CN102016032B

CN102016032B - 使植物的油脂增产的基因及其利用方法

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Publication number: CN102016032B
Application number: CN200980116011.3A
Authority: CN
Inventors: 大音德; 茶谷大志; 近藤聪; 光川典宏; 村本伸彦; 高木优; 松井恭子
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2008-03-04
Filing date: 2009-03-03
Publication date: 2014-05-07
Anticipated expiration: 2029-03-03
Also published as: CA2717727C; CN102016032A; US20110081691A1; CA2717727A1; US9045786B2; WO2009110466A1; AU2009220650B2; JP5299886B2; JP2009207421A; AU2009220650A1

Abstract

探索具有能够提高每个个体的物质生产性的新功能的转录调控因子，提高植物体内的这些特性。使属于包括含有序列号4所示氨基酸序列的转录因子的转录因子家族转录因子与阻遏物结构域融合而成的嵌合蛋白质在植物体内表达。

Description

使植物的油脂增产的基因及其利用方法

背景技术

所谓生物量(biomass)，一般是指在每一定面积生息或存在的生物的总量，特别在以植物为对象的情况下，意味着每单位面积的干重。生物量的单位以质量或能量来数值化。所谓生物量的表达与“生物体量”、“生物量”是同义语，在植物生物量的情况下还有时使用“现存量(Standing crop)”的用语。植物生物量是使用太阳能固定大气中的二氧化碳而生成的，因而可以作为所谓碳中和的能量而被捕获。因此，增加植物的生物量具有保全地球环境、防止地球温暖化、降低温室效应气体排放的效果。因此，使植物生物量增产的技术在产业上很重要性

另一方面，植物是以获得其一部分组织本身(种子、根、叶茎等)为目的栽培的，或者是以生产油脂等各种物质为目的栽培的。例如，作为由植物产生的油脂，大豆油、胡麻油、橄榄油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、红花油、棕榈油和菜籽油等自古以来已经为人们所知，在家庭用途和/或工业用途中被广泛利用。另外，由植物产生的油脂也可以作为生物柴油燃料和/或生物塑料的原料使用，作为石油替代能源应用性正在扩大。

在这样的现状下，为了使用植物在工业上成功地进行油脂生产，需要提高每单位耕地面积的生产性。这里假定每单位耕地面积的栽培个体数一定，则可判定需要提高每个个体的油脂生产量。在从由植物体采摘的种子中回收油脂的情况下，通过提高每个个体的种子产量、和提高种子中的油脂含量等技术，可期待能够实现提高每个个体的油脂生产量。

增加植物种子的油脂生产量的技术大致分为通过改良栽培法的技术、油脂增产品种的开发。油脂增产品种的开发方法大致分为以杂交技术为核心的现有育种法和利用基因重组的分子育种法。作为利用基因重组的油脂增产技术，已知：A)改变作为植物油脂的主成分的种子三酰甘油(TAG)的合成体系的技术、和B)对调控植物的形态形成和/或代谢和与它们相关的基因的表达的各种调控基因进行改变的技术。

对于上述A)的方法，作为增加以通过光合成生产的糖为原料合成的TAG的合成量的方法，可以考虑(1)提高从作为TAG的构成成分的脂肪酸、或甘油的糖的合成活性的方法、(2)强化由甘油和脂肪酸合成TAG的反应的方法。对于这些方法，作为使用基因工程学方法的技术，报告了以下技术。作为(1)的例子，可列举通过使拟南芥的细胞质型乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)在油菜籽的质粒中过量表达，从而将种子的油脂含量提高5％的报告(非专利文献1)。另外，作为(2)的例子，可列举涉及通过在二酰甘油的sn-3位转移酰基的DGAT(二酰甘油乙酰转移酶)的过量表达来使油脂增产的技术的报告(非专利文献2)。在非专利文献2的方法中，还报告了有时油脂含量和种子重量随着DGAT的表达量增加而增加，每个个体的种子数增加。应用了该方法的拟南芥的种子油脂含量增加46％，每个个体的油脂量最高增加约125％。

另一方面，作为上述B)的方法，可以考虑对与生物合成体系酶基因的表达调控相关的转录因子基因的表达进行调控的方法。作为其例子可列举专利文献1。在该专利文献1中，采用了制作大范围地将转录因子过量表达或敲除而得的重组植物，然后筛选出提高种子的油脂含量的基因的方法。专利文献1记载了通过ERF亚族B-4转录因子基因的过量表达而使种子的油脂含量增加了23％。但是，在专利文献1中，没有记载每个个体的油脂含量增减。另外，非专利文献3记载了通过使作为具有AP2/EREB结构域的转录因子的WRINKLED1过量表达，可以提高种子的油脂含量。

然而，虽然以改良各种性状为目的开发了上述的分子育种法，但伴随植物的重量增产、特定的组织增产、或目的物质的生产性提高的提高产量的技术尚未达到实用的程度。

认为其原因在于：未发现真正优异的基因；在试验阶段有效的重组新品种在实用阶段多样的自然环境下不能发挥如期待的效果。另外，植物的重量增产、特定的组织增产、或目的物质的生产性等量的性状与从调控体系到代谢体系的各步骤中的大量基因相关，发现、开发改善量的性状的真正优异的有用基因是困难的。为了解决这些问题，发现效果非常高的新基因、开发虽然效果水平同等但能在实用环境条件下发挥效果的基因成为课题。

非专利文献1：Plant Physiology(1997)Vol.11，pp.75-81

非专利文献2：Plant Physiology(2001)，Vol.126，pp.861-874

非专利文献3：Plant J.(2004)40，575-585

专利文献1：WO01/36597

发明内容

发明要解决的问题

因此，鉴于上述事实，本发明的目的是探索具有能够提高每个个体的物质生产性、特别是种子中的油脂量的新功能的基因，提供能够提高植物体中的这些特性的技术。

用于解决问题的方法

为了实现上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现，通过表达由属于特定的转录因子家族的转录因子与将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽(以下，也有时称为阻遏物结构域)融合而成的嵌合蛋白质，可以改善各种量的性状，特别是可以提高每个个体的物质生产性、特别是油脂生产性，从而完成了本发明。

本发明所涉及的植物体表达由转录因子和功能性肽融合而成的嵌合蛋白质，所述转录因子属于包括含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质的转录因子家族，所述功能性肽是将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽。在本发明所涉及的植物体中，优选通过融合功能性肽，来抑制规定的转录因子的转录调控活性、特别是转录促进活性。

这里，作为融合上述功能性肽的转录因子，优选为以下(a)～(c)的任一蛋白质。

(a)含有序列号4所示氨基酸序列的蛋白质，

(b)含有在序列号4所示氨基酸序列中缺失、置换、添加或插入了1或多个氨基酸而得的氨基酸序列、并具有转录促进活性的蛋白质，

(c)由与含有序列号3所示碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码、并具有转录促进活性的蛋白质。

这里作为上述功能性肽，可列举以下所示的式(1)～(8)。

(1)X1-Leu-Asp-Leu-X2-Leu-X3

(其中，式中的X1表示0～10个氨基酸残基，X2表示Asn或Glu，X3表示至少6个氨基酸残基。)

(2)Y1-Phe-Asp-Leu-Asn-Y2-Y3

(其中，式中的Y1表示0～10个氨基酸残基，Y2表示Phe或Ile，Y3表示至少6个氨基酸残基。)

(3)Z1-Asp-Leu-Z2-Leu-Arg-Leu-Z3

(其中，式中的Z1表示Leu、Asp-Leu或Leu-Asp-Leu，Z2表示Glu、Gln或Asp，Z3表示0～10个氨基酸残基。)

(4)Asp-Leu-Z4-Leu-Arg-Leu

(其中，式中的Z4表示Glu、Gln或Asp。)

(5)α1-Leu-β1-Leu-γ1-Leu

(6)α1-Leu-β1-Leu-γ2-Leu

(7)α1-Leu-β2-Leu-Arg-Leu

(8)α2-Leu-β1-Leu-Arg-Leu

(其中，式(5)～(8)中，α1表示Asp、Asn、Glu、Gln、Thr或Ser，α2表示Asn、Glu、Gln、Thr或Ser，β1表示Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser或His，β2表示Asn、Arg、Thr、Ser或His，γ1表示Arg、Gln、Asn、Thr、Ser、His、Lys或Asp，γ2表示Gln、Asn、Thr、Ser、His、Lys或Asp。)

另外，使用本发明所涉及的植物体的物质制造方法，包括从上述本发明所涉及的植物体中分离和回收生产性提高了的物质。这里，作为上述物质可列举油脂。

另一方面，为了实现上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现，在与色素合成途径相关的基因缺失的植株中，可以提高每个个体的物质生产性、特别是油脂生产性，从而完成了本发明。所谓与色素合成途径相关的基因，包括：编码涉及色素合成途径代谢反应的底物和/或产物的输送的因子的基因、编码催化色素合成途径代谢反应的酶的基因、和/或编码催化形成色素合成途径代谢反应的场所的反应的酶的基因。还包括：对编码涉及色素合成途径代谢反应的底物和/或产物的输送的因子的基因、编码催化色素合成途径代谢反应的酶的基因、和/或编码催化形成色素合成途径代谢反应的场所的反应的酶的基因的表达进行调控的基因。

即，本发明所涉及的植物来源油脂的制造方法包括从由选自查耳酮合酶基因、查耳酮异构酶基因和黄酮-3-水化酶基因中的至少1种基因的功能缺失的植物体采摘的种子中回收油脂成分的工序。

另外，本发明所涉及的油脂量提高了的植物体的筛选方法，包括以下工序：从作为评价种子内的油脂量的对象的植物体采摘种子的工序；以及观察采摘的种子的种皮色，将颜色更白的情况判定为种子内的油脂量高的工序。

发明的效果

本发明所涉及的植物体是每个个体的物质生产性提高了的植物体。因此，通过使用本发明所涉及的植物体，可以实现提高目的物质的生产性，从而可以以低成本制造目的物质。

另外，本发明的植物来源油脂的制造方法在特定的基因的功能缺失的植物体中大幅提高每单位量的种子所含的油脂量，因此可以提高油脂生产性。

而且，本发明的油脂量提高了的植物体的筛选方法非破坏地评价种子内的油脂量，因此可以使用小量的种子迅速、且简便地进行筛选。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2008-054008号说明书和/或附图所记载的内容。

附图说明

图1是显示导入了各改良型转录因子基因、改良型转录共激活因子基因或转录因子基因的家系和野生株的种子油脂含量的测定结果的特性图。

图2是显示色素合成途径缺失株和野生株的种子油脂含量的测定结果的特性图。

图3是显示对于种子的种皮色使用图像数据计算出R值、G值和B值的乘积值，并与野生型的种子进行比较的结果的特性图。

具体实施方式

以下，详细说明本发明。

本发明所涉及的植物体表达属于规定的转录调控因子家族的转录调控因子，特别是属于规定的转录因子家族的转录因子与将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽融合而成的嵌合蛋白质，与野生型植物体相比，每个个体的物质生产性提高了。即，本发明所涉及的植物体是以所需的植物为对象，为了显著提高该植物中的物质生产性，而使转录因子作为与上述功能性肽的嵌合蛋白质表达的植物体。

特别是在本发明所涉及的植物体中，优选通过与上述功能性肽融合来抑制转录因子的转录促进活性。换言之，本发明所涉及的植物体优选具有如下特征：表达转录因子与上述功能性肽融合而成的嵌合蛋白质，结果由上述功能性肽所产生的转录抑制效果作为优势的性状而显现出来。

这里，所谓每个个体的物质生产性意味着由植物产生的各种物质的每单位体积的含量。作为物质，不特别限定，既可以是植物体本来产生的物质，也可以是植物体本来不产生但能够通过基因操作技术等产生的物质。特别是如果每个组织的目的生产物的含量高，则能够降低精制成本和/或运输成本，因此产业上的有用性高。特别是作为目的生产物，可以是占植物的大部分重量的木质纤维素，也可以是作为种子油在产业上利用的植物油。植物油可以是作为脂肪酸与醇的酯的单纯脂质，也可以是含有磷、糖和/或氮等的复合脂质，还可以是脂肪酸本身。作为单纯脂质的醇，可以是分子量高的高级醇，也可以是丙三醇(甘油)等多元醇。作为单纯脂质的脂肪酸，可以是饱和脂肪酸，也可以是不饱和脂肪酸，另外，还可以是含有羟基和/或环氧基的特殊脂肪酸。作为甘油与脂肪酸的酯的单纯脂质，可以是单酰甘油，也可以是二酰甘油，还可以是三酰甘油。

在以下的说明中，作为提高其生产性的物质例示油脂进行说明，但本发明的技术范围不限于此。本发明对于作为植物所产生的物质的除油脂以外的物质也同样适用。

这里，作为植物体，不特别限定，可以以任何植物为对象。特别优选以一直以来用于油脂生产的植物为对象。作为对象植物，可列举例如，大豆、胡麻、橄榄油、椰子、稻、棉花、向日葵、玉米、甘蔗、麻疯树、椰子(パ一ムヤシ)、烟草、红花和油菜籽等。另外，还可以以在植物的基因分析中作为模型生物被广泛应用的、已确立了基因表达分析方法的拟南芥为对象植物。

另外，所谓转录因子的嵌合蛋白质所具有的转录抑制活性，是指识别该转录因子所识别的cis序列、和/或与该cis序列类似的其他转录因子中的cis序列，积极地抑制下游基因表达的活性，也称为转录抑制因子。对使转录因子的嵌合蛋白质具有的转录抑制活性的方法，不特别限定，特别是构建添加了阻遏物结构域序列和/或SRDX序列的嵌合蛋白质(融合蛋白质)的方法是最优选的。

在该方法中所谓阻遏物结构域序列，是指构成将任意转录因子转换成转录抑制因子的肽的氨基酸序列，是由本发明者们发现的各种序列。对于使用阻遏物结构域序列的方法，例如，可以参考特开2001-269177公报、特开2001-269178公报、特开2001-292776公报、特开2001-292777公报、特开2001-269176公报、特开2001-269179公报、国际公开第WO03/055903号小册子、Ohta，M.，Matsui，K.，Hiratsu，K.，Shinshi，H.and Ohme-Takagi，M.，The Plant Cell，Vol.13，1959-1968，August，2001和Hiratsu，K.，Ohta，M.，Matsui，K.，Ohme-Takagi，M.，FEBS Letters 514(2002)351-354。阻遏物结构域序列是从II类ERF(Ethylene Responsive Element Binding Factor)蛋白质和/或植物的锌指蛋白(Zinc Finger Protein、例如拟南芥SUPERMAN蛋白质等)中截取的序列，具有极其单纯的结构。

作为以嵌合蛋白质的形式表达的转录调控因子，可以列举拟南芥中由AGI编码的At1g71030所特定的转录因子(以下，简称为“转录因子At1g71030”)。已知转录因子At1g71030是myb家族的转录因子，与大麦来源的MybHv5GI：19055类似。转录因子At1g71030的氨基酸序列示于序列号4。编码转录因子At1g71030的基因的碱基序列示于序列号3。

另外，由At5g24520所特定转录共激活因子(transcription coactivator)(以下，简称为“转录共激活因子At5g24520”)、转录抑制因子(transcriptionrepressor)和/或转录共抑制因子(transcripition corepressor)作为转录调控因子已经为人们所知，对于这些转录共激活因子和/或转录抑制因子也同样可以构建添加了阻遏物结构域的嵌合蛋白质。此外，AGI编码的At5g24520是作为transparent testa glabra 1protein(TTG1)已知的转录共激活因子。在其他植物来源的基因中，已知苹果(Malus domestica)来源的GenBank登录号AAF27919所编码的蛋白质、碧冬茄(Petunia hybrida)来源的GenBank登录号AAC18914所编码的蛋白质、棉花(Gossypium hirsutum)来源的GenBank登录号AAM95645所编码的蛋白质、紫苏(Perilla frutescens)来源的GenBank登录号BAB58883所编码的蛋白质与转录共激活因子At5g24520同源，可以期待与本说明书所记载的功能同等的功能。转录共激活因子At5g24520的氨基酸序列示于序列号2。编码转录共激活因子At5g24520的基因的碱基序列示于序列号1。

另外，作为嵌合蛋白质的对象的转录共激活因子At5g24520和转录因子At1g71030分别不仅限于含有序列号2和4所示氨基酸序列的蛋白质，也可以是含有在该氨基酸序列中缺失、置换、添加或插入了1或几个氨基酸序列的氨基酸序列、且具有转录促进活性的蛋白质。这里，作为几个氨基酸，例如，表示1～20个，优选为1～10个，更优选为1～7个，进一步优选为1个～5个，特别优选为1个～3个。此外，氨基酸的缺失、置换或添加可以通过利用该技术领域公知的方法改变编码上述转录因子的碱基序列来进行。为了在碱基序列中导入突变，可以通过Kunkel法或Gappedduplex法(缺口双链体法)等公知方法或依据这些公知方法的方法来进行，例如，使用利用了定点诱变法的突变引入用试剂盒(例如Mutant-K和/或Mutant-G (均为商品名，TAKARA Bio社制))等，或使用LA PCR in vitroMutagenesis系列试剂盒(商品名，TAKARA Bio社制)来引入突变。另外，作为突变引入方法，还可以是使用以EMS(甲磺酸乙酯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、其他致癌性化合物为代表的化学诱变剂的方法，还可以是利用以X射线、α射线、β射线、γ射线、离子束为代表的放射线处理和/或紫外线处理的方法。

另外，作为嵌合蛋白质的对象的转录共激活因子和转录因子不限于拟南芥中的转录共激活因子At5g24520和转录因子At1g71030，还包括除拟南芥以外的植物(例如上述的植物)中具有相同功能的转录共激活因子和转录因子(以下，分别称为同源转录共激活因子和同源转录因子)。对于转录共激活因子At5g24520的同源转录共激活因子或转录因子At1g71030的同源转录因子，如果植物基因组信息已清楚，则可以基于转录共激活因子At5g24520或转录因子At1g71030的氨基酸序列或各基因的碱基序列从检索对象植物的基因组信息中进行检索。这时，作为同源转录共激活因子和同源转录因子，检索与转录共激活因子At5g24520或转录因子At1g71030的氨基酸序列具有例如为70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的同源性的氨基酸序列。这里，同源性的值意味着使用安装了blast算法的计算机程序和存储了基因序列信息的数据库、以默认设定求得的值。

另外，在植物基因组信息不清楚的情况下，可以从对象植物提取基因组或构建对象植物的cDNA文库，通过分离与转录共激活因子At5g24520或转录因子At1g71030的碱基序列的至少一部分在严格条件下杂交的基因组区域或cDNA来鉴定同源基因。这里，所谓严格条件，是指形成所谓特异性的杂种、且不形成非特异性的杂种的条件。例如，可列举在45℃、6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)下进行杂交、然后在50～65℃、0.2～1×SSC、0.1％SDS下进行洗涤，或者作为这样的条件，可列举在65～70℃、1×SSC下进行杂交、然后在65～70℃、0.3×SSC下进行洗涤。杂交可以按照J.Sambrook etal.Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.(分子克隆实验指南第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)所记载的方法等现有公知的方法来进行。

本发明所涉及的植物体通过表达如上所述的转录因子与功能性肽的嵌合蛋白质来显示油脂生产量显著提高这样的特征。另外，在表达上述转录共激活因子与功能性肽的嵌合蛋白质时，也显示油脂生产量显著提高这样的特征。特别是通过制成嵌合蛋白质，可以使对象转录因子以抑制了转录促进活性的状态表达，并且使其以识别与对象转录因子所识别的cis序列具有同源性的cis序列的转录抑制活性表达，使对象转录因子和转录共激活因子所具有的与其他因子、核酸、脂质和/或糖质的亲和特异性变化，从而显示油脂生产量显著提高这样的特征。这时，在上述植物体中，既可以改变内源性的转录因子和/或转录共激活因子来生产其嵌合蛋白质，也可以导入编码嵌合蛋白质的基因来使该基因表达。

作为一例，优选以下方法：将编码由如上所述的转录因子和/或转录共激活因子、与将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽融合而成的嵌合蛋白质(融合蛋白质)的基因导入对象植物中，使该嵌合蛋白质(融合蛋白质)在植物内表达的方式。

作为本说明书中所记载的“转录促进活性被抑制的转录因子”，不特别限定，是指该转录因子本来具有转录促进活性显著降低了的转录因子。另外，所谓“将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽”，是指具有在与任意转录因子融合形成嵌合蛋白质时，形成该转录因子本来具有的转录促进活性显著降低了的转录因子的功能的肽(也有时称为转录抑制转换肽)。作为这样的“将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽”，不特别限定，尤其优选为含有作为阻遏物结构域序列和/或SRDX序列已知的氨基酸序列的肽。对于转录抑制转换肽，在特开2005-204657号公报中有详细叙述，可以使用该公报所公开的所有肽。

转录抑制转换肽可以列举例如以下所示式(1)～(8)的任一项所示的氨基酸序列。

(1)X1-Leu-Asp-Leu-X2-Leu-X3

(2)Y1-Phe-Asp-Leu-Asn-Y2-Y3

(3)Z1-Asp-Leu-Z2-Leu-Arg-Leu-Z3

(4)Asp-Leu-Z4-Leu-Arg-Leu

(其中，式中的Z4表示Glu、Gln或Asp。)

(5)α1-Leu-β1-Leu-γ1-Leu

(6)α1-Leu-β1-Leu-γ2-Leu

(7)α1-Leu-β2-Leu-Arg-Leu

(8)α2-Leu-β1-Leu-Arg-Leu

式(1)的转录抑制转换肽

在上述式(1)的转录抑制转换肽中，上述X1所示的氨基酸残基的数只要在0～10个的范围内即可。另外，对构成X1所示的氨基酸残基的具体氨基酸种类不特别限定，可以是任何氨基酸。从合成式(1)的转录抑制转换肽时的容易程度出发，该X1所示的氨基酸残基优选尽量短。具体来说，X1所示的氨基酸残基优选为5个以下。

同样地，在上述式(1)的转录抑制转换肽中，上述X3所示的氨基酸残基的数只要是至少6个即可。另外，对构成X3所示的氨基酸残基的具体氨基酸种类不特别限定，可以是任何氨基酸。

式(2)的转录抑制转换肽

在上述式(2)的转录抑制转换肽中，与上述式(1)的转录抑制转换肽的X1同样地，上述Y1所示的氨基酸残基的数只要在0～10个的范围内即可。另外，对构成Y1所示的氨基酸残基的具体氨基酸种类不特别限定，可以是任何氨基酸。具体来说，Y1所示的氨基酸残基优选为5个以下。

同样地，在上述式(2)的转录抑制转换肽中，与上述式(1)的转录抑制转换肽的X3同样地，上述Y3所示的氨基酸残基的数只要是至少6个即可。另外，对构成Y3所示的氨基酸残基的具体氨基酸种类不特别限定，可以是任何氨基酸。

式(3)的转录抑制转换肽

在上述式(3)的转录抑制转换肽中，上述Z1所示的氨基酸残基在1～3个的范围内、并含有Leu。在氨基酸为1个的情况下，是Leu，在氨基酸为2个的情况下，是Asp-Leu，在氨基酸为3个的情况下，是Leu-Asp-Leu。

另一方面，在上述式(3)的转录抑制转换肽中上述Z3所示的氨基酸残基的数只要在0～10个的范围内即可。另外，对构成Z3所示的氨基酸残基的具体氨基酸种类不特别限定，可以是任何氨基酸。具体来说，Z3所示的氨基酸残基更优选为5个以下。作为Z3所示的氨基酸残基的具体例，可列举Gly、Gly-Phe-Phe、Gly-Phe-Ala、Gly-Tyr-Tyr、Ala-Ala-Ala等，当然不限于这些。

另外，对该式(3)所示的转录抑制转换肽整体的氨基酸残基的数不特别限定，从合成时容易程度出发，优选为20个氨基酸以下。

式(4)的转录抑制转换肽

上述式(4)的转录抑制转换肽是含有6个氨基酸残基的六聚体(6mer)。此外，在上述式(4)的转录抑制转换肽中Z4所示的氨基酸残基是Glu的情况下的氨基酸序列，相当于拟南芥SUPERMAN蛋白质(SUP蛋白质)的第196～201位氨基酸序列。

以上说明的各种转录抑制转换肽可以通过与上述转录因子和/或转录共激活因子融合形成嵌合蛋白质(融合蛋白质)，从而改变该转录因子和/或转录共激活因子的特性。具体来说，可以通过与上述转录因子和/或转录共激活因子融合形成嵌合蛋白质(融合蛋白质)，从而将转录因子和/或转录共激活因子转换成转录抑制因子和/或负的转录共激活因子。另外，还可以将不是显性的转录抑制因子变成显性型转录抑制因子。

另外，如果使用编码上述转录抑制转换肽的多核苷酸，获得与编码转录因子和/或转录共激活因子的基因的融合基因，则可以生产嵌合蛋白质(融合蛋白质)。具体来说，通过将编码上述转录抑制转换肽的核苷酸(称为转录抑制转换多核苷酸)与编码上述转录因子和/或转录共激活因子的基因连接来构建融合基因，并导入植物细胞中。由此可以生产嵌合蛋白质(融合蛋白质)。对上述转录抑制转换多核苷酸的具体碱基序列不特别限定，只要基于遗传密码，包含与上述转录抑制转换肽的氨基酸序列对应的碱基序列即可。另外，根据需要，上述转录抑制转换多核苷酸还可以含有作为用于与转录因子基因连接的连接部位的碱基序列。而且，在上述转录抑制转换多核苷酸的氨基酸阅读框、与转录因子和/或转录共激活因子的基因的阅读框不一致这样的情况下，还可以含有用于使它们一致的添加的碱基序列。并且，还可以含有具有用于使转录因子和/或转录共激活因子与转录抑制转换肽之间连接的接头(linker)功能的多肽、和/或像His和/或Myc、Flag等那样用于赋予嵌合蛋白质(融合蛋白质)表位标记的多肽等的各种附加多肽。另外，根据需要，上述嵌合蛋白质(融合蛋白质)还可以含有除多肽以外的结构、例如糖链和/或类异戊二烯基等。

对于制造植物体的方法，只要是包含在植物体内生产上述转录因子和/或转录共激活因子与转录抑制转换肽的嵌合蛋白质、提高油脂生产性的过程即可，不特别限定，例如，可列举包含表达载体构建工序、转化工序、筛选工序等工序的制造法方法。以下对各工序进行具体说明。

表达载体构建工序

表达载体构建工序只要是构建含有编码上述转录因子和/或转录共激活因子的基因、转录抑制转换多核苷酸和启动子的重组表达载体的工序即可，不特别限定。作为重组表达载体的母体的载体，可以使用现有公知的各种载体。例如，可以使用质粒、噬菌体或粘粒等，可以根据所导入的植物细胞和/或导入方法不同来适当选择。具体来说，可列举例如，pBR322、pBR325、pUC19、pUC119、pBluescript、pBluescriptSK、pBI系的载体等。特别是在向植物体的载体导入法是使用农杆菌的方法时，优选使用pBI系的双元载体。作为pBI系的双元载体，具体来说，可列举例如，pBIG、pBIN19、pBI101、pBI121、pBI221等。

启动子只要是能够在植物体内表达基因的启动子即可，不特别限定，优选使用公知的启动子。作为所述启动子，可列举例如，花椰菜花叶病毒35S启动子(CaMV35S)、各种肌动蛋白基因启动子、各种遍在蛋白基因启动子、胭脂碱合成酶基因的启动子、烟草的PR1a基因启动子、番茄的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基基因启动子、Napin(油菜储藏蛋白)基因启动子、油质蛋白(oleosin)基因启动子等。其中，更优选使用花椰菜花叶病毒35S启动子、肌动蛋白基因启动子或遍在蛋白基因启动子。如果使用上述各启动子，则可以在导入植物细胞内时可以使任意基因增强表达。启动子只要使得编码转录因子和/或转录共激活因子的基因与转录抑制转换多核苷酸连接而成的融合基因能够表达那样地连接、并导入载体内即可，对作为重组表达载体的具体结构不特别限定。

此外，重组表达载体中除了启动子和上述融合基因之外，还可以含有其他DNA片段。对该其他DNA片段不特别限定，可列举终止子、筛选标记、增强子、用于提高翻译效率的碱基序列等。另外，上述重组表达载体还可以具有T-DNA区。T-DNA区特别是在使用农杆菌将上述重组表达载体导入植物体中的情况下可以提高基因导入的效率。

转录终止子只要具有作为转录终止部位的功能即可，不特别限定，可以是公知的终止子。例如，具体来说，优选使用胭脂碱合成酶基因的转录终止区(Nos终止子)、花椰菜花叶病毒35S的转录终止区(CaMV35S终止子)等。其中更优选使用Nos终止子。在上述重组载体中，可以通过将转录终止子配置在适当的位置，从而在导入植物细胞之后防止不必要地合成长转录物、强启动子使质粒的拷贝数减少等现象发生。

作为转化体筛选标记，例如，可以使用抗药性基因。作为所述抗药性基因的具体例，可列举例如，针对潮霉素、博来霉素、卡那霉素、庆大霉素、氯霉素等的抗药性基因。由此，通过选择在含有上述抗生素的培养基中生长的植物体，可以容易地筛选转化的植物体。

作为用于提高翻译效率的碱基序列，可列举例如，烟草花叶病毒来源的omega序列。通过使该omega序列配置在启动子的非翻译区(5’UTR)，可以提高上述融合基因的翻译效率。这样，根据其目标，上述重组表达载体可以含有各种DNA片段。

对于重组表达载体的构建方法，不特别限定，只要在适当选择的作为母体的载体中，以规定的顺序导入上述启动子、编码转录因子和/或转录共激活因子的基因、转录抑制转换多核苷酸、以及根据需要的上述其他DNA片段即可。例如，将编码转录因子的基因与转录抑制转换多核苷酸连接来构建融合基因，接着将该融合基因与启动子(根据需要的转录终止子等)连接来构建表达盒(expression cassette)，将其导入载体即可。

在嵌合基因(融合基因)的构建和表达盒的构建中，例如，可以通过预先使各DNA片段的切割部位形成彼此互补的突出末端，然后用连接酶使其反应，从而规定该DNA片段的顺序。此外，在表达盒包含终止子的情况下，从上流开始依次为启动子、上述嵌合基因、终止子即可。另外，对于用于构建重组表达载体的试剂种类、即限制性酶和/或连接酶等的种类不特别限定，适当选择使用市售的试剂即可。

另外，对上述重组表达载体的增殖方法(生产方法)也不特别限定，可以使用现有公知的方法。一般以大肠杆菌为宿主使其在该大肠杆菌内增殖即可。这时，可以根据载体的种类来选择优选的大肠杆菌的种类。

转化工序

本发明中进行的转化工序，是使用上述重组表达载体将上述融合基因导入植物细胞以使其表达的工序。对使用重组表达载体导入植物细胞的方法(转化方法)不特别限定，可以根据植物细胞而使用适当的现有公知的方法。具体来说，例如，可以使用利用农杆菌的方法和/或直接导入植物细胞的方法。作为利用农杆菌的方法，例如，可以使用Bechtold，E.，Ellis，J.andPelletier，G.(1993)In Planta Agrobacterium-mediated gene transfer byinfiltration of adult Arabidopsis plants.C.R.Acad.Sci.Paris Sci.Vie，316，1194-1199.或Zyprian E，Kado Cl，Agrobacterium-mediated planttransformation by novel mini-T vectors in conj unction with a high-copy virregion helper plasmid.Plant Molecular Biology，1990，15(2)，245-256.所记载的方法。

作为将含有重组表达载体和对象基因的DNA直接导入植物细胞的方法，例如，可以使用微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法、基因枪法、原生质体融合法、磷酸钙法等。

另外，如果采用将DNA直接导入植物细胞的方法，则只要是含有对象基因表达所需的转录单位、例如启动子和/或转录终止子、以及对象基因的DNA就足够了，载体功能不是必须的。而且，即使是不具有转录单位的仅含有对象基因的蛋白质编码区的DNA也可以，只要是能够整合到宿主的转录单位内表达对象基因即可。

作为导入了上述含有重组表达载体和对象基因的DNA、和/或不含表达载体而含有对象基因DNA的DNA的植物细胞，可列举例如，花、叶、根等植物器官中各组织的细胞、愈伤组织、悬浮培养细胞等。这里，在本发明所述的植物体的生产方法中，上述重组表达载体既可以根据要进行生产的植物体的种类来构建适当载体，也可以预先构建通用的重组表达载体，将其导入植物细胞。即，在本发明所涉及的植物体的制造方法中，既可以包含上述使用重组表达载体的转化用DNA构建工序，也可以不包含。

其他工序、其他方法

在本发明所涉及的植物体的生产方法中，只要包含上述转化工序即可，还可以包含上述使用重组表达载体的转化用DNA构建工序，但还可以另外包含其他工序。具体来说，可列举从转化后的植物体中筛选适当的转化体的筛选工序等。

对筛选方法不特别限定，例如，可以以潮霉素抗性等抗药性为基准进行筛选，也可以在培育出转化体之后，根据植物体本身或任意器官和/或组织所含的油脂含量进行筛选。例如，作为根据油脂含量进行筛选的例子，可列举由转化体的种子按照常规方法来定量油脂成分、并与未转化的植物体的种子所含的油脂含量进行比较的方法(参考后述的实施例)。

在本发明所涉及的植物体的制造方法中，由于将上述融合基因导入植物体，因而可以由该植物体通过有性繁殖或无性繁殖来获得油脂含量显著提高的后代。另外，可以由该植物体和/或其后代获得植物细胞和/或种子、果实、植株、愈伤组织、块茎、扦插枝、块等繁殖材料，以他们为基础来大量生产该植物体。因此，在本发明所涉及的植物体的制造方法中，可以包含繁殖筛选后的植物体的繁殖工序(大量生产工序)。

此外，所谓本发明中的植物体，包含长成的植物个体、植物细胞、植物组织、愈伤组织、种子的至少任一者。即，在本发明中，只要是最终能生长成植物个体的状态即全部可看作是植物体。另外，上述植物细胞包括各种形态的植物细胞。作为所述植物细胞，包含例如，悬浮培养细胞、原生质体、叶的切片等。通过使这些植物细胞增殖、分化可以获得植物体。此外，由植物细胞再生植物体可以根据植物细胞的种类使用现有公知的方法来进行。因此，在本发明所涉及的植物体的制造方法中，还可以包括由植物细胞等再生植物体的再生工序。

另外，本发明所涉及的植物体的生产方法不限于利用重组表达载体进行转化的方法，还可以使用其他方法。具体来说，例如，可以将上述嵌合蛋白质(融合蛋白质)本身给予植物体。这时，为了能够在最终利用的植物体的部位提高油脂含量，只要对幼年期的植物体给予嵌合蛋白质(融合蛋白质)即可。另外对嵌合蛋白质(融合蛋白质)的给予方法也不特别限定，使用公知的各种方法即可。

正如以上说明的那样，根据本发明，可以通过使属于规定的转录因子家族的转录因子与上述功能性肽的嵌合蛋白质表达，来提供与野生型植物体相比每个个体的物质生产性提高了的植物体。另外，可以通过使规定的转录共激活因子与上述功能性肽的嵌合蛋白质表达，来提供与野生型植物体相比每个个体的物质生产性提高了的植物体。如果在植物体中表达上述嵌合蛋白质，则有时对象转录因子的转录促进活性被抑制，或有时针对对象转录因子所识别的cis序列的同源序列显示转录抑制效果。而且，嵌合蛋白质有时针对与对象转录因子和/或转录共激活因子具有亲和性的其他因子、DNA、RNA、脂质或糖质发挥作用以使该亲和特异性发生变化，或有时针对与对象转录因子无亲和性的物质发挥作用以使其亲和性提高。在本发明所涉及的植物体中，虽然嵌合蛋白质的对象转录因子、识别与该因子所识别的cis序列具有同源性的cis序列的转录因子、与嵌合蛋白质的对象转录因子具有同源性的转录因子、与嵌合蛋白质的对象转录因子具有亲和性的其他因子等也同样地在植物体内表达，但通过上述嵌合蛋白质的作用效果，能够显性负性地抑制调控对象的基因表达。由此，认为在本发明所涉及的植物体中，与油脂生产相关的基因簇和/或与生产出的油脂的分解相关的基因簇的表达水平发生变化，其结果是油脂含量显著提高。

这里所谓油脂含量显著提高，意味着以下任一种情况：与野生型相比每一粒种子的质量无变化但油脂量提高的情况；与野生型相比每一粒种子的质量显著变大、且油脂量提高的情况；与野性型相比种子中的油脂含量提高的情况。在任一种情况下，每一个植物个体所生产的油脂量都提高了。本发明所涉及的植物体可以在植物来源的油性的制造方法中利用。例如，可以使本发明所涉及的植物体生长并采摘种子，从采摘的种子中回收油脂成分来制造油脂。

特别是利用了本发明所涉及的植物体的油脂制造方法由于植物的每一个个体中油脂含量高，因而可以说是生产性优异的方法。换言之，如果假定每单位耕地面积的栽培个体数一定，则通过利用本发明所涉及的植物体，可以大幅提高由每单位耕地面积制造的油脂量。因此，通过利用本发明所涉及的植物体，可以大幅削减油脂生产所需的制造成本。

而且，利用了本发明所涉及的植物体的油脂制造方法由于每单位重量的种子中的油脂含量高，因而可以说是生产性优异的方法。

此外，在利用了本发明所涉及的植物体的油脂制造方法中，作为制造对象的油脂，不特别限定，可例示例如，大豆油、胡麻油、橄榄油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、红花油和菜籽油等植物来源的油脂。另外，制造的油脂可以在家庭用途和/或工业用途中广泛利用，还可以作为生物柴油燃料的原料使用。即，通过利用本发明所涉及的植物体，可以低成本地制造上述的家庭用途或工业用途的油脂、和/或生物柴油燃料等。

植物来源油脂的制造方法

另外，在本发明中，发现了在由显示特定表型的植物体采摘的种子中油脂含量显著提高这样的新见解。具体来说，由参考文献(Plant J.1995Nov；8(5)：659-71.)所公开的4种色素合成途径缺失株(tt4、tt5、tt6和ΔCHS)采摘的种子与野生型相比种子中的油脂含量显著提高。即，本发明所涉及的植物来源油脂的制造方法，包括从由选自查耳酮合酶基因、查耳酮异构酶基因和黄酮-3-水化酶基因中的至少1种基因的功能缺失的植物体采摘的种子中回收油脂成分的工序。此外，上述参考文献所公开的tt4株和ΔCHS是查耳酮合酶基因缺失的植株，tt5株是查耳酮异构酶基因缺失的植株，tt6株是黄酮-3-水化酶基因缺失的植株。

拟南芥中的查耳酮合酶基因的碱基序列示于序列号5，由该基因所编码的查耳酮合酶的氨基酸序列示于序列号6。拟南芥中的查耳酮异构酶基因的碱基序列示于序列号7，由该基因所编码的查耳酮异构酶的氨基酸序列示于序列号8。拟南芥中的黄酮-3-水化酶基因的碱基序列示于序列号9，由该基因所编码的黄酮-3-水化酶的氨基酸序列示于序列号10。

但是，在本发明中，查耳酮合酶基因、查耳酮异构酶基因和黄酮-3-水化酶基因不限于上述的具体序列。即，查耳酮合酶基因、查耳酮异构酶基因和黄酮-3-水化酶基因还可以是编码包含在上述的具体氨基酸序列中缺失、置换、添加或插入了1或几个氨基酸序列的氨基酸序列、且具有查耳酮合酶活性、查耳酮异构酶活性和黄酮-3-水化酶活性的蛋白质的基因。这里，作为几个氨基酸，例如为1～20个，优选为1～10个，更优选为1～7个，进一步优选为1个～5个，特别优选为1个～3个。此外，氨基酸的缺失、置换或添加可以通过利用该技术领域公知的方式改变编码上述转录因子的碱基序列来进行。为了在碱基序列中引入突变，可以通过Kunkel法或Gapped duplex法(缺口双链体法)等公知方法或依据这些公知方法的方法来进行，例如，使用利用了定点诱变法的突变引入用试剂盒(例如Mutant-K和/或Mutant-G(均为商品名，TAKARA Bio社制))等，或使用LA PCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒(商品名，TAKARA Bio社制)引入突变。另外，作为突变引入方法，还可以是使用以EMS(甲磺酸乙酯)、5-溴尿嘧啶、2-氨基嘌呤、羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、其他致癌性化合物为代表的化学诱变剂的方法，还可以是利用以X射线、α射线、β射线、γ射线、离子束为代表的放射线处理和/或紫外线处理的方法。

而且，在本发明中，查耳酮合酶基因、查耳酮异构酶基因和黄酮-3-水化酶基因包括在除拟南芥以外的植物(例如上述的植物)中具有相同功能的基因(以下，称为同源基因)。对于查耳酮合酶基因、查耳酮异构酶基因或黄酮-3-水化酶基因的同源基因，如果植物基因组信息已清楚，则可以基于查耳酮合酶基因、查耳酮异构酶基因或黄酮-3-水化酶基因的碱基序列或由该基因所编码的氨基酸序列从检索对象的植物基因组信息中进行检索。这时，作为同源转录因子，检索与上述的具体氨基酸序列具有例如70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的同源性的氨基酸序列。这里，同源性的值意味着使用安装了blast算法的计算机程序和存储了基因序列信息的数据库、以默认设定求得的值。

另外，在植物基因组信息不清楚的情况下，可以从对象植物提取基因组或构建对象植物的cDNA文库，通过分离与查耳酮合酶基因、查耳酮异构酶基因或黄酮-3-水化酶基因的碱基序列的至少一部分在严格条件下杂交的基因组区域或cDNA来鉴定同源基因。这里，所谓严格条件，是指形成所谓特异性的杂种、且不形成非特异性的杂种的条件。例如，可列举在45℃、6×SSC (氯化钠/柠檬酸钠)下进行杂交、然后在50～65℃、0.2～1×SSC、0.1％SDS下进行洗涤，或者作为这样的条件，可列举在65～70℃、1×SSC下进行杂交、然后在65～70℃、0.3×SSC下进行洗涤。杂交可以按照J.Sambrook et al.Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd Ed.(分子克隆实验指南第二版)，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)所记载的方法等现有公知的方法来进行。

换言之，本发明所涉及的植物来源油脂的制造方法不限于使用拟南芥来源的种子的体系，可以以所有植物为对象来应用。作为能够应用本发明所涉及的植物来源油脂的制造方法的植物，可列举例如，双子叶植物、单子叶植物，例如，属于十字花科、禾本科、茄科、豆科、杨柳科等的植物(参考下述)，但并不限于这些植物。

十字花科：拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica rapa、Brassicanapus)、卷心菜(Brassica oleracea var.capitata)、油菜籽(Brassica rapa、Brassica napus)、油菜花(Brassica rapa、Brassica napus)、大白菜(Brassicarapa var.pekinensis)、青菜(Brassica rapa var.chinensis)、芜青(Brassicarapa var.rapa)、野泽菜(Brassica rapa var.hakabura)、日本芜青(Brassicarapa var.lancinifolia)、小松菜(Brassica rapa var.peruviridis)、小白菜(パクチヨイ，Brassica rapa var.chinensis)、萝卜(Brassica Raphanus sativus)、山葵(Wasabia japonica)等。

茄科：烟草(Nicotiana tabacum)、茄子(Solanum melongena)、马铃薯(Solaneum tuberosum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum)、辣椒(Capsicumannuum)、矮牵牛(Petunia)等。

豆科：大豆(Glycine max)、豌豆(Pisum sativum)、蚕豆(Vicia faba)、多花紫藤(Wisteria floribunda)、花生(Arachis.hypogaea)、日本百脉根(Lotus corniculatus var.japonicus)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、赤小豆(Vigna angularis)、金合欢(Acacia)等。

菊科：菊(Chrysanthemum morifolium)、向日葵(Helianthus annuus)等。

棕榈科：油棕(Elaeis guineensis、Elaeis oleifera)、椰子(Cocos nucifera)、海枣(Phoenix dactylifera)、巴西棕榈(Copernicia)

漆树科：野漆树(Rhus succedanea)、腰果(Anacardium occidentale)、漆树(Toxicodendron vernicifluum)、芒果(Mangifera indica)、阿月浑子(Pistacia vera)

葫芦科：南瓜(Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbitapepo)、黄瓜(Cucumis sativus)、王瓜(Trichosanthes cucumeroides)、葫芦(Lagenaria siceraria var.gourda)

蔷薇科：扁桃(Amygdalus communis)、玫瑰(Rosa)、草莓(Fragaria)、樱(Prunus)、苹果(Malus pumila var.domestica)等。

石竹科：康乃馨(Dianthus caryophyllus)等。

杨柳科：杨(Populus trichocarpa、Populus nigra、Populus tremula)

禾本科：玉米(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、大麦(Hordeum vulgare)、小麦(Triticum aestivum)、毛竹属(Phyllostachys)、甘蔗(Saccharumofficinarum)等。

百合科：郁金香属(Tulipa)、百合属(Lilium)等。

另外，所谓使基因功能缺失，包括使该基因从基因组中缺失、抑制该基因的表达(转录水平和翻译水平)、以及使由该基因所编码的蛋白质的活性降低或缺失的含义。

更详细地说，作为使基因缺失的方法，不特别限定，可列举使用同源重组的方法和/或使用转座子的方法。另外，在使该基因缺失时，既可以使该基因的全长缺失，也可以使其部分缺失。

另外，作为抑制基因表达的方法，不特别限定，可列举使调控该基因表达的启动子缺失的方法、将调控该基因表达的启动子替换成表达诱导型启动子的方法、在调控该基因表达的启动子中引入突变的方法、利用RNA干涉来分解该基因的转录产物的方法、以及利用反义RNA来抑制该基因的翻译的方法。

另外，作为降低该基因所编码的蛋白质的活性的方法，可列举使具有与该蛋白质特异性地结合来抑制该蛋白质的活性的功能的物质发挥作用的方法。作为该物质，可列举能够抑制该蛋白质的功能的抗体和/或抑制物质。

在本发明所涉及的植物来源油脂的制造方法中，对从种子中回收油脂的方法不特别限定，可以使用压榨法、提取法和挤出法等任何方法。例如，可以通过使用索氏抽提器的醚提取法，从由植物采摘的种子中回收油脂成分。根据本发明所涉及的植物来源油脂的制造方法，即使能够从每一个植物个体采摘的种子量相等，也由于使用每一粒种子的油脂含量高的植物体，因此可以说是生产性优异的方法。换言之，如果假定每单位耕地面积的栽培个体数一定，则通过本发明所涉及的植物来源油脂的制造方法，由每单位耕地面积制造的油脂量大幅提高，从而可以大幅削减油脂生产所需的制造成本。

此外，在本发明所涉及的植物来源油脂的制造方法中，作为制造对象的油脂，不特别限定，可例示例如，大豆油、胡麻油、橄榄油、椰子油、米糠油、棉籽油、向日葵油、玉米油、红花油和菜籽油等植物来源的油脂。另外，制造的油脂可以在家庭用途和/或工业用途中广泛利用，还可以作为生物柴油燃料和/或生物塑料的原料使用。即，通过利用本发明所涉及的植物体，可以低成本地制造上述的家庭用途或工业用途的油脂、和/或生物柴油燃料和/或生物塑料等。

油脂量提高了的植物体的筛选方法

如上所述，在本发明中，发现了由色素合成途径缺失株(参考文献：Plant J.1995Nov；8(5)：659-71.)采摘的种子与野生型相比油脂含量显著提高这样的新见解。色素合成途径缺失株是与色素合成体系相关的基因的功能缺失了的突变株，与野生株相比显示种皮色为淡色(与野生型相比颜色更白)这样的表型。上述参考文献所公开的tt4株和ΔCHS是查耳酮合酶基因缺失的植株，tt5株是查耳酮异构酶基因缺失的植株，tt6株是黄酮-3-水化酶基因缺失的植株。在这些基因缺失的突变株中，由于色素的合成不全而种皮色变得更白。因此，如果从筛选对象植物采摘种子，并确认采摘的种子的种皮色，则在可以判断该植物中的色素合成途径的色素合成能力的同时，可以高精度地推断采摘的种子所含的种子含量。

即，例如，在存在同种所包含的各种植物体时，可以观察从这些植物体采摘的种子的种皮色，将颜色更白的作为油脂生产量高的品种筛选出来。这里，所谓筛选对象植物体，既可以是进行了任何诱变剂处理的植物体，也可以是通过现有公知的育种法等制作出的植物品种。

这里，作为诱变剂处理，不特别限定，可以使用用于广泛诱发突变的化学诱变剂和/或物理诱变剂进行处理。作为化学诱变剂，可以使用例如甲磺酸乙酯(EMS)、乙基亚硝基脲(ENS)、2-氨基嘌呤、5-溴尿嘧啶(5-BU)、烷基化剂等。另外，作为物理诱变剂，可以使用放射线、紫外线等。使用这些诱变剂诱发突变可以按照公知的方法来进行。

根据本发明所涉及的筛选方法，无需破坏从植物采摘的种子，可以通过目视观察种皮色这种非常简便且迅速的判定法来判定种子所含的油脂量。

另外，在本发明所涉及的筛选方法中，还可以根据图像数据来判断从植物采摘的种子的种皮色，从而定量地测定种皮色。具体来说，将评价对象的种子的图像转换成数字数据，测定图像数据中的种子区域的R值、G值和B值(RGB值)。种子区域的R值、G值和B值的测定只要使用图像处理软件来进行即可，可以使用任何软件。接着，将测定的R值、G值和B值与野生型的种子中的R值、G值和B值进行比较。作为一例，计算出测定的R值、G值和B值的乘积值，与野生型的种子中的R值、G值和B值的乘积值进行比较。例如，如果测定的R值、G值和B值的乘积值与野生型的种子中的R值、G值和B值的乘积值相比显著上升，则可以判断测定对象的种子的种皮色更接近白色。特别是在测定的R值、G值和B值的乘积值显示相对于野生型的种子中的R值、G值和B值的乘积值为2.88倍以上的值时，可以判断为是更白色化(淡色化)的种子。

如上，通过将从植物采摘的种子的种皮色作为图像数据进行观察这种方式，也无需破坏种子，可以通过非常简便且迅速的判定法来判定种子所含的油脂量。此外，在由图像数据观察种子的种皮色时，不仅可以计算R值、G值和B值的乘积值，还可以计算R值、G值和B值的合计值等。

实施例

以下，通过实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术的范围不限于这些实施例。

[实施例1]

在本实施例中，对于拟南芥中的转录共激活因子At5g24520和转录因子At1g71030，分别在植物体中表达添加了阻遏物结构域序列的嵌合蛋白质(融合蛋白质)，测定从该植物体采摘的种子中的油脂含量。另外，对于用于比较的转录因子At1g56650，同样地在植物体中表达嵌合蛋白质(融合蛋白质)，测定种子中的油脂含量。

转录因子基因的扩增

使用以下所记载的引物，通过PCR从拟南芥的cDNA文库中扩增出At1g71030的除终止密码子以外的编码区的DNA片段和包含终止密码子的编码区的DNA片段、At5g24520的除终止密码子以外的编码区的DNA片段和At1g56650的除终止密码子以外的编码区的DNA。PCR条件是将94℃1分钟、47℃2分钟、延伸反应74℃1分钟进行25循环。PCR结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离、回收扩增出的DNA片段。

·At1g71030扩增用正向引物1

gATGAACAAAACCCGCCTTCGTGCTCTCTC(序列号11)

·At1g71030扩增用反向引物1

TCGGAATAGAAGAAGCGTTTCTTGACCTGT(序列号12)

·At1g71030扩增用正向引物2

gATGAACAAAACCCGCCTTCGTGCTCTCTC(序列号13)

·At1g71030扩增用反向引物2(序列号14)

TCATCGGAATAGAAGAAGCGTTTCTTGACC

·At1g56650扩增用正向引物

GATGGAGGGTTCGTCCAAAGGGC(序列号15)

·At1g56650扩增用反向引物

ATCAAATTTCACAGTCTCTCCATCG(序列号16)

·At5g24520扩增用正向引物

gATGGATAATTCAGCTCCAGATTCGTTATC(序列号17)

·At5g24520扩增用反向引物

AACTCTAAGGAGCTGCATTTTGTTAGCAAA(序列号18)

融合基因的制作

为了在由上述DNA片段所编码的转录因子基因的3’末端添加阻遏物结构域序列，使用在CaMV35S启动子的下游具有SmaI位点和阻遏物结构域(氨基酸序列：GLDLDLELRLGFA)序列的载体p35SSXG。为了连接转录因子基因序列和阻遏物结构域序列，将本载体用SmaI切割，插入编码上述的转录因子的PCR扩增片段，制作p35SSXG(At1g56650)和p35SSXG(At5g24520)、p35SSXG(At1g71030)。此外p35SSXG(At1g71030)插入了使用At1g71030扩增用正向引物1和At1g71030扩增用反向引物1获得的PCR扩增片段。另外，为了在不添加阻遏物结构域的状态下表达使用At1g71030扩增用正向引物2和At1g71030扩增用反向引物2获得的PCR扩增片段，将其插入在CaMV35S启动子的下游具有SmaI位点序列的载体的p35SOXG的SmaI切割部位，制作p35SOXG(At1g71030)。

改良型转录因子和转录因子表达载体的构建

作为用于利用农杆菌在植物中导入基因的双元载体，使用pBCKH。本载体是在pBIG(Hygr)(Nucleic Acids Res.18，203(1990))的HindIII位点插入Gateway载体转换系统(Invitrogen)的盒而成的载体。为了在该载体中插入改良型转录因子基因，将本载体与p35SSXG(At1g56650)、p35SSXG(At5g24520)、p35SSXG(At1g71030)或p35SOXG(At1g71030)混合，使用GATEWAY LR clonase(Invitrogen)进行重组反应。其结果是制成了pBCKH-p35SSXG(At1g56650)、pBCKH-p35SSXG(At5g24520)、pBCKH-p35SSXG(At1g71030)和pBCKH-p35SOXG(At1g71030)。

改良型转录因子基因表达载体向植物的导入

用于导入改良型转录因子的植物使用拟南芥(Arabidopsis thaliana，Columbia)。基因导入法按照Transformation of Arabidopsis thaliana byvacuum infiltration来进行。但是，感染时不进行减压处理，仅将其浸入农杆菌菌液中。具体来说，将改良型转录因子表达载体pBCKH-p35SSXG(At1g56650)、pBCKH-p35SSXG(At5g24520)、pBCKH-p35SSXG(At1g71030)和pBCKH-p35SOXG(At1g71030)用电穿孔法导入农杆菌Agrobacterium tumefaciens strain GV3101(C58C1Rifr)pMP90(Gmr)(koncz and Schell 1986)菌株中。

将1升的进行了导入的菌在含有抗生素(卡那霉素(Km)50μg/ml、庆大霉素(Gm)25μg/ml、利福平(Rif)50μg/ml)的YEP培养基中培养至OD600为1。接着，从培养液回收菌体，悬浮在1升的感染用培养基(Infiltrationmedium，每1升含有2.2g MS salt、1×维生素B5，50g蔗糖，0.5g MES，0.044μM苄氨基嘌呤，400μl Silwet，pH为5.7)中。将培育了14天的拟南芥在该溶液中浸渍1分钟使其感染，然后再继续栽培使其结果。将采摘的种子(T1种子)在50％bleach、0.02％Triton X-100溶液中灭菌7分钟，然后用灭菌水冲洗3次，接种到灭菌的潮霉素选择培养基(4.3g/l MS salts、0.5％蔗糖、0.5g/l MES、pH 5.7、0.8％琼脂、30mg/l潮霉素、250mg/l万古霉素)上。从在上述潮霉素平板上培育的转化植物体(T1植物)中对各改良型转录基因分别筛选出10个家系，移植到装有蛭石混合土的直径50mm的盆中。将其在22℃、16小时光周期8小时暗周期、光强度约60～80μE/cm2的条件下栽培而获得种子(T2种子)。与野生株的表皮色为深棕色相对，所得的T2种子的表皮色无论哪个家系均为淡棕色或黄色。

色素合成途径缺失株

另外，在本实施例中，还测定了从色素合成途径缺失株采摘的种子所含的油脂含量。在本实施例中，具体来说，对于色素合成途径缺失株tt4(NASC保藏号N85)(参考文献：Plant J.，8，659-671，1995)、tt5(NASC保藏号N86)、tt6(NASC保藏号N87)(参考文献：Plant Physiol.，111，339-345，1996)、ΔCHS(NASC保藏号N520583))，从NASC(The NottinghamArabidopsis Stock Centre)获得。tt4、tt5、tt6由Arabidopsis thaliana，Ler株制备，ΔCHS由Arabidopsis thaliana，Col-0株制备。将它们用50％bleach、0.02％Triton X-100溶液灭菌7分钟，然后用灭菌水冲洗3次，接种在培养基(4.3g/l MS salts，0.5％蔗糖，0.5g/l MES，pH 5.7，0.8％琼脂)上。将在上述平板上培育的植物体移植到装有蛭石混合土的直径50mm的盆中。将其在22℃、16小时光周期8小时暗周期、光强度约50～60μE/cm2(tt4，tt5，tt6，WT(Ler))、或光强度约40μE/cm2(ΔCHS、WT(Col-o))的条件下栽培，从而获得种子。与野生株的表皮色为深棕色相对，所得种子的表皮色无论哪个家系均为淡棕色或黄色。

导入了改良型转录因子或转录因子的T2种子的分析

对导入了2种改良型转录因子基因和改良型转录共激活因子基因的任一种的T2种子(At1g56650-SRDX、At5g24520-SRDX、At1g71030-SRDX)和导入了转录因子的T2种子(At1g71030)以及野生株(Col-0、Ler)进行油脂含量分析。油脂的定量分析使用MARAN-23(ResonanceInsturuments Ltd.，UK)H-NMR和分析软件RI-NMR 2.0版，对2～10mg的拟南芥种子进行测定。使用橄榄油作为油脂的标准物质来制作标准曲线，求出种子中的油脂含量(重量％)。

求出导入了各改良型转录因子基因、改良型转录共激活因子或转录因子基因的家系和野生株的种子油脂含量的平均值(n＝3～10)。其结果是，在设Col-0的油脂含量平均值为1时，各家系的油脂含量增加率如下：T2种子(At1g56650-SRDX)为30.2％、T2种子(At5g24520-SRDX)为12.3％、T2种子(At1g71030-SRDX)为12.2％、T2种子(At1g71030)为2.3％(图1)。

色素合成途径缺失株种子的分析

对4种色素合成途径缺失株种子(tt4、tt5、tt6、ΔCHS)和野生株(Col-0、Ler)进行油脂含量分析。油脂的定量分析使用MARAN-23(ResonanceInsturuments Ltd.，UK)H-NMR和分析软件RI-NMR 2.0版，对2～10mg的拟南芥种子进行测定。使用橄榄油作为油脂的标准物质来制作标准曲线，求出种子中的油脂含量(重量％)。

求出色素合成途径缺失株和野生株的种子油脂含量的平均值(n＝3～10)。ΔCHS的油脂含量相对于Col-0株为8.9％，tt4、tt5和tt6的油脂含量相对于Ler株分别为4.7％、8.8％、11.1％(图2)。

结果和讨论

由以上结果可判明，分别导入了添加有阻遏物结构域的转录因子At1g56650、转录共激活因子At5g24520、转录因子At1g71030的各嵌合基因的植物体的种子的每单位重量的油脂含量与同时栽培的野生株的每单位重量的油脂含量相比优异，是在油脂生产中非常有效的植物体。另一方面，导入了具有表达促进活性的At1g71030的植物体的种子的每单位重量的油脂含量与同时栽培的植物体的每单位重量的油脂含量相比有一些增加，但其增加率为导入了抑制表达促进活性的At1g71030的植物体种子的每单位重量的油脂含量的增加率的1/5左右。At1g71030编码具有MYB信号样的结构域的蛋白质(AtMybL2)，通过使该基因以CaMV35S启动子过量表达，从而显示缺失叶、茎、萼的毛状体的性状。认为这是由于形成毛状体所需的GL2基因表达被抑制的缘故(参考文献：DNA Res.，9，31-34，2002)。有人报告了通过破坏GL2基因，种子的油脂含量增加8％(参考文献：PlantMol Biol.2006，60，：377-87，2006)。

另外，AtMybL2蛋白质在其羧基末端区域具有包含6个氨基酸的转录阻遏物，在过量表达AtMybL2基因的植物和过量表达编码添加了作为EAR基序已知的转录阻遏物的AtMybL2的基因的植物中，任一种情况下花色素苷前体的合成均被抑制(参考文献：18TH INTERNATIONALCONFERENCE ON ARABIDOPSIS RESEARCH，TAIR accessionPublication：501721814)。然而，分析结果表明，相对于At1g71030的过量表达体的T2种子的油脂含量增加率为2.3％，添加了阻遏物结构域的At1g71030的过量表达体的T2种子的油脂含量的增加率大幅提高至12.2％，另外与GL2基因破坏时的油脂含量增加率8％相比也显著提高。由这些结果可认为，添加了阻遏物结构域的At1g71030通过除GL2以外的未知途径作用于种子的油脂合成和储存过程，从而增加油脂含量。

另一方面，根据色素合成途径缺失株的分析结果，色素合成途径的主要基因被破坏的突变株tt4、tt5、tt6、由于插入了T-DNA而CHS基因被破坏的ΔCHS株的种子的油脂含量均高于野生株。关于种皮色和油脂含量，有人报告了在油菜籽中种皮色为黄色的品种HUA-yellow No.1比种皮色为黑色的品种油脂含量高5-7％(参考文献：Genome 44：1077-1082(2001))。然而，在由异种间的杂交产生的现有育种法中，在决定种皮色和种子的油脂含量的性状的基因座接近的情况下也可以观察到同样的减少。因此，关于基因表达与性状的相关关系迄今为止尚未搞清楚。即，到目前为止，人们并不知道左右种皮色的性状的基因座会影响油脂含量这种见解。

与此相对，在本结果中，通过实际地破坏编码种皮的色素合成酶的基因而证实了种子中的油脂含量增加。因此，首次搞清楚了不仅在利用杂交的现有育种法中，而且在利用基因导入法、基因破坏法的分子育种法中，种皮色都是预测油脂含量的重要表型。通过使用种皮色为指标，可以非破坏地评价种子的油脂含量，并且无需使用特别的装置，就可以有效地筛选出油脂含量增加的种子。

更详细地说，拍摄野生株、At1g71030-SRDX、At1g56650-SRDX、ΔCHS家系的种子的照片并转换成数字数据。对得到的数字数据使用图像处理软件(Adobe Photoshop)分别定量种子区域的RGB值。接着，计算出定量的R值、G值和B值的乘积值。另外，也计算出相对于在野生型中所定量的R值、G值和B值的乘积值的比率。将其结果示于表1和图3。

表1

如表1和图3所示，在At1g71030-SRDX、At1g56650-SRDX和ΔCHS家系中，将R值、G值和B值的乘积值与野生型比较，结果显示了至少为2.88倍以上的值。如上，可以使用种子的图像数据来定量测定种皮色，从而能够非常简便且迅速地评价种子中的油脂量。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均直接作为参考而引入本说明书中。

Claims

1.使用植物体的油脂制造方法，包括从下述植物体中分离和回收生产性提高了的油脂的工序，所述植物体是十字花科植物，表达由转录因子和功能性肽融合而成的嵌合蛋白质，其中所述转录因子由序列号4所示氨基酸序列组成，所述功能性肽是将任意转录因子转换成转录抑制因子的功能性肽，该功能性肽由GLDLDLELRLGFA的氨基酸序列组成。