CN108845068B - 一种炒青绿茶中吡嗪类化合物的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种炒青绿茶中吡嗪类化合物的检测方法，包括如下步骤：(1)配置10个不同系列浓度的吡嗪混合标准工作液，加入到空白基质样品中，红外辅助顶空固相微萃取技术进行萃取，GC‑QqQ‑MS/MS多反应监测(MRM)模式进行分析检测，然后绘制色谱峰面积与对应吡嗪类化合物浓度的标准工作曲线；(2)与步骤(1)相同的条件下提取炒青绿茶中的吡嗪类化合物并进行分析，标准加入法进行定量。本发明将红外辅助顶空固相微萃取技术与气相色谱‑三重四极杆串联质谱技术相结合，样品前处理简单，选择性好，灵敏度高，解决了炒青绿茶中吡嗪类化合物水平低，以及炒青绿茶中复杂基质对目标物分析干扰严重的影响，可以实现炒青绿茶中吡嗪类化合物快速、准确地测定。

Description

一种炒青绿茶中吡嗪类化合物的检测方法
技术领域
本发明属于化学分析领域，涉及了一种炒青绿茶中吡嗪类化合物的检测方法。
背景技术
炒青绿茶是我国绿茶的主要品类，以其香气高鲜、滋味浓醇的优异品质备受消费者的青睐，诸多名优绿茶，如西湖龙井、信阳毛尖和碧螺春等均属于炒青绿茶。目前，绿茶香气成分的研究中，已分离鉴定包括醇、醛、酮、酯、酸、氮氧杂环类化合物等在内200余种香气组分，其中吡嗪类化合物，香气特征突出，香味阈值低，对炒青绿茶特征品质的形成具有重要贡献。
Kumazawa等(Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50(20),5660-5663)测定了炒青类绿茶香气组分的香气稀释因子(FD)，其中2-乙酰基-1-吡咯啉、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2-乙酰基-2-噻唑啉、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪有着非常高的FD值，这些吡嗪类、吡咯类物质是炒青绿茶的关键香气组分。Mizukami等(Journalof Agricultural and Food Chemistry,2006,54(19),7370-7377)研究炒青绿茶干燥过程中Maillard反应中间产物丙烯酰胺的浓度变化与香气品质的关系，通过AEDA分析，2-乙基-3,6-二甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪被鉴定为关键的香气组分。Baba等(Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2014,62(33),8308-8313)研究了龙井、毛峰、碧螺春三种主要的绿茶品种，通过AEDA分析，4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、3-羟基-4,5-二甲基-2(5H)-呋喃酮、香豆素、香草醛、香叶醇、(E)-异月桂醇和2-甲氧基苯酚7种化合物在三个品种均显示很高的FD值，是绿茶的关键香气成分；2-异丙基-3-甲基吡嗪、2-乙烯基-3,5-二甲基吡嗪、顺式-4,5-环氧-(E)-2-癸烯醛、4-乙基愈创木酚、(E)-异丁烯醇和3-苯基丙酸酸这6种化合物为绿茶中首次报道的比较重要香气成分。
目前国内外有关吡嗪类物质的提取方法主要有溶剂提取、液-液萃取(LLE)、固相萃取等,这些方法通常需要较长的处理时间、操作繁琐、劳动强度大，且消耗大量的有机溶剂，已不能满足现代食品分析的要求。目前，简便、快速、高效、绿色环保是当前样品前处理方法的发展方向和要求。在吡嗪类物质的检测分析中，最早使用的是气相色谱火焰离子检测器(FID)，对于含量低的物质灵敏度不够。尽管气相色谱能有效的对不同的成分进行分离，但是对于一些特殊的组分很难进行可靠的检测，因此需要联合质谱检测器。王莉等(食品与生物技术学报,2014,(08),891-895)采用气相色谱质谱联用仪对白酒中吡嗪类物质进行定性分析，该方法引入除去大部分酯类和醇类的提取步骤，有效提高了吡嗪类物质的检出，但是该方法仅局限于定性分析，同时该方法前处理步骤非常复杂，需要较长时间，因为前处理步骤太多也会导致目标物在前处理过程中的损失。
红外辐射是介于可见光与微波之间的电磁波，其波长范围在约0.76μm到1000μm之间，频率从4×1014Hz到3×1011Hz之间。红外辐射加热速度快，加热均匀，节能高效，安全无害。由于红外辐射具有高的热渗透力和安全性，是一种理想的热源，已被广泛应用在健康护理、动物养殖以及农副产品加工等领域。顶空固相微萃取技术(HS-SPME)集样品采集、萃取、浓缩、进样和分析于一体，操作简便，准确度高，特别适合于水相基体中有机物的萃取分离。目前，HS-SPME已被广泛应用于萃取各种样品中的极性或非极性、挥发或半挥发有机化合物。将红外辐射的高效和HS-SPME的富集作用联合起来，不仅可以提高分析的速度和灵敏度,而且还可以避免使用有机溶剂带来的污染。
气相色谱-三重四极杆串联质谱技术(GC-QqQ-MS/MS)具有保留时间和串联质谱确证的优点，大大提高了检测的准确性，其多反应监测(MRM)模式能够消除食品中复杂基质的干扰，选择性好，灵敏度高，己成为现代分析实验室一种快速、准确、可靠的分析工具。
由于茶叶中吡嗪化合物含量低微、易挥发、不稳定等特殊性能加之茶叶内源性组分的干扰，同时由于分析手段的限制如灵敏性和选择性不足，使得目前炒青绿茶中吡嗪化合物的研究仅局限于简单的定性研究层面。鉴于此，迫切需要开发高选择性与高灵敏性的快速分析方法，为炒青绿茶品质调控和工艺的提升提供理论指导。
发明内容
本发明提供了一种炒青绿茶中吡嗪类化合物的检测方法，红外辅助顶空固相微萃取技术结合气相色谱-三重四极杆串联质谱技术快速分析炒青绿茶中吡嗪类化合物，该方法为集高选择性与高灵敏性于一体的快速分析方法。
一种炒青绿茶中吡嗪类化合物的检测方法，包括如下步骤：
(1)配置一系列不同浓度的2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪的混合标准工作液，采用GC-QqQ-MS/MS进行多反应监测模式(MRM)分析，绘制色谱峰面积与对应吡嗪类化合物浓度的标准工作曲线；
以2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪的标准品为目标物，用乙醇定容配成1mg/mL的混合标准储备液，用乙醇逐级稀释至10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.0μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.02μg/mL、0.01μg/mL吡嗪类化合物标准工作溶液备用。
(2)红外辅助顶空固相微萃取提取炒青绿茶中的吡嗪类化合物，与步骤(1)相同的GC-QqQ-MS/MS条件下进行分析，然后将待测目标物的峰面积带入对应标准曲线中计算即得待测目标物的浓度。
优选地，红外辅助顶空固相微萃取包括如下步骤：
将炒青绿茶置于顶空瓶中，加入蒸馏水和乙醇，密封帽密封；采用红外灯辅助加热样品，将固相微萃取针刺穿密封帽隔膜然后推出萃取纤维头于顶空瓶上方进行吸附；萃取完成后，拔出固相微萃取针插入GC进样口，热解析后进行GC-QqQ-MS/MS分析。
优选地，所述萃取纤维头为65μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯、75μm Carboxen/聚二甲基硅氧烷、100μm聚二甲基硅氧烷或85μm聚丙烯酸酯；吸附时间为5～20min；红外功率为100～175W。
进一步优选地，所述萃取纤维头为75μm Carboxen/聚二甲基硅氧烷；吸附时间为14～16min；红外功率为140～160W。
最优选地，所述萃取纤维头为75μm Carboxen/聚二甲基硅氧烷；吸附时间为15min；红外功率为150W。
纤维头预处理过程为插入温度为270℃的进样口老化30min。
优选地，炒青绿茶、蒸馏水和乙醇的质量体积比为0.5g：1800～1900μl：200～100μl；热解析条件为270℃下解析5min。进一步优选地，炒青绿茶、蒸馏水和乙醇的质量体积比为0.5g：1900μl：100μl。
优选地，色谱分离条件为：
色谱柱VF-WAXms,(260℃，30m×250μm×0.25μm)；程序升温：初始柱温60℃，保持5min，以3℃/min升120℃，保持2min，然后再以30℃/min升至240℃，保持0min；载气：氦气(纯度99.999％)；载气流速：1.0mL/min；N2碰撞气流速1.5mL/min；进样方式：分流比50:1。
GC-QqQ-MS/MS质谱条件优化：优化的质谱参数主要有母离子、子离子和碰撞能量。首先，对标准储备液在m/z 40-400之间进行全扫描(Scan模式)，确定7种吡嗪类化合物的保留时间和一级质谱图，并从一级质谱图中选择适当的离子作为母离子；其次，对选定的母离子在产物离子扫描(Product ion Scan)模式下，分别对7种吡嗪类化合物进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，确定定性和定量离子对：2-甲基吡嗪定性和定量离子对分别为94→67和94→53、2,5-二甲基吡嗪定性和定量离子对分别为108→54和108→81、2-乙基吡嗪定性和定量离子对分别为107→52和107→79、2,3-二甲基吡嗪定性和定量离子对分别为108→67和108→93、2-乙基-6-甲基吡嗪定性和定量离子对分别为121→53和121→66、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪定性和定量离子对分别为135→107和135→80和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪定性和定量离子对分别为150→135和150→121；然后对其二级质谱的碰撞能量(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50eV)进行优化，为保证每种吡嗪化合物的灵敏度，按照每组需要监测离子的出峰顺序，分时段监测，同时控制每个时间段内监测的离子数目和驻留时间，使每个色谱峰具有恒定的循环扫描时间，并保证所有监测的化合物都有足够的数据采集点。最终优选的多反应监测(MRM)模式的优选条件如下，该参数使目标物定性更加准确，并能有效降低基质干扰。
质谱条件中各目标物的母离子、定性离子、定量离子、定性离子碰撞能量以及定量离子碰撞能量分别为：
2-甲基吡嗪：母离子94m/z、定性离子对94→67m/z、定量离子对94→53m/z、定性离子碰撞能量5～50eV、定量离子碰撞能量5～50eV；
2,5-二甲基吡嗪：母离子108m/z、定性离子对108→54m/z、定量离子对108→81m/z、定性离子碰撞能量5～50eV、定量离子碰撞能量5～50eV；
2-乙基吡嗪：母离子107m/z、定性离子对107→52m/z、定量离子107→79m/z、定性离子碰撞能量5～50eV、定量离子碰撞能量量5～50eV；
2,3-二甲基吡嗪：母离子108m/z、定性离子对108→67m/z、定量离子对108→93m/z、定性离子碰撞能量5～50eV、定量离子碰撞能量5～50eV；
2-乙基-6-甲基吡嗪：母离子121m/z、定性离子对121→53m/z、定量离子对121→66m/z、定性离子碰撞能量5～50eV、定量离子碰撞能量5～50eV；
3-乙基-2,5-二甲基吡嗪：母离子135m/z、定性离子对135→107m/z、定量离子对135→80m/z、定性离子碰撞能量5～50eV、定量离子碰撞能量5～50eV；
2,3-二乙基-5-甲基吡嗪：母离子150m/z、定性离子对150→135m/z、定量离子对150→121m/z、定性离子碰撞能量5～50eV、定量离子碰撞能量5～50eV。
进一步优选地，质谱条件中各目标物的定性离子碰撞能量以及定量离子碰撞能量分别为：
2-甲基吡嗪：定性离子对94→67m/z碰撞能量10eV、定量离子对94→53m/z碰撞能量10eV；
2,5-二甲基吡嗪：定性离子对108→54m/z碰撞能量20eV、定量离子对108→81m/z碰撞能量10eV；
2-乙基吡嗪：定性离子对107→52m/z碰撞能量25eV、定量离子107→79m/z碰撞能量25eV；
2,3-二甲基吡嗪：定性离子对108→67m/z碰撞能量10eV、定量离子对108→93m/z碰撞能量10eV；
2-乙基-6-甲基吡嗪：定性离子对121→53m/z碰撞能量20eV、定量离子对121→66m/z碰撞能量20eV；
3-乙基-2,5-二甲基吡嗪：定性离子对135→107m/z碰撞能量10eV、定量离子对135→80m/z碰撞能量20eV；
2,3-二乙基-5-甲基吡嗪：定性离子对150→135m/z碰撞能量10eV、定量离子对150→121m/z碰撞能量20eV。
余下质谱参数：传输线温度：280℃；离子源温度280℃；溶剂延迟：5min；电离方式：EI源；电离能量：70eV；Q2碰撞气：纯度≥99.999％的氮气。
优选地，采用标准加入法进行定量分析：在建立的最优的红外辅助顶空固相微萃取条件下，将10个不同系列浓度的标准溶液分别加入“空白基质样品”中，根据所选的特征定量离子的峰面积和相应的标准浓度，进行线性回归分析，得到标准工作曲线，在相同的条件下，通过将待测样品中目标挥发物的峰面积带入相应的标准曲线中来计算得出待测茶样中目标挥发物的含量。
所述炒青绿茶优选为西湖龙井、早春甘露或蒙顶山茶等。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明采用红外辅助顶空固相微萃取技术对炒青绿茶中吡嗪类化合物进行提取，样品前处理简单快速，避免了繁琐的预处理过程，无需有机溶剂，绿色环保。
2.本发明方法使用气相色谱-三重四极杆串联质谱技术的MRM模式测定炒青绿茶中吡嗪类化合物的含量，优化了每个化合物的碰撞能量，提高了检测灵敏度及降低了检出限，解决了炒青绿茶中吡嗪类化合物水平低，以及茶叶复杂基质对目标物的分析干扰严重的问题。
3.本发明建立的炒青绿茶中吡嗪类化合物检测方法，克服了现有技术的不足，提供一种炒青绿茶中吡嗪类化合物高选择性与高灵敏性于一体的快速分析方法。
附图说明
图1为吡嗪类化合物在MRM分析模式下的总离子流图(TIC)。
图2为吡嗪类化合物IRAE-HS-SPME提取条件优化结果图。
具体实施方式
通过下述实施例对本发明做进一步的说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限定。
实施例1
1.仪器与试剂
7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent Technologies公司)，10种炒青绿茶样品信息见表1，电子天平(SQP型，赛多利斯科学仪器有限公司)，固相微萃取手柄和萃取纤维头购买于Supelco公司(Bellefonte，PA，USA)，固相微萃取纤维头主要有65μm聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯(PDMS/DVB)，75μm Carboxen/聚二甲基硅氧烷(CAR-PDMS)，100μm聚二甲基硅氧烷(PDMS)，85μm聚丙烯酸酯(PA)；AL 204电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；顶空瓶(20ml，Agilent Technologies)；密封帽(聚四氟乙烯，AgilentTechnologies)；红外灯(100W，150W，175W，250W，275W，海宁市奇异照明电器有限公司，浙江)。
吡嗪标准品：2-甲基吡嗪(≥99％)、2,5-二甲基吡嗪(≥98％)、2-乙基吡嗪(≥99％)、2,3-二甲基吡嗪(99％)、2-乙基-6-甲基吡嗪(95％)、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪(≥99％)、2,3-二乙基-5-甲基吡嗪(≥98％)均购于北京普益华科技有限公司。
试剂：乙醇(AR，纯度≥99.7％)购于麦克林试剂公司；去离子水由娃哈哈公司提供。
表1炒青绿茶样本信息
Figure BDA0001701404290000071
Figure BDA0001701404290000081
2.实验方法
(a)标准工作溶液的制备：
以2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪的标准品为目标物，用乙醇定容配成1mg/mL的标准储备液，用乙醇逐级稀释至10.0μg/mL、5.0μg/mL、2.0μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.3μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.02μg/mL、0.01μg/mL吡嗪类标准工作溶液备用。
(b)红外辅助顶空固相微萃取技术提取吡嗪类化合物
I：萃取纤维头老化：将萃取纤维头装入手柄中，组成手动SPME进样器，插入温度为270℃的进样口老化30min钟后缩回纤维头，拔出进样器。
II：标样样品和炒青绿茶样品准备：加入1900μl蒸馏水和100μl不同浓度的吡嗪类化合物标准工作溶液(0.01μg/mL、0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL)于20ml顶空瓶中，用聚四氟乙烯密封帽拧紧；准确称取0.50g茶样于20ml顶空瓶中，加入1900μl蒸馏水和100μl乙醇，用聚四氟乙烯密封帽拧紧。
III：吡嗪类化合物萃取：将红外灯设置距离顶空瓶底部2cm，在150W的红外灯照射样品瓶，采用CAR-PDMS纤维头将固相微萃取针刺穿隔膜于样品上方进行吸附15min。
IV：样品解析：萃取完成后，固相微萃取针插入GC进样口，270℃下解析5min，采用GC-QqQ-MS/MS进行多反应监测模式分。
(c)气相色谱-三重四极杆串联质谱技术分析条件优化。
色谱分离条件：色谱柱VF-WAXms,(260℃，30m×250μm×0.25μm)；程序升温：初始柱温60℃，保持5min，以3℃/min升120℃，保持2min，然后再以30℃/min升至240℃，保持0min；载气：氦气(纯度99.999％)；载气流速：1.0mL/min；N2碰撞气流速1.5mL/min；进样方式：分流比50:1。
质谱条件优化：优化的质谱参数主要有母离子、子离子和碰撞能量。首先，对标准储备液在m/z 40-400之间进行全扫描(Scan模式)，确定7种吡嗪类化合物的保留时间和一级质谱图，并从一级质谱图中选择适当的离子作为母离子；其次，对选定的母离子在产物离子扫描(Product ion Scan)模式下，分别对7种吡嗪类化合物进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，确定定性和定量离子对：2-甲基吡嗪定性和定量离子对分别为94→67和94→53、2,5-二甲基吡嗪定性和定量离子对分别为108→54和108→81、2-乙基吡嗪定性和定量离子对分别为107→52和107→79、2,3-二甲基吡嗪定性和定量离子对分别为108→67和108→93、2-乙基-6-甲基吡嗪定性和定量离子对分别为121→53和121→66、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪定性和定量离子对分别为135→107和135→80和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪定性和定量离子对分别为150→135和150→121；然后对其二级质谱的碰撞能量(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50eV)进行优化，优选结果见表1。为保证每种吡嗪化合物的灵敏度，按照每组需要监测离子的出峰顺序，分时段监测，同时控制每个时间段内监测的离子数目和驻留时间，使每个色谱峰具有恒定的循环扫描时间，并保证所有监测的化合物都有足够的数据采集点。最终优选的多反应监测(MRM)模式的参数情况见表2，该参数使目标物定性更加准确，并且能有效降低基质干扰。
表2吡嗪类化合物保留时间、定性离子、定量离子及碰撞能量优化结果
Figure BDA0001701404290000091
Figure BDA0001701404290000101
其它质谱参数：传输线温度：280℃；离子源温度280℃；溶剂延迟：5min；电离方式：EI源；电离能量：70eV；Q2碰撞气：氮气(纯度≥99.999％)。
(d)吡嗪类化合物的定性及定量分析
定性分析：依据各标准品的保留时间及特征离子峰。
采用标准加入法进行定量分析：在建立的最优的红外辅助顶空固相微萃取条件下，将10个不同系列浓度的标准溶液分别加入“空白基质样品”中，根据所选的特征定量离子的峰面积和相应的标准浓度，进行线性回归分析，得到标准工作曲线。在相同的条件下，通过将待测样品中目标挥发物的峰面积带入相应的标准曲线中来计算得出待测茶样中目标挥发物的含量。
3.结果与分析
3.1红外辅助顶空固相微萃取技术提取条件优化
为了提高吡嗪类化合物的提取效率，基于优化的MRM采集参数，对吡嗪类化合物的红外辅助顶空固相微萃取提取条件进行了初步优化，主要包括萃取头类别(PDMS/DVB、CAR-PDMS、PDMS、PA)、提取时间(1、5、10、15、20min)和红外功率(100、150、175、250、275W)几个关键参数进行了优化，以吡嗪类化合物的总峰面积作为优选的指标，结果如图2所示，图中A为萃取头类别的优化结果图；B为提取时间的优化结果图；C为红外功率的优化结果图。最后优选的结果为采用CAR-PDMS萃取头在150W红外辐射下提取15min。
3.2吡嗪类化合物的定量标准曲线绘制、最低检测限、定量限及回收率测定
为了精确定量，对一系列浓度梯度的吡嗪类化合物标准品溶液进行GC-QqQ-MS/MS分析，并绘制了色谱峰面积与吡嗪类化合物浓度的标准曲线。如表3所示，所有标准曲线在极广的浓度范围内均呈现较好的线性关系，相关系数(correlation coefficient，R2)均高于0.990，很好地验证了分析方法的精确性和操作的准确性。此外，为了确保定量结果在可靠的检测浓度之内，考察了吡嗪类化合物的最低检测限(limit of determination，LOD)及最低定量限(limit of quantitation，LOQ)，以3倍信噪比为方法的检出限(LOD)，10倍信噪比为定量限(LOQ)。结果表明，各萜类化合物对映异构体的LOD及LOQ在数量级上无明显差异，均可低至ng/ml级别，其中LOD介于1.46—3.27ng/ml，LOQ介于4.89—10.90ng/ml，充分说明该分析方法的灵敏度较为理想。
表3吡嗪类化合物的线性浓度范围、检测限与定量限
Figure BDA0001701404290000111
为了进一步验证该分析方法的可靠性，对吡嗪类化合物的回收率进行测定。如表4所示，在茶样中添加了一定浓度的吡嗪类化合物标准品后，所计算出的加标回收率介于86.4％—116.4％，RSD值介于1.76％—8.38％。以上结果充分表明了分析方法具有较强的可靠性。
表4吡嗪类化合物的回收率及RSD值测定
Figure BDA0001701404290000121
3.3炒青绿茶中吡嗪类化合物的定性定量分析
通过对10种典型炒青绿茶样品进行分析，共鉴定7种吡嗪类化合物，包括2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪，其结果见表5。
表5炒青绿茶中吡嗪类化合物的含量
Figure BDA0001701404290000122
Figure BDA0001701404290000131
10种典型炒青绿茶样品中2-甲基吡嗪含量介于399.17～1559.21ng/ml，2,5-二甲基吡嗪吡嗪含量介于314.90～4098.96ng/ml，2-乙基吡嗪含量介于74.20～292.75ng/ml，2,3-二甲基吡嗪含量介于41.34～438.39ng/ml，2-乙基-6-甲基吡嗪含量介于38.53～457.42ng/ml，3-乙基-2,5-二甲基吡嗪含量介于94.51～2400.97ng/ml，2,3-二乙基-5-甲基吡嗪含量介于21.47～164.47。由于品种、产地、气候、土壤、加工方式等因素的影响，不同炒青绿茶样品间吡嗪类化合物的差异较大。
以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征并不局限于此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (1)

1.一种炒青绿茶中吡嗪类化合物的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配置一系列不同浓度的2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和2,3-二乙基-5-甲基吡嗪的混合标准工作液，加入“空白基质样品”中，进行GC-QqQ-MS/MS分析，在多反应监测模式下进行检测，并绘制色谱峰面积与对应吡嗪类化合物浓度的标准工作曲线；
(2)红外辅助顶空固相微萃取提取炒青绿茶中的吡嗪类化合物，与步骤(1)相同的GC-QqQ-MS/MS条件下进行分析，然后将待测目标物的峰面积代入对应标准曲线中计算即得待测样中目标物的浓度；
红外辅助顶空固相微萃取包括如下步骤：
将炒青绿茶置于顶空瓶中，加入蒸馏水和乙醇，密封帽密封；采用红外灯辅助加热样品，将固相微萃取针刺穿密封帽隔膜然后推出萃取纤维头于顶空瓶上方进行吸附；萃取完成后，拔出固相微萃取针插入GC进样口，热解析后进行GC-QqQ-MS/MS分析；
所述萃取纤维头为75μm Carboxen/聚二甲基硅氧烷；吸附时间为14～16min；红外功率为140～160W；
炒青绿茶、蒸馏水和乙醇的质量体积比为0.5g：1800～1900μl：200～100μl；热解析条件为270℃下解析5min；
色谱分离条件为：
色谱柱VF-WAXms,260℃，30m×250μm×0.25μm；程序升温：初始柱温60℃，保持5min，以3℃/min升120℃，保持2min，然后再以30℃/min升至240℃，保持0min；载气：氦气，纯度99.999％；载气流速：1.0mL/min；N2碰撞气流速1.5mL/min；进样方式：分流比50:1；
质谱条件中各目标物的母离子、定性离子、定量离子、定性离子碰撞能量以及定量离子碰撞能量分别为：
2-甲基吡嗪：母离子94m/z、定性离子对94→67m/z、定量离子对94→53m/z、定性离子碰撞能量10eV、定量离子碰撞能量10eV；
2,5-二甲基吡嗪：母离子108m/z、定性离子对108→54m/z、定量离子对108→81m/z、定性离子碰撞能量20eV、定量离子碰撞能量10eV；
2-乙基吡嗪：母离子107m/z、定性离子对107→52m/z、定量离子107→79m/z、定性离子碰撞能量25eV、定量离子碰撞能量25eV；
2,3-二甲基吡嗪：母离子108m/z、定性离子对108→67m/z、定量离子对108→93m/z、定性离子碰撞能量10eV、定量离子碰撞能量10eV；
2-乙基-6-甲基吡嗪：母离子121m/z、定性离子对121→53m/z、定量离子对121→66m/z、定性离子碰撞能量20eV、定量离子碰撞能量20eV；
3-乙基-2,5-二甲基吡嗪：母离子135m/z、定性离子对135→107m/z、定量离子对135→80m/z、定性离子碰撞能量10eV、定量离子碰撞能量20eV；
2,3-二乙基-5-甲基吡嗪：母离子150m/z、定性离子对150→135m/z、定量离子对150→121m/z、定性离子碰撞能量10eV、定量离子碰撞能量20eV；
余下质谱参数：传输线温度：280℃；离子源温度280℃；溶剂延迟：5min；电离方式：EI源；电离能量：70eV；Q2碰撞气：纯度≥99.999％的氮气；
采用标准加入法进行定量分析：在建立的最优的红外辅助顶空固相微萃取条件下，将10个不同系列浓度的标准溶液分别加入“空白基质样品”中，根据所选的特征定量离子的峰面积和相应的标准浓度，进行线性回归分析，得到标准工作曲线，在相同的条件下，通过将待测样品中目标挥发物的峰面积代入相应的标准曲线中来计算得出待测茶样中目标物的含量。
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