JPWO2009116309A1 - アフィニティー粒子の製造方法、アフィニティー粒子及び分離方法 - Google Patents
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Abstract
Description
で表される官能基及び前記反応性官能基に対して反応性を有する官能基を有する表面改質剤を反応させて、該リガンドが結合された粒子に該表面改質剤を結合させる工程を有することを特徴とする。
で表される官能基及び反応性官能基に対して反応性を有する官能基を有する表面改質剤を反応させて、リガンドが結合された粒子に表面改質剤を結合させる工程を有する。これにより、リガンド及びホスホリルコリン類似基を高密度で粒子の表面に導入することができる。その結果、目的物質の捕捉効率に優れると共に、目的物質以外の物質の吸着を抑制することが可能なアフィニティー粒子が得られる。
アミノ基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、例えば、特開2006−7203号公報、特開2006−7204号公報に開示されている化合物等が挙げられるが、中でも、一般式(2)
で表される化合物が好ましい。
まず、構造式(1)
まず、L−α−グリセロホスホリルコリンの水溶液を氷水浴中で冷却した後、過ヨウ素酸ナトリウム及び三塩化ルテニウムを添加し、3時間攪拌する。次に、メタノールを添加して、さらに30分間攪拌した後、ろ過により沈殿を除去し、減圧濃縮及び減圧乾燥を行うことにより、構造式(4)
まず、L−α−グリセロホスホリルコリンを氷水浴中で冷却しながら、塩酸に溶解させた後、過マンガン酸カリウムを添加し、3時間攪拌する。次に、メタノールを添加して、さらに30分間攪拌した後、ろ過により沈殿を除去し、減圧濃縮及び減圧乾燥を行うことにより、構造式(4)で表されるホスホリルコリン誘導体が得られる。
ヒドロキシル基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、例えば、L−α−グリセロホスホリルコリン等が挙げられる。ヒドロキシル基を有する表面改質剤の製造方法としては、例えば、構造式(2)で表されるホスホリルコリン誘導体又は構造式(4)で表されるホスホリルコリン誘導体を水素化ホウ素ナトリウム等により還元する方法が挙げられる。
アルデヒド基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、例えば、特開2006−11383号公報に開示されている化合物等が挙げられる。
カルボキシル基を有する表面改質剤としては、特に限定されないが、例えば、特開2006−11381号公報に開示されている化合物等が挙げられる。
3−アミノプロピルトリメトキシシラン1.5mmol、メタノール380mL、超純水20mL、平均粒径が50μmのシリカゲル60gをフラスコに入れ、70℃で一晩還流させた後、メタノールと水を用いて、ろ過洗浄を行い、表面にアミノ基を有するシリカ粒子を得た。次に、得られたシリカ粒子50gに、4重量%のグルタルアルデヒドの水溶液500mL、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム5gを加えて、室温で5時間反応させた後、PBS(Phosphate buffered saline)を用いて、ろ過洗浄を行い、表面にアルデヒド基を有するシリカ粒子を得た。さらに、10mg/mLのプロテインA(リガンド)の水溶液80mL、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム0.8gを加えて室温で1日反応させた後、PBSを用いて、ろ過洗浄を行い、表面にリガンド及びアルデヒド基を有するシリカ粒子を得た。次に、0.5Mのアミノ基を有する表面改質剤(表面改質剤B)の水溶液(pH7.0)600mL、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム6gを加えて、室温で2時間反応させた後、PBSを用いて、ろ過洗浄を行い、表面にリガンド及びホスホリルコリン基を有するシリカ粒子(アフィニティー粒子)を得た。
3−アミノプロピルトリメトキシシラン1.5mmol、0.15Mの構造式
アフィニティー粒子25mL及び5倍希釈したヒト血清2mLをエッペンチューブに加えて、室温で1時間反応させた。次に、遠心分離(5000g)を行って上清を取り除いた後、PBSを用いて遠心分離(5000g)を5回行った。さらに、0.2MのGly−HClバッファー(pH2.5)500μLを加えて、室温で1時間反応させて抗体を溶出させ、遠心分離(5000g)を行い、上清を得た。得られた上清に含まれる抗体(目的物質)とアルブミン(不純物)の量を、ELISA法を用いて定量した。
Claims (4)
- 前記反応性官能基は、アミノ基、ヒドロキシル基、アルデヒド基及びカルボキシル基の少なくとも一つであることを特徴とする請求項1に記載のアフィニティー粒子の製造方法。
- 請求項1に記載のアフィニティー粒子の製造方法を用いて製造されていることを特徴とするアフィニティー粒子。
- 請求項3に記載のアフィニティー粒子を用いて、目的物質を分離することを特徴とする分離方法。
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