CN104931379A - 一种检测红参中非挥发脂溶性成分含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测注射用制剂原料红参中非挥发脂溶性成分含量的方法，所述方法包括，将红参药材粉碎，过筛，加石油醚或乙醚或二氯甲烷或氯仿，回流提取，提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

Description

一种检测红参中非挥发脂溶性成分含量的方法

技术领域

本发明涉及一种中药材中药物成分的检测方法，特别涉及一种检测红参中非挥发脂溶性成分含量的方法。

背景技术

红参为五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Mey.）经蒸制后的干燥根和根茎，其味甘，微苦，性温，归脾、肺、心经，具大补元气，复脉固脱，益气摄血功效（国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:中国医药科技出版社,2010:8,143）。红参的成分较为复杂，其主要成分均为皂苷类、氨基酸类、挥发油类、无机元素类和脂肪酸类等（文献：郭秀丽.人参化学成分和药理研究进展[J].中医临床研究,2012,04(14):26-27；杨秀伟.红参化学、药理和临床研究进展[J].中成药研究,1984(05):30-33）。

目前，关于红参药材的鉴别以及分析红参中化学成分的研究比较多。（文献：王钢力,聂黎行,张继,梁锡猛,徐纪民,林瑞超.应用近红外光谱技术鉴别红参药材[J].中草药,2008,39(3):438-439；杨海雷,刘雪松,瞿海斌,程翼宇.一种基于近红外的红参药材质量快速评价方法[J].中草药,2005,36(6):912-915；刘丹，濮社班，钱士辉，张静岩.中国红参化学成分的研究[J].中国中药杂志，2011,36（4）：462-464）关于人参脂溶性成分的研究也有很多报道，主要包括脂肪酸和酯、挥发油（文献：魏建华,徐涛,曹立军,赵花,赵锐.超临界CO2萃取人参脂溶性成分的GC-MS分析[J].人参研究,2012,04:19-22）。张宏桂、杨艳辉等用甲醇和乙醚提取人参中脂肪酸成分主要亚油酸和油酸等不饱和脂肪酸（文献：杨艳辉,杨兴斌,王燕,等.人参脂肪酸和挥发油成分的GC-MS分析[J].陕西师范大学学报(自然科学版),2007(01):77-81；张宏桂,阎吉昌,吴广宣,等.长白人参中脂肪酸成分的研究[J].白求恩医科大学学报,1994,20(4):365），阎吉昌等采用GC-MS联用技术鉴定了人参中的挥发油发现萜烯类成分较多（文献：阎吉昌.人参挥发油的提取和分析[J].分析测试学报,1994(03):46-50）。鲁歧发现人参加工品种经加热处理，亚油酸含量呈上升趋势（文献：鲁歧,富力,李向高,等.人参属植物及人参不同加工品种中脂肪酸成分的研究[J].吉林农业大学学报,1993(04):52-53+107）。

红参中非挥发脂溶性成分通常不易除去，通过提取、干燥后进入加工产品及其相关制剂中。采用红参药材加工非注射用制剂，无论是对于红参药材的筛选还是在加工过程中的质量控制，非挥发脂溶性成分对非注射用制剂的质量和临床应用的安全性影响并不大。如果红参药材作为注射用制剂的原料，在红参药材的采购和加工过程中就必须考虑到非挥发脂溶性成分的影响，而关于红参中非挥发脂溶性物质总体含量测定的研究未见报道，因此本发明通过一系列的摸索实验，找到了一种对红参中非挥发脂溶性成分进行含量检测的简单有效的方法。该方法可作为药材质量检测指标，采购红参药材时，检测红参药材中非挥发脂溶性物质含量，根据实际需要，确定相应标准，确保后续加工产品质量稳定及提高临床使用安全性；该方法也可作为红参加工时质量控制指标，根据需要，优化红参加工方法，减少非挥发脂溶性物质含量。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于加工注射用制剂的红参中非挥发脂溶性成分含量测定的方法，用于红参药材的采购和加工时的质量检测。

本发明所述含量测定方法，步骤如下：

将红参药材粉碎，过筛，加有机溶剂，回流提取，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重（得红参中脂溶性成分的重量），以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

其中过筛优选过2-4号筛，优选4号筛；

有机溶剂添加量优选8-16倍量，更优选10-14倍量，最优选12倍量；

回流提取优选：3-5次，每次1-3小时，更优选回流提取4次，每次2小时。

优选的测定方法为：将红参药材粉碎，过2-4号筛，加8-16倍量的有机溶剂，回流提取3-5次，每次1-3小时，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

较优选的测定方法为：将红参药材粉碎，过4号筛，加10-14倍量的有机溶剂，回流提取3-5次，每次2小时，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

更优选的测定方法为：将红参药材粉碎，过4号筛，加10-14倍量的有机溶剂，回流提取4次，每次2小时，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

最优选的测定方法为：将红参药材粉碎，过4号筛，加12倍量的有机溶剂，回流提取4次，每次2小时，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

以上所述有机溶剂选自：石油醚，乙醚，二氯甲烷或氯仿；优选氯仿。

测定方法的详细步骤为：将红参药材粉碎，过4号筛，称取5g，加11-13倍量的氯仿，回流提取3-5次，每次2小时。提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

优选：将红参药材粉碎，过4号筛，称取5g，加12倍量的氯仿，回流提取4次，每次2小时。提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

上述红参中脂溶性成分的含量=红参中脂溶性成分的重量/红参药材重量×100%。

本发明的方法是经过筛选获得的，筛选实验如下：

1、材料

1.1材料

红参，购于吉林省长白县，为6年生鲜参加工而成。

1.2仪器及试剂

BUCHI R-215型旋转蒸发仪；电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；电热恒温干燥箱（天津市天宇实验仪器有限公司制造）；METTLER TOLEDO AL-204万分之一电子天平。石油醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿均为分析纯。

2、方法与结果

2.1药材粗细的选择

将同一批号的红参药材粉碎，分别过1号筛（10目）、2号筛（24目）、3号筛（50目）、4号筛（65目）。称取过筛后的药材粉末各5g，加入氯仿10mL，没过药材表面，密闭，室温静置48h，溶液过滤，水浴挥干，放入烘箱内干燥至恒重，称重。平行两次实验，实验结果见表1：

表1药材粗细对非挥发脂溶性成分溶出度的影响

由以上实验结果明显看出，过4号筛红参药材非挥发性脂溶性成分溶出率最高，所以本实验选用过4号筛粉末。

2.2提取溶剂的选择

将红参药材粉碎，过4号筛。称取药材粉末4份，每份5g，分别加入石油醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿各10mL，使其没过药材表面，密闭，室温静置24h，溶液过滤，水浴挥干，放入烘箱内干燥至恒重，称重。按上述方法做两次平行实验，实验结果见表2：

表2溶剂对非挥发脂溶性成分溶出度的影响

由以上结果明显看出：氯仿提取效果最好，可选为红参非挥发脂溶性成分提取的最佳提取溶剂。

2.3提取方法的选择

将红参药材粉碎，过4号筛。称取药材粉末3份，每份5g，加入100ml氯仿，分别采用超声、回流、索氏提取1h，过滤，滤液水浴挥干，放入烘箱中干燥至恒重，称重。每种提取方法做两次平行实验，实验结果见表3：

表3不同提取方法的比较

由以上结果明显看出：通过实验结果可得出采用回流提取红参，所得脂溶性成分含量最多，超声提取红参所得脂溶性成分含量最少。故本试验选用回流提取方法。

2.4、正交试验建立最佳提取方法

为进一步优化红参中脂溶性物质提取方法，采用正交试验，以提取溶剂用量（倍）、提取时间（h）、提取次数为因素进行考察，设计L₉（3）⁴正交表，见表4：

表4因素水平表

通过正交实验得出的结果，如表5所示，极差分析表见表6，方差分析表见表7

表5正交实验结果

表6直观分析表

表7方差分析表

经直观分析和方差分析得出，影响提取效率的主次因素是：提取次数>溶剂用量>提取时间；其中提取次数有显著性影响，提取溶媒用量和提取时间无显著性影响。优选的最佳提取方案是A3B2C3，即12倍量溶剂，提取4次，每次2小时。

2.5验证实验

正交实验结果显示，影响提取效率的主次因素是：提取次数>溶剂用量>提取时间。最佳提取方案是A3B2C3，即12倍量溶剂，提取4次，每次2小时。取同一批红参药材粉末，按上述优化条件做3组平行验证实验。实验结果见表8：

表8验证实验结果

验证实验结果均高于正交试验中最大值即第7组实验结果，且结果稳定。

2.6红参药材中非挥发脂溶性含量测定

为验证不同批次的红参药材和红参药材的不同部位中非挥发脂溶性成分含量的差异性，选用不同批次的红参药材20批：其中十批为红参饮片（去芦、去须的红参主根），六批为全参，后四批为芦头，参须，参表皮，参芯（参表皮和参芯是从主根部分机械分离得到）。根据前述最佳提取方案A3B2C3，将红参药材粉碎，过4号筛，分别称取5g，加12倍量氯仿（实际应用中也可以使用8-16倍量的石油醚或乙醚或二氯甲烷或氯仿，12倍量氯仿为最优方案），回流提取4次，每次2小时。提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。依上述实验方法平行2次。

2.6.1红参药材20批水分测定，结果见表9。

按照2010版《中国药典》附录IX H水分测定法进行测定。

2.6.2实验结果

20批红参药材非挥发性脂溶性成分含量测定结果见表9：

表9样品测定结果

人参中脂溶性物质主要是脂肪酸和挥发油，试验结果显示不同部位含量的高低顺序是芦头>参须>全参>主根，参表皮>参芯。参须和芦头的脂溶性成分含量均高于主根，提示应用该部分时应予以相应考虑。

3、红参药材不同部位安全性考察

参照2010年版《中国药典》一部附录XIXM过敏反应检查法。采用全身主动过敏实验观察高低剂量各组样品产生过敏反应的情况。方法系将一定量的供试品腹腔注射入豚鼠体内致敏，间隔一定时间后静脉注射供试品进行激发，观察豚鼠出现过敏反应的情况，以此判定供试品是否产生过敏反应。如供试品含有过敏反应物质，临床用药时可能使患者致敏状态或产生严重过敏反应。

3.1实验动物

健康成年豚鼠66只，体重350～420g左右。

3.2实验分组

样品组每组各3只。阳性对照组、阴性对照组每组3只。

3.3实验用药

样品组为上述2.6的20组样品(即红参药材用氯仿提取后的提取物)，选用0.5%羧甲基纤维素钠溶液为溶剂溶解；阳性对照组为13.64mg/ml牛血清白蛋白溶液；阴性对照组为0.5%羧甲基纤维素钠溶液。

3.4给药方法

采用腹腔注射给药，注射速度一般为0.2ml/s。

致敏给药：样品组隔日每只每次分别腹腔注射供试品溶液1.0mL，阳性对照组隔日每只每次腹腔注射牛血清白蛋白1.0mL，阴性对照组隔日每只每次腹腔注射羧甲基纤维素钠1.0mL，共进行5次给药。

激发给药：末次给药后第14日静脉注射致敏剂量的2倍量（如阳性对照组每只2.0ml）对各组动物进行快速攻击，观察静脉注射后30分钟内出现的症状。

3.5实验观察方法

致敏期间每日观察每只动物的症状，静脉激发注射后立刻持续观察30分钟，最长观察3小时，记录过敏反应现象。

3.6实验结果

参照2010年版《中国药典》一部附录ⅩⅧG结果判定标准，实验结果见表10。

表10激发后豚鼠表现

“+”表示出现过敏反应“-”表示未出现过敏反应

通过对20批红参药材做豚鼠全身主动过敏实验。结果得出，参须和芦头部位的脂溶性成分的含量较高，致敏作用明显，全参中脂溶性成分的含量比主根部位的含量普遍高一点，豚鼠的过敏反应出现的几率也相应增大。

3.6结论

通过豚鼠全身过敏反应实验结果可以判定，当红参药材中非挥发脂溶性成分含量<1.40%时，采用红参药材作为注射用制剂的原料比较安全。

本发明的有益效果如下：

红参药材作为注射用制剂的原料时，本发明所述方法在不需要明确成分的情况下，可以作为检测红参中非挥发脂溶性成分含量的一种简单快速有效的方法。该方法可作为采购红参药材时的药材质量检测指标；该方法也可作为红参加工时质量控制指标，根据需要，优化红参加工方法，减少非挥发脂溶性物质含量。

具体实施方式

实施例1

取批号为20120302红参药材粉碎，过4号筛，分别取5g，加12倍量氯仿，回流提取4次，每次2小时。提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。依上述方法平行2次，结果见表11：

表11样品测定结果

实施例2

用实施例1相同方法测定红参不同部位的有关成分含量，结果如下表：

表12

实施例3

用实施例1相同方法，提取溶剂变更后，脂溶性成分含量，结果如下表：

表13

实施例4

取红参药材粉碎，过2号筛，分别取5g，加12倍量氯仿，回流提取4次，每次2小时。提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

实施例5

取红参药材粉碎，过4号筛，分别取5g，加16倍量氯仿，回流提取4次，每次3小时。提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

实施例6

取红参药材粉碎，过3号筛，分别取5g，加12倍量氯仿，回流提取4次，每次1小时。提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

实施例7

取红参药材粉碎，过4号筛，分别取5g，加8倍量氯仿，回流提取5次，每次2小时。提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

实施例8

取红参药材粉碎，过4号筛，分别取5g，加12倍量氯仿，回流提取3次，每次2小时。提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

实施例9

将红参药材粉碎，过4号筛，加10倍量的石油醚，回流提取5次，每次2小时，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

实施例10

将红参药材粉碎，过4号筛，加14倍量的乙醚，回流提取3次，每次2小时，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

实施例11

将红参药材粉碎，过4号筛，加12倍量的二氯甲烷，回流提取4次，每次2小时，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

实施例12

将红参药材粉碎，过4号筛，称取5g，加11倍量的氯仿，回流提取3次，每次2小时。提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

实施例13

将红参药材粉碎，过2号筛，加14倍量的乙醚，回流提取3次，每次2小时，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

实施例14

将红参药材粉碎，过4号筛，称取5g，加13倍量的氯仿，回流提取5次，每次2小时。提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

实施例15

将红参药材粉碎，过4号筛，称取5g，加12倍量的氯仿，回流提取4次，每次2小时。提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

Claims (10)

1.一种红参中非挥发脂溶性成分含量测定方法，所述方法，步骤如下：

将红参药材粉碎，过筛，加有机溶剂，提取，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：

将红参药材粉碎，过2-4号筛，加有机溶剂，回流提取，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：

将红参药材粉碎，过2-4号筛，加8-16倍量的有机溶剂，回流提取3-5次，每次1-3小时，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：

将红参药材粉碎，过4号筛，加10-14倍量的有机溶剂，回流提取3-5次，每次2小时，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：

将红参药材粉碎，过4号筛，加10-14倍量的有机溶剂，回流提取4次，每次2小时，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

6.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：

将红参药材粉碎，过4号筛，加12倍量的有机溶剂，回流提取4次，每次2小时，提取液减压浓缩至干，干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法，其中所述有机溶剂选自：石油醚，乙醚，二氯甲烷或氯仿。

8.根据权利要求7的方法，其特征在于，所述方法，其中所述有机溶剂选自：氯仿。

9.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：

将红参药材粉碎，过4号筛，称取5g，加11-13倍量的氯仿，回流提取3-5次，每次2小时，提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。

10.根据权利要求9的方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：

将红参药材粉碎，过4号筛，称取5g，加12倍量的氯仿，回流提取4次，每次2小时，提取液减压浓缩至干，放入烘箱干燥至恒重，以干品计算红参中脂溶性成分的含量。