CN114732888A - 一种莪术提取物及其在制备防治冠心病药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种莪术提取物及其在制备防治冠心病药物制备中的应用。莪术提取物是由如下方法提取得到的：将生或醋莪术饮片用乙醇加热提取；将药渣用水提取；合并提取液，加入乙醇至含醇浓度为40~60%后静置，过滤后将滤液减压浓缩至含生药量0.5～1.0 g/mL。该莪术提取物能显著升高冠心病大鼠肝脏指数、脾脏指数，改善其肝细胞脂肪变性、心肌纤维化、坏死、炎性浸润程度；能显著降低冠心病大鼠全血粘度、红细胞聚集指数等指标，降低血液粘稠状态；能显著改善血脂异常，同时达到减轻血管胆固醇沉积和炎症、恢复内皮功能的治疗效果。脂质组学结果还表明，其可通过抑制鞘脂代谢、促进甘油酯代谢和脂肪酰代谢调控冠心病脂质代谢异常。

Description

一种莪术提取物及其在制备防治冠心病药物中的应用
技术领域
本发明属于生物制药及分子生物学技术领域，具体涉及一种莪术提取物及其在制备防治冠心病药物中的应用。
背景技术
冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease，CHD)简称冠心病，是以脂质代谢异常为病理基础，多种诱因共同作用导致的一种疾病。其发病过程是在血瘀、脂质代谢异常等诱因作用下，脂质沉积于冠状动脉内膜上，随着时间延长形成白色斑块，称为动脉粥样硬化病变。随着时间延长，动脉硬化程度逐渐加重，冠状动脉管腔逐渐狭窄或形成堵塞，使心肌缺血、缺氧引发心脏病。在现代中医学理论中，冠心病归属于“胸痹”、“心痛”的范畴。中医学认为冠心病的发病机制为心脉痹阻，痹阻不通，不通则痛。
血瘀证是冠心病的主要证型，“血瘀”的病理改变伴随着冠心病的整个病程，是冠心病发病的病因病机。现代研究表明，脂质代谢异常是冠心病发生的主要因素，血瘀是冠心病的主要病理实质，这两个因素均在冠心病的发生与发展中起着主要作用。脂质代谢紊乱是冠心病血瘀证的主要特征。活血化瘀药治疗冠心病的作用机制在于：①活其血脉，即改善血管微循环的功能、血液的物理化学性状，改善血小板及凝血系统功能；②化其瘀滞，即抗心肌缺血、抑制血小板的聚集、抗凝、抗血栓形成等。
莪术为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val.、广西莪术CurcumaKwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang或温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎。具有行气破血、消积止痛的功效。莪术临床常见的饮片有生、醋莪术。生莪术行气消积力强，多用于食积胃痛，瘀积腹痛；醋莪术主入肝经血分，增强活血化瘀作用，常用于癥瘕、胸痹等血瘀证引起的冠心病等治疗。历版《中国药典》莪术【炮制】项下均收载生、醋莪术；历代经典名方及《中国药典》收载的含醋莪术饮片入药的成方制剂，大多用于治疗血瘀证引起的疾病。
发明内容
本发明目的是针对现有改善冠心病药物及手术多副作用且疗效不显著的问题，提供了一种莪术提取物及其在制备防治冠心病药物中的应用。具体为应用生、醋莪术提取物通过调控鞘脂代谢等代谢通路，改善冠心病血脂异常，减轻血管炎症、脂质沉积，恢复血管内皮功能，降低血液粘度，最终改善心肌纤维化、坏死、炎性浸润程度达到冠心病防治的目的，为其在制备防治冠心病药物中的应用前景提供依据。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种莪术提取物，其是由如下方法提取得到的：
(1)将莪术饮片用乙醇加热提取，得到乙醇提取液和药渣；所述莪术饮片为生莪术饮片或醋莪术饮片；优选为醋莪术饮片；
(2)将所述药渣用水提取，得到水提取液；
(3)合并所述乙醇提取液和所述水提取液，加入乙醇至含醇浓度为40～60％(v/v)后静置，过滤后将滤液减压浓缩至含生药量0.5～1.0g/mL，即得。
优选的，步骤(1)中所述乙醇的用量为莪术饮片质量的10～20倍，优选15倍。
优选的，步骤(1)中所述乙醇为90％(v/v)的乙醇。
优选的，步骤(1)中乙醇分2次提取，第一次提取使用莪术饮片9倍的质量，第二次提取使用莪术饮片6倍的质量。
优选的，步骤(1)中所述的提取的时间为1～2h，优选1.5h。
优选的，步骤(2)中所述水的用量为药渣质量的5～15倍，优选10倍。
优选的，步骤(2)中所述的提取的时间为1～2h，优选1.5h。
优选的，步骤(3)中所述静置的时间为12～36h，优选24h。
优选的，步骤(3)中所述的减压浓缩的温度为50℃。
优选的，所述生莪术饮片由如下方法制得：将莪术置于蒸制容器内蒸至圆汽后40min切厚、干燥，即得。
优选的，所述醋莪术饮片由《中国药典》2020年版醋煮法(通则0213)制备得到。
本发明还提供上述莪术提取物在制备防治冠心病药物中的应用。
所述莪术提取物提取自莪术生和醋品，植物来源为姜科植物温郁金Curcumawenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎。
本发明的有益效果在于：
本发明所制备的莪术提取物能够防治冠心病。经研究发现，生莪术提取物和醋莪术提取物能通过调控鞘脂代谢等代谢通路，改善冠心病血脂异常，减轻血管炎症、脂质沉积，恢复血管内皮功能，降低血液粘度，最终改善心肌纤维化、坏死、炎性浸润程度达到冠心病防治的目的，且相比于生莪术提取物，由于辅料醋的协同作用，使得醋莪术中的成分更易被吸收入血发挥作用，醋莪术提取物的效果更好。此外，莪术中的药效物质主要为倍半萜类和姜黄素类等小分子化合物，醇沉可去除蛋白质、多糖、鞣质等大分子化合物，达到提升疗效的作用。经醇沉后的提取物可制备成一种防治冠心病的药物，尤其是口服药物。对莪术提取物防治冠心病的药理药效进行评价有利于其作用机制的阐明，为其在制备防治冠心病药物中的应用前景提供依据。
附图说明
图1生莪术提取物和醋莪术提取物对冠心病大鼠脏器指数的影响；其中*p＜0.05，**p＜0.01，与正常组相比；#p＜0.05，##p＜0.01，与模型组相比。
图2生莪术提取物和醋莪术提取物对冠心病大鼠肝组织形态的影响(HE染色)，其中细胞核染紫蓝色，细胞质染红色。
图3生莪术提取物和醋莪术提取物对冠心病大鼠心肌组织形态的影响(HE染色)，其中细胞核染紫蓝色，细胞质染红色。
图4莪术提取物对冠心病大鼠心肌组织形态的影响(Masson染色)，其中胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。
图5生莪术提取物和醋莪术提取物对冠心病大鼠血脂水平的影响；其中*p＜0.05，**p＜0.01，与正常组相比；#p＜0.05，##p＜0.01，与模型组相比。
图6生莪术提取物和醋莪术提取物对冠心病大鼠血液流变学指标的影响；其中*p＜0.05，**p＜0.01，与正常组相比；#p＜0.05，##p＜0.01，与模型组相比。
图7生莪术提取物和醋莪术提取物对冠心病大鼠血清生化因子水平的影响；其中*p＜0.05，**p＜0.01，与正常组相比；#p＜0.05，##p＜0.01，与模型组相比。
图8样本中脂质化合物归一化前后RSD和PCA散点图；其中(A、C)为正离子模式；(B、D)为负离子模式。
图9各组大鼠血浆脂质代谢PLS-DA得分图及置换检验图；其中(A、B)为正离子模式；(C、D)为负离子模式。
图10各组大鼠血浆脂质代谢火山得分图；其中(A)正离子模式下模型组vs.正常组；(B)负离子模式下模型组vs.正常组；(C)正离子模式下生莪术给药组vs.模型组；(D)负离子模式下生莪术给药组vs.模型组；(E)正离子模式下醋莪术给药组vs.模型组；(F)负离子模式下醋莪术给药组vs.模型组。
图11大鼠血浆中差异脂质大类富集分析图；其中(A)模型组vs.正常组；(B)生莪术组vs.模型组；(C)醋莪术组vs.模型组；圆的大小表示脂质代谢物数量，颜色代表上调和下调(蓝色代表下调，红色代表上调)；GL：甘油酯，FA：脂肪酰，SP：鞘脂，GP：甘油磷脂，ST：甾醇。
图12莪术提取物(醇沉前)和莪术提取物(醇沉后)对冠心病大鼠肝组织形态的影响(HE染色)，其中细胞核染紫蓝色，细胞质染红色。
图13莪术提取物(醇沉前)和莪术提取物(醇沉后)对冠心病大鼠心肌组织形态的影响(HE染色)，其中细胞核染紫蓝色，细胞质染红色。
图14莪术提取物(醇沉前)和莪术提取物(醇沉后)对冠心病大鼠心肌组织形态的影响(Masson染色)，其中胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。
图15莪术提取物(醇沉前)和莪术提取物(醇沉后)对冠心病大鼠血脂水平的影响；其中*p＜0.05，**p＜0.01，与正常组相比；#p＜0.05，##p＜0.01，与模型组相比。
图16莪术提取物(醇沉前)和莪术提取物(醇沉后)对冠心病大鼠血液流变学指标的影响；其中*p＜0.05，**p＜0.01，与正常组相比；#p＜0.05，##p＜0.01，与模型组相比。
图17莪术提取物(醇沉前)和莪术提取物(醇沉后)对冠心病大鼠血清生化因子水平的影响；其中*p＜0.05，**p＜0.01，与正常组相比；#p＜0.05，##p＜0.01，与模型组相比。
具体实施方式
以下结合图表和具体实施操作对本发明作具体的介绍。
实施例1
1.莪术饮片：
生莪术饮片：取莪术药材，除去杂质，略泡，洗净，大小分档，置于蒸制容器内蒸至圆汽后40min，趁热切厚片(规格2-4mm)，50℃干燥，即得。
醋莪术饮片：照《中国药典》2020年版醋煮法(通则0213)制备。取净莪术，大小分档，加适量米醋共煮透，至切开内无白心时，取出，晾至六成干，切厚片(规格2-4mm)，50℃干燥，即得。每100kg莪术，用醋20kg。
2.提取物：
将制备的生、醋莪术饮片分别用15倍质量的90％(v/v)乙醇加热回流，分2次提取，每次1.5h(第一次9倍质量，第二次6倍质量)；药渣加10倍量的水提取1.5h，合并以上提取液，加乙醇至50％浓度静置24小时，过滤，取滤液50℃减压浓缩至含生药量1.0g/ml，得到生莪术提取物和醋莪术提取物。
3.冠心病大鼠模型的建立：
饲养条件：温度(25±2℃)，湿度(60％±5％)，12/12h昼/夜循环。实验前适应性喂养1周，给予普通饲料(20g/d)，整个实验期间保持自由饮水。
动物分组：取健康雄性SD大鼠，适应性喂养1周后，随机分为5组，分别为正常组、模型组、阳性药组、生莪术提取物高低剂量组、醋莪术提取物高低剂量组，每组10只。
造模方法：采用高脂饲料饲养复合维生素D3和盐酸异丙肾上腺素制备大鼠冠心病模型，实验总周期为17周。正常组采用基础饲料喂养，其余各组采用高脂饲料喂养，连续喂养17周。造模第一天，模型组和各给药组大鼠灌胃维生素D3(60万单位/kg)，另于造模第2、4、6、8周灌胃维生素D3(10万单位/kg)，正常组大鼠灌胃等体积的生理盐水。于第28天大鼠异氟烷麻醉后眼内眦取血(1.0ml)检测血脂，剔除28天时血脂水平未升高的大鼠。在给药的第17周最后两天，给药后模型组及各给药组大鼠背部多点皮下注射盐酸异丙肾上腺素(85mg/kg)，1次/d。
4.冠心病大鼠模型的给药：
于造模第15周开始，取(2)中提取的生莪术提取物和醋莪术提取物按下列方法连续给药3周：
(1)正常组：每天给予等量(10ml/kg)的生理盐水1次；
(2)模型组：每天给予等量(10ml/kg)的生理盐水1次；
(3)阳性组：每天给予2.1mg/kg(10ml/kg)的阿托伐他汀1次；
(4)生莪术提取物低剂量组：每天给予0.95g/kg(10ml/kg)生莪术提取物药液1次；
(5)生莪术提取物高剂量组：每天给予1.90g/kg(10ml/kg)生莪术提取物药液1次；
(6)醋莪术提取物低剂量组：每天给予0.95g/kg(10ml/kg)醋莪术提取物药液1次；
(7)醋莪术提取物高剂量组：每天给予1.90g/kg(10ml/kg)醋莪术提取物药液1次。
每日上午灌胃一次，每周称重一次以调整灌胃剂量。
5.生、醋莪术提取物防治冠心病的药效研究：
取造模和给药结束后的大鼠，末次给药后用3％戊巴比妥钠(0.15ml/100g)麻醉各组大鼠，腹主动脉取血。取心脏、肝脏、脾脏，生理盐水中涮洗干净，滤纸吸干水分，称重。心脏和肝脏置于装有4％多聚甲醛溶液的离心管中固定48h，常规处理石蜡包埋，切厚片后脱蜡，肝脏进行HE染色，心脏进行HE和Masson染色，之后在显微镜下进行检查。
(1)心脏、肝脏、脾脏脏器指数测定：
脏器指数又称脏器相对重量，是指脏器的重量与单位体重的比值，在一定程度上能反映脏器病理状态(脏器充血、水肿、肥大、萎缩等)。取清洗后吸干水分的心脏、肝脏、脾脏，精密称定，计算心脏、肝脏、脾脏指数，公式如下：
脏器指数＝脏器重量(g)/体重(100g)。
测定结果如图1所示，与正常组相比，模型组大鼠心脏和肝脏指数显著升高(p＜0.01)，脾脏指数显著降低(p＜0.01)，表明其心、肝、脾脏有严重损伤；与模型组相比，生莪术提取物、醋莪术提取物能降低肝、脾脏指数，醋莪术提取物给药组有显著性差异；同时能降低心脏指数，但无显著性差异。
综合比较，醋莪术提取物效果较生莪术提取物更优。
(2)肝脏HE染色：
取固定好的组织，梯度浓度乙醇逐级脱水，石蜡包埋切片，按试剂盒操作说明书进行HE染色，使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色，细胞质和细胞外基质中的成分着红色，反映组织或细胞病变的一般形态结构特点。
结果如图2所示，与正常组相比，模型组大鼠肝细胞脂肪变性情况严重，表明其脂质代谢异常；与模型组相比，生莪术提取物、醋莪术提取物组大鼠肝细胞脂肪变性明显减轻，且醋莪术提取物的改善效果较生莪术提取物更优。
(3)心脏HE和Masson染色：
取固定好的组织，梯度浓度乙醇逐级脱水，石蜡包埋切片，按试剂盒操作说明书分别进行HE和Masson染色。HE染色使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色，细胞质和细胞外基质中的成分着红色；Masson染色使胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色，反映组织中纤维以及炎性因子状况。
结果如图3和图4所示，与正常组相比，模型组大鼠心肌纤维化、坏死情况严重，并伴有炎性浸润；与模型组相比，生莪术提取物和醋莪术提取物组大鼠心肌梗死及炎性浸润状态减轻，且醋莪术提取物的改善效果较生莪术提取物更优。
(4)血清中总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)的测定：
取大鼠血清，采用全自动生化分析仪检测各项血脂指标，侧面反映动脉粥样硬化或冠心病等心血管疾病的病理状态。
结果如图5所示，与正常组相比，模型组大鼠各血脂指标显著升高(p＜0.01)，表明其处于较为严重的血脂异常状态；与模型组相比，生莪术提取物和醋莪术提取物组大鼠TC和LDL-C水平显著回调(p＜0.05或p＜0.01)，抗动脉粥样硬化因子HDL-C水平显著升高(p＜0.05)，且醋莪术提取物的效果较生莪术提取物更优。
(5)全血黏度(200s-1、30s-1、5s-1、1s-1)、红细胞聚集指数、全血相对黏度(低切、高切)的测定：
取大鼠全血，采用全自动血流变测试仪检测各项血液流变学指标，反映血液流动性、凝滞性和血液粘度。血流变学异常是心血管病的发病先兆之一。
结果如图6所示，与正常组相比，模型组大鼠全血黏度等指标显著升高(p＜0.01)；与模型组相比，生莪术提取物和醋莪术提取物组大鼠全血黏度等指标显著降低(p＜0.01)，且醋莪术提取物的效果较生莪术提取物更优。
(6)血清氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、内皮素(ET)、白介素6(IL-6)的测定：
取大鼠血清，ELISA法测定各组样本中ox-LDL、ET、IL-6的水平，测定按照试剂盒说明书严格进行。ox-LDL能反映血管内壁胆固醇沉积情况，ET能反映血管内皮损伤情况，IL-6能反映机体炎症反应的水平。
结果如图7所示，与正常组相比，模型组大鼠各指标显著升高，表明存在血管内皮损伤，炎症反应和胆固醇沉积；与模型组相比，生莪术提取物和醋莪术提取物组大鼠各指标有不同程度的回调，其中IL-6和ET显著降低(p＜0.01)。
综上所述，莪术提取物能改善冠心病大鼠心肌纤维化、坏死、炎性浸润程度，调节血脂异常，降低血液粘度，同时减轻血管内皮损伤，炎症反应和胆固醇沉积，此外，其对肝组织脂肪变性有较好的预防作用，且醋莪术提取物的效果整体上较生莪术提取物更优。
6.脂质组学研究：
(1)脂质组学血浆样本供试品制备：
取冻存的正常组、模型组、生莪术提取物组、醋莪术提取物组大鼠血浆样本于4℃解冻，精密吸取20μL于1.5ml离心管中，加入225μL含内标(Lyso PE(17:1)，D5 TG(17:0-17:1-17:0)，PE(17:0)浓度约为2.5μg/mL)的冰甲醇，涡旋10s，加入750μL MTBE再次涡旋10s，然后4℃振荡10min，加入超纯水188μL，涡旋20s后于4℃，18 000rpm离心2min。精密吸取350μL上清液至1.5mL离心管中，置于离心浓缩仪中挥干。向挥干的样品中加110μL复溶液(甲醇：甲苯＝9:1)，涡旋10min，超声10min，然后4℃，18 000rpm离心10min，取上清液进样分析。
QC样本制备：从每个样本中精密吸取5μL于同一离心管中混匀，精密吸取20μL按照上述实验步骤进行处理。
(2)血浆脂质组学色谱条件设置：
色谱柱：ACQUITY CSH C18(1.7μm×2.1×100mm)，流速：0.3mL/min，正离子模式的流动相：A：乙腈:水＝6：4+10mM甲酸铵+0.1％甲酸；B：异丙醇:乙腈＝9:1+10mM甲酸铵+0.1％甲酸。负离子模式的流动相：A：乙腈:水＝6:4+10mM乙酸铵；B：异丙醇:乙腈＝9:1+10mM乙酸铵。流动相梯度：0-2min，15-30％B；2-2.5min，30-48％B；2.5-11min，48-82％B；11-11.5min，82-99％B；11.5-12min，99％B；12-13min，99-15％B；13-15min，15％B。柱温：65℃，正离子进样量：3μL，负离子进样量：2μL。
(3)血浆脂质组学质谱条件设置：
电离方式：ESI源。正离子模式：喷雾电压3.5kV，离子源温度：306℃，毛细管温度：300℃，鞘气流：45arb，辅助气流：10arb，扫描范围：215-1800m/z，S-lens：50。负离子模式：喷雾电压：3.0kV，离子源温度：325℃，毛细管温度：300℃，鞘气流：45arb，辅助气流：10arb，扫描范围：215-1800m/z，S-lens：50。
(4)血浆脂质组学方法学考察：
采用3种方式来监测实验操作误差并进行仪器稳定性考察:①进实验样本前先进5针QC样本平衡系统；②监测内标物质在所有样本中的峰高值,并计算其RSD；③每进10针实验样本进一针空白溶剂样本和QC样本,利用包括QC样本在内的所有样本的主成分分析和各物质在QC样本中的变异度来检测仪器的重复性和可靠性。
经SERRF归一化法计算，正、负离子模式下QC样本的RSD值分别为12.95％和9.67％，见图8A和B。所有实验样本与QC样本一起进行PCA分析，相较于实验样本，QC样本在PCA图中均较集中，表明本实验操作与仪器条件相对稳定，见图8C和D。
(5)血浆脂质组学数据分析和处理过程：
正、负离子两种模式检测获得的样本及QC的原始谱图文件，经Abf Converter转换为abf格式，导入MS-DIAL软件中进行峰过滤、峰识别和峰对齐处理。物质鉴定是将一级和二级碎片离子和软件内置的Lipidblast数据库匹配，MS-DIAL运算后生成的结果经MS-FLO标记处理。整理得到的数据矩阵，经R语言归一化，以减少仪器误差，保留生物误差。根据QC聚集程度以及RSD，挑选出最优的归一化方法SERRF，整理后用Metaboanalyst 5.0网站(https://www.metaboanalyst.ca/)，采用最小二乘判别分析(PLS-DA)和火山图(Volcanoplot)等多变量统计分析，并根据各物质在样本中的峰面积的中值计算fold change值，选取p<0.05及fold change>2.0或fold change<0.5筛选所得的物质为差异性代谢物。采用ChemRICH(http://chemrich.fiehnlab.ucdavis.edu/)对差异代谢物中具有结构相似性的物质进行富集分析。
(6)血浆中脂质化合物的鉴定：
采用(4)中的数据处理方法，在各组大鼠血浆中的正离子模式下共鉴定出422个脂质，主要为酰基肉碱(CAR)、胆固醇酯(CE)、神经酰胺(Cer)、甘油二酯(DG)、己糖苷神经酰胺(HexCer)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、N-酰基乙酰胺(NAE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷酸肌醇(PI)、菜油甾醇酯(CASE)、鞘磷脂(SM)、甘油三酯(TG)。
负离子模式下共鉴定出154个脂质，主要为胆汁酸(BA)、神经酰胺(Cer)、双磷脂酰甘油(CL)、脂肪酸(FA)、己糖苷神经酰胺(HexCer)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷酸肌醇(PI)、鞘磷脂(SM)、胆酸(BileAcid)。
(7)血浆脂质组学轮廓分析：
将正、负离子模式得到的数据集进行偏最小二乘回归分析法(PLS-DA)代谢轮廓分析，见图9A和C。由图中可以看出，正常组和模型组区分良好，提示正常组和冠心病大鼠之间存在明显的脂质代谢差异，生莪术提取物和醋莪术提取物给药组接近正常组，提示莪术对冠心病大鼠的脂质代谢异常有回调作用。此外，置换检验见图9B和D，结果表明，PLS-DA模型没有过拟合，表明该模型是有效的(p＜0.01)。
(8)差异脂质化合物分析：
①正离子模式：
采用火山图(volcano plot)对各个组别进行两两分析(包括正常组/模型组、生莪术提取物给药组/模型组、醋莪术提取物给药组/模型组)，见图10A、B和C。通过FC＞2.0和p＜0.05的指标筛选出正常组与模型组之间的差异脂质化合物，即为冠心病潜在的生物标志物。如图所示，模型组与正常组之间有188个差异脂质标志物，其中117个含量上升，71个含量下降，主要包含胆固醇酯(CE)、神经酰胺(Cer)、甘油二酯(DG)等；通过p＜0.05的指标筛选出生莪术给药组与模型组之间有89个差异脂质标志物，其中83个含量上升，6个含量下降，主要包含溶血磷脂酰胆碱(LPC)、甘油二酯(DG)、甘油三酯(TG)等；醋莪术提取物给药组与模型组之间有161个差异脂质标志物，其中143个含量上升，18个含量下降，主要包含溶血磷脂酰胆碱(LPC)、甘油二酯(DG)、甘油三酯(TG)等。各组大鼠血浆脂质差异化合物详细信息见表1、表2和表3。
表1正离子模式下冠心病模型组与正常组大鼠之间的差异脂质
Figure BDA0003637837880000101
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Figure BDA0003637837880000131
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表2正离子模式下生莪术提取物给药组与冠心病模型组大鼠之间的差异脂质
Figure BDA0003637837880000151
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表3正离子模式下醋莪术提取物给药组与冠心病模型组大鼠之间的差异脂质
Figure BDA0003637837880000172
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Figure BDA0003637837880000211
②负离子模式：
采用与正离子模式下分析相同的方法得到差异火山图，见图9C和D。通过FC＞2.0和p＜0.05的指标筛选出正常组与模型组之间的差异脂质化合物。如图所示，模型组与正常组之间有55个差异脂质标志物，其中52个含量上升，3个含量下降，主要包含神经酰胺(Cer)、己糖苷神经酰胺(HexCer)、磷酸肌醇(PI)、鞘磷脂(SM)。通过p＜0.05的指标筛选出生莪术给药组与模型组之间有38个差异脂质标志物，其中31个含量上升，7个含量下降，主要包含脂肪酸(FA)、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰胆碱(PC)等；醋莪术提取物给药组与模型组之间有29个差异脂质标志物，其中24个含量上升，5个含量下降，主要包含溶血磷脂酰胆碱(LPC)、脂肪酸(FA)、鞘磷脂(SM)等。各组大鼠血浆脂质差异化合物详细信息见表4、表5和表6。
表4负离子模式下冠心病模型组与正常组大鼠之间的差异脂质
Figure BDA0003637837880000212
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表5负离子模式下生莪术提取物给药组与模型组大鼠之间的差异脂质
Figure BDA0003637837880000232
Figure BDA0003637837880000241
表6负离子模式下醋莪术提取物给药组与模型组大鼠之间的差异脂质
Figure BDA0003637837880000242
Figure BDA0003637837880000251
7.莪术提取物对冠心病大鼠脂质代谢通路的调控作用
为了深入了解脂质代谢的机制，采用ChemRICH(http://chemrich.fiehnlab.ucdavis.edu/)对脂质代谢物进行化学相似性和本体映射性富集分析，见图10。簇颜色为红色表示化合物增加，簇颜色为蓝色表示化合物减少，大小表示化合物数量，图中仅展示p<0.05的富集簇。脂质化合物根据结构分为五个大类：脂肪酰(FA)、甘油酯(GL)、甘油磷脂(GP)、鞘脂(SP)、甾醇(ST)。
将正、负离子模式下正常组与模型组血浆中差异脂质代谢物合并后根据所属大类进行富集分析，结果见图11A，从图中可以看出，与正常组相比，模型组甘油磷脂、鞘脂、甾醇含量显著升高，而甘油酯、脂肪酰含量显著降低；对生莪术提取物和醋莪术提取物给药组与模型组之间相比显著改变的代谢物进行相同的富集分析，分别见图11B和C，从图中可以看出，经生莪术提取物给药后，脂肪酰和甘油酯含量显著升高，鞘脂含量显著下降，产生了显著的回调趋势；经醋莪术提取物给药后，脂肪酰和甘油酯含量显著升高，鞘脂和甾醇含量显著下降，与生莪术提取物相比，醋莪术提取物对冠心病血瘀证模型脂质的回调作用更为显著，回调脂质个数也更多。结果表明，生莪术提取物和醋莪术提取物调控冠心病脂质代谢异常主要与调节鞘脂代谢、甘油酯代谢、脂肪酰代谢密切相关，且醋莪术提取物较生莪术提取物有更强的调控作用。
实施例2
1.莪术饮片：
采用实施例1中莪术饮片的制备方法制备莪术饮片(生莪术饮片，在本实施例2中标记为莪术饮片)。
2.醇沉前后莪术提取物：
莪术提取物(醇沉前)：将制备的莪术饮片分别用15倍质量的90％(v/v)乙醇加热回流，分2次提取，每次1.5h(第一次9倍质量，第二次6倍质量)；药渣加10倍量的水提取1.5h，合并以上提取液，过滤，取滤液50℃减压浓缩至含生药量1.0g/ml，得醇沉前的莪术提取物。
莪术提取物(醇沉后)：将制备的莪术饮片分别用15倍质量的90％(v/v)乙醇加热回流，分2次提取，每次1.5h(第一次9倍质量，第二次6倍质量)；药渣加10倍量的水提取1.5h，合并以上提取液，过滤，取滤液50℃减压浓缩至含生药量1.0g/ml，加乙醇至50％浓度静置24小时，得醇沉后的莪术提取物。
3.冠心病大鼠模型的建立：
动物饲养条件、分组、造模方法同实施例1。
4.冠心病大鼠模型的给药：
于造模第15周开始，取(2)中提取的莪术提取物(醇沉前)和莪术提取物(醇沉后)按下列方法连续给药3周：
(1)正常组：每天给予等量(10ml/kg)的生理盐水1次；
(2)模型组：每天给予等量(10ml/kg)的生理盐水1次；
(3)阳性组：每天给予2.1mg/kg(10ml/kg)的阿托伐他汀1次；
(4)莪术提取物(醇沉前)低剂量组：每天给予0.95g/kg(10ml/kg)莪术提取物(醇沉前)药液1次；
(5)莪术提取物(醇沉前)高剂量组：每天给予1.90g/kg(10ml/kg)莪术提取物(醇沉前)药液1次；
(6)莪术提取物(醇沉后)低剂量组：每天给予0.95g/kg(10ml/kg)莪术提取物(醇沉后)药液1次；
(7)莪术提取物(醇沉后)高剂量组：每天给予1.90g/kg(10ml/kg)莪术提取物(醇沉后)药液1次。
5.莪术提取物醇沉前后防治冠心病的药效研究：
(1)肝脏HE染色：
测定方法同实施例1。
结果如图12所示，与正常组相比，模型组大鼠肝细胞脂肪变性情况严重，表明其脂质代谢异常；与模型组相比，莪术提取物(醇沉前)、莪术提取物(醇沉后)给药组大鼠肝细胞脂肪变性减轻，且莪术提取物(醇沉后)的改善效果更优。
(2)心脏HE和Masson染色：
测定方法同实施例1。
结果如图13和图14所示，与正常组相比，模型组大鼠心肌纤维化、坏死情况严重，并伴有炎性浸润；与模型组相比，莪术提取物(醇沉前)、莪术提取物(醇沉后)给药组大鼠心肌梗死及炎性浸润状态减轻，且莪术提取物(醇沉后)的改善效果更优。
(3)血清中总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)的测定：
测定方法同实施例1。
结果如图15所示，与正常组相比，模型组大鼠各血脂指标显著升高(p＜0.01)，表明其处于较为严重的血脂异常状态；与模型组相比，莪术提取物(醇沉前)、莪术提取物(醇沉后)给药组TC和LDL-C水平显著回调(p＜0.05或p＜0.01)，抗动脉粥样硬化因子HDL-C水平升高，且莪术提取物(醇沉后)的改善效果更优。
(4)全血黏度(200s-1、30s-1、5s-1、1s-1)、红细胞聚集指数的测定：
测定方法同实施例1。
结果如图16所示，与正常组相比，模型组大鼠全血黏度等指标显著升高(p＜0.01)；与模型组相比，莪术提取物(醇沉前)、莪术提取物(醇沉后)给药组大鼠全血黏度等指标显著降低(p＜0.01)，且莪术提取物(醇沉后)的改善效果更优。
(5)血清氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)、内皮素(ET)、白介素6(IL-6)的测定：
测定方法同实施例1。
结果如图17所示，与正常组相比，模型组大鼠各指标显著升高，表明存在血管内皮损伤，炎症反应和胆固醇沉积；与模型组相比，莪术提取物(醇沉前)、莪术提取物(醇沉后)给药组大鼠各指标有不同程度的回调，其中IL-6和ET显著降低(p＜0.01)。
综上所述，莪术提取物醇沉前后均能改善冠心病大鼠心肌纤维化、坏死、炎性浸润程度，调节血脂异常，降低血液粘度，同时减轻血管内皮损伤，炎症反应和胆固醇沉积，此外，其对肝组织脂肪变性有较好的预防作用，但经过醇沉后的莪术提取物的效果整体上较醇沉前更优。
由实以上对比可以看出，采用本发明制备的莪术提取物，由于对有效成分进行精准提取，醇沉去除了非药效成分，相比传统的莪术饮片，其防治冠心病的效果更好。

Claims (10)

1.一种莪术提取物，其特征在于，是由如下方法提取得到的：
（1）将莪术饮片用乙醇加热提取，得到乙醇提取液和药渣；所述莪术饮片为生莪术饮片或醋莪术饮片；优选为醋莪术饮片；
（2）将所述药渣用水提取，得到水提取液；
（3）合并所述乙醇提取液和所述水提取液，加入乙醇至含醇浓度为40~60%体积含量后静置，过滤后将滤液减压浓缩至含生药量0.5～1.0 g/mL，即得。
2.根据权利要求1所述的莪术提取物，其特征在于，步骤（1）中所述乙醇的用量为莪术饮片质量的10～20倍，优选15倍。
3.根据权利要求1所述的莪术提取物，其特征在于，步骤（1）中所述乙醇为90%体积含量的乙醇。
4.根据权利要求1所述的莪术提取物，其特征在于，步骤（1）中乙醇分2次提取，第一次提取使用莪术饮片9倍的质量，第二次提取使用莪术饮片6倍的质量。
5. 根据权利要求1所述的莪术提取物，其特征在于，步骤（1）中所述的提取的时间为1～2 h，优选1.5h。
6. 根据权利要求1所述的莪术提取物，其特征在于，步骤（2）中所述水的用量为药渣质量的5～15 倍，优选10倍。
7. 根据权利要求1所述的莪术提取物，其特征在于，步骤（2）中所述的提取的时间为1～2 h，优选1.5h。
8. 根据权利要求1所述的莪术提取物，其特征在于，步骤（3）中所述静置的时间为12～36 h，优选24h。
9.根据权利要求1所述的莪术提取物，其特征在于，步骤（3）中所述的减压浓缩的温度为50℃。
10.权利要求1所述的莪术提取物在制备防治冠心病药物中的应用。
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