JP2008245638A

JP2008245638A - ホスホリパーゼｄ欠失性イネ系統

Info

Publication number: JP2008245638A
Application number: JP2008045995A
Authority: JP
Inventors: Yasuhiro Suzuki; 保宏鈴木
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization
Priority date: 2007-03-02
Filing date: 2008-02-27
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2028-02-27
Also published as: JP5190928B2

Abstract

【課題】ホスホリパーゼＤが欠失された新規のイネ系統、ならびにイネ植物においてＰＬＤ欠失性遺伝子の有無を判定する方法を提供すること。
【解決手段】ホスホリパーゼＤ欠失性である、イネ系統（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１２３１）、その後代またはその交雑株が作出される。そのイネ系統が有するホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子が同定され、特定配列に示される塩基配列における２７７９番目の塩基のグアニンからアデニンへの変異、あるいはそれに相当する位置の塩基のナンセンス変異を検出することを含む方法により、ホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子の有無が判定される。
【選択図】なし

Description

本発明は、ホスホリパーゼＤ欠失性イネ系統に関する。

籾から籾殻を取り除いて調製された玄米、および玄米を精米して得られた米ヌカは、米を機能性や健康志向の視点からみた場合、風味成分や栄養成分が豊富に存在する重要な画分であるが、デンプン質やタンパク質よりも酸化しやすい脂質が多く含まれている。脂質が酸化されると、玄米および米ヌカの品質、風味などが低下する。

脂質の酸化分解は、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）が、米ヌカ細胞にあるスフェロゾーム（細胞顆粒）膜のホスホジルコリンを加水分解してスフェロゾーム膜を崩壊させ、スフェロゾーム中に蓄積された中性脂質が細胞質へ漏出することにより生じ、中性脂質がリパーゼにより遊離脂肪酸（ＦＦＡ）に分解される。このＦＦＡは、米の品質、風味などを低下させる原因となる。特に、精白・搗精や粉食のための製粉工程においては、米ヌカ細胞が破壊されるために、脂質の酸化が進行する。そこで、玄米や米ヌカの脂質の酸化を抑える方法が求められていた。

例えば、脂質の酸化を抑えて米の貯蔵性を高める方法や米ヌカを安定化する方法がいくつか開発されており、（ｉ）米を１５℃程度の冷温で保存する方法（多くの貯蔵倉庫で実施されている）、（ｉｉ）高温・高圧の水蒸気でヌカを処理することにより脂質分解酵素を不活性化する方法（特許文献１）、（ｉｉｉ）ＰＬＤ阻害剤の添加により（トウモロコシ等の）老化・劣化を防止する方法（特許文献２）、（ｉｖ）ヌカに水とタンパク質分解酵素を加えて脂質分解酵素を不活性化した後に加熱・脱水処理する方法（特許文献３）、（ｖ）ＦＦＡ量を測定し、高ＦＦＡ量の場合に更に精白する方法（特許文献４）等を挙げることができる。

しかし、これらの方法や従来行われている方法で米、玄米または米ヌカの劣化を抑制するためには、以下のような施設または技術が必要である。例えば、米の劣化（古米化）を抑えるためには、冷却・保冷施設が必要であり、あるいはＦＦＡ量を測定し精白する等の処理を行う必要がある。また、穀粒の劣化を抑制するためにＰＬＤの阻害剤を加えたり、ヌカの劣化を抑えるために加熱やタンパク質分解酵素で脂質分解酵素を不活化する必要がある。これらの処理を行うためには、設備、時間、費用が必要となる。
従って、脂質の酸化分解が抑制されたイネを作出することが望まれている。

例えば特許文献５には、細胞が産生するリン脂質の組成を変化させるため、アンチセンスベクターを用いてＰＬＤ遺伝子の発現を抑制したイネを作出したことが開示されている。このイネでは、公知のＰＬＤ遺伝子をターゲットとして、宿主細胞中のＰＬＤ遺伝子のｍＲＮＡと細胞内でハイブリダイズするｍＲＮＡをコードする遺伝子をベクターに組込んで導入することにより、ＰＬＤ遺伝子の発現が直接抑制されている。

特開平１１−９２０７号公報米国特許第６５１４９１４号明細書特表平８−５０６７２０号公報特開平１０−４８７５号公報再公表ＷＯ９７／３１１０６号公報

本発明の課題は、ＰＬＤが欠失された新規のイネ系統、ならびにイネ植物においてＰＬＤ欠失性遺伝子の有無を判定する方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、イネの種子を突然変異原で処理し、その種子を栽培したところ、ＰＬＤが欠失された個体を見出し、この個体の後代においてＰＬＤ欠失性の遺伝を確認し、ＰＬＤ欠失性系統として確立することに成功し、そのＰＬＤ欠失性イネ系統が有するＰＬＤ欠失性遺伝子を同定し、本発明を完成した。

本発明の特徴は、要約すると以下の通りである。
（１）ＰＬＤ欠失性である、イネ系統（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１２３１）、その後代またはその交雑株。
（２）イネの種子を突然変異原で処理し、その種子を栽培して植物体にし、ＰＬＤ欠失について植物体をスクリーニングすることを含む、ＰＬＤ欠失性イネ系統の作出方法。
（３）（１）に記載のイネ系統とイネ野生型株を交配し、その種子を栽培して植物体にし、ＰＬＤ欠失について植物体をスクリーニングすることを含む、ＰＬＤ欠失性イネ系統の作出方法。

（４）（１）に記載のイネ系統から得た細胞とイネ野生型株から得た細胞を細胞融合し、得られた融合細胞を培養して植物体に再生し、ＰＬＤ欠失について植物体をスクリーニングすることを含む、ＰＬＤ欠失性イネ系統の作出方法。
（５）ホスホリパーゼＤ欠失が、ホスホリパーゼＤ遺伝子のナンセンス変異によるものである、（２）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）（１）に記載のＰＬＤ欠失性である、イネ系統、その後代またはその交雑株の種子。

（７）（６）に記載の種子由来の米粉。
（８）（６）に記載の種子由来の米飯。
（９）調理米飯である、（８）に記載の米飯。
（１０）（６）に記載の種子由来の米油。
（１１）（６）に記載の種子から米ヌカを得、その米ヌカを搾ることを含む、米油の歩留まりを向上させる方法。

（１２）以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかである、ホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子。
（ａ）配列番号４に示される塩基配列において２７７９番目の塩基のグアニンがアデニンに置換された塩基配列からなるＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列において２７７９番目の塩基のグアニンがアデニンに置換され、かつ該塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
（ｃ）配列番号４に示される塩基配列において２７７９番目の塩基のグアニンがアデニンに置換され、かつ該塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列において２７７９番目の塩基のグアニンがアデニンに置換され、かつ該塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
（ｅ）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子

（１３）（１２）に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
（１４）（１２）に記載の遺伝子を植物細胞に導入して相同組換えを行い、植物を育成することを含む、ホスホリパーゼＤ欠失性形質転換植物の作出方法。
（１５）（１３）に記載の組換えベクターを用いてＤＮＡが導入される、（１４）に記載の方法。
（１６）植物がイネ科植物である、（１４）または（１５）に記載の方法。
（１７）配列番号４に示される塩基配列において、２７７９番目の塩基のグアニンからアデニンへの変異を検出することを含む、（１２）に記載のホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子の有無を判定する方法。
（１８）核酸試料について、ＣＡＰＳ法、ドットブロットＳＮＰ法、ＳＳＣＰ法、ｄＣＡＰＳ法のいずれかの方法によって上記変異を検出する、（１７）に記載の方法。
なお、本明細書において、イネ野生型株とは、ＰＬＤを有する全てのイネ品種・系統等を含む。

本発明のイネ系統はＰＬＤ活性が実質的に欠けていること（本明細書中、「ホスホリパーゼＤ欠失性」または「ＰＬＤ欠失性」と称する）から、スフェロゾーム膜の崩壊が少なく、その結果中性脂質の分解が少ない。従って、本発明のイネ系統の種子は、品質を維持したまま長期間の保存が可能であり、ＰＬＤ阻害剤などを添加しなくても穀粒の劣化を抑制でき、米の貯蔵性の向上と省エネルギー化、低コスト化を推進できる。また、その種子から調製された玄米および米ヌカは、脂質の酸化が抑制され、その米ヌカから米油を製造すれば、歩留まりを向上させることができる。更に、脂質酸化や異臭発生が生じにくい米粉、玄米全粒粉、米油などの製造が可能になる。

また、本発明のＰＬＤ欠失性遺伝子を様々な植物に導入することにより、ＰＬＤ欠失性形質転換植物を作出することができる。

さらに、該遺伝子のナンセンス変異に基づいてＰＬＤ欠失性遺伝子の有無を判定することができる。

１．本発明のイネ系統とその作出方法
本発明のイネ系統は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１中央第６）受託番号ＦＥＲＭＰ−２１２３１のイネ系統、該イネ系統の自家受粉による後代、および該イネ系統を親としてイネ野生型株と交配または細胞融合して得られた交雑株であってかつＰＬＤ欠失性であるイネ系統をも含有する。なお、本明細書において、本発明のイネ系統を０３−ｓ１０８ということがある。

受託番号ＦＥＲＭＰ−２１２３１のイネ系統（０３−ｓ１０８）は、例えば人為的突然変異により作出することができる。

突然変異原処理に用いるイネはとくに限定されない。イネについては様々な品種、系統が開発されているのでそれらを用いることができる。

突然変異原処理は、各種変異原性化学物質（アルキル化剤、核酸塩基アナログ、アジ化ナトリウムなど）で処理することにより、また各種放射線（電磁波、紫外線、Ｘ線、γ線、粒子線、中性子線、α線、β線、電子、イオンビームなど）を植物に照射することにより行うことができるが、本発明においてはアジ化ナトリウムを用いることが好ましい。例えばイネの種子を１ｍＭのアジ化ナトリウムの溶液（ｐＨ３）に約３〜６時間浸漬すればよい。

アジ化ナトリウム処理後、種子を播種し、育苗する（Ｍ１個体）。例えば、Ｍ１世代を株別に栽培し、Ｍ２世代（種子）を養成して、Ｍ２世代種子のＰＬＤ欠失について確認し、ＰＬＤ欠失性突然変異体を選抜する。

ＰＬＤ欠失についてのスクリーニングは、例えば、ＳＤＳ電気泳動や抗ＰＬＤ抗体を用いたウエスタンブロッティング法、酵素活性測定などで行うことができる。例えば、イネの種子の胚芽をＳＤＳ、メルカプトエタノール等を加えたタンパク質抽出緩衝液中で摩砕して、湯浴して（１００℃、３分間の処理）抽出タンパク質を変性させる。その後、遠心して、上清をサンプルとする。ポリアクリルアミドゲルにサンプルをアプライし、電気泳動を行う。電気泳動後、分離したタンパク質をメンブレンに転写する。ビオチン、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ、ＲＩ、フルオレセインなどで標識した抗ＰＬＤ抗体をメンブレンに適用し、ＰＬＤを検出する。また、後述のＰＬＤ欠失性遺伝子の有無を判定する方法を用いてもよい。

ＰＬＤが検出されなかったＭ１世代を選抜し、そのＭ２種子を播種して栽培し、自家受粉によりさらにＰＬＤ欠失性の後代を作出することができる。

また、受託番号ＦＥＲＭＰ−２１２３１のイネ系統と、イネ野生型株、例えばコシヒカリ、ササニシキ、ひとめぼれ、あきたこまち、ヒノヒカリ、きらら３９７、日本晴、キヌヒカリ、むつほまれ、カサラス、中国１８３号などを親として交配して栽培するか、あるいは細胞融合して培養して植物体に再生して、ＰＬＤ欠失についてスクリーニングし、好ましいイネ野生型株が有している他の形質（良食味性、多収性、耐病性、耐乾燥性、耐低温性、耐高温性、耐薬剤性など）を併せ持つ後代を作出することもできる。

交配は、本発明のイネ系統の交配前日の穎花を透かしてみて、葯の先端が穎花の１／２以上に達しているものを除雄の対象とし、他の穎花は切り落としておき、除雄対象の穎花の先端をはさみで切除してピンセットで６本の葯を抜き取り、イネ野生型株の穎花から取り出した葯を除雄した穎花に軽くこすりつけて受粉させて行う（剪穎法）。あるいは、交配前に本発明のイネ系統の開花直前の穂を恒温水槽で４３℃に保った温湯に約７分間浸漬し、花粉のみを不稔化し、交配袋をかけ、その日に開花しなかった穎花を切除し、イネ野生型株の穎花から取り出した葯を除雄した穎花に軽くこすりつけて受粉させて行う（温湯除雄法）。

細胞融合は、本発明のイネ系統とイネ野生型株の葯、胚盤などからカルスを誘導し、プロトプラストを作製してポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、エレクトロポレーション法で融合させる。

カルス誘導培地には、ＭｕｒａｓｈｉｇｅＳｋｏｏｇ（ＭＳ）培地またはＬｉｎｓｍａｉｅｒＳｋｏｏｇ（ＬＳ）培地に炭素源としてショ糖などのほか、カルス誘導部位に応じて、例えば２ｍｇ／ｍｌの２，４−Ｄ、またはＮＡＡやＩＡＡなどのオーキシン、カイネチンなどの植物ホルモンを加える。

液体培地に植え継いだ培養細胞を、セルラーゼ、ＭＥＳ、ＣａＣｌ_２、マンニトール等を含む酵素液で処理してプロトプラストを単離し、洗浄する。

ＰＥＧ法による細胞融合は、例えば３０％ＰＥＧ６０００溶液をプロトプラスト懸濁液に加え、混合し、例えば３０℃、１０分間培養後、遠心して上澄みを除去する。１％ＤＭＳＯを含むアルカリ性洗浄液を加え、遠心して上澄みを除去し、更にプロトプラスト培養用培地を加えて洗浄する。

エレクトロポレーション法による細胞融合は、プロトプラスト懸濁液をキュベットに入れ、例えば１０００μＦ、３０ｍｓｅｃ、５００Ｖ／ｃｍの電気条件で電圧をかけて融合する。

融合したプロトプラストは、例えばアガロースビーズ法、ナース培養法などにより培養することができる。具体的には、濃度を調整したプロトプラスト液と、アガロースが入ったプロトプラスト培地（ｐＨ５．８、無機塩類、ＭＳビタミン、ショ糖、２，４−Ｄなどを含む）を混合し、アガロースが固まるまで冷却して、例えば１×１０^６個／ｍｌのプロトプラストが入ったアガロースブロックを作製する。アガロースブロックと、プロトプラスト培地、ナース細胞をシャーレに入れ、培養する。

培養約１０日後、ナース細胞を取り除いてプロトプラスト培地に植え替える。約２週間後、アガロースブロックをプロトプラスト培地と前培養培地（ｐＨ５．８、Ｎ６改変培地に、ＭＳビタミン、プロリン、カザミノ酸、２，４−Ｄ、ショ糖等を加えたもの）を等量混合した培地に植え替え、さらに２週間後、前培養培地に植え替える。

得られたプロトプラスト由来コロニーを再分化培地（無機要素、ビタミン、鉄、ショ糖、ソルビトールなどを含む）に置床して２週間ごとに移植し、芽が３ｃｍ程度になったらホルモンフリー培地（２，４−Ｄ無添加のカルス誘導培地）に移植して栽培し、幼植物を馴化培土に移植して植物体を栽培する。
植物体のＰＬＤ欠失についてのスクリーニングは、上記方法と同様に行う。

２．本発明のイネ系統の種子から調製される製品
本発明のイネ系統の種子から、例えば米粉、米飯、調理米飯、米油などを調製することができる。

米粉は、玄米、精米などを粒のまま粉砕してもよいし、加熱後粉砕して製造してもよく、特に限定されない。

米飯は、玄米、精米などを通常の方法で炊飯すればよく、ムギを含む麦飯、アズキを含む赤飯なども含まれる。

調理米飯は、調理、調味された米飯であり、例えば、魚介類や肉、野菜などの具を調味料と炊き込んだ加薬飯、五目飯などの炊き込みご飯、具や調味料を炊飯後に混ぜた混ぜご飯、ピラフ、チャーハン、すし飯、粥などを挙げることができる。

米油は、一般的に、米ヌカをヘキサンで抽出し、脱漏、脱ガム、脱酸、脱色等の工程を経て、精製して製造される（油脂・油糧ハンドブック、阿部芳郎監修、幸書房、１９８８年版参照）。

３．米油の歩留まりを向上させる方法
本発明のイネ系統の種子から得られた米ヌカを米油の原料とすれば、米油の歩留まりを向上させることができる。

米油の生産において従来のイネの種子を原料に用いた場合、米ヌカに含まれる脂質が分解・酸化されることが大きな原因となって、夏場で約１５〜２０％、冬場で約５〜１０％のロスが生じる。本発明のＰＬＤ欠失性イネ系統の種子を原料に用いれば、脂質の分解・酸化が抑えられるので、ロスが少なくなる。

４．ＰＬＤ欠失性遺伝子
本発明のＰＬＤ欠失性遺伝子は、ホスホリパーゼＤ１（ＰＬＤ１）遺伝子にナンセンス変異が導入された遺伝子である。なお、ＰＬＤ１遺伝子は、International Rice Genome Sequencing Project (Nature436:793-800,2005）により公開されているイネゲノム情報から、座乗する染色体を明らかにすることができ、イネの第１染色体上の２４．０ｃＭの位置にある。さらに具体的には、マーカーＲＧ４７２とＲＧ２４６の間にある（図６参照）。

本発明のＰＬＤ欠失性遺伝子は、以下の（ａ）〜（ｅ）
（ａ）配列番号４に示される塩基配列において２７７９番目の塩基のグアニンがアデニンに置換された塩基配列からなるＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列において２７７９番目の塩基のグアニンがアデニンに置換され、かつ該塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
（ｃ）配列番号４に示される塩基配列において２７７９番目の塩基のグアニンがアデニンに置換され、かつ該塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列において２７７９番目の塩基のグアニンがアデニンに置換され、かつ該塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
（ｅ）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
のいずれかである。

配列番号４に示される塩基配列は、日本晴（イネ品種）のＰＬＤ５遺伝子にＴｏｓ１７が挿入された変異系統であるＮＤ００５２のＰＬＤ１遺伝子のＤＮＡ配列である。ＮＤ００５２は、独立行政法人農業生物資源研究所（〒３０５−８６０２茨城県つくば市観音台２−１−２）から入手可能である。また、配列番号５に該ＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列を示す。

配列番号４に示される塩基配列の２７７７〜２７７９番目の塩基はＴＧＧであり、このコドンはトリプトファンをコードするが、本発明の遺伝子は、該コドン（ＴＧＧ）から終止コドン（ＴＧＡ）へのナンセンス突然変異を有しており、ＰＬＤ欠失性を示す。配列番号４に示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列（配列番号５）において、８０番目のアミノ酸が、上記コドン（ＴＧＧ）によりコードされるトリプトファン（Ｔｒｐ）である。また、本発明のイネ系統０３−ｓ１０８のＰＬＤ１遺伝子を配列番号２２に示す。配列番号２２において、２７７４〜２７７６番目の塩基が、上記終止コドン（ＴＧＡ）に対応する。配列番号２２に示される塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を配列番号２３に示す。

上記「配列番号４に示される塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列」とは、例えば、配列番号４に示される塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が欠失してもよく、配列番号４に示される塩基配列に１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が付加してもよく、あるいは配列番号４に示される塩基配列の１〜１０個、好ましくは１〜５個の塩基が他の塩基に置換してもよいことを意味する。

上記「配列番号４に示される塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列」の「同一性」は、９５％以上、好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上である。

上記「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが実質的に形成されない条件をいう。例えば、同一性が高い核酸、すなわち配列番号４に示す塩基配列と９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡの相補鎖がハイブリダイズし、それより同一性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が４０〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。洗浄液には０．１〜０．２％ＳＤＳを含むことが好ましい。

上記（ｂ）〜（ｄ）の遺伝子の例としては、配列番号４に示される塩基配列における２０４８番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への置換（配列番号５に示されるアミノ酸配列でいえば１７番目のアラニン（Ａｌａ）からトレオニン（Ｔｈｒ）への変異）が挙げられるが、これに限定されない。上記置換は、本発明のイネ系統０３−ｓ１０８の配列番号２２でいえば２０４５番目の塩基（アデニン）であり、上記変異は、配列番号２３でいえば１７番目のトレオニンである。

本発明のＰＬＤ欠失性遺伝子は、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用いて、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリー等由来の核酸を鋳型としたＰＣＲ増幅を行うことにより、核酸断片として得ることができる。また、該遺伝子は、上記ライブラリー等由来の核酸を鋳型とし、該遺伝子の一部であるＤＮＡ断片をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸断片として得ることができる。あるいは該遺伝子は、化学合成法等の当該技術分野で公知の各種の核酸配列合成法によって、核酸断片として合成することもできる。

また、上記塩基の欠失、付加および置換は、遺伝子を当該技術分野で公知の手法によって改変することによって行うことができる。遺伝子に変異を導入するには、例えばKunkel法またはGapped duplex法等により行うことができ、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット（Mutan-K（タカラバイオ株式会社）、LA PCR in vitro mutagenesis kit（タカラバイオ株式会社））等を用いて変異を導入できる。

５．組換えベクター
植物の形質転換に用いる組換えベクターは、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのＰＬＤ欠失性遺伝子を適当なベクターに導入することにより構築することができる。ベクターとしては、特に限定されないが、アグロバクテリウムを介して植物に目的遺伝子を導入することができるｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系のベクター等が好適に用いられる。特にｐＢＩ系のバイナリーベクターまたは中間ベクター系が好適に用いられ、例えばｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩＧ２１１３等が挙げられる。また、他のベクターとして、植物に遺伝子を直接導入することができるｐＵＣ系のベクター、例えばｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９等が挙げられる。さらに、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、インゲンマメモザイクウイルス（ＢＧＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）等の植物ウイルスベクターが挙げられる。

ベクターに目的遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法等が採用される。

バイナリーベクター系プラスミドを用いる場合、上記バイナリーベクターの境界配列（ＬＢ、ＲＢ間）に、目的遺伝子を挿入し、この組換えベクターを大腸菌中で増殖する。次いで、増幅した組換えベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンスＧＶ３１０１、Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５あるいはアグロバクテリウム・リゾゲネスＬＢＡ１３３４等に、エレクトロポレーション法等により導入し、該アグロバクテリウムを用いて植物への目的遺伝子の導入を行う。

また、目的遺伝子が形質転換される植物の核ＤＮＡに相同組換えされるように、目的遺伝子の両側に、核ＤＮＡに存在する遺伝子の配列を組み込んでもよい。さらに、ベクターには目的遺伝子の上流、内部あるいは下流に、プロモーター（カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、イネ由来アクチンプロモーターなど）、エンハンサー（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域など）、ターミネーター（ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子のターミネーター、ＣａＭＶ３５ＳＲＮＡ遺伝子のターミネーターなど）、バイナリーベクター系を使用するための複製開始点（ＴｉまたはＲｉプラスミド由来の複製開始点等）、選択マーカー遺伝子（ハイグロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子など）等を連結することができる。

６．ＰＬＤ欠失性形質転換植物の作出方法
本発明のＰＬＤ欠失性形質転換植物は、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子または上記組換えベクターを対象植物に導入して相同組換えを行うことにより作出することができる。対象植物としては、ＰＬＤ欠失性を付与したい植物であれば特に限定されないが、イネ科植物（イネ、トウモロコシ、小麦、大麦など）が好ましく、他に、マメ科植物（大豆、ピーナッツなど）、アブラナ科植物（ナタネなど）が挙げられる。

形質転換の対象とする植物材料としては、茎、葉、種子、胚、胚珠、子房、茎頂、葯、花粉等の植物器官・植物組織、これらの切片、未分化のカルス、これを酵素処理して細胞壁を除いたプロトプラスト等の植物培養細胞のいずれであってもよい。また、in planta法の場合、吸水種子や植物体全体を利用できる。

遺伝子または組換えベクターの導入は、公知の方法、例えばアグロバクテリウム法、ＰＥＧ−リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、パーティクルガン法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。アグロバクテリウム法では、プロトプラストを用いる場合、組織片を用いる場合、および植物体そのものを用いる場合（in planta法）がある。プロトプラストを用いる場合は、ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドをもつアグロバクテリウム（それぞれAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenes）と共存培養する方法、スフェロプラスト化したアグロバクテリウムと融合する方法（スフェロプラスト法）、組織片を用いる場合は、対象植物の無菌培養葉片（リーフディスク）に感染させる方法やカルス（未分化培養細胞）に感染させる等により行うことができる。また、種子あるいは植物体を用いるin planta法を適用する場合、吸水種子、幼植物（幼苗）、鉢植え植物等へのアグロバクテリウムの直接処理等にて実施可能である。これらの植物形質転換法は、「新版モデル植物の実験プロトコール遺伝学的手法からゲノム解析まで（監修島本功岡田清孝、秀潤社、2001年）」等の記載に従って行うことができる。

遺伝子が植物体に組み込まれたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、後述のＰＬＤ欠失性遺伝子の有無を判定する方法等により行うことができる。あるいは、種々のレポーター遺伝子、例えばベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、Green fluorescent protein（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）等の遺伝子を目的遺伝子の下流域に連結したベクターを作製し、該ベクターを導入したアグロバクテリウムを用いて上記と同様にして植物を形質転換させ、該レポーター遺伝子の発現を測定することによっても確認できる。

ＰＬＤ欠失性遺伝子が組み込まれた形質転換体を選抜して、植物を育成するにあたり、植物培養細胞を形質転換の対象とした場合は、得られた形質転換細胞から形質転換体を再生させる。再生には、既知の組織培養法を用いればよく、当業者であれば容易に行うことができる。植物細胞から植物体への再生については、例えば以下のように行うことができる。

まず、形質転換の対象とする植物材料として植物組織またはプロトプラストを用いた場合、これらを無機要素、ビタミン、炭素源、エネルギー源としての糖類、植物生長調節物質（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノステロイド等の植物ホルモン）等を加えて滅菌したカルス形成用培地中で培養し、不定形に増殖する脱分化したカルスを形成させる（以下「カルス誘導」という）。このように形成されたカルスをオーキシン等の植物生長調節物質を含む新しい培地に移しかえて更に増殖（継代培養）させる。

カルス誘導は寒天等の固形培地で行い、継代培養は例えば液体培養で行うと、それぞれの培養を効率よくかつ大量に行うことができる。次に継代培養により増殖したカルスを適当な条件下で培養することにより器官の再分化を誘導し（以下、「再分化誘導」という）、最終的に完全な植物体を再生させる。再分化誘導は、培地におけるオーキシン等の植物生長調節物質、炭素源等の各種成分の種類や量、光、温度等を適切に設定することにより行うことができる。かかる再分化誘導により、不定胚、不定根、不定芽、不定茎葉等が形成され、さらに完全な植物体へと育成させる。あるいは、完全な植物体になる前の状態（たとえばカプセル化された人工種子、乾燥胚、凍結乾燥細胞および組織等）で貯蔵等を行うこともできる。

本発明のＰＬＤ欠失性形質転換植物は、上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかの遺伝子を導入した植物体全体、植物体の一部（例えば葉、花弁、茎、根、花粉等）、植物培養細胞（例えばカルス、プロトプラスト等）、種子のいずれをも包含するものである。また、該植物体の有性生殖または無性生殖により得られる子孫の植物体、およびその子孫植物体の一部、培養細胞、種子も包含するものとする。本発明の形質転換植物は、形質転換植物から種子、プロトプラスト等の繁殖材料を取得し、それを栽培または培養することによって量産することができる。

７．ＰＬＤ欠失性遺伝子の有無を判定する方法
本発明の上記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのＰＬＤ欠失性遺伝子の有無を判定する方法は、イネ科植物において、配列番号４に示される塩基配列において、２７７９番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異、あるいはそれに相当する位置の塩基のナンセンス変異を検出することを含む。

核酸試料は、公知の核酸の抽出・精製方法（Murray and Thompson(Nucleic Acid Res.8:4321-4325,1980；またはSambrook, J. et al. (1989)：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.)” Cold Spring Harbor Laboratory, NYなど）に従って行うことができる。例えば、葉などを粉砕した試料にＣＴＡＢバッファーを加えインキュベートした後、クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出を行うことにより核酸試料を得る。また、市販の核酸抽出・精製キットを用いてもよい。

配列番号４に示される塩基配列における、２７７９番目の塩基のグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異などのナンセンス変異の検出は、公知のＤＮＡ変異（多型）検出方法を用いればよく、特に限定されないが、例えばＣＡＰＳ法、ドットブロットＳＮＰ法、ＳＳＣＰ法、ｄＣＡＰＳ法などが挙げられる。

ＣＡＰＳ（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法は、ＤＮＡの特定の塩基配列部分をＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法で増幅し、増幅産物を制限酵素で切断し、切断されたＤＮＡ断片の長さの違いにより変異を検出する方法である（Konieczny and Ausubel Plant J.4:403-410,1993参照）。

ドットブロットＳＮＰ法は、ＤＮＡ含有試料を、ナイロン膜等にドットブロットし、検出用プローブ（ＤＮＡ変異に対して特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するプローブであって適当な標識物質で標識されたプローブ）と、競合用プローブ（ＤＮＡ変異に対して野生型である塩基配列に対して特異的にハイブリダイズする塩基配列を有するプローブであって標識されていないプローブ）を、検出用プローブに対して競合用プローブが適当に過剰となる割合（例えば検出用プローブ：競合用プローブ＝１：１〜１０）で適用し、ＤＮＡ変異を検出する方法である（Shirasawa et al. 2006 Theor Appl Genet 113, 147-155参照）。

ＳＳＣＰ（Singl Strand conformation Polymorphism）法は、ＤＮＡの特定の塩基配列部分をＰＣＲ法で増幅し、増幅産物を熱変性（加熱、急冷）し、熱変性させた増幅産物をポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、電気泳動における移動度の差異（塩基配列のわずかな違いから生ずる熱変性後のＤＮＡ高次構造の変化による）によりＤＮＡ変異を検出する方法である（Oritaら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2766-2770参照）。

ｄＣＡＰＳ(derived CAPS)法は、置換された塩基に近接する領域にプライマーを設計し、かつプライマーの一部の塩基にミスマッチを導入することによって増幅産物内に新たな制限酵素部位を作出する方法である（Neffら、Plant J.14:387-392,1998参照）。

本発明のＰＬＤ欠失性遺伝子の有無を判定する方法において、例えばＣＡＰＳ法を用いる場合、配列番号１６および配列番号１７のプライマーを用い、ＰＣＲ法により配列番号４に示される塩基配列の２７７９番目の塩基のＧからＡへの置換部分を含むＤＮＡ断片を増幅し、得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｒＩで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、染色してバンドを検出し、得られたバンドのパターンを比較して、ＰＬＤ欠失性遺伝子の有無を判定する。

配列番号４に示される塩基配列の２７７９番目の塩基のＧからＡへの変異は、制限酵素ＰｓｒＩの認識部位「５’．．．（Ｎ）７ＧＴＡ（Ｎ）６ＧＴＴＣ（Ｎ）１２．．．３’」（配列番号２４）の下線を付されたＧに起きているので、ＰｓｒＩは、配列番号４に示される塩基配列の２７７９番目の塩基のＧ（ＰＬＤ欠失性遺伝子ではＡに置換されている）を含むＤＮＡ断片に用いる制限酵素として好適である。

本発明のＰＬＤ欠失性遺伝子の有無を判定する方法において、例えばドットブロットＳＮＰ法を用いる場合、配列番号１６および配列番号１７のプライマーを用い、ＰＣＲ法により配列番号４に示される塩基配列の２７７９番目の塩基のＧからＡへの置換部分を含むＤＮＡ断片を増幅し、ナイロン膜にドットブロットする。野生型（ＰＬＤ遺伝子）検出用プローブとして配列番号１８のプローブ、競合用プローブとして配列番号１９のプローブを例えば１：５の割合で混合したものを用いてハイブリダイゼーションを行う。また、変異型（ＰＬＤ欠失性遺伝子）検出用プローブとして配列番号２０のプローブ、競合用プローブとして配列番号２１のプローブを例えば１：５の割合で混合したものを用いて、ハイブリダイゼーションを行う。ハイブリダイゼーション後、ドットブロットのシグナルを野生型と変異型とで比較し、ＰＬＤ欠失性遺伝子の有無を判定する。

上記ＣＡＰＳ法によるバンドのパターンやドットブロットＳＮＰ法によるシグナルから、野生型ホモ個体、ヘテロ個体、ＰＬＤ欠失性遺伝子を有するホモ個体を識別できるので、ＰＬＤ欠失性形質転換植物の選抜を簡易に行うことができる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。

[ＰＬＤ欠失性イネ系統の作出]
変異原処理するイネの種子として、イネの変異系統ＮＤ００５２の気乾種子を用いた。

種子から枝梗、不稔粒を除き、変異原液（１ｍＭアジ化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ３．０）を調製して、種子２５ｇに対して２００ｍＬの変異原液を加え、２５℃で６時間振盪した。種子を水道水で３回洗浄した後、種子を催芽させた。

通常行われている、水稲の苗を育苗する方法で育苗し、苗を１株１本で移植して栽培した。登熟したＭ１株を、株単位で収穫した。

１株当たりＭ２種子を２粒ずつ無作為に選び、胚芽を取り出し、ＳＤＳ電気泳動用の抽出緩衝液で胚芽１粒当たり４０μＬの割合で磨砕した。磨砕液をサンプルとしてＳＤＳ電気泳動を行い、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写した。ＰＬＤの検出は、抗ＰＬＤ抗体を用いたウエスタンブロッティングで行った。抗体は、日本たばこ産業株式会社の好意により分譲されたものを使用した。ウエスタンブロッティングでＰＬＤが検出できないＭ１株が見出された場合、更に最大１０粒をめどにＰＬＤの有無を検討した。もし、ＰＬＤが検出できない粒が合計２粒以上あった場合は、Ｍ２種子を播種した。なお、ここでＰＬＤが検出できなかったＭ１株を０３−ｓ１０８と命名した。

０３−ｓ１０８のＭ２株を栽培しＭ３種子を、また０３−ｓ１０８のＭ３種子を播種・栽培しＭ４種子を、それぞれ得た。そして、Ｍ３種子およびＭ４種子中のＰＬＤの有無を、抗ＰＬＤ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより検出した（図１および図２、矢印はＰＬＤを示す）。図１において、レーン１、７は日本晴、レーン２〜６は０３−ｓ１０８のＭ３種子を示す。０３−ｓ１０８のＭ３種子の場合、１０粒解析したが、全ての粒でＰＬＤを検出できなかった。また、図２において、レーン１、４は日本晴、レーン２はＮＤ００５２、レーン３は０３−ｓ１０８のＭ４種子を示し、ここでも０３-ｓ１０８のＭ４種子のＰＬＤを検出できなかった。

以上の結果から、０３−ｓ１０８では玄米中のＰＬＤが欠失しているものと考えられた。０３−ｓ１０８はＰＬＤ欠失形質が後代においても確認され、新規なＰＬＤ欠失性イネ系統（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１２３１）とした。

[ＰＬＤ欠失性イネ系統０３−ｓ１０８のＰＬＤ酵素活性の測定]
ＰＬＤ酵素活性の測定は、Uekiら（Plant Cell Physiol.36:903-914,1995）の方法に従って、ＰＬＤがホスホジルコリンを分解する機構を指標に評価した。

まず、日本晴、ＮＤ００５２および０３−ｓ１０８の完熟種子・玄米より、小型精米機パーレストでヌカ・胚芽画分を採取した。これらは、必要な時まで−３０℃で保存した。

ヌカ・胚芽画分を所定の緩衝液に懸濁後に磨砕して、粗酵素画分と硫安で分画した画分を得た。粗酵素画分、硫安で分画した画分のタンパク質量は、Ｂｉｏ−Ｒａｄのタンパク質定量試薬により行った。

ＮＤ００５２のヌカ・胚芽画分由来の粗酵素画分には日本晴と同程度のＰＬＤ活性が認められたが、０３−ｓ１０８ではほとんどＰＬＤ活性は認められなかった（表１、図３）。

図３のチューブの番号１、５および７は日本晴、番号２、６および８はＮＤ００５２、番号３は０３−ｓ１０８のＭ３種子、番号４は０３−ｓ１０８のＭ４種子を示す。またチューブの番号１〜４のタンパク質濃度は５ｍｇ／ｍｌ、番号５〜６は０．０５ｍｇ／ｍｌ、番号７〜８は０．５ｍｇ／ｍｌである。

以上の結果は、０３−ｓ１０８の玄米では、ＰＬＤがタンパク質としても、また酵素活性としても欠失していることを示しており、０３−ｓ１０８ではＰＬＤが欠失しているものと考えられた。

[ＰＬＤ欠失性の遺伝的な解析]
ＰＬＤ欠失性はどのような遺伝的特性により支配されているかを明らかにするために、０３−ｓ１０８にコシヒカリを交配し、そのＦ２種子中のＰＬＤの有無をウエスタンブロッティングにより解析した。

コシヒカリの種子ではＰＬＤが“有”であるのに対して、０３−ｓ１０８種子では“無”であり、従って表２において、コシヒカリ型は“ＰＬＤ有り”、０３−ｓ１０８型は“ＰＬＤ無し”を示す。Ｆ２種子では、ＰＬＤタンパク質の有：無は９６粒：３２粒であり、３：１に分離した（表２）。従って、ＰＬＤの欠失性は劣性の１遺伝子支配であると考えられた。

Ｆ２種子中のＰＬＤタンパク質の有無を調査したタンパク質抽出液より、ＤＮＡを抽出した。この抽出したＤＮＡを鋳型にして、ＰＬＤ５遺伝子へのＴｏｓ１７の挿入の有無を検定するＰＣＲを行った。

プライマーはＡＧＴＧＡＴＴＴＴＧＣＧＧＴＴＧＴＴＣＣ（配列番号１）、ＣＡＴＴＴＴＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＣＡ（配列番号２）およびＧＡＧＡＧＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＣ（配列番号３）を用い、ＰＣＲ条件は、９８℃（２分）を１サイクル、［９４℃（１分）−６０℃（２分）−７２℃（２分）］を３０サイクル、［７２℃（１０分）−１０℃（この状態で終了休止）］を１サイクル、で行った。ＰＣＲ産物をアガロースで分離し、ＰＣＲ産物の移動度からＴｏｓ１７の挿入の有無を解析した。

コシヒカリの種子ではＴｏｓ１７の挿入が“無”であるのに対して、０３−ｓ１０８種子では“有”であった。Ｆ２種子では、Ｔｏｓ１７挿入の無：ヘテロ：有＝３６粒：５６粒：３３粒（χ^２＝１．４９６、ｐ＝０．４７３）であり、Ｔｏｓ１７の挿入は１遺伝子の劣性遺伝子支配であることが明らかになった（表３、表中のＴｏｓ１７（−）はＴｏｓ１７挿入無し、Ｔｏｓ１７（±）はＴｏｓ１７の挿入に関してヘテロ、Ｔｏｓ１７（＋）はＴｏｓ１７挿入有り、を示す）。

次に、上記ＰＣＲ法により検定されたＰＬＤ５遺伝子へのＴｏｓ１７の挿入の有無と、上記ウエスタンブロッティングにより判定されたＰＬＤの有無について、両者の遺伝的な関係を検討した。これら２形質（Ｔｏｓ１７の有無／ＰＬＤの有無）について無／有：無／無：有／有：有／無が約９：３：３：１に分離したので、Ｔｏｓ１７挿入およびＰＬＤタンパク質無しの特性は２つの独立な劣性遺伝子により支配されると推定された。つまり、Ｔｏｓ１７の挿入とは無関係にＰＬＤタンパク質の有無が決定されると考えられた（表４、表中のＴはＴｏｓ１７挿入無し、ｔはＴｏｓ１７挿入有り、ＰはＰＬＤ有り、ｐはＰＬＤ無し、を示す）。

[スフェロゾームの顕微鏡観察]
各品種系統（日本晴、ＮＤ００５２および０３−ｓ１０８）のヌカ・胚芽画分より、スフェロゾーム画分および粗酵素画分を調製した。調製は、高野克己らの方法（日本食品工業学会誌，36:468-474,1987）に従った。

スフェロゾーム画分に粗酵素画分を加え、３５℃、処理後０時間、６時間、２４時間後に光学顕微鏡を用いて観察した。

図４は、日本晴（パネルＡ、Ｂ、Ｃ）および０３−ｓ１０８（パネルＤ、Ｅ、Ｆ）のヌカ・胚芽画分より調製したスフェロゾームに、日本晴より調製した粗酵素画分をパネルＢ、Ｅのスフェロゾームに添加し、０３−ｓ１０８より調製した粗酵素画分をパネルＣ、Ｆのスフェロゾームに添加し、あるいは緩衝液をパネルＡ、Ｄをスフェロゾームに添加して、６時間、３５℃で振とうしたときのスフェロゾームの構造を示す（光学顕微鏡を用いて２００倍で観察）。

日本晴のスフェロゾームでは、粗酵素画分添加時点（処理後０時間）や緩衝液添加の場合（パネルＡ）でもスフェロゾーム膜の融合が認められた（図４の矢印は融合したスフェロゾームを示す）。緩衝液または粗酵素画分を添加したことによる日本晴スフェロゾーム膜融合の程度は「日本晴粗酵素＞＞０３−ｓ１０８粗酵素＞緩衝液」（パネルＢ＞＞パネルＣ＞パネルＡ）の順であった。

０３−ｓ１０８のスフェロゾームに緩衝液または粗酵素画分を添加した場合も、各添加試料による融合の効果は「日本晴＞＞０３−ｓ１０８＞緩衝液」（パネルＥ＞＞パネルＦ＞パネルＤ）であった。

また、日本晴と０３−ｓ１０８のスフェロゾーム画分に緩衝液を添加した場合、スフェロゾームの融合程度は「日本晴＞＞０３−ｓ１０８」（パネルＡ＞＞パネルＤ）であった。日本晴と０３−ｓ１０８のスフェロゾーム画分に日本晴の粗酵素画分を添加した場合、スフェロゾーム膜の融合程度は「日本晴＞＞０３−ｓ１０８」（パネルＢ＞＞Ｅ）であった。日本晴と０３−ｓ１０８のスフェロゾーム画分に０３−ｓ１０８の粗酵素画分を添加した場合も、スフェロゾーム膜の融合程度は「日本晴＞＞０３−ｓ１０８」（パネルＣ＞＞パネルＦ）であった。なお、処理後２４時間においても、処理後６時間と同様の結果が得られた（データは示さず）。また、日本晴のスフェロゾームとＮＤ００５２のスフェロゾームの膜の融合に関し、顕著な品種・系統間差は認められなかった。

以上の結果は、ＰＬＤを含む日本晴またはＮＤ００５２の粗酵素画分をスフェロゾーム画分へ添加することにより、ＰＬＤがスフェロゾーム膜のホスファチジルコリンを分解し、結果的にスフェロゾーム膜の融合が生じること、日本晴のスフェロゾームにはＰＬＤが吸着している可能性が高いことを示していると考えられた。

［マイクロサテライトマーカーによる連鎖分析］
実施例１でＰＬＤ欠失性系統０３−ｓ１０８を見出すために用いられたポリクローナル抗体は、コシヒカリの種子のＰＬＤ１タンパク質に対する抗体である。そのＰＬＤ１遺伝子はＮＣＢＩのアクセッションナンバーＡＢ００１９２０で登録されているので、ＰＬＤ欠失性の変異がＰＬＤ１遺伝子の変異に由来しているかを明らかにするために、コシヒカリと０３−ｓ１０８を交配し、そのＦ２集団を用いて連鎖分析を行った。

ＰＬＤ遺伝子を有するコシヒカリ型ホモの種子には、ＰＬＤが含まれるため、ウェスタンブロット分析ではシグナルが検出される。それに対し、ＰＬＤ欠失性遺伝子を有する０３−ｓ１０８型ホモの種子には、ＰＬＤは含まれないため、ウェスタンブロット分析ではシグナルが検出されない。また、ＰＬＤ欠失性遺伝子がヘテロの種子には、ＰＬＤが含まれるため、ウェスタンブロット分析ではシグナルが検出されるが、その自殖種子では、コシヒカリ型ホモ、ヘテロ、０３−ｓ１０８型ホモに分離するため、ウェスタンブロット分析でシグナルが検出される種子とシグナルが検出されない種子に分離する。

４４個体のＦ２植物に実ったＦ３種子の胚芽抽出物をそれぞれ複数用いて、ＰＬＤの有無をウェスタンブロット分析で検出することによる後代検定により、Ｆ２植物の表現型を決定した。

連鎖分析には、International Rice Genome Sequencing Project(Nature436:793-800,2005)により公開されているマイクロサテライトマーカーのうち、ＰＬＤ遺伝子の近傍に座乗するＲＭ３４５３（短腕側から２５．０ｃＭに存在）を用いた。４４個体のＦ２植物の葉からMurray and Thompson(Nucleic Acid Res.8:4321-4325,1980)の方法によりＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行った。プライマーは、ＣＴＡＡＡＴＧＡＣＡＡＡＡＧＡＴＡＧＣＡ（配列番号６）およびＡＡＡＴＴＣＴＧＡＣＴＴＧＴＡＴＧＡＣＡ（配列番号７）を用いた。ＰＣＲ条件は９４℃（１分）を１サイクル、［９４℃（３０秒）―５５℃（３０秒）―７２℃（３０秒）］を４０サイクル、［７２℃（１０分）―１０℃（この状態で終了休止）］を１サイクルで行った。ＰＣＲ産物を８％のポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビス＝１９：１）で分離し、ＰＣＲ産物の移動度の差からそれぞれのＤＮＡマーカーの遺伝子型を決定した。

ウェスタンブロット分析の結果、Ｆ２植物では、ＰＬＤ欠失性の表現型がコシヒカリ型ホモ：ヘテロ：０３−ｓ１０８型ホモが１２：１９：１３（χ^２＝０．８６４，Ｐ＝０．６４９）の分離比を示した。

マイクロサテライトマーカーＲＭ３４５３での分析では、コシヒカリ型ホモ：ヘテロ：０３−ｓ１０８型ホモが１３：１７：１４の分離比を示し、ＰＬＤ欠失性との組換え個体は４個体だった（図５の星印）。組換え値は、１×４／（４４×２）＝４．５ｃＭであった。すなわち、ＰＬＤ欠失性遺伝子は、ＲＭ３４５３の近傍に座乗し、遺伝距離はＲＭ３４５３から４．５ｃＭであることが明らかになった（図６）。

［ＰＬＤ欠失性遺伝子の塩基配列の決定］
ＰＬＤ欠失性がＰＬＤ１遺伝子の変異によるものであるかを調査するため、０３−ｓ１０８のＰＬＤ遺伝子のエキソン部分の塩基配列を決定した。ＰＬＤ１遺伝子の長さは約６０００塩基であり、１組のプライマー対を用いたＰＣＲでは全長の増幅が困難であるため、ＰＬＤ遺伝子を４つの領域（ＰＬＤ−１から４）に分けた。０３−ｓ１０８のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、それぞれの増幅断片の塩基配列を決定した。プライマーは、ＰＬＤ−１領域にはＣＧＡＣＧＧＡＣＡＧＡＴＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣ（配列番号８）とＣＡＡＡＣＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＣＡＡＧＣ（配列番号９）、ＰＬＤ−２領域にはＧＴＧＴＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＴＣ（配列番号１０）とＴＧＧＧＴＡＣＴＧＴＣＧＡＧＴＧＴＣＣＴＡＡ（配列番号１１）、ＰＬＤ−３領域にはＡＣＣＴＴＧＧＴＴＡＧＧＧＡＣＴＣＣＡＡＴＣ（配列番号１２）とＧＧＧＡＡＧＣＡＴＧＡＣＴＴＣＡＡＣＴＴＡＧ（配列番号１３）、ＰＬＤ−４領域にはＧＡＡＧＴＣＡＴＧＣＴＴＣＣＣＴＴＴＡＣＴＣ（配列番号１４）とＡＣＧＡＧＣＣＡＴＡＡＡＣＡＡＴＣＡＣＡＣＣ（配列番号１５）を用いた。さらに、ＰＬＤ１遺伝子（約６０００塩基）の全塩基配列を決定するため、プライマーＧＧＴＧＴＧＡＧＧＣＴＴＣＡＡＡＣＣＴＡＧ（配列番号２５）とＡＧＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＧＡＣＧＡＧＴＡ（配列番号２６）、プライマーＣＡＴＴＴＴＣＣＡＴＣＡＣＡＴＣＡＡＣＴ（配列番号２７）とＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧＧＡＧＣＡＧＡ（配列番号２８）、プライマーＣＧＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＣＡＡＡＴＣＣＡ（配列番号２９）とＣＴＣＡＧＧＧＧＴＡＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣ（配列番号３０）、プライマーＣＴＧＴＧＴＧＴＧＡＴＧＴＧＴＧＣＴＴ（配列番号３１）とＴＧＡＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＣＴＧＡＧ（配列番号３２）、プライマーＧＧＧＡＴＧＴＴＣＴＴＴＡＣＡＡＴＴＴＣＧ（配列番号３３）とＡＡＣＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＴＧＣＣＡＴＧＴ（配列番号３４）、プライマーＣＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＴＧ（配列番号３５）とＣＡＡＣＡＡＣＧＣＴＡＡＡＣＡＧＴＡＧ（配列番号３６）とＴＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＡＡＡＴＣＴＧ（配列番号３７）を用いた。ＰＣＲ条件は９４℃（１分）を１サイクル、［９８℃（１０秒）―６８℃（１分）］を３５サイクル、［７２℃（３分）―４℃（この状態で終了休止）］を１サイクルで行った。得られたＤＮＡ断片をQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）で精製した。これを鋳型としてダイターミネーター法による反応を行い、ABI社製のＤＮＡシークエンサーで塩基配列を決定した。得られた０３−ｓ１０８の塩基配列を配列番号２２に示し、該塩基配列によりコードされるアミノ酸を配列番号２３に示す。

０３−ｓ１０８の塩基配列（配列番号２２）を、ＮＤ００５２のＰＬＤ１の塩基配列（配列番号４）と比較した。なお、ＮＤ００５２のＰＬＤ１の塩基配列は日本晴のＰＬＤ１の塩基配列と同じである。

ＮＤ００５２のＰＬＤ１遺伝子の塩基配列（配列番号４）の２７７９番目の塩基のグアニン（Ｇ）が、０３−ｓ１０８ではアデニン（Ａ）に変異していた（配列番号２２の２７７６番目の塩基に該当）。この変異は、第３エキソンのトリプトファンを指定するコドン（ＴＧＧ）を終止コドン（ＴＧＡ）へと変異させるナンセンス変異であった。

０３−ｓ１０８では、このナンセンス変異により正常なＰＬＤタンパク質が合成されなくなり、これがＰＬＤ欠失性を示す原因となると考えられた。

［ＰＬＤ欠失性遺伝子の有無を判定する方法］
実施例６により見出されたグアニン（Ｇ）からアデニン（Ａ）への変異は、制限酵素ＰｓｒＩの認識部位（５’．．．（Ｎ）７ＧＴＡ（Ｎ）６ＧＴＴＣ（Ｎ）１２．．．３’）の１つ目の塩基（下線を付したＧ）に起きている変異であるため、制限酵素ＰｓｒＩを用いたＣＡＰＳ法によって変異の検出を行った。また、任意の一塩基多型を検出できるドットブロットＳＮＰ法によっても変異の検出を行った。

(i)ＣＡＰＳ法
ＰＣＲにより目的の変異を含むＤＮＡ断片を増幅した。プライマーは、ＣＡＣＧＴＧＡＧＣＴＣＡＴＧＴＣＡＡＣＡＧＴＴＴＧ（配列番号１６）とＧＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＣＴＣＣＣＡＡＴＡＴＴＣＧ（配列番号１７）を用いた。ＰＣＲ条件は９４℃（１分）を１サイクル、［９４℃（３０秒）―６０℃（３０秒）―７２℃（３０秒）］を３５サイクル、［７２℃（１０分）―１０℃（この状態で終了休止）］を１サイクルで行った。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｒＩで切断し、６％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ゲルに紫外線を照射してバンドの検出を行った。

ＣＡＰＳ分析の結果、コシヒカリでは切断された１７７、１４５、１１４、８２、３２ｂｐのサイズのＤＮＡ断片を示すバンドが検出されるのに対して、０３−ｓ１０８では切断されない２５９ｂｐのサイズのＤＮＡ断片を示すバンドが検出された（図７）。３２個体からなるＦ２集団を分析した結果、９個体がコシヒカリ型ホモ、１２個体が０３−ｓ１０８型ホモ、１１個体がヘテロであった。また全ての個体においてホスホリパーゼＤ遺伝子の遺伝子型とウェスタンブロット分析による表現型が一致した（図７）。

(ii)ドットブロットＳＮＰ法
ＰＣＲにより目的の変異を含むＤＮＡ断片を増幅した。用いたプライマーとＰＣＲ条件は、ＣＡＰＳ法と同じである。Shirasawaら（Theor. Appl. Genet.113:147-155）の方法に従い、得られたＤＮＡ断片をナイロン膜にドットブロットし、競合プローブを用いたハイブリダイゼーションを行った。コシヒカリ型の対立遺伝子を検出するためのプローブには、５’末端をジゴキシゲニン標識したオリゴヌクレオチド（ＣＣＴＣＧＣＴＧＧＴＡＴＧＡＧＴＣ（配列番号１８））と競合用プローブとして無標識のオリゴヌクレオチド（ＣＣＴＣＧＣＴＧＡＴＡＴＧＡＧＴＣ（配列番号１９））を１対５の濃度比で混合したものを用いた。逆に、０３−ｓ１０８型の対立遺伝子を検出するためのプローブには、５’末端をジゴキシゲニン標識したオリゴヌクレオチド（ＣＣＴＣＧＣＴＧＡＴＡＴＧＡＧＴＣ（配列番号２０））と競合用プローブとして無標識のオリゴヌクレオチド（ＣＣＴＣＧＣＴＧＧＴＡＴＧＡＧＴＣ（配列番号２１））を１対５の濃度比で混合したものを用いた。ハイブリダイゼーションは４２℃で、５×ＳＳＣ、０．１％Ｓａｒｃｏｃｙｌ、０．０２％ＳＤＳ、１％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ試薬（＃１０９６１７６、Roche社）のバッファーで行い、洗浄液には４２℃の０．５×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いた。

ドットブロットＳＮＰ分析の結果、コシヒカリ型の対立遺伝子を検出するプローブでハイブリダイゼーションを行った時には、コシヒカリに特異的なシグナルを得たほか、４４個体のＦ２植物のうち３１個体でシグナルを検出した（図８、Ａ１とＡ５には０３−ｓ１０８、Ｂ１とＢ５にはコシヒカリのＤＮＡをブロットした）。逆に、０３−ｓ１０８型の対立遺伝子を検出するプローブでハイブリダイゼーションを行った時には、０３−ｓ１０８に特異的なシグナルを得たほか、４４個体のＦ２集団のうち３１個体でシグナルを検出した（図８）。ヘテロでは、両方のプローブを用いたときにシグナルを検出した。これらの４４個体のうち、コシヒカリ型の対立遺伝子を検出するプローブを用いた時にのみシグナルを検出した１３個体のＦ２植物はコシヒカリ型ホモ、０３−ｓ１０８型の対立遺伝子を検出するプローブを用いた時にのみシグナルを検出した１３個体のＦ２植物は０３−ｓ１０８型ホモ、および両方のプローブを用いた時にシグナルを検出した１８個体のＦ２植物はヘテロである。また、全ての個体においてＰＬＤ１遺伝子の遺伝子型とウェスタンブロット分析による表現型が一致した（図８）。

(i)および(ii)の結果は、ＰＬＤ欠失性が配列番号４に示されるＰＬＤ１遺伝子のナンセンス変異によるものであることを裏付けた。

本発明のイネ系統のＰＬＤの有無を調べたウエスタンブロッティングを示す。本発明のイネ系統のＰＬＤの有無を調べたウエスタンブロッティングを示す。本発明のイネ系統のＰＬＤ活性を示す。パネルＡ〜Ｃは、日本晴のスフェロゾーム膜の融合を示す。パネルＤ〜Ｆは、０３−ｓ１０８のスフェロゾーム膜の融合を示す。マイクロサテライトマーカーＲＭ３４５３によるＦ２植物の連鎖分析の例を示す。マイクロサテライトマーカーＲＭ３４５３を含む連鎖地図を示す。Ｆ２植物のＣＡＰＳ法による分析の例を示す。Ｆ２植物のドットブロットＳＮＰ法による分析の例を示す。

Claims

ホスホリパーゼＤ欠失性である、イネ系統（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１２３１）、その後代またはその交雑株。
イネの種子を突然変異原で処理し、その種子を栽培して植物体にし、ホスホリパーゼＤ欠失について植物体をスクリーニングすることを含む、ホスホリパーゼＤ欠失性イネ系統の作出方法。
請求項１に記載のイネ系統とイネ野生型株を交配し、その種子を栽培して植物体にし、ホスホリパーゼＤ欠失について植物体をスクリーニングすることを含む、ホスホリパーゼＤ欠失性イネ系統の作出方法。
請求項１に記載のイネ系統から得た細胞とイネ野生型株から得た細胞を細胞融合し、得られた融合細胞を培養して植物体に再生し、ホスホリパーゼＤ欠失について植物体をスクリーニングすることを含む、ホスホリパーゼＤ欠失性イネ系統の作出方法。
ホスホリパーゼＤ欠失が、ホスホリパーゼＤ遺伝子のナンセンス変異によるものである、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
請求項１に記載のホスホリパーゼＤ欠失性である、イネ系統、その後代またはその交雑株の種子。
請求項６に記載の種子由来の米粉。
請求項６に記載の種子由来の米飯。
調理米飯である、請求項８に記載の米飯。
請求項６に記載の種子由来の米油。
請求項６に記載の種子から米ヌカを得、その米ヌカを搾ることを含む、米油の歩留まりを向上させる方法。
以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかである、ホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子。
（ａ）配列番号４に示される塩基配列において２７７９番目の塩基のグアニンがアデニンに置換された塩基配列からなるＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列において２７７９番目の塩基のグアニンがアデニンに置換され、かつ該塩基配列において１もしくは数個の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
（ｃ）配列番号４に示される塩基配列において２７７９番目の塩基のグアニンがアデニンに置換され、かつ該塩基配列に対して９５％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
（ｄ）配列番号４に示される塩基配列において２７７９番目の塩基のグアニンがアデニンに置換され、かつ該塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
（ｅ）配列番号２２に示される塩基配列からなるＤＮＡを含むホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子
請求項１２に記載の遺伝子を含む組換えベクター。
請求項１２に記載の遺伝子を植物細胞に導入して相同組換えを行い、植物を育成することを含む、ホスホリパーゼＤ欠失性形質転換植物の作出方法。
請求項１３に記載の組換えベクターを用いてＤＮＡが導入される、請求項１４に記載の方法。
植物がイネ科植物である、請求項１４または１５に記載の方法。
イネ科植物において、配列番号４に示される塩基配列における２７７９番目の塩基のグアニンからアデニンへの変異、あるいはそれに相当する位置の塩基のナンセンス変異を検出することを含む、請求項１２に記載のホスホリパーゼＤ欠失性遺伝子の有無を判定する方法。
核酸試料について、ＣＡＰＳ法、ドットブロットＳＮＰ法、ＳＳＣＰ法、ｄＣＡＰＳ法のいずれかの方法によって上記変異を検出する、請求項１７に記載の方法。