CN101570557A

CN101570557A - 一种青钱柳中的化合物及其在医药领域的应用

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Publication number: CN101570557A
Application number: CNA2009100526976A
Authority: CN
Inventors: 肖凯; 李佳; 张娟; 沈强; 张薇; 孙铭学
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2009-06-09
Filing date: 2009-06-09
Publication date: 2009-11-04
Anticipated expiration: 2029-06-09
Also published as: CN101570557B

Abstract

本发明涉及医药技术领域，公开了从青钱柳中分离得到的一种治疗糖尿病及肥胖症的新化合物，经多种现代光谱分析，特别是应用多种先进的二维核磁共振谱的综合分析和X－衍射分析，确定了该化合物的化学结构及立体构型，其化学结构式为式(1)。蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制实验表明，该化合物具有显著的PTP1B抑制效果。本发明可为研制新的降血糖及治疗肥胖症的药物或者保健品提供先导化合物，对开发利用中国传统的中草药资源具有重要价值。

Description

一种青钱柳中的化合物及其在医药领域的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说是涉及一种中药提取物即青钱柳提取物用于制备治疗糖尿病的用途，再具体地说是涉及一种从传统中草药青钱柳叶中分离得到的新的化合物(1R，2R，4R)-1，2，4-trihydroxy-1，2，3，4-tetrahydro-naphthalene-1-O-β-D-glucopyranoside用于制备抗糖尿病产品的用途。

背景技术

(一)青钱柳的研究概况

青钱柳叶为胡桃科青钱柳属落叶乔木青钱柳[Cyclocarya paliulus(Batalin.)Iijinsk]的叶。胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属(Cyclocarya)植物仅有一种，即青钱柳，分布于我国长江流域以南各省区，广东仅分布于北部地区(陈风怀.广东植物志第二卷，广州：广东科技出版社，1991，317-324.)，它是我国独有的单种属植物，是国家重点保护的濒危植物之一，属三类保护植物。青钱柳别名青钱李(江西)、山麻柳(四川)、甜茶树(贵州)、一串钱(湖北)、金钱树、钱耳树、摇钱树等。《中华本草》第五卷，《云南植物志》，《广东植物志》对其有收载。《中华本草》(国家中医药管理局<中华本草>编委会.中华本草第二卷上海：上海科学技术出版社，1999，370-371.)记载：青钱柳叶味辛、微苦、性平。具有祛风止痒的功效，主治皮肤疾病。根据《全国中草药汇编》记载，青钱柳树皮具有清热消肿、止痛功能，可用于治疗顽廯；其叶常被用来当茶饮。经过多年的研究，利用现代科学手段成功的将青钱柳研制成保健茶，实现了产业化。

对青钱柳化学成分的研究起始于90年代。至今，已从青钱柳的叶中分离出多种游离黄酮、黄酮苷、三萜皂苷及甾体皂苷类成分。黄酮类成分是迄今为止报道最多的一类成分。如山奈酚、山奈酚-7-O-α-L-鼠李糖苷、山柰酚-3-O-β-D-吡喃葡萄醛酸苷、槲皮素、异槲皮苷等等(①张晓瑢，廖循，丁立生.青钱柳的化学成分.应用与环境生物学报，2001，7(1)：90-91；②谢明勇，王远兴，易醒，等.青钱柳叶中黄酮化合物结构及含量研究.分析化学，2004，32(8)：1053-1056；③李俊，陆园园，许子竞，等。青钱柳中黄酮类成分的研究.中药材，2005，28(12)：1058-1059；④张晓琦，叶文才，殷志琦，等。青钱柳的化学成分研究.中国中药杂志，2005，30(10)：791-792)。青钱柳中含有的三萜类成分包括五环三萜，如青钱柳酸A、(cyclocaric acid A，B)、2α-乌苏酸和arjunolic acid(①钟瑞建，舒任庚，倪小兰，等。青钱柳酸A的结构研究.药学学报，1996，31(5)：398-400；②钟瑞建，高幼衡，许昌瑞.青钱柳中五坏三萜类成分的研究.中草药，1996，27(7)：387-388.)；另外还有达马烷型四环三萜皂苷青钱柳苷A-C(cyclocarioside A)和青钱柳苷I-III(cyclocarioside I-III)(①杨大坚，钟炽昌，谢昭明.甜茶树甜味成分的研究.药学学报，1992，27(11)：841-844；②Jiang ZY，Zhang MX，Zhou J，etal.Two new triterpenoid glycosides from Cyclocarya paliurus.Journalof Asian Natural Products Research，2006，8(2)：93-98；③舒任庚，许昌瑞，黎莲娘.青钱柳甜味成分的研究.药学学报，1995，30(10)：757-761；④Sbu RG，Xu CR，Li LN，et al.Cyclocariosides II and III-two secodammaranetriterpenoid saponins from Cyclocarya paliurus.Planta Medica，1995，61(6)：551-553.)。除了以上三类成分之外，还有其他一些成分的报道，如硬脂酸、棕榈酸(舒任庚，许昌瑞，刘庆华，等。青钱柳化学成分的研究.中国中药杂志，1995，20(11)：680-681)、肌醇(钟瑞建，舒任庚，倪小兰，等。青钱柳酸A的结构研究.药学学报，1996，31(5)：398-400.)、逆没石子酸(易醒，石建功，周光雄，等.青钱柳化学成分的研究.中国中药杂志，2002，27(1)：43-45.)、香草酸和苯甲酸(张晓琦，叶文才，殷志琦，等。青钱柳的化学成分研究.中国中药杂志，2005，30(10)：791-792.)等等。我们最近对青钱柳的70％乙醇提取物进行了研究，分离鉴定了山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸钠盐、槲皮素-3-OβD-葡萄糖醛酸钠盐、杨梅素-3O-βD-葡萄糖醛酸钠盐、2，6-二甲氧基4-羟基苯酚-1-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、色氨酸、没食子酸、苯甲酸等一系列水溶性成分(张娟，路金才，肖凯，等.青钱柳水溶性成分的研究.药学实践杂志.2007，25(2)：82-84.)。

关于青钱柳的药理作用研究，降血糖作用的报道比较多。国内学者在四氧嘧啶造成的小鼠糖尿病模型上发现青钱柳醇提取物具有降血糖作用，认为青钱柳降血糖作用可能与恢复受损的胰岛结构和功能及影响糖的代谢有关(易醒，谢明勇，温辉梁，等。青钱柳对四氧嘧啶糖尿病小鼠降血糖作用的研究.天然产物研究与开发，2001，13(3)：52-54)，水提物也有降糖作用(徐明生，沈勇根，吴海龙，等.青钱柳水提物降血糖作用的研究.营养学报，2004，26(3)：230-234)，有人认为青钱柳醇提取物的降糖效果更好(上官新晨，陈锦屏，吴少福，等.青钱柳提取物对家兔实验性糖尿病模型降糖作用的研究.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2003，31(6)：117-120)。青钱柳多糖也被证明有降血糖作用并能增强糖尿病小鼠对葡萄糖的耐受力(李磊，谢明勇，易醒，等。青钱柳多糖降血糖作用研究.中药材，2002，25(1)：39-41)。临床研究发现，青钱柳制剂确有降血糖作用而对正常血糖无影响，无毒副作用，与降糖药物有协同作用，对消除糖尿病症状，防治并发症和降糖药毒副作用有较好效果(谌梦奇，梁锦业，焦志海，等。青钱柳制剂治疗II型糖尿病疗效观察.怀化医专学报，2002，1(1)：36-39)。最近日本学者也发现青钱柳水提物可以降低口服蔗糖和淀粉的小鼠血糖水平，在遗传高血糖模型小鼠KK-Ay上也可显著降低血糖；体外实验发现它抑制α-葡萄糖苷酶，推测青钱柳可能是通过抑制葡萄糖的吸收而降低血糖(Kurihara H，Fukami H，Kusumoto A，et al.Hypoglycemic action of Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja in normaland diabetic mice.Biosci.Biotechnol.Biochem.，2003，67(4)：877-880)。但是关于青钱柳中单体化合物抗糖尿病的活性研究则未见报道。

除了降血糖作用以外，青钱柳是降血脂作用也研究较多，青钱柳可抑制大鼠血清总胆固醇的升高(①谢明勇，李磊.青钱柳化学成分和生物活性研究概况.中草药，2001，32(4)：365-366；②易醒，谢明勇.青钱柳对胆固醇调节作用的初步研究.中国商办工业.2000，4：51-52)。给小鼠喂猪油和橄榄油，经口服青钱柳提取物后可以降低血浆中TG水平，但对自由脂肪酸水平没有影响，认为青钱柳的降血脂作用是由于其抑制了胰脂肪酶(Kurihara H，Asami S，Shibata H，et al.Hypolipemic effect of Cyclocarya paliu-rus(Batal.)Iljinskaja in lipid-loaded mice.Biol.Pharm.Bull.，2003，26(3)：383-385)。

另外，青钱柳提取物还有降血压作用、抗菌作用(①黄敬耀，楼兰英，徐膨.摇钱树叶的药理研究.中药通报1986，11(11)：61；②黄贝贝，叶荷平，黄星宇，等。青钱柳抗菌作用的实验研究.江西中医学院学报，2006，8(18)：48-49)。

青钱柳作为降糖神茶已走向了产业化，化学成分的研究尚不够深入，而其降糖活性成分的研究几乎没有开展，因此对降糖活性成分的研究非常必要。

(二)蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(Protein tyrosine phosphotases 1B，PTP1B)的研究概况

目前的基础与临床研究证明，胰岛素抵抗是II型糖尿病的最重要的病理基础或危险因子(Reaven GM.Banting lecture 1988.Role of insulin resistancein human disease.Diabetes 1988，37：1595-1607.)。胰岛素信号通路中，比较重要的一步是胰岛素受体(IR)复合物上的酪氨酸磷酸化。而这一过程与蛋白质酪氨酸磷酸酶关系密切。其中蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(Protein tyrosinephosphotases 1B，PTP1B，下简称PTP1B)是胰岛素信号通路的关键负调因子，能使已活化的IR、胰岛素受体底物IRS-1及IRS-2复合物上的酪氨酸去磷酸化，从而抑制胰岛素信号传导(①Kenner K，Anyanwu E，Olefsky J，Kusari J.Protein-tyrosine phosphatase 1B is a negative regulator of insulin-andinsulin-like growth factor-I-stimulated signaling.J.Biol.Chem.1996，271：19810-19816；②Seely B，Staubs P，Reichart D，et al.Protein tyrosinephosphatase 1B interacts with the activated insulin receptor.Diabetes.1996，45：1379-1385；③Calera M，Vallega G，Pilch P：Dynamicsof protein-tyrosine phosphatases in rat adipocytes.J.Biol.Chem.2000，275：6308-6312.)。大量研究表明，PTP1B在体内与体外都参与胰岛素信号传导的负调节，正大量增加的人基因数据也支持这一理论(Johnson TO，Ermolieff J，Jirousek MR.Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors for diabetes.NatRev.Drug Discov.2002，1(9)：696-709.)。胰岛素抵抗的肥胖病人显示PTP1B蛋白水平增高(Ahmad F，Azevedo JJ，Cortright R，Dohm G，Goldstein B.Alterations in skeletal muscle protein-tyrosine phosphatase activity andexpression in insulin-resistant human obesity and diabetes.J.Clin.Invest.1997，100：449-458.)。动物实验表明，相对于野生型小鼠，PTP1B基因敲除小鼠对于胰岛素更敏感，一半水平的胰岛素就能够维持血糖平衡；在胰岛素刺激时，PTP1B基因敲除小鼠肝中胰岛素受体磷酸化水平显著提高，肌肉等组织也如此。并且这些小鼠能够抵抗高脂饲养所致的肥胖和体重增加，基础代谢率提高而无明显的毒性(①Johnson TO，Ermolieff J，Jirousek MR.Proteintyrosine phosphatase 1B inhibitors for diabetes.Nat.Rev.Drug Discov.2002，1(9)：696-709；②Elchebly M，Payette P，Michaliszyn E，et al.Increased insulin sensitivity and obesity resistance in mice lacking theprotein tyrosine phosphatase-1B gene.Science.1999，283：1544-1548；③Klaman L，Boss O，Peroni O，et al.Increased energy expenditure，decreased adiposity，and tissue-specific insulin sensitivity inprotein-tyrosine phosphatase 1B-deficient mice.Mol.Cell.Biol.2000，20：5479-5489.)。用PTP1B反义寡核苷酸处理过的小鼠中，肝内PTP1B下降，同样剂量的胰岛素刺激导致IR、IRS-1和IRS-2的酪氨酸磷酸化及肝内蛋白激酶B(PKB)丝氨酸磷酸化水平分别增加几倍，磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)-3-激酶、肝糖元合成酶激酶(GSK)3α与3β水平也增加(①Gum RJ，Gaede LL，Koterski SL，et al.Reduction of protein tyrosinephosphatase 1B increases insulin-dependent signaling in ob/ob mice.Diabetes.2003，52(1)：21-28；②Zinker BA，Rondinone CM，Trevillyan JM，et al.PTP1B antisense oligonucleotide lowers PTP1B protein，normalizesblood glucose，and improves insulin sensitivity in diabetic mice.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002，99(17)：11357-11362.)。IR、IRS-1、IRS-2、PKB和磷脂酰肌醇-3-激酶等都是胰岛素信号传导通路中重要组成部分，对于葡萄糖和脂肪代谢至关重要(Avruch J.Insulin signal transduction throughprotein kinase cascades.Molec and Cell Biochem.1998，182：31-48.)。同时，PTP1B反义寡核苷酸处理的糖尿病肥胖ob/ob小鼠，血糖水平恢复正常；高胰岛素血症也因为对胰岛素的敏感性提高而降低；肝内糖异生的酶等的表达下调(Kushner JA，Haj FG，Klaman LD，et al.Islet-sparing effects of proteintyrosine phosphatase-1b deficiency delays onset of diabetes in IRS2knockout mice.Diabetes.2004，53(1)：61-66.)。以上研究证明在动物模型中，消除或降低PTP1B水平可以充分增加胰岛素的信号传导，逆转胰岛素抵抗，提高胰岛素的敏感性。所以PTP1B是治疗II型糖尿病很有吸引力的药物作用靶点(Johnson TO，Ermolieff J，Jirousek MR.Protein tyrosine phosphatase1B inhibitors for diabetes.Nat Rev.Drug Discov.2002，1(9)：696-709.)，高活性的PTP1B抑制剂在糖尿病和肥胖症的防治中有重要的价值。

发明内容

本发明的目的在于从天然产物中寻找安全有效的用于制备预防和治疗抗糖尿病与肥胖的天然产物，经过不断努力，终于从一种从生长于中国长江以南各省区的胡桃科青钱柳属青钱柳叶中提取分离到了一种新的化合物，发现该化合物能够显著抑制PTP1B的活性，因而在糖尿病和肥胖症的治疗中有重要的价值，从而完成了本发明。

本发明的青钱柳中的一种化合物可用于治疗可能与糖尿病和肥胖症有关的疾病。

本发明是通过如下技术方案完成的，具体内容包括：青钱柳中的一种新化合物的提取分离，结构鉴定；通过生物学实验等研究和理论探索，意在明确一种从青钱柳中提取的新化合物在抗糖尿病及肥胖应用方面的活性。该种新化合物的抑制PTP1B的活性的研究及与之相关的医药用途的研究。

该新化合物是从生长于中国长江以南各省区的胡桃科青钱柳属青钱柳叶中分离得到的一种新的化合物，本发明从青钱柳叶提取分离该新化合物的方法，其具体步骤如下：

(1)提取：青钱柳的干燥叶，70％乙醇回流提取3次，滤出提取液，减压回收乙醇至无醇味，然后将浓缩液过滤，分为沉淀和滤液两部分，滤液经石油醚萃取后，浓缩，过滤，过Diaion HP20大孔吸附树脂柱，依次用水和10％乙醇冲洗，收集10％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得到提取物。

(2)分离：上述提取物过滤，浓缩后过MCI gel CHP20P柱，依次用水、10％、20％、30％的甲醇冲洗，薄层层析检测，收集含该化合物的流分，过滤，浓缩后过三次TSK gel Toyopearl HW40F柱，用水冲洗，薄层层析检测，得到该化合物。

经采用紫外、红外、质谱、一维与二维核磁共振、X-衍射等各种光谱手段和理化性质，确定了该化合物为(1R，2R，4R)-1，2，4-trihydroxy-1，2，3，4-tetrahydro-naphthalene-1-O-β-D-glucopyranoside，其结构式如下：

该化合物为为无色透明棱柱状结晶(甲醇)，易溶于甲醇和含水甲醇。紫外光谱(UV)λmax(MeOH)：261和212nm。红外光谱(IR)(KBr)cm^-1：3428(羟基)和1559(苯环)。(ESI-MS⁺)m/z：365.91[M+Na]⁺、707.48[2M+Na]⁺；电喷雾-飞行时间-阳离子质谱(ESI-MS^-)m/z：341.34[M-H]^-、683.11[2M-H]^-。高分辨电喷雾质谱(HRESI-MS)给出准分子离子峰m/z 365.1214[M+Na]⁺，确定其分子式为C₁₆H₂₂O₈(理论值m/z 365.1212[C₁₆H₂₂O₈Na])。氢核磁共振(¹H-NMR)和碳核磁共振(¹³C-NMR)。数据见表一：

表一：(1R，2R，4R)-1，2，4-trihydroxy-1，2，3，4-tetrahydro-naphthalene-1-O-β-D-glucopyranoside的¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆+D₂O)、¹H-NMR(500MHz，DMSO-d₆)和¹³C-NMR(125MHz，DMSO-d₆+D₂O)数据

N₀：碳原子序号δ_H：氢原子化学位移δ_C：碳原子化学位移J：偶合常数该化合物的单晶X-衍射分析结果，见图1所示。

本发明通过实验，对该化合物进行了蛋白质酪氨酸磷酸酯酶(PTP1B)抑制实验，实验结果表明：本发明化合物有显著的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶PTP1B抑制作用，故可用于制备治疗糖尿病及肥胖的药物。本发明为研制新的治疗糖尿病和肥胖的药物提供了先导化合物，对开发利用中国传统的中草药资源具有重要价值。

附图说明

图1为该化合物的单晶X-衍射分析结果图。

具体实施方式：

实施例1

下面通过实施例进一步描述(1R，2R，4R)-1，2，4-trihydroxy-1，2，3，4-tetrahydro-naphthalene-1-O-β-D-glucopyranoside的分离制备。

选择生长于中国长江流域以南各省区的青钱柳干燥叶10Kg，用15倍量(重量)70％的乙醇回流提取3次，滤出提取液，减压回收乙醇至无醇味，然后将浓缩液过滤，分为沉淀和滤液两部分，滤液经石油醚(10L)萃取后，浓缩，过滤，过Diaion HP20大孔吸附树脂柱，依次用水和10％乙醇冲洗，收集10％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得到提取物80g。取提取物过滤，浓缩后过MCI gel CHP20P柱，依次用水、10％、20％、30％甲醇冲洗，薄层层析检测，收集含该化合物的流分，过滤，浓缩后过三次TSK gel Toyopearl HW40F柱，用水冲洗，薄层层析检测，得到(1R，2R，4R)-1，2，4-trihydroxy-1，2，3，4-tetrahydro-naphthalene-1-O-β-D-glucopyranoside纯品38mg。

实施例2.蛋白质酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制实验

实验目的：胰岛素抵抗是II型糖尿病的最重要的病理基础，大量研究表明，其中PTP1B是胰岛素信号通路的关键负调因子。在动物模型中，消除或降低PTP1B水平可以充分增加胰岛素的信号传导，逆转胰岛素抵抗，提高胰岛素的敏感性。所以高活性的PTP1B抑制剂在糖尿病和肥胖症的治疗中有重要的价值。检测实施例1制得的青钱柳中的新化合物对PTP1B抑制作用。

实验方法：用于筛选的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶PTP1B是从大肠杆菌中表达并纯化的GST融合蛋白。采用紫外底物pNPP，观察1，2，4-trihydroxy-1，2，3，4-tetrahydro-naphthalene-1-O-β-D-glucopyranoside对重组酶的活性抑制，以初步评价药用效果。PTP1B水解底物pNPP的磷酯得到的产物在410nm处有很强的光吸收。因此可以直接监测410nm处光吸收的变化以观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制情况。实验中所采用的阳性参照化合物为HD0518。首先，在单浓度条件下，测定该化合物对PTP1B的抑制率，然后进一步测定IC50值。

实验结果：

以上实验表明：本发明化合物有明显的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶PTP1B抑制作用，故可用于制备治疗糖尿病及肥胖的药物或者保健品。本发明为研制新的治疗糖尿病及肥胖症的药物或者保健品提供了先导化合物，对开发利用中国传统的中草药资源具有重要价值。

Claims

1.一种青钱柳中的化合物，其特征在于该化合物具有化学结构式如下：

2.权利要求1所述的一种青钱柳中的化合物的制备方法，其具体步骤如下：

(1)提取：青钱柳的干燥叶，70％乙醇回流提取3次，滤出提取液，减压回收乙醇至无醇味，然后将浓缩液过滤，分为沉淀和滤液两部分，滤液经石油醚萃取后，浓缩，过滤，过Diaion HP20大孔吸附树脂柱，依次用水和10％乙醇冲洗，收集10％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得到提取物；

(2)分离：上述提取物过滤，浓缩后过MCI gel CHP20P柱，依次用水、10％、20％、30％的甲醇冲洗，薄层层析检测，收集含(1R，2R，4R)-1，2，4-trihydroxy-1，2，3，4-tetrahydro-naphthalene-1-O-β-D-glucopyranoside的流分，过滤，浓缩后过三次TSK gel Toyopearl HW40F柱，用水冲洗，薄层层析检测，得到该化合物。

3.权利要求1所述的一种青钱柳中的化合物在制备治疗糖尿病及肥胖症药物或者保健品中的应用。