CN102062760B - 一种脂肪组织中挥发性脂肪酸的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪脂肪组织中挥发性脂肪酸测定方法，包括以下步骤：A1：脂肪组织样品的皂化；A2：分离挥发性脂肪酸，使用同时蒸馏萃取装置从步骤A1得到的皂化产物中分离挥发性脂肪酸；A3：浓缩；A4：气相色谱分析。本发明在现有技术的基础上，结合同时蒸馏萃取和气相色谱技术，并且针对挥发性脂肪酸的特点在操作步骤上做出适当改进，省去了脂肪酸的提取环节，并将分离的挥发性脂肪酸直接进行气相色谱分析，没有衍生化，建立一套简单、快捷、经济的脂肪组织中挥发性脂肪酸的测定方法，为深入研究脂肪组织中挥发性脂肪酸奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种，尤其涉及一种脂肪组织中挥发性脂肪酸的测定方法。
背景技术
脂肪组织中挥发性脂肪酸对肉品在烹饪过程所产生的风味有重要作用，尤其对反刍动物肉品的作用更为突出。由于动物脂肪组织中挥发性脂肪酸具有含量低、挥发性强及操作难度大等特点，因此在国内对于动物脂肪组织中脂肪酸的研究，主要集中在长链脂肪酸范围内，而对挥发性脂肪酸的研究很少，对挥发性支链脂肪酸的研究几乎没有报道。国外的研究资料中针对挥发性脂肪酸的测定主要有两种方法：第一种方法是将脂肪组织加热至烹饪的温度，利用吹扫捕集装置对所有挥发性物质进行吸附，随之在较高温度下进行解吸附，解吸附后的挥发性物质通过特定管道进入气相色谱质谱联用仪(GC-MS)进行定性定量分析。第二种方法是将脂肪组织进行破碎，利用有机溶剂提取总脂肪酸，再对总脂肪酸进行皂化处理，依靠蒸馏的方法从总脂肪酸中分离出挥发性脂肪酸，然后对提取物进行浓缩、衍生化和气相色谱分离和质谱鉴定，从而进行定性定量分析。第一种方法，能够较好的模拟羊肉烹饪过程，但所产生的挥发性物质种类较为复杂，挥发性脂肪酸的没有完全挥发，因此，在定量方面只限于相对含量；第二种方法，可使挥发性脂肪酸的完全挥发，可以很好的进行定量研究，但目前，操作过程较为复杂，挥发性脂肪酸损失较大。
为了在我国开展对动物脂肪组织中挥发性脂肪酸的研究，需要结合自身的特点，建立一套简单、快捷、经济的挥发性脂肪酸测定方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一套简单、快捷、经济的脂肪组织中挥发性脂肪酸的测定方法。
一种脂肪脂肪组织中挥发性脂肪酸测定方法，包括以下步骤：A1：脂肪组织样品的皂化；A2：分离挥发性脂肪酸，使用同时蒸馏萃取装置从步骤A1得到的皂化产物中分离挥发性脂肪酸；A3：浓缩；A4：气相色谱分析。
所述的脂肪脂肪组织中挥发性脂肪酸测定方法，所述步骤A1具体执行以下操作：
(1)称取脂肪组织样品置于广口瓶中，加入相应量的2mol/L的NaOH溶液，即每1g脂肪组织相应加入1ml所述浓度的NaOH溶液。
(2)将脂肪组织样品与碱性溶液充分混匀，密封所述广口瓶的瓶口；
(3)将广口瓶置于105℃的烘箱中，放置2h，每隔30min摇晃一次；
(4)将广口瓶由烘箱取出，待温度降至室温后，用4mol/L的H2SO4调节pH值，直至溶液的呈酸性，备用。
所述的脂肪脂肪组织中挥发性脂肪酸测定方法，所述步骤A2具体执行以下操作：
(1)将所述广口瓶中经酸化过的溶液完全转移至样品烧瓶中，加入沸石；
(2)向150mL的萃取烧瓶中加入10mL乙醚，将两瓶分别与同时蒸馏萃取装置连接；
(3)向萃取室加入蒸馏水，直至有蒸馏水可回流至样品烧瓶，再向萃取室加入乙醚，直至有乙醚可回流至萃取烧瓶中。
(4)样品烧瓶和萃取烧瓶分别用控温电热套加热和恒温水浴锅加热，使之充分沸腾；
(5)使用冰水混合物对同时蒸馏萃取装置进行冷却。
(6)同时蒸馏萃取的时间为60min；
(7)达到蒸馏时间后，停止加热，待装置降至室温，将分离室和萃取烧瓶中乙醚浸提物收集于带有螺旋盖的离心管中；
(8)向上述离心管中加入0.2g左右的无水硫酸钠，置于冰箱中冷冻过夜。
所述的脂肪脂肪组织中挥发性脂肪酸测定方法，其特征在于，同时蒸馏萃取时间为60min。
所述的脂肪脂肪组织中挥发性脂肪酸测定方法，所述步骤A3具体执行以下操作：(1)将所述装有乙醚浸提物的离心管置于通风橱中，利用水浴加热至30℃；(2)使含有挥发性脂肪酸的乙醚缓慢挥发，最终总体为0.5mL，转移至1mL的离心管，密封，保存于的-20℃冰箱中，待气相分析。
所述的脂肪脂肪组织中挥发性脂肪酸测定方法，所述气象色谱分析参数为：在参数确定阶段所用色谱柱及气相条件为0V-225，50m×0.32mm×0.5μm；载气：氮气；燃气：氢气；空气助燃；进样模式：不分流；进样口温度：240℃；检测器温度：240℃；升温程序：60℃，维持5min，以4℃/min升至240℃，维持5min；进样量：1μL；在样品测定阶段，所用色谱柱及气相条件为DB-FFAP，30m×0.32mm×0.5μm；载气：氮气；氢气：燃气；空气助燃，进样模式：不分流，进样口温度240℃，检测器温度240℃；升温程序：60℃，维持5min，以4℃/min升至240℃，维持5min；采用手动进样，进样体积1μL。
本发明在现有技术的基础上，结合同时蒸馏萃取和气相色谱技术，并且针对挥发性脂肪酸的特点在操作步骤上做出适当改进，省去了脂肪酸的提取环节，并将分离的挥发性脂肪酸直接进行气相色谱分析，没有衍生化，建立一套简单、快捷、经济的脂肪组织中挥发性脂肪酸的测定方法，为深入研究脂肪组织中挥发性脂肪酸奠定基础。
附图说明
图1各挥发性脂肪酸酸标准品的色谱峰；1.乙酸，2.丁酸，3.3-甲基丁酸，4.戊酸，5.己酸，6.庚酸，7.辛酸，8.4-甲基辛酸，9.壬酸，10.4-甲基壬酸，11.2-乙基壬酸(内标)，12.癸酸，13.月桂酸；
图2绵羊脂肪组织中挥发性脂肪酸气相色谱图；1.丁酸，2.3-甲基丁酸，3.戊酸，4.己酸，5.庚酸，6.辛酸，7.4-甲基辛酸，8.壬酸，9.4-甲基壬酸，10.2-乙基壬酸(内标)，11.癸酸；
图3同时蒸馏萃取装置；A萃取室，B冷凝管，C分离室，D样品烧瓶，E萃取剂烧瓶，F阀。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样品
供试脂肪样品采自绵羊核心养殖区，选择10只周岁左右绵羊，每只绵羊采取腰部皮下脂肪组织200g，所有脂肪样品经绞肉机绞碎，充分均质化，铝箔纸包裹，保存于-20℃冰箱中，备用。
1.1.2主要仪器
配有氢火焰离子检测器(FID)的HP-6890气相色谱仪(美国惠普公司)；
HP6890-5973N气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)，美国惠普公司
101-2AB型电热鼓风干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司
HH-4型数显恒温水浴锅，国花电器有限公司
控温电热套，天津市泰斯特仪器有限公司
同时蒸馏萃取装置(自制，见图3)
JA500A电子天平，上海精天电子仪器有限公司
色谱柱：0V-225(50m×0.32mm×0.5μm膜厚)，中科院兰州化学物理研究所色谱技术研究开发中心；DB-FFAP(30m×0.32mm×0.5μm)，美国安捷伦公司。
1.1.3主要试剂
乙醚，浓硫酸，氢氧化钠和无水硫酸钠均为分析纯级试剂，购自天津市富宇精细化工有限公司。
2mol/L的NaOH溶液：称取80g NaOH，定容至1L。
4mol/L的H2SO4溶液：217.4mL浓硫酸，稀释至1L。
脂肪酸标准品：乙酸，丁酸，3-甲基丁酸，戊酸，己酸，更酸，辛酸，壬酸，癸酸，月桂酸购自上海晶纯世纪有限公司。
4-甲基辛酸、4-甲基壬酸，购自Sigma公司；
2-乙基壬酸，购自Narchem Corporation(美国芝加哥)；
1.2方法
1.2.1样品用量、蒸馏萃取时间、色谱柱及升温程序的确定
分别将50g，100g和150g脂肪组织样品进行60min蒸馏萃取，以确定最适脂肪组织样品的用量。100g脂肪组织样品分别进行30min，60min和90min蒸馏萃取，以确定最佳蒸馏时间。并对同一蒸馏样品用两种不同极性的色谱柱和两种升温程序进行分离比较，以筛选合适的色谱柱类型及升温程序。
1.2.2脂肪组织样品的皂化
(1)分别按要求称取不同质量脂肪组织样品置于500mL广口瓶中，加入相应量的2mol/L的NaOH溶液(50g组织样品加入50mL，100g组织样品加入100mL，150g组织样品加入150mL)。
(2)将脂肪样品与碱性溶液充分混匀，密封广口瓶的瓶口。
(3)将广口瓶置于105℃的烘箱中，放置2h，每隔30min摇晃一次。
(4)将广口瓶由烘箱取出，待温度降至室温后，用50mL 4mol/L的H2SO4调节pH值，直至溶液的呈酸性，备用。
1.2.3分离挥发性脂肪酸
对挥发性脂肪酸的分离，本实验采用乙醚作为萃取剂的同时蒸馏萃取装置(图7)。
(1)将上述广口瓶中经酸化过的溶液完全转移至500mL的样品瓶中，加入沸石。
(2)向150mL的萃取瓶中加入10mL乙醚，将两瓶分别与蒸馏萃取装置连接。
(3)向萃取室加入蒸馏水，直至有蒸馏水可回流至样品烧瓶，再向萃取室加入乙醚，直至有乙醚可回流至萃取烧瓶中。
(4)样品瓶和萃取瓶分别用控温电热套加热和恒温水浴锅加热，使之充分沸腾。
(5)使用冰水混合物对装置进行冷却。
(6)同时蒸馏萃取的时间，依照要求而定。
(7)达到蒸馏时间后，停止加热，待装置降至室温，将分离室和萃取瓶中乙醚浸提物收集于带有螺旋盖的离心管中。
(8)向上述离心管中加入0.2g左右的无水硫酸钠，置于冰箱中冷冻过夜。
1.2.4浓缩
(1)将上述装有乙醚浸提物的离心管置于通风橱中，利用水浴加热至30℃。
(2)使含有挥发性脂肪酸的乙醚缓慢挥发，最终总体大致为0.5mL，转移至1mL的离心管，密封，保存于的-20℃冰箱中，待气相分析。
1.2.5挥发性脂肪酸的气相色谱分析
在参数确定阶段所用色谱柱及气相条件为0V-225(50m×0.32mm×0.5μm)；载气：氮气；燃气：氢气；空气助燃；进样模式：不分流；进样口温度：240℃；检测器温度：240℃；升温程序：60℃，维持5min，以4℃/min升至240℃，维持5min；进样量：1μL。
在样品测定阶段，所用色谱柱及气相条件为DB-FFAP(30m×0.32mm×0.5μm)；载气：氮气；氢气：燃气；空气助燃，进样模式：不分流，进样口温度240℃，检测器温度240℃。升温程序：60℃，维持5min，以4℃/min升至240℃，维持5min。采用手动进样，进样体积1μL。
1.2.6挥发性脂肪酸的定性
在本实验中，对于挥发性脂肪酸的定性主要根据与各挥发性脂肪酸的标准品在同一色谱条件下的保留时间相比较对进行定性。当两者在保留时间相差较大时，利用HP6890-5973N气相色谱-质谱联用仪进行重新定性。质谱运行条件为：色谱柱：DB-FFAP(30m×0.32mm×0.5μm)；载气：氦气；流速：36.1cm/s；总流量16.8ml/min；进样口温度：250℃，进样口压力30.7kPa；分流比10∶1；升温程序：60℃，维持1min，4℃/min，直至240℃，维持5min；源温度：200℃；发射电流：150μA；电子能量：200eV；扫描质量：35-500amu；溶剂保留时间：6min。将各物质碎片与NIST数据库中的化合物相比对，选择匹配度最大的化合物。
1.2.7不同蒸馏时间回收率的测定
为了评价本方法的回收率，将各挥发性脂肪酸的标准品分别称量50mg与50mg 2-乙基壬酸混合溶解到100mL的乙醚溶液中。向四个广口瓶中分别加入100mL 2mol/LNaOH和1mL上述乙醚，然后，依照以上测定挥发性脂肪酸的方法进行分析，除蒸馏时间分别为15，30，45和60min外，其他步骤相同。
1.2.8挥发性脂肪酸校正系数的测定
各挥发性脂肪酸相对于内标物的校正系数的测定方法根据Yang和Choong(2001)(YangM H，Choong YM.A rapid gas chromatographic method fpr directdetermination of short-chain(C2-C 12)volatile organic acids in foods[J].Food chemistry，2001，75：101-108)所提供的方法。各挥发性脂肪酸包括丁酸、3-甲基丁酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、4-甲基辛酸、壬酸、4-甲基壬酸、癸酸和月桂酸分别以三种比例与2-乙基壬酸(内标)混合于乙醚之中，三种混合比例为2∶1，1∶1和1∶2。按照不同比例的混合物分别1mL乙醚按照上述脂肪酸分析的程序进行分离，并计算校正系数，其计算公式如下。
MCRVFA＝(WVFA*PAIS)/(WIS*PAVFA)
MCRVFA：VFA脂肪酸的校正系数 PAVFA：VFA峰面积
PAIS：内标物峰面积 WVFA：VFA质量
WIS：内标物重量
1.3数据处理与统计
各挥发性脂肪酸的峰面积利用气象色谱工作站平台自动积分处理所得。各挥发性脂肪酸的浓度根据以下公式计算：
CVFA(mg/kg)＝[(PAVFA)×(WIS)]/[(PAIS)×(WS)]×MCRVFA
CVFA：VFA的浓度 PAVFA：VFA的峰面积
WIS：内标物的重量 PAIS：内标物的峰面积
WS：样品重量 MCRVFA：VFA的校正系数
所有数据用EXCEL初步整理，利用SPSS16.0软件进行统计分析。
2结果与分析
2.1脂肪组织样品用量的选择
在对最佳脂肪组织样品的用量进行筛选时，对50g、100g和150g三种个样品用量进行蒸馏分离，其衡量指标主要有相对溶质峰面积、操作难易程度、色谱峰个数及分布情况。
表5-1不同质量样品的色谱峰总面积
注：相对溶质峰总面积＝溶质峰总面积/总峰面积*1000
在同一蒸馏萃取时间下，随着脂肪组织样品用量的增加，乙醚浸提物中挥发性物质的总含量也增大，具体体现在相对应的色谱峰的高度和峰面积都在增大。由于本实验的气相色谱仪器的进样方式为手动进样，因此很难确保每次进样量的体积大小完全一致，这会对单个峰面积产生影响，因此本试验采用相对溶质峰面积对乙醚浸提物中挥发性物质的总含量进行评估，以避免由于进样量体积的不同导致峰面积出现差异。不同样品用量的相对溶质峰面积如表5-1所示，150g样品质量的相对溶质峰面积大于100g样品，100g样品的相对溶质峰面积大于50g样品。但是，相对溶质峰面积的增幅有很大差异，样品质量由50g增加到100g，其相对溶质峰的面积增加幅度大于由100g到150g的增加幅度，说明在100g样品用量以上乙醚浸提物中挥发性物质含量增幅降低。在色谱峰的个数和分布方面，不同样品用量基本一致；在操作难易程度方面，150g脂肪组织的样品用量对于本试验装置操作难度大增，主要体现在易出现过度沸腾，致使试验分析失败。考虑总体因素，因此在以后的实验中脂肪组织样品用量确定为100g。
2.2同时蒸馏萃取时间的选择
在对最佳蒸馏萃取时间筛选方面，对100g脂肪样品，分别进行30min、60min和90min三个梯度的蒸馏萃取时间，其衡量指标主要有相对溶质峰面积、操作难易程度、色谱峰个数及分布情况。
表5-2不同蒸馏萃取时间的色谱峰总面积
相同脂肪组织样品用量分别在三个不同蒸馏萃取时间下存在一定区别，具体表现为：在30min蒸馏萃取时间下，获得挥发性物质种类较少，且多为一些含量大的物质，而在60min和90min蒸馏萃取时间下，获得挥发性物质种类较为丰富。造成这种现象主要是由于蒸馏萃取时间过短，一些含量较少的物质没有被完全被蒸馏萃取出所致。随着蒸馏萃取时间的延长，物质峰的数量开始增加，60min和90min物质峰的数量大于30min的蒸馏萃取。并且在大小方面随着蒸馏时间的延长，挥发性物质浓度的浓度也随着增加。但60min与90min之间差别不明显。在相对溶质峰面积方面，随着蒸馏时间的延长，其也在逐渐增大，但由30min到60min的增加幅度大于由60min到90min的增加幅度。这可能是对100g脂肪组织样品用量，60min的蒸馏萃取时间已经是大多数挥发性物质得到蒸馏萃取，再延长蒸馏萃取时间只能提高各物质的色谱峰的幅度，而不会出现新的物质峰。另外过长蒸馏萃取时间会导致萃取效率低下，有时还会产生副产物。
所以从以上的数据来看，60min是一个较为合理的蒸馏萃取时间。这既满足了试验精度上的要求，又保证了实验的效率。
2.3色谱柱选择
为了对气相色谱所用的色谱柱进行选择，本试验将弱极性性色谱柱Carbowax(25m×0.32mm×0.5μm)和中极性色谱柱0V-225对相同处理样品的分离。
结果表明，Carbowax色谱柱对化合物的分离效果差，而0V-225色谱柱对化合物的分离效果好，各挥发性物质基本能分离完全，出峰集中，峰形对称，并且大多数物质峰实现了基线分离。由此可以得到随着色谱柱极性的增强，对挥发性脂肪酸的分离能力也在随之增强。
2.4升温程序的选择
色谱定量的准确性和可靠性主要取决于色谱峰的有效分离，而化合物组分分离的程度与色谱柱的温度有密切关系。因为本实验所测得挥发性脂肪酸为多种酸的混合物，具有较宽的沸点范围，因此本实验比较了不同升温程序对分离效果的影响。
结果表明：在所考察的温度范围内，采用4℃/min的升温程序，蒸馏所得到的挥发性脂肪酸可实现较好分离；而采用10℃/min的升温程序，由于升温速度较快，挥发性脂肪酸无法完全分离。因此在以后实验中采用4℃/min的升温速率。
2.5挥发性脂肪酸回收率的测定
Ha和Lindsay(1990)研究指出对于挥发性脂肪酸的测定利用同时蒸馏萃取技术将其与含量丰富的非挥发性脂肪酸进行分离是必要的步骤，否则，溶剂溶解能力和色谱柱的过载问题会使试验分析失败。在蒸馏萃取过程中，最适的蒸馏萃取时间对于提高分析工作效率是非常重要的，因此，本实验对15min，30min，45min和60min分钟的蒸馏时间的回收率进行了评估。表3数据表明，在操作过程中挥发能力较强脂肪酸的损失量大于挥发能力较弱的脂肪酸，因此，挥发能力弱的脂肪酸的回收率大于挥发能力强的脂肪酸。随着蒸馏时间的延长，各脂肪酸的回收率都有所增加，但挥发性较弱脂肪酸增加的幅度大于挥发性较强脂肪酸。数据结果表明，蒸馏时间60min时，对于大部分挥发性脂肪酸的回收率大于其他蒸馏时间。
表3不同蒸馏萃取时间的挥发性脂肪酸的回收率
2.6挥发性脂肪酸校正系数测定
含有13种挥发性脂肪酸标准品的乙醚，经过气相色谱分离得到13个色谱峰，如图1所示，即为检测到13种挥发性脂肪酸。各挥发性脂肪酸在设定条件下，利用气相色谱得到很好的分离。
在设定条件下，挥发性脂肪酸的出峰时间依照其碳原子数由少到多，先后出峰；具有相同碳原子数的挥发性脂肪酸若带有支链，则其出峰时间比直链的提前，这是由于带有支链的挥发性脂肪酸与相应的直链脂肪酸相比，具有较大的挥发性。
表4各挥发性脂肪酸的校正因子和保留时间
注：a挥发性脂肪酸的校正系数是针对于2-乙基壬酸
b所使用的色谱柱为DB-FFAP(30.0m×0.33mm i.d.；0.53-μm膜厚)
c为内标物质
表4给出不同脂肪酸与内标物质在相同的条件下所测得校正系数。由于乙酸的挥发性较强，在操作过程中大部分损失掉，因此，在对浓缩的乙醚浸提物进行气相色谱中分离中没有检测到乙酸峰，在校正系数计算结果中同样没有关于乙酸的数值。总体来看，随着脂肪酸的碳原子增多，挥发性减弱，在操作过程中的损失也在减少，其校正系数逐渐减小。短链脂肪酸由于其挥发性较强，在蒸馏萃取时损失较多，因此，所得校正系数较大；而长链脂肪酸其挥发性较小，不容易损失，所得校正系数较小。
2.7绵羊脂肪组织中挥发性脂肪酸组成
将绵羊的脂肪组织按照上述方法进行分析，经与标准挥发性脂肪酸的保留时间相比较及气相质谱联用仪(GC-MS)的定性分析，如图2所示，确定在乙醚浸提物中含有丁酸、3-甲基丁酸、戊酸、己酸、4-甲基己酸、辛酸、4-甲基辛酸、壬酸、4-甲基壬酸、癸酸，其中由于乙酸的挥发性较强，在测定校正系数过程中损失很大，并且对羊肉膻味的形成贡献较小，因此，不做定量分析；对与十四酸、十五酸、十六酸及十八酸等长链脂肪酸，他们挥发性较弱，只有在蒸馏萃取时间较长时，使他们可部分的进入乙醚提取物中，本方法对它们的测定其准确性不如脂肪酸传统的分析方法，因此也不做定量分析。本研究定量分析的重点在C4到C10范围之内，这部分挥发性脂肪酸对羊肉膻味的形成有重要作用。
表5绵羊皮下脂肪组织中挥发性脂肪酸的重复测定
表5结果显示羊脂肪组织中各挥发性脂肪酸的含量及用此方法的重复性，在变异系数方面挥发性脂肪酸含量越少其变异系数越大，这可能由于本研究方法的系统误差比较恒定，含量越少的挥发性脂肪酸受到的影响越大，导致变异系数较大，总体上变异系数的变化范围有7％到14％，其中大部分集中在9％到12％之间，说明此方法对各种挥发性脂肪酸的测定其重复性较好。在本方法的检测灵敏度方面，本实验测定脂肪酸的最低含量为4.104mg/kg，现有研究资料结果显示，对羊肉膻味起主要作用的4-甲基辛酸在羊脂肪组织中的含量在均在10.000mg/kg以上，因此，本方法的灵敏度可以用以对形成羊肉膻味的脂肪酸进行研究。
3讨论
3.1关于测定方法的选择
目前对于挥发性脂肪酸的研究方法主要有两种：一是利用吹扫捕集方法，先加热脂肪组织，使其产生挥发性物质，然后在吹入惰性气体，不断将挥发性物质带入到吸附管中经吸附物吸附，接着加热吸附管进行解吸，使挥发性物质脱离吸附剂进入GC-MS，进行分离分析，此方法可以较好模拟脂肪组织的加热过程，获得的挥发性产物种类也较多，但是此方法对挥发性脂肪酸的定量研究存在难度，并且要求的仪器设备较为昂贵；二是利用蒸馏技术将挥发性脂肪酸与非挥发性脂肪酸先进行分离浓缩，再进行测定。具体操作为首先用提取剂将脂肪酸有脂肪组织中提取出，随后将脂肪酸进行皂化得到游离的脂肪酸，使用蒸馏装置对脂肪酸进行蒸馏，使得挥发性脂肪酸得到分离并进行浓缩，随后对挥发性脂肪酸进行衍生化处理和气相色谱分离分析，此方法专门针对挥发性脂肪酸进行分析，获得挥发性物质较少，但可对挥发性脂肪酸进行较为准确的定量分析，并且对所使用的仪器要求不高。
本发明是在第二种方法的基础上，做了两处创新，其一依据挥发性脂肪酸具有较强的挥发性，而衍生化过程主要是增加脂肪酸的挥发性的特点，删减了脂肪酸衍生化步骤对所提取挥发性脂肪酸进行研究，这样可以避免在衍生化过程中造成挥发性脂肪酸的损失。其二，通常第二种方法包括脂肪酸的提取步骤，在脂肪酸提取过程需要大量的氯仿及其它试剂，并且如果处理样品量较多，这步环节经常使得处理效率地下，同时氯仿的大量应用对操作人员健康构成威胁。因此，本方法将脂肪组织直接皂化，酸化后进行同时蒸馏萃取分离挥发性脂肪酸。这样做可能会引入其他挥发性物质干扰分离，故而对色谱柱和升温程序进行优化选择，以避免干扰现象出现。
3.2关于参数的优化
对于最佳样品用量的确定，需要依据主要检测物的浓度，仪器灵敏性以及操作的方便性等因素而定。本次实验初步选定50g，100g和150g作为备选方案。经过实验证实，50g的样品用量对于所用实验仪器性能来说，属于偏少用量，使得有些物质峰不明显。150g的样品量有相对较多，占具样品瓶大部分空间，使得样品在样品瓶中沸腾翻动不够充分，挥发性物质得不到充分分离；使用150g样品量使得萃取剂乙醚中挥发性物质浓度的增大，可导致在下一步浓缩过程中损失量增大；150g的样品量在操作上有较大难度，容易出现酸化不彻底，在加热过程中有爆沸现象出现，造成实验分析失败；最后较大的样品用量使得采样开展存在较大难度。对于100g样品用量，色谱图中物质峰的数量、形状都与150g无明显差别，且操作容易，工作量较少，不易爆沸，因此建议以后使用100g样品用量。由于本试验的进样采用手动进样，每次进样的速度以及进样量上存在一定差别，导致进入色谱柱的样品量不同，因此出现100g脂肪样品的总面积小于50g脂肪样品量。本实验采用相对溶质峰总面积来进行比较来筛选最适样品用量，从而避免由于进样量的不同而导致的差异。
对于样品的整流萃取时间，并不是时间越长越好。当样品中可挥发的物质被大部分被分离萃取后，再延长时间可使高沸点物质在乙醚浸提物中的含量增多，还可能使一些不稳定的物质发生分解，生成一些衍生物，从而造成分析的假象，如噻啶被认为是一种从不同肉中分离出来的风味活性物质，感官描述为烧牛肉香、烤虾香、肉香以及硫似气味。如Barbara Siegmund等(1997)以母鸡肉为原料通过一系列的试验显示噻啶并不是样品中原有的物质，而是在样品预处理时形成的物质。另外长时间的SDE，会使实验的效率下降，增大工作量。而过短时间的整馏萃取，会导致挥发性物质挥发不完全，进一步影响实验测定结果准确性。通过与30min和90min的蒸馏萃取时间相比较，60min的蒸馏萃取时间不论是实验效率方面还是挥发物的挥发程度上都是可选的。
在色谱柱的选择方面，脂肪组织经过皂化和酸化，分离出的大部分物质为脂肪酸类物质。脂肪酸属于极性较强的物质，而Carbowax色普柱为弱极性色谱柱，在对脂肪酸进行分离时，这类色谱柱对所分离的物质亲和力不强，因此，分离效果较差。0V-225色谱柱为中等极性的色谱，其对脂肪酸类物质有较强的亲和力，在分离时可使脂肪酸实现较好的分离。并由此推断，随着色谱柱极性的增强，其对脂肪酸的分离程度也逐渐变好。另外，色谱柱的长度也是影响分离效果的重要因素，因此，在实验条件允许的情况下，选择强极性、长度较长的色谱柱，以确保分离效果。
对于升温速率，若升温速度较快，使得各物质与在色谱柱中快速汽化，而在较短时间内通过色谱柱，这样有利于提高气相色谱使用效率，但是，较快的升温速度也使得各物质在色谱柱中的停留时间缩短，进而降低对各物质的分离效果。因此需要选择较合适的升温速度。
3.3关于操作环节
本实验借鉴国外相关文献报道实验的操作步骤，并根据挥发性脂肪酸的特点做出适当修改，所修改的环节主要集中在对脂肪酸的提取和衍生化技术环节上。在总挥发性脂肪酸的测定，国外研究方法主要利用氯仿和甲醇的混合溶液对总脂肪酸进行提取，然后皂化，再从总脂肪酸中分离挥发性脂肪酸，进而浓缩和衍生化。本实验直接将脂肪组织皂化、调节其pH使其为酸性溶液，使得脂肪酸为游离状态，然后从中分离挥发性脂肪酸，这可省去脂肪酸的提取过程的操作。在脂肪酸的衍生化方面，其作用主要是增加脂肪酸的挥发性和稳定性，而挥发性脂肪酸本身具有较强的挥发性，在气相色谱的进样口可完全气化，并且衍生化操作所带来的损失，可影响测定结果的准确性和重复性。因此，对于挥发性脂肪酸的测定可进行直接进样。
4小结
结果表明，脂肪组织样品用量100g，同时整馏时间60min萃取溶剂中所含有的萃取物浓度能够满足对挥发性脂肪酸研究的需要；在气相分离过程中，萃取物的分离度随着色谱柱固定相极性的增加而曾加，因此，建议对挥发性脂肪酸的气相色谱分离，应采用极性较强的色谱柱类型；对于分离过程中的温度控制，4℃/min的升温速率萃取物分离效果优于10℃/min的升温速率。应用所建立的方法对绵羊脂肪组织样品进行分析，结果表明本方法总体上变异系数的变化范围有7％到14％，其中大部分集中在9％到12％之间，挥发性脂肪酸的最检测量低含量为4.104mg/kg，基本上满足了对脂肪组织中挥发性的研究要求。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (3)
1.一种脂肪组织中挥发性脂肪酸测定方法，其特征在于，包括以下步骤：A1：脂肪组织样品的皂化；A2：分离挥发性脂肪酸，使用同时蒸馏萃取装置从步骤A1得到的皂化产物中分离挥发性脂肪酸；A3：浓缩；A4：气相色谱分析；
所述气相色谱分析参数为：在参数确定阶段所用气相条件，色谱柱为OV-225，50m×0.32mm×0.5μm；载气：氮气；燃气：氢气；空气助燃；进样模式：不分流；进样口温度：240℃；检测器温度：240℃；升温程序：60℃，维持5min，以4℃/min升至240℃，维持5min；进样量：1μL；在样品测定阶段，所用气相条件，色谱柱为DB-FFAP，30m×0.32mm×0.5μm；载气：氮气；燃气：氢气；空气助燃，进样模式：不分流，进样口温度240℃，检测器温度240℃；升温程序：60℃，维持5min，以4℃/min升至240℃，维持5min；采用手动进样，进样体积1μL；
所述步骤A1具体执行以下操作：
(1)称取脂肪组织样品置于广口瓶中，加入相应量的2mol/L的NaOH溶液，即每1g脂肪组织相应加入1ml所述浓度的NaOH溶液；
(2)将脂肪组织样品与碱性溶液充分混匀，密封所述广口瓶的瓶口；
(3)将广口瓶置于105℃的烘箱中，放置2h，每隔30min摇晃一次；
(4)将广口瓶由烘箱取出，待温度降至室温后，用4mol/L的H2SO4调节pH值，直至溶液的呈酸性，备用；
所述步骤A2具体执行以下操作：
(1)将所述广口瓶中经酸化过的溶液完全转移至样品烧瓶中，加入沸石；
(2)向150mL的萃取烧瓶中加入10mL乙醚，将两瓶分别与同时蒸馏萃取装置连接；
(3)向萃取室加入蒸馏水，直至有蒸馏水可回流至样品烧瓶，再向萃取室加入乙醚，直至有乙醚可回流至萃取烧瓶中；
(4)样品烧瓶和萃取烧瓶分别用控温电热套加热和恒温水浴锅加热，使之充分沸腾；
(5)使用冰水混合物对同时蒸馏萃取装置进行冷却。
(6)同时蒸馏萃取的时间为30-90min；
(7)达到蒸馏时间后，停止加热，待装置降至室温，将分离室和萃取烧瓶中乙醚 浸提物收集于带有螺旋盖的离心管中；
(8)向上述离心管中加入0.2g左右的无水硫酸钠，置于冰箱中冷冻过夜。
2.根据权利要求1所述的脂肪脂肪组织中挥发性脂肪酸测定方法，其特征在于，同时蒸馏萃取时间为60min。
3.根据权利要求1所述的脂肪脂肪组织中挥发性脂肪酸测定方法，其特征在于，所述步骤A3具体执行以下操作：(1)将所述装有乙醚浸提物的离心管置于通风橱中，利用水浴加热至30℃；(2)使含有挥发性脂肪酸的乙醚缓慢挥发，最终总体为0.5mL，转移至1mL的离心管，密封，保存于的-20℃冰箱中，待气相色谱分析。
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