CN102317782A

CN102317782A - 表面改性基板以及生物芯片及其制造方法

Info

Publication number: CN102317782A
Application number: CN2010800079193A
Authority: CN
Inventors: 前野克行
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 2009-03-02
Filing date: 2010-03-01
Publication date: 2012-01-11
Also published as: KR20110137292A; JPWO2010101126A1; US20120034709A1; WO2010101126A1; EP2405267A1; JP5391265B2; EP2405267A4

Abstract

提供一种表面改性基板和生物芯片及其制造方法，其中所述表面改性基板，通过在表面具有反应性官能团的基板上，使具有对该反应性官能团持有反应性的官能团与具有由通式[化学式1](式中，R¹、R²以及R³分别为独立的碳数量为1～6的烷基，m为2～6的整数，n为1或2)表示的基团的化合物反应来制造。

Description

表面改性基板以及生物芯片及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种表面改性基板、生物芯片、生物芯片的制造方法、生物传感器以及分析方法。

背景技术

以往，具有磷酰胆碱基团(phosphorylcholine group)的高分子作为一种生物体适应性(biocompatible)高分子为公众所知，另外，使用这种高分子对各种树脂材料进行覆盖的生物体适应性材料也为公众所知。

在专利文献1中公开了一种医疗用材料，其在基材表面上形成了一覆盖层，该覆盖层由侧链上具有磷酰胆碱(phosphorylcholine)类似基团的单体、具有可与肝磷酯或肝磷酯衍生物结合的基团的单体的共聚物、以及肝磷酯或肝磷酯衍生物构成。

在专利文献2中，公开了一种分离材料，其至少在表面上具有磷酰胆碱类似基团，并且，在通过表面的X射线光电子分光分析所测量的光谱中，源自磷酰胆碱类似基团的磷元素的量P和碳元素的量C之间的比值(P/C)为0.002～0.3。

但是，由于无法在由具有磷酰胆碱基团的高分子所覆盖的材料上高密度地导入磷酰胆碱基团，因此存在容易吸附生物体物质的问题。

现有技术文献如下：

专利文献1：(日本)特开2000-279512号公报

专利文献2：(日本)特开2002-98676号公报

发明内容

本发明想要解决的课题如下：

鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种能够抑制生物体物质吸附的表面改性基板及生物芯片、该生物芯片的制造方法、具有该生物芯片的生物传感器以及使用该生物传感器的分析方法。

用于解决上述课题的手段如下：

权利要求1记载的发明为一种表面改性基板，其特征在于，通过在表面具有反应性官能团的基板上，使具有对该反应性官能团持有反应性的官能团以及具有由下列化学式1(通式)

[化学式1]

(式中，R¹、R²以及R³分别为独立的碳数量为1～6的烷基(alkyl)，m为2～6的整数，n为1或2)表示的基团的化合物反应来制造。

权利要求2记载的发明为如根据权利要求1所述的表面改性基板，其特征在于，所述反应性官能团为选自氨基、羟(hydroxyl)基、醛(aldehyde)基、羧基、可通过加水分解而生成硅烷醇(silanol)基的官能团以及硅烷醇基中的一种以上。

权利要求3记载的发明为一种生物芯片，其特征在于，通过在权利要求1所述的表面改性基板上，使具有所述对反应性官能团持有反应性的官能团的配体反应来制造。

权利要求4记载的发明为一种生物芯片的制造方法，其特征在于，包含：在表面具有反应性官能团的基板上，使具有对该反应性官能团持有反应性的官能团的配体反应的工序；使该配体反应的基板与所述对反应性官能团持有反应性的官能团以及具有由下列化学式2(通式)

[化学式2]

(式中，R¹、R²以及R³分别为独立的碳数量为1～6的烷基(alkyl)，m为2～6的整数，n为1或2)表示的基团的化合物反应的工序。

权利要求5记载的发明为一种生物芯片，其特征在于，使用权利要求4所述的生物芯片的制造方法来制造。

权利要求6记载的发明为一种生物传感器，其特征在于，具有权利要求3或5所述的生物芯片。

权利要求7记载的发明为一种分析方法，其特征在于，使用权利要求6所述的生物传感器对特定结合在所述配体上的物质进行分析。

本发明的效果如下：

根据本发明，能够提供一种能够抑制生物体物质吸附的表面改性基板及生物芯片、该生物芯片的制造方法、具有该生物芯片的生物传感器以及使用该生物传感器的分析方法。

附图说明

图1为表示实施例1及比较例1的生物芯片的S/N比的评价结果的图。

具体实施方式

下面参照附图对本发明的实施方式进行说明。

本发明的表面改性基板，通过在表面具有反应性官能团的基板上，使具有对该反应性官能团持有反应性的官能团以及具有由下列化学式3(通式)

[化学式3]

(式中，R¹、R²以及R³分别为独立的碳数量为1～6的烷基(alkyl)，m为2～6的整数，n为1或2)表示的磷酰胆碱类似基团的化合物反应来制造。由此，可在基板的表面上高密度地导入磷酰胆碱类似基团。其结果是可得到能够抑制生物体物质吸附的表面改性基板。

在本发明中，作为基板表面具有的反应性官能团，没有特别进行限定，但可以列举出氨基、羟基、醛基、羧基、可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团以及硅烷醇基等，也可以同时使用两种以上。另外，作为可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团可以列举出氢甲硅烷基(hydrosilyl)、烷氧基甲硅烷基(alkoxysilyl)、卤甲硅烷基(Halosilyl)、酰氧基甲硅烷基(Acyloxysilyl)、氨基甲硅烷基(Aminosilyl)等，但从稳定性、反应性等观点来看优选为碳数量为1～6的烷氧基甲硅烷基或者氢甲硅烷基。

这样，构成表面具有这样的反应性官能团的基板的材料可以是有机材料以及无机材料中的任意一种。

作为有机材料，没有特别进行限定，但可以列举出通过聚合苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油基酯(methacrylic acid glycidyl)、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基酯、(甲基)丙烯酸氨烷基酯、(甲基)丙烯酸羟烷基酯等的单体而得到的单聚物或共聚物等。其中，优选为丙烯酸-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺共聚物、甲基丙烯酸2-羟乙基-苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、2-氨乙基甲基丙烯酸酯-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺共聚物等。另外，作为这些之外的有机材料，可以列举出琼脂糖(agarose)、琼脂糖凝胶(sepharose)等。

作为无机材料，没有特别进行限定，但可以列举出滑石(talc)、高岭土、云母、绢云母(sericite)、白云母、金云母、合成云母、红云母、黑云母、蛭石(vermiculite)、碳酸镁、碳酸钙、硅酸铝、硅酸钡、硅酸钙、硅酸镁、硅酸锶、钨酸的金属盐、镁、硅、沸石、硫酸钡、烧成硫酸钙(烧石膏)、磷酸钙、氟磷灰石、羟基磷灰石、陶瓷粉、金属皂(例如，肉豆蔻酸锌、棕榈酸钙、硬脂酸铝)、氮化硼、氧化铈等。其中，优选为硅、氧化钛、氧化锌、氧化铝、氧化铁、滑石、云母(mica)、绢云母等。

在此需要说明的是，作为表面具有反应性官能团的基板，可以是通过对基板进行表面处理而导入反应性官能团。

作为在基板表面导入氨基的方法，可以列举出等离子处理、使表面处理剂反应的方法、硅酮(silicone)气相处理(gas-phasetreatment)。

在等离子处理中，在氮气气氛下通过低温等离子向基板的表面导入氨基(例如，参见Surface and Coatings Technology116-119(1999)802-807，Colloids and Surfaces A：Physicochem.Eng.Aspects195(2001)81-95，Macromol.Chem.Phys.200.989-996(1999))。具体而言，将基板收容到反应容器中，用真空泵将反应容器抽成真空后导入氮气，进行辉光放电。

在使表面处理剂反应的方法中，使用具有氨基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氮烷等表面处理剂，向具有硅烷醇基、烷氧基甲硅烷基等的基板表面导入氨基。具体而言，首先将基板泡入水和2-丙醇混合液中，添加3-氨丙基三甲氧基硅烷之后，加热到100℃使其反应6个小时。然后，冷却至室温，用甲醇洗净并进行干燥。

作为构成基板的材料，可以列举出甲基丙烯酸3-三甲氧基硅丙基-甲基丙烯酸甲酯-二乙烯基苯共聚物等有机材料；硅、玻璃、氧化铝、滑石、粘土、云母、石棉、氧化钛、氧化锌、氧化铁等无机材料等。

在硅酮气相处理中，使用1，3，5，7-四甲基环四硅氧烷向基板表面导入氢甲硅烷基之后通过使具有氨基的单体反应，从而向基板表面导入氨基(例如，参见日本特许公报平1-54379号、特许公报平1-54380号、特许公报平1-54381号)。具体而言，首先将基板和1，3，5，7-四甲基环四硅氧烷放入干燥器中，用抽气机(aspirator)除气。然后，在80℃使其反应16个小时后取出基板在120℃进行干燥。之后，将所得到的基板泡入酒精中，添加烯丙基胺后，添加氯铂酸的酒精溶液，在60℃搅拌2小时。反应结束后，用酒精清洗并进行减压干燥。

作为构成基板的材料，可以列举出苯乙烯-二乙烯基苯共聚物等有机材料；云母、滑石、高岭土、氧化铝、氧化钛、氧化锌、氧化铁等无机材料等。

作为具有氨基的单体，并不限定于烯丙基胺，可以是具有氨基的乙烯基单体(vinyl monomer)、丙烯基单体等。另外，氨基可以被丁氧羰基(butoxycarbonyl)、苄氧羰基(benzyloxycarbonyl)等保护起来。再者，还可以使用环氧基等，例如具有可以通过与二胺反应而可导入氨基官能团的单体来替代具有氨基的单体。

作为向基板表面导入醛基的方法，可以列举出在表面具有氨基的基板上使戊二醛反应的方法。

作为向基板表面导入羧基的方法，可以列举出使表面处理剂反应的方法、硅酮气相处理等。

在使表面处理剂反应的方法中，使用具有羧基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氮烷等表面处理剂，向具有硅烷醇基、烷氧基甲硅烷基等的基板表面导入羧基。具体而言，首先将三乙氧基硅丙基琥珀酸酐溶解到N，N-二甲基甲酰胺中，添加蒸馏水和4-二甲氨基吡啶，在室温搅拌16个小时，合成具有羧基的硅烷偶联剂。然后，将基板泡入水和2-丙醇混合液中，添加具有羧基的硅烷偶联剂后加热到100℃使其反应6个小时。然后，冷却至室温后，用甲醇洗净并进行干燥。

在硅酮气相处理中，使用1，3，5，7-四甲基环四硅氧烷向基板表面导入氢甲硅烷基之后通过使具有羧基的单体反应，从而向基板表面导入羧基(例如，参见日本特许公报平1-54379号、特许公报平1-54380号、特许公报平1-54381号)。具体而言，首先将基板和1，3，5，7-四甲基环四硅氧烷放入干燥器中，用抽气机除气。然后，在80℃使其反应16个小时后取出基板在120℃进行干燥。之后，将所得到的基板泡入酒精中，添加丙烯基羧酸(allyl carboxylicacid)后，添加氯铂酸的酒精溶液，在60℃搅拌2小时。反应结束后，用酒精清洗并进行减压干燥。

作为具有羧基的单体，并不限定于丙烯羧酸，可以是具有羧基的乙烯基单体、丙烯酸单体等。

作为向基板表面导入可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团以及/或者硅烷醇基的方法，可以列举出向基板表面涂敷含有具有可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团的聚合物(以下，称为“加水分解性聚合物”)和硅氧烷(alkoxysilane)的涂敷液的方法。

一旦在基板上涂敷含有加水分解性聚合物和硅氧烷的涂敷液，加水分解性聚合物和硅氧烷被加水分解，生成硅烷醇基。再者，通过硅烷醇基彼此之间的脱水缩合，加水分解性聚合物被架桥，并形成导入了硅烷醇基的架桥聚合物层。具体而言，向基板涂敷涂敷液后，涂敷水、酸或碱，并加热。另外，也可以在向基板涂敷水、酸或碱之后再涂敷涂敷液。再有，涂敷液中也可混合水、酸或碱。这种情况下，因为涂敷液中发生加水分解，所以涂敷时可以适当调制涂敷液。在此需要说明的是，使用水、酸或碱的情况下，可以进行加热，但通常室温下就可以进行充分的反应。另外，即便不使用水、酸或碱，依靠大气中的水分也可以缓慢地进行反应。

作为加水分解中所使用的酸或碱，只要能够进行加水分解，对其并无特别限定，可以将两种以上混合来使用，也可作为水溶液来使用。

作为涂敷液，可以使用将加水分解性聚合物和硅氧烷溶解或分散在有机溶剂中的涂敷液。作为有机溶剂，没有特别限定，但可以列举出：脂肪族烃，芳香族烃，氯代烃，醚(ether)系溶剂，碳数量为1～4、1～4价的脂肪族醇等醇系溶剂，甲基溶纤剂(methyl cellosolve)，丁基溶纤剂(butyl cellosolve)等溶纤剂系溶剂，二噁烷(dioxane)，醋酸甲酯(methyl acetate)，二甲酰胺(diformamide)等，也可并用两种以上。

涂敷液中的加水分解性聚合物的浓度优选为0.001～20重量％，更优选为0.1～5重量％。如果浓度未满0.001重量％，则一次处理可能得不到充分的效果；如果浓度超过20重量％，则涂敷性等可能变差。

另外，对加水分解性聚合物和硅氧烷的重量比也没有特别限定，优选为0.01％～20％，更优选为0.2％～5％。如果重量比未满0.01％，则架桥聚合物层的强度可能变得不充分；如果重量比超过20％，则向架桥聚合物中导入的硅烷醇基的量可能变得不充分。

作为涂敷涂敷液的方法，并无特别限定，但可以列举出浸渍涂敷法、喷雾涂敷法、旋转铸模(spin cast)法等。

作为构成基板的材料，可以列举出PP(polypropylene)、聚碳酸酯(polycarbonate)、PET(polyethylene terephthalate)、PEEK、氟系树脂、聚苯乙烯(polystyrene)、氯乙烯(vinyl chloride)等有机材料；金、钛、铝、铁、铜、不锈钢、氧化铝、氧化钛、氧化锌等无机材料。

作为加水分解性聚合物，只要是具有能够通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团的聚合物，就对其并无特别限定，可以使用对由下列化学式4(通式)

[化学式4]

(式中，R¹为氢原子或甲基；R²为碳数量为1～6的亚烃(alkylene)基，优选为亚丙基(propylene)；R³、R⁴以及R⁵分别为独立的碳数量为1～6的烷氧基(alkoxy)，优选为甲氧基(methoxyl)或乙氧基(ethoxyl)。)所表示的单体(A-1)进行聚合而得到的均聚物或共聚物(以下，称为“聚合物(A)”)。此时，可以使用两种以上的单体(A-1)。

另外，合成聚合物(A)时，可以对由下列化学式5(通式)

[化学式5]

(式中，R⁶为氢原子或甲基R⁷为碳数量为1～18的直链状、分歧状或环状的烷基(alkyl)，优选为碳数量为1～6的烷基，特别优选为甲基。)所表示的单体(A-2)进行聚合。此时，可以使用两种以上的单体(A-2)。

另外，合成聚合物(A)时，可以对由下列化学式6(通式)

[化学式6]

(式中，R⁸为氢原子或甲基R⁹为碳数量为1～6的亚烃基，优选为亚乙基、亚丙基或2-羟亚丙基(2-hydroxy propylene)，X为下列化学式7(通式)

[化学式7]

(式中，R¹⁰、R¹¹、R¹²、R¹³、R¹⁴、R¹⁵、R¹⁶、R¹⁷以及R¹⁸分别为独立的碳数量为1～6的直链或分歧状的烷基，优选为甲基。)

所表示的官能团(X-1)、下列化学式8(通式)

[化学式8]

(式中，R¹⁹、R²⁰、R²¹、R²²、R²³以及R²⁴分别为独立的碳数量为1～6的直链或分歧状的烷基，优选为甲基R²⁵为碳数量为1～6的直链或分歧状的烷基，优选为丁基x为正整数。)

所表示的官能团(X-2)或者下列化学式9(通式)

[化学式9]

(式中，R²⁶、R²⁷、R²⁸、R²⁹、R³⁰以及R³¹分别为独立的碳数量为1～6的直链或分歧状的烷基，优选为甲基R³²为碳数量为1～6的亚烃基，优选为亚乙基、亚丙基或2-羟亚丙基、R³³为氢原子或甲基y为正整数。)

所表示的官能团(x-3))

所表示的单体(A-3)进行共聚。在此需要说明的是，如果X为官能团(X-2)或(X-3)，则单体(A-3)的分子量优选为1000～100000，特别优选为2000～20000。此时，可以使用两种以上的单体(A-3)。

另外，合成聚合物(A)时，可以对由下列化学式10(通式)

[化学式10]

(式中，R³⁴为氢原子或甲基；R²为碳数量为1～6的亚烃基，优选为亚乙基或亚丙基；Y为由下列化学式11(通式)

[化学式11]

(式中，R³⁶、R³⁷以及R³⁸分别为独立的碳数量为1～6的烷基，优选为甲基；Z^-为卤化物离子或者有机酸或无机酸的共轭离子。)

所表示的官能团(Y-1)或者由下列化学式12(通式)

[化学式12]

(式中，R³⁹以及R⁴⁰分别为独立的碳数量为1～6的烷基，优选为甲基。)

所表示的官能团(Y-2)。)

所表示的单体(A-4)进行共聚。此时，可以使用两种以上的单体(A-4)。

换言之，合成聚合物(A)时，可以将单体(A-2)、单体(A-3)以及单体(A-4)中的至少一个与单体(A-1)一同进行共聚。

合成聚合物(A)时所使用的所有单体中的单体(A-1)的含量优选为40～85重量％。该含量如果未满40重量％，则架桥密度可能变低，亲水化的效果可能不能持久；如果超过85重量％，则架桥聚合物层的均匀性可能变低。

另外，合成聚合物(A)时所使用的所有单体中的单体(A-2)的含量优选为1重量％以上，更优选为为10重量％以上。该含量如果未满1重量％，则架桥聚合物层的耐水性可能变低。再有，合成聚合物(A)时所使用的所有单体中的单体(A-2)的含量优选为75重量％以下，更优选为60重量％以下。该含量如果超过75重量％，则聚合物(A)可能变为难以溶于醇系溶剂中。

另外，合成聚合物(A)时所使用的所有单体中的单体(A-3)的含量优选为1重量％以上，更优选为5重量％以上。该含量如果未满1重量％，则架桥聚合物层的耐水性可能变低。再有，合成聚合物(A)时所使用的所有单体中的单体(A-3)的含量优选为70重量％以下，更优选为60重量％以下。该含量如果超过70重量％，则聚合物(A)可能变为难以溶于乙醇系溶剂中。

另外，单体(A-4)与单体(A-1)、单体(A-2)以及单体(A-3)的总重量的重量比优选为0.01～1，更优选为0.05～0.5。该比值如果未满0.01，则架桥聚合物层的柔软性可能变低；如果超过1，则架桥结合物层的耐水性可能变低。

聚合物(A)的数均分子量(number average molecularweight)，只要具有低聚物(oligomer)以上的聚合度就无特别限定，但优选为2000～150000。数均分子量如果未满2000，则形成架桥聚合物层的时间可能变长；如果超过150000，则涂敷液的粘度可能变高，涂敷性和操作性可能变差。

在此需要说明的是，关于聚合物(A)的具体实例以及制造方法，由专利文献日本特开平11-302129号公报等所公开。

另外，作为加水分解性聚合物，可以使用具有由下列化学式13(通式)

[化学式13]

(式中，R¹为碳数量为1～22的烷基或苯基，优选为甲基。)所表示的构成单位(B-1)的均聚物或共聚物(以下，称为“聚合物(B)”)。此时，聚合物(B)可以具有两种以上的构成单位(B-1)。

另外，聚合物(B)可以具有由下列化学式14(通式)

[化学式14]

(式中，R²以及R³分别为独立的碳数量为1～22的烷基或苯基，优选为甲基。)

所表示的构成单位(B-2)。此时，聚合物(B)可以具有两种以上的构成单位(B-2)。

聚合物(B)中的构成单位(B-1)的含量优选为1～90重量％。该含量如果未满1重量％，则架桥密度可能变低，亲水化的效果可能不能持久；如果超过90重量％，则架桥聚合物层的均匀性变低。

再有，聚合物(B)中的构成单位(B-2)的含量优选为10～99重量％。该含量如果未满10重量％，则架桥聚合物层的均匀性变低；如果超过99重量％，则架桥密度变低，亲水化的效果可能不能持久。

聚合物(B)的数均分子量，只要具有低聚物以上的聚合度就无特别限定，但优选为2000～50万。数均分子量如果未满2000，则形成架桥聚合物层的时间可能变长；如果超过50万，则涂敷液的粘度变高，涂敷性和操作性可能变差。

作为加水分解性聚合物，可以同时使用聚合物(A)和聚合物(B)，也可以同时使用加水分解性聚合物和非加水分解性聚合物。作为非加水分解性聚合物并无特别限定，但可以列举出不具有能够通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团的聚合物(A)、聚合物(B)等。

作为向基板表面导入硅烷醇基的方法，可以列举出通过向基板涂敷含有硅酮树脂的涂敷液，形成含有具有硅烷醇基的硅酮树脂的膜的方法。

含有具有硅烷醇基的硅酮树脂的膜，优选的水接触角为3～8°。很难形成水接触角未满3°的膜，而如果形成水接触角超过8°的膜，则可能很难向基板表面高密度的导入磷酰胆碱类似基团。

作为涂敷液中所含有的硅酮树脂并无特别限定，可以列举出将由通式

(R¹O)_nSi(R²)_4-n

(式中，R¹以及R²分别为独立的碳数量为1～8的烷基，n为1～4的整数，当n为1或2时，多个R²可以相同也可以不同，当n为2或3时，多个R¹可以相同也可以不同。)

所表示的硅氧烷进行加水分解后，通过缩合所得到的树脂、也可以同时使用两种以上。此时，具有水接触角为3～8°的膜中所含有的硅烷醇基的硅酮树脂，可以与涂敷液中所含有的硅酮树脂相同，也可以不同。

作为涂敷液中所含有的硅酮树脂的市场销售商品，可以列举出frescera R(松下电工公司生产)等。

作为有机溶剂，没有特别限定，但可以列举出：脂肪族烃，芳香族烃，氯代烃，醚系溶剂，碳数量为1～4、1～4价的脂肪族醇等醇系溶剂，甲基溶纤剂，丁基溶纤剂等溶纤剂系溶剂，二噁烷，醋酸甲酯，二甲酰胺等，也可并用两种以上。

涂敷液中的硅酮树脂的浓度优选为0.001～1重量％，更优选为0.1～1重量％。如果浓度未满0.001重量％，则可能不能形成均匀的膜；如果浓度超过20重量％，则涂敷性等可能变差。

作为涂敷涂敷液的方法并无特别限定，但可以列举出浸渍涂敷法、喷雾涂敷法、旋转铸模法等。

作为构成基板的材料并无特别限定，但可以列举出聚碳酸酯、PET、聚苯乙烯、丙烯酸类树脂(acryl resin)等有机材料；金、钛、铝、铁、铜、不锈钢、氧化铝、氧化钛、氧化锌等无机材料。

在本发明中，表面改性剂的分子量优选为255～549，更优选为255～283。由此，可以向基板表面高密度地导入磷酰胆碱类似基团，以及可以抑制生物体物质的吸附。

另外，作为表面改性剂所具有的对反应性官能团持有反应性的官能团，并无特别限定。具体而言，对氨基、羟基持有反应性的官能团可以列举出有羧基、醛基等，但从反应性高的观点考虑，优选为羧基。另外，对醛基、羧基持有反应性的官能团可以列举出氨基、羟基等，但从反应性高的观点考虑，优选为氨基。再有，作为对可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团或硅烷醇基持有反应性的官能团，可以列举出可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团或硅烷醇基。

另外，表面改性剂中，可以将反应性官能团通过间隔基团结合在磷酰胆碱类似基团上。作为间隔基团并无特别限定，但可以列举出亚甲基、氧化亚乙基、具有一个以上氨基的亚烃基等。

下面，对表面改性剂进行具体说明。

(具有氨基的表面改性剂)

对具有氨基的表面改性剂并无特别限定，例如可以列举专利文献日本特开2006-7203号公报、日本特开2006-7204号公报中所公开的化合物等，其中优选为由下列化学式15(通式)

[化学式15]

(式中，R¹、R²以及R³分别为独立的碳数量为1～6的烷基(alkyl)，A为亚氨基、酯键或酰氨键，B为碳数量为1～3的亚烃基、碳数量为1～3的聚氧乙烯基或亚芳基(arylene)，m为2～6的整数，n为1或2)

所表示的化合物。

当A为亚氨基时，由化学式15表示的化合物可以通过这样的方式合成，例如，通过高碘酸使甘磷酸胆碱氧化，以合成具有醛基的磷酰胆碱衍生物，然后使其与具有氨基的化合物缩合，进行合成。另外，当A为酰胺键或酯键时，由化学式15表示的化合物可以通过这样的方式合成，例如，以通过高碘酸及三氯化钌使甘磷酸胆碱氧化的方法合成具有羧基的磷酰胆碱衍生物，然后使其与具有氨基或羟基的化合物缩合，进行合成。

当A为酰胺键或酯键时，由化学式15表示的化合物可以通过这样的方式合成，例如，通过高锰酸及盐酸使甘磷酸胆碱氧化，以合成具有羧基的磷酰胆碱衍生物，然后使其与具有氨基或羟基的化合物缩合，进行合成。

下面，具体说明由化学式15表示的化合物的制造方法。

(表面改性剂A的制造例)

首先，将由结构式(1)

[化学式16](结构式(1))

表示的L-α-甘油磷酸胆碱(市场销售产品)溶解到蒸馏水中，在冰水池中冷却后添加高碘酸钠，搅拌5小时。之后，通过进行减压浓缩及减压干燥后，用甲醇提取而得到由结构式(2)

[化学式17](结构式(2))

表示的磷酰胆碱衍生物。

然后，将由结构式(2)表示的磷酰胆碱衍生物溶解到甲醇中，添加乙二胺并在室温下搅拌。之后，在冰水池中冷却后，添加氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)，使其恢复到室温后搅拌16小时。在此需要说明的是，在反应容器中持续通入干燥氮气。之后，通过过滤除去沉淀后，进行减压浓缩及减压干燥而得到由结构式(3)

[化学式18](结构式(3))

表示的表面改性剂A。

(表面改性剂B的制造例1)

首先，在冰水池中冷却L-α-甘油磷酸胆碱的水溶液，然后添加高碘酸钠及三氯化钌，搅拌3个小时。之后，添加甲醇再次搅拌30分钟，然后通过过滤除去沉淀，进行减压浓缩及减压干燥而得到由结构式(4)

[化学式19](结构式(4))

表示的磷酰胆碱衍生物。

然后，在由结构式(4)表示的磷酰胆碱衍生物的甲醇溶液中添加乙二胺，然后添加三嗪型脱水缩合剂(triazine typedehydration-condensation agent)(DMT-MM)搅拌3个小时。之后，通过过滤除去沉淀，进行减压浓缩及减压干燥而得到由结构式(5)

[化学式20](结构式(5))

表示的表面改性剂B。

(表面改性剂B的制造例2)

首先，一边将L-α-甘油磷酸胆碱溶解到盐酸中，一边在冰水池中冷却，然后添加高锰酸钾搅拌3个小时。之后，添加甲醇再次搅拌30分钟后，通过过滤除去沉淀，进行减压浓缩及减压干燥而获得由结构式(4)表示的磷酰胆碱衍生物。

然后，在由结构式(4)表示的磷酰胆碱衍生物的甲醇溶液中添加乙二胺，然后添加三嗪型脱水缩合剂(DMT-MM)搅拌3个小时。之后，通过过滤而除去沉淀，进行减压浓缩及减压干燥而得到由结构式(5)表示的表面改性剂B。

表面具有羧基的基板与具有氨基的表面改性剂通过一般的反应进行缩合，形成酰胺键。具体而言，将基板浸渍到N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺溶液中，使基板的羧基被活性酯化后，加入表面改性剂。

表面具有醛基的基板与具有氨基的表面改性剂通过一般的反应进行缩合，形成亚氨键。具体而言，将基板和表面改性剂添加到甲醇中，在室温下放置6个小时，然后在0℃添加氰基硼氢化钠加热搅拌一晚上。在此需要说明的是，作为反应溶剂，除了甲醇以外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子性溶剂，但使用甲醇时具有导入率高的倾向。

(具有羟基的表面改性剂)

作为具有羟基的表面改性剂，无特别限定，可以列举出例如L-α-甘油磷酸胆碱等。具有羟基的表面改性剂的制造方法为，例如通过硼氢化钠等还原由结构式(2)表示的磷酰胆碱衍生物或由结构式(4)表示的磷酰胆碱衍生物。

表面具有羧基的基板与具有羟基的表面改性剂通过一般的反应进行缩合，形成酯键。具体而言，使用溴化氰使表面改性剂的羟基活性化后，浸渍基板。

表面具有醛基的基板与具有羟基的表面改性剂通过一般的反应被加成，形成乙缩醛键。具体而言，将基板和表面改性剂添加到甲醇中，在室温下放置6个小时，然后在0℃添加氰基硼氢化钠加热搅拌一晚上。在此需要说明的是，作为反应溶剂，除了甲醇以外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子性溶剂，但使用甲醇时具有导入率高的倾向。

(具有醛基的表面改性剂)

作为具有醛基的表面改性剂，无特别限定，可以列举出例如专利文献日本特开2006-11383号公报中所公开的化合物等。

表面具有羟基的基板与具有醛基的表面改性剂通过一般的反应被加成，形成乙缩醛键。具体而言，将基板和表面改性剂添加到甲醇中，在室温下放置6个小时，然后在0℃添加氰基硼氢化钠加热搅拌一晚上。在此需要说明的是，作为反应溶剂，除了甲醇以外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子性溶剂，但使用甲醇时具有导入率高的倾向。

表面具有氨基的基板与具有醛基的表面改性剂通过一般的反应进行缩合，形成亚氨键。具体而言，将基板和表面改性剂添加到甲醇中，在室温下放置6个小时，然后在0℃添加氰基硼氢化钠加热搅拌一晚上。在此需要说明的是，作为反应溶剂，除了甲醇以外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子性溶剂，但使用甲醇时具有导入率高的倾向。

(具有羧基的表面改性剂)

作为具有羧基的表面改性剂，无特别限定，可以列举出例如专利文献日本特开2006-11381号公报中所公开的化合物等。

表面具有羟基的基板与具有羧基的表面改性剂，通过一般的反应进行缩合，形成酯键。具体而言，使用溴化氰使表面改性剂的羧基活性化后，浸渍基板。

表面具有氨基的基板与具有羧基的表面改性剂，通过一般的反应使氨基与羧基缩合，形成酰胺键。具体而言，将表面改性剂浸渍到N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺溶液中，使羧基被活性酯化后，浸渍基板。

(具有可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团和/或硅烷醇基的表面改性剂)

作为可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团，可以列举出氢甲硅烷基、烷氧基甲硅烷基、卤甲硅烷基、酰氧基甲硅烷基、氨基甲硅烷基等，但从亲水化剂的稳定性、反应性等观点来看优选为碳数量为1～6的烷氧基甲硅烷基或者氢甲硅烷基。作为具有可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团和/或硅烷醇基的表面改性剂，无特定限定，可以列举出例如专利文献日本特开2006-11380号公报中所公开的化合物等。

通过向在其表面具有可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团和/或硅烷醇基的基板上，涂敷含有具有可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团和/或硅烷醇基的表面改性剂的涂敷液，根据需要，可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团被加水分解，生成硅烷醇基。之后，通过由表面改性剂所产生的硅烷醇基和基板表面具有的硅烷醇基的脱水缩合，基板表面被改性。具体而言，加水分解可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团时，向基板涂敷涂敷液后，涂敷水、酸或碱、并进行加热。另外，也可以在涂敷水、酸或碱之后，再涂敷涂敷液。还可以在涂敷液中混合水、酸或碱。这种情况下，因为通过涂敷液而发生加水分解，所以在涂敷时可以适当地调制涂敷液。在此需要说明的是，使用水、酸或碱时，可以进行加热，但通常在室温下就可以充分进行反应。另外，也可以不使用水、酸或碱，而是通过大气中的水分而缓慢地进行反应。

作为加水分解中所使用的酸或碱，只要可以进行加水分解，并无特别限定，可以将两种以上混合来使用，也可作为水溶液来使用。

作为涂敷液，可以使用将表面改性剂溶解或分散在有机溶剂中的涂敷液。作为有机溶剂，可以列举出脂肪族烃，芳香族烃，氯代烃，醚系溶剂，碳数量为1～4、1～4价的脂肪族醇等醇系溶剂，甲基溶纤剂，丁基溶纤剂等溶纤剂系溶剂，二噁烷，醋酸甲酯，二甲酰胺等。

涂敷液中的表面改性剂的浓度，优选为0.1～30重量％，更优选为0.1～10重量％。如果浓度未满0.1重量％，则通过一次涂敷可能不能充分地涂敷表面改性剂；如果浓度超过30重量％，则涂敷性等可能变差。

作为涂敷涂敷液的方法，并无特别限定，但可以列举出浸渍涂敷法、喷雾涂敷法、旋转铸模法等。

本发明的生物芯片，通过使具有对基板表面上所具有的反应性官能团持有反应性的官能团的配体反应来制造。由此，可在基板的表面上高密度地导入配体以及磷酰胆碱类似基团。其结果是，在优化对目标物质的捕捉效率的同时，可得到能够抑制目标物质以外的生物体物质的吸附的生物芯片。

在本发明中，作为对配体所具有的对反应性官能团持有反应性的官能团，并无特别限定。具体而言，作为对氨基、羟基持有反应性的官能团，可以列举出羧基、醛基等，但从反应性高的观点，优选为羧基。另外，作为对醛基、羧基持有反应性的官能团，可以列举出氨基、羟基等，但从反应性高的观点，优选为氨基。再有，作为对可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团或硅烷醇基持有反应性的官能团，可以列举出对可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团或硅烷醇基。作为对可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团，可以列举出氢甲硅烷基、烷氧基甲硅烷基、卤甲硅烷基、酰氧基甲硅烷基、氨基甲硅烷基等，但从稳定性、反应性等观点来看优选为碳数量为1～6的烷氧基甲硅烷基或者氢甲硅烷基。

另外，配体和反应性官能团最好通过间隔基团结合。作为间隔基团，并无特别限定，但可以列举出亚甲基、氧化亚乙基、具有一个以上氨基的亚烃基等。

作为配体，并无特别限定，但可以列举出IgG(ImmunoglobulinG)、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY等各种抗体；蛋白质、多醣类等抗原；谷胱甘肽-S-转移酶等酶；谷胱甘肽等基质；激素受体、细胞因子受体等受体；肽、DNA、RNA、适体(Aptamer)、蛋白质A、蛋白质G、抗生物素蛋白(avidin)、生物素；氨三乙酸等螯合物；Ni²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺等各种金属离子等。

当配体为蛋白质时，表面具有醛基的基板与蛋白质的氨基通过一般的反应进行缩合，形成亚氨键。具体而言，将基板和蛋白质添加到甲醇中，在室温下放置6个小时，然后在0℃添加氰基硼氢化钠加热搅拌一晚上。在此需要说明的是，作为反应溶剂，除了甲醇以外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子性溶剂，但使用甲醇时具有导入率高的倾向。

另外，表面具有羧基的基板与蛋白质的氨基通过一般的反应进行缩合，形成酰胺键。具体而言，将基板浸渍到N-羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺溶液中，使基板的羧基被活性酯化后，加入蛋白质。

另外，表面具有氨基的基板与蛋白质的氨基通过一般的反应进行藉由戊二醛进行缩合，形成亚氨基。具体而言，使基板(或蛋白质)与戊二醛进行反应后，与蛋白质(或基板)反应。

另外，表面具有羟基的基板与蛋白质的羧基通过一般的反应进行缩合，形成酯键。具体而言，使用溴化氰使基板的羟基活性化后，加入蛋白质。

在此需要说明的是，对配体所具有的反应性官能团持有反应性的官能团，可以与对表面改性剂所具有的反应性官能团持有反应性的官能团相同，也可以不同。

本发明的生物芯片的制造方法包含：在表面具有反应性官能团的基板上，使具有对该反应性官能团持有反应性的官能团的配体反应的工序；使该配体反应的基板与对反应性官能团持有反应性的官能团以及具有由下列化学式21(通式)

[化学式21]

(式中，R¹、R²以及R³分别为独立的碳数量为1～6的烷基，m为2～6的整数，n为1或2)表示的磷酰胆碱类似基团的表面改性剂反应的工序。由此，可在基板的表面上高密度地导入配体以及磷酰胆碱类似基。其结果是，在优化对目标物质的捕捉效率的同时，可得到能够抑制目标物质以外的生物体物质的吸附的生物芯片。

通过将这种生物芯片浸渍到含有对配体特定性结合的目标物质的液体试料中，可以选择性地捕捉目标物质。作为生物芯片并无特别限定，但可以列举出蛋白质芯片、DNA芯片等。

另外，蛋白质芯片可以适用于血糖传感器、BOD传感器、DNA传感器等生物传感器(sensor)。血糖传感器具有表面固定化有葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)的传感器芯片，并且通过使用电气化学分析或比色法分析对葡萄糖氧化后生成的过氧化氢进行定量，可以测量出血中的葡萄糖浓度。

实施例

[实施例1]

将聚苯乙烯制的96孔板(well plate)的孔(well)用2-异丙醇(propanol)进行洗净后，浸渍到由0.21ml的2-异丙醇和0.09ml的frescera R(松下电工公司生产)构成的混合液中，在室温下干燥1小时，向孔的表面导入硅烷醇基。

然后，用甲醇(methanol)将孔洗净后，涂敷将2mg的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基琥珀酸酐(3-(trimethoxysilyl)propylsuccininc anhydride)溶解到0.2ml甲醇(methanol)制成的溶液，使其在室温下干燥5小时后，用水洗净并干燥，向孔的表面导入羧基。

接着，将3mg的N-羟基琥珀酰亚胺和3mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺溶解到0.3ml的超纯水中后，向孔加入用盐酸将PH值调整到4.5的液体，并在室温下反应1小时后，孔表面导入的羧基被活性酯化。之后，加入将1mg的抗人白蛋白(anti-humanalbumin)抗体溶解到0.2ml的磷酸盐缓冲生理盐水(phosphatebuffered saline，PBS)制成的溶液，并在室温下反应1小时后，向孔的表面导入抗人白蛋白抗体。

然后，用PBS将孔洗净后，向孔加入将6mg的表面改性剂B溶解到0.2ml的超纯水中后用盐酸将PH值调整到7.5的液体，并在室温下反应1小时后，向孔的表面导入磷酰胆碱基，得到生物芯片。

[比较例1]

除了替代表面改性剂B而使用乙醇胺(ethanolamine)，向孔的表面导入羟基以外，同实施例1一样得到生物芯片。

[信号的评价]

在实施例1和比较例1的生物芯片的孔中，加入0.1ml的含有1mg/ml的人白蛋白(human albumin)的PBS溶液，在室温下反应1小时。之后，用PBS将孔洗净后，加入0.1ml的含有1μg/ml的HRP标记抗人白蛋白抗体的PBS溶液，在室温下反应1小时。之后，用PBS将孔洗净后，使用基质TMBZ进行发色实验，测量出波长为450nm的吸光度。其结果为，得出实施例1和比较例1的生物芯片的在波长为450nm的吸光度(信号)时为同一水平的结论(参见图1)。由此，推测出在向孔的表面导入的抗人白蛋白抗体中，由人白蛋白所固定化的HRP标记抗人白蛋白抗体的量为同一水平。

[噪声的评价]

在实施例1和比较例1的生物芯片的孔中，加入1ml的PBS，在室温下保存1小时。之后，用PBS将孔洗净后，加入0.1ml的含有1μg/ml的HRP标记抗人白蛋白抗体的PBS溶液，在室温下反应1小时。之后，用PBS将孔洗净后，使用基质TMBZ进行发色实验，测量出波长为450nm的吸光度。其结果为，得出实施例1的生物芯片在波长为450nm的吸光度(噪声)为比较例1的1/2水平的结论。由此，推测出实施例1的生物芯片的在孔的表面所固定化的HRP标记抗人白蛋白抗体的量为比较例1的1/2水平。因此，可以想到实施例1的生物芯片，可在孔的表面上高密度地导入磷酰胆碱基，因此可高效地抑制蛋白质的吸附。

由以上结果，得出实施例1的生物芯片相比比较例1的生物芯片具有更大的信噪比(S/N)的结论。

本国际申请以2009年3月2日申请的日本专利申请2009-47518作为主张优先权的基础，本国际申请援引该专利申请的全部内容。

Claims

1.一种表面改性基板，其特征在于，通过在表面具有反应性官能团的基板上，使具有对所述反应性官能团持有反应性的官能团以及具有由通式

[化学式1]

(式中，R¹、R²以及R³分别为独立的碳数量为1～6的烷基，m为2～6的整数，n为1或2)表示的基团的化合物反应来制造。

2.根据权利要求1所述的表面改性基板，其特征在于，所述反应性官能团为选自氨基、羟基、醛基、羧基、可通过加水分解而生成硅烷醇基的官能团以及硅烷醇基中的一种以上。

3.一种生物芯片，其特征在于，通过在权利要求1所述的表面改性基板上，使具有对反应性官能团持有反应性的官能团的配体反应来制造。

4.一种生物芯片的制造方法，其特征在于，包含：

在表面具有反应性官能团的基板上，使具有对该反应性官能团持有反应性的官能团的配体反应的工序；

使该配体反应的基板与所述对反应性官能团持有反应性的官能团以及具有由通式

[化学式2]

(式中，R¹、R²以及R³分别为独立的碳数量为1～6的烷基，m为2～6的整数，n为1或2)表示的基团的化合物反应的工序。

5.一种生物芯片，其特征在于，使用权利要求4所述的生物芯片的制造方法来制造。

6.一种生物传感器，其特征在于，具有权利要求3或5所述的生物芯片。

7.一种分析方法，其特征在于，使用权利要求6所述的生物传感器对特异性结合在所述配体上的物质进行分析。