WO2009116309A1 - アフィニティー粒子の製造方法、アフィニティー粒子及び分離方法 - Google Patents

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WO2009116309A1
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克行 前野
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株式会社資生堂
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing affinity particles, affinity particles, and a separation method.
  • affinity particles are used when separating and purifying biological materials.
  • Affinity particles have a ligand supported on the surface, so they can selectively capture the target substance that specifically binds to the ligand, but substances other than the target substance are adsorbed and the target substance capture efficiency is improved. There was a problem of lowering.
  • affinity particles having a phosphorylphorin group covalently bonded to the surface of organic particles or inorganic particles are known (see Patent Documents 1 and 2).
  • JP 2006-7203 A Japanese Patent Laid-Open No. 2006-7204
  • the present invention provides an affinity particle production method capable of suppressing the adsorption of a substance other than the target substance while being excellent in capture efficiency of the target substance, and a method for producing the affinity particle. It is an object of the present invention to provide affinity particles produced by using the method and a separation method using the affinity particles.
  • a particle having a reactive functional group on a surface thereof is reacted with a ligand having a functional group reactive to the reactive functional group, A step of binding the ligand to particles, a particle to which the ligand is bound, and a general formula
  • R 1 , R 2 and R 3 are each independently an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, m is an integer of 2 to 6 and n is 1 or 2) is there.) Reacting a surface modifying agent having a functional group represented by formula (1) and a functional group having reactivity with the reactive functional group to bind the surface modifying agent to the particles to which the ligand is bound. It is characterized by having.
  • the invention according to claim 2 is the method for producing affinity particles according to claim 1, wherein the reactive functional group is at least one of an amino group, a hydroxyl group, an aldehyde group, and a carboxyl group. To do.
  • the invention described in claim 3 is characterized in that the affinity particles are manufactured using the method for manufacturing affinity particles described in claim 1.
  • the invention described in claim 4 is characterized in that, in the separation method, the target substance is separated using the affinity particles according to claim 3.
  • ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, it is excellent in the capture
  • the method for producing affinity particles of the present invention comprises a step of reacting a particle having a reactive functional group on the surface with a ligand having a functional group reactive to the reactive functional group, and binding the ligand to the particle.
  • R 1 , R 2 and R 3 are each independently an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, m is an integer of 2 to 6 and n is 1 or 2).
  • a step of reacting the surface modifier with a functional group having reactivity with the functional group represented by (1) and a reactive functional group to bind the surface modifier to the particles to which the ligand is bound a step of reacting the surface modifier with a functional group having reactivity with the functional group represented by (1) and a reactive functional group to bind the surface modifier to the particles to which the ligand is bound.
  • the ligand and the phosphorylcholine-like group can be introduced to the surface of the particle at a high density.
  • affinity particles that are excellent in capture efficiency of the target substance and that can suppress adsorption of substances other than the target substance.
  • the reactive functional group that the particle has on the surface is not particularly limited, but at least one of an amino group, a hydroxyl group, an aldehyde group, and a carboxyl group is preferable.
  • the particles having such a reactive functional group on the surface may be either organic particles or inorganic particles, but the average particle size is preferably 20 nm to 500 ⁇ m.
  • the material constituting the organic particles is not particularly limited, but styrene, glycidyl methacrylate, (meth) acrylic acid, N-alkylacrylamide, alkyl (meth) acrylate, aminoalkyl (meth) acrylate, (meth) acrylic Examples include homopolymers or copolymers obtained by polymerizing monomers such as hydroxyalkyl acid. Among them, acrylic acid-N-isopropylacrylamide-methylenebisacrylamide copolymer, 2-hydroxyethyl methacrylate-styrene-divinylbenzene copolymer, 2-aminoethyl methacrylate-N-isopropylacrylamide-methylenebisacrylamide copolymer, etc. Is preferred.
  • Such organic particles can be synthesized by emulsion polymerization, suspension polymerization or the like. Moreover, agarose, sepharose, etc. are mentioned as a material which comprises organic particles other than these.
  • the material constituting the inorganic particles is not particularly limited, but talc, kaolin, mica, sericite (sericite), muscovite, phlogopite, synthetic mica, safmica, biotite, permiculite, magnesium carbonate, calcium carbonate, Aluminum silicate, barium silicate, calcium silicate, magnesium silicate, strontium silicate, metal salt of tungstic acid, magnesium, silica, zeolite, barium sulfate, calcined calcium sulfate (calcined gypsum), calcium phosphate, fluorine apatite, hydroxyapatite , Ceramic powder, metal soap (for example, zinc myristate, calcium palmitate, aluminum stearate), boron nitride, cerium oxide, gold colloid, and the like.
  • silica, titanium oxide, zinc white, alumina, iron oxide, talc, mica, sericite, colloidal gold, and the like are preferable
  • the particles having a reactive functional group on the surface may be those having a reactive functional group introduced by surface modification of the particle.
  • Examples of methods for introducing amino groups on the surface of particles include plasma treatment, a method of reacting with a surface modifier, and a silicone gas phase treatment.
  • amino groups are introduced into the surface of particles by low-temperature plasma under a nitrogen gas atmosphere (for example, Surface and Coatings Technology 116-119 (1999) 802-807, Colloids and Surfaces A: Physicochem. Eng. Aspects 195 ( 2001) 81-95, Macromol. Chem. Phys. 200.989-996 (1999)).
  • the particles are accommodated in a reaction vessel, the inside of the reaction vessel is evacuated with a vacuum pump, nitrogen gas is introduced, and glow discharge is performed.
  • particles having an amino group on the surface may be produced by mechanically granulating the plasma-treated material.
  • an amino group is introduced onto the surface of a particle having a silanol group, an alkoxysilyl group, or the like using a surface modifier such as an alkoxysilane having an amino group, chlorosilane, or silazane.
  • a surface modifier such as an alkoxysilane having an amino group, chlorosilane, or silazane.
  • the particles are immersed in a water / 2-propanol mixed solution, and 3-aminopropyltrimethoxysilane is added, followed by heating to 100 ° C. and reaction for 6 hours. Next, after cooling to room temperature, it is washed with methanol and dried.
  • organic particles such as 3-trimethoxysilylpropyl methacrylate-methyl methacrylate-divinylbenzene copolymer; silica, glass, alumina, talc, clay, mica, asbestos, titanium oxide, zinc white, iron oxide, etc. Inorganic particles and the like.
  • 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane is used to introduce a hydrosilyl group on the surface of the particle, and then react with a monomer having an amino group to react with the amino acid on the surface of the particle.
  • a group is introduced (for example, see Japanese Patent Publication No. 1-54379, Japanese Patent Publication No. 1-54380, Japanese Patent Publication No. 1-54381).
  • particles and 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane are placed in a desiccator and deaerated with an aspirator. Next, after reacting at 80 ° C. for 16 hours, the particles are taken out and dried at 120 ° C.
  • the obtained particles are dispersed in ethanol, allylamine is added, an ethanol solution of chloroplatinic acid is added, and the mixture is stirred at 60 ° C. for 2 hours. After the reaction is completed, filtration, ethanol washing and vacuum drying are performed.
  • the particles include organic particles such as styrene-divinylbenzene copolymer; inorganic particles such as mica, talc, kaolin, alumina, titanium oxide, zinc oxide, and iron oxide.
  • the monomer having an amino group is not limited to allylamine, and may be a vinyl monomer having an amino group, an acrylic monomer, or the like.
  • the amino group may be protected with a butoxycarbonyl group, a benzyloxycarbonyl group, or the like.
  • a monomer having a functional group capable of introducing an amino group for example, by reaction with a diamine, such as an epoxy group, may be used.
  • Examples of a method for introducing a carboxyl group onto the particle surface include a method of reacting a surface modifier, a silicone gas phase treatment, and the like.
  • an amino group is introduced onto the surface of the particle having a silanol group, an alkoxysilyl group, or the like using a surface modifier such as an alkoxysilane having a carboxyl group, chlorosilane, or silazane.
  • a surface modifier such as an alkoxysilane having a carboxyl group, chlorosilane, or silazane.
  • triethoxysilylpropyl succinic anhydride is dissolved in N, N-dimethylformamide, distilled water and 4-dimethylaminopyridine are added, and the mixture is stirred at room temperature for 16 hours to give a silane having a carboxyxyl group.
  • a coupling agent is synthesized.
  • the particles are immersed in a water / 2-propanol mixed solution, a silane coupling agent having a carboxyl group is added, and then heated to 100 ° C. and reacted for 6 hours. Further, after cooling to room temperature, it is washed with methanol and dried.
  • organic particles such as 3-trimethoxysilylpropyl methacrylate-methyl methacrylate-divinylbenzene copolymer; silica, glass, alumina, talc, clay, mica, asbestos, titanium oxide, zinc white, iron oxide, etc. Inorganic particles and the like.
  • 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane is used to introduce a hydrosilyl group on the surface of the particle, and then react with a monomer having a carboxyl group to react with the carboxyl on the surface of the particle.
  • a group is introduced (for example, see Japanese Patent Publication No. 1-54379, Japanese Patent Publication No. 1-54380, Japanese Patent Publication No. 1-54381). Specifically, first, particles and 1,3,5,7-tetramethylcyclotetrasiloxane are placed in a desiccator and deaerated with an aspirator. Next, after reacting at 80 ° C. for 16 hours, the particles are taken out and dried at 120 ° C.
  • an ethanol solution of chloroplatinic acid is added and stirred at 60 ° C. for 2 hours. After the reaction is completed, filtration, ethanol washing and vacuum drying are performed.
  • the particles include organic particles such as styrene-divinylbenzene copolymer; inorganic particles such as mica, talc, kaolin, alumina, titanium oxide, zinc oxide, and iron oxide.
  • the monomer having a carboxyl group is not limited to allyl carboxylic acid, and may be any vinyl monomer or acrylic monomer having a carboxyl group.
  • the functional group having reactivity with the reactive functional group of the ligand is not particularly limited.
  • examples of the functional group having reactivity with an amino group and a hydroxyl group include a carboxyl group and an aldehyde group, and a carboxyl group is preferable because of high reactivity.
  • Examples of functional groups having reactivity with aldehyde groups and carboxyl groups include amino groups and hydroxyl groups, but amino groups are preferred because of their high reactivity.
  • the ligand has a functional group having reactivity with the reactive functional group bonded through a spacer.
  • the spacer is not particularly limited, and examples thereof include an alkylene group having at least one methylene group, oxyethylene group, and amino group.
  • the ligand is not particularly limited, but various antibodies such as IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, IgY; antigens such as proteins and polysaccharides; enzymes such as glutathione-S-transferase; substrates such as glutathione; hormone receptors, Receptors such as cytokine receptors; peptides, DNA, RNA, aptamers, protein A, protein G, avidin, biotin; chelating compounds such as nitrilotriacetic acid; various metals such as Ni 2+ , Co 2+ , Cu 2+ , Zn 2+ , Fe 3+ And ions.
  • various antibodies such as IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, IgY; antigens such as proteins and polysaccharides; enzymes such as glutathione-S-transferase; substrates such as glutathione; hormone receptors, Receptors such as cytokin
  • the ligand is a protein
  • particles having an aldehyde group on the surface and the amino group of the protein are condensed by a general reaction to form an imino bond.
  • sodium cyanotrihydroborate is added at 0 ° C. and stirred overnight with heating.
  • a protic solvent such as water, ethanol, 2-propanol or the like can be used as the reaction solvent, but the introduction rate tends to be high when methanol is used.
  • particles having a carboxyl group on the surface and the amino group of the protein are condensed by a general reaction to form an amide bond. Specifically, the particles are immersed in a solution of N-hydroxysuccinimide and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide to convert the carboxyl groups of the particles into active esters, and then a protein is added.
  • particles having amino groups on the surface and amino groups of proteins are condensed via glutaraldehyde by a general reaction to form imino bonds. Specifically, after reacting particles (or proteins) with glutaraldehyde, the particles (or proteins) are reacted with proteins (or particles).
  • particles having a hydroxyl group on the surface and a carboxyl group of the protein are condensed by a general reaction to form an ester bond.
  • the protein is added after activating the hydroxyl group of the particles using cyanogen bromide.
  • the surface modifier to be reacted with the ligand-bound particles preferably has a molecular weight of 255 to 549, more preferably 255 to 283.
  • phosphorylcholine-like groups can be introduced to the surface of the particles at a higher density.
  • the functional group having reactivity with the reactive functional group of the surface modifier is not particularly limited.
  • examples of the functional group having reactivity with an amino group and a hydroxyl group include a carboxyl group and an aldehyde group, and a carboxyl group is preferable because of high reactivity.
  • Examples of functional groups having reactivity with aldehyde groups and carboxyl groups include amino groups and hydroxyl groups, but amino groups are preferred because of their high reactivity.
  • a functional group having reactivity with the reactive functional group is bonded to a phosphorylcholine-like group via a spacer.
  • the spacer is not particularly limited, and examples thereof include an alkylene group having at least one methylene group, oxyethylene group, and amino group.
  • the functional group having reactivity with the reactive functional group of the surface modifier may be the same as or different from the reactive functional group of the ligand.
  • the surface modifier having an amino group is not particularly limited, and examples thereof include compounds disclosed in JP-A-2006-7203 and JP-A-2006-7204. 2)
  • R 1 , R 2 and R 3 each independently represents an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, A represents an imino group, an ester bond or an amide bond, and B represents a carbon number.
  • the compound represented by these is preferable.
  • the compound represented by the general formula (2) includes, for example, a compound having an amino group after synthesizing a phosphorylcholine derivative having an aldehyde group by oxidizing glycerophosphorylcholine with periodic acid. It can be synthesized by condensation. Further, when A is an amide bond or an ester bond, the compound represented by the general formula (2) synthesizes a phosphorylcholine derivative having a carboxyl group by, for example, a method of oxidizing glycerophosphorylcholine with periodic acid and ruthenium trichloride. Then, it can be synthesized by condensing with a compound having an amino group or a hydroxyl group.
  • the compound represented by the general formula (2) is obtained by, for example, oxidizing glycerophosphorylcholine with permanganic acid and hydrochloric acid to synthesize a phosphorylcholine derivative having a carboxyl group, It can be synthesized by condensation with a compound having a group or a hydroxyl group.
  • L- ⁇ -glycerophosphorylcholine represented by the formula (commercially available product) is dissolved in distilled water, cooled in an ice water bath, sodium periodate is added, and the mixture is stirred for 5 hours. Further, after concentration under reduced pressure and drying under reduced pressure, extraction with methanol gives structural formula (2)
  • ethylenediamine is added to a methanol solution of the phosphorylcholine derivative represented by the structural formula (4), and then a triazine-type dehydrating condensing agent (DMT-MM) is added and stirred for 3 hours. Further, the precipitate is removed by filtration, concentrated under reduced pressure, and dried under reduced pressure to obtain the structural formula (5).
  • DMT-MM triazine-type dehydrating condensing agent
  • the surface modifier B represented by is obtained.
  • ethylenediamine is added to a methanol solution of the phosphorylcholine derivative represented by the structural formula (4), and then a triazine-type dehydrating condensing agent (DMT-MM) is added and stirred for 3 hours.
  • DMT-MM triazine-type dehydrating condensing agent
  • the surface modifier B represented by Structural Formula (5) is obtained by removing the precipitate by filtration, performing vacuum concentration and drying under reduced pressure.
  • the particles having a carboxyl group on the surface and the surface modifier having an amino group are condensed by a general reaction to form an amide bond. Specifically, the particles are immersed in a solution of N-hydroxysuccinimide and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide to convert the carboxyl groups of the particles into active esters, and then a surface modifier is added. Add.
  • the particles having an aldehyde group on the surface and the surface modifier having an amino group are condensed by a general reaction to form an imino bond. Specifically, after leaving the particles and the surface modifier in methanol at room temperature for 6 hours, sodium cyanotrihydroborate is added at 0 ° C. and stirred overnight with heating.
  • a protic solvent such as water, ethanol, 2-propanol or the like can be used as the reaction solvent, but the introduction rate tends to be high when methanol is used.
  • the surface modifier having a hydroxyl group is not particularly limited, and examples thereof include L- ⁇ -glycerophosphorylcholine.
  • Examples of the method for producing the surface modifier having a hydroxyl group include a method of reducing the phosphorylcholine derivative represented by the structural formula (2) or the phosphorylcholine derivative represented by the structural formula (4) with sodium borohydride or the like. Can be mentioned.
  • the particles having a carboxyl group on the surface and the surface modifier having a hydroxyl group are condensed by a general reaction to form an ester bond. Specifically, after activating the hydroxyl group of the surface modifier using cyanogen bromide, the particles are immersed.
  • the particles having an aldehyde group on the surface and the surface modifier having a hydroxyl group are added by a general reaction to form an acetal bond. Specifically, after leaving the particles and the surface modifier in methanol at room temperature for 6 hours, sodium cyanotrihydroborate is added at 0 ° C. and stirred overnight with heating.
  • a protic solvent such as water, ethanol, 2-propanol or the like can be used as the reaction solvent, but the introduction rate tends to be high when methanol is used.
  • the surface modifier having an aldehyde group is not particularly limited, and examples thereof include compounds disclosed in JP-A-2006-11383.
  • the particles having a hydroxyl group on the surface and the surface modifier having an aldehyde group are added by a general reaction to form an acetal bond. Specifically, after leaving the particles and the surface modifier in methanol at room temperature for 6 hours, sodium cyanotrihydroborate is added at 0 ° C. and stirred overnight with heating.
  • a protic solvent such as water, ethanol, 2-propanol or the like can be used as the reaction solvent, but the introduction rate tends to be high when methanol is used.
  • the particles having an amino group on the surface and the surface modifier having an aldehyde group are condensed by a general reaction to form an imino bond. Specifically, after leaving the particles and the surface modifier in methanol at room temperature for 6 hours, sodium cyanotrihydroborate is added at 0 ° C. and stirred overnight with heating.
  • a protic solvent such as water, ethanol, 2-propanol or the like can be used as the reaction solvent, but the introduction rate tends to be high when methanol is used.
  • the surface modifier having a carboxyl group is not particularly limited, and examples thereof include compounds disclosed in JP-A-2006-11381.
  • the particles having a hydroxyl group on the surface and the surface modifying agent having a carboxyl group are condensed by a general reaction to form an ester bond. Specifically, after activating the hydroxyl group of the surface modifier using cyanogen bromide, the particles are immersed.
  • the particles having an amino group on the surface and the surface modifier having a carboxyl group form an amide bond by condensing the amino group and the carboxyl group by a general reaction.
  • the surface modifier is immersed in a solution of N-hydroxysuccinimide and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide to convert the carboxyl group into an active ester, and then the particles are immersed.
  • the affinity particles of the present invention can be produced as described above. By selectively dispersing the affinity particles in a liquid sample containing a target substance that specifically binds to a ligand, the target substance is selectively selected. Can be captured. Specifically, first, affinity particles are dispersed in a liquid sample containing a target substance, gently shaken at 4 ° C. for 30 minutes, then centrifuged at 15000 rpm for 30 minutes, and the supernatant is discarded. Next, 1 ml of PBS solution is added and gently shaken, and then centrifuged at 15000 rpm for 30 minutes, and the supernatant is discarded. This washing operation is repeated three times. Furthermore, the target substance captured from the affinity particles is recovered.
  • elution buffer 1 ml of elution buffer is added, and gently shaken at 4 ° C. for 30 minutes to elute the target substance from the affinity particles, and the supernatant is recovered.
  • 1 ml of elution buffer is added, gently shaken, and centrifuged at 15000 rpm for 30 minutes to recover the supernatant. This operation is repeated twice. Thereby, the target substance can be separated.
  • the target substance may be separated using the affinity particles of the present invention as a packing material for an affinity column.
  • Example 1 Put 1.5 g of 3-aminopropyltrimethoxysilane, 380 mL of methanol, 20 mL of ultrapure water, and 60 g of silica gel with an average particle size of 50 ⁇ m in a flask, reflux at 70 ° C. overnight, and filter with methanol and water. Washing was performed to obtain silica particles having amino groups on the surface.
  • a surface modifier represented by the following formula: 1.5 mL, methanol: 47.5 mL, distilled water: 2.5 mL, 60 g of silica gel having an average particle size of 50 ⁇ m was placed in a flask and refluxed at 70 ° C. overnight.
  • silica particles having phosphorylcholine groups and aldehyde groups on the surface were obtained. Further, 80 mL of an aqueous solution of 10 mg / mL protein A (ligand) and 0.8 g of sodium cyanotrihydroborate were added and reacted at room temperature for 1 day, followed by filtration and washing with PBS, and phosphorylcholine groups on the surface. Silica particles having a ligand and an unreacted aldehyde group were obtained. Next, 600 mL of an aqueous solution of 0.5 M ethanolamine (pH 7.0) and 6 g of sodium cyanotrihydroborate were added and reacted at room temperature for 2 hours, followed by filtration and washing using PBS. Silica particles (affinity particles) having phosphorylcholine groups, ligands and hydroxyl groups were obtained.
  • FIGS. 1A and 1B Evaluation results are shown in FIGS. 1A and 1B. From FIG. 1A and FIG. 1B, it can be seen that the affinity particles of Example 1 are excellent in antibody capture efficiency and suppress the adsorption of albumin. From this, it is considered that the ligand and the phosphorylcholine group are introduced into the surface of the silica particle at a high density. On the other hand, the affinity particles of Comparative Example 1 introduced protein A after introducing phosphorylcholine groups, so that the amount of protein A introduced decreased, resulting in decreased antibody capture efficiency and increased albumin adsorption. Conceivable.

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Abstract

　アフィニティー粒子の製造方法は、表面に反応性官能基を有する粒子と、反応性官能基に対して反応性を有する官能基を有するリガンドを反応させて、粒子にリガンドを結合させる工程と、リガンドが結合された粒子と、一般式 （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数であり、ｎは、１又は２である。） で表される官能基及び反応性官能基に対して反応性を有する官能基を有する表面改質剤を反応させて、リガンドが結合された粒子に表面改質剤を結合させる工程を有する。

Description

アフィニティー粒子の製造方法、アフィニティー粒子及び分離方法
　本発明は、アフィニティー粒子の製造方法、アフィニティー粒子及び分離方法に関する。
　従来、生体物質を分離精製する方法としては、カラムクロマトグラフィーが用いられていた。しかしながら、目的物質を得るまでに多種のカラムを用いる必要があり、精製効率が低いという問題があった。また、分画成分中に目的物質が含まれているかどうかを確認する必要があり、精製に多大な時間を要するという問題があった。さらに、精製時のロスが多く、多量の試料が必要となるという問題があった。
　そこで、生体物質を分離精製する際に、アフィニティー粒子が用いることが知られている。アフィニティー粒子は、表面にリガンドが担持されているため、リガンドと特異的に結合する目的物質を選択的に捕捉することができるが、目的物質以外の物質が吸着して、目的物質の捕捉効率が低下するという問題があった。
　そこで、ホスホリルホリン基を有機粒子又は無機粒子の表面に共有結合で有するアフィニティー粒子が知られている（特許文献１及び２参照）。
　しかしながら、特許文献１及び２に開示されている製造方法では、アフィニティー粒子の表面にリガンドとホスホリルコリン基以外の部分が形成されてしまうため、目的物質の捕捉効率が低下したり、目的物質以外の物質の吸着が増加したりするという問題がある。
特開２００６－７２０３号公報 特開２００６－７２０４号公報
　本発明は、上記の従来技術が有する問題に鑑み、目的物質の捕捉効率に優れると共に、目的物質以外の物質の吸着を抑制することが可能なアフィニティー粒子の製造方法、該アフィニティー粒子の製造方法を用いて製造されているアフィニティー粒子及び該アフィニティー粒子を用いる分離方法を提供することを目的とする。
　請求項１に記載の発明は、アフィニティー粒子の製造方法において、表面に反応性官能基を有する粒子と、該反応性官能基に対して反応性を有する官能基を有するリガンドを反応させて、該粒子に該リガンドを結合させる工程と、該リガンドが結合された粒子と、一般式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数であり、ｎは、１又は２である。）
で表される官能基及び前記反応性官能基に対して反応性を有する官能基を有する表面改質剤を反応させて、該リガンドが結合された粒子に該表面改質剤を結合させる工程を有することを特徴とする。
　請求項２に記載の発明は、請求項１に記載のアフィニティー粒子の製造方法において、前記反応性官能基は、アミノ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基及びカルボキシル基の少なくとも一つであることを特徴とする。
　請求項３に記載の発明は、アフィニティー粒子において、請求項１に記載のアフィニティー粒子の製造方法を用いて製造されていることを特徴とする。
　請求項４に記載の発明は、分離方法において、請求項３に記載のアフィニティー粒子を用いて、目的物質を分離することを特徴とする。
　本発明によれば、目的物質の捕捉効率に優れると共に、目的物質以外の物質の吸着を抑制することが可能なアフィニティー粒子の製造方法、該アフィニティー粒子の製造方法を用いて製造されているアフィニティー粒子及び該アフィニティー粒子を用いる分離方法を提供することができる。
実施例１及び比較例１の上清に含まれる抗体の量を示す図である。 実施例１及び比較例１の上清に含まれるアルブミンの量を示す図である。
　次に、本発明を実施するための最良の形態を図面と共に説明する。
　本発明のアフィニティー粒子の製造方法は、表面に反応性官能基を有する粒子と、反応性官能基に対して反応性を有する官能基を有するリガンドを反応させて、粒子にリガンドを結合させる工程と、リガンドが結合された粒子と、一般式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１～６のアルキル基であり、ｍは、２～６の整数であり、ｎは、１又は２である。）
で表される官能基及び反応性官能基に対して反応性を有する官能基を有する表面改質剤を反応させて、リガンドが結合された粒子に表面改質剤を結合させる工程を有する。これにより、リガンド及びホスホリルコリン類似基を高密度で粒子の表面に導入することができる。その結果、目的物質の捕捉効率に優れると共に、目的物質以外の物質の吸着を抑制することが可能なアフィニティー粒子が得られる。
　本発明において、粒子が表面に有する反応性官能基としては、特に限定されないが、アミノ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基及びカルボキシル基の少なくとも一つが好ましい。
　このような反応性官能基を表面に有する粒子は、有機粒子及び無機粒子のいずれであってもよいが、平均粒径が２０ｎｍ～５００μｍであることが好ましい。
　有機粒子を構成する材料としては、特に限定されないが、スチレン、メタクリル酸グリシジル、（メタ）アクリル酸、Ｎ－アルキルアクリルアミド、（メタ）アクリル酸アルキル、（メタ）アクリル酸アミノアルキル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシアルキル等のモノマーを重合することにより得られる単独重合体又は共重合体等が挙げられる。中でも、アクリル酸－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド－メチレンビスアクリルアミド共重合体、メタクリル酸２－ヒドロキシエチル－スチレン－ジビニルベンゼン共重合体、２－アミノエチルメタクリレート－Ｎ－イソプロピルアクリルアミド－メチレンビスアクリルアミド共重合体等が好ましい。このような有機粒子は、乳化重合、懸濁重合等により合成することができる。また、これら以外の有機粒子を構成する材料としては、アガロース、セファロース等が挙げられる。
　無機粒子を構成する材料としては、特に限定されないが、タルク、カオリン、雲母、絹雲母（セリサイト）、白雲母、金雲母、合成雲母、紅雲母、黒雲母、パーミキュライト、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸バリウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム、ケイ酸ストロンチウム、タングステン酸の金属塩、マグネシウム、シリカ、ゼオライト、硫酸バリウム、焼成硫酸カルシウム（焼セッコウ）、リン酸カルシウム、弗素アパタイト、ヒドロキシアパタイト、セラミックパウダー、金属石鹸（例えば、ミリスチン酸亜鉛、パルミチン酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム）、窒化ホウ素、酸化セリウム、金コロイド等が挙げられる。中でも、シリカ、酸化チタン、亜鉛華、アルミナ、酸化鉄、タルク、マイカ、セリサイト、金コロイド等が好ましい。
　なお、表面に反応性官能基を有する粒子としては、粒子を表面改質することにより反応性官能基を導入したものであってもよい。
　粒子の表面にアミノ基を導入する方法としては、プラズマ処理、表面改質剤を反応させる方法、シリコーン気相処理が挙げられる。
　プラズマ処理では、窒素ガス雰囲気下、低温プラズマにより粒子の表面にアミノ基を導入する（例えば、Ｓｕｒｆａｃｅ　ａｎｄ　Ｃｏａｔｉｎｇｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１１６－１１９（１９９９）８０２－８０７、Ｃｏｌｌｏｉｄｓ　ａｎｄ　Ｓｕｒｆａｃｅｓ　Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ　１９５（２００１）８１－９５、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．２００．９８９－９９６（１９９９）参照）。具体的には、粒子を反応容器内に収容し、反応容器内を真空ポンプで真空にした後、窒素ガスを導入し、グロー放電を行う。このとき、プラズマ処理した材料を機械的に粒子化することにより、表面にアミノ基を有する粒子を作製してもよい。
　表面改質剤を反応させる方法では、アミノ基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザン等の表面改質剤を用いて、シラノール基、アルコキシシリル基等を有する粒子の表面にアミノ基を導入する。具体的には、まず、粒子を水／２－プロパノール混合液中に浸し、３－アミノプロピルトリメトキシシランを添加した後、１００℃に加熱し、６時間反応させる。次に、室温に冷却した後、メタノールで洗浄し、乾燥する。粒子としては、メタクリル酸３－トリメトキシシリルプロピル－メタクリル酸メチル－ジビニルベンゼン共重合体等の有機粒子；シリカ、ガラス、アルミナ、タルク、クレー、マイカ、アスベスト、酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄等の無機粒子等が挙げられる。
　シリコーン気相処理では、１，３，５，７－テトラメチルシクロテトラシロキサンを用いて、粒子の表面にヒドロシリル基を導入した後、アミノ基を有するモノマーを反応させることにより、粒子の表面にアミノ基を導入する（例えば、特公平１－５４３７９号公報、特公平１－５４３８０号公報、特公平１－５４３８１号公報参照）。具体的には、まず、粒子と１，３，５，７－テトラメチルシクロテトラシロキサンをデシケーター中に入れ、アスピレーターで脱気する。次に、８０℃で１６時間反応させた後、粒子を取り出し、１２０℃で乾燥させる。さらに、得られた粒子をエタノール中に分散し、アリルアミンを添加した後、塩化白金酸のエタノール溶液を添加し、６０℃で２時間攪拌する。反応が終了した後、濾過、エタノール洗浄及び減圧乾燥を行う。粒子としては、スチレン－ジビニルベンゼン共重合体等の有機粒子；マイカ、タルク、カオリン、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄等の無機粒子等が挙げられる。アミノ基を有するモノマーとしては、アリルアミンに限定されず、アミノ基を有するビニルモノマー、アクリルモノマー等であればよい。また、アミノ基は、ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基等により保護されていてもよい。さらに、アミノ基を有するモノマーの代わりに、エポキシ基等の、例えば、ジアミンとの反応により、アミノ基を導入することが可能な官能基を有するモノマーを用いてもよい。
　粒子の表面にアルデヒド基を導入する方法としては、表面にアミノ基を有する粒子にグルタルアルデヒドを反応させる方法が挙げられる。
　粒子の表面にカルボキシル基を導入する方法としては、表面改質剤を反応させる方法、シリコーン気相処理等が挙げられる。
　表面改質剤を反応させる方法では、カルボキシル基を有するアルコキシシラン、クロロシラン、シラザン等の表面改質剤を用いて、シラノール基、アルコキシシリル基等を有する粒子の表面にアミノ基を導入する。具体的には、まず、トリエトキシシリルプロピル無水コハク酸をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミドに溶解させ、蒸留水と４－ジメチルアミノピリジンを添加し、１６時間室温で撹拌し、カルボンキシル基を有するシランカップリング剤を合成する。次に、粒子を水／２－プロパノール混合液中に浸し、カルボキシル基を有するシランカップリング剤を添加した後、１００℃に加熱し、６時間反応させる。さらに、室温に冷却した後、メタノールで洗浄し、乾燥する。粒子としては、メタクリル酸３－トリメトキシシリルプロピル－メタクリル酸メチル－ジビニルベンゼン共重合体等の有機粒子；シリカ、ガラス、アルミナ、タルク、クレー、マイカ、アスベスト、酸化チタン、亜鉛華、酸化鉄等の無機粒子等が挙げられる。
　シリコーン気相処理では、１，３，５，７－テトラメチルシクロテトラシロキサンを用いて、粒子の表面にヒドロシリル基を導入した後、カルボキシル基を有するモノマーを反応させることにより、粒子の表面にカルボキシル基を導入する（例えば、特公平１－５４３７９号公報、特公平１－５４３８０号公報、特公平１－５４３８１号公報参照）。具体的には、まず、粒子と１，３，５，７－テトラメチルシクロテトラシロキサンをデシケーター中に入れ、アスピレーターで脱気する。次に、８０℃で１６時間反応させた後、粒子を取り出し、１２０℃で乾燥させる。さらに、得られた粒子をエタノール中に分散し、アリルカルボン酸を添加した後、塩化白金酸のエタノール溶液を添加し、６０℃で２時間攪拌する。反応が終了した後、濾過、エタノール洗浄及び減圧乾燥を行う。粒子としては、スチレン－ジビニルベンゼン共重合体等の有機粒子；マイカ、タルク、カオリン、アルミナ、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化鉄等の無機粒子等が挙げられる。カルボキシル基を有するモノマーとしては、アリルカルボン酸に限定されず、カルボキシル基を有するビニルモノマー、アクリルモノマー等であればよい。
　本発明において、リガンドが有する反応性官能基に対して反応性を有する官能基としては、特に限定されない。具体的には、アミノ基、ヒドロキシル基に対して反応性を有する官能基としては、カルボキシル基、アルデヒド基等が挙げられるが、反応性が高いことから、カルボキシル基が好ましい。また、アルデヒド基、カルボキシル基に対して反応性を有する官能基としては、アミノ基、ヒドロキシル基等が挙げられるが、反応性が高いことから、アミノ基が好ましい。
　また、リガンドは、反応性官能基に対して反応性を有する官能基が、スペーサーを介して、結合されていることが好ましい。スペーサーとしては、特に限定されないが、メチレン基、オキシエチレン基、アミノ基を１個以上有するアルキレン基等が挙げられる。
　リガンドとしては、特に限定されないが、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＹ等の各種抗体；蛋白質、多糖類等の抗原；グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ等の酵素；グルタチオン等の基質；ホルモンレセプター、サイトカインレセプター等のレセプター；ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アプタマー、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ビオチン；ニトリロ三酢酸等のキレート化合物；Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋等の各種金属イオン等が挙げられる。
　リガンドが蛋白質である場合、表面にアルデヒド基を有する粒子と、蛋白質のアミノ基は、一般的な反応により縮合させることで、イミノ結合を形成する。具体的には、粒子及び表面改質剤をメタノール中、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。なお、反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２－プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
　また、表面にカルボキシル基を有する粒子と、蛋白質のアミノ基は、一般的な反応により縮合させることで、アミド結合を形成する。具体的には、粒子をＮ－ヒドロキシスクシンイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの溶液に浸漬して、粒子のカルボキシル基を活性エステル化させた後、蛋白質を加える。
　また、表面にアミノ基を有する粒子と、蛋白質のアミノ基は、一般的な反応により、グルタルアルデヒドを介して縮合させることで、イミノ結合を形成する。具体的には、粒子（又は蛋白質）にグルタルアルデヒドを反応させた後、蛋白質（又は粒子）と反応させる。
　また、表面にヒドロキシル基を有する粒子と、蛋白質のカルボキシル基は、一般的な反応により縮合させることで、エステル結合を形成する。具体的には、臭化シアンを用いて、粒子のヒドロキシル基を活性化させた後、蛋白質を加える。
　本発明において、リガンドが結合された粒子と反応させる表面改質剤は、分子量が２５５～５４９であることが好ましく、２５５～２８３がさらに好ましい。これにより、ホスホリルコリン類似基をさらに高密度で粒子の表面に導入することができる。
　また、表面改質剤が有する反応性官能基に対して反応性を有する官能基としては、特に限定されない。具体的には、アミノ基、ヒドロキシル基に対して反応性を有する官能基としては、カルボキシル基、アルデヒド基等が挙げられるが、反応性が高いことから、カルボキシル基が好ましい。また、アルデヒド基、カルボキシル基に対して反応性を有する官能基としては、アミノ基、ヒドロキシル基等が挙げられるが、反応性が高いことから、アミノ基が好ましい。
　また、表面改質剤は、反応性官能基に対して反応性を有する官能基が、スペーサーを介して、ホスホリルコリン類似基に結合されていることが好ましい。スペーサーとしては、特に限定されないが、メチレン基、オキシエチレン基、アミノ基を１個以上有するアルキレン基等が挙げられる。
　なお、表面改質剤が有する反応性官能基に対して反応性を有する官能基は、リガンドが有する反応性官能基と同一であってもよいし、異なっていてもよい。
　以下、表面改質剤について具体的に説明する。
　（アミノ基を有する表面改質剤）
　アミノ基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、例えば、特開２００６－７２０３号公報、特開２００６－７２０４号公報に開示されている化合物等が挙げられるが、中でも、一般式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１～６のアルキル基であり、Ａは、イミノ基、エステル結合又はアミド結合であり、Ｂは、炭素数が１～３のアルキレン基、炭素数が１～３のポリオキシエチレン基又はアリーレン基であり、ｍは、２～６の整数、ｎは、１又は２である。）
で表される化合物が好ましい。
　Ａがイミノ基である場合、一般式（２）で表される化合物は、例えば、グリセロホスホリルコリンを過ヨウ素酸により酸化させて、アルデヒド基を有するホスホリルコリン誘導体を合成した後、アミノ基を有する化合物と縮合させることにより、合成することができる。また、Ａがアミド結合又はエステル結合である場合、一般式（２）で表される化合物は、例えば、グリセロホスホリルコリンを過ヨウ素酸及び三塩化ルテニウムにより酸化させる方法でカルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体を合成した後、アミノ基又はヒドロキシル基を有する化合物と縮合させることにより、合成することができる。
　Ａがアミド結合又はエステル結合である場合、一般式（２）で表される化合物は、例えば、グリセロホスホリルコリンを過マンガン酸及び塩酸により酸化させて、カルボキシル基を有するホスホリルコリン誘導体を合成した後、アミノ基又はヒドロキシル基を有する化合物と縮合させることにより、合成することができる。
　次に、一般式（２）で表される化合物の製造方法を具体的に説明する。
　（表面改質剤Ａの製造例）
　まず、構造式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 で表されるＬ－α－グリセロホスホリルコリン（市販品）を蒸留水に溶解させ、氷水浴中で冷却した後、過ヨウ素酸ナトリウムを添加し、５時間攪拌する。さらに、減圧濃縮及び減圧乾燥を行った後、メタノールで抽出することにより、構造式（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 で表されるホスホリルコリン誘導体が得られる。
　次に、構造式（２）で表されるホスホリルコリン誘導体をメタノールに溶解させた後、エチレンジアミンを添加し、室温で撹拌する。さらに、氷水浴中で冷却した後、シアノトリヒドロホウ素化ナトリウムを添加し、室温に戻して１６時間撹拌する。なお、反応容器には乾燥窒素を流し続ける。次に、ろ過により沈殿を除去した後、減圧濃縮及び減圧乾燥を行うことにより、構造式（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 で表される表面改質剤Ａが得られる。
　（表面改質剤Ｂの製造例１）
　まず、Ｌ－α－グリセロホスホリルコリンの水溶液を氷水浴中で冷却した後、過ヨウ素酸ナトリウム及び三塩化ルテニウムを添加し、３時間攪拌する。次に、メタノールを添加して、さらに３０分間攪拌した後、ろ過により沈殿を除去し、減圧濃縮及び減圧乾燥を行うことにより、構造式（４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 で表されるホスホリルコリン誘導体が得られる。
　次に、構造式（４）で表されるホスホリルコリン誘導体のメタノール溶液に、エチレンジアミンを添加した後、トリアジン型脱水縮合剤（ＤＭＴ－ＭＭ）を添加し、３時間撹拌する。さらに、ろ過により沈殿を除去し、減圧濃縮及び減圧乾燥を行うことにより、構造式（５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 で表される表面改質剤Ｂが得られる。
　（表面改質剤Ｂの製造例２）
　まず、Ｌ－α－グリセロホスホリルコリンを氷水浴中で冷却しながら、塩酸に溶解させた後、過マンガン酸カリウムを添加し、３時間攪拌する。次に、メタノールを添加して、さらに３０分間攪拌した後、ろ過により沈殿を除去し、減圧濃縮及び減圧乾燥を行うことにより、構造式（４）で表されるホスホリルコリン誘導体が得られる。
　次に、構造式（４）で表されるホスホリルコリン誘導体のメタノール溶液に、エチレンジアミンを添加した後、トリアジン型脱水縮合剤（ＤＭＴ－ＭＭ）を添加し、３時間撹拌する。さらに、ろ過により沈殿を除去し、減圧濃縮及び減圧乾燥を行うことにより、構造式（５）で表される表面改質剤Ｂが得られる。
　表面にカルボキシル基を有する粒子と、アミノ基を有する表面改質剤は、一般的な反応により縮合させることで、アミド結合を形成する。具体的には、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの溶液に粒子を浸漬して、粒子のカルボキシル基を活性エステル化させた後、表面改質剤を加える。
　表面にアルデヒド基を有する粒子と、アミノ基を有する表面改質剤は、一般的な反応により縮合させることで、イミノ結合を形成する。具体的には、粒子及び表面改質剤をメタノール中、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。なお、反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２－プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
　（ヒドロキシル基を有する表面改質剤）
　ヒドロキシル基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、例えば、Ｌ－α－グリセロホスホリルコリン等が挙げられる。ヒドロキシル基を有する表面改質剤の製造方法としては、例えば、構造式（２）で表されるホスホリルコリン誘導体又は構造式（４）で表されるホスホリルコリン誘導体を水素化ホウ素ナトリウム等により還元する方法が挙げられる。
　表面にカルボキシル基を有する粒子と、ヒドロキシル基を有する表面改質剤は、一般的な反応により縮合させることで、エステル結合を形成する。具体的には、臭化シアンを用いて、表面改質剤のヒドロキシル基を活性化させた後、粒子を浸漬する。
　表面にアルデヒド基を有する粒子と、ヒドロキシル基を有する表面改質剤は、一般的な反応により付加させることで、アセタール結合を形成する。具体的には、粒子及び表面改質剤をメタノール中、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。なお、反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２－プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
　（アルデヒド基を有する表面改質剤）
　アルデヒド基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、例えば、特開２００６－１１３８３号公報に開示されている化合物等が挙げられる。
　表面にヒドロキシル基を有する粒子と、アルデヒド基を有する表面改質剤は、一般的な反応により付加させることで、アセタール結合を形成する。具体的には、粒子及び表面改質剤をメタノール中、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。なお、反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２－プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
　表面にアミノ基を有する粒子と、アルデヒド基を有する表面改質剤は、一般的な反応により縮合させることで、イミノ結合を形成する。具体的には、粒子及び表面改質剤をメタノール中、室温で６時間放置した後、シアノトリヒドロホウ素酸ナトリウムを０℃で添加して、一晩加熱攪拌する。なお、反応溶媒としては、メタノール以外にも、水、エタノール、２－プロパノール等のプロトン性溶媒を使用することができるが、メタノールを用いた場合の導入率が高い傾向にある。
　（カルボキシル基を有する表面改質剤）
　カルボキシル基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、例えば、特開２００６－１１３８１号公報に開示されている化合物等が挙げられる。
　表面にヒドロキシル基を有する粒子と、カルボキシル基を有する表面改質剤は、一般的な反応により縮合させることで、エステル結合を形成する。具体的には、臭化シアンを用いて、表面改質剤のヒドロキシル基を活性化させた後、粒子を浸漬する。
　表面にアミノ基を有する粒子と、カルボキシル基を有する表面改質剤は、一般的な反応によりアミノ基とカルボキシル基を縮合させることで、アミド結合を形成する。具体的には、表面改質剤をＮ－ヒドロキシスクシンイミド、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの溶液に浸して、カルボキシル基を活性エステル化させた後、粒子を浸漬する。
　本発明のアフィニティー粒子は、以上のようにして製造することができるが、アフィニティー粒子を、リガンドに対して特異的に結合する目的物質を含む液体試料に分散させることにより、目的物質を選択的に捕捉することができる。具体的には、まず、アフィニティー粒子を、目的物質を含む液体試料に分散させ、３０分間４℃で緩やかに振った後、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上清を捨てる。次に、ＰＢＳ溶液１ｍｌを加えて、緩やかに振った後、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して、上清を捨てる。この洗浄操作を３回繰り返す。さらに、アフィニティー粒子から捕捉された目的物質を回収する。具体的には、まず、溶出バッファー１ｍｌを加え、３０分間４℃で緩やかに振り、アフィニティー粒子から目的物質を溶出させ、上清を回収する。次に、溶出バッファー１ｍｌを加えて、緩やかに振り、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心して、上清を回収する。この操作を２回繰り返す。これにより、目的物質を分離することができる。
　なお、本発明のアフィニティー粒子を、アフィニティーカラムの充填剤として用いて、目的物質を分離してもよい。
　［実施例１］
　３－アミノプロピルトリメトキシシラン１．５ｍｍｏｌ、メタノール３８０ｍＬ、超純水２０ｍＬ、平均粒径が５０μｍのシリカゲル６０ｇをフラスコに入れ、７０℃で一晩還流させた後、メタノールと水を用いて、ろ過洗浄を行い、表面にアミノ基を有するシリカ粒子を得た。次に、得られたシリカ粒子５０ｇに、４重量％のグルタルアルデヒドの水溶液５００ｍＬ、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム５ｇを加えて、室温で５時間反応させた後、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）を用いて、ろ過洗浄を行い、表面にアルデヒド基を有するシリカ粒子を得た。さらに、１０ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ（リガンド）の水溶液８０ｍＬ、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム０．８ｇを加えて室温で１日反応させた後、ＰＢＳを用いて、ろ過洗浄を行い、表面にリガンド及びアルデヒド基を有するシリカ粒子を得た。次に、０．５Ｍのアミノ基を有する表面改質剤（表面改質剤Ｂ）の水溶液（ｐＨ７．０）６００ｍＬ、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム６ｇを加えて、室温で２時間反応させた後、ＰＢＳを用いて、ろ過洗浄を行い、表面にリガンド及びホスホリルコリン基を有するシリカ粒子（アフィニティー粒子）を得た。
　［比較例１］
　３－アミノプロピルトリメトキシシラン１．５ｍｍｏｌ、０．１５Ｍの構造式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 で表される表面改質剤のメタノール溶液１．５ｍＬ、メタノール４７．５ｍＬ、蒸留水２．５ｍＬ、平均粒径が５０μｍのシリカゲル６０ｇをフラスコに入れ、７０℃で一晩還流させた後、メタノールと水を用いて、ろ過洗浄を行い、表面にホスホリルコリン基及びアミノ基を有するシリカ粒子を得た。次に、得られたシリカ粒子５０ｇに、４重量％のグルタルアルデヒドの水溶液５００ｍＬ、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム５ｇを加えて、室温で５時間反応させた後、ＰＢＳを用いて、ろ過洗浄を行い、表面にホスホリルコリン基及びアルデヒド基を有するシリカ粒子を得た。さらに、１０ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ（リガンド）の水溶液８０ｍＬ、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム０．８ｇを加えて室温で１日反応させた後、ＰＢＳを用いて、ろ過洗浄を行い、表面にホスホリルコリン基、リガンド及び未反応のアルデヒド基を有するシリカ粒子を得た。次に、０．５Ｍのエタノールアミンの水溶液（ｐＨ７．０）６００ｍＬ、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム６ｇを加えて、室温で２時間反応させた後、ＰＢＳを用いて、ろ過洗浄を行い、表面にホスホリルコリン基、リガンド及びヒドロキシル基を有するシリカ粒子（アフィニティー粒子）を得た。
　［評価方法及び評価結果］
　アフィニティー粒子２５ｍＬ及び５倍希釈したヒト血清２ｍＬをエッペンチューブに加えて、室温で１時間反応させた。次に、遠心分離（５０００ｇ）を行って上清を取り除いた後、ＰＢＳを用いて遠心分離（５０００ｇ）を５回行った。さらに、０．２ＭのＧｌｙ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ２．５）５００μＬを加えて、室温で１時間反応させて抗体を溶出させ、遠心分離（５０００ｇ）を行い、上清を得た。得られた上清に含まれる抗体（目的物質）とアルブミン（不純物）の量を、ＥＬＩＳＡ法を用いて定量した。
　評価結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。図１Ａ及び図１Ｂより、実施例１のアフィニティー粒子は、抗体の捕捉効率に優れると共に、アルブミンの吸着を抑制していることがわかる。このことから、リガンド及びホスホリルコリン基が高密度でシリカ粒子の表面に導入されていると考えられる。一方、比較例１のアフィニティー粒子は、ホスホリルコリン基を導入した後にプロテインＡを導入したため、プロテインＡの導入量が低下し、その結果、抗体の捕捉効率が低下し、アルブミンの吸着が増加したものと考えられる。
　本国際出願は、２００８年３月１９日に出願された日本国特許出願第２００８－７０７５０号に基づく優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２００８－７０７５０号の全内容を本国際出願に援用する。

Claims (4)

  1. 　表面に反応性官能基を有する粒子と、該反応性官能基に対して反応性を有する官能基を有するリガンドを反応させて、該粒子に該リガンドを結合させる工程と、
    　該リガンドが結合された粒子と、一般式
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、炭素数が１以上６以下のアルキル基であり、ｍは、２以上６以下の整数であり、ｎは、１又は２である。）
    で表される官能基及び前記反応性官能基に対して反応性を有する官能基を有する表面改質剤を反応させて、該リガンドが結合された粒子に該表面改質剤を結合させる工程を有することを特徴とするアフィニティー粒子の製造方法。
  2. 　前記反応性官能基は、アミノ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基及びカルボキシル基の少なくとも一つであることを特徴とする請求項１に記載のアフィニティー粒子の製造方法。
  3. 　請求項１に記載のアフィニティー粒子の製造方法を用いて製造されていることを特徴とするアフィニティー粒子。
  4. 　請求項３に記載のアフィニティー粒子を用いて、目的物質を分離することを特徴とする分離方法。
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