CN110161162A - 一种莱菔子代谢组学分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种莱菔子代谢组学分析方法。本发明采用液质联用技术对样品进行分析，本发明利用水、甲酸、乙腈为流动相，采用正负离子模式对样品进行检测，经液质联用分析出代谢标志物，由此可对莱菔子治疗高血压的机制进行深入探讨。
Description
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种莱菔子代谢组学分析方法，尤其是一种基于液-质联用技术的莱菔子代谢组学分析方法。
背景技术
代谢组学是将某一生物体或生物系统在一特定的生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门学科。代谢组学可以检测到导致疾病发生过程中细微改变的内源性代谢物，分析差异代谢物的作用和参与的代谢通路，发现特异性代谢通路，从而发现中医证候的内在机制。
代谢组学研究所采用的分析方法主要有核磁共振法、液-质联用法、气-质联用法等。液-质联用法定性定量能力强，适用范围广，已成为代谢组学研究的最重要分析方法之一。目前尚未有对莱菔子采用液质联用技术进行代谢组学分析的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种莱菔子代谢组学分析方法，本发明采用液质联用技术对样品进行分析，利用该法可以确定出莱菔子降血压过程中的代谢标志物。
其具体步骤为：
(1)莱菔子水煎液的制备：将莱菔子用高速粉碎机粉碎后，用中国药典3号筛过筛。称取过筛后的莱菔子粉90.00g，加蒸馏水浸泡20min，于红外炉上加热至沸后保持微沸20min，过滤，将滤渣放入蒸馏水中，继续加热至沸后，保持微沸20min，过滤。将两次滤液合并后用容量瓶定容至200mL。
(2)实验动物的选择：将20只SPF级自发性高血压大鼠(SHR)适应性饲养1周后，随机分为给药组和模型组，每组10只。将每只大鼠称体重后，按10mL·kg-1的量对模型组灌服莱菔子水煎液，连续给药6周，同时模型组大鼠给予同等剂量的蒸馏水，其余饲养条件相同。
(3)血清样本的收集：莱菔子水煎液连续干预6周后，采用吸入乙醚麻醉的方式，眼眶取血，注入不抗凝EP管中，静置30min，4000rmp·min-1离心10min，取上清液。将所得血清置于-80℃冰箱保存备用。
(4)样品的处理：取备用血清，于4℃解冻，摇匀，精密吸取血清100μL，加入预冷高效液相色谱用甲醇300μL，涡旋1min后以12000r·min-1的速度离心10min，吸取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤于液相小瓶中，-20℃保存备用。
(5)色谱质谱条件的确定：使用Thermo Scientific公司的UltiMate 3000超高效液相色谱仪，T Halo-C18色谱柱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)。流动相A为水(含0.05％甲酸)，B为乙腈(含0.05％甲酸)，流动相流速经实验确定为0.30mL·min-1，柱温45℃，进样器温度为15℃，进样量为5μL。采用梯度洗脱的方式进行分离：0～1min，2％～2％B；1～3min，2％～20％B；3～4min，20％～20％B；4～7min，20％～40％B；7～9min，40％～70％B；9～15min，70％～98％B，其余为A。
质谱仪为Thermo Scientific公司的四级杆-静电场轨道阱超高分辨质谱仪(QExactiveTMhybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer)。采用正负离子模式对样品进行检测。正离子模式检测条件为：HESI离子源，鞘气45arb，辅助气10arb，裂解电压3.5KV，源内温度300℃，S-Lens RF Level为55，质谱采集范围为80-1000m/z，分辨率为70000。负离子模式检测条件为：HESI离子源，鞘气40arb，辅助气10arb，裂解电压为2.8KV，源内温度为320℃，S-Lens RF Level为55，质谱采集范围为80-1000m/z，分辨率为70000。
(6)代谢标志物的发现：借助Thermo Scientific公司的Compound Discoverer2.1软件，通过p-value和fold change值进行代谢标志物的初选，再结合mzCloud matchscore确定代谢标志物。筛选p-value<0.05，log2(fold change)>0.59的化合物作为初选的代谢标志物。
初步确定的莱菔子水煎液治疗高血压的代谢标志物为：
本发明采用甲醇沉淀血清样品中的蛋白质，采用mzcloud数据库定性鉴定质谱采集的所有代谢物。该方法的建立为从代谢组学角度研究莱菔子治疗高血压的机制提供了重要参考。
附图说明
图1为模型组血清样品经质谱分析后得到的总离子流图(负离子模式)；
图2为模型组血清样品经质谱分析后得到的总离子流图(正离子模式)；
图3为给药组血清样品经质谱分析后得到的总离子流图(负离子模式)；
图4为给药组血清样品经质谱分析后得到的总离子流图(正离子模式)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1莱菔子煎煮液治疗高血压的代谢组学研究。
采用以下方法制备莱菔子煎煮液。
将莱菔子用高速粉碎机粉碎后，用中国药典3号筛过筛。称取过筛后的莱菔子粉90.00g，加蒸馏水浸泡20min，于红外炉上加热至沸后保持微沸20min，过滤，将滤渣放入蒸馏水中，继续加热至沸后，保持微沸20min，过滤。将两次滤液合并后用容量瓶定容至200mL。
采用以下方法确定治疗效果。
将20只SPF级自发性高血压大鼠(SHR)适应性饲养1周后，随机分为给药组和模型组，每组10只。将每只大鼠称体重后，按10mL·kg-1的量对模型组灌服莱菔子水煎液，连续给药6周，同时模型组大鼠给予同等剂量的蒸馏水，其余饲养条件相同。给药6周后，分别测量给药组和模型组大鼠安静状态下的尾动脉血压，确定治疗效果。
采用以下方法采集血清样品。
水煎液连续干预6周后，采用乙醚吸入麻醉的方式，眼眶取血，注入不抗凝EP管中，静置30min，4000rmp·min-1离心10min，取上清液。将所得血清置于-80℃冰箱保存备用。
采用以下方法处理样品。
取备用血清，于4℃解冻，摇匀，精密吸取血清100μL，加入预冷高效液相色谱用甲醇300μL，涡旋1min后以12000r·min-1的速度离心10min，吸取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤于液相小瓶中，-20℃保存备用。
最终色谱、质谱条件的确定。
色谱质谱条件的确定：使用Thermo Scientific公司的UltiMate 3000超高效液相色谱仪，T Halo-C18色谱柱柱(2.1mm×100mm，2.7μm)。流动相A为水(含0.05％甲酸)，B为乙腈(含0.05％甲酸)，流动相流速经实验确定为0.30mL·min-1，柱温45℃，进样器温度为15℃，进样量为5μL。采用梯度洗脱的方式进行分离：0～1min，2％～2％B；1～3min，2％～20％B；3～4min，20％～20％B；4～7min，20％～40％B；7～9min，40％～70％B；9～15min，70％～98％B。
质谱仪为Thermo Scientific公司的四级杆-静电场轨道阱超高分辨质谱仪(QExactiveTMhybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer)。采用正负离子模式对样品进行检测。正离子模式检测条件为：HESI离子源，鞘气45arb，辅助气10arb，裂解电压3.5KV，源内温度300℃，S-Lens RF Level为55，质谱采集范围为80-1000m/z，分辨率为70000。负离子模式检测条件为：HESI离子源，鞘气40arb，辅助气10arb，裂解电压为2.8KV，源内温度为320℃，S-Lens RF Level为55，质谱采集范围为80-1000m/z，分辨率为70000。
代谢标志物的确定。
借助Thermo Scientific公司的Compound Discoverer 2.1软件，通过p-value和fold change值进行代谢标志物的初选，再结合mzCloud match score确定代谢标志物。筛选p-value<0.05，log2(fold change)>0.59的化合物作为初选的代谢标志物。
初步确定的莱菔子水煎液治疗高血压的代谢标志物为：
Claims (7)
1.一种莱菔子代谢组学分析方法，其特征在于，采用液质联用技术对样品进行测定分析，具体步骤为：
色谱质谱条件的确定：使用Thermo Scientific公司的UltiMate 3000超高效液相色谱仪，T Halo-C18色谱柱柱：2.1mm×100mm，2.7μm，流动相A为水(含0.05％甲酸)，B为乙腈(含0.05％甲酸)，流速为0.30mL·min-1，柱温45℃，进样器温度为15℃，进样量为5μL；采用梯度洗脱的方式进行分离：0～1min，2％～2％B；1～3min，2％～20％B；3～4min，20％～20％B；4～7min，20％～40％B；7～9min，40％～70％B；9～15min，70％～98％B，其余为A；
质谱仪为Thermo Scientific公司的四级杆-静电场轨道阱超高分辨质谱仪；采用正负离子模式对样品进行检测；正离子模式检测条件为：HESI离子源，鞘气45arb，辅助气10arb，裂解电压3.5KV，源内温度300℃，S-Lens RF Level为55，质谱采集范围为80-1000m/z，分辨率为70000；负离子模式检测条件为：HESI离子源，鞘气40arb，辅助气10arb，裂解电压为2.8KV，源内温度为320℃，S-Lens RF Level为55，质谱采集范围为80-1000m/z，分辨率为70000；
代谢标志物的发现：借助Thermo Scientific公司的Compound Discoverer 2.1软件，通过p-value和fold change值进行代谢标志物的初选，再结合mzCloud match score确定代谢标志物。
2.根据权利要求1所述的一种莱菔子代谢组学分析方法，其特征在于，样品采用以下步骤获得：
(1)莱菔子水煎液的制备：称取过筛后的莱菔子粉90.00g，加蒸馏水浸泡20-30min，加热至沸后保持微沸20-25min，过滤，得滤液和滤渣；将滤渣再次放入蒸馏水中，继续加热至沸后，保持微沸20-25min，过滤，得滤液和滤渣；将两次滤液合并后用容量瓶定容至200mL；
(2)实验动物的选择：将20只SPF级自发性高血压大鼠适应性饲养1周后，随机分为给药组和模型组，每组10只；将每只大鼠称体重后，按10mL·kg-1的量对给药组灌服莱菔子水煎液，连续给药6周，同时模型组大鼠给予同等剂量的蒸馏水，其余饲养条件相同；
(3)血清样本的收集：莱菔子水煎液连续干预6周后，分别对给药组和模型组大鼠眼眶取血，注入不抗凝EP管中，静置，离心，取上清液；将所得血清保存备用；
(4)样品的处理：取备用血清，解冻，摇匀，精密吸取血清100μL，加入预冷高效液相色谱用甲醇300μL，涡旋，离心，吸取上清液，微孔滤膜过滤于液相小瓶中，作为样品保存备用。
3.根据权利要求2所述的一种莱菔子代谢组学分析方法，其特征在于，所述莱菔子粉为将莱菔子用高速粉碎机粉碎后，用中国药典3号筛过筛所得。
4.根据权利要求2所述的一种基于莱菔子代谢组学分析方法，其特征在于，步骤(3)中静置30min，4000rmp·min-1离心10min，保存温度为-80℃。
5.根据权利要求2所述的一种莱菔子代谢组学分析方法，其特征在于，步骤(4)中涡旋1min后以12000r·min-1的速度离心10min，吸取上清液，用0.22μm微孔滤膜过滤；保存温度为-20℃。
6.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学分析方法，其特征在于，代谢标志物的发现步骤中，筛选p-value<0.05，log2(fold change)>0.59的化合物作为初选的代谢标志物。
7.根据权利要求1所述的一种基于代谢组学分析方法，其特征在于，初步确定的莱菔子水煎液治疗高血压的代谢标志物为：
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