CN101952033A - 亲和颗粒的制造方法、亲和颗粒以及分离方法 - Google Patents

亲和颗粒的制造方法、亲和颗粒以及分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明的亲和颗粒的制造方法，包含：使表面具有反应性官能团的颗粒与具有对反应性官能团持有反应性的官能团的配体反应，以在颗粒上结合配体的工序；使结合有配体的颗粒与具有由通式[化学式1](式中，R1、R2以及R3分别为独立的碳数量为1～6的烃基，m为2～6的整数，n为1或2)表示的官能团和对反应性官能团持有反应性的官能团的表面改性剂反应，在结合有配体的颗粒上结合表面改性剂的工序。

Description

亲和颗粒的制造方法、亲和颗粒以及分离方法
技术领域
本发明涉及一种亲和颗粒的制造方法、亲和颗粒以及分离方法。
背景技术
以往，使用柱层析法作为生物物质的分离精制方法。然而，该方法存在要得到目标物质需要使用多种柱子，而且精制效率低的问题。还存在需要确认分馏成分中是否含有目标物质，精制过程需要很长时间的问题。还存在精制时浪费多，需要大量试料的问题。
因此，众所周知，对生物物质进行分离精制时使用亲和颗粒。由于亲和颗粒表面担载有配体，可以选择性地捕捉与配体特异性结合的目标物质，但存在目标物质以外的物质也被吸附，导致目标物质的捕捉效率降低。
因此，提供在有机颗粒和无机颗粒的表面通过共价结合具有磷酰胆碱基(phosphorylcholine)的亲和颗粒(参照专利文献1：日本专利公开2006-7203号公报；专利文献2：日本专利公开2006-7204号公报)。
但是，专利文献1和专利文献2中公开的制造方法，会在亲和颗粒表面形成配体和磷酰胆碱基以外的部分，因此存在目标物质的捕捉效率降低、对目标物质以外的物质的吸附增加的问题。
发明内容
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种对目标物质的捕捉效率出色、同时可以抑制目标物质以外的物质被吸附的亲和颗粒的制造方法，使用该亲和颗粒的制造方法制造的亲和颗粒以及使用该亲和颗粒的分离方法。
一种亲和颗粒的制造方法，包含：使表面具有反应性官能团的颗粒与具有对反应性官能团持有反应性的官能团的配体反应，以在该颗粒上结合该配体的工序；使结合有该配体的颗粒与具有由通式(1)表示的官能团和对反应性官能团持有反应性的官能团的表面改性剂反应，在结合有配体的颗粒上结合表面改性剂的工序。
[化学式1](通式(1))
Figure BPA00001197200200021
(式中，R1、R2以及R3分别为独立的碳数量为1～6的烃基，m为2～6的整数，n为1或2)。
在亲和颗粒的制造方法中，所述反应性官能团为氨基、羟基、醛基以及羧基中的至少一种。
一种亲和颗粒，通过上述亲和颗粒的制造方法来制造。
一种分离方法，使用上述亲和颗粒分离目标物质。
根据本发明，可以提供对目标物质的捕捉效率出色、同时可以抑制目标物质以外的物质被吸附的亲和颗粒的制造方法，使用该亲和颗粒的制造方法制造的亲和颗粒以及使用该亲和颗粒的分离方法。
附图说明
图1A为表示包含在实施例1及比较例1的上清中的抗体的量的图。
图1B为表示包含在实施例1及比较例1的上清中的白蛋白(albumin)的量的图。
本发明的最佳实施方式
下面，参照附图说明本发明的最佳实施方式。
本发明的亲和颗粒的制造方法，包含：使表面具有反应性官能团的颗粒与具有对反应性官能团持有反应性的官能团的配体反应，以在颗粒上结合配体的工序；使结合有配体的颗粒与具有由通式(1)表示的官能团和对反应性官能团持有反应性的官能团的表面改性剂反应，在结合有配体的颗粒上结合表面改性剂的工序。
[化学式2](通式(1))
Figure BPA00001197200200031
(式中，R1、R2以及R3分别为独立的碳数量为1～6的烃基，m为2～6的整数，n为1或2)。
据此，可以在颗粒表面高密度地导入配体以及磷酰胆碱类似基团(analogous group)。其结果，可以得到对目标物质的捕捉效率出色，而且可以抑制目标物质以外的物质被吸附的亲和颗粒。
在本发明中，对颗粒表面所具有的反应性官能团没有进行特别限定，但最好是氨基、羟基(hydroxyl)、醛基(aldehyde)以及羧基中的至少一种。
表面具有这种反应性官能团的颗粒可以是有机颗粒和无机颗粒中的任意一种，但平均粒径最好为20nm～500μm。
对构成有机颗粒的材料没有进行特别限定，可以列举通过聚合苯乙烯、甲基丙烯酸缩水甘油基(methacrylic acid glycidyl)、(甲基)丙烯酸、N-烷基丙烯酰胺、(甲基)丙烯酸烷基、(甲基)丙烯酸氨烷基、(甲基)丙烯酸羟烷基等的单体而得到的单聚物或共聚物等。其中，优选为丙烯酸-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺共聚物、甲基丙烯酸2-羟乙基-苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、2-氨乙基甲基丙烯酸酯-N-异丙基丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺共聚物等。这些有机颗粒可以通过乳液聚合、悬浮聚合等进行合成。并且，构成这些有机颗粒以外的有机颗粒的材料，可以列举琼脂糖(agarose)、琼脂糖凝胶(sepharose)等。
对构成无机颗粒的材料没有进行特别限定，可以列举滑石(talc)、高岭土、云母、绢云母(sericite)、白云母、金云母、合成云母、红云母、黑云母、蛭石(vermiculite)、碳酸镁、硅酸铝、硅酸钡、硅酸钙、硅酸镁、硅酸锶、钨酸的金属盐、镁、硅、沸石、硫酸钡、烧成硫酸钙(烧石膏)、磷酸钙、氟磷灰石、羟基磷灰石、陶瓷粉、金属肥皂(例如，肉豆蔻酸锌、棕榈酸钙、硬脂酸铝)、氮化硼、氧化铈、胶态金(gold colloid)等。其中，优选为硅、氧化钛、氧化锌、氧化铝、氧化铁、滑石、云母(mica)、绢云母、胶态金等。
在此，表面具有反应性官能团的颗粒可以是对颗粒进行表面改性而导入反应性官能团的颗粒。
在颗粒表面导入氨基的方法有，等离子体处理、反应表面改性剂的方法、硅氧烷(silicone)气相处理(gas-phase treatment)。
在等离子体处理中，在氮气气氛下通过低温等离子体向颗粒表面导入氨基(例如，参见Surface and Coatings Technology 116-119(1999)802-807，Colloids and Surfaces A：Physicochem.Eng.Aspects195(2001)81-95，Macromol.Chem.Phys.200.989-996(1999))。具体来讲，将颗粒收容到反应容器中，用真空泵将反应容器抽真空之后导入氮气，进行辉光放电。此时，也可以通过对进行了等离子体处理的材料进行机械性颗粒化，制作出表面具有氨基的颗粒。
在反应表面改性剂的方法中，使用具有氨基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氮烷等表面改性剂，在具有硅醇(silanol)基、烷氧基甲硅烷(alkoxysilyl)基等的颗粒表面导入氨基。具体来讲，首先将颗粒泡在水和2-丙醇混合液中，添加3-氨丙基三甲氧基硅烷之后，加热到100℃使其反应6个小时。然后，冷却到室温，用甲醇洗净并进行干燥。作为颗粒，可以列举甲基丙烯酸3-三甲氧基硅丙基-甲基丙烯酸甲酯-二乙烯基苯共聚物等有机颗粒；硅、玻璃、氧化铝、滑石、黏土、云母、石棉、氧化钛、氧化锌、氧化铁等无机颗粒等。
在硅氧烷气相处理中，使用1，3，5，7-四甲基环四硅氧烷在颗粒表面导入氢硅烷(hydrosilyl)基团，然后反应具有氨基的单体，从而在颗粒表面导入氨基(例如，参照日本特许公报平1-54379号、特许公报1-54380号、特许公报1-54381号)。具体来讲，首先将颗粒和1，3，5，7-四甲基环四硅氧烷放入干燥器中，用抽气机(aspirator)除气。然后，在80℃使其反应16个小时，取出颗粒，在120℃进行干燥。进一步，将所得到的颗粒分散到酒精中，添加烯丙基胺后，添加氯铂酸的酒精溶液，在60℃搅拌两个小时。反应结束后，进行过滤、清洗酒精及减压干燥。作为颗粒，可以列举苯乙烯-二乙烯基苯共聚物等有机颗粒；云母、滑石、高岭土、氧化铝、氧化钛、氧化锌、氧化铁等的无机颗粒等。具有氨基的单体并不限定于烯丙基胺，可以是具有氨基的乙烯基单体(vinyl monomer)、丙烯基单体等。并且，氨基可以被丁氧羟基(butoxycarbonyl)、苄氧羰基(benzyloxycarbonyl)等保护起来。再者，还可以使用环氧基等的、具有通过与二氨反应可以导入氨基的官能团的单体来替代具有氨基的单体。
在颗粒表面导入醛基的方法有，在表面具有氨基的颗粒上反应戊二醛的方法。
在颗粒表面导入羧基的方法有，反应表面改性剂的方法、硅氧烷气相处理等。
在反应表面改性剂的方法中，使用具有羧基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氮烷等表面改性剂，在具有硅醇(silanol)基、烷氧基甲硅烷(alkoxysilyl)基等的颗粒表面导入羧基。具体来讲，首先将三乙氧基硅丙基琥珀酸酐溶解到N，N-二甲基甲酰胺中，添加蒸馏水和4-二甲氨基吡啶，在室温搅拌16个小时，合成具有羧基的硅烷偶联剂。然后，将颗粒泡在水和2-丙醇混合液中，添加具有羧基的硅烷偶联剂后加热到100℃，使其反应6个小时。然后，冷却到室温用甲醇洗净，进行干燥。作为颗粒，可以列举甲基丙烯酸3-三甲氧基硅丙基-甲基丙烯酸甲酯-二乙烯基苯共聚物等有机颗粒；硅、玻璃、氧化铝、滑石、黏土、云母、石棉、氧化钛、氧化锌、氧化铁等的无机颗粒等。
在硅氧烷气相处理中，使用1，3，5，7-四甲基环四硅氧烷在颗粒表面导入氢硅烷(hydrosilyl)基团，然后反应具有羧基的单体，从而在颗粒表面导入羧基(例如，参照日本特许公报平1-54379号、特许公报1-54380号、特许公报1-54381号)。具体来讲，首先将颗粒和1，3，5，7-四甲基环四硅氧烷放入干燥器中，用抽气机(aspirator)除气。然后，在80℃使其反应16个小时，取出颗粒，在120℃进行干燥。进一步，将所得到的颗粒分散到酒精中，添加丙烯羧酸(allyl carboxylic acid)后，添加氯铂酸的酒精溶液，在60℃搅拌两个小时。反应结束后，进行过滤、清洗酒精及减压干燥。作为颗粒，可以列举苯乙烯-二乙烯基苯共聚物等有机颗粒；云母、滑石、高岭土、氧化铝、氧化钛、氧化锌、氧化铁等的无机颗粒等。具有羧基的单体并不限定于丙烯羧酸，可以是具有羧基的乙烯基单体、丙烯基单体等。
在本发明中，没有特别限定配体所具有的对反应性官能团持有反应性的官能团。具体来讲，作为对氨基、羟基具有反应性的官能团，可以列出羧基、醛基等，但从反应性高的观点而言，最好为羧基。并且，作为对醛基、羧基具有反应性的官能团，可以列出氨基、羟基等，但从反应性高的观点，最好为氨基。
并且，在配体中，对反应性官能团具有反应性的官能团最好通过间隔基结合。对间隔基并不进行特别限定，可以列举亚甲基、氧乙烯基、具有一个以上氨基的亚烃基(alkylene)等。
对配体没有进行特别限定，可以列举IgG(Immunoglobulin G)、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY等各种抗体；蛋白质、多糖类等抗原；谷胱甘肽-S-转移酶等酶；谷胱甘肽等基质；激素受体、细胞因子受体等受体；肽、DNA、RNA、适体(Aptamer)、蛋白质A、蛋白质G、抗生物素蛋白(avidin)、生物素；氨三乙酸等螯合物；Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+等各种金属离子等。
当配体为蛋白质时，表面具有醛基的颗粒与蛋白质的氨基通过一般的反应进行缩合，形成亚氨键。具体来讲，将颗粒和表面改性剂放入到甲醇中，在室温下放置6个小时，然后在0℃添加氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)加热搅拌一晚上。在此，除甲醇之外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子性溶剂作为反应溶剂，但使用甲醇时具有导入率高的倾向。
并且，表面具有羧基的颗粒与蛋白质的氨基通过一般的反应进行缩合，形成酰胺键。具体来讲，将颗粒浸渍到羟基琥珀硫亚氨、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺溶液中，使颗粒的羧基被活性酯化之后，加入蛋白质。
并且，表面具有氨基的颗粒与蛋白质的氨基，由一般的反应藉由戊二醛进行缩合，形成亚氨基。具体来讲，使颗粒(或蛋白质)与戊二醛进行反应后，与蛋白质(或颗粒)反应。
并且，表面具有羟基的颗粒与蛋白质的羧基通过一般的反应进行缩合，形成酯键。具体来讲，使用溴化氰使颗粒的羟基活性化后，加入蛋白质。
在本发明中，与结合有配体的颗粒反应的表面改性剂，分子量优选为255～549，更优选为255～283。据此，可以在颗粒表面更加高密度地导入磷酰胆碱类似基团。
并且，表面改性剂所具有的对反应性官能团持有反应性的官能团，在此没有对其进行限定。具体来讲，对氨基、羟基具有反应性的官能团有羧基、醛基等，但从反应性高的观点考虑，最好为羧基。并且，对醛基、羧基具有反应性的官能团有氨基、羟基等，但从反应性高的观点考虑，最好为氨基。
并且，在表面改性剂中，对反应性官能团具有反应性的官能团最好通过间隔基结合在磷酰胆碱类似基团上。对间隔基并不进行特别限定，可以列举亚甲基、氧乙烯基、具有一个以上氨基的亚烃基(alkylene)等。
在此，表面改性剂所具有的对反应性官能团具有反应性的官能团可以与配体所具有的反应性官能团相同，也可以不同。
下面，对表面改性剂进行具体说明。
(具有氨基的表面改性剂)
对具有氨基的表面改性剂并没有进行特别限定，例如，可以列举日本特开2006-7203号公报、日本特开2006-7204号公报中所公开的化合物等，其中，最好为由通式(2)表示的化合物。
[化学式3](通式(2))
Figure BPA00001197200200081
(其中，R1、R2以及R3分别为独立的碳数量为1～6的烃基，A为亚氨基、酯键或酰胺键，B为碳数量为1～3的亚烃基、碳数量为1～3的聚氧乙烯基或亚芳基(arylene)，m为2～6的整数，n为1或2)。
当A为亚氨基时，由通式(2)表示的化合物可以通过这样的方式合成。例如，通过高碘酸使甘磷酸胆碱氧化，以合成具有醛基的磷酰胆碱衍生物，然后使其与具有氨基的化合物缩合，进行合成。并且，当A为酰胺键或酯键时，由通式(2)表示的化合物可以通过这样的方式合成。例如，以通过高碘酸及三氯化钌使甘磷酸胆碱氧化的方法合成具有羧基的磷酰胆碱衍生物，然后使其与具有氨基或羟基的化合物缩合，进行合成。
当A为酰胺键或酯键时，由通式(2)表示的化合物可以通过这样的方式合成。例如，通过高锰酸及盐酸使甘磷酸胆碱氧化，以合成具有羧基的磷酰胆碱衍生物，然后使其与具有氨基或羟基的化合物缩合，进行合成。
下面，具体说明由通式(2)表示的化合物的制造方法。
(表面改性剂A的制造例子)
首先，将由结构式(1)表示的L-α-甘油磷酸胆碱(现成品)溶解到蒸馏水中，在冰水池中冷却后添加高碘酸钠，搅拌5个小时。并且，进行减压浓缩及减压干燥后，用甲醇提取得到由结构式(2)表示的磷酰胆碱衍生物。
[化学式4](结构式(1))
Figure BPA00001197200200091
[化学式5](结构式(2))
Figure BPA00001197200200101
其次，将由结构式(2)表示的磷酰胆碱衍生物溶解到甲醇中，添加乙二胺并在室温下搅拌。并且，在冰水池中冷却后，添加氰基硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)，使其恢复到室温后搅拌16个小时。在此，在反应容器中通入干燥氮气。然后，通过过滤除去沉淀后，进行减压浓缩及减压干燥而得到由结构式(3)中表示的表面改性剂A。
[化学式6](结构式(3))
Figure BPA00001197200200102
(表面改性剂B的制造例1)
首先，在冰水池中冷却L-α-甘油磷酸胆碱的水溶液，然后添加高碘酸钠及三氯化钌，搅拌3个小时。其次，添加甲醇再次搅拌30分钟，然后通过过滤除去沉淀，进行减压浓缩及减压干燥而得到由结构式(4)中表示的磷酰胆碱衍生物。
[化学式7](结构式(4))
其次，在结构式(4)中表示的磷酰胆碱衍生物的甲醇溶液中添加乙二胺，然后添加三嗪型脱水缩合剂(triazine type dehydration-condensation agent)(DMT-MM)搅拌3个小时。然后，通过过滤除去沉淀，且进行减压浓缩及减压干燥而得到结构式(5)中表示的表面改性剂B。
[化学式8](结构式(5))
Figure BPA00001197200200112
(表面改性剂B的制造例2)
首先，一边将L-α-甘油磷酸胆碱溶解到盐酸中，一边在冰水池中冷却，然后添加高锰酸钾搅拌3个小时。其次，添加甲醇再次搅拌30分钟后，通过过滤除去沉淀，进行减压浓缩及减压干燥而获得结构式(4)中表示的磷酰胆碱衍生物。
其次，在结构式(4)中表示的磷酰胆碱衍生物的甲醇溶液中添加乙二胺，然后添加三嗪型脱水缩合剂(DMT-MM)搅拌3个小时。然后，通过过滤而除去沉淀，且进行减压浓缩及减压干燥而得到结构式(5)中表示的表面改性剂B。
表面具有羧基的颗粒与具有氨基的表面改性剂通过一般的反应进行缩合，形成酰胺键。具体来讲，将颗粒浸渍到羟基琥珀硫亚氨、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺溶液中，使颗粒的羧基被活性酯化之后，加入表面改性剂。
表面具有醛基的颗粒与具有氨基的表面改性剂通过一般的反应进行缩合，形成亚氨键。具体来讲，将颗粒和表面改性剂添加到甲醇中，在室温下放置6个小时，然后在0℃添加氰基硼氢化钠加热搅拌一晚上。在此，除甲醇之外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子性溶剂作为反应溶剂，但使用甲醇时具有导入率高的倾向。
(具有羟基的表面改性剂)
对具有羟基的表面改性剂没有进行特别限定，可以举例L-α-甘油磷酸胆碱等。具有羟基的表面改性剂的制造方法为，例如通过硼氢化钠等还原结构式(2)中表示的磷酰胆碱衍生物或结构式(4)中表示的磷酰胆碱衍生物。
表面具有羧基的颗粒与具有羟基的表面改性剂通过一般的反应进行缩合，形成酯键。具体来讲，使用溴化氰使表面改性剂的羟基活性化后，浸渍颗粒。
表面具有醛基的颗粒与具有羟基的表面改性剂通过一般的反应被加成，形成乙缩醛键。具体来讲，将颗粒和表面改性剂添加到甲醇中，在室温下放置6个小时，然后在0℃添加氰基硼氢化钠加热搅拌一晚上。在此，除甲醇之外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子性溶剂作为反应溶剂，但使用甲醇时具有导入率高的倾向。
(具有醛基的表面改性剂)
对具有醛基的表面改性剂没有进行特别限定。例如，可以举例日本特开2006-11383号公报中公开的化合物等。
表面具有羟基的颗粒与具有醛基的表面改性剂通过一般的反应被加成，形成乙缩醛键。具体来讲，将颗粒和表面改性剂添加到甲醇中，在室温下放置6个小时，然后在0℃添加氰基硼氢化钠加热搅拌一晚上。在此，除甲醇之外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子性溶剂作为反应溶剂，但使用甲醇时具有导入率高的倾向。
表面具有氨基的颗粒与具有醛基的表面改性剂通过一般的反应进行缩合，形成亚氨键。具体来讲，将颗粒和表面改性剂添加到甲醇中，在室温下放置6个小时，然后在0℃添加氰基硼氢化钠加热搅拌一晚上。在此，除甲醇之外，还可以使用水、乙醇、2-丙醇等质子性溶剂作为反应溶剂，但使用甲醇时具有导入率高的倾向。
(具有羧基的表面改性剂)
对具有羧基的表面改性剂没有进行特别限定，例如可以举例日本特开2006-11381号公报中公开的化合物等。
表面具有羟基的颗粒与具有羧基的表面改性剂通过一般的反应进行缩合，形成酯键。具体来讲，使用溴化氰使表面改性剂的羟基活性化后，浸渍颗粒。
表面具有氨基的颗粒与具有羧基的表面改性剂，通过一般的反应使氨基与羧基缩合，形成酰胺键。具体来讲，将表面改性剂浸渍到羟基琥珀硫亚氨、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺溶液中，使羧基被活性酯化之后，浸渍颗粒。
本发明的亲和颗粒可以通过上述方法制造，通过将亲和颗粒分散到含有对配体特异性结合的目标物质的液体试料中，可以选择性地捕捉目标物质。具体来讲，首先将亲和颗粒分散到含有目标物质的液体试料中，在4℃缓慢地摇动30分钟后，以15000转数/分钟(rpm)进行30分钟的离心分离，扔掉上清液。其次，加入1毫升(ml)的PBS(磷酸盐缓冲溶液)溶液缓慢摇动，然后以15000转数/分钟(rpm)进行30分钟的离心分离，扔掉上清液。反复进行三次该清洗操作。进一步，回收由亲和颗粒捕捉的目标物质。具体来讲，首先加入1毫升的洗脱缓冲液，在4℃缓慢地摇动30分钟，从亲和颗粒洗脱(elution)目标物质，回收上清液。其次，加入1毫升的洗脱缓冲液，缓慢摇动后，以15000转数/分钟(rpm)进行30分钟的离心分离，回收上清液。该操作反复进行两次。据此，可以分离目标物质。
在此，本发明的亲和颗粒还可以作为亲和层析柱的填充剂来使用，以分离目标物质。
实施例
[实施例1]
在烧瓶中倒入3-氨丙基三甲氧基硅烷1.5毫摩尔(mmol)、甲醇380毫升、超纯水20毫升、平均粒径为50μm的硅胶60克，在70℃使其回流(reflux)一晚上，然后使用甲醇和水进行过滤清洗，得到表面具有氨基的硅颗粒。然后，在所得到的硅颗粒50克中加入4重量百分比的戊二醛的水溶液500毫升、氰基硼氢化钠5克，使其在室温反应5个小时，然后使用PBS(磷酸盐缓冲溶液，Phosphate buffered saline)溶液进行过滤清洗，得到表面具有醛基的硅颗粒。进一步，加入10mg/ml的蛋白质A(配体)的水溶液80毫升、氰基硼氢化钠0.8克，使其在室温下反应一天，然后使用PBS进行过滤清洗，得到表面具有配体及醛基的硅颗粒。然后，加入具有0.5M的氨基的表面改性剂(表面改性剂B)的水溶液(pH7.0)600毫升、氰基硼氢化钠6克，使其在室温下反应2个小时，然后使用PBS进行过滤清洗，得到表面具有配体及磷酰胆碱基的硅颗粒(亲和颗粒)。
[比较例1]
在烧瓶中倒入3-氨丙基三甲氧基硅烷1.5毫摩尔、0.15M的由[化学式9]表示的表面改性剂的甲醇溶液1.5毫升、甲醇47.5毫升、蒸馏水2.5毫升、平均粒径为50微米(μm)的硅胶60克，在70℃下使其回流一晚上，然后使用甲醇和水进行过滤清洗，得到表面具有磷酰胆碱基和氨基的硅颗粒。
[化学式9]
Figure BPA00001197200200151
然后，在所得到的硅颗粒50克中加入4重量百分比的戊二醛的水溶液500毫升、氰基硼氢化钠5克，使其在室温反应5个小时，然后使用PBS进行过滤清洗，得到表面具有磷酰胆碱基和醛基的硅颗粒。进一步，加入10mg/ml的蛋白质A(配体)的水溶液80毫升、氰基硼氢化钠0.8克，使其在室温下反应一天，然后使用PBS进行过滤清洗，得到表面具有磷酰胆碱基、配体及未反应的醛基的硅颗粒。然后，加入具有0.5M的乙醇胺的水溶液(pH7.0)600毫升、氰基硼氢化钠6克，使其在室温下反应2个小时，然后使用PBS进行过滤清洗，得到表面具有磷酰胆碱基、配体及羟基的硅颗粒(亲和颗粒)。
[评价方法及评价结果]
在离心管(Eppentube)中加入亲和颗粒25毫升和5倍稀释的人血清2毫升，使其在室温下反应1个小时。其次，进行离心分离(5000克)而清除上清液，然后使用PBS进行五次离心分离(5000g)。进一步，加入0.2M的Gly-HCI缓冲液(PH2.5)500微升(μL)，在室温下使其反应1个小时而洗提抗体，进行离心分离(5000g)，得到了上清液。使用ELISA法定量所得到的上清液中所包含的抗体(目标物质)和白朊(杂质)的量。
图1A和图1B中示出评价结果。通过图1A和图1B可知，实施例1的亲和颗粒不仅对抗体的捕捉效率出色，还能抑制白朊被吸附。由此可以判断，配体及磷酰胆碱基被高密度地导入到硅颗粒的表面。另外，比较例1的亲和颗粒，由于在导入磷酰胆碱基之后导入蛋白质A，因此蛋白质A的导入量下降，结果使抗体的捕捉效率降低，白朊的吸附增加。
本国际申请以2008年3月19日申请的日本专利申请第2008-70750号作为主张优先权的基础，本国际申请引用该申请的全部内容。

Claims (4)

1.一种亲和颗粒的制造方法，其特征在于，包含：
使表面具有反应性官能团的颗粒与具有对反应性官能团持有反应性的官能团的配体反应，以在所述颗粒上结合所述配体的工序；
使结合有所述配体的颗粒与具有由通式
[化学式1]
Figure FPA00001197200100011
(式中，R1、R2以及R3分别为独立的碳数量为1～6的烃基，m为2～6的整数，n为1或2)
表示的官能团和对反应性官能团持有反应性的官能团的表面改性剂反应，在结合有所述配体的颗粒上结合所述表面改性剂的工序。
2.根据权利要求1所述的亲和颗粒的制造方法，其特征在于，所述反应性官能团为氨基、羟基、醛基以及羧基中的至少一种。
3.一种亲和颗粒，其特征在于，通过权利要求1所述的亲和颗粒的制造方法来制造。
4.一种分离方法，其特征在于，使用权利要求3中记载的亲和颗粒分离目标物质。
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