CN110146638A - 一种测定放线菌新种m8jj-5中脂肪酸种类的方法 - Google Patents

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Abstract

本方案公开了放线菌中细胞脂肪酸检测技术领域的一种测定放线菌新种M8JJ‑5中脂肪酸种类的方法，包括以下步骤：步骤一、制备皂化试剂、甲基化试剂、萃取溶剂、碱洗涤试剂；步骤二、样品处理、向试管内依次加入皂化试剂、甲基化试剂、萃取溶剂、碱洗涤试剂；步骤三、样品测试：抽取试管内的上层有机层注入到Trace1310气相色谱串联TraceISQ质谱仪内，并用Nist08Library软件进行分析。本发明较全面的提供了一种快速、准确的方法。

Description

一种测定放线菌新种M8JJ-5中脂肪酸种类的方法
技术领域
本发明涉及放线菌细胞脂肪酸检测的技术领域，具体涉及一种测定放线菌新种M8JJ-5中脂肪酸种类的方法。
背景技术
脂肪酸是细菌细胞脂类的主要成分，是细胞膜和细胞壁的组成成分,是一类重要的分类特征。脂肪酸的类型、大小和不饱和度对细胞膜的理化性质影响很大。放线菌脂肪酸碳链的大小一般主要在C12-C18之间，类型有支链、分支和复杂形式。
脂肪酸的分析应在标准化的条件下进行，因为脂肪酸组分的相对含量因菌龄与培养条件的不同而异，在进行不同种属放线菌的脂肪酸测定时，要确保获得的菌体是在相同培养条下且应在对数生长期后获得，当前通常采用MIDI(MicrobialIdentificationSystem)Sherlock全自动微生物鉴定系统，对不同菌株的脂肪酸图谱分析，同时与标准数据库进行比对，确定菌体的细胞脂肪酸成分。该方法由于是通过对细胞中的脂肪酸和脂肪酸标准品在气相色谱上的出峰时间进行比对，进而确定细胞脂肪酸的种类。具有准确度不高，需要购买标准品的缺点。
发明内容
本发明意在提供一种测定放线菌新种M8JJ-5中脂肪酸种类的方法，以解决现有的检测方法准确度不高的问题。
本方案中的一种测定放线菌新种M8JJ-5中脂肪酸种类的方法，包括以下步骤：
步骤一、试剂的制备：
①试剂1-皂化试剂：将45gNaOH溶于150mL甲醇内，并加入150mL蒸馏水；
②试剂2-甲基化试剂：190mL浓盐酸、275mL甲醇溶于135mL蒸馏水；
③试剂3-萃取溶剂：200mL正己烷与200mL甲基叔丁醚混合均匀；
④试剂4-碱洗涤试剂：10.8gNaOH溶于900mL蒸馏水；
步骤二、样品处理：
①将活化好的放线菌菌株M8JJ-5接种于R2A固体培养基中，在30℃培养至对数生长期后收获菌体培养物；
②皂化：取0.1g的菌体培养物置于试管中，并向试管内加入1～3mL的试剂1，拧紧试管盖并震荡5～10s，放入95～100℃的沸水浴中水浴30min；
③甲基化：打开管盖后，试管内加入1.9～2.1mL的试剂2，拧紧试管盖后震荡5～10s，在79～81℃的温度下水浴10min后取出冷却至室温；
④萃取：再向试管内加入1.15～1.3mL的试剂3，拧紧试管盖并快速震荡10min，离心后弃去下层水相；
⑤洗涤：加入2.8～3.2mL试剂4到试管内，并拧紧试管盖，震荡试管5min，离心3min；
步骤三、样品测试：
抽取试管内的上层有机层注入到气相色谱串联TraceISQ质谱仪内，并用Nist08Library软件进行分析。
有益效果:现有的通常采用MIDI(MicrobialIdentificationSystem)Sherlock全自动微生物鉴定系统，这是美国MIDI公司依据自20世纪60年代以来对微生物细胞脂肪酸的研究经验，开发的一套根据微生物中特定脂肪酸的种类和含量进行鉴定和分析的软件。该系统备有图谱识别软件和微生物鉴定系统中的数据库资源。另外，该软件可以操控气相色谱，利用气相色谱将微生物中的不同脂肪酸分离开来，然后与MIDI系统中已有脂肪酸的种类和含量的图谱进行比对，从而对微生物种类进行鉴定。MIDI系统对已知微生物种类鉴定比较准确，但对微生物新种的鉴定并不适用。这种采用单一气相色谱配套MIDI系统对菌株的脂肪酸进行检测时，是根据菌株脂肪酸提取样品和脂肪酸标准品的出峰时间来进行对比，检测条件稍有变化，出峰时间可能会变，重现性不好，因此准确度低；而本方案利用Trace1310气相色谱串联TraceISQ质谱仪配合NIST谱库进行测定，测定时不需要同时检测脂肪酸标准品，而是首先利用气相色谱将不同脂肪酸分离开，然后利用质谱仪的离子源将样品中各种有机分子轰击成分子离子，分子离子进一步碎裂成各种碎片离子、中性离子和游离基，再利用电磁学原理使离子按不同的质荷比分离并测量各种离子的强度，从而确定被测有机物的分子量和结构。再通过与NIST数据库中已有的数据进行比对，将气相色谱峰对应的有机物成分、结构式、分子量等鉴定出来，因此准确度较高。
进一步，所述皂化中将试管水浴5min后取出震荡10s，再继续水浴加热25min。通过取出震荡判断试管内是否有气泡上升，以此判断试管盖是否盖紧，以防止水浴过程中试管内的试剂蒸发。
进一步，所述皂化步骤中加入3mL的试剂1。通过加大试剂1的加入量能够防止在甲基化步骤中出现盐颗粒。
进一步，所述洗涤中离心的转速为2000r/min。此转速下可避免脂肪酸链断裂。
进一步，所述皂化中水浴的温度为100℃。此温度下皂化效果好。
附图说明
图1是放线菌新种M8JJ-5细胞脂肪酸提取物总离子流图；
图2～图10为放线菌M8JJ-5细胞脂肪酸提取物的成分图；
图11为放线菌新种M8JJ-5细胞脂肪酸成分分析图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细的说明：
仪器：Trace1310-TraceISQ气相色谱-质谱联用仪(美国ThermoScientific)，ST8R型冷冻离心机(美国ThermoScientific)，HH·S11-2-S水浴锅(上海跃进)，chorus超纯水系统(ELGA)，VORTEX-5涡旋混合器(海门市其林贝尔)。
色谱柱：HP-5MS(30m×0.25mmi.d.×0.25μmfilmthickness；ThermoScientific)；载气:氦气；流量1ml/min；进样量：2μL；进样口：270℃；平衡时间0.5min；隔垫吹扫5mL/min；不分流模式进样；升温程序：起始温度90℃，保持1min，以10℃/min升至180℃，随后以2℃/min升至210℃，最后以20℃/min的速度升至270℃并维持2min。
质谱条件
电离模式：电子轰击源(EI)，电子能量70eV；离子源温度：250℃；传输线温度：250℃；溶剂延迟时间：3.0min；离子检测模式：全扫描(SCAN)，扫描范围为(m/z)50-550；运用NIST谱库检索所有峰。
实验试剂：正已烷(色谱纯)，甲基叔丁醚，甲醇，氢氧化钠，氯化钠，浓盐酸。
一种测定放线菌新种M8JJ-5中脂肪酸种类的方法,本方法的步骤如下：
步骤一、试剂的制备：
①试剂1-皂化试剂：将45gNaOH溶于150mL甲醇内，并加入150mL蒸馏水；
②试剂2-甲基化试剂：190mL浓盐酸、275mL甲醇溶于135mL蒸馏水；
③试剂3-萃取溶剂：200mL正己烷与200mL甲基叔丁醚混合均匀；
④试剂4-碱洗涤试剂：10.8gNaOH溶于900mL蒸馏水；
步骤二、样品处理：
①将活化好的放线菌株M8JJ-5接种于R2A固体培养基中，在30℃培养至对数生长期后期收获菌体培养物；
②皂化：取5ml的菌株培养物置于试管中，并向试管内加入1mL的试剂1，拧紧试管盖并震荡5s，放入95℃的沸水浴中水浴30min；
③甲基化：打开管盖后，试管内加入1.9mL的试剂2，拧紧试管盖后震荡5s，在79℃的温度下水浴10min后取出冷却至室温；
④萃取：再向试管内加入1.15mL的试剂3，拧紧试管盖并快速震荡10min，离心后弃去下层水相；
⑤洗涤：加入2.8mL试剂4到试管内，并拧紧试管盖，震荡试管5min，在离心3min；
步骤三、样品测试：抽取试管内的上层有机层注入到Trace 1310气相色谱串联TraceISQ质谱仪内，并用Nist08Library软件进行分析。
过气相色谱串联质谱测定(图1)，运用Nist08Library软件检索，得到有效成分见图2～图10、图11。得到放线菌M8JJ-5细胞脂肪酸提取物的主要成分为：iso-C16:0，anteiso-C15:0，anteiso-C17:0，iso-C15:0，iso-C14:0等。

Claims (5)

1.一种测定放线菌新种M8JJ-5中脂肪酸种类的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、试剂的制备：
①试剂1-皂化试剂：将45gNaOH溶于150mL甲醇内，并加入150mL蒸馏水；
②试剂2-甲基化试剂：190mL浓盐酸、275mL甲醇溶于135mL蒸馏水；
③试剂3-萃取溶剂：200mL正己烷与200mL甲基叔丁醚混合均匀；
④试剂4-碱洗涤试剂：10.8gNaOH溶于900mL蒸馏水；
步骤二、样品处理：
①将活化好的放线菌菌株M8JJ-5接种于R2A固体培养基中，在30℃培养至对数生长期后收获菌体培养物；
②皂化：取0.1g的菌体培养物置于试管中，并向试管内加入1～3mL的试剂1，拧紧试管盖并震荡5～10s，放入95～100℃的沸水浴中水浴30min；
③甲基化：打开管盖后，试管内加入1.9～2.1mL的试剂2，拧紧试管盖后震荡5～10s，在79～81℃的温度下水浴10min后取出冷却至室温；
④萃取：再向试管内加入1.15～1.3mL的试剂3，拧紧试管盖并快速震荡10min，离心后弃去下层水相；
⑤洗涤：加入2.8～3.2mL试剂4到试管内，并拧紧试管盖，震荡试管5min，离心3min；
步骤三、样品测试：
抽取试管内的上层有机层注入到气相色谱串联TraceISQ质谱仪内，并用Nist08Library软件进行分析。
2.根据权利要求1所述的测定放线菌新种M8JJ-5中脂肪酸种类的方法，其特征在于：所述皂化中将试管水浴5min后取出震荡10s，再继续水浴加热25min。
3.根据权利要求2所述的测定放线菌新种M8JJ-5中脂肪酸种类的方法，其特征在于：所述皂化步骤中加入3mL的试剂1。
4.根据权利要求3所述的测定放线菌新种M8JJ-5中脂肪酸种类的方法，其特征在于：所述洗涤中离心的转速为2000r/min。
5.根据权利要求4所述的测定放线菌新种M8JJ-5中脂肪酸种类的方法，其特征在于：所述皂化中水浴的温度为100℃。
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