beagle mâles pour le groupe témoin et pour le groupe ayant reçu l'administration, respectivement.

Un échantillon d'essai (Composé n° 2) a été dissous à une concentration de 10 mg/0,1 ml, en utilisant un tampon phosphate 0,1 M (pH 7,2). Après dissolution, la solution a été stérilisée par filtration à travers un filtre stérile (taille de pores, 0,2 pm) puis on a administré 0,3 ml de la solution par kg de poids corporel (30 mg/kg). L'administration a été effectuée par la veine de la patte de devant pendant 7 jours consécutifs. Le sang recueilli a été mélangé avec du citrate de sodium à 3,8 % dans un rapport de 9:1 en volume. Par centrifugation à 3000 tours/minute pendant 15 minutes, on a isolé le plasma.

L'activité de I'a2-PI a été mesurée en tant qu'activité d'inhibition contre la décomposition de la plasmine par le substrat chomogène synthétique S-2251. Les résultats de la mesure sont exprimés en modification de l'activité d'inhibition après administration sur la base de 100% d'activité d'inhibition de la plasmine avant l'administration de l'échantillon d'essai (Tableau 2). Le nombre d'échantillons dans chaque groupe était de 3 échantillons.

L'activité de I'c®-PI a été manifestement déprimée par administration ultérieure du composé d'essai à une dose de 30 mg/kg.

Tableau 2 (Activité de I'ct2-Pl)

Jour

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C

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Echantillon

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C: témoin

Echantillon: échantillon d'essai

EXEMPLE D'ESSAI 3 Essai sur une fibrinolyse in vitro

Un échantillon d'essai (Composé n° 2) a été administré à des chiens Beagle à la dose de 30 mg/kg une fois par jour. Le plasma a été isolé avant l'administration et 4 jours après. L'activité de I'ci2-Pl dans le plasma a été mesurée et en même temps, on a formé un caillot de fibrine in vitro en utilisant le plasma. En faisant agir l'urokinase comme agent thrombolytique sur le caillot de fibrine, on a comparé le degré de iyse entre le plasma avant l'administration et le plasma 4 jours après l'administration.

A300 ni du plasma isolé, on a ajouté 40 ni d'un fibrînogène 1251 (0,1 mCi/ml) et on a introduit 50 |xl de mélange dans un tube à essai. 5 ni d'un mélange en solution de 25 U/ml de thrombine et de chlorure de cal-

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Gium 0,5 M ont été ajoutés dans chaque tube à essai, que l'on a fait incuber à 37°C pendant 30 minutes pour préparer des caillots de fibrine. Des solutions à 15 et 30 U/ml d'urokinase dans une solution d'albumine à 2% et la solution obtenue ont été introduites dans chaque tube à essai à raison d'1 ml chacune.

Après avoir fait incuber à 37°C pendant 12 heures, on a recueilli 25 ni du liquide surnageant dans un tube d'iode radio-actif et les produits de décomposition de la fibrine-125! isolés dans le liquide surnageant ont été mesurés avec un compteur de rayons y. Le nombre d'échantillons était de 3 dans chaque groupe.

Comme le montre le Tableau 3, il est clair que lorsqu'on utilisait le plasma ayant une activité d'aa-Pl abaissée, la lyse des caillots de fibrine était accélérée par administration du composé d'essai, par comparaison avec le plasma avant l'administration.

Tableau 3

Vitesse de lyse du caillot fibrineux (%)

Activité de l'urokinase Avant l'administration 4 jours après l'administration OU 18,1 21,5 15 U 37,4 63,8 30 U 70,0 93,7

EXEMPLE D'ESSAI 4 Essai thromboiytique in vitro •

La capacité d'induire l'activité thromboiytique dans un système de culture de cellules endothéliaies vasculaires a été examinée en utilisant des endothéliums d'artère pulmonaire de veau (CPAË).

Les cellules CPAE ont été achetées à la société Dainippon Pharmaceutical Ltd., Department of Labo-ratory Products, Les cellules CPAE ont été sous-cultivées dans un milieu MËM sérum de fœtus de veau-Eagle à 10% introduit dans un flacon de culture de 25 cm2. De la suspension cellulaire fractionnée après sous-culture, on a fait passer 0,1 ml dans un tube à essai avec une pipetfre stérilisée. Puis on a dilué la suspension cellulaire à 10 fois avec 0,9 ml de solution de Bleu Trypan et on a compté les cellules avec un compteur à cellule. Après dilution avec du milieu MEM sérum de fœtus de veau-Eagle à 10% de manière à avoir un nombre de cellules de 2 x 105 cellules/ml, on a dispensé avec une micropipettre dans une plaque de microtitrage à 96 puits (fabriquée par la société Corning) 100 ni de chaque/puits, c'est-à-dire 2 x 104 cellules/puits, de la dilution. La plaque a été mise à incuber à 37°C dans du CO2 à 5%.

Le composé de la présente invention a été dissous dans le milieu à raison de 0,2 mg/ml. Le composé qui était insoluble dans le milieu était dissous dans du sulfoxyde de diméthyle à moins de 1% et la solution obtenue était filtrée aseptiquement à travers un filtre, 5 ni de la solution ont été ajoutés dans le puits avec un micropipette stérilisée 24 heures après le début de l'incubation. Après avoir cultivé à 37®C pendant 72 heures dans du CO2 à 5%, le liquide surnageant de la culture recuillie a été soumis à la mesure.

La mesure a été effectuée comme suit. Du plasminogène, 5 ni» a été introduit dans un puits d'une plaque de fibrine (fabriquée par l'Institut Kitazato) que l'on a laissée reposer jusqu'à ce que la diffusion soit terminée. Après diffusion, on a introduit 5 ni du liquide surnageant, puis on l'a placé dans un incubateur à gaz carbonique à 37°C. Quatre heures après, on a effectué une évaluation par formation d'un cercle de lyse transparent dû à la fibrinolyse. Dans ce cas, il a été confirmé qu'un cercle transparent se formait simultanément par fibrinolyse dans un puits dans lequel on avait introduit du t-PA comme témoin positif. Le diamètre du cercle transparent était de 9 à 10 mm.

Dans le cas du liquide surnageant additionné du composé de la présente invention, on a noté également un cercle transparent dû à la fibrinolyse présentant un diamètre de 4,5 à 8,5 mm. Cependant, dans le cas du liquide surnageant non additionné de composé de la présente invention (témoin), on n'a observé aucune modification. Dans le cas de la formation d'un cercle de 4 mm ou davantage dû à la fibrinolyse, une capacité thromboiytique des cellules CPAE a été considérée comme induite.

Après avoir vérifié l'activité fibrinolytique, le puits a été fixé avec 2,5% de glutaraldéhyde dans une concentration finale. Puis, la solution a été jetée et le système a été lavé avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Après lavage, on a éliminé l'humidité. Après coloration avec 100 n' de violet cristal à 0,1% et après avoir laissé reposer 2 à 3 minutes, on a lavé le système à l'eau courante. Après avoir éliminé l'excès de solution de coloration, on a éliminé l'humidité et le colorant lié aux cellules a été éluê avec 100 ni de méthanoi. En utilisant un balayage multiple (Titertech), on a effectué des mesures à une longueur d'onde de 580 nm conformément à la méthode ABS et à la méthode de la matrice pour confirmer que les cellules n'étaient pas lésées.

Le diamètre en mm du cercle dû à la fibrinolyse est indiqué dans le tableau 4. On voit clairement que les composés de la présente invention présentent une activité thromboiytique.

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 677 610 A5

Tableau 4

Composé n°

Diamètre (mm)

Composé n°

Diamètre (mm)

2

7,9

25

4,1

8

6,3

26

5,7

9

8,2

27

8,5

10

4,5

28

8,3

12

5,9

29

7,1

14

5,9

30

7,6

15

6,3

31

7,9

17

7,5

32

7,5

18

6,8

33

7,8

19

5,8

34

7,6

20

8,0

35

7,8

21

5,6

36

7,6

22

6,5

37

6,9

23

8,4

38

6,9

24

7,6

2a

7,5

EXEMPLE D'ESSAI 5 Activité thrombolvtiaue in vitro

Il a été établi que les composés de la présente invention sont capables d'induire une activité fibrino-lytique dans les cellules CPAE. Pour vérifier par quelle substance cette activité fibrinolytique est induite en plus de l'activité d'abaissement de l'oa-PI, on a effectué une analyse sur la solution de culture additionnée du composé n° 2, parmi les composés de la présente invention, par autographie de la fibrine.

Cette solution de culture et du t-PA (activateur du plasminogène des tissus) et de l'urokinase ont été soumis à une électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide en utilisant 10% de sel. Après l'électropho-rèse, le gel a été traité par du Triton X-100 à 2,5%, on l'a inoculé sur une boîte de gélose additionnée de fibrinogène, de thrombine et de plasminogène. Dans un incubateur à 37°C dans du CO2 à 5%, on a confirmé l'existence d'un emplacement de la fibrine qui provoquait la lyse.

Comme résultat, on a observé une fibrinolyse importante dans le liquide surnageant de la culture additionné du composé de la présente invention, à l'emplacement de masse moléculaire de l'aciivateur du plasminogène du type Urokinase. Il a été établi que le composé de la présente invention induisait fortement la production d'activateur de plasminogène du type Urokinase dans les CPAE.

Essai de toxicité aiguë:

On a utilisé pour chaque groupe d'échantillons d'essai quatre souris mâles de souche ddY âgées de 6 semaines.

Méthode:

Pour l'administration intraveineuse, chacun des échantillons a été dissous dans du sérum physiologique à 0,9% et la solution a été administrée par la veine de la queue. Pour l'administration intrapéritoné-ale, chaque échantillon a été mis en suspension dans du sérum physiologique contenant 0,5% de CMC et on a administré par voie intrapéritonéale 0,1 ml de la suspension pour 10 mg de poids corporel des souris. Pour l'administration orale, chacun des échantillons a été mis en suspension dans une solution de CMC à 0,5% dans du sérum physiologique et on a administré par voie orale 0,2 ml de la suspension pour 10 mg de poids corporel des souris.

On a effectué l'observation immédiatement après l'administration. Après observation pendant 1 semaine après l'administration, on a sacrifié les souris avec du chloroforme et on les a autopsiées.

La DL50 de chaque échantillon est résumée dans le tableau suivant. La sécurité des composés de la présente invention est clairement établie:

9

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 677 610 A5

administration intraveineuse:

(Composé n°)

DL50 (mg/kg)

1

3235

2

5091

administration intrapéritonéale:

(Composé n°)

DL50 (mg/kg)

1

>5000

2

>10 000

administration orale:

(Composé n0)'

DL50 (mg/kg)

1

>7500

2

>10 000

EXEMPLE 1

Pour un comprimé, on a ajouté les composés suivants au composé (Composé n° 2) de la présente invention, et on a préparé des comprimés de la manière classique.

Par comprimé (dans 300 mg)

Composé de la présente invention (Composé n° 2)

200 mg

Lactose

50 mg

Amidon de maïs

20 mg

Hydroxypropylcellulose à base degré de substitution

15 mg

Hydroxypropylcellulose

5 mg

Stéarate de magnésium

10 mg

300 mg

EXEMPLE 2

Pour 1 ampoule, on a ajouté les composés suivants au composé (Composé nû 2) de la présente invention et on a obtenu des ampoules pour injection d'une manière classique.

Par ampoule (dans 10 ml)

Composé de la présente invention (Composé n° 2)

200 mg

Chlorure de sodium

90 mg

Eau distillée pour injection q. s.

10 ml

La présente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaîtront à l'homme de l'art.

Claims

Revendications

1. Composition thromboiytique comprenant, comme ingrédient principal, un composé choisi dans le groupe constitué des composés ci-dessous:

a) un composé représenté par la formule générale (II) ou un de ses sels d'addition aux acides physiolo-giquement acceptables, ainsi qu'un de ses sels d'ammonium quaternaire:

10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 677 610 A5

OH

CH^-OH

(IX)

dans laquelle R2 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, carboxyalkyle, alkyloxycarbonyl-alkyle, hydroxyalkyle, cycloalkylalkyle, arylalkyie substitué ou non substitué, aryloxyalkyle substitué ou non substitué, alcényle, hydroxyalcényle, arylalcényle substitué ou non substitué, aryloxyalcényle ou alkylcarbamoylalkyle, le groupe R2 pouvant, lorsqu'il est le groupe éthyle, être combiné avec le groupe CH2OH adjacent, de fa~on a former un hétérocycie pentagonali b) la nojirimycine ou un de ses sels d'addition aux acides pharmaceutiquement acceptables; et c) le composé de formule:

M<\

H0—/ N-CHi-CH=CH HO Ctfjörf

- CH — CH -

H0CHZ OH

ou un de ses sels d'addition aux acides physiologiquement acceptables.

2. Dépresseur de l'inhibiteur de I'cc2 - plasmine comprenant, comme ingrédient principal, un composé choisi dans le groupe constitué des composés ci-dessous:

a) un composé représenté par la formule générale (I) ou un de ses sels d'addition aux acides physiologiquement acceptables, ainsi qu'un de ses sels d'ammonium quaternaire:

(1)

CH2~OH

dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, carboxyalkyle, alkyloxycarbonyl-alkyle, hydroxyalkyle, cycloalkylalkyle, arylalkyie, aryloxyalkyle, alcényle ou arylalcényle substitué ou non substitué, le groupe R1 pouvant, lorsqu'il est le groupe éthyle, être combiné avec le groupe CH2OH adjacent, de façon à former un hétérocycie pentagona!;

b) la nojirimycine ou un de ses sels d'addition aux acides pharmaceutiquement acceptables; et c) le composé de formule:

11

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH677 610 AS

HO. HÖH

\

M —CHi~CH =

^ch-CH^—tf

HöC% OH

ou un de ses sels d'addition aux acides physiologiquement acceptables.

3. Accélérateur de la sécrétion d'urokinase comprenant, comme ingrédient principal, un composé choisi dans le groupe constitué des composés ci-dessous:

a) un composé représenté par la formule générale (II) ou un de ses sels d'addition aux acides physiologiquement acceptables, ainsi qu'un de ses sels d'ammonium quaternaire:

OH

CHrOH

dans laquelle R2 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle, carboxyalkyle, alkytoxycar-bonylalkyle, hydroxyalkyle, cycloalkylalkyle, arylalkyie substitué ou non substitué, aryloxyalkyle substitué ou non substitué, alcényle, hydroxyalcényle, arylalcényle substitué ou non substitué, aryloxyalcényle ou alkylcarbamoylalkyle, le groupe R2 pouvant, lorsqu'il est le groupe éthyle, être combiné avec le groupe CH2OH adjacent, de façon à former un hétérocycie pentagonal;

N-CH1-CH=CH

- CH = CH - CHt-U

HO C^OH

HOCfl, OH

ou un de ses sels d'addition aux acides physiologiquement acceptables.

12