JP4395540B2 - トリプレニルフェノール化合物及びトリプレニルフェノール化合物の製造方法並びに、血栓溶解促進剤 - Google Patents

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプレニルフェノール化合物及びトリプレニルフェノール化合物の製造方法並びに、血栓溶解促進剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリプレニルフェノール骨格を有する微生物代謝産物には、重要な生理活性を有するものがある。例えば、糸状菌から得られた特定のトリプレニルフェノール化合物は、血栓溶解促進作用や、血管新生抑制作用といった生体に重要な現象に対する生理活性作用を有することが知られている（特許文献１〜３）。
また、上記トリプレニルフェノール化合物とは立体構造が異なる他のトリプレニルフェノール化合物として、特許文献４には、育毛活性を有するトリプレニルフェノール化合物が開示されている。また、非特許文献１には、抗菌活性及び抗真菌活性を有するトリプレニルフェノール化合物が開示されている。
糸状菌を用いた培養によって得られるトリプレニルフェノール化合物は、プラスミノーゲン（Ｐｌｇ）のコンフォメーション変化を導き、この結果、プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ）による活性化の感受性とプラスミノーゲンのフィブリン結合能を増加させ、その結果血栓溶解を促進することが示唆されている（非特許文献２）。アミノ酸としてオルニチンを添加したときに得られるトリプレニルフェノール骨格を２つ有する化合物（以下、オルニプラビンという）は、特にこのような血栓溶解促進作用が顕著に強いことが知られている（特許文献２）。
このように、トリプレニルフェノール骨格を有する化合物は、その立体構造や置換基によって多様な活性を発揮するため、その利用価値が高い。
【０００３】
これら多様な活性型のトリプレニルフェノール化合物は、複雑な構造を有しているためより効率よく得ることが要請されている。このような製造方法としては、微生物を培養することによって製造する方法が開発されている。しかし微生物を用いる方法では通常、数多くの類似体と共に生産されるため、効率よく大量に得るために種々の工夫がなされている。特に、血栓溶解促進作用や血管新生阻害作用といった生理活性を有する活性型トリプレニルフェノール化合物を製造するために、特許文献１〜３では、培養開始直後などの糸状菌の培養初期に、置換基に応じたアミノ酸又はアミノアルコールを添加する培養系が開示されている。
特許文献１：特開２００２−６５２８８号公報
特許文献２：特開２００４−２２４７３７号公報
特許文献３：特開２００４−２２４７３８号公報
特許文献４：国際公開９８／５６９４０号パンフレット
非特許文献１：Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，（１９９２），Ｖｏｌ．５７，ｐｐ．６７００−６７０３
非特許文献２：ＦＥＥＳ Ｌｅｔｔｅｒ，（１９９７）Ｖｏｌ．４１８，ｐｐ．５８−６２
発明の開示
発明が解決しようとする課題
［０００４］
しかしながら、オルニプラビンは分子量８００を超える２量体であるため、生体への吸収という観点からは不利と考えられている。
また、従来の糸状菌を利用した培養方法では、添加可能なアミノ酸及びアミノアルコールの種類に応じて、得られる生成物の種類が限定される。また、生成量も充分とは言えない。さらには、活性型トリプレニルフェノール化合物は複雑な構造をしているため、全工程を化学合成することは非常に効率が悪い。
従って、本発明の目的は、低分子量で高い血栓溶解促進作用を発揮することができる新規なトリプレニルフェノール化合物を提供すること、及びこれを含む血栓溶解促進剤を提供することである。
また、本発明の他の目的は、生理活性の高い活性型トリプレニルフェノール化合物を効率よく製造することである。
課題を解決するための手段
［０００５］
本発明の第一のトリプレニルフェノール化合物は、下記式（Ｉ）で表され、旋光度（−）のトリプレニルフェノール化合物である。下記式（Ｉ）中、Ｘは−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ_３）_２Ｚであり、Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ又は−ＯＨであるか、一緒になって単結合を形成する。
好ましくは、本第一のトリプレニルフェノール化合物は、下記式（Ｉ−Ａ）で表されるものである。
［０００６］
［化１］
［０００７］
また、本発明の第二のトリプレニルフェノール化合物は、下記一般式（ＩＩ）で表されるトリプレニルフェノール化合物である。下記一般式（ＩＩ）中Ｒ^１は、カルボキシ基、水酸基、スルホン酸基及び第二アミノ基からなる群より選択された少なくとも１つを置換基として若しくは置換基の一部として有する芳香族基、又は第二アミノ基を含み且つ窒素を含んでいてもよい芳香族基を表す。Ｘは−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ_３）_２Ｚであり、Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ又は−ＯＨであるか、一緒になって単結合を形成する。
［０００８］
［化２］
［０００９］
本発明の第三のトリプレニルフェノール化合物は、下記一般式（ＩＩＩ）で表されるトリプレニルフェノール化合物である。下記一般式（ＩＩＩ）中Ｒ^４は、下記一般式（ＩＩＩ−１）で示される芳香族アミノ酸残基（ただし、本発明のある態様においては、チロシン残基及びフェニルアラニン残基は除かれる）を表し、下記一般式（ＩＩＩ−１）中Ｒ^５は、あってもなくてもよい水酸基を表し、ｎは０又は１の整数を表す。Ｘは−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ_３）_２Ｚであり、Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ又は−ＯＨであるか、一緒になって単結合を形成する。
［００１０］
［化３］
［００１１］
［化４］
［００１２］
本発明の血栓溶解促進剤は、上記一般式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）で表されるトリプレニルフェノール化合物を有効成分として含む血栓溶解促進剤である。
［００１３］
本発明の上記第二のトリプレニルフェノール化合物の製造方法は、アミノフェノール、アミノ安息香酸、アデニン、アデノシン、アミノジヒドロフタラジンジオン、アミノナフトールスルホン酸、スルファニル酸及びそれらの誘導体からなる群より選択された添加アミン化合物を含む培養液中で糸状菌を培養する培養工程と、培養工程後の培養物から、本トリプレニルフェノール化合物を分離する分離工程と、を含むものである。
本発明の上記第三のトリプレニルフェノール化合物を製造する製造方法は、芳香族アミノ酸又はその誘導体からなる群より選択された添加アミン化合物を含む培養液中で糸状菌を培養する培養工程と、培養工程後の培養物から、本トリプレニルフェノール化合物を分離する分離工程と、を含むものである。
また本発明の上記第二及び第三のトリプレニルフェノール化合物は、前記糸状菌の培養工程が、アミン化合物の含有量が０．５質量％以下の制限培地による第１の培養工程と、培養中期以降の、添加アミン化合物を含有している生産用培地による第２の培養工程と、を含む上記製造方法によって製造してもよい。
【００１４】
本発明のラクタム窒素原子を有するトリプレニルフェノール化合物を製造する製造方法は、スタキボトリス属糸状菌を、１質量％以下の無機アミン化合物を含み有機アミン化合物を含まない制限培地、０．５質量％以下の有機アミン化合物を含み無機アミン化合物を含まない制限培地又は、１質量％以下の無機アミン化合物及び０．５質量％以下の有機アミン化合物の双方を含む制限培地による第１の培養工程で培養し、培養中期以降に、アミン化合物を含有している生産用培地による第２の培養工程で培養すること、前記第２の培養工程後の培養物から、ラクタム窒素原子を有するトリプレニルフェノール化合物を得ること、を含むものである。
ここで、前記第１の培養工程で使用される制限培地が、無機アミン化合物、有機アミン化合物又はこれらの組み合わせを総量０．５質量％以下で含み、前記生産用培地が有機アミン化合物を含むものであってもよい。
また本発明の第一のトリプレニルフェノール化合物は、本製造方法において、前記第１の培養工程で使用される制限培地が０．５質量％以下の有機アミン化合物を含み、前記第２の培養工程で使用される生産用培地が無機第一アミン化合物を含む方法によって製造されることが好ましい。
【００１５】
本発明の上記いずれかの製造方法において、前記制限培地及び生産用培地が、マグネシウム、コバルト、鉄、カルシウムからなる群より選択された少なくとも１種の金属イオンを更に含むものであることが好ましい。
まだ、本発明の上記いずれかの製造方法において、前記糸状菌が、スタキボトリス・ミクロスポラＩＦＯ３００１８であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によれば、低分子量で高い血栓溶解促進作用を発揮することができる新規なトリプレニルフェノール化合物を提供すること、及びこれを含む血栓溶解促進剤を提供することができる。
また、本発明によれば、生理活性の高い活性型トリプレニルフェノール化合物を効率よく製造することができる。
【図面の簡単な説明】
［００１７］
［図１］本発明に係る各種のＳＭＴＰ化合物の構造の一覧である。
［図２］本実施例１にかかるクロマトグラフィーのチャートである。
［図３］本実施例５にかかるＳＭＴＰ−０及びオルニプラビン（ＳＭＴＰ−７）のプラスミノーゲン活性化に及ぼす影響を示すグラフである（凡例の濃度の単位はμＭ）。
［図４］本実施例５にかかるＳＭＴＰ−０及びオルニプラビン（ＳＭＴＰ−７）のプラスミノーゲン断片の生成に及ぼす影響を示すグラフである（濃度の単位はμＭ）。
発明を実施するための最良の形態
【００１８】
＜トリプレニルフェノール化合物の製造方法及び第一のトリプレニルフェノール化合物＞
本発明のトリプレニルフェノール化合物を製造する製造方法は、スタキボトリス属糸状菌を、１質量％以下の無機アミン化合物を含み有機アミン化合物を含まない制限培地、０．５質量％以下の有機アミン化合物を含み無機アミン化合物を含まない制限培地又は、１質量％以下の無機アミン化合物及び０．５質量％以下の有機アミン化合物の双方を含む制限培地による第１の培養工程で培養し、培養中期以降に、アミン化合物を含有している生産用培地による第２の培養工程で培養すること、前記第２の培養工程後の培養物から、ラクタム窒素原子を有するトリプレニルフェノール化合物を得ること、を含むことを特徴としている。
上記製造方法では、第１の培養工程で使用する培地として、１質量％以下の無機アミン化合物を含み有機アミン化合物を含まない制限培地、０．５質量％以下の有機アミン化合物を含み無機アミン化合物を含まない制限培地又は、１質量％以下の無機アミン化合物及び０．５質量％以下の有機アミン化合物の双方を含む制限培地を用いるので、第２の培養工程に移る培養中期以降に、従来よりも大量の中間体化合物を得ることができる。その後、アミン化合物を含む生産用培地による第２の培養工程を実行することにより、効率よく且つ選択性よく目的とするトリプレニルフェノール化合物を得ることができる。
なお、本発明におけるトリプレニルフェノール化合物とは、ラクタム窒素原子を有するトリプレニルフェノール化合物を意味し、本明細書では、単に「トリプレニルフェノール化合物」と称する。
［００１９］
また本発明の第一のトリプレニルフェノール化合物は、下記式（Ｉ）で表され、旋光度（−）の化合物である。式中Ｘは、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ_３）_２Ｚであり、Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ又は−ＯＨであるか、一緒になって単結合を形成する。
［００２０］
［化５］
【００２１】
この式（Ｉ）で表されるトリプレニルフェノール化合物は、１位の窒素原子が第二アミンあり、８位及び９位が共に（Ｓ）の絶対配置を有すると共に全体として（−）の旋光度を示す。このような光学活性及び絶対配置は、血栓溶解促進などの生理活性を有する活性型トリプレニルフェノール化合物と同一のものであるため、本化合物における１位の置換基を適宜変更することにより、多様なトリプレニルフェノール化合物を容易に得ることができる。
【００２２】
以下、本発明のトリプレニルフェノール化合物の製造方法について説明する。
本発明の製造方法において、トリプレニルフェノール化合物を得るために使用される糸状菌としては、スタキボトリス属の糸状菌が選択される。特に好ましい生産菌は、スタキボトリス・ミクロスポラ（Stachybotrys microspora）などであり、より好ましくはスタキボトリス・ミクロスポラ（S. microspora）ＩＦＯ３００１８株であるが、本発明は、この菌に限定されるものではない。
【００２３】
本発明の製造方法では、上記糸状菌を、制限培地を用いた第１の培養工程と、培養中期以降の生産用培地を用いた第２の培養工程との２段階の培養工程によって培養する。
第１の培養工程では、アミン化合物の種類及び量の少なくとも一方が制限された制限培地が用いられる。ここでいう「種類及び量の少なくとも一方が制限された」とは、選択されたアミン化合物の種類に応じて制限培地への添加量が決定されることを意味する。アミン化合物の種類及び量の少なくとも一方を制限したこのような制限培地を用いることによって、培養中期以降の第２の培養工程で、効率よく且つ選択性よくトリプレニルフェノール化合物を生成することができる。
培養中期以降の第２の培養工程では、アミン化合物を含有している生産用培地が用いられる。ここで「培養中期」とは、第１の培養工程を確実に継続させるための培養開始からの所定期間、好ましくは培養開始後２日目以降、更に好ましくは４日目以降とすることができる。この期間が短すぎる、例えば培養開始直後に生産用培地による培養を開始すると、目的とするトリプレニルフェノール化合物を得るために必要な中間体化合物の量が不充分となり、効率よくトリプレニルフェノール化合物を生成することができない。
【００２４】
本発明の製造方法では、第１の培養工程で使用される制限培地が０．５質量％以下のアミン化合物を含み、第２の培養工程で使用される生産用培地が有機アミン化合物を含むものとすることができる（以下、本明細書では「本発明の第一の製造方法」という）。
これにより、制限培地中における糸状菌の化合物生成能を損なうことなく、生産用培地に含まれる有機アミン化合物に対応した官能基を含む中間体化合物、例えば、下記一般式（Ｉ−Ｂ）で表される化合物を得ることができる。一般式（Ｉ−Ｂ）中、Ｘは前記と同様であり、式中＃は生産用培地に含まれるアミン化合物に対応した所定の官能基を示す。
【００２５】
【化６】
【００２６】
本発明の第一の製造方法において、制限培地中のアミン化合物は、後述する有機及び無機のアミン化合物のいずれもが該当する。このアミン化合物は、制限培地での糸状菌成育のための窒素源、成育促進因子、あるいはトリプレニルフェノール化合物前駆体の生産促進因子として作用する。添加の形態としては、酵母エキス、ブイヨン、ペプトン、トリプトン、ソイビーンミール、ファーマメディア、コーンスティープリカー、魚肉エキス等の天然の混合物として、あるいは精製化合物として利用することができる。天然の混合物は多種のアミン化合物を含有するため、制限培地ではその量を制限する必要がある。この場合、制限培地の全容量に対して０．５質量％以下、菌の生育、生産量及び生産の選択性の観点から好ましくは、０．０１〜０．５質量％、更に好ましくは０．１質量％〜０．３質量％とすることができる。０．５質量％を超える場合には、中間体化合物以外の化合物が同時に生成されて選択性に劣り、生産効率も下がる場合があり、好ましくない。一方、０．０１質量％未満では、糸状菌の活性に劣る場合があり好ましくない。また、精製化合物をアミン化合物として添加する場合は、生産に用いる糸状菌の成育とトリプレニルフェノール化合物前駆体の生産が良好に起こる範囲の量と種類が用いられる。
【００２７】
制限培地中で培養された糸状菌は、培養中期以降に、有機アミン化合物を含有する生産用培地による第２の培養工程での培養に提供される。
第２の培養工程で用いられる生産用培地は、有機アミン化合物を含有する以外は、制限培地と同一の組成で構成することができる。このため、第２の培養工程における培養は、第１の培養工程で使用した制限培地に、有機アミン化合物を添加することによって実施してもよく、改めて調製したアミン化合物含有培地をそのまま添加してもよい。
第２の培養工程での生産用培地に含有可能な有機アミン化合物は、目的とするトリプレニルフェノール化合物を得るために必要な量で培地中に存在していればよく、培地の全容量の５質量％以下、生産量の観点から好ましくは０．０１質量％〜１質量％、更に好ましくは０．１質量％〜０．５質量％で用いられる。
【００２８】
本発明の第一の製造方法における有機アミン化合物としては、合成品又は天然由来のアミン化合物を挙げることができる。天然由来のアミン化合物成分としては、例えば酵母エキス、ブイヨン、ペプトン、トリプトン、ソイビーンミール、ファーマメディア、コーンスティープリカー、魚肉エキス等の主としてタンパク質や天然アミノ酸を培地に添加するために従来使用されている成分を挙げることができ、生産量の観点から酵母エキス、ペプトンが好ましい。
また生成されるトリプレニルフェノール化合物の種類及び生産量から、生産用培地に添加される有機アミン化合物には、第一アミン化合物が含まれていることが好ましい。第一アミン化合物としては、天然アミノ酸、合成アミノ酸を含み、例えばα−アミノ酸として、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン、シスチン、リジン、オルニチン、また、天然アミノ酸におけるカルボキシル基を水素、ヒドロキシル基叉はヒドロキシルメチル基に置き換えたもの、例えば、２−アミノエタノールなどのアミノアルコール等を挙げることができる。
【００２９】
これらのうち、第２の培養工程での生産用培地に含有されるアミン化合物の種類は、目的とするトリプレニルフェノール化合物の種類に応じて適宜選択することができる。
例えば、血栓溶解促進作用を有する活性型トリプレニルフェノール化合物を得るには、Ｄ−リジン、Ｄ−フェニルアラニン、Ｄ−ロイシン、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−オルニチンなどのアミノ酸を含有する生産用培地とすればよい。
【００３０】
具体的には、ＳＭＴＰ−３ＤはＤ−セリンを、ＳＭＴＰ−４ＤはＤ−フェニルアラニンを、ＳＭＴＰ−５ＤはＤ−ロイシンを、ＳＭＴＰ−６ＤはＤ−トリプトファンを、ＳＭＴＰ−７ＤはＤ−オルニチンを、ＳＭＴＰ−８ＤはＤ−リジンを、ＳＭＴＰ−３はＬ−セリンを、ＳＭＴＰ−４はＬ−フェニルアラニンを、ＳＭＴＰ−５はＬ−ロイシンを、ＳＭＴＰ−６はＬ−トリプトファンを、ＳＭＴＰ−７はＬ−オルニチンを、ＳＭＴＰ−８はＬ−リジンを、ＳＭＴＰ−９ＬはＬ−シスチンを、ＳＭＴＰ−１０ＬはＬ−イソロイシンを、ＳＭＴＰ−１１ＬはＬ−バリンを、それぞれ含有する生産用培地を用いることによって、目的とするトリプレニルフェノール化合物を選択的に生産することができる（図１参照）。
第２の培養工程での生産用培地におけるアミノ酸の含有量は、生産培地の容量に対して０．０３質量％〜０．３質量％であることが望ましい。
【００３１】
また本製造方法における無機アミン化合物としては、無機塩類として含有される硝酸、無機第一アミン化合物等を挙げることができる。無機第一アミン化合物については後述する。
【００３２】
制限培地及び生産用培地には、上記成分に加えて、微生物による化合物の生成を促進するためなどを目的として、上記微生物の培養に通常用いられている合成培地の添加成分を含む。本制限培地に添加可能な添加成分としては、例えばグルコース、シュークロース、デキストリン、動物油、植物油などの栄養源、ビタミン類、例えば塩素、硝酸、硫酸、リン酸、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、及びその他のイオンを生成しうる無機塩類を挙げることができる。
【００３３】
無機塩類のうち、特に金属イオンを生成しうる無機塩類、生成物の生産量の増大や生産効率の観点から、好ましく制限培地に添加することができる。このような金属イオンとしては、マグネシウムイオン、コバルトイオン、鉄イオン、カルシウムイオン、カリウムイオン、ナトリウムイオン等を挙げることができる。
これらの金属イオンの添加量は、生成物の生産量や菌の生育の観点からそれぞれ培地の全容量に対して、マグネシウムイオンの場合には硫酸マグネシウム７水和物として０．００１質量％〜０．５質量％（より好ましくは０．０１質量％〜０．１質量％）、コバルトイオンの場合には塩化コバルト６水和物として０．００００１質量％〜０．０１質量％（より好ましくは０．０００１質量％〜０．００５質量％）、鉄イオンの場合には硫酸鉄（II）７水和物として０．０００１質量％〜０．１質量％（より好ましくは０．０００５質量％〜０．０５質量％）、カルシウムイオンの場合には塩化カルシウム２水和物として０．００００１質量％〜０．１質量％（より好ましくは０．０００１質量％〜０．０５質量％）、カリウムイオンの場合にはリン酸二カリウムあるいは硝酸カリウムとして０．００２質量％〜２質量％（より好ましくは０．０５質量％〜０．５質量％）、ナトウムイオンの場合にはリン酸二ナトウムあるいは硝酸ナトウムとして０．００２質量％〜２質量％（より好ましくは０．０５質量％〜０．５質量％）、とすることができる。
上記無機塩類及び金属イオンは、これらを単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３４】
制限培地による第１の培養工程は、効率よく目的とするトリプレニルフェノール化合物を得るために充分な量の中間体化合物が得られる培養中期まで継続する。トリプレニルフェノール化合物の効率的な製造の観点から、生産用培地による第２の培養工程は、好ましくは糸状菌の培養開始後２日以降、更に好ましくは培養開始後４日から実施される。
第２の培養工程は、生成されたトリプレニルフェノール化合物の量が最大のときに培養を停止することによって終了する。第２の培養工程の期間は、微生物の状態及び培養系の大きさによって異なるが、一般に１日〜５日、生産量の観点から好ましくは１〜３日間である。
［００３５］
また、本発明の製造方法では、第１の培養工程で使用される制限培地が０．５質量％以下の有機アミン化合物を含み、第２の培養工程で使用される生産用培地が無機第一アミン化合物を含むものとすることができる（以下、本明細書では「本発明の第二の製造方法」という）。
これにより、制限培地中における糸状菌の化合物生成能を損なうことなく、生産用培地に含まれる無機第一アミン化合物に対応して第二アミンを含む下記式（Ｉ）で表され、旋光度（−）の化合物を得ることができる。式中Ｘは、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ_３）_２Ｚであり、Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ又は−ＯＨであるか、一緒になって単結合を形成する。
［００３６］
［化７］
［００３７］
本発明の第二の製造方法において、制限培地は０．５質量％以下の有機アミン化合物を含む。ここでの有機アミン化合物は、第一の製造方法について前述したものと同様のものを挙げることができ、好ましくは天然由来のアミン化合物成分を挙げることができる。これにより、糸状菌の生産能を損なうことなく、中間体化合物を得ることができる。制限培地における有機アミン化合物の含有量は、制限培地の全容量に対して０．５質量％以下、菌の生育、生産量及び生産の選択性の観点から好ましくは、０．０１〜０．５質量％、更に好ましくは０．１質量％〜０．３質量％とすることができる。０．５質量％を超える有機アミン化合物を含有すると、上記式（Ｉ）の化合物に対応した中間体化合物以外の化合物が同時に生成されて選択性に劣り、生産効率も下がる場合があり、好ましくない。
【００３８】
また本製造方法の制限培地は、無機アミン化合物を含有してもよい。この無機アミン化合物は、無機塩類として含有される硝酸の他、他の無機アミンであってもよく、得られるトリプレニルフェノール化合物の構造の観点から無機第一アミン化合物が好ましく含まれる。制限培地に含有可能な無機アミン化合物の含有量は、目的とするトリプレニルフェノール化合物の種類及び量によって異なるが、菌の生育、生産量及び生産の選択性の観点から、制限培地の容量に対して１質量％以下であることが好ましく、生産性の観点から０．５質量％以下であることがより好ましく、０．３質量％以下であることが更に好ましい。
【００３９】
本発明の第二の製造方法において、生産用培地は無機第一アミン化合物を含む。これにより、上記式（Ｉ）の化合物を効率よく得ることができる。
制限培地及び生産性培地に含有される無機第一アミン化合物としては、例えば、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩を挙げることができる。中でも、生成物の生産量の観点から、塩化アンモニウムが好ましい。
第２の培養工程での生産用培地に含有可能な無機アミン化合物は、目的とするトリプレニルフェノール化合物を得るために必要な量で培地中に存在していればよく、培地の全容量の５質量％以下、生産量の観点から好ましくは０．０１質量％〜１質量％、更に好ましくは０．１質量％〜０．５質量％で用いられる。
【００４０】
本発明の第二の製造方法での制限培地及び生産用培地については、本発明の第一の製造方法と同様に、糸状菌の生育及び生産される化合物の生産量の観点から、無機塩類を含有することが好ましい。含有可能な無機塩類及び金属イオンに関しては前記した内容をそのまま適用することができる。
【００４１】
本発明の第一及び第二の製造方法における第１及び第２の培養工程は、通常、上記培地を用いて静置培養または振盪培養による。振盪培養を適用する場合には、真菌の培養で通常適用される速度で行えばよく、例えば高崎科学社製、ＴＢ−２５Ｓ（振幅７０ｍｍ）のロータリーシェイカーであれば、５００ｍｌ容のフラスコ中１００ｍｌの培地量とした場合に３０ｒｐｍ〜２４０ｒｐｍ、好ましくは１６０ｒｐｍ〜２００ｒｐｍとすることができる。
また第１及び第２の培養工程における培養温度は、種々の温度における真菌の生育条件に応じて適宜設定することができるが、一般に４〜５０℃、好ましくは１５〜３７℃、より好ましくは２０〜３０℃、最も好ましくは室温（２５℃）である。この範囲外では、効率よくトリプレニルフェノール化合物を生成することができない。またそれぞれ用いられる培地のｐＨは、一般に３〜９、好ましくは５〜６とすることができる。
［００４２］
なお、第１及び第２の培養工程よりも前に、微生物による生成能を安定化させるために、予備培養工程を設けてもよい。予備培養工程で用いられる培地は、微生物を維持するために用いられる通常の生育培地であってもよい。
［００４３］
得られたトリプレニルフェノール化合物は、培養物から回収・精製することによって得ることができる。回収・精製方法としては、培地中に放出されたトリプレニルフェノール化合物を回収・精製できる手段であればいずれであってもよく、液体クロマトグラフィー、溶媒抽出、結晶化等を挙げることができる。生成物の回収・精製は、回収効率の観点から２段階以上の多段階で行うことが好ましい。
これらの回収・精製方法においては、トリプレニルフェノール化合物が脂溶性であることを利用して、溶媒等を選択することが好ましい。
トリプレニルフェノール化合物を培養物から回収・精製する際には、予め培養物から菌体を除去することが好ましい。その際には、培養物にメタノールなどの溶媒を加えて菌体内のトリプレニルフェノール化合物を抽出し、その後の菌体の除去には、濾過等を用いればよい。
［００４４］
次に本発明の第一のトリプレニルフェノール化合物、即ち前駆体トリプレニルフェノール化合物について説明する。
下記式（Ｉ）で表される前駆体トリプレニルフェノール化合物（式（Ｉ）中、Ｘは−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ_３）_２Ｚであり、Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ又は−ＯＨであるか、一緒になって単結合を形成する）は、前述したように、血栓溶解促進などの生理活性を有する活性型トリプレニルフェノール化合物と同一の光学活性及び絶対配置を有するため、化合物中の１位の置換基を他の置換基に適宜変更することにより、多様なトリプレニルフェノール化合物を容易に得ることができる。これは、１位が二級アミンとなっているので、１位の第二アミンを生理活性置換基で修飾することができるためである。これによって、血栓溶解促進などの生理活性を有する活性型トリプレニルフェノール化合物に誘導することができる。このとき、修飾に用いる生理活性置換基は、目的とする活性に応じて、既知の置換基から適宜選択することができる。
また、トリプレニルフェノール化合物は、抗癌作用や腎障害治療作用、また後述するように血栓溶解促進作用などをもち、また、それらの目的に適応した体内動態や吸収特性をもつので、このようなトリプレニルフェノール化合物の誘導体の合成にも、本発明の前駆体トリプレニルフェノール化合物を利用することができる。
【００４５】
【化８】
【００４６】
一般に生理活性物質では平面構造が同一であっても光学活性などによって性質が大きく異なることが知られている。上記トリプレニルフェノール化合物においても、８（Ｒ）、９（Ｒ）の絶対配置を有し（＋）の旋光度を示すものは、８（Ｓ）、９（Ｓ）であって（−）の旋光度を示すものと異なる作用を示す。本発明のトリプレニルフェノ−ル化合物は、８（Ｓ）、９（Ｓ）であって（−）の旋光度を示し、生体において有用な生理活性を有する活性型トリプレニルフェノール化合物を効率よく得るために有用なものである。
ここで８位及び９位の絶対配置及び旋光度については、化合物の立体構造を確認するために当業界で通常用いられている周知の手段、例えば、Ｃ−ＮＭＲ、Ｈ−ＮＭＲ、質量分析、ＩＲ、Ｘ線結晶構造解析、比旋光度などを用いて、確認することができる。
生理活性の観点から特に好ましくは、Ｙ及びＺは、それぞれ一緒になって単結合を形成した下記式（Ｉ−Ａ）で表され、旋光度（−）のトリプレニルフェノール化合物である。
【００４７】
【化９】
【００４８】
本発明の第一のトリプレニルフェノール化合物は、化学合成や微生物を用いた製造方法によって得ることができるが、本発明の第二の製造方法を用いることが、本化合物を効率よく得ることができるため特に好ましい。
【００４９】
＜第二のトリプレニルフェノール化合物＞
本発明の第二のトリプレニルフェノール化合物は、下記一般式（II）で表される化合物である。
本第二のトリプレニルフェノール化合物は、トリプレニルフェノール骨格に加えて、後述する所定の置換基を有する芳香族基が１位の窒素原子に直接結合している単量体且つ低分子量の化合物であり、低濃度でも高いプラスミノーゲン活性化促進作用を示すことができる。
【００５０】
【化１０】
【００５１】
式中Ｒ¹は、カルボキシ基、水酸基、スルホン酸基及び第二アミノ基からなる群より選択された少なくとも１つを置換基として若しくは置換基の一部として有する芳香族基、又は第二アミノ基を含み且つ窒素を含んでいてもよい芳香族基を表す。即ち、本化合物は、トリプレニルフェノール骨格中の窒素原子に芳香族基が直接連結している。芳香族基の置換基が複数存在する場合には、これらは互いに同一であっても異なってもよい。このような置換基は、吸収性の観点から置換基全体として分子量２００以下の芳香族基であることが好ましく、１６０以下であることが更に好ましく、１４０以下であることが特に好ましい。また、芳香族基の置換基の位置は、トリプレニルフェノール骨格の窒素原子に対してパラ位、メタ位、オルト位のいずれであってもよい。
【００５２】
本化合物における芳香族基は、カルボキシ基、水酸基、スルホン酸基及び第二アミノ基からなる群より選択された少なくとも１つを置換基として若しくは置換基の一部として有し、或いは第二アミノ基を含み且つ窒素を含んでいてもよい芳香族基であればよく、他の置換基を追加の置換基として更に有していてもよい。このような追加の置換基としては、低級アルキル基、例えば炭素数１〜５のアルキル基を挙げることができる。
【００５３】
芳香族基としては、血栓溶解作用の観点から、下記一般式（II−１）で表されるものであることが好ましい。下記一般式（II−１）中Ｒ²及びＲ³はそれぞれ水素原子、カルボキシ基、水酸基若しくはスルホン酸基、又は互いに結合して第二アミノ基を含む環状構造基を表すが、同時に水素原子になることはない。
【００５４】
【化１１】
【００５５】
このような芳香族基としては、下記から選択されたものであることが血栓溶解作用の観点から更に好ましい。
【００５６】
【化１２】
［００５７］
このような芳香族基は、後述するようにアミノフェノール、アミノ安息香酸、アデニン、アデノシン、アミノジヒドロフタラジンジオン、アミノナフトールスルホン酸、スルファニル酸及びこれらの誘導体からなる群より選択された添加アミン化合物から誘導することができる。
［００５８］
また式中Ｘは、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ_３）_２Ｚであり、Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ又は−ＯＨであるか、一緒になって単結合を形成する。生理活性の観点から、Ｙ及びＺはそれぞれ一緒になって単結合を形成したものであることが好ましい。
［００５９］
このような第二のトリプレニルフェノール化合物としては、以下のものを挙げることができる。
［００６０］
［化１３］
【００６１】
【化１４】
【００６２】
【化１５】
【００６３】
【化１６】
【００６４】
【化１７】
【００６５】
【化１８】
【００６６】
上記本発明の第二のトリプレニルフェノール化合物は、化学合成によって製造することもできるが、糸状菌を用いて効率よく製造することができる。
即ち、本発明の第二のトリプレニルフェノール化合物を製造する製造方法は、後述する添加アミン化合物を含む培養液中で糸状菌を培養する培養工程と、培養工程後の培養物から、上記トリプレニルフェノール化合物を分離する分離工程とを含むものである。
本製造方法では、糸状菌が、培養液中のアミノフェノール、アミノ安息香酸、アデニン、アデノシン、アミノジヒドロフタラジンジオン、アミノナフトールスルホン酸、スルファニル酸又はそれら誘導体である添加アミン化合物を、トリプレニルフェノール骨格に直接連結する芳香族基として取り込む。これにより、効率よく第二のトリプレニルフェノール化合物を得ることができる。
【００６７】
本発明のトリプレニルフェノール化合物を得るために使用される糸状菌としては、スタキボトリス属の糸状菌が選択される。特に好ましい生産菌は、スタキボトリス・ミクロスポラ（Stachybotrys microspora）などであり、より好ましくはスタキボトリス・ミクロスポラ（S. microspora）ＩＦＯ３００１８株であるが、本発明は、この菌に限定されるものではない。
【００６８】
本製造方法では、本製造方法にかかる添加アミン化合物は、糸状菌の培養工程中に存在していればよく、培養初期から存在させてもよいが、生産効率の観点から、培養中期に添加されることが好ましい。
培養中期に添加アミン化合物を添加する場合には、前記糸状菌の培養工程が、アミン化合物の含有量が０．５質量％以下の制限培地による第１の培養工程と、培養中期以降の添加アミン化合物を含有している生産用培地による第２の培養工程と、を含むことが好ましい。
第１の培養工程で使用する培地として、アミン化合物の含有量が０．５質量％に制限された制限培地を用いるので、第２の培養工程に移る培養中期以降に、従来よりも大量の中間体化合物を得ることができる。またこのように中間体化合物を大量に生成してから、第二のトリプレニルフェノール化合物を得るための添加アミン化合物を含む生産用培地による第２の培養工程を実行することにより、効率よく且つ選択性よく目的とする第二のトリプレニルフェノール化合物を得ることができる。なお、本明細書において「アミン化合物」とは、特に断らないかぎり、添加アミン化合物も包含する。
【００６９】
第二のトリプレニルフェノール化合物を製造するための製造方法は、添加アミン化合物の種類以外は、前述の本発明のトリプレニルフェノール化合物の製造方法における第一の製造方法について記述したものと同様であり、前述した記載をそのまま適用することができる。
【００７０】
添加アミン化合物としては、カルボキシ基、水酸基、スルホン酸基及び第二アミノ基の他に置換基を有していてもよく、低級アルキル基、例えば炭素数１〜５のアルキル基を有していてもよい。また添加アミン化合物は複数のアミノ基を有していてもよいが、製造効率の観点から、アミノ基を１つ有するものであることが好ましい。
このような添加可能なアミン化合物は、血栓溶解促進作用の観点から好ましくは、カルボキシ基と水酸基とを共に有するモノアミン化合物である。
【００７１】
添加アミン化合物としては、アミノフェノール、アミノ安息香酸、アデニン、アデノシン、アミノジヒドロフタラジンジオン、アミノナフトールスルホン酸、スルファニル酸及びこれらの誘導体を挙げることができる。このような添加アミン化合物としては、例えば、アミノフェノール、メチルアミノフェノール、アミノ安息香酸、アミノサリチル酸、アミノヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシアントラニル酸、アデニン、アデノシン、アミノジヒドロフタラジンジオン、アミノナフトールスルホン酸、スルファニル酸を挙げることができ、例えば、ｐ−アミノ安息香酸、３−アミノサリチル酸、ｏ−アミノ安息香酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸、３−ヒドロキシアントラニル酸、５−ヒドロキシアントラニル酸、４−アミノサリチル酸、５−アミノサリチル酸、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノ−３−メチルサリチル酸、アデニン、アデノシン、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸、ｐ−スルファニル酸及びそれらの誘導体等を挙げることができる。これらの添加アミン化合物は、１又は複数を組み合わせて使用することができる。
これらの内でも、血栓溶解促進作用の観点から、ｐ−アミノ安息香酸、ｏ−アミノ安息香酸、３−アミノサリチル酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸、３−ヒドロキシアントラニル酸、５−ヒドロキシアントラニル酸、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸、４−アミノサリチル酸、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン、１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸、が好ましい。
【００７２】
第２の培養工程での生産用培地に含有可能な添加アミン化合物は、目的とするトリプレニルフェノール化合物を得るために必要な量で培地中に存在していればよく、培地の全容量の５質量％以下、生産量の観点から好ましくは０．０１質量％〜１質量％、更に好ましくは０．１質量％〜０．５質量％で用いられる。
［００７３］
＜第三のトリプレニルフェノール化合物＞
本発明の第三のトリプレニルフェノール化合物は、下記一般式（ＩＩＩ）で表されるトリプレニルフェノール化合物である。
本第三のトリプレニルフェノール化合物は、トリプレニルフェノール骨格に、α−芳香族アミノ酸に由来する置換基が１位の窒素原子に直接結合している。このため第二のトリプレニルフェノール化合物は、この１位の窒素原子と芳香環との間に１個又は２個のメチル基のみが介在する。この結果、第二のトリプレニルフェノール化合物は単量体且つ低分子量の化合物であり、低濃度でも高いプラスミノーゲン活性化促進作用を示すことができる。
［００７４］
［化１９］
［００７５］
式中Ｒ^４は、下記一般式（ＩＩＩ−１）で示される芳香族アミノ酸残基（ただし、本発明のある態様においては、チロシン残基及びフェニルアラニン残基は除かれる）を表す。下記一般式（ＩＩＩ−１）中Ｒ^５はあってもなくてもよい水酸基を表し、ｎは０又は１の整数を表す。
［００７６］
［化２０］
【００７７】
本化合物における芳香族アミノ酸残基は、吸収性の観点から置換基全体として分子量２００以下であることが好ましく、１６０以下であることが更に好ましく、１４０以下であることが特に好ましい。本芳香族アミノ酸残基は、α位のカルボキシ基以外の他の置換基を追加の置換基として更に有していてもよい。このような追加の置換基としては、水酸基、カルボキシ基や、例えば炭素数１〜５のアルキル基を挙げることができる。なお、芳香族アミノ酸残基における芳香環に連結した置換基の位置は、パラ位、メタ位、オルト位のいずれであってもよい。
【００７８】
このような芳香族アミノ酸残基としては、血栓溶解作用の観点から、フェニルグリシン、チロシン又はこれらの誘導体であることが好ましい。なお、チロシン残基の場合、芳香環に連結した水酸基、カルボキシ基、低級アルキル基等の位置はパラ位、メタ位、オルト位のいずれであってもよい。このような芳香族アミノ酸残基としては、中でも、以下に挙げるものが更に好ましい。
【００７９】
【化２１】
［００８０］
このような芳香族アミノ酸残基は、後述するようにフェニルグリシン、チロシン及びこれらの誘導体からなる群より選択された添加アミン化合物から誘導することができる。
［００８１］
また式中Ｘは、−ＣＨＹ−Ｃ（ＣＨ_３）_２Ｚであり、Ｙ及びＺは、それぞれ−Ｈ又は−ＯＨであるか、一緒になって単結合を形成する。生理活性の観点から、Ｙ及びＺはそれぞれ一緒になって単結合を形成したものであることが好ましい。
［００８２］
このような第三のトリプレニルフェノール化合物としては、以下のものを挙げることができる。
［００８３］
［化２２］
【００８４】
【化２３】
【００８５】
【化２４】
【００８６】
上記本発明の第三のトリプレニルフェノール化合物は、化学合成によって製造することもできるが、糸状菌を用いて効率よく製造することができる。
即ち、本発明の第三のトリプレニルフェノール化合物を製造する製造方法は、後述する添加アミン化合物を含む培養液中で糸状菌を培養する培養工程と、培養工程後の培養物から、上記トリプレニルフェノール化合物を分離する分離工程とを含むものである。
本製造方法では、糸状菌が、培養液中の芳香族アミノ酸又はその誘導体である添加アミン化合物を、トリプレニルフェノール骨格中の窒素原子に直接連結するα−芳香族アミノ酸残基として取り込む。これにより、効率よく第三のトリプレニルフェノール化合物を得ることができる。
【００８７】
本発明の第三のトリプレニルフェノール化合物を得るために使用される糸状菌としては、前記製造方法と同様にスタキボトリス属の糸状菌が選択される。特に好ましい生産菌は、スタキボトリス・ミクロスポラ（Stachybotrys microspora）などであり、より好ましくはスタキボトリス・ミクロスポラ（S. microspora）ＩＦＯ３００１８株であるが、本発明は、この菌に限定されるものではない。
【００８８】
第三のトリプレニルフェノール化合物の製造方法では、芳香族アミノ酸及びその誘導体である添加アミン化合物は、糸状菌の培養工程中に存在していればよく、培養初期から存在させてもよいが、生産効率の観点から、培養中期に添加されることが好ましい。
培養中期に添加アミン化合物を添加する場合には、前記糸状菌の培養工程が、アミン化合物の含有量が０．５質量％以下の制限培地による第１の培養工程と、培養中期以降の添加アミン化合物を含有している生産用培地による第２の培養工程と、を含むことが好ましい。
第１の培養工程で使用する培地として、アミン化合物の含有量が０．５質量％に制限された制限培地を用いるので、第２の培養工程に移る培養中期以降に、従来よりも大量の中間体化合物を得ることができる。またこのように中間体化合物を大量に生成してから、第三のトリプレニルフェノール化合物を得るための添加アミン化合物を含む生産用培地による第２の培養工程を実行することにより、効率よく且つ選択性よく目的とする第三のトリプレニルフェノール化合物を得ることができる。
なお、本明細書において「アミン化合物」とは、特に断らないかぎり、添加アミン化合物も包含する。
【００８９】
第三のトリプレニルフェノール化合物を製造するための製造方法は、添加アミン化合物の種類以外は、前述の本発明のトリプレニルフェノール化合物の製造方法における第一の製造方法について記述したものと同様であり、前述した記載をそのまま適用することができる。
【００９０】
添加アミン化合物としては、アミノ基、カルボキシ基の他に置換基を有していてもよく、水酸基や、例えば炭素数１〜５の低級アルキル基を有していてもよい。また添加アミン化合物中にアミノ基が複数あってもよいが、製造効率の観点から、アミノ基を１つ有するものであることが好ましい。
【００９１】
添加アミン化合物としては、フェニルグリシン、ヒドロキシフェニルグリシン、チロシン及びこれらの誘導体を挙げることができる。このような添加アミン化合物としては、例えば、Ｌ−フェニルグリシン、Ｄ−フェニルグリシン、Ｌ−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｄ−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−チロシン、Ｌ−ヒドロキシメチルフェニルグリシン、Ｄ−ヒドロキシメチルフェニルグリシン、Ｌ−ヒドロキシエチルフェニルグリシン、Ｄ−ヒドロキシエチルフェニルグリシン、Ｌ−カルボキシフェニルグリシン、Ｄ−カルボキシフェニルグリシン、Ｌ−カルボキシメチルフェニルグリシン、Ｄ−カルボキシメチルフェニルグリシン、Ｌ−カルボキシエチルフェニルグリシン、Ｄ−カルボキシエチルフェニルグリシン、Ｌ−メチルチロシン、Ｄ−メチルチロシン、Ｌ−エチルチロシン、Ｄ−エチルチロシン、Ｌ−カルボキシフェニルアラニン、Ｄ−カルボキシフェニルアラニン、Ｌ−カルボキシメチルフェニルアラニン、Ｄ−カルボキシメチルフェニルアラニン、Ｌ−カルボキシエチルフェニルアラニン、Ｄ−カルボキシエチルフェニルアラニン等を挙げることができる。具体例としては、例えば、Ｌ−フェニルグリシン、Ｄ−フェニルグリシン、Ｌ−３−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｄ−３−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｌ−４−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｄ−４−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｌ−ｐ−チロシン、Ｄ−ｐ−チロシン、Ｌ−２−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｄ−２−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｌ（or Ｄ）−２（or ３ or ４）−ヒドロキシ−３（２ or ４ or ５ or ６）−メチル（or エチル）−フェニルグリシン、Ｌ（or Ｄ）−２（or ３ or ４）−カルボキシ−フェニルグリシン、Ｌ（or Ｄ）−２（or ３ or ４）−カルボキシ−３（２ or ３ or ４ or ５ or ６）−メチル（or エチル）−フェニルグリシン、Ｌ（or Ｄ）−o−チロシン、Ｌ（or Ｄ）−ｍ−チロシン、Ｌ（or Ｄ）−２（or ３ or ４ or ５ or ６）−メチル（or エチル）−ｐ（or o or ｍ）−チロシン、Ｌ（or Ｄ）−２（or ３ or ４）−カルボキシフェニルアラニン、Ｌ（or Ｄ）−２（or ３ or ４）−カルボキシ−３（２ or ４ or ５ or ６）−メチル（or エチル）フェニルアラニン及びそれらの誘導体等を挙げることができる。これらの添加アミン化合物は、１又は複数を組み合わせて使用することができる。
これらの内でも、血栓溶解促進作用の観点から、Ｌ−フェニルグリシン、Ｄ−フェニルグリシン、Ｌ−３−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｄ−３−ヒドロキシフェニルグリシン、Ｌ−ｐ−チロシンが好ましい。
【００９２】
第２の培養工程での生産用培地に含有可能な添加アミン化合物は、目的とするトリプレニルフェノール化合物を得るために必要な量で培地中に存在していればよく、培地の全容量の５質量％以下、生産量の観点から好ましくは０．０１質量％〜１質量％、更に好ましくは０．１質量％〜０．５質量％で用いられる。
【００９３】
＜血栓溶解促進剤＞
本発明の血栓溶解促進剤は、上記第二及び第三のトリプレニルフェノール化合物の少なくとも１つを有効成分として含むことを特徴とするものである。
上述した第二及び第三のトリプレニルフェノール化合物は、低分子量で効果的な血栓溶解促進作用を有する。
上記トリプレニルフェノール化合物は、本血栓溶解剤中では、遊離形態、薬学的に許容可能な塩又はエステルなど、医薬として通常適用可能な形態で本血栓溶解剤に含有されることができる。
また本血栓溶解剤は、各種投与形態に応じて適宜剤型を変更することができる。経口投与形態としては、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤又はシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与形態としては、注射剤、点滴剤、座剤、吸入剤、貼付剤等を挙げることができる。
これらの形態を維持するために、これらの用途に使用可能な周知の溶媒、賦形剤等の添加剤を含むことができる。
【００９４】
本発明の血栓溶解剤は、年齢、体重、症状に応じて適切な投与量で投与することができ、例えば静脈内投与の場合には、成人１日あたり有効成分量として、１から２５ｍｇ／ｋｇの投与、経口投与の場合には、成人１日あたり有効成分量として、２から２００ｍｇ／ｋｇの投与が好ましく、投与期間は、年齢、症状に応じて任意に定めることができる。
【実施例】
【００９５】
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、質量／容量基準である。
【００９６】
［実施例１］
Stachybotrys microspora ＩＦＯ３００１８株の胞子を種培養用培地１００ｍｌの入った５００ｍｌ容三角フラスコに接種し、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で４日間にわたり種培養を行った。種培養用培地は、グルコース（４％）、大豆ミール（０．５％），乾燥ブイヨン（０．３％）、粉末酵母エキス（０．３％）を水に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調製し、消泡剤ＣＢ４４２（０．０１％）（日本油脂化学，日本）を加え、培養器に１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ（１２１℃，１５ｍｉｎ）を行ったものを使用した。
【００９７】
この培養液５ｍｌを、本培養培地１００ｍｌの入った５００ｍ１容三角フラスコに接種し、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で４日間にわたり本培養を行った。本培養用培地（制限培地）は、スクロース（５％），粉末酵母エキス（０．１％），ＮａＮＯ₃（０．３％），Ｋ₂ＨＰＯ₄（０．１％），ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０５％），ＫＣ１（０．０５％）、ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ（０．０００２５％），ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．００１５％），ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ（０．０００６５％）を水に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調製し、消泡剤ＣＢ４４２（０．０１％）（日本油脂化学，日本）を加え培養器に１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ（１２１℃，１５ｍｉｎ）を行ったものを使用した。
接種した日を培養０日目とし、培養４日目（９６時間後）に１００ｍｇの塩化アンモニウムを培地に添加（生産用培地）して培養を継続した。培養５日目にメタノールを２００ｍｌ添加して、培養を終了した。その後、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で約３時間にわたり振盪して抽出を行った。
【００９８】
［実施例２］
実施例１の培養抽出液３００ｍｌから、ブフナーロートを用いて菌体を除去し、培養上清を得た。水流ポンプによる減圧下、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮を行った。残量が約５０ｍｌとなった時点で濃縮を止めた。等量の酢酸エチルで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後、ろ過し、濃縮、乾固した。乾固物を、ＭｅＯＨ約３ｍｌに溶解した後、ろ過した。
さらにこれを３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎで遠心した。ＨＰＬＣでの分取を行う前に、この上清をLichrolut（登録商標）ＲＰ−１８（１００ｍｇ）（MERCK KGaA、Darmstadt，Germany）にて前処理を行った。逆相ＨＰＬＣはカラム；Inertsil PREP-ODS（直径３０×２５０ｍｍ）（ジーエルサイエンス株式会社，東京，日本）、温度；４０℃、流速；２５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長；２６０ｎｍ、展開溶媒；５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む７５％メタノールで行い、保持時間１１．５分のピークを分取した（図２参照）。ロータリーエバポレーターを用いてメタノールを留去した後、等量の酢酸エチルで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後ろ過し、濃縮した。これをメタノールに溶解してろ過し、濃縮、乾固して精製物３３．２３ｍｇを得た。収率約３０質量／質量％。
【００９９】
［実施例３］
実施例２で得られた白固体の化合物（ＳＭＴＰ−０とする）の物理化学的性状を調べた。
なお、本実施例の化合物の対照物としては、下記スタキボトリン（Stachybotrin）Ｂ（旋光度は（＋））を用いた。スタキボトリンＢの構造は、J. Org. Chem., (1992), Vol.57, pp.6700-6703を参照したものである。（ただし、絶対立体構造が未決定であるため下記の構造は相対立体配置である。）
【０１００】
【化２５】
【０１０１】
ＮＭＲは、Ａｌｐｈａ６００（ＪＥＯＬ）を用い、¹Ｈ ６００ＭＨｚ， ¹³Ｃ １５０ＭＨｚ、５０℃で測定した。サンプルは約１０ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ−ｄ₆溶液とした。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、Voyager-DE STR（Applied Biosystem社）を用い、positive ion modeでα−シアノ−４−ヒドロキシケイヒ酸をマトリックスとして測定した。
ＵＶは、３２０ spectrophotometer（Hitachi）を用いた。試料はＭｅＯＨに溶解した（５μｇ／ｍｌ）。
ＦＴ−ＩＲは、ＪＩＲ−ＷＩＮＳＰＥＣ５０（ＪＥＯＬ）を用いた。ＭｅＯＨに溶解した試料７５０μｇを岩塩に塗布して測定した。
旋光度は、ＤＩＰ−３６０（ＪＡＳＣＯ）を用いた（２７℃、Ｎａ）。試料はＭｅＯＨに溶解した（１０ｍｇ／ｍｌ）。
結果を図２及び表１に示す。
【０１０２】
実施例２で得られたＳＭＴＰ−０の物理化学的性状は、以下の通りであった。
外観：白固体
分子式：Ｃ₂₃Ｈ₃₁ＮＯ₄
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）⁺： ３８６．２５９９
理論値：３８６．２３３１（Ｃ₂₃Ｈ₃₂ＮＯ₄）
ＵＶ λｍａｘ（ε）ＭｅＯＨ：
215（ε55,769）、251（ε10,615）、300（ε4,000）
ＩＲスペクトル ν（ｃｍ^-1）：
3259.15、2917.81、1666.22、1612.22、1469.51、1359.59、1166.74、1081.88、850.46、773.32、723.18、674.97、566.98、
比旋光度［α］_D ²⁷＝−２．２３°（ｃ １．０，ＭｅＯＨ）
【０１０３】
【表１】
【０１０４】
これらの結果から、実施例２で得られたＳＭＴＰ−０は、スタキボトリンＢ（前述の非特許文献１参照）と同一の平面構造を有することが示唆された。しかしながら、ＳＭＴＰ−０は（−）の旋光度を有するのに対して、スタキボトリンＢの旋光度は（＋）であった。このように、下記に示される本実施例のＳＭＴＰ−０は明らかにスタキボトリンＢと異なる立体構造を有している。
【０１０５】
【化２６】
【０１０６】
［実施例４］
実施例３で明らかになったＳＭＴＰ−０とスタキボトリンＢの立体構造の相違の詳細を明らかにするため、改変モッシャー法を用いた解析を行った。
ＳＭＴＰ−０（５０ｍｇ、７８μｍｏｌ）をアセトニトリル（２ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５０μｌ）とトリメチルシリルジアゾメタン（２．０Ｍ、ヘキサン溶液）（１５０μｌ）を加え室温で２４時間撹拌した。反応液を濃縮することによってＳＭＴＰ−０のメチルエーテル（ＳＭＴＰ−０−ＯＭｅ）（４４ｍｇ）を得た。
ＳＭＴＰ−０−ＯＭｅ（２０ｍｇ、５０μｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍＬ）に溶解し、Ｒ−（−）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロリド（２５ｍｇ）、トリエチルアミン（３０μｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（２ｍｇ）を加えて室温で２４時間撹拌した。反応液に水（１０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層は、１Ｎ ＨＣｌ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、および飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥し、減圧下濃縮した。残留物を薄層クロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）により精製し、Ｓ−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチル酢酸のＳＭＴＰ−０−ＯＭｅエステル（Ｓ−ＭＴＰＡ−ＳＭＴＰ−０−ＯＭｅ）（１８ｍｇ）を得た。
【０１０７】
Ｒ−（−）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロリドの代わりに、Ｓ−（＋）−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチルクロリドを用いた上記と同様の反応を行うことによって、ＳＭＴＰ−０−ＯＭｅ（２０ｍｇ、５０μｍｏｌ）からＲ−α−メトキシ−α−（トリフルオロメチル）フェニルアセチル酢酸のＳＭＴＰ−ＯＭｅエステル（Ｒ−ＭＴＰＡ−ＳＭＴＰ−０−ＯＭｅ）（１７ｍｇ）を得た。
【０１０８】
上記の方法により得られたＲ−ＭＴＰＡ−ＳＭＴＰ−０−ＯＭｅ、Ｓ−ＭＴＰＡ−ＳＭＴＰ−０−ＯＭｅについて各種核磁気共鳴スペクトルを測定し、それぞれの化合物のプロトンの帰属を行った。結果を表２に示す。
Ｓ−ＭＴＰＡ−ＳＭＴＰ−０−ＯＭｅのケミカルシフトδＳとＲ−ＭＴＰＡ−ＳＭＴＰ−０−ＯＭｅのケミカルシフトδＲの差（Δδ＝δＳ−δＲ）を計算した結果、７位のアキシアル位プロトンのΔδが負の値となり（Δδ＝−０．１２）、２５位メチル基プロトンのΔδが正の値（Δδ＝＋０．０３）となったことから、本発明のＳＭＴＰ−０の絶対立体配置は、上記実施例３で示したような絶対立体配置（８位および９位の立体はともにＳ）と決定した。
【０１０９】
【表２】
【０１１０】
［実施例５］
実施例２で得られたＳＭＴＰ−０（５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ）の線溶促進活性を、ウロキナーゼ触媒によるプラスミノーゲン活性化を促進する活性として以下のようにして評価した。
３０ｍＭのＳＭＴＰ溶液（ＤＭＳＯ溶液）をＴＢＳ／Ｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ８０，ｐＨ７．４）で希釈して１．５ｍＭ（in ５％ＤＭＳＯ・ＴＢＳ／Ｔ）溶液を調製した。この溶液を５％ＤＭＳＯ in ＴＢＳ／Ｔで希釈して上記の濃度のＳＭＴＰ溶液を調製した。
【０１１１】
（１）プラスミノーゲン断片生成活性の測定
ＳＭＴＰ溶液（６０μｌ）を２４０μｌの１．２５倍濃度反応液（ＶＬＫ−ｐＮＡ（Val−Leu−Lys−ｐ−ニトロアニリド）を含まない）と混合して３７℃で６０分間反応させた。その後、７５μｌの５０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えて反応を停止して氷上で６０分間放置した。ＴＣＡ不溶性物質を遠心により沈殿させ、これをアセトンで２回洗浄した。得られた沈殿を乾燥後、１１μｌのＳＤＳサンプルバッファー（０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，２０％グリセロール，０．０２％ブロモフェノールブルー）を加えて溶解し、その１０μｌを用いてＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った（１０％ゲル）。結果を図３に示す。
【０１１２】
（２）プラスミノーゲン活性化の測定
１０μｌのＳＭＴＰ溶液（１０μｌ）を４０μｌの１．２５倍濃度反応液（０．０６２５μＭのプラスミノーゲン，６２．５Ｕ／ｍｌのウロキナーゼ、０．１２５ｍＭのＶＬＫ−ｐＮＡ）と９６穴マイクロプレート中で混合し、直ちにマイクロプレートリーダーで経時的にＶＬＫ−ｐＮＡの加水分解を４０５ｎｍの吸収をモニタすることにより測定した。測定は３７℃で、２分間隔で６０分まで行った。結果を図４に示す。
【０１１３】
図３及び図４に示されるように、その結果、いずれの濃度においてもプラスミノーゲン活性化を促進する作用は示さなかった（図３参照）。また、血管新生阻害活性をもつプラスミノーゲン断片の生成に対しても作用を示さなかった（図４参照）。
このようなＳＭＴＰ−０の二級アミンをＤ−トリプトファンなどのアミノ酸で修飾することによって、強いプラスミノーゲン活性化促進作用を示す活性型トリプレニルフェノール化合物を得ることができる。
【０１１４】
本実施例では、活性化トリプレニルフェノ−ル化合物を容易に誘導可能な中間体トリプレニルフェノール化合物を提供することができた。
これにより、安定して発酵法では生産できない態様な活性化トリプレニルフェノール化合物を得ることができる。
【０１１５】
［実施例６］
アミン化合物の添加時期について以下のように検討した。
本培養用培地（制限培地）は、スクロース（５％），ＮａＮＯ₃（０．３％），Ｋ₂ＨＰＯ₄（０．１％），ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０５％），ＫＣ１（０．０５％）を水に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調製し、消泡剤ＣＢ４４２（０．０１％）（日本油脂化学，日本）を加え培養器に１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ（１２１℃，１５ｍｉｎ）を行ったものを使用し、実施例１と同様に培養を行った。
培養開始後、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間にそれぞれ、アミン化合物としてのＬ−シスチン（０．３％）を添加し、その後、２４時間培養して、生産量を測定した。生産量の測定には、培養液に２倍量のメタノールを添加後１時間振とうしてＳＭＴＰ化合物を抽出し、１０,０００ｒｐｍで遠心して上清を分離して、これを用いた。この上清の０．０１ｍｌを、シリカＯＤＳカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーに供し、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む８０％メタノールで１ｍｌ／ｍｉｎの流速で展開し、２６０ｎｍの吸光度をモニタした。標準サンプルの保持時間と一致するサンプルのピークの面積を標準サンプルのピーク面積と比較することにより定量を行った。
結果を表３に示す。
【０１１６】
【表３】
【０１１７】
表３に示されるように、アミン化合物を含有しない制限培地による培養開始直後ではなく、一定期間後に、アミノ酸を含有する生産用培地による培養を行うことによって、ＳＭＴＰ−９の生産量が増加した。特に、制限培地による培養開始後の培養初期ではなく、７２時間以降、即ち、培養中期以降にアミノ酸を添加した場合に、ＳＭＴＰ−９の生産量が大幅に増加した。
また比較例として、培養初期（培養と同時〜４日目以内）に、アミン化合物の量と種類を制限しない培地にＬ−シスチンを添加することにより、ＳＭＴＰ−９を得た（特開２００２−６５２８８号及び特開２００４−２２４７３７号参照）が、本実施例による製造方法と比較して、生産量は、最大で０．１ｍｇ／ｍｌ程度で、本方法の１５％以下であった。また、この従来の方法では特に、アミノ酸又はアミノアルコールを培養開始後５日以降に添加すると、生成物の生産が激減したが、本実施例では５日後の添加でも高い生成量を維持することができた。
従って、本実施例の製造方法は、ＳＭＴＰ化合物を効率よく製造することができる。
【０１１８】
［実施例７］
次に、制限培地及び生産用培地に添加可能な無機塩類について以下のとおり検討した。
本培養用培地（制限培地）は、グルコース（２％），ＮａＮＯ₃（０．３％），Ｋ₂ＨＰＯ₄（０．１％），ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０５％），ＫＣ１（０．０５％），ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．００１％）を水に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調製し、消泡剤ＣＢ４４２（０．０１％）（日本油脂化学，日本）を加え培養器に１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ（１２１℃，１５ｍｉｎ）を行った培地（Ｄ培地）を基本培地として、表４に記載の成分および濃度を変更した。これらの培地を使用し、実施例１と同様に培養を行った。
培養開始後、７２時間にアミン化合物としてのＬ−シスチン（０．１％）を添加し、その後、４８時間培養して、生産量を実施例６に記載の方法で測定した。
結果を表４に示す。
【０１１９】
【表４】
【０１２０】
［実施例８］
さらに、金属塩、炭素源、硝酸ナトリウム、添加するアミン（以下の実施例ではＬ−シスチン）の濃度の検討を以下のように行った。
本培養用培地（制限培地）は、スクロース（５％），ペプトン（０．１％）、ＮａＮＯ₃（０．３％），Ｋ₂ＨＰＯ₄（０．１％），ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０５％），ＫＣ１（０．０５％）を水に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調製し、消泡剤ＣＢ４４２（０．０１％）（日本油脂化学，日本）を加え培養器に１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ（１２１℃，１５ｍｉｎ）を行った培地（Ｆ培地）を基本培地として、表５に記載の成分および濃度を変更した。これらの培地を使用し、実施例１と同様に培養を行った。
培養開始後、７２時間にアミン化合物としてのＬ−シスチン（表５に記載の量）を添加し、その後、２４時間、４８時間および７２時間培養して、生産量を実施例６に記載の方法で測定した。
結果を表５に示す。
【０１２１】
【表５】
【０１２２】
これらの結果から、炭素源としてスクロース、窒素源として酵母エキスおよび硝酸ナトリウム、無機塩類としてリン酸二カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化コバルトを含む培地を用いることにより、ＳＭＴＰ−９の生産量が、特開２００４−２２４７３７号に記載された方法（２％のグルコース，０．５％のペプトン，０．３％の酵母エキス，０．３％のＫ₂ＨＰＯ₄，０．０１％のＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏと、Ｌ−シスチン１００ｍｇを含む培地１００ｍｌ中で培養を開始する）と比較して１０倍以上（０．０８ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌ以上）に増加した。また、上記制限培地（Ｆ培地）で２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間培養後にそれぞれ、アミン化合物としてのＬ−シスチン（０．５％）を添加し、その後、４８時間培養して、生産量を測定した場合、ＳＭＴＰ−９の生産量はそれぞれ、０．５５、０．７０、０．９２、１．２１、１．１５ｍｇ／ｍｌとなった。
【０１２３】
ＳＭＴＰ−９以外での化合物の生産を検討するため、オルニチン１ｍｇ／ｍｌを用いて、ＳＭＴＰ−７を、実施例１で用いた制限培地及び生産用培地を用いた培養と（オルニチンの添加時期は培養４日目）、比較例として特開２００２−６５２８８号に記載の基本培地（グルコース（２％），ペプトン０．５％，酵母エキス０．３％，Ｋ₂ＨＰＯ₄（０．３％），ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０１％）を水に溶かし、ＨＣｌ又はＮａＯＨを用いてｐＨ５．５に調整したもの）とオルニチン１ｍｇ／ｍｌを含む培地を用いた培養とで生産量を比較した。その結果、ＳＭＴＰ−７の生産量は、約５倍（０．３ｍｇ／ｍｌから１．５ｍｇ／ｍｌ）に増加した。
これらの結果から、ＳＭＴＰ化合物を効率よく得るためには、制限培地による培養開始中期以降に、アミン化合物を含有する生産用培地による培養を行って生成する際に、所定の無機塩類を制限培地及び生産用培地に含有することが好ましいことがわかった。
【０１２４】
［実施例９］
化合物Ｉ−１の合成
Stachybotrys microspora ＩＦＯ３００１８株（財団法人発酵研究所）の胞子を種培養用培地１００ｍｌの入った５００ｍｌ容三角フラスコに接種し、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で４日間にわたり種培養を行った。種培養用培地は、グルコース（４％）、大豆ミール（０．５％）、乾燥ブイヨン（０．３％）、粉末酵母エキス（０．３％）を水に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調製し、消泡剤ＣＢ４４２（０．０１％）（０．１ｇ／ｍｌアセトン溶液を１ｍｌ／Ｌ添加）（日本油脂化学，日本）を加え、培養器に１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ（１２１℃，１５ｍｉｎ）を行ったものを使用した。
【０１２５】
この培養液５ｍｌを、本培養培地１００ｍｌの入った５００ｍ１容三角フラスコに接種し、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で５日間にわたり本培養を行った。
本培養用培地（制限培地）は、スクロース（５％），粉末酵母エキス（０．１％），ＮａＮＯ₃（０．３％）、Ｋ₂ＨＰＯ₄（０．１％）、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０５％）、ＫＣ１（０．０５％）、ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ（０．０００２５％）、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．００１５％）、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ（０．０００６５％）を水に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調製し、消泡剤ＣＢ４４２（０．０１％）（０．１ｇ／ｍｌアセトン溶液を１ｍｌ／Ｌ添加）（日本油脂化学，日本）を加え培養器に１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ（１２１℃，１５ｍｉｎ）を行ったものを使用した。
接種した日を培養０日目とし、培養４日目（９６時間後）に１００ｍｇのｐ−アミノフェノールを培地に添加して生産用培地とし、培養を継続した。それから約２４時間後にメタノールを２００ｍｌ添加して、培養を終了した。その後、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で約３時間にわたり振盪して抽出を行った。
【０１２６】
得られた培養抽出液３００ｍｌから、ブフナーロートを用いて菌体を除去し、培養上清を得た。水流ポンプによる減圧下、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮を行った。残量が約１００ｍｌ以下となった時点で濃縮を止め、リン酸でｐＨを２に調製して低温室に一晩放置した。生じた沈殿を遠心により分離し、これをアセトンに溶解した。このアセトン懸濁液を遠心して上清を分離して濃縮乾固して３２４．１ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎで遠心した。ＨＰＬＣでの分取を行う前に、この上清をLichrolut（登録商標）ＲＰ−１８（１００ｍｇ）（MERCK KGaA、Darmstadt，Germany）にて前処理を行った。逆相ＨＰＬＣはカラム；Inertsil PREP-ODS（直径３０×２５０ｍｍ）（ジーエルサイエンス株式会社，東京，日本）、温度；４０℃、流速；２５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長；２６０ｎｍ、展開溶媒；５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む８０％メタノールで行い、保持時間１６〜１７分のピークを分取した。ロータリーエバポレーターを用いてメタノールを留去した後、等量の酢酸エチルで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後ろ過し、濃縮した。これをメタノールに溶解してろ過し、濃縮、乾固して化合物Ｉ−１の精製物９９．３３ｍｇを得た。
【０１２７】
化合物Ｉ−１の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは、Voyager-DE STR（Applied Biosystem社）を用い、positive ion modeでα−シアノ−４−ヒドロキシケイヒ酸をマトリックスとして測定した。
ＵＶは、メタノール中で３２０ spectrophotometer（Hitachi）を用いて測定した。
ＦＴ−ＩＲは、ＪＩＲ−ＷＩＮＳＰＥＣ５０（ＪＥＯＬ）を用いた。アセトンに溶解した試料を岩塩に塗布して測定した。
【０１２８】
化合物Ｉ−１の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ₂₉Ｈ₃₅ＮＯ₅
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 478.4473
Calculated: 478.2593 for Ｃ₂₉Ｈ₃₆ＮＯ₅
ＵＶ λ_max nm (ε) 214 (sh) (84,000), 260 (sh) (21,500), 291 (30,000)
IR ν_max (NaCl) cm^-1 3855, 3747, 3309, 2971, 2919, 2863, 1664, 1618, 1513, 1461, 1373, 1247, 1168, 1074, 943, 835, 765, 684
【０１２９】
［実施例１０］
化合物Ｉ−２の合成
実施例９と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、ｐ−アミノ安息香酸とした以外は、実施例９と同様に本培養を行った。
得られた培養抽出液３００ｍｌから、ブフナーロートを用いて菌体を除去し、培養上清を得た。水流ポンプによる減圧下、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮を行った。残量が約１００ｍｌ以下となった時点で濃縮を止め、リン酸でｐＨを２に調製して低温室に一晩放置した。生じた沈殿を遠心により分離し、これをアセトンに溶解した。このアセトン懸濁液を遠心して上清を分離して濃縮乾固して６０３．３ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎで遠心した。ＨＰＬＣでの分取を行う前に、この上清をLichrolut ＲＰ−１８（１００ｍｇ）にて前処理を行った。逆相ＨＰＬＣはカラム；Inertsil PREP-ODS（直径３０×２５０ｍｍ）、温度４０℃、流速；２５ｍｌ／ｍｉｎ、検出波長：２６０ｎｍ、展開溶媒；５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む７０％メタノールで行い、保持時間２１〜２２分のピークを分取した。ロータリーエバポレーターを用いてメタノールを留去した後、等量の酢酸エチルで３回抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水後ろ過し、濃縮した。これをメタノールに溶解してろ過し、濃縮、乾固して化合物Ｉ−２の精製物５２．４４ｍｇを得た。
【０１３０】
化合物Ｉ−２の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、及びＦＴ−ＩＲは、実施例９と同様に測定した。ＮＭＲは、Ａｌｐｈａ６００（ＪＥＯＬ）を用い、¹Ｈ ６００ＭＨｚ， ¹³Ｃ １５０ＭＨｚ、６０℃で測定した。サンプルは約１０ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ−ｄ₆溶液とした。
化合物Ｉ−２の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ₃₀Ｈ₃₅ＮＯ₆
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 506.2778
Calculated: 506.2543 for C₃₀H₃₆NO₆
ＵＶ λ_max nm (ε) 296 (29,300)
IR ν_max (NaCl) cm^-1 3853, 3739, 3392, 2969, 2915, 2858, 1691, 1610, 1513, 1463, 1429, 1365, 1303, 1267, 1187, 1076, 939, 848, 779, 676, 551
ＮＭＲ
【０１３１】
【表６】
【０１３２】
［実施例１１］
化合物Ｉ−３の合成
実施例１０と同様に前培養を行った。
この培養液５ｍｌを、本培養培地１００ｍｌの入った５００ｍ１容三角フラスコに接種し、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で６日間にわたり本培養を行った。
本培養用培地（制限培地）は、スクロース（５％）、粉末酵母エキス（０．１％）、ＫＮＯ₃（０．７％）、Ｋ₂ＨＰＯ₄（１．５％）、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．０５％）、ＫＣ１（０．０５％）、ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ（０．０００２５％）、ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ（０．００１５％）、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ（０．０００６５％）を水に溶かし、ＨＣｌを用いてｐＨ５．８に調製し、消泡剤ＣＢ４４２（０．０１％）（０．１ｇ／ｍｌアセトン溶液を１ｍｌ／Ｌ添加）（日本油脂化学，日本）を加え培養器に１００ｍｌずつ分注後、オートクレーブ（１２１℃，１５ｍｉｎ）を行ったものを使用した。
接種した日を培養０日目とし、培養４日目（９６時間後）に１００ｍｇのｍ−アミノ安息香酸を培地に添加して生産用培地とし、培養を継続した。それから約４０時間後にメタノールを２００ｍｌ添加して、培養を終了した。その後、ロータリーシェイカーを用いて１８０ｒｐｍ，２５℃で約２時間にわたり振盪して抽出を行った。
【０１３３】
実施例１０と同様に粗精製を行い、２２３．１ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例１０と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例１０と同様に行った。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノールを用い、メタノール濃度を７０％から９０％へ、３０分間かけて直線的に増加させた。保持時間１７．５〜１８．５分のピークを分取した。得られた画分を実施例１０と同様に精製し、化合物Ｉ−３の精製物４０．３６ｍｇを得た。
【０１３４】
化合物Ｉ−３の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、及びＦＴ−ＩＲは、実施例１０と同様に測定した。ＮＭＲは、Ａｌｐｈａ６００（ＪＥＯＬ）を用い、¹Ｈ ６００ＭＨｚ， ¹³Ｃ １５０ＭＨｚ、２５℃で測定した。サンプルは約１０ｍｇ／ｍｌのアセトン−ｄ₆溶液とした。
【０１３５】
化合物Ｉ−３の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ₃₀Ｈ₃₅ＮＯ₆
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 506.2573
Calculated: 506.2543 for Ｃ₃₀Ｈ₃₆ＮＯ₆
ＵＶ λ_max nm (ε) 217 (46,786), 281 (17,583)
ＩＲ ν_max (NaCl) cm^-1 3352, 2970, 2920, 2858, 2634, 2540, 1693, 1616, 1593, 1462, 1367, 1290, 1244, 1155, 1072
ＮＭＲ
【０１３６】
【表７】
【０１３７】
［実施例１２］
化合物Ｉ−４の合成
実施例１０と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、ｏ−アミノ安息香酸とした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例１０と同様に粗精製を行い、１２０ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例１０と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例１０と同様に行った。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノールを用い、メタノール濃度を７０％から９０％へ、４０分間かけて直線的に増加させた。保持時間２２．８〜２３．８分のピークを分取した。得られた画分を実施例１０と同様に精製し、化合物Ｉ−４の精製物１４．５８ｍｇを得た。
【０１３８】
化合物Ｉ−４の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、及びＦＴ−ＩＲは、実施例９と同様に測定した。ＮＭＲは、４０℃で実施例１１と同様に測定した。
【０１３９】
化合物Ｉ−４の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ₃₀Ｈ₃₅ＮＯ₆
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 506.2573
Calculated: 506.2543 for Ｃ₃₀Ｈ₃₆ＮＯ₆
ＵＶ λ_max nm (ε) 215 (sh) (48,908), 260 (13,440), 301 (sh) (5,255)
ＩＲ ν_max (NaCl) cm^-1 3398, 2970, 2920, 2860, 2630, 2488, 1707, 1612, 1466, 1369, 1240, 1159, 1078, 1036
ＮＭＲ
【０１４０】
【表８】
【０１４１】
［実施例１３］
化合物Ｉ−５の合成
実施例１０と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、４−アミノサリチル酸とした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例１０と同様に粗精製を行い、４０８ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１５０ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例１０と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例１０と同様に行った。検出波長は２９０ｎｍとした。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む７０％メタノールを用い、保持時間１２．７〜１５分のピークを分取した。得られた画分を実施例１０と同様に精製し、化合物Ｉ−５の精製物１８．５０ｍｇを得た。
【０１４２】
化合物Ｉ−５の特性を以下のようにして確認した。
ＦＡＢ−ＭＳはＪＥＯＬ ＳＸ−１０２Ａを用いて、グリセロールをマトリックスとしてポジティブイオンモードで測定した。ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ及びＮＭＲは、実施例１１と同様に測定した。
【０１４３】
化合物Ｉ−５の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ₃₀Ｈ₃₅ＮＯ₇
FAB-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 522
Calculated: 522.2492 for Ｃ₃₀Ｈ₃₆ＮＯ₇
ＵＶ λ_max nm (ε) 212 (sh) (47,641), 288 (18,973), 306 (18,243)
ＩＲ ν_max (NaCl) cm^-1 3396, 2968, 2922, 2860, 2553, 1689, 1622, 1462, 1362, 1253, 1218, 1157, 1074
ＮＭＲ
【０１４４】
【表９】
【０１４５】
［実施例１４］
化合物Ｉ−６の合成
実施例１０と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、４−アミノ−３−ヒドロキシ安息香酸とした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例１０と同様に粗精製を行い、１７０ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例１０と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例１０と同様に行った。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノールを用い、メタノール濃度を７０％から１００％へ、４０分間かけて直線的に増加させた。保持時間１４．３〜１５．３分のピークを分取した。得られた画分を実施例１０と同様に精製し、化合物Ｉ−６の精製物９．５４ｍｇを得た。
【０１４６】
化合物Ｉ−６の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ、及びＮＭＲは、実施例１１と同様に測定した。
化合物Ｉ−６の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ₃₀Ｈ₃₅ＮＯ₇
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 522.2533
Calculated: 522.2492 for Ｃ₃₀Ｈ₃₆ＮＯ₇
ＵＶ λ_max nm (ε) 206 (66,823), 263 (16,471), 297 (13,865)
ＩＲ ν_max (NaCl) cm^-1 3388, 2968, 2922, 2858, 2578, 1697, 1614, 1466, 1371, 1215, 1076
ＮＭＲ
【０１４７】
【表１０】
【０１４８】
［実施例１５］
化合物Ｉ−７の合成
実施例１０と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、３−ヒドロキシアントラニル酸とした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例１０と同様に粗精製を行い、２００ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例１０と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例１０と同様に行った。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノールを用い、メタノール濃度を７０％から８０％へ、１０分間かけて直線的に増加させた後に８０％を１０分間維持した。保持時間１２．４〜１３．５分のピークを分取した。得られた画分を実施例１０と同様に精製し、化合物Ｉ−７の精製物３１．１ｍｇを得た。
【０１４９】
化合物Ｉ−７の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ、及びＮＭＲは、実施例１１と同様に測定した。
化合物Ｉ−７の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ₃₀Ｈ₃₅ＮＯ₇
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 522.2327
Calculated: 522.2492 for Ｃ₃₀Ｈ₃₆ＮＯ₇
ＵＶ λ_max nm (ε) 213 (57,753), 255 (11,155), 290 (7,714)
ＩＲ ν_max (NaCl) cm^-1 3356, 2968, 2920, 2858, 1697, 1616, 1470, 1294, 1159, 1076, 762
ＮＭＲ
【０１５０】
【表１１】
【０１５１】
［実施例１６］
化合物Ｉ−８の合成
実施例１０と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、３−アミノサリチル酸とした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例１０と同様に粗精製を行い、２８０ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例１０と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例１０と同様に行った。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む７５％メタノールを用い、保持時間１６．０〜１８．６分のピークを分取した。得られた画分を実施例１０と同様に精製し、化合物Ｉ−８の精製物２３．２９ｍｇを得た。
【０１５２】
化合物Ｉ−８の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ、及びＮＭＲは、実施例１１と同様に測定した。
化合物Ｉ−８の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ₃₀Ｈ₃₅ＮＯ₇
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 522.2537
Calculated: 2492 for Ｃ₃₀Ｈ₃₆ＮＯ₇
ＵＶ λ_max nm (ε) 4 (57,962), 256 (10,633), 304 (11,676)
ＩＲ ν_max (NaCl) cm^-1 221, 2850, 2918, 2976, 1678, 1616, 1464, 1240, 1157, 1074
ＮＭＲ
【０１５３】
【表１２】
【０１５４】
［実施例１７］
化合物Ｉ−９の合成
実施例１０と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、５−アミノサリチル酸とした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例１０と同様に粗精製を行い、５０２ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて２００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例１０と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例１０と同様に行った。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む７０％メタノールを用い、保持時間２２．０〜２５．５分のピークを分取した。得られた画分を実施例１０と同様に精製し、化合物Ｉ−９の精製物６６．３４ｍｇを得た。
【０１５５】
化合物Ｉ−９の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ、及びＮＭＲは、実施例１１と同様に測定した。
化合物Ｉ−９の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ₃₀Ｈ₃₅ＮＯ₇
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 522.2505
Calculated: 522.2492 for Ｃ₃₀Ｈ₃₆ＮＯ₇
ＵＶ λ_max nm (ε) 214 (50,665), 259 (sh) (9,591), 295 (14,490)
ＩＲ ν_max (NaCl) cm^-1 3394, 2970, 2920, 2858, 1676, 1618, 1489, 1464, 1370, 1203, 1161, 1076
ＮＭＲ
【０１５６】
【表１３】
【０１５７】
［実施例１８］
化合物Ｉ−１０の合成
実施例１０と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、３−アミノ−４−ヒドロキシ安息香酸とした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例１０と同様に粗精製を行い、４２０ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１５０ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例１０と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例１０と同様に行った。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノールを用い、メタノール濃度を６５％で２５分間維持した後に、６５％から１００％へ、５分間かけて直線的に増加させた後に１００％を１０分間維持した。保持時間２８．７〜３２．５分のピークを分取した。得られた画分を実施例１０と同様に精製し、化合物Ｉ−１０の精製物７８．９４ｍｇを得た。
【０１５８】
化合物Ｉ−１０の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ、及びＮＭＲは、実施例１１と同様に測定した。
化合物Ｉ−１０の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ₃₀Ｈ₃₅ＮＯ₇
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 522.2550
Calculated: 522.2492 for Ｃ₃₀Ｈ₃₆ＮＯ₇
ＵＶ λ_max nm (ε) 215 (52,124), 252 (22,205), 308 (sh) (6,255)
ＩＲ ν_max (NaCl) cm^-1 3803, 3429, 3068, 2970, 2924, 2860, 2549, 2517, 1691, 1601, 1464, 1302, 1076, 1036
ＮＭＲ
【０１５９】
【表１４】
【０１６０】
［実施例１９］
化合物Ｉ−１１の合成
実施例１０と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、５−ヒドロキシアントラニル酸とした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例１０と同様に粗精製を行い、３０５ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例１０と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、検出方法および展開条件以外は実施例１０と同様に行った。検出はダイオードアレイ検出器を用い２６０〜３５０ｎｍをモニタした。展開溶媒としては、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ギ酸を含む８０％メタノールを用い、保持時間１６．７〜１７．７分のピークを分取した。得られた画分をロータリーエバポレーターで濃縮してメタノールを除去した後に凍結乾燥した。乾燥物にｎ−ヘキサンを加えて攪拌後遠心し、不溶物を回収した。この操作を３回行い、不溶物をメタノールで溶解後ろ過し、これを濃縮乾固して、化合物Ｉ−１１の精製物４３．３７ｍｇを得た。
【０１６１】
化合物Ｉ−１１の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ、及びＮＭＲは、実施例１１と同様に測定した。
化合物Ｉ−１１の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ₃₀Ｈ₃₅ＮＯ₇
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 522.2516
Calculated: 522.2492 for Ｃ₃₀Ｈ₃₆ＮＯ₇
ＵＶ λ_max nm (ε) 214 (66,614), 260 (16,471), 297 (sh) (9,695)
ＩＲ ν_max (NaCl) cm^-1 3373, 3329, 2970, 2920, 2860, 1705, 1660, 1610, 1504, 1464, 1338, 1296, 1219, 1074, 1032
ＮＭＲ
【０１６２】
【表１５】
【０１６３】
［実施例２０］
化合物Ｉ−１６の合成
実施例９と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、アデニンとした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例９と同様に粗精製を行い、１２３ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例９と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例９と同様に行った。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノールを用い、メタノール濃度を７０％から１００％へ、３０分間かけて直線的に増加させた。保持時間１７．５〜１８分のピークを分取した。得られた画分を実施例９と同様に精製し、化合物Ｉ−１６の精製物１．６６ｍｇを得た。
【０１６４】
化合物Ｉ−１６の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶは、実施例９と同様に測定した。
化合物Ｉ−１６の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula C₂₈H₃₃N₅O₄
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M+H)⁺ : 504.2665
Calculated: 504.2611 for C₂₈H₃₄N₅O₄
ＵＶ λ _max nm (ε) 212 (43,984), 258 (9,260), 301 (3,422)
【０１６５】
［実施例２１］
化合物Ｉ−１７の合成
実施例９と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオンとした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例９と同様に粗精製を行い、１３０ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例９と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例９と同様に行った。展開溶媒は、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む７５％メタノールで行い、保持時間１６．５〜１７．５分のピークを分取した。分取画分を実施例９と同様に精製し、化合物Ｉ−１７の精製物１０．２０ｍｇを得た。
【０１６６】
化合物Ｉ−１７の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、及びＦＴ−ＩＲは、実施例９と同様に測定した。
化合物Ｉ−１７の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula C₃₁H₃₅N₃O₆
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M+H)⁺ : 546.2742
Calculated: 546.2604 for C₃₁H₃₆N₃O₆
ＵＶ λ_max nm (ε) 208 (85,822), 260 (14,722), 306 (11,668)
IR ν _max (NaCl) cm^-1 3408, 3259, 2968, 2918, 2858, 1659, 1605, 1473, 1333, 1159,1076, 1041
【０１６７】
［実施例２２］
化合物Ｉ−１８の合成
実施例９と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、１−アミノ−２−ナフトール−４−スルホン酸とした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例９と同様に粗精製を行い、１９９ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例９と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例９と同様に行った。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノールを用い、メタノール濃度を７０％から１００％へ、３０分間かけて直線的に増加させた。保持時間１４．５〜１５．５分のピークを分取した。得られた画分を実施例９と同様に精製し、化合物Ｉ−１８の精製物１８．４０ｍｇを得た。
【０１６８】
化合物Ｉ−１８の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、及びＦＴ−ＩＲは、実施例９と同様に測定した。
化合物Ｉ−１８の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula C₃₃H₃₇NO₈S
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M+H)⁺ : 608.2346
Calculated: 608.2318 for C₃₃H₃₈NO₈S
ＵＶ λ_max nm (ε) 217 (63,880), 234 (sh) (49,185), 260 (12,144), 285 (11,173), 296 (11,051), 326 (5,586), 338 (60,72)
IR ν_max (NaCl) cm^-1 3452, 3242, 2968, 2916, 2856, 2146, 1670, 1616, 1464, 1425, 1358, 1171, 1051
【０１６９】
［実施例２３］
化合物Ｉ−１９の合成
実施例９と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、ｐ−スルファニル酸とした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例９と同様に粗精製を行い、３１６ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例９と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例９と同様に行った。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノールを用い、メタノール濃度を６５％から１００％まで３５分間かけて直線的に増加させた。保持時間１８〜１８．５分のピークを分取した。得られた画分を実施例１９と同様に精製し、化合物Ｉ−１９の精製物１２．３３ｍｇを得た。
【０１７０】
化合物Ｉ−１９の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ及びＮＭＲは、実施例１２と同様に測定した。
化合物Ｉ−１９の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula C₂₉H₃₅NO₇S
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M+H)⁺ : 542.2233
Calculated: 542.2212 for C₂₉H₃₆NO₇S
ＵＶ λ _max nm (ε) 224 (sh) (25,112), 286 (19,484)
IR ν_max (NaCl) cm^-1 3188, 3057, 2972, 2918, 2856, 1697, 1606, 1460, 1367, 1174, 1132, 1080, 1036
ＮＭＲ
【０１７１】
【表１６】
【０１７２】
［実施例２４］
化合物Ｉ−２０の合成
実施例９と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、Ｌ−フェニルグリシンとした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例９と同様に粗精製を行い、２７０ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例９と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例９と同様に行った。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノールを用い、メタノール濃度を７５％から９０％へ、４０分間かけて直線的に増加させた。保持時間１５〜１８．５分のピークを分取した。得られた画分を実施例９と同様に精製し、化合物Ｉ−２０の精製物３７．８５ｍｇを得た。
【０１７３】
化合物Ｉ−２０の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ及びＮＭＲは、実施例１１と同様に測定した。
化合物Ｉ−２０の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula C₃₁H₃₇NO₆
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M+H)⁺ : 520.2662
Calculated: 520.2699 for C₃₁H₃₈NO₆
ＵＶ λ _max nm (ε) 214 (46,214), 259 (11,112), 300 (3,012)
IR ν_max (NaCl) cm^-1 3423, 2968, 2920, 2864, 1726, 1660, 1620, 1464, 1350, 1205, 1169, 1074
ＮＭＲ
【０１７４】
【表１７】
【０１７５】
［実施例２５］
化合物Ｉ−２１の合成
実施例９と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、Ｄ−フェニルグリシンとした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例９と同様に粗精製を行い、１５０ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて７５ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例９と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例９と同様に行った。展開溶媒としては、５０ｍＭ酢酸アンモニウムを含むメタノールを用い、メタノール濃度を７０％から１００％へ、３０分間かけて直線的に増加させた。保持時間１９〜２０．５分のピークを分取した。得られた画分を実施例９と同様に精製し、化合物Ｉ−２１の精製物１７．５９ｍｇを得た。
【０１７６】
化合物Ｉ−２１の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ、及びＮＭＲは、実施例１１と同様に測定した。
化合物Ｉ−２１の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula C₃₁H₃₇NO₆
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M+H)⁺ : 520.2747
Calculated: 520.2699 for C₃₁H₃₈NO₆
ＵＶ λ _max nm (ε) 215 (44,864), 259 (11,008), 300 (3,012)
IR ν_max (NaCl) cm^-1 3354, 2968, 2922, 2862, 1714, 1664, 1620, 1466, 1356, 1207, 1167, 1074
ＮＭＲ
【０１７７】
【表１８】
【０１７８】
［実施例２６］
化合物Ｉ−２２の合成
実施例９と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、Ｌ−４−ヒドロキシフェニルグリシンとした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例９と同様に粗精製を行い、３６５ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１５０ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例９と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例１９と同様に行った。展開溶媒としては、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ギ酸とメタノールを用い、メタノール濃度を７５％から９０％へ、３０分間かけて直線的に増加させた。保持時間１３〜１４分のピークを分取した。得られた画分を実施例１９と同様に精製し、化合物Ｉ−２２の精製物６９．６８ｍｇを得た。
【０１７９】
化合物Ｉ−２２の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ、及びＮＭＲは、実施例１１と同様に測定した。
化合物Ｉ−２２の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula C₃₁H₃₇NO₇
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M+H)⁺ : 536.2656
Calculated: 536.2648 for C₃₁H₃₈NO₇
ＵＶ λ _max nm (ε) 216 (42,714), 262 (11,026), 300 (2,783)
IR ν_max (NaCl) cm^-1 3348, 2974, 2922, 2856, 1718, 1660, 1612, 1514, 1464, 1365, 1211, 1173, 1072
ＮＭＲ
【０１８０】
【表１９】
【０１８１】
［実施例２７］
化合物Ｉ−２３の合成
実施例９と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、Ｄ−４−ヒドロキシフェニルグリシンとした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例９と同様に粗精製を行い、５１０ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて２００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例９と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例１９と同様に行った。展開溶媒としては、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ギ酸とメタノールを用い、メタノール濃度を７５％から９０％へ、３０分間かけて直線的に増加させた。保持時間１３．５〜１５分のピークを分取した。得られた画分を実施例１９と同様に精製し、化合物Ｉ−２３の精製物１５０．３９ｍｇを得た。
【０１８２】
化合物Ｉ−２３の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ、及びＮＭＲは、実施例１１と同様に測定した。
化合物Ｉ−２３の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula C₃₁H₃₇NO₇
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M+H)⁺ : 536.2671
Calculated: 536.2648 for C₃₁H₃₈NO₇
ＵＶ λ _max nm (ε) 215 (52,563), 261 (13,274), 300 (5,353)
IR ν_max (NaCl) cm^-1 3325, 2970, 2922, 2858, 1711, 1662, 1612, 1512, 1464, 1365, 1217, 1173, 1074
ＮＭＲ
【０１８３】
【表２０】
【０１８４】
［実施例２８］
化合物Ｉ−２４の合成及び化合物Ｉ−２５の合成
実施例９と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、５０ｍｇのＤＬ−３−ヒドロキシフェニルグリシンとした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例９と同様に粗精製を行い、２３０ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて７０ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例９と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例１９と同様に行った。展開溶媒としては、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ギ酸とメタノールを用い、メタノール濃度を７５％から９０％へ、３０分間かけて直線的に増加させた。保持時間１６〜１７分のピーク（化合物Ｉ−２４）と、保持時間１７．５〜１９分のピーク（化合物Ｉ−２５）を分取した。得られたそれぞれの画分を実施例１９と同様に精製し、化合物Ｉ−２４の精製物１６．４３ｍｇと、化合物Ｉ−２５の精製物２２．９８ｍｇを得た。
【０１８５】
化合物Ｉ−２４の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ及びＦＴ−ＩＲは、実施例９と同様に測定した。
化合物Ｉ−２４の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula C₃₁H₃₇NO₇
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M+H)⁺ : 536.2716
Calculated: 536.2648 for C₃₁H₃₈NO₇
ＵＶ λ _max nm (ε) 215 (47,531), 261 (11,348), 299 (3,212)
IR ν_max (NaCl) cm^-1 3294, 2970, 2926, 2858, 1703, 1662, 1605, 1464, 1367, 1219, 1161, 1076
【０１８６】
化合物Ｉ−２５の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ、ＦＴ−ＩＲ、及びＮＭＲは、実施例１１と同様に測定した。
化合物Ｉ−２５の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula C₃₁H₃₇NO₇
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M+H)⁺ : 536.2723
Calculated: 536.2648 for C₃₁H₃₈NO₇
ＵＶ λ _max nm (ε) 215 (57,915), 261 (13,703), 300 (3,747)
IR ν_max (NaCl) cm^-1 3309, 2974, 2924, 2864, 1707, 1662, 1603, 1464, 1365, 1224, 1163, 1076
ＮＭＲ
【０１８７】
【表２１】
【０１８８】
［実施例２９］
化合物Ｉ−２６の合成
実施例９と同様に前培養を行った。
本培養４日目に添加した有機アミン化合物を、Ｌ−チロシンとした以外は、実施例１１と同様に本培養を行った。
実施例９と同様に粗精製を行い、３１０ｍｇの乾固物を得た。これにＭｅＯＨを加えて１００ｍｇ／ｍｌの溶液とした後に、実施例９と同様に前処理を行った。逆相ＨＰＬＣは、展開条件以外は実施例１９と同様に行った。展開溶媒としては、０．１％ギ酸とメタノールを用い、メタノール濃度を７０％から８０％へ、３０分間かけて直線的に増加させた。保持時間２１〜２３分のピークを分取した。得られた画分を実施例１９と同様に精製し、化合物Ｉ−２６の精製物５３．９４ｍｇを得た。
【０１８９】
化合物Ｉ−２６の特性を以下のようにして確認した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ、ＵＶ及びＦＴ−ＩＲは、実施例９と同様に測定した。
ＮＭＲは、Ａｌｐｈａ６００（ＪＥＯＬ）を用い、¹Ｈ ６００ＭＨｚ， ¹³Ｃ １５０ＭＨｚ、４０℃で測定した。サンプルは約３０ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ−ｄ₆溶液とした。
化合物Ｉ−２６の物理化学的性質を以下に示す。
Molecular formula Ｃ₃₂Ｈ₃₉ＮＯ₇
MALDI-TOF-MS (m/z)
Found (M + H)⁺: 550.4594
Calculated: 550.2805 for Ｃ₃₂Ｈ₄₀ＮＯ₇
ＵＶ λ_max nm (ε) 215 (39,050), 261 (8,690), 297 (sh) (2,530)
IR ν_max (NaCl) cm^-1 3379, 2922, 2854, 1707, 1664, 1514, 1464, 1363, 1221, 1167, 1074
ＮＭＲ
【０１９０】
【表２２】
【０１９１】
［実施例３０］
上記のようにして得られた各種トリプレニルフェノール化合物について、ウロキナーゼ触媒によるプラスミノーゲン（ｐｌｇ）活性化を促進する活性として、血栓溶解活性を以下のように行って性能を評価した。
なお、比較例としてはオルニプラビン（ＳＭＴＰ−７）を用いた。各化合物は以下の通りである。
【０１９２】
【表２３】
【０１９３】
【化２７】
【０１９４】
【化２８】
【０１９５】
【化２９】
【０１９６】
【化３０】
【０１９７】
【化３１】
【０１９８】
【化３２】
【０１９９】
プラスミンが合成発色基質ＶＬＫ−ｐＮＡ（Val−Leu−Lys−ｐ−ニトロアニリド）のペプチド結合を切断し、ｐ−ニトロアリニン（ｐＮＡ）を生成することを利用し、ｐＮＡの４０５ｎｍで吸収される黄色の発色を測定することにより、サンプルのプラスミノーゲン活性化促進活性を測る。測定器にはＭＴＰ−５００形マイクロプレートリーダー（コロナ電気）を用い、９６穴丸底マイクロプレートにて測定を行った。
測定条件はカイネティック測定３７℃、デュアル波長４０５ｎｍ（activity）−５９５ｎｍ（background）で１分ごとに６０回測定した。
精製したサンプルは、ＤＭＳＯ溶液あるいはナトリウム塩の水溶液とした。それをＴＢＳ／Ｔ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ及び０．０１％ Ｔｗｅｅｎ８０，ｐＨ７．４）で希釈して測定サンプルとした。サンプル１５μｌに、反応液（ＴＢＳ／Ｔによりそれぞれ終濃度が０．１ｍＭ ＶＬＫ−ｐＮＡ、５０ｎＭ Ｇｌｕ−ｐｌｇ、５０Ｕ／ｍｌ ｕ−ＰＡになるように調製されたもの）を各３５μｌ加え、５０μｌ／ウェル、各濃度３連で測定を行った。
また、ブランクとしてｕ−ＰＡを含まない反応液を用いて反応を行い、その値を上記の反応で得られた値から差し引いた。時間の二乗に対する吸光度をプロットし、その傾きを反応初速度とし、各種トリプレニルフェノール化合物を加えないものを対照として比較することで、各化合物の活性の度合いとした。
【０２００】
「１０倍促進活性濃度」は、ＳＭＴＰ化合物を含まない反応液（対照）を用いたときの値を１とした場合に１０倍の促進活性となる濃度を表す。また、「最大促進活性」は、ＳＭＴＰ化合物によるプラスミノーゲン活性化の促進が最大となる濃度を表す。
結果を表２４に示す。
【０２０１】
【表２４】
【０２０２】
Ｉ−１〜Ｉ−１１、Ｉ−１６〜Ｉ−１９のトリプレニルフェノール化合物は、アミノフェノール若しくはアミノ安息香酸、アデニン、アデノシン、アミノジヒドロフタラジンジオン、アミノナフトールスルホン酸、スルファニル酸又はそれら誘導体を添加することによって得られたものである。これらの化合物では、カルボキシ基又は水酸基等を置換基として有する芳香族基が、トリプレニルフェノール骨格に直接連結している。
またＩ−２０〜Ｉ−２６のトリプレニルフェノール化合物は、フェニルグリシン、チロシンを添加することによって得られたものである。これらの化合物では、芳香環とトリプレニルフェノール骨格との間にメチル基が１又は２個となっている。
【０２０３】
表２４に示されるように、これらの化合物のいずれにも、プラスミノーゲン活性化促進活性が認められ、オルニプラビンと同様に血栓溶解剤として利用可能であり、また、これらの化合物はいずれも低分子量の化合物であるため、オルニプラビンよりも良好な吸収性が期待される。
また特に化合物Ｉ−２、Ｉ−５、Ｉ−８、Ｉ−２０、Ｉ−２４、Ｉ−２６は、オルニプラビンと同等又はそれ以上の高いプラスミノーゲン活性化促進活性を示し、これらの化合物は、吸収性の観点からオルニプラビンよりも良好な血栓溶解剤として使用できることが示唆された。
これにより本実施例の化合物は、吸収が良く高い活性を有する効果的な血栓溶解剤として利用可能なことは明らかである。

Claims (7)

1. ラクタム窒素原子を有するトリプレニルフェノール化合物を製造する製造方法であって、
   スタキボトリス属糸状菌を、１質量％以下の無機アミン化合物を含み有機アミン化合物を含まない制限培地、０．５質量％以下の有機アミン化合物を含み無機アミン化合物を含まない制限培地又は、１質量％以下の無機アミン化合物及び０．５質量％以下の有機アミン化合物の双方を含む制限培地による第１の培養工程で培養し、培養中期以降に、アミン化合物を含有している生産用培地による第２の培養工程で培養すること、
   前記第２の培養工程後の培養物から、ラクタム窒素原子を有するトリプレニルフェノール化合物を得ること、
   を含むトリプレニルフェノール化合物の製造方法。
2. 前記第１の培養工程で使用される制限培地が、無機アミン化合物、有機アミン化合物又はこれらの組み合わせを総量０．５質量％以下で含み、前記生産用培地が有機アミン化合物を含む請求項１記載の製造方法。
3. 前記第１の培養工程で使用される制限培地が０．５質量％以下の有機アミン化合物を含み、前記第２の培養工程で使用される生産用培地が無機第一アミン化合物を含む請求項１記載の製造方法。
4. 前記制限培地が無機第一アミン化合物を含む請求項３記載の製造方法。
5. 前記生産用培地が、アミノフェノール、アミノ安息香酸、アデニン、アデノシン、アミノジヒドロフタラジンジオン、アミノナフトールスルホン酸、スルファニル酸、メチルアミノフェノール、アミノサリチル酸、アミノヒドロキシ安息香酸、ヒドロキシアントラニル酸及びアミノメチルサリチル酸と、フェニルグリシン、ヒドロキシフェニルグリシン及びチロシン並びに、水酸基、カルボキシ基及び炭素数１〜５のアルキル基からなる群より選択された少なくとも１つの置換基を有するフェニルグリシン、ヒドロキシフェニルグリシン及びチロシンの誘導体とからなる群より選択された少なくとも１種の添加アミン化合物を含む請求項１又は請求項２記載の製造方法。
6. 前記制限培地及び生産用培地が、マグネシウム、コバルト、鉄、カルシウムからなる群より選択された少なくとも１種の金属イオンを更に含む請求項１〜請求項５のいずれか１項記載の製造方法。
7. 前記糸状菌が、スタキボトリス・ミクロスポラＩＦＯ３００１８である請求項１〜請求項６のいずれか１項記載の製造方法。