JPH09313059A - 植物種子の貯蔵脂質含量を増加させる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 種子貯蔵脂質含量を増加させた作物を得る。 【解決手段】 植物種子の細胞質型ピルビン酸キナーゼ
の活性値を、該植物種子固有のピルビン酸キナーゼの活
性値よりも実質的に低下させ、好ましくは、さらにホス
ホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性値を、該
植物種子固有のホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼの活性値よりも実質的に低下させることにより、該
植物の種子貯蔵脂質含量を増加させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物の種子貯蔵脂
質含量を増加させる方法並びに該方法により得られる植
物及びその種子に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ブラ
シカ植物の種子は約４０重量％の脂質を含有しており、
現在世界の多くの場所で油料植物として栽培されてい
る。ナタネ種子においては、有害物質であるエルカ酸や
グルコシノレートの含量減少のために交雑育種法による
変種が作られている。現在のところ、交配育種で種子重
量の約４０％の脂質含量を達成されてはいるが、健康志
向に伴い動物油よりも植物油の消費量が増加している
為、ナタネの育種目標の第一に高脂質含量が位置付けら
れるようになり、更に含量を増加させることが望まれて
いる。

【０００３】しかしながら、高脂質含量の遺伝子源とし
て交配に用いる品種が無いことや、従来の交配育種は方
向性のない雑多な変異の中から目的の形質を持つものを
選び出し純系を作り挙げるという実に多大な労力と時間
を要するプロセスであることが問題となり、交配育種で
の脂質含量の増加は頭打ちであるのが現状である。

【０００４】これに対し、遺伝子操作を用いた組換え植
物の作出は、目的の形質を司る遺伝子のみを対象にして
人工的に改変し導入するので極めて方向性の高い育種法
を提供することが出来る。例えば、アンチセンスＤＮ
Ａ、すなわちアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ配
列（アンチセンスオリゴヌクレオチド）を導入して植物
中の脂質組成を改変した例として、ステアリン酸不飽和
化酵素のアンチセンス遺伝子をナタネに導入することに
よって、オレイン酸含量が減少し、ステアリン酸含量が
増加する事が知られている。（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８９，２６２４，
１９９２）

【０００５】種子貯蔵物質はそれを蓄積する植物によっ
て量比は異なっているが主に脂質、タンパク質、炭水化
物がある。これらの物質は種子登熟期のほぼ同様の時
期、細胞伸長の時期に生成し蓄積され、その生合成経路
は密接に絡み合っていることが知られている。つまり光
合成によって生成した同化産物を出発原料としてそれぞ
れの生合成が進み、最終産物として脂質、タンパク質及
び炭水化物が合成され、蓄積される。ピルビン酸もこれ
らの種子貯蔵物質の生合成の中間産物の一つで、脂質、
タンパク質及び炭水化物を合成する基質となり得る。ナ
タネ種子では、主に脂質とタンパク質が貯蔵物質として
蓄積し、炭水化物はほとんど蓄積しない。そこで、種子
貯蔵タンパク質生合成経路のいずれかの反応を阻害すれ
ば、脂質合成も影響を受ける可能性がある。そのひとつ
の方法としてピルビン酸を合成するピルビン酸キナーゼ
と、その基質となるホスホエノールピルビン酸を同様に
基質とするホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
のアンチセンス遺伝子よる種子貯蔵タンパク質生合成の
阻害が考えられる。

【０００６】しかしながら、植物のピルビン酸キナーゼ
遺伝子の葉緑体型と細胞質型の２つのアイソザイムのう
ち、前者はヒマ種子の遺伝子のｃＤＮＡの全塩基配列
（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９６，１２３８−１
２８８，１９９１）と、タバコの遺伝子のｃＤＮＡの塩
基配列（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２７
（１）， ７９−８９， １９９５）が、また後者はジ
ャガイモの遺伝子のｃＤＮＡの全塩基配列およびヒマ種
子の酵素のアミノ酸配列（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，１５，ｐｐ６６５−６６９，１９９０）とダイズ
のｃＤＮＡの塩基配列（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏ
ｌ．，１０２，ｐｐ１３４５，１９９３、Ｇｅｎｂａｎ
ｋにＬ０８６３２の番号で登録されている。）、イネの
遺伝子の塩基配列の一部（ＥＭＢＬ ＯＳＡＤ１１７２
７）が決定され報告されているものの、貯蔵物質の配分
との関係については明らかにされていない。また、アン
チセンス法による形質転換を用いる場合には、特にその
配列の相同性が重要であり、利用対象からとった遺伝子
を用いることが望ましく、油料作物由来のピルビン酸キ
ナーゼの遺伝子の単離が望まれている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、種子貯蔵
脂質含量を増加させる目的で検討を重ねた結果、ナタネ
種子、大豆、ひまわり、ゴマ等の、胚に貯蔵タンパク質
と貯蔵脂質を蓄積する植物において、光合成による同化
産物から脂質とタンパク質が主に生合成され貯蔵される
ことに着目し、これらの種子貯蔵物質の生合成経路のう
ちアミノ酸生合成経路のいずれかの反応、特に効果的に
は、多枝にわたるアミノ酸生合成経路のうち初期の反応
を阻害することで貯蔵タンパク質合成へ流入する同化産
物が減少し、その結果、脂質合成の増加が見られること
を見い出し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち本発明の要旨は、植物種子の細胞
質型ピルビン酸キナーゼの活性値を、該植物種子固有の
細胞質型ピルビン酸キナーゼの活性値よりも実質的に低
下させることにより該植物の種子貯蔵脂質含量を増加さ
せる方法、前記植物において、さらにホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼの活性値を、該植物種子固有
のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性値
よりも実質的に低下させる方法、上記方法により得られ
る種子貯蔵脂質含量が増加した植物、および上記方法に
より得られる種子貯蔵脂質含量が増加した植物の種子、
に存する。

【０００９】前記植物としては、その胚に貯蔵タンパク
質と貯蔵脂質を蓄積する植物、より具体的には、油料作
物が、例えばナタネ、ダイズ、ヒマワリまたはゴマが挙
げられる。

【００１０】本発明の方法において、細胞質型ピルビン
酸キナーゼの活性値を低下させる方法としては、ピルビ
ン酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列またはその一部
を、種子細胞中の細胞質型ピルビン酸キナーゼの発現を
抑制させる形で目的植物に導入することが挙げられる。
ピルビン酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列またはその
一部を、種子細胞中の細胞質型ピルビン酸キナーゼの発
現を抑制させる形で目的植物に導入する方法としては、
アンチセンス法、コサプレッション法、リボザイム法、
またはジーンターゲッティング法が挙げられる。

【００１１】ピルビン酸キナーゼをコードするＤＮＡ配
列として具体的には、ヒマ、ジャガイモ、ダイズ並びに
イネ由来の細胞質型ピルビン酸キナーゼ遺伝子、及びラ
ット並びに酵母由来のピルビン酸キナーゼ遺伝子又はそ
の一部から選ばれるＤＮＡ配列、より具体的には、以下
の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡまたはその一部が挙げら
れる。 （ａ）配列表配列番号１及び配列番号１１〜１５のいず
れかに記載の配列。 （ｂ）（ａ）の配列を有するＤＮＡまたはこれと相同な
配列を有するＲＮＡと生理的条件下でハイブリダイズし
得るＤＮＡ。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明につき詳細に説明す
る。本発明で使用される植物としては、種子貯蔵物質と
して、種子胚に貯蔵タンパク質と貯蔵脂質をほぼ同時期
に生合成し、蓄積する植物であれば何でもよく、具体的
には、油料植物、例えばナタネ、ダイズ、ヒマワリ、ゴ
マ等が挙げられ、ナタネが好ましい植物として挙げられ
る。

【００１３】植物種子の細胞質型ピルビン酸キナーゼの
抽出および活性測定は、例えば後述の実施例に挙げたよ
うな、Plant Physiol.,86,1064-1069(1988)に記載され
ている方法等によって行うことができるが、この抽出お
よび活性測定は、対象とする植物の種類、対象とする植
物の部位、対象とする植物の成長時期に併せて、適宜変
更することが可能である。本発明においては、対象とす
る植物種子の細胞質型ピルビン酸キナーゼの活性値を上
記のような方法で測定し、その活性値を、あらかじめ上
記のような方法で測定しておいた植物固有の活性値より
も実質的に低下させることにより、該植物の種子貯蔵脂
質含量を増加させることができる。

【００１４】ピルビン酸キナーゼの活性値を低下させる
方法としては、たとえば、ピルビン酸キナーゼをコード
するＤＮＡ配列の全部または一部の配列を、種子細胞中
のピルビン酸キナーゼの発現を抑制させる形、例えば該
遺伝子の転写および／または翻訳を抑制させる形で、対
象とする植物に導入する方法が挙げられる。このような
方法としては、詳細には後述するが、アンセチンス法、
コサプレッション法、リボザイム法、ジーンターゲッテ
ィング法等が挙げられる。

【００１５】ピルビン酸キナーゼをコードするＤＮＡ配
列としては、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１５，６
６５‐６６９（１９９０）に記載のヒマのアミノ酸配列
から推定される遺伝子、ジャガイモの遺伝子（配列表の
配列番号１１）、ＧｅｎｂａｎｋにＬ０８６３２の番号
で登録されているダイズの遺伝子（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙ
ｓｉｏｌ．，１０２，ｐｐ１３４５，１９９３参照）
（配列表の配列番号１２）、ＥＭＢＬに０ＳＡＤｌｌ７
２７の番号で登録されているイネの遣伝子（配列表の配
列番号１３）等の植物由来の細胞質型ピルビン酸キナー
ゼ遺伝子、およびＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９５，９７
−１００（１９８６）に記載のラットのピルビン酸キナ
ーゼ遺伝子（配列表の配列番号１４）、Ｊ．Ｂ．Ｃ，２
５８，２１９３−２２０１（１９８３）に記載の酵母の
ピルビン酸キナーゼ遺伝子（配列表の配列番号１５）等
が既に公知のものとして挙げられる。公知のもの以外で
も、ピルビン酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列は、上
記のような公知のピルビン酸キナーゼをコードする遺伝
子の塩基配列を基に作成したプライマーを用いてPCR法
により、種々の植物体のmRNAから単離できる。たとえ
ば、ナタネの細胞質型ピルビン酸キナーゼをコードする
遺伝子を単離する場合には、例えばＢ．ｎａｐｕｓ ｃ
ｖ． Ｗｅｓｔａｒの登熟中の種子から、”Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ”に準じてｍＲＮＡを抽出し
てこれを鋳型にｃＤＮＡを合成する。このＤＮＡを鋳型
として用いて、上記の公知の遺伝子配列を基に、これら
の遺伝子配列間でホモロジーの高い部分からプライマー
を設定し、ＰＣＲ法で増幅させる。

【００１６】また、本発明を完成させる過程において
は、確実に標的ＤＮＡ領域を増幅させるために、プライ
マーを変えて２度ＰＣＲ法により増幅させたが、１度行
うだけでもよい。ＰＣＲ法（Ｓａｉｋｉ，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３９，ｐｐ４８７−４９１，１９８８）は、鋳型
の熱変性、プライマーと鋳型のアニーリング及び耐熱性
ポリメラーゼによる伸長方法からなる工程を繰り返すこ
とにより、標的ＤＮＡ領域を増幅する方法であり、特に
本発明では、これらの鋳型ＤＮＡとプライマーを９４℃
で、０〜２０秒間程度で熱変性して＋鎖と−鎖の１本鎖
に解離し、４０〜５０℃でプライマーと１５〜３０秒間
アニーリングした後、耐熱性ポリメラーゼによりＤＮＡ
を合成（７２℃、１分程度）するという工程を２０〜４
０回繰り返して該相補鎖ＤＮＡを増幅するのが望まし
い。この増幅させたＤＮＡ領域の確認は、例えば、ＳＴ
ＲＡＴＡＧＥＮＥ社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ｐ
ｈａｇｅｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒｓにクローニングした
後、”ＡＢＩ ３７３Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ”を用
い、そのプロトコールに準じてシークエンスを行える。
配列番号１に記載の塩基配列は他の報告されているピル
ビン酸キナーゼとの比較から転写領域の約３０％をカバ
ーすると考えられる。

【００１７】本発明に用いるピルビン酸キナーゼをコー
ドするＤＮＡ配列としては、上記のような天然のピルビ
ン酸キナーゼをコードする遺伝子、好ましくはそのコー
ド領域、の全部又は導入する植物細胞に合わせて適宜調
製した一部を用いることができる。また、本発明に用い
るピルビン酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列は、上記
の天然型の遺伝子配列において置換、欠失、挿入、転移
などを有するＤＮＡ配列であっても、植物細胞中の細胞
質型ピルビン酸キナーゼ遺伝子又はその転写産物と生理
的条件下、すなわち植物細胞内と同等の条件下でハイブ
リダイズし、細胞質型ピルビン酸キナーゼ遺伝子の転写
および／又は翻訳を抑制することができる限り、用いる
ことができる。さらに、本発明に用いるピルビン酸キナ
ーゼをコードするＤＮＡ配列の由来は、ｃＤＮＡであっ
てもよく、イントロンを含むゲノムＤＮＡであってもよ
い。

【００１８】以下、アンチセンス法を用いる場合につい
て具体的に述べる。アンチセンス法は、標的遺伝子の−
鎖の配列と相同な配列、すなわちｍＲＮＡの配列と相補
的な配列を有するＲＮＡ又はその一部（アンチセンスＲ
ＮＡ）をコードするＤＮＡ（アンチセンスＤＮＡ）を細
胞に導入して発現させ、このアンチセンスＲＮＡとｍＲ
ＮＡとハイブリッドを形成させることにより、転写およ
び／または翻訳を抑制する方法である。したがって、ｍ
ＲＮＡとアンチセンスＲＮＡの塩基配列の相同性が高い
程阻害効率が良い。

【００１９】植物のピルビン酸キナーゼには、細胞質型
と葉緑体型の２種類がある。細胞質内で生合成された共
通の前駆体は、その後、細胞質内で起こるアミノ酸合成
と葉緑体内で起こる脂肪酸合成とに配分されると言われ
ている。そのため、細胞質内で起こるＴＣＡ回路へ流入
するアミノ酸生合成経路のいずれかを阻害すれば、葉緑
体内に移行する経路が促進される可能性がある。２種類
のピルビン酸キナーゼのうち細胞質内タンパク質合成へ
の配分に関与しているのは細胞質型のピルビン酸キナー
ゼであると考えられる為、細胞質型ピルビン酸キナーゼ
遺伝子のアンチセンスＤＮＡを用いるのが好適である。
以下、植物の細胞質型ピルビン酸キナーゼを、単に「ピ
ルビン酸キナーゼ」ということがある。

【００２０】ピルビン酸キナーゼ遺伝子の配列はｃＤＮ
Ａ全長が知られている植物種間で、６５％以上の高い相
同性があるが、その中でもピルビン酸キナーゼタンパク
質をコードしている領域の相同性は７０％以上と高く、
この領域全部又は、一部をアンチセンスＤＮＡとして用
いるのが良い。転写されたアンチセンスＲＮＡの安定性
や転写終了に関与すると考えられる２次構造の解析か
ら、ヘアピン構造を７５％以上の確率で取りうる配列が
アンチセンスＤＮＡ中に極力存在しないのが良い。これ
らの条件を考慮した上で、本発明の好ましい態様では、
発表のあったジャガイモの配列の３４５〜８９８ｂｐ部
分にあたるナタネの配列をアンチセンスＤＮＡとして用
いた。また、この配列以外にこれらの条件を満たす配列
も本発明に使用可能である。

【００２１】ピルビン酸キナーゼをコードするＤＮＡ配
列を植物細胞を導入するには、通常、ベクターに該ＤＮ
Ａ配列を挿入した組換えベクターを用いる。本発明に用
いるベクターは、植物細胞への導入方法に応じて、通常
植物細胞の形質転換に用いられているベクターを用いる
ことができる。例えば、アグロバクテリウム法において
はｐｌａｎ系列のプラスミド、エレクトロポーレーショ
ン法においてはｐＵＣ系列等、ｐＢＲ３２２系等の大腸
菌で増殖可能なプラスミド等が挙げられる。組換えベク
ターの構成は、ピルビン酸キナーゼやホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼの発現を停止させる手法によ
って異なるが、ピルビン酸キナーゼまたはピルビン酸キ
ナーゼとホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの
両方の量を減少させ効率よく種子貯蔵脂質含量を増加さ
せるためには、種子特異的発現プロモーターを用いるの
がよい。例えば、アンチセンス法を用いる場合、このよ
うな組換えベクターは、種子特異的に発現するプロモー
ターの下流にピルビン酸キナーゼやホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼのｍＲＮＡに対するアンチセン
スＲＮＡをコードするＤＮＡ配列（アンチセンスＤＮ
Ａ）を導入することで得られる。

【００２２】種子特異的発現プロモーターとしては、具
体的にはナピン（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，
２６，ｐｐ１１１５−１１２４， １９９４）（Ｅｕ
ｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２２７， ｐｐ３１６
−３２１， １９９５）、クルシフェリン（Ｐｌａｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．， １４， ｐｐ１２３−１３
０， １９９４）、ファゼオリン（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌ
ｌ， １， ｐｐ８３９−８５３， １９８９）、レグ
ミン（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．，２１５， ｐ
ｐ３２６−３３１， １９８９）（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．， ２２５， ｐｐ１４８−１５７，
１９９１）、グルテニン（ＰｌａｎｔＣｅｌｌ， １，
ｐｐ５６９−５７８， １９８９）（ＥＭＢＯ
Ｊ．， ６， ｐｐ３５５９−３５６４， １９８
７）、ヘリアンチニン（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅ
ｔ．， ２２２， ｐｐ４９−５７， １９９０）、グ
ルテリン（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１６，
ｐｐ４９−５８，１９９１）、ゼイン（ＥＭＢＯ
Ｊ．， ７， ｐｐ１２４９−１２５５， １９８８）
等の遺伝子のプロモーターが挙げられるが、その他種子
特異的発現性を有するプロモーターであればよい。

【００２３】更に、効率良く遺伝子の転写を終結させ生
成したＲＮＡを安定させるために、植物ではターミネー
ターが用いられる。具体的には、ノパリン合成酵素遺伝
子，ＮＯＳ，のターミネーター（ｐＢＩ２２１、Ｊｅｆ
ｆｅｒｓｏｎ、ＥＭＢＯ Ｊ．，６，３９０１−３９０
７，１９８７）が挙げられるが、その他植物細胞内でタ
ーミネーターとして機能するものであれば良い。

【００２４】遺伝子の転写および／または翻訳を抑制さ
せる形とは、アンチセンス法を用いる場合は、標的遺伝
子（細胞固有のピルビン酸キナーゼ遺伝子）のアンチセ
ンスＲＮＡを発現するＤＮＡ配列を、コサプレッション
法を用いる場合は、標的遺伝子のセンスＲＮＡを発現す
るＤＮＡ配列のことを指す。抑制とは、ピルビン酸キナ
ーゼ遺伝子の転写および／または翻訳が抑制され、種子
の細胞質型ピルビン酸キナーゼの活性値を、該植物種子
固有の細胞質型ピルビン酸キナーゼの活性値よりも実質
的に低下させ、その結果、該植物の種子貯蔵脂質含量を
増加させることができれば、その程度は特に問わない。
すなわち、標的遺伝子の転写および／または翻訳を完全
に抑制してもよく、部分的に抑制してもよい。

【００２５】遺伝子の転写および／または翻訳を抑制さ
せる形で目的作物に導入する方法としては、アンチセン
ス法、コサプレッション法、リボザイム法、ジーン・タ
ーゲティング法等の通常用いられる方法であれば、特に
限定されない。

【００２６】コサプレッション法は、標的遺伝子の全ｍ
ＲＮＡ配列と相同な配列を有するＲＮＡ、又はその一部
（センスＲＮＡ）をコードするＤＮＡを細胞に導入して
発現させ、その遺伝子の転写及び／または翻訳を抑制さ
せる方法で、トランスウィッチ法とも呼ばれ、ペチュニ
ア（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２，２７９−２８９，１９
９０）、トマト（Ｍｏｌ，Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．，２２
４， ４７７−４８１， １９９０）、タバコ（Ｐｒｏ
ｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，
８８， １７７０−１７７４， １９９１）などの例が
ある。

【００２７】リボザイム法は、ハンマーヘッド型の小さ
いＲＮＡモチーフがＲＮＡの特定部分を切断することに
より、翻訳を抑制する方法（Ａｎｔｉｓｅｎｓ Ｒｅｓ
ｅｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｃｒ
ｏｏｋｅ，ＳＴ ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ Ｂ． ｅｄｓ
ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ８３−９６１９
９３）である。

【００２８】ジーン・ターゲッティング法とは、ゲノム
上を移動するトランスポゾンやホモロガス・リコンビネ
ーションなどにより、目的のゲノム遺伝子配列を壊すこ
とでその遺伝子の転写を抑制する方法である（Ｈｏｍｏ
ｌｏｇｏｕｓ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ
Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ，
Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ Ｊ． ｅｄ， Ｋｌｕｗｅｒ
ＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ １９９
４）。この場合には、細胞に導入するＤＮＡ配列として
は、ピルビン酸キナーゼのコード領域の一部を欠くＤＮ
Ａ配列、あるいは機能しないように改変されたプロモー
ター配列等が用いられる。

【００２９】本発明における形質転換法としては、アグ
ロバクテリウム法（Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
６，９１５−９２２，１９８８、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ，５， １２０１−１２０４，１９８７）また
はエレクトロポーレーション法（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ
Ｒｅｐ．，１０，１０６−１１０，１９９１，Ｐｌａ
ｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，９，５５−６０）により形
質転換を行うことが好ましいが、遺伝子銃法（Ｔｈｅｏ
ｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７９，３３７−３４１，
１９９０、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．，１４，８
１−８６）、ＰＥＧ法等、通常の形質転換法によっても
可能である。

【００３０】植物形質転換法としてアグロバクテリウム
法を用いる場合、本発明の好ましい態様では、ｐｌａｎ
系列のプラスミドを用いたが、他の系列のプラスミドを
用いても良い。プラスミドには、形質転換に使用する外
来遺伝子の他に、目的とする形質転換体を選択する際に
有効な、いわゆる選択マーカー遺伝子を導入するのが好
ましい。選抜マーカー遺伝子としては、通常使用されて
いるものであれば、特に限定はされない。具体的には、
ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、ハ
イグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子、
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝
子、β−グルクロニダーゼ遺伝子等が挙げられる。

【００３１】上記のようなピルビン酸キナーゼをコード
するＤＮＡ配列又はその一部を、細胞中の細胞質型ピル
ビン酸キナーゼ遺伝子の転写および／または翻訳を抑制
させる形で含み、さらに好ましくは選抜マーカー遺伝子
を含むプラスミドをナタネ下胚軸に導入し、植物体を再
生することによって、貯蔵脂質含量の変化したナタネを
作出する。アグロバクテリウム法による形質転換法は、
無菌発芽させた１０〜１４日の下胚軸を用いることが出
来る。

【００３２】エレクトロポーレーション法による形質転
換は、常法により行うことが出来る。エレクトロポーレ
ーション法で使用するプロトプラストは、常法により作
成することが出来るが、ブラシカ植物由来のプロトプラ
ストを作成する場合、例えば、特開平４ー２７６０６９
に記載の方法により効率よく得ることが出来る。例え
ば、ピルビン酸キナーゼ遺伝子のアンチセンスＤＮＡを
導入してＢ．ｎａｐｕｓを形質転換する際には、Ｂ．ｎ
ａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒ由来のプロトプラスト
６×１０⁵個／ｍｌに対し、上記のようにして調製した
ピルビン酸キナーゼアンチセンスＤＮＡ発現ベクター
（例えば４０〜８０μｇ／ｍｌ）を、また選抜遺伝子と
してネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子
（例えば４０〜８０μｇ／ｍｌ）を含み、３０〜２００
ｍＭ塩化カリウム、０〜５０ｍＭ塩化マグネシウム、
０．２〜０．６Ｍマンニトールを含む緩衝液などの液体
媒体中に懸濁し、これに電気パルスを印加してプラスミ
ドをプロトプラスト中に導入する。

【００３３】その後、アグロバクテリウム法であれば、
例えば、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ， ２６， ｐｐ１１１５−１１２４， １９９４
に記載の方法に準じて、エレクトロポーレーション法で
あれば、例えば、ＰｌａｎｔＴｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｌｅｔｔ．，１１，１９９−２０５，１９９４に
記載の方法に準じて細胞選抜し、再生個体を得る。得ら
れた再生幼植物の葉からゲノムＤＮＡを、例えば、Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．，２１１，２７−３４，１９８
８に記載の方法に準じて単離し、このゲノムＤＮＡ３０
０ｎｇをＰＣＲ法に供することで、ピルビン酸キナーゼ
やホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼアンチセ
ンスＤＮＡの取り込まれた形質転換体を二次選択するこ
とが出来る。この場合、用いるプライマーは、例えば前
述の種子特異的発現プロモーターからピルビン酸キナー
ゼの一部の配列間で増幅できるものを使用する。ピルビ
ン酸キナーゼアンチセンスＤＮＡ、および／またはピル
ビン酸キナーゼとホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼの両方のアンチセンスＤＮＡの導入が確認された
幼植物を馴化後、温室にて育成することで３〜６カ月後
に種子を形成する。

【００３４】導入遺伝子の存在は、ゲノミックＤＮＡの
サザン解析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，９８，５０３−５１７，１９７５）によって確認
できる。例えばゲノムＤＮＡは（Ｗｏｌｂｏｔ ｅｔ
ａｌ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｔ．，２１１，２７−３
４，１９８８）に準じて調整し、その１０μｇを１００
μｌの反応系（東洋紡社製）においてＥｃｏＲＩで切断
する。これをエタノール沈殿した後、更に７０％エタノ
ールで洗浄、乾燥し再蒸留水１０μｌに溶かして泳動用
色素２μｌを加えて０．８％アガロースゲル電気泳動
（ＦＭＣシーケム社製ＧＴＧアガロースゲル，ＴＢＥ緩
衝液）で分画する。これをアマシャム社ハイボンドＮメ
ンブレン取扱説明書の方法に準じて酸部分分解、アルカ
リ変成してハイボンドＮ膜にブロットする。膜は４２℃
で１時間以上プレハイブリダイゼーションする（５０％
ホルムアミド、１％ ＳＤＳを含む４ｘＳＳＣＰ，０．
５％スキムミルク，０．２５ｍｇ／ｍｌ ウシ精子ＤＮ
Ａ）。

【００３５】プローブは形質転換に使用したプラスミド
を上記と同様にＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断しエ
タノール沈殿し７０％エタノールで洗浄、乾燥し、再蒸
留水５μｌに溶かして泳動用色素１μｌを加えて０．８
％アガロースゲル電気泳動（ＦＭＣシーケム社製ＧＴＧ
アガロースゲル，ＴＢＥ緩衝液）で分画して、ピルビン
酸キナーゼアンチセンスを含んだＤＮＡ断片をアガロー
スゲルより回収する。そのＤＮＡ断片のうち２５ｎｇを
アマシャム社マルチプライムラベリングキットと［αー
３２Ｐ］ｄＣＴＰにより調整する。熱変性したプローブ
をハイブリダイゼーション液（０．１ｇ，デキストラン
硫酸／ｍｌプレハイブリ液）に混合し、プレハイブリダ
イゼーション液をきった膜にまぶし４２度で一晩静置す
る。０．１％ＳＤＳを含む２ｘＳＳＣ溶液 １００ｍｌ
中で室温で１５分振とうし、これを２回行う。更に０．
１％ＳＤＳを含む０．１ｘＳＳＣ溶液 １００ｍｌ中で
同様に１５分間の洗浄を２回繰り返し、プローブの特異
的な結合をオートラジオグラフィで検出する。種子にお
けるピルビン酸キナーゼアンチセンスＤＮＡの発現は種
子全ＲＮＡを常法、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｇに準じて抽出し、導入したアンチセンス部分を
プローブにしてノザン解析を行うことにより調べる。更
に細胞質型ピルビン酸キナーゼの酵素活性を測定するこ
とにより、ピルビン酸キナーゼアンチセンスＤＮＡ発現
の程度を判定することが出来る。

【００３６】なお、本発明においては、上記のようにピ
ルビン酸キナ―ゼの活性を低下させるだけでなく、併せ
て、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの活性
値も低下させることにより、植物の種子貯蔵脂質含量を
一層増加させることが可能である。ホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼの活性値の低下についても、上
記ピルビン酸キナーゼの場合と同様に、ホスホエノール
ピルビン酸カルボキシラーゼをコ―ドするＤＮＡ配列又
はその一部を、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼ遺伝子の転写および／または翻訳を抑制させる形
で、対象とする植物に導入する方法により行うことがで
きる。

【００３７】ホスホエノールピルビン酸カルポキシラ―
ゼをコードするＤＮＡ配列としては、タバコ（Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １７， ５３５−５３
９，１９９１）、ソルガム（Ｇｅｎｅ， ９９、 ８７
−９４、１９９１）、アイスプラント（Ｎｕｃ．Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，１７， ６７４３−６７４４， １９
８９）、トウモロコシ（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏ
ｌ．， １２， ５７９−５８９， １９８９）、大腸
菌（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１， ４
８７−５０２， １９９３）の遺伝子が知られている
が、上記ピルビン酸キナーゼの場合と同様にしてこれら
の公知の遺伝子配列を基に作成したプライマーを用い
て、ＰＣＲ法により植物体のｍＲＮＡから単離したもの
も使用することができる。また、ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼをコードするＤＮＡ配列又はその
一部の植物への導入方法も、上記ピルビン酸キナーゼの
場合と同様な方法、すなわちアンチセンス法、コサプレ
ッション法、リボザイム法、ジーン・ターゲッティング
法を用いることができる。

【００３８】ピルビン酸キナーゼをコードするＤＮＡ配
列とホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコー
ドするＤＮＡ配列を細胞に導入するには、同一のベクタ
ーを用いてもよく、異なるベクターを用いてもよい。

【００３９】以下、実施例を挙げて本発明を説明する
が、本発明はその要旨を越えない限り、以下の実施例に
限定されるものではない。

【００４０】（１）ベクターの構築 まず、Ｂ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒの種子か
らＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇに記載の方法に準
じてｍＲＮＡを抽出した。すなわち、乳鉢に入れた種子
約７５０ｍｇに液体窒素を適当量加え乳棒を用いてよく
摺り潰した。それに３ｍｌのｍＲＮＡ抽出液（１％
（（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含むトリス−塩酸緩衝液）と同
量のフェノールを加えて更に摺り潰し、抽出物をチュー
ブに移して４０００ｒｐｍで１０分間遠心した。水層を
回収しフェノール、クロロホルムを水層の半量ずつ加え
て攪はんした後、再度遠心し、得られた水層に等量のク
ロロホルムを加え、攪はん、遠心した。水層を回収し
て、１０Ｍ塩化リチウム水溶液を１００分の１量、エタ
ノール２倍量加え、−２０℃に１時間以上置いた。１０
０００×ｇで５分間遠心し、得られた沈殿物を７０％の
エタノールで洗浄後、乾燥させて、滅菌水１ｍｌに溶か
した。この溶液に、１０Ｍ塩化リチウム水溶液を５分の
１量加えて氷中に一晩放置し、１００００ｘｇ、１０分
間遠心して沈殿を回収した。この沈殿を再び滅菌水に溶
かして、全ＲＮＡとした。この全ＲＮＡをオリゴｄＴセ
ルロースカラムにかけてｍＲＮＡを精製した。

【００４１】次に、得られたこのｍＲＮＡからｃＤＮＡ
を合成した。すなわち、１−２μｇのｍＲＮＡと１μｇ
のｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーと、細胞質型ピルビン
酸キナーゼには５’ＣＡＴＴＧＡＴＴＣＡＡＧＣＡＴＣ
ＴＧＡＧＴＮＧＣ３’（配列番号３）の相補鎖配列を、
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼには５’Ａ
ＡＧＣＡＣＴＡＣＡＴＡＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡ３’（配
列番号７）の相補鎖配列を用いて、ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（宝酒造社製）のプロトコールに従
い、それぞれのｃＤＮＡを合成した。

【００４２】得られたｃＤＮＡの半量をＰＣＲ法に供し
た。プライマーは他の植物で発表させている細胞質型ピ
ルビン酸キナーゼとホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼの配列から相同性の高い部分の配列、すなわち
ピルビン酸キナーゼには５’ＣＴＴＧＡＣＡＣＣＡＡＧ
ＧＧＧＣＣＴＧＡＡ（Ｇ）ＡＴ３’（配列番号２）と、
配列番号３に記載の配列の相補鎖配列を、また、ホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼには５’ＴＴＴＣ
ＡＴＧＡＡＡＣＴＡＴＴＴＧＧＡＡＧＧＧ３’（配列番
号６）と配列番号７に記載の配列の相補鎖配列を用い
た。ＰＣＲ法は、パーキン エルマー シータス社（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）製のＤＮＡサ
ーマルサイクラー機（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ
機）を用い、同社のＧｅｎｅ−Ａｍｐ Ｋｉｔのプロト
コールにより試薬を混合し、調製した反応液１００μｌ
を用いて行った。反応は、ピルビン酸キナーゼ用には、
熱変性９４℃で２０秒間、アニーリング４２℃で３０秒
間、耐熱性ポリメラーゼによる伸長反応７２℃で１分
間、からなるサイクルを２５〜３０回行った。ホスホエ
ノールピルビン酸カルボキシラーゼ用には、熱変性をせ
ずにアニーリングを４６℃で１５秒間、伸長反応を７２
℃で３０秒間からなるサイクルを３５回行った。

【００４３】上記のようにして得られたＤＮＡ断片がピ
ルビン酸キナーゼやホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼであることを確実にするために、２度目のＰＣ
Ｒを行った。この時、ピルビン酸キナーゼには熱変性は
せずに、アニーリング４４℃で１５秒間、耐熱性ポリメ
ラーゼによる伸長反応７２℃で１分間からなるサイクル
を２５〜３０回行った。用いたプライマーは５’ＣＴＴ
ＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＧＧＣＣＴＧ３’（配列番号４）
と５’ＧＡＧＡＴＣＡＣＣＴＣＧＡＧＣＡＡＣＣＡＴ
３’（配列番号５）の相補鎖配列を用いた。ここで、
３’側に用いたプライマー（配列番号５）は、確実性を
増すため、一回目に用いたプライマー（配列番号３）よ
りも内側の部分に相当する異なるプライマー配列を用い
て増幅するように設定した。また、ホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼには１回目のＰＣＲと同じプラ
イマーを用いて、熱変性をせずにアニーリング５０℃で
５秒間、伸長反応７２℃で３０秒間のサイクルを３５回
行った。この場合、アニーリング温度を上げることで確
実性を増すように設定した。

【００４４】最終ＰＣＲ反応液の１／２０量をアガロー
スゲル電気泳動で分離し、増幅したバンドを検出した。
ピルビン酸キナーゼアンチセンスＤＮＡは５５５ｂｐの
バンドに、またホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼアンチセンスＤＮＡは３４３ｂｐのバンドとなる。
これらのＤＮＡ断片を１％ＦＭＣシーケム社製ＧＴＧア
ガロースゲルで分離し、目的のサイズのバンド部分をそ
れぞれ切り出して５５℃１５秒間処理して液化した後、
フェノール及びフェノール：クロロフォルム＝１：１混
合液で精製したものをエタノール沈殿で回収した。得ら
れた２種類のＤＮＡ断片を、それぞれ、クレノー（Ｋｌ
ｅｎｏｗ）処理して平滑末端ＤＮＡ断片にした後、Ｔ４
ポリヌクレオチドカイネース処理し、フェノール：クロ
ロフォルム＝１：１混合液で再び精製し、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔプラスミド（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）のＥ
ｃｏＲＶ部位に各々、挿入した。

【００４５】細胞質型ピルビン酸キナーゼｃＤＮＡの挿
入断片をシークエンスして得られた配列（配列番号１）
と他の植物で報告されている細胞質型ピルビン酸キナー
ゼの配列と相同性を比較して、ナタネ種子で発現してい
る細胞質型ピルビン酸キナーゼをコードするｃＤＮＡで
あることを確認した。このプラスミドをＸｈｏＩ部位で
切断し、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）処理して平滑末端と
した後、ＳａｃＩ部位で切断し、増幅ＤＮＡ断片を含む
ＤＮＡ断片を種子特異的に発現する発現ペクター（ｐＮ
ａｐ、特許第５−０７３８０６号）のＳｍａＩ，Ｓａｃ
Ｉ部位に挿入した。この時、増幅したピルビン酸キナー
ゼｃＤＮＡ断片が、本来の酵素の配列とは逆向きに挿入
されているプラスミドを選抜した（以下、このプラスミ
ドをｐ８５と記載する）。

【００４６】また、ホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼｃＤＮＡの挿入断片をシークエンスして得られ
た配列から、５’側プライマーに５’ＧＴＧＴＴＣＣＴ
ＴＡＣＡＡＣＧＣＴＣＣＴＣＴＣ３’（配列番号８）、
３’側プライマーに５’ＣＡＧＡＡＧＣＴＣＡＡＡＧＧ
ＴＧＴＧＣＣＡＡＡ３’（配列番号９）の相補鎖配列を
選択し、これをプライマーに用いて、ナタネ種子ゲノム
ＤＮＡを１０ｎｇ鋳型にし、熱変性をしないでアニーリ
ング５２℃で１０秒間、伸長反応７２℃１分間のサイク
ルを３５回行った。こうして得られた約３４０ｂｐ増幅
断片を１％ＦＭＣシーケム社製ＧＴＧアガロースゲルで
分離し、目的のサイズのバンド部分を切り出して５５℃
で１５秒間処理して液化した後、フェノール及びフェノ
ール：クロロフォルム＝１：１混合液で精製したものを
エタノール沈殿で回収した。得られたＤＮＡ断片を、ク
レノー（Ｋｌｅｎｏｗ）処理して平滑末端ＤＮＡ断片に
した後、Ｔ４ポリヌクレオチドカイネース処理し、フェ
ノール：クロロフォルム＝１：１混合液で再び精製し、
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドのＥｃｏＲＶ部位に
挿入した。

【００４７】ホスホエノールピルビン酸カルボキシラー
ゼＤＮＡ挿入断片をシークエンスして得られた配列（配
列番号１０）と他の植物で報告されているホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼの配列と相同性を比較し
て、２つのイントロンを含むナタネ種子のホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼＤＮＡであることを確認
した。このプラスミドをＨｉｎｄIII部位で切断し、ク
レノー（Ｋｌｅｎｏｗ）処理して平滑末端とした後、Ｓ
ａｃＩ部位で切断し、増幅ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片
を、種子特異的に発現する発現ペクターのＳｍａＩ，Ｓ
ａｃＩ部位に挿入した。この時、増幅したホスホエノー
ルピルビン酸カルボキシラーゼＤＮＡ断片が本来の酵素
の配列とは逆向きに挿入されているプラスミドを選抜し
た（以下、このプラスミドをｐ８４と記載する）。

【００４８】続いてホスホエノールピルビン酸カルボキ
シラーゼＤＮＡ断片とピルビン酸キナーゼｃＤＮＡを以
下のようにして連結した。ｐ８４をＸｂａＩ，ＳｐｅＩ
で処理してホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
を含むＤＮＡ断片を回収し、ｐ８５をＸｂａＩ，ＢＡＰ
処理したプラスミドに連結した（以下、このプラスミド
をｐ８４５と記載する）。エレクトロポーレーション法
で形質転換を行う場合にはこれらのプラスミド（ｐ８
５，ｐ８４５）を用いる。

【００４９】続いて、アグロバクテリウム法に用いるプ
ラスミドは次のように構築した。大腸菌選択マーカーに
テトラサイクリン抵抗性遺伝子及びスペクチノマイシン
抵抗性遺伝子を、植物選択用マーカーにノパリン抵抗性
遺伝子を持つプラスミド（ｐＭＭ４４４）をＸｂａＩ，
ＨｐａＩで切断し、フェノール処理及びエタノール沈殿
によりベクターＤＮＡを精製した。ｐ８５とｐ８４５は
ＰｓｔＩで処理した後、クレノー（Ｋｌｅｎｏｗ）処理
で平滑末端にし、更にＸｂａＩで切断してベクターＤＮ
Ａ断片と同様に精製して、ピルビン酸キナーゼｃＤＮＡ
を含むＤＮＡ断片、またはホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼＤＮＡとピルビン酸キナーゼｃＤＮＡを
含むＤＮＡ断片を回収し、先のｐＭＭ４４４と連結させ
た（以下、これらプラスミドをｐ９５、ｐ９４５と記載
する）。

【００５０】これらのプラスミド（ｐ９５，９４５）
で、アグロバクテリウムＥＨＡ１０１株をＤＮＡ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇに記載の方法に準じて形質転換させた。ＥＨ
Ａ１０１のシングルコロニーを一晩ＹＥＢ培地（０．１
％ Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，０．５％ Ｂｅｅｆ
ｅｘｔｒａｃｔ，０．５％ ペプトン，０．５％ シュ
ークロース，ｐＨ７．０）で培養し、その１ｍｌを２５
μｇ／ｍｌ カナマイシン，１２．５μｇ／ｍｌ クロ
ラムフェニコール，２５μｇ／ｍｌ スペクチノマイシ
ン，１μｇ／ｍｌ テトラサイクリンを含んだＹＥＢ培
地に加えて３０度５〜６時間培養した。その培養液を４
０００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、その沈殿に２０ｍｌ
の１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）を加え洗浄し
た。

【００５１】回収した沈殿を４００μｌのＹＥＢ培地に
懸濁し、この懸濁液９０μｌと先のｐ９５またはｐ９４
５プラスミド１０ｎｇ／１０μｌを合わせて−１１０℃
で５分間、続いて３７℃で２５分間処理した。これにＹ
ＥＢ４００μｌ加えて３０℃で一晩振とう培養した。こ
の培養液を５０μｌを５０μｇ／ｍｌ カナマイシン，
２５μｇ／ｍｌ クロラムフェニコール，５０μｇ／ｍ
ｌ スペクチノマイシン，２μｇ／ｍｌ テトラサイク
リンを含んだＹＥＢ寒天培地にまいて３０℃で二晩培養
し、プラスミドを含んだコロニーを選択した。これらの
コロニーに由来する１ｍｌ培養液からＤＮＡをＭｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｉｎｇに記載の方法に準じてアルカ
リＳＤＳ法で調製し、その全量を制限酵素ＥｃｏＲＩ
（ｐ９５）又はＢｇｌII（ｐ９４５）で切断して（０.
５μｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅを含む１０μｌ反応系、３７
℃で３０分間）、プラスミドを有するクローンを選抜し
た。

【００５２】（２）形質転換 ａ）アグロバクテリウム法による形質転換Ｂ ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒの種子を１０％
過酸化水素水で２５分間滅菌処理して乾燥させ、ＭＳ寒
天培地上で照明下（１０００〜４０００ルクス）２〜３
週間培養した。その無菌下胚軸を２〜５ｍｍの長さに切
断し、前培養培地（Ｂ５−ビタミン、１ｍｇ／ｌ ２，
４−ジクロロフェノキシ酢酸、３％ シュークロース、
０．７％ アガロースを含むＭＳ寒天培地上に適当量の
タバコ培養細胞ＢＹ−２を敷き詰め滅菌濾紙をかぶせた
培地）上に置いて明所下一晩前培養した。ｐ９５又はｐ
９４５プラスミドを有するアグロバクテリウムの１コロ
ニーを抗生物質を含むＹＥＢ液体培地５ｍｌ中、３０℃
で一晩培養した。この培養液を３０００ｒｐｍで１０分
間遠心分離し、３％のショ糖を含むＭＳ液体培地で一回
洗浄した後、同じＭＳ培地に懸濁した。このアグロバク
テリウム懸濁液に、先の前培養した下胚軸を入れて２５
℃で５〜２０分間振とう培養した。この溶液を濾過して
下胚軸のみを取り出し、無菌ペーパータオル上で余分な
アグロバクテリウムを取り除き、元の前培養培地上で二
晩同時培養し、下胚軸にアグロバクテリウムを感染させ
た。

【００５３】この後、下胚軸を除菌培地（Ｂ５−ビタミ
ン，１ｍｇ／ｌ ２，４−ジクロロフェノキシ酢酸，３
％ シュークロース，０．７％ アガロース，５００ｍ
ｇ／ｌ カルベニシリンを含んだＭＳ寒天培地）上に移
して三日培養してアグロバクテリウムの増殖を抑えた。
次に、これらの下胚軸を一次選抜培地（Ｂ５−ビタミ
ン，３ｍｇ／ｌ ベンジルアミノプリン，１ｍｇ／ｌ
ゼアチン，２％ シュークロース，０．７％ アガロー
ス，３０ｍｇ／ｌ カナマイシン，５００ｍｇ／ｌ カ
ルベニシリンを含むＭＳ寒天培地）上に移して２週間培
養した。これによりアグロバクテリウムが感染してｐ９
５、ｐ９４５プラスミドを持った形質転換植物細胞のみ
分裂増殖して緑色のカルスを形成することができる。

【００５４】更にこれらの下胚軸を二次選抜培地（一次
選抜培地のシュークロース含量を２％から１％に減少さ
せた培地）上に移し３週間培養した。この時形質転換し
たカルスは更に大きくなるので、次にこのカルス部分の
みを発芽培地（二次選抜培地よりカナマイシンを除き、
カルベニシリンを５００ｍｇ／ｌから２５０ｍｇ／ｌに
減少させたもの）に移した。再生した芽は伸長培地
（０．１ｍｇ／ｌ ベンジルアミノプリン，２５０ｍｇ
／ｌ カルベニシリン，０．７％ アガロースを含むＢ
５寒天培地）上で成長させ、次に発根培地（０．１ｍｇ
／ｌ １ーナフタレン酢酸、０．０１ｍｇ／ｌ ベンジ
ルアミノプリン、３％ シュークロース、０．８％ ア
ガロースを含むＭＳ寒天培地）に移した後、馴化させ
た。

【００５５】ｂ）エレクトロポーレーション法による形
質転換 無菌発芽させた下胚軸を酵素溶液（２％ セルラーゼＲ
Ｓ、０．０１％ ペクトリアーゼＹー２３、０．５Ｍ
シュークロース、０．０１％ ＭＥＳを含んだＭＳ培地
無機塩溶液、ｐＨ５．７）中で、１ｍｍ程度に切断した
後、２５℃で６時間ゆるやかに振とうした。酵素処理終
了後、濾過して未消化物を除いたろ液を遠心チューブに
移して、その上に２０分の１量の洗浄液（１２５ｍＭ
塩化カルシウム、１５６ｍＭ 塩化ナトリウム、５ｍＭ
塩化カリウム、５ｍＭ グルコース、ｐＨ５．８）を
重層し、３００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた
プロトプラスト画分を新しい遠心チューブに移し、洗浄
液を適当に加えて再度３００ｒｐｍで５分間遠心し、プ
ロトプラストを得た。

【００５６】続いて、エレクトロポーレーション懸濁溶
液（０．４Ｍ マンニトール、５ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、７０ｍＭ 塩化カリウム、０．１％ ＭＥＳ、ｐＨ
５．５）に６×１０⁵個／ｍｌの濃度で得られたプロト
プラストを懸濁した。この懸濁液０．５ｍｌに、ピルビ
ン酸キナーゼ遺伝子のアンチセンスＤＮＡを含んだプラ
スミド（ｐ８５、またはｐ８４５）を４０μｇ／ｍｌ、
ウシ精子遺伝子を４０μｇ／ｍｌの濃度になるように加
えた後、Ｘ−Ｃｅｌｌ ４５０（プロメガ社製）で電気
パルス（電気容量４００μＦ、電圧６００Ｖ／ｃｍ、時
間７．５ミリ秒）を印加して形質転換をした。

【００５７】エレクトロポーレーション処理したプロト
プラストは、０．４Ｍ グルコース、１ｍｇ／ｌ ２，
４−ジクロロフェノキシ酢酸、０．１ｍｇ／ｌ ナフタ
レン酢酸、０．４ｍｇ／ｌ ベンジルアミノプリンを含
むＫＭ８ｐ培地で1週間培養した後、１０ｍｇ／ｌ カ
ナマイシンを加えて形質転換細胞を選抜した。３週間後
に得られた形質転換カルスを１０ｍｇ／ｌ カナマイシ
ンを含んだＣＮ培地、ＤＮ培地、Ｋ３培地、Ｂ５培地、
ＭＳ培地に３週間毎に移植し、再生個体を得た。

【００５８】（３）ピルビン酸キナーゼアンチセンスＤ
ＮＡ、またはピルビン酸キナーゼとホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼの両方のアンチセンスＤＮＡの
導入されたカルスの選抜及び再生 これら両形質転換法で得られた再生植物体からゲノムＤ
ＮＡを調製し、導入したプラスミドの１部をプライマー
としたＰＣＲを行い、ピルビン酸キナーゼアンチセンス
ＤＮＡ、またはピルビン酸キナーゼとホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼの両方のアンチセンスＤＮＡ
の導入された植物を更に選抜した。ゲノムＤＮＡをＭｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１１，ｐｐ２７−３４，
１９８８に記載の方法に準じて次のように調製する。カ
ナマイシン耐性植物５０〜１００ｍｇを緩衝液（１５％
ショ糖、５０ｍＭ トリスー塩酸（ｐＨ８）、５０ｍ
ＭＮａＥＤＴＡ，５００ｍＭ 塩化ナトリウム）中で摩
砕し、核分画を遠心分離する。これを界面活性剤（１．
５％ドデシル硫酸ナトリウム，２０ｍＭ トリス−塩酸
（ｐＨ８），１０ｍＭ ＥＤＴＡ）で処理し、遊離した
核内成分を０．６容のイソプロパノールで沈殿させて核
酸を得、これを７０％エタノールで洗浄した後、乾燥さ
せてゲノム分画とする。

【００５９】この分画３００ｎｇをＰＣＲ法に供した。
この時プライマーは５’側として種子特異的発現プロモ
ーター部分の配列の一部を、３’側としてピルビン酸キ
ナーゼアンチセンスＤＮＡ配列の一部（配列番号３）、
またはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼアン
チセンスＤＮＡ配列の一部（配列番号９）を用いて増幅
させた。ＰＣＲは、熱変性９４℃で１５秒間、アニーリ
ング４２℃で３０秒間、伸長反応７２℃で１分間のサイ
クルを３０回行った。反応後に反応液１０μｌをアガロ
ースゲル電気泳動で分析し、増幅したバンドを検出し
た。ＰＣＲ法で導入遺伝子が確認された植物体は形質転
換体として、また導入遺伝子の確認されなかった植物体
はコントロールとして用いるためにそれぞれ鉢上げし
て、３〜６カ月後に自殖種子を得た。

【００６０】（４）種子におけるピルビン酸キナーゼア
ンチセンスＤＮＡ、またはピルビン酸キナーゼとホスホ
エノールピルビン酸カルボキシラーゼアンチセンスＤＮ
Ａの発現の確認

【００６１】ａ）ピルビン酸キナーゼ活性の測定 ピルビン酸キナーゼの抽出及び活性測定にはヒマで確立
された方法（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ８６，
１０６４−１０６９， １９８８）に従って下記のごと
く行った。

【００６２】コントロールには、形質転換しないＢ．ｎ
ａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａｒの未熟種子を用いた。
脂質含量の増加した形質転換体とコントロールの未熟種
子、各１０粒ずつに、０．５ｍｌの酵素抽出液（０．５
Ｍ シュークロース、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５ｍ
Ｍ ジチオエリスリトール、１ｍＭ 塩化マンガン、１
ｍＭ ＰＭＳＦを含む１００ｍＭ ナトリウムーリン酸
緩衝液 ｐＨ７．５）を加えてすり潰し、それを３００
０ｒｐｍで５分間遠心した。得られた上清を更に１４０
００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清を６０℃で４分
間熱処理して、細胞質型ピルビン酸キナーゼ粗酵素溶液
とした。

【００６３】１μｌの粗酵素溶液を用いて、バイオラッ
ドプロテインアッセイキット（バイオラッド社製）に記
載の方法に準じて、タンパク質含量を測定した。ピルビ
ン酸キナーゼ活性の測定には、１ｍｌの酵素反応液（１
０ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ 塩化カリウム、
０．２ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミン、２ｍＭ ジチ
オエリスリトール、２Ｕ 乳酸脱水素酵素、０．１５ｍ
Ｍ ＮＡＤＨ、２ｍＭＡＤＰ、２ｍＭ ホスホエノール
ピルビン酸を含む０．５Ｍ Ｈｅｐｅｓ−水酸化ナトリ
ウム緩衝液 ｐＨ６．９）中に５０μｇ分のタンパク質
を含むように粗酵素溶液を添加し、３４０ｎｍの吸光度
の変化を３０秒間測定した。また、２ｍＭ ＡＤＰを含
まない酵素反応溶液に同量の酵素溶液を加えて同様に測
定し、各粗酵素溶液のバックグラウンドの値とし、この
値を先のＡＤＰを含んだ反応溶液で測定した値から差し
引いて、真のピルビン酸キナーゼ活性を求めた。活性は
タンパク質１ｍｇ、反応時間１分間当たりにＮＡＤＨが
１μｍｏｌ消費する場合を１Ｕｎｉｔとして表した。そ
の結果を表１に示す。この結果から、細胞質型ピルビン
酸キナーゼのアンチセンス遺伝子を導入することによ
り、細胞質型ピルビン酸キナーゼの活性が減少している
ことが確認された。

【００６４】

【表１】 ─────────────────────────── 測定植物個体 細胞質型ヒ゜ルヒ゛ン酸キナーセ゛活性 授粉後24日目 授粉後28日目 ─────────────────────────── コントロール 1.94 1.26 ｐ９５導入個体 0.92 0.64 ───────────────────────────

【００６５】ｂ）脂質含量の測定 コントロールには導入遺伝子を持たない再生個体と形質
転換しないＢ．ｎａｐｕｓ ｃｖ．Ｗｅｓｔａｒの完熟
種子を用いた。得られた形質転換体とコントロールをそ
れぞれ約２ｇずつ１００℃で２時間熱して水分を除去し
た後、ミルなどを用いて破砕して、おおよそ等量に分け
て重量を測定した。破砕物を半量づつジエチルエーテル
溶媒でソックスレー抽出器を用いて粗脂質を抽出し、抽
出された粗脂質を乾燥させてその質量を測定し、重量％
で脂質含量を求めた。一個体に付き２回測定を行い、そ
の平均値をその個体の脂質含量とした。その結果を表２
に示す。この結果からピルビン酸キナーゼアンチセンス
ＤＮＡ、またはピルビン酸キナーゼとホスホエノールピ
ルビン酸カルボキシラーゼの両方のアンチセンスＤＮＡ
を導入することにより脂質含量が増加することが確認さ
れた。

【００６６】

【表２】 ─────────────────────── 測定植物個体 総脂質含量（％） ─────────────────────── コントロール ３６．１±３．５ ｐ９５導入個体１ ４２．０ ｐ９５導入個体２ ４１．９ ｐ９５導入個体３ ３９．６ ｐ９４５導入個体１ ４６．６ ｐ９４５導入個体２ ４４．８ ───────────────────────

【００６７】（５）ピルビン酸キナーゼアンチセンスＤ
ＮＡ、またはピルビン酸キナーゼとホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼの両方のアンチセンスＤＮＡと
種子貯蔵脂質含量増加の後代への遺伝 当代で脂質含量の増加したｐ９５、ｐ９４５導入個体か
ら得られた自殖種子を発芽させた個体（後代）の葉から
ゲノムＤＮＡを調製し、ＰＣＲによりピルビン酸キナー
ゼアンチセンスＤＮＡ、またはピルビン酸キナーゼとホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの両方のアン
チセンスＤＮＡの後代への遺伝を確認した。更に、後代
の植物体についた自殖種子の脂質含量を（４）と同様に
測定した。その結果を表３に示す。この結果からピルビ
ン酸キナーゼのアンチセンス遺伝子、またはピルビン酸
キナーゼとホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
の両方のアンチセンス遺伝子を持った後代は脂質含量が
増加することが確認された。

【００６８】

【表３】 ─────────────────────── 測定植物個体 総脂質含量（％） ─────────────────────── 遺伝子を持たない後代 ３６．１±３．５ ｐ９５保持後代個体 ４４．３ ｐ９４５保持後代個体 ４７．０ ───────────────────────

【００６９】

【発明の効果】ピルビン酸キナーゼアンチセンスＤＮ
Ａ、またはピルビン酸キナーゼアンチセンスＤＮＡとホ
スホエノールピルビン酸カルボキシラーゼアンチセンス
ＤＮＡを同時に導入した種子特異的発現プロモーターを
有するベクターを用いた植物の形質転換により、従来法
より簡便にかつ確実に種子中の脂質含量を増加させるこ
とが可能となる。

【００７０】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：４９８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ナタネ（Ｂ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａ
ｒ） アンチセンス：Ｎｏ 配列 CGTACTGGTT TCTTGAAAGA TGGGAACCCT ATACGACTCA AGGAAGGTCC GGAGATCACT 60 ATCACCACTG ACTATGAAAC TTTAGGAGAT GAGACGACGA TCTCCATGAG CTATAAGAAG 120 CTTCCCTTAG ATGTGAAGCC CGGAAACACC ATTCTCTGTG CAGATGGAAG CATAAGTCTA 180 GCTGTCTTAT CATGTGATCC AGAGTCTGAA ACTGTTAGGT GCAGGTGCGA AAACACGGCG 240 ATGCTTGGCG AGAGAAAGAA CGTGAATCTC CCCGGTGTCG TTGTTGATCT CCCCACTCTG 300 ACAGACAAGG ATATTGAAGA TATTATGGGT TGGGGTGTTC CTAACAGCAT CGATATGATT 360 GCGCTTTCTT TTGTCCGTAA AGGCTCAGAT CTTGTTAATG TCAGGAGGGT TCTTGGTTCT 420 CATGCTAAAA GCATAATGCT GATGTCAAAG GTTGAGAACC AGGAGGGAGT TGTTAACTTT 480 GATGAGATAC TGCGCGAA 498

【００７１】配列番号：２ 配列の長さ：２３ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTGACACCA AGGGGCCTGA RAT 23

【００７２】配列番号：３ 配列の長さ：２４ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CATTGATTCA AGCATCTGAG TNGC 24

【００７３】配列番号：４ 配列の長さ：１９ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTGACACCA AGGGGCCTG 19

【００７４】配列番号：５ 配列の長さ：２１ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGATCACCT CGAGCAACCA T 21

【００７５】配列番号：６ 配列の長さ：２３ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTCATGAAA CTATTTGGAA GGG 23

【００７６】配列番号：７ 配列の長さ：２２ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAGCACTACA TAGAATTTTG GA 22

【００７７】配列番号：８ 配列の長さ：２３ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTGTTCCTTA CAACGCTCCT CTC 23

【００７８】配列番号：９ 配列の長さ：２３ 鎖の数：１本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGAAGCTCA AAGGTGTGCC AAA 23

【００７９】配列番号：１０ 配列の長さ：３７３ 鎖の数：２本鎖 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (genomic) 起源 生物名：ナタネ（Ｂ．ｎａｐｕｓ ｃｖ． Ｗｅｓｔａ
ｒ） アンチセンス：Ｎｏ 配列 GTGTTCCTTA CAACGCTCCT CTCATTCAGT TCTCTTCCTG GATGGGTGGA GACCGTGATG 60 GTACCCTACA CTCTTATTAT TACTTCTGTA TCCTCTTGAA AACATGATTT TAACTATCAA 120 ACATGTCTTA ATCCAGGAAA CCCTCGAGTC ACTCCTGAAG TTACAAGAGA TGTATGCTTA 180 CTAGCAAGAA TGATGGCTGC TAATCTCTAC TTCTCCCAGA TTGAAGAACT TATGTTCGAA 240 GTGAAGAAAC GTTTTAACTC ATCACAGCTT CCTTAGTTTC TTTGGTAGTT AANGTTAGGT 300 TTATTGGCAG ATGTCCATGT GGCGTTGCAA TGAGGAACTT CGTGTTCGAG CAGAAGCTCA 360 AAGGTGTGCC AAA 373

【００８０】配列番号：１１ 配列の長さ：２００６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓ
ｕｍ） アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：99..1628 配列 CCTGGCAAAA GCACAAGAAA CAAACAGTAG CACTAAAATC TTGAAGGGGT GGTTTAGCTT 60 GATCTGTAGC TTTTGTTAGT GACTGATAAA TAGAAGAAAT GGCCAACATA GACATAGCTG 120 GAATCATGAA GGATCTCCCA AATGATGGCC GTATTCCAAA GACCAAGATT GTTTGCACGT 180 TAGGGCCATC TTCTAGAACA GTGCCAATGC TGGAGAAGCT TCTCCGTGCT GGCATGAACG 240 TTGCCAGGTT TAACTTTTCT CATGGGACCC ATGAGTACCA TCAGGAGACA TTGGACAATC 300 TTAAGATTGC TATGCAGAAT ACTCAGATCC TGTGTGCTGT CATGCTTGAC ACCAAGGGGC 360 CTGAGATTCG TACTGGTTTC TTAACAGATG GAAAACCGAT TCAGCTTAAG GAAGGTCAAG 420 AAATCACTGT ATCCACAGAC TATACCATAA AAGGAAATGA AGAAATGATC TCAATGAGCT 480 ATAAGAAGTT GGTAATGGAC TTGAAGCCCG GCAATACCAT TTTGTGTGCA GATGGTACCA 540 TAACCCTTAC TGTTTTGTCA TGTGATCCAC CGTCTGGAAC GGTGAGATGT CGCTGCGAGA 600 ATACTGCCAC CTTAGGAGAG AGGAAGAATG TAAACCTTCC AGGTGTGGTT GTGGACCTTC 660 CAACACTTAC AGAGAAGGAT AAAGAAGATA TACTAGAGTG GGGTGTTCCT AACAACATTG 720 ATATGATAGC GCTTTCGTTT GTGCGTAAGG GTTCAGATCT TGTCAATGTT CGCAAGGTTC 780 TTGGTCCACA TGCCAAGCGC ATTCAACTAA TGTCAAAGGT TGAAAACCAA GAAGGGGTAA 840 TCAACTTTGA TGAAATCCTT CGTGAGACAG ATTCTTTTAT GGTTGCTCGA GGTGATCTCG 900 GAATGGAAAT TCCAGTTGAG AAGATTTTCT TGGCTCAGAA AATGATGATA TACAAGTGTA 960 ATCTTGCTGG CAAAGCTGTG GTAACTGCCA CTCAGATGCT TGAATCAATG ATCAAGTCTC 1020 CAGCACCCAC CCGTGCTGAG GCTACTGATG TGGCTAATGC TGTCTTGGAT GGCACTGATT 1080 GTGTTATGTT AAGTGGGGAG AGTGCAGCTG GTGCTTATCC TGAGCTGGCA GTAAAAATCA 1140 TGTCACGAAT CTGCATTGAG GCAGAGTCTT CACTTGACAA CGAGGCTATC TTCAAGGAAA 1200 TGATCAGGTG TACCCCACTG CCAATGAGCC CATTGGAGAG TCTTGCATCA TCAGCTGTCC 1260 GTACGGCTAA CAAAGCTAGA GCAAAACTCA TTGTTGTCCT GACACGTGGC GGGAGTACAG 1320 CAAAGCTGGT TGCCAAGTAT AGGCCTGCAG TTCCTATTCT GTCAGTAGTC GTGCCTGTTT 1380 TGACCACAGA CTCTTTCGAT TGGTCCATCA GCGACGAGAC CCCAGCTAGA CACAGTTTGG 1440 TATATAGGGG CTTGATTCCA CTTCTTGGTG AAGGTTCTGC AAAGGCCACT GATTCTGAAT 1500 CAACTGAGGT AATCCTTGAA GCGGCCCTGA AGTCTGCCGT AACGAGAGGG CTATGCAAAC 1560 CTGGTGATGC TGTCGTGGCA CTTCATCGTA TTGGTTCTGC ATCCGTTATC AAGATTTGCG 1620 TCGTGAAGTA ATCGTCGTGT CACATAACAT ACAAATCTTG AACTCCCTCC ACCTGAGCTC 1680 AGACTGATTT TCATTTATGC TTTCTGGTCT TGATAATGCA TTATTAATAT GCTGATTTTG 1740 TCACAATGTC TTAGGATATC TAGTATTATC ACCAAGGATT ACTATATTTC ATGTTATATT 1800 TCATATCTGC TTCAAACACT GGATTTAAAA TAAATATTCC TTTGGTGCAG CAATATCTTT 1860 ATGTTGTTGT ATGTGGTGTA GGTGGGGGTG ATAAAGGCTG TTTTTTTGAA CTTTCTTGAG 1920 GAATTTTTAA TGTAGGACAC TGGAAAGAGT TTCCATTGGC AACTGATTTA CCATGTTCCA 1980 ATGGTTCTTT CATTTTGGAT AAAAAG 2006

【００８１】配列番号：１２ 配列の長さ：１７９５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ） アンチセンス：Ｎｏ 配列 TGAGACTGAG GTTGGGTTTG GAAGGCAAGG GCTTGTGTTG TCACAATCCA AGAGAGAAGT 60 AATGGCGAAC ATAGACATCG AAGGGATCTT GAAGCAGCAG CAGCCTTATG ATGGGCGCGT 120 TCCGAAGACG AAGATAGTGT GTACTTTGGG CCCTGCTTCT CGATCCGTAG AAATGACCGA 180 GAAGCTTCTG AGGGCAGGGA TGAACGTTGC TCGTTTCAAT TTCTCTCATG GCACCCACGA 240 CTATCACCAG GAAACCCTCA ACAATCTCAA GACTGCCATG CACAACACTG GCATACTCTG 300 TGCCGTCATG CTTGACACTA AGGGACCTGA GATTCGGACT GGTTTTCTGA AAGATGGAAA 360 ACCTATTCAA CTTAAAGAAG GGCAAGAAGT CACCATAACT ACTGATTATG ACATTAAGGG 420 GGATCCGGAG ATGATATCCA TGAGTTACAA GAAGCTGCCT GTCCACTTGA AGCCTGGAAA 480 TACCATACTG TGCTCTGACG GGACGATTAC TCTCACTGTC TTGTCTTGTG ACCCTGATGC 540 TGGTACTGTT AGATGTCGTT GTGAAAACAC TGCAACGTTG GGTGAGAGAA AAAATGTTAA 600 CCTTCCTGGT GTTGTGGTGG ATCTACCCAC ACTTACTGAG AAGGATAAGG AAGACATTCT 660 TGGATGGGGT GTACCCAACA AGATTGACAT GATTGCTCTT TCATTTGTTC GTAAAGGCTC 720 GGATCTTGTT AATGTCCGCA AGGTTCTGGG GCCACATGCA AAGAATATTC AGTTGATGTC 780 AAAGGTTGAG AATCAGGAGG GAGTCCTGAA TTTTGACGAA ATCCTGCGGG AGACTGATGC 840 ATTCATGGTG GCACGTGGTG ATCTTGGAAT GGAGATCCCA GTAGAAAAGA TTTTCCTGGC 900 ACAGAAGATG ATGATATACA AGTGTAATCT TGTTGGGAAG CCAGTGGTGA CTGCTACCCA 960 AATGCTTGAA TCAATGATAA AGTCTCCCAG GCCAACCCGA GCTGAAGCAA CTGATGTAGC 1020 TAATGCAGTT CTTGATGGAA CAGATTGTGT GATGCTTAGT GGTGAAAGTG CTGCTGGGGC 1080 ATACCCAGAA CTTGCTGTGA AAATCATGGC TCGCATTTGC ATTGAAGCAG AATCATCCCT 1140 TGACTATGGT GCCATCTTCA AAGAGATGAT AAGGTCTACC CCATTGCCTA TGAGTCCATT 1200 GGAGAGCCTT GCATCATCTG CTGTCCGCAC AGCAAACAAG GCCAAAGCAA AACTCATTGT 1260 TGTGCTGACA CGTGGCGGGT CTACAGCCAA GTTAGTTGCC AAGTATAGGC CAGCGGTTCC 1320 AATATTGTCG GTGGTGGTTC CAGTGTTGAG CACGGACTCA TTTGATTGGA CCTGCAGTGA 1380 TGAGACGCCA GCAAGGCACA GCCTGATATA CAGGGGCTTG ATTCCTATAC TGGGCGAGGG 1440 ATCTGCAAAG GCTACCGATG CAGAATCCAC AGAGGTCATT CTCGAAGCTG CTCTTAAGTC 1500 CGCAACAGAA AGGGCCCTTT GTAAGCCTGG TGATGCAGTT GTTGCCCTGC ATCGTATTGG 1560 AGCTGCCTCT GTCATAAAGA TCTGCATAGT CAAATAATGC ATGCTCAACT CAACGTGCCG 1620 CCAACTAATG CAGGGTTATG TTTTGCCTTT TATTTCTTTC TTTCTGCTGT TTATCCGTAT 1680 CATAAAATGG AGGATTTAGT TACTAGCTGT AGATCGAGTG TTTTTTGGTA TACTCTGTTT 1740 ATATTGCGGA GTACTTCTAA ATCAGATTAT CATGGAAATA ATACTCTTAC CTTTT 1795

【００８２】配列番号：１３ 配列の長さ：２４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ） アンチセンス：Ｎｏ 配列 GTCGTTTGTC CGTAAAGGAT CAGATTTGGT TACCGTCAGA CAACTTCTTG GACAGCATGC 60 AAAGCGCATC AAGCTGATGT NAAAGGTTGA ATACCAAGAG GGTGTTNGTA AACTTCGCTG 120 NGATCTTGAG GGNAACGNCT GCATTTATGG TTGCTAGAGG TGATCTTGGT ATGGAGATTC 180 CANTTGAGAN GATATNTCTC GCACAGAAGA TACTNATTTA CAAGTGNAAC CNTTCCGGAA 240

【００８３】配列番号：１４ 配列の長さ：１３０１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (genomic) 起源 生物名：ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕ
ｓ） アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴 特徴を表す記号：CDS 存在位置：join(3212..3218,3766..3948.5917..6008,61
52..6283,6418..6604,6921..7191,7302..7452,7665..78
17.7911..8077,9298..9479,10163..10269) 特徴を表す記号：exon 存在位置：join(3194..3218,3766..3948.5917..6008,61
52..6283,6418..6604,6921..7191,7302..7452,7665..78
17.7911..8077,9298..9479,10163..11594) 特徴を表す記号：intron 存在位置：join(3219..3765,3949..5916.6009..6151,62
84..6417,6605..6920,7191..7301,7453..7664,7818..79
10,8078..9297,9480..10162) 配列 GAATTCCAGG GCATCAGCCA AGGATAACCC CAGTGAGCTC ATTACCCCAA AAAGTTGGGC 60 ATCAGGGTAG TTCCAAGAAT CTGGATAGAG AGTGTCCTCT GGTAGGAGCA TGTGCTCAGC 120 TTACTCCTCA CCCAGTCTCC CACGGGTGCT ATTCCCCACT GACCAAACTC TGTGGAAGCC 180 CTGGGACAAA GCCTTTGGCT CCTTGCCCCA AATCAGAGAA GAAGGGGCCA GAGACAGGGT 240 CTGGAGTGAC CCCAGATGCA TGGCACACTC TCCTCAACTC CCTGGGGCCT CCTGTCAGGA 300 CAGGAAAGCA AAAGCATGCC CAGCTGTCAG TCCTGGATTT TAATGATTAA CTGGCACTTC 360 AAACACAGCC TGTGCCAAAC AGGAGTCTTG GATTCCACCA TCTTTTTTCT TTCTTTCTTT 420 TCTTTCTTTC TTTTTTTTTT TTGATATTTT TATTTACATT TCAAATGTTA TTCCCTTCCC 480 CGGTTTCCCT TTCTATGAGG ATGTTCCCCC TCCCCAACCA CCCCCCATTC CTGCCTCTCT 540 CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA 600 CTCCTCTGTA CTGGGGGTGG GGTGTGGGTG TCCAGCCTTG GCAGGACCAA GGGCTTCCCA 660 TTGGTGCCCA ACAAAGCTGT CCTCTGCTAC ATATGCAGCT GAAGCCATGG GTCTGTCCAT 720 GTGTACTCTT TGGGTAGTGG TTTAGTCCCT GGAGCTCTGG TTGGTTGGCA TTGTTGTTCA 780 TATGGGGTCT CAAGCCCCTT CAGCTCCTTC AATCCTTTCT CTAAAGGGTT CCACCATCTT 840 AACCCTACTT CCACACTTAC CTCAGTGAAC AACAGACACT TCTCCCCTCC CGCCTGCTTG 900 GGTTATATCA GGGCCCCTTG AAAAGCCCTC TGTGCCTTTT CTCCCTACAG CTCCTCCCTA 960 ATTCTTTGGC TCAAGAGAAG GCCCACCTTG ACCTGGTTGG CCTTTGTGAC TATTGTGGGA 1020 GGTCAGAATC CACTGGAGAC CTCACCCAGT CCGAAGCCTT ATGTCTCACC TCCCCAGGAA 1080 AGCCCTTTGC TCCCCTATCC CAGGAATACA GGGTGTTAGC TATCACATCT TCAAAGGTTG 1140 GCTTCAGAGA AAGATGACTT CCTCCTGCTT GCAGTACCTC AGCACTGGCA GATGGATGGG 1200 ACATTTGACC CCAGAGCAAA ACCAGACTTC TCCATGTTGT ACTCCAAGCA CTGAAAGCCT 1260 CCCTTACCAG TACAGCTCCT CATTCCACTC TGCCTTCCCT TTTCCAAAAC ACATCTCACA 1320 GACTTCTCCC TCCCCACAGT GCCACCCAGG CTAGCCTGTC ACCTCCCACC CTGAGCAACT 1380 CCCAAGACTC ACCTGTGTCT CCCTAATCCA CCACTGACTC CACCACTGAC TCCAGCCAGA 1440 GCAACCGTAA ACTTTACTTG AATTATGTCC CTGGCAGCAA TGCCAGTTGC CGCTCAGTGC 1500 CCAGCTTTAC CATGGCCACG TTCTCCCTCC CAGCTTCTTC TACACGGAAA GGTTTTTCTT 1560 CCTCAGAGTT GTGGGATATA TTTAACCTGC AGAGGAATGT GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT 1620 GTGTGTGTGT GTGTGTGTGT GTGTGTTTCC TCTGCCCCTG CTGGTCCCCT CTCATCTTTA 1680 ATAGTGTAGG CAGAATCACA TCAAAGAGAG CCGCATCTTC ATTAGGAGGT ACCTAAGACA 1740 CATCACTGCA ACGCCCGGCC CCTCTACCCA GTACCGAGAT CCATCCCTGA CAGCCCCTGC 1800 CCTGTTTATA GCATTTATTT ATTTGCTAGT AGTCTGTCCC CCACCCCTGC TATACTATAA 1860 TCCACAGACG GGAAAGTTTC CATCTGCCTG ACTCCCACTG TATCCTCAAG GTCTGTCACT 1920 GGCCGGTGTC ATAGTGAGAA TGCCACGGAA GGCCTCCCAG AGAACCCCCC TGTTTTATCA 1980 ACTTTGCGGA ACATGCAAAA CCACCTAAGA CTGGAGTCAG GAGGATCCCC AGAGTAGGGC 2040 CTTCTGGGAT TCAAGAGAGC AGTAAGTGCC AGGTGGTCCC CTTGGTAGTG ATAGGGGATT 2100 CTGCCTGCAG GACTGCAGTT TACCATCATG GTGGTCAACA AGGCAAGGTC ATTCTCCCTG 2160 GTGCTATGGT ATGATCTCCC TGGTGAGATC GATGCCCTTG TGATGGCTGA GGAGATCCCC 2220 TGTACTCAGG TTTCCATGTG TTTATCCATA CGGCTGGTCA ACAACAATAC AAGTTTATGA 2280 GTTAGTGCCT AGGAATGTTC ATGGTTTCAT CTCTGGGTTC TCAGAGGAAC ATGTGCGAGA 2340 AACTGAGAGA CCCTCTAACC TTTAACTACC AAAGGGTATC CCTGTTTTCC ACAGCCTAGT 2400 CCCCACCTTC AAGCTCTTGT TCTGAGAATA CACCTAAGAT TCTCTTCAAT AAAATGCAAA 2460 GAGAAAGGCA TTGTACTGTT GGCAATCAAC CAATCTCTTC TCTAATGATG AGCCAACAAT 2520 GTGAATGGAC TAATGATTGA TCAGGAAAAA ATAGATGACC TAGGGGAAGG GGAGAGATGG 2580 GGGCCCCACA ACAGGCAGTC CTTGAGAAGG GACTCTGTGG GGATGGGGCT GCCTGCTGGG 2640 TGTGCCCCTT TTCTATTCTC TGGCTTCCTC AGATAAGACC AGCAGTTAGG GTACACTCTC 2700 CTCCCAGTCT GCCGTTCTTG CAGACACAGT TCCACGCTTT GGAAGCATGT CTGTCCAGGA 2760 GAACACTCTA CCCCAGCAGC TCTGGCCGTG GATCTTTAGG TCCCAAAAAG ACTTGGCAAA 2820 GTCTGCCTTA AGTGGGGCTC CCGGAGGTAA GAAGAGGAAG GGAAGCCACT GAAGAGAGAG 2880 GAGAATTAGG GTAGAATCAG CGTTGAGAGA TGGAGGCCTT GTGGGGTAGG ATGCCCAATA 2940 TAGCCTCACC TCGGCTAAAT ACAGACCTGA TCTGAGCCTT TGATCCAGGC TCTGCAGACA 3000 GGCCAAAGGG GATCCAGCAG CATGGGCGCA CGGGGCACTC CCGTGGTTCC TGGACTCTGG 3060 CCCCCAGTGT ACAAGGCTTC CGTTGGCAAG AGAGATGCTA GCTGGTTATA CTTTAACCAG 3120 GACTCATCTC ATCTGAGCCA GGCCCCATCC CACTGACAAA GGCGCAGTAT AAAGCAGACC 3180 CACAGACACA GCAGGTAAGC AACGTAGCAG CATGGAAGGT GCTTCTAAAC CGGGTGCTCT 3240 ACTGAGCAGG GCTGGGTCAA GCTACGGATC CAGCGCAGCC TTGAATGGGT GGAGGGAAGG 3300 TGGAGGGGAG GGGAGTGGAG AAGGCCAGAG AATTGCCTGG AGCTGGAAGA AGTAAACAAG 3360 AAAATGAGGG AAAGTAAGCT GAGTGTTTGC AGGCCTAGAT AATGAGGTGC AGGCTTGAAG 3420 GAGGCCTCTG GGAGGGCTGA AGCTGAGTGG TCTGCAGCGG TGTGACGCTT GGGGAAGGTC 3480 TCTGTAGCTT GGGGATAGAC CTGGATTTGA ATCATCTCAC TTGGCTGATG CATTTTTTTT 3540 TTCTTAGACA ATGTATTTTT TTTTCCCCTT GGTCTTTTTC TTACTTGTAA AGTGGGGATA 3600 GAGCAGGACC CTGGAGACTA AACAAAGTAG CGGGTGTGTG ATAGTCAAAT GGGAGGAAGA 3660 CCTCGCACCA TCTGGAGATC TGAATAGACA CAGGGTGCAC TGGCAGGAAG CACATGGGGG 3720 ACAGGCAGGT GTCTGTGCAA GAGCCTGAGT TTCCATCTAC GGCAGGGCCA GCGGGATACC 3780 TTCGACGTGC GAGTGTGGCT CAACTGACCC AGGAGCTGGG CACTGCCTTC TTCCAGCAGC 3840 AGCAACTGCC GGCAGCTATG GCGGACACCT TCCTGGAACA CCTCTGCCTT CTGGATATCG 3900 ACTCACAGCC TGTGGCTGCT CGTAGCACCA GCATCATTGC CACCATTGGT AAGACCACCC 3960 AAGCCCTAGA AGCCACACAG GGCCACCCAC ATGGCTCAGG TGTCTCCTTA CTTTGCTATC 4020 CTTGTTGTGG TCATTCATTC AACAAATATT TGTGAGATTT GTGCAGGGGT AGGGGGTGGG 4080 TTTGTTTTTG TTTTTGTTTT TGTTTTTTTG AGATCGGGTC TTTTTATGTT GTAGCTCTGA 4140 CTGATGGATA GGCAGGTCTC AAATTTAGAA ATCTCCCTAC CTTTGCCTCC TGAGAGTTGG 4200 ACTGGGACCA CCTTGCTCCA CATGAGGCTG GGTTTTTGAG ACAGGGTCTC AGGTAGCCTT 4260 GGATATTTCT AGCTTATTTC ATAGACCCTA TTATATCGTC TTAGCCTGGT GAAAGCATAG 4320 GTATGTGATA CCACACCCAA CTTAACAAAT GCTTGTTGAG TACCTGGAAA ACAAGGTTTG 4380 GAATTGGGGG GTAGACTCTA TCTCAAAAAC AAATAAGAAC GAGGAAAGGT GTCATCTGCA 4440 CACAGATGGC CTTCCAAGGA TAAGGACGGC TGGGATCACA GAGAAGTGAA AGGTATATAT 4500 AATGAACTGA GGACCAGACA GACACACACC TAATACACAC ATGTCACACA ACATACACAC 4560 ACACCACACA CATACACATG CACCACACAC ATACACACAC ACACCACACA TATACTACAT 4620 ACCCACACAC ACACCACTCA CATATCACAC ACATGTACCA CACATACACA CATCTTGCAC 4680 ACACACACAC ACCACACACA TATCACTCAC ACATCACATA CATATACCAC ATATACACAC 4740 AGCACACACA TACACCGTAT ATGCACCATA TCACATACAC ACACACCATT CACACGTCAC 4800 ACACACACAT GCACTATACA CACACACCAC ACATAACACT ACTCACACAT GACACACATA 4860 TACTACACAT ACACAAATCA CTCACACATA CCATTCATAC ACATACATCA TACACACATA 4920 CCACACACCA CTCACATATA CACCACACAC ACAAACATGT ACAGGCCACA CACACACACA 4980 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACCAGTCCT CACACATTAT GGCTCAGCAT 5040 GCTCAGCAGA TAAAGTCTTG TCATGGAGCT GGGTGACCTG AGTTCAATCC CTGAAACCAC 5100 ATGGAGGATT CGGCCACACA CACCAAAAAC AAAAACAGAA CTCAGTCCAG CCAGGCTATG 5160 AGGCCCTGTT TCAAGGAGAG AGGGTGGGCA GTAGCTCTGT TGTTAGAACA CTTGCCTCCT 5220 GCATGAAGCC CTGGGTCCGT CCTAGCGCTA CATAAATTGG CTGTCGTAGA GTACACCCTT 5280 AACCCAGCAC AGGGGAGGAC AGGAGAACCA AGCCCAAGGT TATCCCCAGA AGCCAGAGCA 5340 AACCCAAGGC TAGCCTGGGT TATGGGAGTC CTTGTCTCAG AAGGAAGGAC TGTTATTCCT 5400 AAAGAATGGG AGATAAGGAT GGGTGTAGCT CAGTACTATA GCATTTATTT GCCTCGCATG 5460 TAGAAGGCCC TGGCCTCCAT CTCCAGAGCA GAAAAAAAAA ATGGTGGCCA GGGAAGAAGA 5520 GGGAGGGGGA AGTGCATACA GCGAGCTGCT GCTGCTGCTG CAGGCTGACG TGGATGAAGA 5580 CAGGGACAGA TCTCAGTTCT GTCAGTGAGA TTGCTCAGCT TTCAAAGTGC CTTTTTGACC 5640 TGCCTGGCGT TCTGACCCTT CACAGCCTAC AGTAACCTCC ACAGCATACA CTTATGTCAG 5700 GTCACTTGCT AACAAAGGTC CTGAGGCCTG ACTGAGATTT AGACATTCCA CAAGCTGCCT 5760 TCCCAAGGGC TGTGTACTGG TTGGAGTGGG GGAAAAAAAG AGTTTGTGAG TAGAGGAACT 5820 TCGAAGGACT CCTGGGTAGG GGAGTCTCTC CGATGTTGCA GATGGGTTTG ACTGTCAGGC 5880 TTGGGAGGAC CTTCTTAGTG GGTTCTCTGG TTCCAGGGCC AGCATCCCGC TCTGTGGACC 5940 GCCTCAAGGA GATGATCAAA GCAGGGATGA ACATTGCACG ACTCAACTTC TCCCATGGCT 6000 CCCATGAGGT GTGGGGAAGA AGTCATGGAG GGTGGAGCTG AGAATGCCCC CAAGGTCCTG 6060 TTCACTTTGC CTTAAGATCC AGGTTTTGTT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT 6120 CTCTCTCTCT CTCTCGCTTT CTCTCTGGTA GTACCATGCA GAATCCATCG CCAACATCCG 6180 GGAGGCAACT GAGAGTTTTG CAACCTCCCC ACTCAGCTAC AGACCTGTGG CCATCGCCCT 6240 GGACACCAAG GGACCTGAGA TACGAACCGG AGTCTTGCAG GGGGTGAGAA GCCTTTGGGT 6300 CCGAGCTGTC TGGGGCCTGG AGGAGCATGA GAGCCCTGGA GCAAGAGAGA GGGTCCCTAC 6360 CCTCTCAGGG TCCACTTGCA AAACTCAGGC TTCTCTACCC ACCCCACTCC CCTCCAGGGT 6420 CCGGAGTCGG AGGTGGAAAT TGTGAAGGGC TCACAGGTGC TGGTGACGGT GGACCCGAAG 6480 TTCCAGACAA GGGGTGATGC AAAGACAGTG TGGGTGGACT ACCACAATAT CACCCGGGTC 6540 GTTGCAGTGG GGGGCCGCAT CTACATTGAC GACGGGCTCA TCTCCTTAGT GGTACAGAAA 6600 ATCGGTACAG AAATGCATCC TGATCTTATG AGGCGCTCCC AAAACCCTGA AACAGGGCAT 6660 TTTCTCTTCC CTTTGGTTTC TATGTTCTGT CAGCTCCTTA CCCATACCTT CCCCTAGTGG 6720 TGCTTGCTTC TCCACCTGTC CTAGTGGTCC CTGCTGTCAT CATGGGTTGG AGCTGAGCAT 6780 TTGATGCCTC TTCTTGTGTG TGGAGTGAGT GAAGGGTTCA GAAGATTCCA ATTTCTGGAG 6840 GATCCAAGCT TAAGAGTTCC CTCTGCAGTG CCTATATCGC AGCTCAGCCT TACAGACACT 6900 GGTTCTCTCT ATACCCGCAG GCCCAGAGGG ACTGGTGACA GAAGTGGAGC ACGGTGGTAT 6960 CTTGGGCAGC AGGAAGGGTG TGAACTTGCC AAACACTGAG GTGGACCTGC CCGGGCTGTC 7020 TGAGCAAGAC CTTTTGGATC TGCGCTTCGG GGTGCAGCAT AATGTGGACA TCATCTTTGC 7080 CTCCTTTGTG CGGAAAGCCA GTGACGTGTT AGCAGTCCGG GATGCCCTGG GGCCAGAAGG 7140 ACAGAACATC AAAATTATCA GCAAAATCGA GAACCATGAA GGCGTGAAGA AGTGAGGCTT 7200 AGTCTTTGGT CCGTCAGCCC TCTGTTTCTC TTTCCCTCTC TTCTGCATGA TATTTCCTGC 7260 CATCTCCTCC TCTGCCTAGC CTGGATTCCT CCAACCACCA GGTTTGATGA AATTCTAGAA 7320 GTGAGCGATG GCATCATGGT GGCACGGGGT GACCTGGGCA TTGAGATCCC TGCGGAGAAG 7380 GTTTTCTTGG CTCAGAAGAT GATGATTGGA CGCTGCAACC TGGCCGGCAA GCCTGTCGTT 7440 TGTGCCACAC AGGTCTGGAG CAAACCCTTG GGCTTTAAAG GTGCTGAGAA ACCTACATGT 7500 TGCTGTCTGG TGCCTGGTCA CAAAAGACGA TGACATGAAC TTCCAGGGTC TTACTGTGAC 7560 CCTGGCACTC TAAGCGTGCA GGTGCCAGAG AAATAGCGTG GGCGGGTTCG GGTCCCCAGT 7620 CAGAATGTGA CTTCTACAGC TTTGACATCC ATGGTGTCAC TCAGATGCTG GAGAGCATGA 7680 TCACTAAGGC TCGACCAACT CGGGCGGAGA CAAGCGATGT GGCCAATGCC GTGCTGGATG 7740 GGGCTGACTG TATCATGCTG TCCGGAGAGA CCGCCAAGGG CAGTTTTCCT GTGGAAGCTG 7800 TAATGATGCA ACATGCGGTA GGTACTCCGT TCTGAAAAGC TGCTGGGCCA GCGACACAGA 7860 CCCCTCTGGA ACCCCGTTGA CTACTCAACC TGACCTACTG GTCCCTGCAG ATTGCGCGGG 7920 AGGCAGAGGC CGCTGTGTAC CACCGCCAGT TGTTTGAGGA GCTACGCCGG GCAGCGCCGC 7980 TGAGCCGTGA CCCAACTGAG GTCACTGCGA TTGGAGCCGT GGAGGCTTCC TTCAAGTGCT 8040 GTGCAGCAGC CATCATCGTG CTGACGAAGA CTGGCCGGTG AGAAACATAT TGGAAACAGG 8100 GCTTTGGGCA GGGGCGGCTG ACACAGAGGC TAATAAAAAA AGCACTGCTT TAGGGCAAGC 8160 AAAGAAACAG CCATGGATGC TAGAGGCCAG GAGAGGCTAG AGGCTTGGAC AGGTGGCTTT 8220 TTGATGATCT AGAATCAGAG CCAGTGATGG GGGGGGGGGG GCGCACGGGG ACGGGGACGC 8280 AGCAGGTGAT AACCCAAGCA CGTTGGCCTT AGGGTATTTG AAGACCAGGC TCTGACAGAT 8340 CTTCACTGTG CTGAGGTGTT GCTGAAAAAC CCAGTAGGCC CAAGAGCTGA GGATTTTTCT 8400 CAAACTTAGT AGTGAGATCC TAAGTAATTG TTAGGGCTTA CAAGCCTTGA CTCCATGGAT 8460 CTGTGTGAGT TTTTCATTTG TCCCCACCCC ACCCCACCCC CATGGGGTTG TGAGGATTAA 8520 CAAAAAATGG TTAAGAGTCA TATGGAGGTT GGGAATGATG TAAACATATC TTCTAGACAG 8580 TTTTACCCTT TTTTTGTTGT TTGTTTGGTA GGATTTTTCT GACATAGGGA CTTATTAGTC 8640 CTGGCTGGCC TGAAACTTCC TTAGTACCTG AAGTAGCCTT GAACTTAACC CTTTACCCCG 8700 AGGGCTGAGG TTGTGGGCGT GTCTCACCAC GCCTGGCTGG CTTTACATTT CTAATTTTTT 8760 GGAGGATTTA TTACTTTTAT GTGTGCATGT ACAGTTCTAA GGCGAGAAGA GGTTGGACCC 8820 TCTGGAGCTG GAGTTACAGG CAGTTGTAAG GGATTTGATG TGGGTGCTCA GAACCAACTC 8880 TGGTCCTCAG AAAGAGCAGT GCGAGCCTTT AAGAACTGAG CCATCTCTCT AGCCCAGGTT 8940 TTACATTTAT CTTTCAATAT GGATTGACAT TTTGCCTGCC CTTACGTCTG AGCACCATTT 9000 GCATGTCTGG TGCCAGTGAA GGCCAGAAGA GGATGTTAGA GCCCCTGAAA CTGGACTTAA 9060 AAACCATTGT TAGCCACCAT GCTGGTGTTG AAAACGTAAT CCCAGCGTGT GCTCTTAATG 9120 GTGAGCCGTC TCTACATCAG GGTAGGTCTT CTTACTACTT AATGAGAAAG ACAAAGATCA 9180 GAGGAGTATA CCTTACCCAA GGACACAGGG TTTGTTAGTG ACAGTGACAC CTGGAACCAT 9240 AATTCAAACT CGTTTCTTGG GTCAACACTC AGAGCTAACC TTTTCTTCCT CATGCAGTTC 9300 AGCCCAGCTT CTATCTCAAT ACCGACCTCG GGCGGCTGTC ATTGCTGTGA CTCGATCTGC 9360 CCAGGCTGCC CGACAGGTCC ACCTGTCCCG AGGAGTCTTC CCCTTGCTCT ACCGTGAGCC 9420 TCCAGAGGCC ATCTGGGCAG ATGATGTGGA TCGAAGGGTC CAATTTGGCA TTGAAAGTGG 9480 TGAGCCTTGC CCTCTGTTCC ACAGCCTGCC TTCTTACCCC GACTCCAAAG CTCTGTCTGT 9540 CCTCACTGGC CCAAGTTTTC TAGGAATCGC TAAGATGGAC ATGTCTTGGG CTTTATTTTT 9600 GTTTTTTTGT TTGTTTGTTT TTTGTTTTTT TTTTAAAGAT TTATTCATTT ATTATATATA 9660 AGTACACTGT AGCTGTCTTC AGACACACCA GAAGAGGGCA TCAGATTCTG TTACAGATGG 9720 TTGTGAGCCA CCATGTGGTT GCTGGGATTT GAACTCAGGA CCTCTGGAAG AACAGTCAGT 9780 GCTCTTATCC GCTGAGCCAT CTCTCCAGCC CATGTCTTGA GCTTTAAAGC AGGAAGGGTA 9840 GGCTGAGAGG AAAGGAGTGA GAGCAGGACC CCTGAGAAGT CCTTGCTGCT GTCTGCCACA 9900 GCCTAGTAGG ACACATCAGT AAGAGGAGGT TCCAGAAGAG CTGGAACTAA ATTTTAATTT 9960 ATAGTTGTCC TTGTCCCATT AGTGCAGCCA CATGGGTGAA AAGGCTCAAT GCTGAAAAAC 10020 AGTATACAGC ATCCCTCCAC ACACACATCC TCTCAAACCA CTGCCTTTGG TTCCTTTCCC 10080 CTACAGGATA GGTAGCCTTG AGGTGGTCGA TGCTAATGGC TGACCCAGGT TCTTCAATGA 10140 CTGTCATATT TTTCTCCACC AGGAAAGCTC CGTGGTTTCC TCCGTGTGGG TGATCTGGTG 10200 ATTGTGGTGA CAGGTTGGCG GCCTGGCTCT GGCTATACCA ACATCATGCG GGTGCTGAGC 10260 GTATCCTGAA ATGCCTCTCC CCATTCTGAC CCAGTTACAC CCTATTTCTT TCAACCCACA 10320 CCCCTCCCAT AGTCCTACAT CTGCCATCTA GCCCCATCCC TGTGCTTTAC ACAGCCCTGA 10380 ATGTCTGTGT CCAATTATAC AGTGGCCACC GGCAGCATCG GTTGTATATC CCTGTCTCAA 10440 TCCGCTCAGC TGGACTCTAA GATACCCTGA GCCTTTAATC CCAGCCCAGC TGGTGATTCG 10500 ATTCCTTCCG GGTCCCAATC ATTGGAATGG GGGAGTGGAA ACAGGGTGAT CTTGTCCAAT 10560 TTTCATACAA TCATGATTTT AAAACACTGT CTGATATAAC CCTCATGATC AGTTCCTAGC 10620 AAAGTGTCAT CTCCTAATGG CCTCAAGTCA GGGCAGAATA CTCCTTCAAG GAGCACAGCT 10680 CCACACTTTA GGGAAGGCTG GGGCAGCTGG GTACTGGAGA GAACTAAGAC AGGCGGCTTT 10740 TCTCTCTCTC TCTCTCTCTT TTTTTTTTTC TTTTCTTTTT CTTTTTTTCG GAGCTGGGGA 10800 CCGAACCCAG GGCCTTGTGC TTGCTAGGCA AGCGCTCTAC CACTGAGCTA AATCCCAACC 10860 CCAGCTTTTC TCTTTTTAAT ACAAGCTCTC ACTGGCCTCA AACTCCTAAG TCCTCCTGCC 10920 TGGCCCTCCT AAGGGTAGGG ACTACAGGCA TGAGTGACCA GCTGGACTTC GGGTGCCTTA 10980 TTTTCTTACT GACTCCACAA ACCATGGTTG TTCTCCTGCC CACTGCTCTG CTGGGTCAGA 11040 TGATCCAGAA ATTCTTCCAC AACCACTTGG CTCCCACATA CAAATTAGAA GCAAACTGAA 11100 TCTTTTCTTT TAAACCCAAC TGTTTAGGTG CAATTATAAA AACAACTCCC ACAGGCAAAG 11160 AATCCCAGAA TCTCCTACCC TAGGAGATGT ATAGTCCTGG CCCCACCCAT CAATCTGTAG 11220 TATACTCCTG AAGCGGGACA GAACTGGTGG ACAGGGGACT CCTCTTGTCC CTAAGAAAGT 11280 GGAGGCACTG TTGGCCCACC CCTCCTAGGT TTGAATACTC CAGGCCCTCC TCTTAGCACC 11340 AACAGCAAAT CCAGATGAGG AAAAAAAAAT AAGTGCAGTT CTCCTGCTGC CCTCCTCTTT 11400 TCACTACCTC AATACAGCAA GTTTGAGTAT TGCTGCTGAT GGCAGTGTGC AAGGCCACAA 11460 AGATGTCCCC CCTCAGCCCC CTACCAGAAG GTGGAGAGGA CAGAGGAATG AATAATAAAG 11520 TGAATGCGTC AAATTAGCAA ATGAATAAAT AAAATTAATA AGTGACTGAA TAAGACACAG 11580 GGAAAGATAA AAGGTCACAT GAGGATTCAG CCCCTTACCC CCTACCTGGG GGAGCTAGGC 11640 TAGCACAGTA AGGAGGCGCC AAGTATCCCT TAGCTTTAGG GCAACACCAT TGAGTCAGGG 11700 AGCACAGTGA AGAGCAGCTT CTAGTTTACA AAGGTAGTGC TTTCCACACA GGAGCTGCGG 11760 AGGGCAGACT ACAGTGGGCA GAGATACCCG TTCTCACGTG GTGTAGACAA GGACGGTCCG 11820 TCCACACGTG GCAGTGAGAG GGAAGATGGT CACACCTAGG GCCCTAGACA TCTGTTGGCT 11880 GTACTAGATA ATTGACAGTA CCCAGCTACG ACAATGGGGA TGGGAAGAAA GGACACACTG 11940 GGCACAACCT GCAGGGTCAC TGACAGGGAG ACAGCCATCT AGTCACTCGG CAGTGAAGGA 12000 AGCAGCAAGT ACTTGTGCTT AATAAAGGCA GGGCTGTGGG CCCAAGCCTG CACCTGGCAG 12060 GACTGTGGCC TGGGGACACC TTGTTAAAGG GCTTTGAGTC ACTTCTACTT GGCAGTGGCT 12120 ACACATTGTA CTTAGCACAA TGCCTTGACG GGGTAGGCAC TGGTACCTAT GACAAATGGG 12180 TATGTGATTA GGATTCGCAG GCTGCAGCTG CTATGAGCTG AGGACACAGA GGACAACTTT 12240 GTGGTAGTAA AGGGCAGTGT GTTAGATCCC CGCAGCCTTC CCCAGGGGCG TCTACCCTCA 12300 GGCACACCTT ATTGCGTGCC AATAGCTAAG GCCAGTGCAA TCTAGGATTT CACATGTTGG 12360 CAGAAATTTG GGGACCTCTG GGGGTAACTG GCTCAGGCAC TGATGACCTG GATGGCTGGA 12420 CAGTCCCTGG AGGCTTGGCC AGGAGCCCCA AGGGCAGCAC GCTCACTTCC AGAGCCTTTG 12480 CGCCTAGGAG AGCCATCCCC CGTGGCTCGC TGAGGCAGAG AGGGTTGAGA GGCAGAGAGT 12540 GGGCGGCCCC TAGGTCCTAG CCTCCGACCA CCTCCTCCTG GGGAGGGCCC AACAGAGACA 12600 CCTGGGAACG CCCTGTCCGG GATAGGCTGG CATGGAGGGT TCGGGCAGGT GGAGGGGGAG 12660 GGCCCAACAG AGACACCTTG GGAACCCCTG TCCGGGATAG GCTGGCATGG AGGGTTCGGG 12720 CAGGTGGAGC AGGCAGGCGA GAAGTGGACG CCCAGGGTCC CCGGGCCAGC AGAGGACCTG 12780 CTCGGACAGG CACCAGTGGG GAGGCTGGGG AGCCTGCTGA GCGTCTAGCA GATCGAGCCA 12840 GGAGGGTGGC TGGAGAATCA GGGGAGAGGG GCAGAGGGCC TCGCTGATGA GTCAAGGCTA 12900 TGGCCACGTT GGAGGTCACA GCAGCTGCCT GCAGAGGTGC GTGTACCAGT GGTTCCCACA 12960 GCACTGGCTT TCCACTGAGG CGAGCTCCTG TGCCCGGAGC CAGACCCCGA A 13011

【００８４】配列番号：１５ 配列の長さ：２８８５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：DNA (genomic) 起源 生物名：酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ） アンチセンス：Ｎｏ 配列 GATCCAAATG TAAATAAACA ATCACAAGGA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ATAGCCGCCA 60 TGACCCCGGA TCGTCGGCTT GTGATACGGT CAGGGTAGCG CCCTGGTCAA ACTTCAGAAC 120 TAAAAAAATA ACTAAGGAAG AAAAAAATAG CTAATTTTTC CGGCAGAAAG ATTTTCGCTA 180 CCCGAAAGTT TTTCCGGCAA GCTAAATGGA AAAAGGAAAG ATTATTGAAA GAGAAAGAAA 240 GAAAAAAAAA AAATGTACAC CCAGACATCG GGCTTCCATA ATTTCGGCTC TATTGTTTTC 300 CATCTCTCGC AACGGCGGGA TTCCTCTATG GCGTGTGATG TCTGTATCTG TTACTTAATC 360 CAGAAACTGG CACTTGACCC AACTCTGCCA CGTGGGTCGT TTTGCCATCG ACAGATTGGG 420 AGATTTTCAT AGTAGAATTC AGCATGATAG CTACGTAAAT GTGTTCCGCA CCGTCACAAA 480 GTGTTTTCTA CTGTTCTTTC TTCTTTCGTT CATTCAGTTG AGTTGAGTGA GTGCTTTGTT 540 CAATGGATCT TAGCTAAAAT GCATATTTTT TCTCTTGGTA AATGAATGCT TGTGATGTCT 600 TCCAAGTGAT TTCCTTTCCT TCCCATATGA TGCTAGGTAC CTTTAGTGTC TTCCTAAAAA 660 AAAAAAAAGG CTCGCCACTC AAAACGATAT TCGTTGGCTT TTTTTTCTGA ATTATAAATA 720 CTCTTTGGTA ACTTTTCATT TCCAAGAACC TCTTTTTTCC AGTTATATCA TGGTCCCCTT 780 TCAAAGTTAT TCTCTACTCT TTTTCATATT CATTCTTTTT CATCCTTTGG TTTTTTATTC 840 TTAACTTGTT TATTATTCTC TCTTGTTTCT ATTTACAAGA CACCAATCAA AACAAATAAA 900 ACATCATCAC AATGTCTAGA TTAGAAAGAT TGACCTCATT AAACGTTGTT GCTGGTTCTG 960 ACTTGAGAAG AACCTCCATC ATTGGTACCA TCGGTCCAAA GACCAACAAC CCAGAAACCT 1020 TGGTTGCTTT GAGAAAGGCT GGTTTGAACA TTGTCCGTAT GAACTTCTCT CACGGTTCTT 1080 ACGAATACCA CAAGTCTGTC ATTGACAACG CCAGAAAGTC CGAAGAATTG TACCCAGGTA 1140 GACCATTGGC CATTGCTTTG GACACCAAGG GTCCAGAAAT CAGAACTGGT ACCACCACCA 1200 ACGATGTTGA CTACCCAATC CCACCAAACC ACGAAATGAT CTTCACCACC GATGACAAGT 1260 ACGCTAAGGC TTGTGACGAC AAGATCATGT ACGTTGACTA CAAGAACATC ACCAAGGTCA 1320 TCTCCGCTGG TAGAATCATC TACGTTGATG ATGGTGTTTT GTCTTTCCAA GTTTTGGAAG 1380 TCGTTGACGA CAAGACTTTG AAGGTCAAGG CTTTGAACGC CGGTAAGATC TGTTCCCACA 1440 AGGGTGTCAA CTTACCAGGT ACCGATGTCG ATTTGCCAGC TTTGTCTGAA AAGGACAAGG 1500 AAGATTTGAG ATTCGGTGTC AAGAACGGTG TCCACATGGT CTTCGCTTCT TTCATCAGAA 1560 CCGCCAACGA TGTTTTGACC ATCAGAGAAG TCTTGGGTGA ACAAGGTAAG GACGTCAAGA 1620 TCATTGTCAA GATTGAAAAC CAACAAGGTG TTAACAACTT CGACGAAATC TTGAAGGTCA 1680 CTGACGGTGT TATGGTTGCC AGAGGTGACT TGGGTATTGA AATCCCAGCC CCAGAAGTCT 1740 TGGCTGTCCA AAAGAAATTG ATTGCTAAGT CTAACTTGGC TGGTAAGCCA GTTATCTGTG 1800 CTACCCAAAT GTTGGAATCC ATGACTTACA ACCCAAGACC AACCAGAGCT GAAGTTTCCG 1860 ATGTCGGTAA CGCTATCTTG GATGGTGCTG ACTGTGTTAT GTTGTCTGGT GAAACCGCCA 1920 AGGGTAACTA CCCAATCAAC GCCGTTACCA CTATGGCTGA AACCGCTGTC ATTGCTGAAC 1980 AAGCTATCGC TTACTTGCCA AACTACGATG ACATGAGAAA CTGTACTCCA AAGCCAACCT 2040 CCACCACCGA AACGTCGCTG CCTCGTGTCG CTGCTGTTTT CGAACAAAAG GCCAAGGCTA 2100 TCATTGTCTT GTCCACTTCC GGTACCACCC CAAGATTGGT TTCCAAGTAC AGACCAAACT 2160 GTCCAATCAT CTTGGTTACC AGATGCCCAA GAGCTGCTAG ATTCTCTCAC TTGTACAGAG 2220 GTGTCTTCCC ATTCGTTTTC GAAAAGGAAC CTGTCTCTGA CTGGACTGAT GATGTTGAAG 2280 CCCGTATCAA CTTCGGTATT GAAAAGGCTA AGGAATTCGG TATCTTGAAG AAGGGTGACA 2340 CTTACGTTTC CATCCAAGGT TTCAAGGCCG GTGCTGGTCA CTCCAACACT TTGCAAGTCT 2400 CTACCGTTTA AAAAAAGAAT CATGATTGAA TGAAGATATT ATTTTTTTGA ATTATATTTT 2460 TTAAATTTTA TATAAAGACA TGGTTTTTCT TTTCAACTCA AATAAAGATT TATAAGTTAC 2520 TTAAATAACA TACATTTTAT AAGGTATTCT ATAAAAAGAT AACTTATGTT ATTGTTAACC 2580 TTTTTGTCTC CAATTGTCGT CATAACGATG AGGTGTTCGA TTTTTGGAAA CGAGATTGAC 2640 ATAGAGTCAA AATTTGCTAA ATTTGATCCC TCCCATCGCA AGATAATCTT CCCTCAAGGT 2700 TATCATGATT ATCAGGATGG CGAAAGGATA CGCTAAAAAT TCAATAAAAA ATTCAATATA 2760 ATTTTCGTTT CCCAAGAACT AACTTGGAAG GTTATACATG GGTACATAAA TGCAGATGCC 2820 AGTGAACTAT GTTCAGCTTC TGGCCTTCGT TTGGTGGTTT AATCTATTTT TTATAAAAAA 2880 TGACG 2885

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明におけるベクターの構築を記載したも
のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 岩渕 万里 秋田県秋田市保戸野中町７−20 (72)発明者 早川 孝彦 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 株式会社植物工学研究所内 (72)発明者 今村 順 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 株式会社植物工学研究所内

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 植物種子の細胞質型ピルビン酸キナーゼ
   の活性値を、該植物種子固有の細胞質型ピルビン酸キナ
   ーゼの活性値よりも実質的に低下させることにより該植
   物の種子貯蔵脂質含量を増加させる方法。
2. 【請求項２】 前記植物が、その胚に貯蔵タンパク質と
   貯蔵脂質を蓄積する植物である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 植物が油料作物である請求項１記載の方
   法。
4. 【請求項４】 植物がナタネ、ダイズ、ヒマワリまたは
   ゴマである請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】 植物がナタネである請求項４記載の方
   法。
6. 【請求項６】 前記細胞質型ピルビン酸キナーゼの活性
   値を、ピルビン酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列また
   はその一部を、種子細胞中の細胞質型ピルビン酸キナー
   ゼの発現を抑制させる形で目的植物に導入することで低
   下させる請求項１記載の方法。
7. 【請求項７】 ピルビン酸キナーゼをコードするＤＮＡ
   配列またはその一部を、種子細胞中の細胞質型ピルビン
   酸キナーゼの発現を抑制させる形で目的植物に導入する
   方法が、アンチセンス法、コサプレッション法、リボザ
   イム法、またはジーンターゲッティング法である請求項
   ６記載の方法。
8. 【請求項８】 ピルビン酸キナーゼをコードするＤＮＡ
   配列が、ナタネ、ヒマ、ジャガイモ、ダイズ並びにイネ
   由来の細胞質型ピルビン酸キナーゼ遺伝子、及びラット
   並びに酵母由来のピルビン酸キナーゼ遺伝子又はその一
   部から選ばれる請求項１記載の方法。
9. 【請求項９】 ピルビン酸キナーゼをコードするＤＮＡ
   配列が、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡまたはその
   一部である請求項８記載の方法。 （ａ）配列表配列番号１及び配列番号１１〜１５のいず
   れかに記載の配列。 （ｂ）（ａ）の配列を有するＤＮＡまたはこれと相同な
   配列を有するＲＮＡと生理的条件下でハイブリダイズし
   得るＤＮＡ。
10. 【請求項１０】 さらにホスホエノールピルビン酸カル
    ボキシラーゼの活性値を、該植物種子固有のホスホエノ
    ールピルビン酸カルボキシラーゼの活性値よりも実質的
    に低下させる請求項１記載の方法。
11. 【請求項１１】 請求項１又は１０に記載の方法により
    得られる種子貯蔵脂質含量が増加した植物。
12. 【請求項１２】 請求項１又は１０に記載の方法により
    得られる種子貯蔵脂質含量が増加した植物の種子。