CN115301214A - 一种胆碱磷酸类复合磁性纳米材料及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医用材料领域,具体公开了一种胆碱磷酸类复合磁性纳米材料及其制备方法与应用。本发明制备的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料,由内到外依次包括磁核、二氧化硅层、巯基二氧化硅层和胆碱磷酸类聚合物层。本发明首次以2‑甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸丁酯作为C‑反应蛋白的识别配体,利用巯基‑烯烃聚合反应和可逆的加成‑断裂链转移加成反应提高配体密度,可以有效地提高对C‑反应蛋白的纯化效率。该材料具有操作快速便携、生物相容性好、抗蛋白非特异性吸附能力强的优点。同时,利用其能够从复杂体系中富集分离C‑反应蛋白的优势,实现对C‑反应蛋白的检测,避免了杂蛋白和复杂基质的干扰,提高C‑反应蛋白检测的准确度。

Description

一种胆碱磷酸类复合磁性纳米材料及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医用材料领域,具体涉及一种胆碱磷酸类复合磁性纳米材料及其制备方法与应用。
背景技术
C-反应蛋白是一种由肝细胞产生的急性时相五聚体蛋白,由五个分子量约为23kDa的非糖基化原体围绕一个中心通过非共价键组成。[Nature communications,2017,8(1):1-19.]相关研究表明,C-反应蛋白具有活化经典补体途径,刺激细胞吞噬作用,结合免疫球蛋白受体等生理功能。[Acta Biomaterialia,2017,48:206-214.]迄今为止,C-反应蛋白不仅可作为感染或炎症状况的早期指标,同时与心血管疾病、小儿新生败血症、坏死性小肠结肠炎、关节持续性恶化等多种疾病、病症和病理状况息息相关。[Biotechnologyadvances,2016,34(3):272-290.]因此,高纯度的C-反应蛋白有助于研究C-反应蛋白在多种疾病的作用机制和信号通路。[ACS applied materials&interfaces,2018,10(49):41999-42008.]准确、灵敏、高通量C-反应蛋白的检测方法对于疾病的早期发现、诊断和预后具有重要意义。
C-反应蛋白通过与受损细胞膜上的两性离子极性头部磷脂酰胆碱(PC)特异性结合而激活补体途径。[Nature immunology,2010,11(9):785-797.]磷脂酰胆碱的磷酸基团配位两个钙离子与C-反应蛋白发生相互作用,胆碱基团则通过疏水作用结合C-反应蛋白的疏水口袋。[Structure,1999,7(2):169-177.]“反向PC”的胆碱磷酸类具有与磷脂酰胆碱相同的带负电荷的磷酸基团和带正电荷的胆碱基团。同时,胆碱磷酸类作为两性离子具有高度的仿生性、生物相容性和优异的抗非特异性吸附能力。[Journal of the AmericanChemical Society,2016,138(6):1828-1831.]游离在外的磷酸基团有利于对其进一步的功能化修饰。因此,研究胆碱磷酸类化合物与C-反应蛋白的相互作用具有重要意义。
常见的C-反应蛋白富集纯化方法是将磷脂酰胆碱等配体固定在琼脂糖载体上。[Clinical and Experimental Immunology,1977,30(1):32]该纯化方法步骤繁琐,纯化效率低,且以琼脂糖为载体容易产生非特异性吸附。磁性纳米材料由于具有比表面积大、快速的磁响应、优异的生物相容性和稳定性等优点而被广泛应用于生物医药领域。[Nanotechnology Reviews,2016,5(3):331-340.]磁性纳米材料能通过表面修饰提高其抗非特异性吸附能力,固定在磁性纳米材料表面的配体则能够特异性地识别目标物并实现快速分离,基于巯基-烯烃聚合反应和可逆的加成-断裂链转移加成反应,有效提高配体在磁性纳米材料表面的接枝密度,提高对C-反应蛋白的纯化效率。[Chemical Communications,2015,51(79):14778-14780.]。
C-反应蛋白的检测容易受到杂蛋白和复杂基质的干扰,影响C-反应蛋白检测的准确度。为了克服上述问题,利用磁性纳米材料能够快速从复杂体系富集和分离目标物的优点,与拉曼等常用检测方法结合,实现C-反应蛋白的超灵敏检测,避免了杂蛋白的干扰,提高检测的准确度。[Sensors and Actuators B:Chemical,2021,334:129640.]因此,开发一种新型胆碱磷酸类复合磁性纳米材料对于复杂生物样品中C-反应蛋白的富集和检测具有广泛的应用前景。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点,本发明的首要目的在于提供一种胆碱磷酸类复合磁性纳米材料的制备方法。
本发明的第二目的在于提供上述制备方法制备得到的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料。
本发明的第三目的在于提供上述胆碱磷酸类复合磁性纳米材料在C-反应蛋白纯化与检测中的应用。
本发明的首要目的通过以下技术方案实现:
一种胆碱磷酸类复合磁性纳米材料的制备方法,包括如下步骤:
S1、溶剂热法制备磁核,得到产物Ⅰ;
S2、在步骤S1得到的产物Ⅰ表面用Stober法包覆二氧化硅层,得到产物Ⅱ;
S3、在步骤S2得到的产物Ⅱ表面通过硅烷化试剂改性,得到产物Ⅲ;
S4、在所述产物Ⅲ表面通过巯基-烯烃聚合反应和可逆的加成-断裂链转移加成反应将胆碱磷酸类化合物单体接枝在磁性纳米材料表面,得到产物Ⅳ(MBP-MNPs),产物Ⅳ即为所述胆碱磷酸类复合磁性纳米材料;
所述胆碱磷酸类化合物单体的结构为式Ⅰ或式Ⅱ,式Ⅰ或式Ⅱ分子结构式如下:
Figure BDA0003789568420000021
其中,R1、R2独立的选自取代或非取代烷烃;R3为取代烷烃或磷酸基团进一步修饰的功能化基团;R4为H或者CH3。优选地,步骤S4具体为:将胆碱磷酸类化合物单体、引发剂、溶剂、可逆的加成-断裂链转移试剂、产物Ⅲ混合,然后超声并装入密闭容器,脱气后通氮气,在40~80℃温度下或紫外光照条件下聚合反应,得到所述产物Ⅳ,即胆碱磷酸类复合磁性纳米材料。
优选地,所述胆碱磷酸类单体化合物与引发剂的质量比为10:1~50:1;所述胆碱磷酸类单体化合物与产物Ⅲ的质量比为10:1~50:1;所述引发剂与可逆的加成-断裂链转移试剂的质量比为3:5~3:20;所述聚合时间为1~72小时。
优选地,步骤S3中所述硅烷化试剂为3-巯丙基三甲氧基硅烷或3-巯丙基三乙氧基硅烷中的一种。
优选地,所述胆碱磷酸类化合物单体为2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸丁酯(MBP)。
优选地,所述引发剂为热引发剂2,2’-偶氮二异丁腈脒二盐酸盐或光引发剂安息香双甲醚,或偶氮二异丁腈、过氧化苯甲酰、过氧化双月桂酰中的任意一种;所述可逆的加成-断裂链转移试剂为4-氰基-4-(苯基碳基硫戊酸)、2-氰基-2-丙基苯并二硫、2-氰基-2-丙基-4-氰基苯二硫代碳酸酯、2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯酰中的任意一种;所述溶剂为正丙醇、正癸醇、异丙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、甲醇、环己醇、1,4-丁二醇、正十二醇或水中的至少一种。
优选地,所述引发剂为2,2’-偶氮二异丁腈脒二盐酸盐;所述溶剂由甲醇与水组成;所述可逆的加成-断裂链转移试剂为4-氰基-4-(苯基碳基硫戊酸)。
本发明的第二目的通过以下技术方案实现:
一种胆碱磷酸类复合磁性纳米材料,由内到外依次包括磁核、二氧化硅层、巯基二氧化硅层和胆碱磷酸类聚合物层。
优选地,所述磁核为磁性纳米颗粒四氧化三铁磁核,粒径大小为50~800nm。
优选地,所述二氧化硅层为四氧化三铁磁核外包覆二氧化硅,呈核壳结构,所述二氧化硅层的厚度为50~500nm。
优选地,所述巯基二氧化硅层为二氧化硅表面通过巯基硅烷化试剂改性而成,所述巯基二氧化硅层的厚度为10~100nm。
优选地,所述胆碱磷酸类聚合物层为胆碱磷酸类化合物单体通过巯基-烯烃聚合反应和可逆的加成-断裂链转移加成反应接枝在磁性纳米材料表面得到,所述胆碱磷酸类聚合物层的厚度为50~800nm。
本发明的第三目的通过以下技术方案实现:
一种胆碱磷酸类复合磁性纳米材料在C-反应蛋白纯化与检测中的应用。
相对于现有技术,本发明具有如下优点及有益效果:
(1)本发明所述用于纯化和检测C-反应蛋白的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料,在制备四氧化三铁磁核的表面,通过Stober法包覆二氧化硅,利用硅烷化试剂对二氧化硅表面改性,最后通过巯基-烯烃聚合反应和可逆的加成-断裂链转移加成反应将胆碱磷酸类化合物单体接枝在磁性纳米材料表面得到胆碱磷酸类复合磁性纳米材料。该材料通过胆碱磷酸类聚合物与C-反应蛋白的特异性相互作用,实现对C-反应蛋白的纯化和检测。该材料具有操作快速便携、生物相容性好、抗蛋白非特异性吸附能力强的优点。同时,利用其能够从复杂体系中富集分离C-反应蛋白的优势,实现对C-反应蛋白的检测,避免了杂蛋白和复杂基质的干扰,提高C-反应蛋白检测的准确度。
(2)本发明首次以2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸丁酯作为C-反应蛋白的识别配体,利用巯基-烯烃聚合反应和可逆的加成-断裂链转移加成反应提高配体密度,可以有效地提高对C-反应蛋白的纯化效率。本发明还首次报道了胆碱磷酸类功能单体接枝的磁性纳米材料用于复杂生物样本中C-反应蛋白的纯化和检测。胆碱磷酸类功能单体结构中,胆碱磷酸部分高度仿生细胞膜的亲水头基磷脂酰胆碱基团,具有与相同带正电荷的磷酸基团和带负电荷的胆碱基团,既具有两性离子的亲水性和抗污特性,又能够与C-反应蛋白发生相互作用。游离在外的磷酸基团有利于对其进一步的功能化修饰。
(3)本发明制备的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料相比于传统的亲和色谱、凝胶过滤和琼脂糖纯化,其表现出诸多优点:高度的仿生性、优异的生物相容性和抗非特异性吸附能力、操作简单便携、分散性好、在施加磁场条件下能够实现快速分离等优点。
(4)本发明制备的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料能够从复杂的生物体液中富集C-反应蛋白并分离,避免了杂蛋白和复杂基质的干扰。与C-反应蛋白的检测方法结合,可以实现C-反应蛋白的超灵敏检测,提高C-反应蛋白检测的准确度。
附图说明
图1所示为本发明实施例一种用于纯化和检测C-反应蛋白的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料的合成路线示意图。
图2所示为本发明实施例胆碱磷酸类复合磁性纳米材料制备过程中不同产物的扫描电镜图。
图3所示为本发明实施例胆碱磷酸类复合磁性纳米材料制备过程中不同产物的的X射线光电子能谱谱图。
图4所示为本发明实施例胆碱磷酸类复合磁性纳米材料对C-反应蛋白的特异选择性的SDS-PAGE图(A)和回收率结果图(B)。
图5所示为本发明实施例胆碱磷酸类复合磁性纳米材料对炎症患者血清(A)和肿瘤小鼠血清(B)的纯化结果图。
图6所示为本发明实施例胆碱磷酸类复合磁性纳米材料用于C-反应蛋白检测的线性范围。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
下文将结合具体附图详细描述本发明具体实施例。应当注意的是,下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的,它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。在下述实施例的附图中各附图所出现的相同标号代表相同的特征或者部件,可应用于不同实施例中。
本发明所述实施例一种用于纯化和检测C-反应蛋白的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料,首先制备四氧化三铁磁核,通过Stober法包覆二氧化硅,利用3-巯丙基三甲氧基硅烷改性得到巯基二氧化硅层,最后通过巯基-烯烃聚合反应和可逆的加成-断裂链转移加成反应将胆碱磷酸类化合物单体(2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸丁酯)接枝在磁性纳米材料表面。
在一个具体实施例中,四氧化三铁磁核,粒径大小为50~800nm,如图2中(A)所示,四氧化三铁磁核形貌均一,表面粗糙凹凸不平。如图3中(A)所示,具有铁和氧元素特征峰。
在一个具体实施例中,所述的二氧化硅层为四氧化三铁磁核外包覆二氧化硅,呈核壳结构,所述二氧化硅层的厚度为50~500nm,如图2中(B)所示,四氧化三铁磁核包覆了二氧化硅后表面光滑。如图3中(B)所示,具有硅元素特征峰。
在一个具体实施例中,所述巯基二氧化硅层为二氧化硅表面通过巯基硅烷化试剂改性而成,所述巯基二氧化硅层的厚度为10~100nm,如图2中(C)所示,改性后的巯基二氧化硅层,磁性纳米颗粒表面再度变得粗糙。如图3中(C)所示,具有硫元素特征峰。
在一个具体实施例中,所述胆碱磷酸类聚合物层为2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸丁酯通过巯基-烯烃聚合反应和可逆的加成-断裂链转移加成反应接枝在磁性纳米材料表面得到。如图2所示,所述胆碱磷酸类聚合物层的厚度为50~800nm。如图2中(D)所示,磁性纳米颗粒表面粗糙程度增强,可以明显观察到表面的聚合物层。如图3中(D)所示,具有氮元素和磷元素特征峰。
如图1所示,本发明实施例一种用于纯化和检测C-反应蛋白的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料的制备方法,包括如下步骤:
S1、制备四氧化三铁磁核,得到产物Ⅰ(Fe3O4);
S2、在所述产物Ⅰ表面包覆二氧化硅层,得到产物Ⅱ(Fe3O4@SiO2);
S3、在所述产物Ⅱ表面通过硅烷化试剂改性,得到产物Ⅲ(Fe3O4@SiO2-SH);
S4、在所述产物Ⅲ表面通过巯基-烯烃聚合反应和可逆的加成-断裂链转移加成反应将2-甲基丙烯酰氧乙基胆碱磷酸丁酯接枝在磁性纳米材料表面,得到产物Ⅳ(MBP-MNPs)。产物Ⅳ即为所述胆碱磷酸类复合磁性纳米材料。
在下述具体实施例中:
实施例1
产物Ⅰ:将2.7g FeCl3·6H2O超声溶解在80mL乙二醇中形成澄清溶液,加入7.2g无水乙酸钠和2g聚乙二醇10000,剧烈搅拌30min,形成橙红色溶液。将其密封在高压反应釜中,加热至200℃并维持反应8h。反应结束后冷却至室温,磁分离,得到Fe3O4磁核,用乙醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅱ:取240mL乙醇、60mL去离子水、3mL浓氨水溶液(28wt%)和300mgFe3O4于三颈烧瓶中,超声30min使Fe3O4均匀分散在混合溶液中,机械搅拌下通过恒压漏斗缓慢滴加3mL硅酸四乙酯,滴完后室温搅拌6h。反应结束后,磁分离,得到Fe3O4@SiO2,并用乙醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅲ:取300mgFe3O4@SiO2于三颈烧瓶中,加入100mL无水甲苯,超声30min,抽真空-通氮气,循环3次除氧。氮气氛围下,加热至110℃,机械搅拌,待甲苯开始冷凝回流,从冷凝管上端加入3mL3-巯丙基三甲氧基硅烷和1mL吡啶,回流24h。反应结束后,磁分离,得到Fe3O4@SiO2-SH,用甲苯和无水乙醇分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅳ:取40mgAIBA、12mgCPA-DB、1gMBP、30mL甲醇-水(1:1,v/v)于三颈烧瓶中,超声溶解,加入100mgFe3O4@SiO2-SH,抽真空-通氮气,循环3次除氧。氮气氛围下,加热至55℃,机械搅拌反应4h。反应结束后,磁分离,得到MBP-MNPs,用甲醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
实施例2
产物Ⅰ:将2.7g FeCl3·6H2O超声溶解在80mL乙二醇中形成澄清溶液,加入7.2g无水乙酸钠和2g聚乙二醇10000,剧烈搅拌30min,形成橙红色溶液。将其密封在高压反应釜中,加热至200℃并维持反应8h。反应结束后冷却至室温,磁分离,得到Fe3O4磁核,用乙醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅱ:取240mL乙醇、60mL去离子水、3mL浓氨水溶液(28wt%)和300mgFe3O4于三颈烧瓶中,超声30min使Fe3O4均匀分散在混合溶液中,机械搅拌下通过恒压漏斗缓慢滴加3mL硅酸四乙酯,滴完后室温搅拌6h。反应结束后,磁分离,得到Fe3O4@SiO2,并用乙醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅲ:取300mgFe3O4@SiO2于三颈烧瓶中,加入100mL无水甲苯,超声30min,抽真空-通氮气,循环3次除氧。氮气氛围下,加热至110℃,机械搅拌,待甲苯开始冷凝回流,从冷凝管上端加入3mL3-巯丙基三甲氧基硅烷和1mL吡啶,回流24h。反应结束后,磁分离,得到Fe3O4@SiO2-SH,用甲苯和无水乙醇分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅳ:取40mgAIBA、12mgCPA-DB、1gMBP、30mL甲醇-水(1:1,v/v)于三颈烧瓶中,超声溶解,加入100mgFe3O4@SiO2-SH,抽真空-通氮气,循环3次除氧。氮气氛围下,加热至55℃,机械搅拌反应1h。反应结束后,磁分离,得到MBP-MNPs,用甲醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
实施例3
产物Ⅰ:将2.7g FeCl3·6H2O超声溶解在80mL乙二醇中形成澄清溶液,加入7.2g无水乙酸钠和2g聚乙二醇10000,剧烈搅拌30min,形成橙红色溶液。将其密封在高压反应釜中,加热至200℃并维持反应8h。反应结束后冷却至室温,磁分离,得到Fe3O4磁核,用乙醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅱ:取240mL乙醇、60mL去离子水、3mL浓氨水溶液(28wt%)和300mgFe3O4于三颈烧瓶中,超声30min使Fe3O4均匀分散在混合溶液中,机械搅拌下通过恒压漏斗缓慢滴加3mL硅酸四乙酯,滴完后室温搅拌6h。反应结束后,磁分离,得到Fe3O4@SiO2,并用乙醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅲ:取300mgFe3O4@SiO2于三颈烧瓶中,加入100mL无水甲苯,超声30min,抽真空-通氮气,循环3次除氧。氮气氛围下,加热至110℃,机械搅拌,待甲苯开始冷凝回流,从冷凝管上端加入3mL3-巯丙基三甲氧基硅烷和1mL吡啶,回流24h。反应结束后,磁分离,得到Fe3O4@SiO2-SH,用甲苯和无水乙醇分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅳ:取40mgAIBA、12mgCPA-DB、1gMBP、30mL甲醇-水(1:1,v/v)于三颈烧瓶中,超声溶解,加入100mgFe3O4@SiO2-SH,抽真空-通氮气,循环3次除氧。氮气氛围下,加热至55℃,机械搅拌反应12h。反应结束后,磁分离,得到MBP-MNPs,用甲醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
实施例4
产物Ⅰ:将2.7g FeCl3·6H2O超声溶解在80mL乙二醇中形成澄清溶液,加入7.2g无水乙酸钠和2g聚乙二醇10000,剧烈搅拌30min,形成橙红色溶液。将其密封在高压反应釜中,加热至200℃并维持反应8h。反应结束后冷却至室温,磁分离,得到Fe3O4磁核,用乙醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅱ:取240mL乙醇、60mL去离子水、3mL浓氨水溶液(28wt%)和300mgFe3O4于三颈烧瓶中,超声30min使Fe3O4均匀分散在混合溶液中,机械搅拌下通过恒压漏斗缓慢滴加3mL硅酸四乙酯,滴完后室温搅拌6h。反应结束后,磁分离,得到Fe3O4@SiO2,并用乙醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅲ:取300mgFe3O4@SiO2于三颈烧瓶中,加入100mL无水甲苯,超声30min,抽真空-通氮气,循环3次除氧。氮气氛围下,加热至110℃,机械搅拌,待甲苯开始冷凝回流,从冷凝管上端加入3mL3-巯丙基三甲氧基硅烷和1mL吡啶,回流24h。反应结束后,磁分离,得到Fe3O4@SiO2-SH,用甲苯和无水乙醇分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅳ:取40mgAIBA、12mgCPA-DB、1gMBP、30mL甲醇-水(1:1,v/v)于三颈烧瓶中,超声溶解,加入200mgFe3O4@SiO2-SH,抽真空-通氮气,循环3次除氧。氮气氛围下,加热至55℃,机械搅拌反应1h。反应结束后,磁分离,得到MBP-MNPs,用甲醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
实施例5
产物Ⅰ:将2.7g FeCl3·6H2O超声溶解在80mL乙二醇中形成澄清溶液,加入7.2g无水乙酸钠和2g聚乙二醇10000,剧烈搅拌30min,形成橙红色溶液。将其密封在高压反应釜中,加热至200℃并维持反应8h。反应结束后冷却至室温,磁分离,得到Fe3O4磁核,用乙醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅱ:取240mL乙醇、60mL去离子水、3mL浓氨水溶液(28wt%)和300mgFe3O4于三颈烧瓶中,超声30min使Fe3O4均匀分散在混合溶液中,机械搅拌下通过恒压漏斗缓慢滴加3mL硅酸四乙酯,滴完后室温搅拌6h。反应结束后,磁分离,得到Fe3O4@SiO2,并用乙醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅲ:取300mgFe3O4@SiO2于三颈烧瓶中,加入100mL无水甲苯,超声30min,抽真空-通氮气,循环3次除氧。氮气氛围下,加热至110℃,机械搅拌,待甲苯开始冷凝回流,从冷凝管上端加入3mL3-巯丙基三甲氧基硅烷和1mL吡啶,回流24h。反应结束后,磁分离,得到Fe3O4@SiO2-SH,用甲苯和无水乙醇分别洗涤,50℃真空干燥24h。
产物Ⅳ:取40mgAIBA、12mgCPA-DB、500mgMBP、30mL甲醇-水(1:1,v/v)于三颈烧瓶中,超声溶解,加入100mgFe3O4@SiO2-SH,抽真空-通氮气,循环3次除氧。氮气氛围下,加热至55℃,机械搅拌反应1h。反应结束后,磁分离,得到MBP-MNPs,用甲醇和纯化水分别洗涤,50℃真空干燥24h。
测试实验
上述实施例1的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料在C-反应蛋白中纯化和检测的应用测试效果如下所述。
一、考察实施例1的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料对C-反应蛋白的特异选择性。
以C-反应蛋白、人血清白蛋白(HSA)、β-乳球蛋白(β-Lg)、肌红蛋白(MYO)为混合样品模型考察胆碱磷酸类复合磁性纳米材料的特异性识别能力。纯化条件为:
胆碱磷酸类复合磁性纳米材料:MBP-MNPs;
样品:0.1mg/mLC-反应蛋白、HSA、β-Lg、MYO混合蛋白溶液;
淋洗液:缓冲溶液A(组成为10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris),140mM氯化钠(NaCl),40mM氯化钙(CaCl2),0.025%吐温20,pH=8.0);
洗脱液:缓冲溶液B(组成为10mM三羟甲基氨基甲烷(Tris),140mM氯化钠(NaCl),10mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na),0.025%吐温20,pH=8.0);
纯化步骤:取1mgMBP-MNPs超声分散于200μL缓冲溶液A活化,磁分离。加入100μL混合蛋白混悬孵育1小时,磁分离。加入500μL淋洗缓冲液去除未结合的蛋白,磁分离,重复淋洗步骤3次。加入200μL缓冲溶液B洗脱C-反应蛋白,磁分离,重复洗脱步骤3次。
MBP-MNPs对混合蛋白的纯化结果(A)和回收率结果(B)如图4所示,杂蛋白在淋洗过程中被完全去除,洗脱液中仅有C-反应蛋白,这证明胆碱磷酸类复合磁性纳米材料对C-反应蛋白具有非常好的特异选择性。
二、将实施例1的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料用于实际生物样品中C-反应蛋白的纯化。
纯化条件为:
样品:A:炎症患者血清;B:肿瘤小鼠血清
淋洗液:缓冲溶液A;
洗脱液:缓冲溶液B;
纯化步骤:取1mgMBP-MNPs分散于200μL缓冲溶液A活化,磁分离。加入100μL炎症患者血清和肿瘤小鼠血清,混悬孵育1小时,磁分离。加入1mL缓冲溶液A去除未结合的蛋白,磁分离,重复淋洗步骤3次。加入200μL缓冲溶液B洗脱C-反应蛋白,磁分离,重复洗脱步骤3次。
MBP-MNPs对炎症患者血清(A)和肿瘤小鼠血清(B)的纯化结果如图5所示,洗脱液中仅含有C-反应蛋白,不含其他杂蛋白。这证明胆碱磷酸类复合磁性纳米材料能够用于实际样本的纯化。
三、将实施例1的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料用于C-反应蛋白的检测。
检测条件为:
样品:0.1、0.5、1、5、10、20、30、50nM C-反应蛋白溶液;
淋洗液:缓冲溶液A;
洗脱液:缓冲溶液B;
溶剂:缓冲溶液C(0.01M磷酸盐缓冲液,0.0027M氯化钾和0.137M氯化钠,pH=7.4);
检测体系:1μM C-反应蛋白适配体溶液(适配体序列为5’-CGA AGG GGA TTC GAGGGG TGA TTG CGT GCT CCA TTT GGT G-3’)和25μM硫磺素T溶液,溶剂为缓冲溶液C。
检测步骤:取1mg MBP-MNPs超声分散于1mL淋洗缓冲液活化,取100μL于离心管中,磁分离,加入50μL C-反应蛋白溶液,振荡孵育15min,磁分离。向磁珠加入20μL适配体溶液,振荡孵育15min,磁分离。取10μL分离出来的溶液加入至含有90μLThT溶液的384孔板中,在酶标仪中25℃振板孵育30min后进行荧光值测定。激发波长为425nm,发射波长为490nm,增益为80。
如图6所示,得到C-反应蛋白检测的线性范围在0.1~50nM,良好的线性范围证明胆碱磷酸类复合磁性纳米材料能够用于C-反应蛋白的检测。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种胆碱磷酸类复合磁性纳米材料的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、溶剂热法制备磁核,得到产物Ⅰ;
S2、在步骤S1得到的产物Ⅰ表面用Stober法包覆二氧化硅层,得到产物Ⅱ;
S3、在步骤S2得到的产物Ⅱ表面通过硅烷化试剂改性,得到产物Ⅲ;
S4、在所述产物Ⅲ表面通过巯基-烯烃聚合反应和可逆的加成-断裂链转移加成反应将胆碱磷酸类化合物单体接枝在磁性纳米材料表面,得到胆碱磷酸类复合磁性纳米材料;
所述胆碱磷酸类化合物单体的结构为式Ⅰ或式Ⅱ,式Ⅰ或式Ⅱ分子结构式如下:
Figure FDA0003789568410000011
其中,R1、R2独立的选自取代或非取代烷烃;R3为取代烷烃或磷酸基团进一步修饰的功能化基团;R4为H或者CH3
2.根据权利要求1所述的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料的制备方法,其特征在于,步骤S4具体为:将胆碱磷酸类化合物单体、引发剂、溶剂、可逆的加成-断裂链转移试剂、产物Ⅲ混合,然后超声并装入密闭容器,脱气后通氮气,在40~80℃温度下或紫外光照条件下聚合反应,得到所述产物Ⅳ,即胆碱磷酸类复合磁性纳米材料。
3.根据权利要求2所述的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料的制备方法,其特征在于,所述胆碱磷酸类单体化合物与引发剂的质量比为10:1~50:1;所述胆碱磷酸类单体化合物与产物Ⅲ的质量比为10:1~50:1;所述引发剂与可逆的加成-断裂链转移试剂的质量比为3:5~3:20;所述聚合时间为1~72小时。
4.根据权利要求1所述的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料的制备方法,其特征在于,所述引发剂为热引发剂2,2’-偶氮二异丁腈脒二盐酸盐或光引发剂安息香双甲醚,或偶氮二异丁腈、过氧化苯甲酰、过氧化双月桂酰中的任意一种;所述可逆的加成-断裂链转移试剂为4-氰基-4-(苯基碳基硫戊酸)、2-氰基-2-丙基苯并二硫、2-氰基-2-丙基-4-氰基苯二硫代碳酸酯、2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯酰中的任意一种;所述溶剂为正丙醇、正癸醇、异丙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、甲醇、环己醇、1,4-丁二醇、正十二醇或水中的至少一种。
5.一种根据权利要求1至4任一项所述的制备方法制备的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料,其特征在于,由内到外依次包括磁核、二氧化硅层、巯基二氧化硅层和胆碱磷酸类聚合物层。
6.根据权利要求5所述的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料,其特征在于,所述磁核为磁性纳米颗粒四氧化三铁磁核,粒径大小为50~800nm。
7.根据权利要求5所述的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料,其特征在于,所述二氧化硅层为四氧化三铁磁核外包覆二氧化硅,呈核壳结构,所述二氧化硅层的厚度为50~500nm。
8.根据权利要求5所述的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料,其特征在于,所述巯基二氧化硅层为二氧化硅表面通过巯基硅烷化试剂改性而成,所述巯基二氧化硅层的厚度为10~100nm。
9.根据权利要求5所述的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料,其特征在于,,所述胆碱磷酸类聚合物层为胆碱磷酸类化合物单体通过巯基-烯烃聚合反应和可逆的加成-断裂链转移加成反应接枝在磁性纳米材料表面得到,所述胆碱磷酸类聚合物层的厚度为50~800nm。
10.一种根据权利要求5至9任一项所述的胆碱磷酸类复合磁性纳米材料在C-反应蛋白纯化与检测中的应用。
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