CN102014903A

CN102014903A - 用于治疗细菌性肠疾病的5-羟基甲基-*唑烷-2-酮衍生物

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Publication number: CN102014903A
Application number: CN2009801143512A
Authority: CN
Inventors: 克里斯蒂安·修布史沃兰; 汉斯·洛克
Original assignee: Actelion Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Actelion Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2008-05-09
Filing date: 2009-05-08
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2029-05-08
Also published as: ES2390405T3; KR101283222B1; RU2010149994A; CA2723232C; CA2723232A1; EP2296651B1; TW200948808A; MY156304A; JP4819980B2; NZ589734A; TWI447115B; EP2296651A1; AU2009245351A1; KR20100137569A; WO2009136379A1; PL2296651T3; BRPI0911991A2; JP2011519914A; SI2296651T1; BRPI0911991B1

Abstract

本发明是关于式I化合物

Description

用于治疗细菌性肠疾病的5-羟基甲基-唑烷-2-酮衍生物

本发明是关于某些5-羟基甲基-唑烷-2-酮衍生物用来预防或治疗藉由难辨梭菌、产气荚膜梭菌或金黄色葡萄球菌引起的肠疾病。

难辨梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的某些菌株产生引起腹泻的毒素。这些产生毒素的菌株的出现通常与使用抗生素有关。

在这些菌株中，难辨梭菌是一种厌氧性可形成芽孢的革兰氏阳性菌，其产生两种肠毒素(A及B)且不仅可引起腹泻，而且会引起更严重肠病症，例如威胁生命的假膜性结肠炎(pseudomembranous colitis)。目前，在工业发达国家，其是医院及长期保健机构中最常见的感染性腹泻源。近年来，其发病率逐渐增加且现在在北美及欧洲是重要的临床问题。风险因素包含预先采用抗生素治疗、年龄及由(例如)细胞毒性化学疗法或器官移植导致的受损免疫系统。

当前用于治疗与难辨梭菌有关的腹泻(CDAD)的药物是万古霉素或甲硝唑(metronidazole)。然而，在两种情况下皆观察到高复发率且无法阻止毒素及芽孢的产生。此外，采用万古霉素或甲硝唑治疗是促进肠内出现耐万古霉素的肠球菌属(Enterococcus spp.)(粪肠球菌(E.fa e calis)及屎肠球菌(E.faecium))及金黄色葡萄球菌菌株(分别是VRE及VRSA)的另一因素(参见W.N.Al-Nassir等人，Antimicrob.AgentsChemother.，印刷前公开，2008年4月28日)。肠球菌是栖居在胃肠道内的正常的革兰氏阳性球菌。然而，其亦可成为重要的病原体，导致心内膜炎及泌尿道、血流、及伤口感染。一旦获得后，VRE可在肠道内寄居长达数年，成为被寄居患者受到潜在感染及将VRE传播至其它患者的源泉。感染难辨梭菌的患者可同时感染VRE，或VRE更常见地在某些高风险患者中引发感染，例如在血液病及肿瘤患者、重症监护患者、长期护理机构中的老年患者及接受实体器官移植的患者中引发感染。

因此，对于CDAD及相关感染的情况，业内需求更好的治疗方法，具体而言藉由确定具有较强的抗难辨梭菌活性的化合物，该化合物可明显降低毒素负荷，减少芽孢的产生并克服VRE，同时对共生肠菌群具有较小影响。

WO 03/032962、W O 2004/096221及WO 2005/058888揭示含有

唑烷部分及1-环丙基-6-氟-4-氧代-1，4-二氢-喹啉-3-甲酸或1-环丙基-6-氟-4-氧代-1，4-二氢-[1，8]萘啶-3-甲酸的抗细菌化合物。

此外，如下文所定义的式I化合物及其抗细菌活性先前已阐述于PCT申请案第PCT/IB2007/054557号中。

下文给出本发明各个实施方式：

i)根据其第一主要实施方式，本发明是关于式I化合物

其中

A是N或CH；且

n是0或1；

或其医药上可接受的盐，其是用来预防或治疗由选自难辨梭菌、产气荚膜梭菌或金黄色葡萄球菌的细菌引起的肠疾病。

以下段落提供本文中所用各个术语的定义，且除非另有明确阐述的定义提供更广或更窄的定义，否则，意欲在整个说明书及权利要求中统一使用。

当使用词语“预防(preventing、prevent或prevention)”提及疾病时意指患者或动物不会发生该疾病，或者尽管此动物或患者受该疾病影响，但该疾病的部分或全部症状减轻或不存在。

当使用用词语“治疗(treating、treat或treatment)”提及疾病时意指治愈患者或动物的该疾病，或者尽管此动物或患者仍受该疾病影响，但该疾病的部分或全部症状减轻或消除。

术语“医药上可接受的盐”是指无毒、无机酸或有机酸及/或碱加成盐。可参照“Salt selection for basic drugs”，Int.J.Pharm.(1986)，33，201-217制备。

术语“卤素”是指氟、氯、溴及碘，且较佳是指氟或氯。

除非涉及温度，否则放在数值“X”前的词语“约”在本申请案中是指自X减去X的10％延伸至X加上X的10％的间隔，且较佳是指自X减去X的5％延伸至X加上X的5％的间隔。在特定温度情况下，放在温度“Y”前的词语“约”在本申请案中是指自温度Y减去10℃延伸至Y加上10℃的间隔，且较佳地是指自Y减去5℃延伸至Y加上5℃的间隔；此外，在本专利申请案中室温意指25℃。

ii)较佳地，如实施方式i)中所定义的式I化合物或其医药上可接受的盐将能够有效预防或治疗与难辨梭菌、产气荚膜梭菌或金黄色葡萄球菌的产肠毒素菌株有关的腹泻疾病，而不增加肠内耐万古霉素的肠球菌(VRE)的浓度。

iii)更佳地，如实施方式i)中所定义的式I化合物或其医药上可接受的盐将能够有效预防或治疗与难辨梭菌、产气荚膜梭菌或金黄色葡萄球菌的产肠毒素菌株有关的腹泻疾病并降低肠内VRE的浓度。

iv)较佳地，如实施方式i)至iii)中任一项所定义的式I化合物或其医药上可接受的盐中的A为CH。

v)亦较佳地，如实施方式i)至iv)中任一项所定义的式I化合物或其医药上可接受的盐中的n为1。

vi)根据实施方式i)至iii)的较佳次级实施方式，式I化合物或其医药上可接受的盐选自：

-1-环丙基-6-氟-7-{4-[2-氟-4-((R)-5-羟基甲基-2-氧代-

唑烷-3-基)-苯氧基甲基]-4-羟基-六氢吡啶-1-基}-4-氧代-1，4-二氢-喹啉-3-甲酸；

-1-环丙基-6-氟-7-{4-[2-氟-4-((R)-5-羟基甲基-2-氧代-

唑烷-3-基)-苯氧基甲基]-4-羟基-六氢吡啶-1-基}-4-氧代-1，4-二氢-[1，8]萘啶-3-甲酸；

-1-环丙基-6-氟-7-{3-[2-氟-4-((R)-5-羟基甲基-2-氧代-

唑烷-3-基)-苯氧基甲基]-3-羟基-吡咯烷-1-基}-4-氧代-1，4-二氢-喹啉-3-甲酸；

及其医药上可接受的盐。

vii)根据实施方式i)至iii)的更佳次级实施方式，式I化合物或其医药上可接受的盐是1-环丙基-6-氟-7-{4-[2-氟-4-((R)-5-羟基甲基-2-氧代-

唑烷-3-基)-苯氧基甲基]-4-羟基-六氢吡啶-1-基}-4-氧代-1，4-二氢-喹啉-3-甲酸或其医药上可接受的盐。

viii)根据实施方式i)至vii)的一个方面，本发明是关于如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或其医药上可接受的盐，其是用来治疗由选自难辨梭菌、产气荚膜梭菌及金黄色葡萄球菌的细菌引起的肠疾病。

ix)根据实施方式viii)的一个较佳方面，本发明是关于如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或其医药上可接受的盐，其是用来治疗由难辨梭菌(尤其由难辨梭菌的产生毒素的菌株)引起的肠疾病。

x)根据实施方式i)至vii)的另一主要方面，本发明是关于如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或其医药上可接受的盐，其是用来预防由选自难辨梭菌、产气荚膜梭菌及金黄色葡萄球菌的细菌引起的肠疾病。

xi)根据实施方式x)的一个较佳方面，本发明是关于如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或其医药上可接受的盐，其是用来预防由难辨梭菌(尤其由难辨梭菌的产生毒素的菌株)引起的肠疾病。

xii)较佳地，其中实施方式i)至xi)中所述的肠疾病意欲预防的患者是用其它抗生素或用抗病毒疗法治疗的患者、具有免疫受损系统的患者(例如细胞毒性化学疗法或器官移植患者)、老年(65岁或更年老)患者、或重症监护或长期护理机构的患者。

xiii)本发明另一主要实施患者是关于预防或治疗患者的由选自难辨梭菌、产气荚膜梭菌及金黄色葡萄球菌的细菌引起的肠疾病的方法，该方法包括给予该患者有效量的如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或此化合物的医药上可接受的盐一段足够长的时间，以预防或治疗肠疾病。

xiv)较佳地，实施方法xiii)的方法将能够有效预防或治疗与难辨梭菌、产气荚膜梭菌或金黄色葡萄球菌的产肠毒素菌株有关的腹泻疾病，而不增加肠内耐万古霉素的肠球菌(VRE)的浓度。

xv)更佳地，实施方式xiii)的方法将能够有效预防或治疗与难辨梭菌、产气荚膜梭菌或金黄色葡萄球菌的产肠毒素菌株有关的腹泻疾病且降低肠内VRE的浓度。

xvi)根据实施方式xiii)至xv)的一个方面，本发明是关于治疗患者由选自难辨梭菌、产气荚膜梭菌及金黄色葡萄球菌的细菌引起的肠疾病的方法，该方法包括给予该患者有效量的如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或此化合物的医药上可接受的盐一段足够长的时间，以治疗肠疾病。

xvii)根据实施方式xvi)的一个较佳方面，本发明是关于治疗患者由难辨梭菌(尤其由难辨梭菌的产生毒素的菌株)引起的肠疾病的方法。

xviii)根据实施方式xiii)至xv)的另一方面，本发明是关于预防患者的由选自难辨梭菌、产气荚膜梭菌及金黄色葡萄球菌的细菌引起的肠疾病的方法，该方法包括给予该患者有效量的如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或此化合物的医药上可接受的盐一段足够长的时间，以预防肠疾病。

xix)根据实施方式xviii)的一个较佳方面，本发明是关于预防患者由难辨梭菌(尤其由难辨梭菌的产生毒素的菌株)引起的肠疾病的方法。

xx)较佳地，经受实施方式xiii)至xix)中一种方法的患者是用其它抗生素或用抗病毒疗法治疗的患者、具有免疫受损系统的患者(例如细胞毒性化学疗法或器官移植患者)、老年(65岁或更年老)患者、或重症监护或长期护理机构的患者。

xxi)本发明另一方面是关于如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或此化合物的医药上可接受的盐在制造意欲预防或治疗由选自难辨梭菌、产气荚膜梭菌及金黄色葡萄球菌的细菌引起的肠疾病的药剂中的用途。

xxii)根据实施方式xxi)的一个方面，本发明是关于如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或此化合物的医药上可接受的盐在制造意欲治疗由选自难辨梭菌、产气荚膜梭菌及金黄色葡萄球菌的细菌引起的肠疾病的药剂中的用途。

xxiii)根据实施方式xxii)的一个较佳方面，意欲治疗的肠疾病是由难辨梭菌(尤其由难辨梭菌的产生毒素的菌株)引起的。

xxiv)根据实施方式xxi)的另一方面，本发明是关于如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或此化合物的医药上可接受的盐在制造意欲预防由选自难辨梭菌、产气荚膜梭菌及金黄色葡萄球菌的细菌引起的肠疾病的药剂中的用途。

xxv)根据实施方式xxiv)的一个较佳方面，意欲预防的肠疾病是由难辨梭菌(尤其由难辨梭菌的产生毒素的菌株)引起的。

xxvi)较佳地，意欲使用根据实施方式xxi)至xxv)中一个实施方式所制造的药剂的患者是用其它抗生素或用抗病毒疗法治疗的患者、具有免疫受损系统的患者(例如细胞毒性化学疗法或器官移植患者)、老年(65岁或更年老)患者、或重症监护或长期护理机构的患者。

xxvii)本发明另一方面是关于预防或治疗动物(例如，狗、猫、猪、牛或马)的由选自难辨梭菌、产气荚膜梭菌及金黄色葡萄球菌的细菌引起的肠疾病的方法，该方法包括给予该动物有效量的如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或此化合物的医药上可接受的盐一段足够长的时间，以治疗肠疾病。

xxviii)根据实施方式xxvii)的一个方面，本发明是关于治疗动物(例如，狗、猫、猪、牛或马)由选自难辨梭菌、产气荚膜梭菌及金黄色葡萄球菌的细菌引起的肠疾病的方法，该方法包括给予该患者有效量的如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或此化合物的医药上可接受的盐一段足够长的时间，以治疗肠疾病。

xxix)根据实施方式xxvii)的另一方面，本发明是关于预防动物(例如，狗、猫、猪、牛或马)的由选自难辨梭菌、产气荚膜梭菌及金黄色葡萄球菌的细菌引起的肠疾病的方法，该方法包括给予该患者有效量的如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或此化合物的医药上可接受的盐一段足够长的时间，以预防肠疾病。

根据本发明实施方式i)至xxix)欲预防或治疗的肠疾病包括明显腹泻、大肠炎及假膜性结肠炎。较佳地，该等肠疾病是由难辨梭菌(且尤其由难辨梭菌的产生毒素的菌株)引起。

根据本发明实施方式i)至xxix)所用式I化合物的最适宜给予路径是经口路径。可每天给予(例如，每天一至四次)或可降低频率(例如，每隔一天一次或每周一次或两次)。

尽管如实施方式i)至vii)中任一项所定义的式I化合物或其医药上可接受的盐的确切给予剂量须由治疗医师或兽医师确定，但预期0.5-50毫克之间的式I化合物或其医药上可接受的盐的量/公斤患者体重/天(例如，1-5毫克之间的式I化合物或其医药上可接受的盐的量/公斤患者体重/天)每天给予一或两次、持续3-15天(例如持续7-14天)是适宜的。

含有如实施方式i)至vii)中一个实施方式中所定义的式I化合物或其医药上可接受的盐的医药组合物的制备可以任何本领域的技术人员所熟悉的方式(参见例如Remington，TheScience and Practice of Pharmacy，第21版(2005)，第5部分“Pharmaceutical Manufacturing”“由Lippincott Williams &Wilkins出版”)藉由将所述式I化合物或其医药上可接受的盐、任选与其它有治疗价值的物质组合连同适宜无毒惰性治疗兼容固体或液体载体材料及若需要常用医药佐剂制成盖仑制剂给予的形式来实现。

式I化合物可根据本发明使用下文所述程序来制造。

式I化合物的制备

缩写：

以下缩写使用于整个说明书及实施例中：

AcOH 乙酸

AD-混合物α 1，4-双(二氢奎宁)酞嗪、K₃Fe(CN)₆、K₂CO₃及

K₂OsO₄.2H₂O

AD-混合物β 1，4-双(二氢奎尼丁)酞嗪、K₃Fe(CN)₆、K₂CO₃

及K₂OsO₄.2H₂O

Alloc 烯丙氧基羰基

aq. 含水

Boc 叔-丁氧基羰基

t-BuOK 叔丁醇钾

Cbz 苄氧基羰基

CDAD 与难辨梭菌有关的腹泻

CFU 菌落形成单位

CLSI 临床实验室标准委员会(Clinical Laboratory

Standards Institute)

DBU 1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯

DCM 二氯甲烷

DIAD 偶氮二甲酸二异丙酯

DIPEA N，N-二异丙基乙胺

DMF N，N-二甲基甲酰胺

DMSO 二甲亚砜

EA 乙酸乙酯

EDC 1-(二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸盐

ESI 电喷雾离子化

醚或Et₂O 乙醚

FC 急骤层析法

h 小时

Hex 正己烷

IC50 使效果降低50％的浓度

LZD-R 耐利奈唑胺(linezolid-resistant)

MeCN 乙腈

MCPBA 间-氯过氧苯甲酸

MIC 抑制细菌生长的最低抑制浓度

MIC90 抑制≥90％菌株生长的最低抑制浓度

MRSA 耐甲氧西林(methicillin)的金黄色葡萄球菌

MeOH 甲醇

MS 质谱

NaOMe 甲醇钠

NMP N-甲基吡咯烷酮

OD595 在595nM下测量的光学密度

org. 有机

Pd/C或Pd(OH)₂/C 炭上钯或炭上二羟基钯

PPh₃ 三苯基膦

rt 室温

sat. 饱和

SiO₂ 硅胶

TBDMSCl 叔丁基二甲基氯硅烷

TEA 三乙胺

TFA 三氟乙酸

THF 四氢呋喃

TMSCl 三甲基氯硅烷

通用制备方法：

式I化合物可根据本发明由以下方法制造：

a)使式II化合物

与式III化合物

其中n及A都如式I中所定义，R¹是(C₁-C₃)烷基磺酰基(例如甲基磺酰基)、三氟甲基磺酰基或芳基磺酰基(例如苯基-或对-甲苯基-磺酰基)，较佳地在介于约10℃与100℃之间(更佳地介于约40℃与80℃之间)在无机碱(例如K₂CO₃)或有机碱(例如TEA)存在下于有机溶剂(例如DMF)中反应；

或

b)使式II化合物与式IV化合物反应

其中n及A都如式I中所定义，如a)部分中所述。该等式IV化合物可藉由在有机碱(例如，TEA)或无机碱(例如，K₂CO₃或碱金属的甲醇盐(例如NaOMe)或碱金属氢化物(例如NaH))存在下于有机溶剂(例如，DMF)中处理式III化合物来获得；

或

c)使式V化合物

其中n如式I中所定义，

与式VI化合物

其中A如式I中所定义，Y是卤素且R²是氢、BF₂或B(OC(＝O)(C₁-C₄)烷基)₂、(C₁-C₅)烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基或叔丁基)、烯丙基、芳基-(C₁-C₅)烷基(例如，苄基、对硝基苄基或对甲氧基苄基)、三-(C₁-C₅)烷基甲硅烷基(例如，三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基)或二芳基-(C₁-C₅)烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二苯基甲硅烷基)，较佳地在介于约10℃与100℃之间、更佳地在介于约40℃与80℃之间在有机碱(例如TEA或DIPEA)存在下于有机溶剂(例如NMP)中反应；

或

d)藉由水解、皂化或氢解(例如，如Protecting groups，Kocienski，P.J.，Thieme(1994)中所论述)使式VII化合物转化为相应的式I化合物

其中R³是(C₁-C₅)烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基或叔丁基)、芳基-(C₁-C₅)烷基(例如，苄基、对硝基苄基或对甲氧基苄基)、烯丙基、三-(C₁-C₅)烷基甲硅烷基(例如，三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基)或二芳基-(C₁-C₅)烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二苯基甲硅烷基)且n及A都如式I中所定义。

关于以上制程，应注意以下方面：

对于变化形式a)，式III化合物亦可由其酯即式III_E化合物替代

其中n、A及R¹都如式III中所定义且R⁴表示烷基、烯丙基或芳基烷基，在该情况下酯去保护步骤应在式III_E化合物与式II化合物的反应之后实施(实施酯去保护步骤的常用方法已在Protecting groups，Kocienski，P.J.，Thieme(1994)中进行论述)；

对于变化形式a)，式II化合物亦可由其甲硅烷基醚即式II_PG化合物替代

其中PG²表示醇官能团的甲硅烷基保护基团，例如三-(C₁-C₅)烷基甲硅烷基(例如，三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基)或二芳基-(C₁-C₅)烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二苯基甲硅烷基)，在该情况下去保护步骤应在式III或III_E化合物与式II_PG化合物的反应之后实施(实施此等反应的常用方法已在Protecting groups，Kocienski，P.J.，Thieme(1994)中进行论述)；

对于变化形式c)，式V化合物亦可由式V_P化合物替代

其中n如式V中所定义且PG²表示醇官能团的保护基团(例如，烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基，例如三甲基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基或叔丁基二苯基甲硅烷基)，在该情况下适当去保护步骤应在式V_P化合物与式VI化合物的反应之后实施(实施此等反应的常用方法已在Protecting groups，Kocienski，P.J.，Thieme(1994)中进行论述)；

对于变化形式c)，当R²不为H时，需要另外酯去保护步骤(实施此等反应的常用方法已在Protecting groups，Kocienski，P.J.，Thieme(1994)中进行论述)，但其中R²是BF₂或B(OC(＝O)(C₁-C₄)烷基)₂及其中在酸化处理期间已发生水解的情况除外。

若需要，如此获得的式I化合物可转化为其盐、且尤其转化为其医药上可接受的盐。

除此以外，当式I化合物以对映异构体的混合物形式获得时，对映异构体可使用为本领域技术人员所已知的方法分离(例如，藉由形成及分离非对映异构体盐或藉由在手性固定相上层析)。当式I化合物以非对映异构体的混合物形式获得时，其可藉由硅胶层析、HPL C及结晶技术的适当组合来分离。

各种合成中间体的制备：

式II化合物的制备

式II化合物可藉由使式VIII化合物

在贵金属催化剂(例如炭上钯或炭上铂)上于溶剂(例如THF、MeOH或EA)中在介于0℃与40℃之间氢化、或藉由在HBr溶于水或AcOH的溶液存在下在介于0℃与80℃之间于溶剂(例如AcOH)中水解来获得。

式III化合物的制备

式III化合物可如下文反应图1中所概述来制备。

反应图1

在反应图1中，R²是H、烷基、烯丙基或芳基烷基，且其它符号与上文相同。

其中R¹是SO₂R⁵(R⁵是烷基、三氟甲基或芳基(如苯基或对甲苯基))的式III化合物可由式III_A化合物(其中R¹是H)藉由在有机碱(例如TEA)存在下于溶剂(例如DCM或THF)中在介于-10℃与50℃之间与相应磺酰氯反应来获得(反应图1)。式III_A化合物可藉由在有机碱(例如TEA或DIPEA)存在下在介于40℃与100℃之间于溶剂(例如THF、DMF或NMP)中使式VI化合物与式IX的六氢吡啶或吡咯烷反应来制备。若R²是苄基，则式III_S的羧酸可根据如Protecting groups，Kocienski，P.J.，Thieme(1994)中所述的标准程序(例如，在Pd/C上氢化)来释放。

式V化合物的制备

式V化合物可如下文反应图2中所概述来制备。

反应图2

式V化合物可藉由使其中PG³表示氨基保护基团(例如烷氧基羰基(例如，Boc)、苄氧基羰基(例如，Cbz)、烯丙氧羰基(Alloc)或苄基)的式XI化合物去保护来获得。实施此仲胺的保护/去保护顺序的常用方法已在Protecting groups，Kocienski，P.J.，Thieme(1994)中进行论述。

式XI化合物可藉由使式II化合物与式X化合物(其中R¹是SO₂R⁵，R⁵是烷基、三氟甲基或芳基(如苯基或对甲苯基))反应、或藉由使式II化合物与衍生自式X化合物的相应环氧化物反应来获得。在溶剂(例如THF、醚或DCM)中于介于-10℃与40℃之间用有机碱(例如TEA、吡啶或DBU)或无机碱(例如K₂CO₃)处理后可自式X化合物(其中R¹是SO₂R⁵)获得该环氧化物。式X化合物(其中R¹是H)可购得(例如，其中PG³＝Boc、n＝1及R¹＝H的化合物X，或衍生自式X化合物(其中PG³＝Boc，n＝0)的环氧化物)或可如稍后所阐释来制备。或者，式XI化合物可藉由在Mitsunobu条件下使式II化合物与式X化合物(其中R¹是H)反应来获得。

式VI化合物的制备

式VI化合物(其中R²是氢、Me或Et)可购得(例如，其中A＝CH、Y＝Cl及R²＝H、Me或Et、或Y＝F及R²＝BF₂的化合物，或其中A＝N、Y＝Cl及R²＝H或Et的化合物)。式VI化合物(其中R²是B(OC(＝O)(C₁-C₄)烷基)₂)可根据WO 88/07998由其中R²是H的式VI化合物获得。式VI的其它化合物可根据标准方法由其中R²是H的式VI化合物获得。

式VII化合物的制备

式VII化合物可藉由在与式V化合物与式VI化合物的反应所述的相同的条件下使式V化合物或者如前文所定义的式V_P化合物与如前文所定义的式VI化合物偶合来获得，只是R²表示(C₁-C₅)烷基(例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基或叔丁基)、芳基-(C₁-C₅)烷基(例如，苄基、对硝基苄基或对甲氧基苄基)、烯丙基、三-(C₁-C₅)烷基甲硅烷基(例如，三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基)或二芳基-(C₁-C₅)烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二苯基甲硅烷基)。若使用式V_P化合物，则可在偶合反应后实施去保护步骤。

式VIII化合物的制备

式VIII化合物可根据WO 2004/096221来获得。

式IX化合物的制备

式IX化合物可藉由式X化合物(R¹＝H)的去保护来获得，例如藉由用TFA处理相应经Boc保护的化合物、或者藉由在Pd/C上氢化相应经Cbz保护的化合物。

式X化合物的制备

式X化合物可如下文反应图3中所概述由式XII的亚甲基衍生物来制备。

反应图3

式Xb化合物即其中R¹是SO₂R⁵的式X化合物是使用与式III_A化合物转化为式III_S化合物所用相同的方法由其中R¹是H的相应式Xa化合物来制备。式Xa化合物可藉由经四氧化锇催化的顺二羟基化或藉由其不对称形式(使用AD-混合物α或β的厦普勒斯(Sharpless)二羟基化)如J.Am.Chem.Soc.(1988)，110，1968中所述由已知式XII亚甲基衍生物(例如，其中n＝0且PG³＝苄基、Boc或苄氧基羰基的化合物-参见欧洲专利第241206号及欧洲专利第550025号；或其中n＝1且PG³＝苄基、Boc的化合物，这些化合物可购得)来获得。式Xc化合物即衍生自式Xb化合物的环氧化物是藉由用无机碱(例如K₂CO₃或NaH)或有机碱(例如TEA或DBU)使式Xb化合物分子内环闭合来获得、或藉由用过酸(例如MCPBA)使式XII化合物的亚甲基双键环氧化来获得。或者，式Xc化合物亦可藉由在碱金属类氢氧化物(例如氢氧化钾)存在下于极性溶剂(例如MeCN)中在介于20与100℃之间使相应氧代衍生物(当n＝0或1且PG³＝Cbz或Boc时，其可购得)与三甲基碘化亚砜或三甲基碘化锍反应来获得(如J.Am.Chem.Soc.(1965)，87，1353-1364及TetrahedronLett.(1987)，28，1877-1878中所述)。

本发明具体实施方式阐述于以下实施例中，这些实施例用来更详细地阐释本发明而不以任何方式限制其范围。

实施例

所有温度皆以℃来说明。所有非手性相上的分析型及制备型HPLC研究都使用基于RP-C18的柱来实施。分析型HPLC研究是在两个不同仪器上实施，且循环时间分别为约2.5分钟及约3.5分钟。除非另有说明，否则表示MS的值对应于主峰((M+H)⁺，变化量为+/-0.5单位)。在NMR光谱中，偶联常数J以Hz给出。

标准处理程序：

在适当有机溶剂中稀释后(参见相应的实施例文本)，分离有机相并用水及盐水依次洗涤。在可溶于水溶剂(例如，MeOH、THF或DMF)中实施反应的情况下，采用与实施处理所用相同的溶剂回洗合并的水层。合并的有机相经MgSO₄干燥并过滤。在减压下蒸发滤液。

标准层析程序：

将粗材料溶于最少量的洗脱液中(参见相应的实施例文本)并在SiO₂上层析。汇集相关级分并在减压下蒸发。

实施例1：1-环丙基-6-氟-7-{4-[2-氟-4-((R)-5-羟基甲基-2-氧代-5

唑烷-3-基)-苯氧基甲基]-4-羟基-六氢吡啶-1-基}-4-氧代-1，4-二氢-喹啉-3-甲酸：

1.i.(R)-3-(3-氟-4-羟基-苯基)-5-羟基甲基-

唑烷-2-酮：

将(R)-3-(4-苄氧基-3-氟-苯基)-5-羟基甲基-

唑烷-2-酮(6.34克，根据WO 2004/096221来制备)溶于THF/MeOH(1∶1；200毫升)的溶液在Pd/C10％(1克)上氢化过夜。过滤催化剂，在减压下蒸发滤液并使残余物在EA中搅拌。藉由过滤收集结晶，得到3.16克(70％产率)无色固体。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：3.5(m，1H)，3.64(m，1H)，3.74(dd，J＝8.8，6.4，1H)，3.99(t，J＝8.8，1H)，4.64(m，1H)，5.16(t，J＝5.6，1H)，6.93(d d，J＝9.7，8.8，1H)，7.08(d dd，J＝8.8，2.6，1.2，1H)，7.45(dd，J＝13.5，2.6，1H)，9.66(s，1H)。

MS(ESI)：228.1。

1.ii.4-[2-氟-4-((R)-5-羟基甲基-2-氧代-

唑烷-3-基)-苯氧基甲基]-4-羟基-六氢吡啶-1-甲酸苄基酯：

将中间体1.i(1.27克)及1-氧杂-6-氮杂-螺[2.5]辛烷-6-甲酸苄基酯(1.60克；根据美国专利第4244961号来制备)的溶液溶于DMF(15毫升)中，并用Na₂CO₃(1.16克)处理。将混合物在100℃下加热过夜。将处理(DCM)后所获得的残余物在EA中搅拌，且藉由过滤收集固体并用EA及Hex依次洗涤，得到2.52克(94.5％产率)浅褐色固体。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：1.57(m，4H)，3.14(m，2H)，3.54(m，1H)，3.64(m，1H)，3.79(m，5H)，4.03(t，J＝9.1，1H)，4.66(m，1H)，4.78(s，1H)，5.05(s，2H)，5.16(t，J＝5.6，1H)，7.18(m，2H)，7.32(m，5H)，7.55(d，J＝12，1H)。

MS(ESI)：475.0。

1.iii.(R)-3-[3-氟-4-(4-羟基-六氢吡啶-4-基甲氧基)-苯基]-5-羟基甲基-唑烷-2-酮：

将中间体1.ii(2.5克)存于EA/MeOH(1∶1；100毫升)中的悬浮液在Pd/C上氢化48小时。将悬浮液在40℃下加热并过滤催化剂。在减压下蒸发滤液，得到1.61克(89％产率)黄色粉末。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：1.4-1.63(m，4H)，2.67(m，2H)，2.83(m，2H)，3.53(dd，J＝4.0，12.0，1H)；3.66(dd，J＝3.3，12.0，1H)，3.71(s，2H)；3.80(m，1H)，4.05(t，J＝9.0，1H)，4.48(s，1H)，4.68(m，1H)，5.20(s，1H)，7.20(m，2H)，7.57(d，1H)。

MS(ESI)：341.5。

1.iv.1-环丙基-6-氟-7-{4-[2-氟-4-((R)-5-羟基甲基-2-氧代-

将中间体1.iii(200毫克)、7-氯-1-环丙基-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-3-喹啉甲酸硼二乙酸盐复合物(241毫克；根据WO88/07998来制备)及DIPEA(100微升)溶于NMP(2毫升)中的溶液在85℃下搅拌5小时。在减压下蒸发反应混合物并将残余物吸收于存于MeOH(3毫升)中的5M HCl中并实施搅拌。藉由过滤收集所得固体，并用MeOH洗涤，以得到230毫克(67％产率)黄色固体。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：1.66-1.35(m，4H)，1.75(d，J＝12.8，2H)，1.95(m，2H)，3.33(t宽峰，J＝11.0，2H)，3.57(m，3H)，3.67(d d，J＝12.3，3.3，1H)，3.83(m，2H)，3.92(s，2H)，4.06(t，J＝9.0，1H)，4.69(m，1H)，7.24(m，2H)，7.60(m，2H)，7.90(d，J＝13.3，1H)，8.66(s，1H)。

MS(ESI)：585.9。

实施例2：1-环丙基-6-氟-7-{4-[2-氟-4-((R)-5-羟基甲基-2-氧代-唑烷-3-基)-苯氧基甲基]-4-羟基-六氢吡啶-1-基}-4-氧代-1，4-二氢-[1，8]萘啶-3-甲酸：

用TEA(0.32毫升)及TMSCl处理7-氯-1-环丙基-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-1，8-萘啶-3-甲酸(166毫克；市售)及中间体1.iii(200毫克)溶于NMP(5毫升)中的溶液，并在85℃下加热5小时。在减压下蒸发反应混合物并将残余物吸收于存于MeOH(3毫升)中的5M HCl中，并搅拌30分钟。在减压下蒸发溶液并将残余物吸收于EA中。藉由过滤收集所得固体并用EA进行洗涤，得到271毫克(78％产率)黄色固体。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：0.89-1.27(m，4H)；1.78(d，J＝12.8，2H)；1.90-2.04(m，2H)；3.53-3.88(m，6H)；3.88(s，2H)，4.06(t，J＝9.0，1H)，4.42(d宽峰，J＝13.2，2H)，4.44(m，1H)；7.11(m，2H)；7.55(d，J＝14.5，1H)；8.05(d，J＝13.5，1H)；8.60(s，1H)。

MS(ESI)：586.8。

实施例3：1-环丙基-6-氟-7-{(RS)-3-[2-氟-4-((R)-5-羟基甲基-2-氧代-

唑烷-3-基)-苯氧基甲基]-3-羟基-吡咯烷-1-基}-4-氧代-1，4-二氢-喹啉-3-甲酸：

3.i.二烯丙基-氨基甲酸苄基酯：

在0℃经30分钟将苯甲酰氯(15.5毫升)逐滴添加至二烯丙基胺(12.3毫升)及TEA(21毫升)于DCM(100毫升)中的溶液中。反应混合物在室温搅拌16小时。处理(DCM)后所获得的残余物藉由层析(Hex/EA 95∶5)纯化以得到20.71克(88％产率)无色液体。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：3.83(dt，J＝1及J＝6，4H)；5.05-5.18(m，6H)；5.70-5.86(m，2H)；7.27-7.48(m，5H)。

3.ii.2，5-二氢-吡咯-1-甲酸苄基酯：

在室温于氮下将亚苄基-双(三环己基膦)二氯钌(5克)添加至中间体3.i(17.56克)于DCM(1.5升)中的溶液中。反应混合物在40℃搅拌2小时，并在真空下浓缩。残余物藉由FC(Hex/EA90∶10)纯化以得到14.08克(91％产率)黄色液体。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：4.05-4.16(m，4H)；5.08(s，2H)；5.81-5.92(m，2H)；7.27-7.41(m，5H)。

3.iii.(RS)-3-羟基-吡咯烷-1-甲酸苄基酯：

在0℃于氮下将硼烷于THF(9毫升)中的1M溶液添加至中间体3.ii(1.81克)于THF(25毫升)中的溶液中。反应混合物在室温搅拌16小时并冷却至0℃。小心逐滴添加20％NaOH(1.8毫升)，随后添加35％过氧化氢水溶液(1.2毫升)。混合物在0℃搅拌30分钟且在室温搅拌2小时。添加Et₂O及40％亚硫酸氢钠水溶液，并将反应混合物剧烈搅拌15分钟。处理(Et₂O)后所得残余物藉由FC(Hex/EA 5∶5至3∶7)纯化，以得到1.01克(51％产率)无色油。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：1.67-1.82(m，1H)；1.82-1.96(m，1H)；3.16-3.25(m，1H)；3.28-3.44(m，3H)；4.20-4.29(宽峰，1H)；4.92(d，J＝3，1H)；5.06(s，2H)；7.27-7.41(m，5H)。

3.iv.3-氧代-吡咯烷-1-甲酸苄基酯：

将中间体3.iii(1.10克)溶于DCM(8毫升)的溶液冷却至0℃并逐滴添加DIPEA(2.5毫升)，随后添加三氧化硫吡啶复合物(1.79克)溶于DMSO(6.5毫升)的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌1小时，并藉由添加水(6毫升)结束反应。用Et₂O/Hex(1∶1，3x5毫升)萃取含水层，并在真空下浓缩合并的有机层。藉由FC(Hex/EA 5∶5)对处理(Et₂O/Hex 1∶1)后所得残余物实施纯化，以得到1.05克(96％产率)微黄色油。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：2.48-2.61(m，2H)；3.61-3.80(m，4H)；5.09(s，2H)；7.27-7.41(m，5H)。

3.v.3-亚甲基-吡咯烷-1-甲酸苄基酯：

在室温下于氮气下将t-BuOK(617毫克)以一份添加至溴化甲基三苯基鏻(1.98克)存于THF(10毫升)中的白色悬浮液中。将黄色悬浮液在室温下搅拌1小时且随后冷却至-10℃。经10分钟逐滴添加中间体3.iv(1.05克)溶于THF(2毫升)的溶液，并经2小时使反应混合物温热至室温。藉由添加饱和NH₄Cl水溶液(1毫升)结束反应，并用EA进行稀释。藉由层析(Hex/EA 90∶10)对处理(EA)后所得残余物实施纯化，以得到633毫克(64％产率)微黄色液体。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：2.48-2.61(m，2H)；3.36-3.53(m，2H)；3.84-4.01(m，2H)；4.97-5.03(m，2H)；5.08(s，2H)；7.27-7.41(m，5H)。

3.vi.1-氧杂-5-氮杂-螺[2.4]庚烷-5-甲酸苄基酯：

在室温下用MCPBA(20.1克)及NaHCO₃(22.3克)处理中间体3.v(7.21克)溶于DCM(400毫升)的溶液。将反应在室温下搅拌2小时，用DCM(200毫升)稀释并倒入Na₂SO₃(45克)溶于水(400毫升)的溶液中。将混合物搅拌10分钟并分离有机层。藉由FC(Hex/EA 6∶4)对处理(DCM)后所得残余物实施纯化，以得到4.37克(56％产率)黄色油。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：1.70-1.83(m，1H)；2.22-2.37(m，1H)；2.90-2.94(m，1H)；2.95-2.99(m，1H)；3.15(t，J＝11，1H)；3.39-3.77(m，3H)；5.09(s，2H)；7.27-7.41(m，5H)。

3.vii.(RS)-3-[2-氟-4-((R)-5-羟基甲基-2-氧代-

唑烷-3-基)-苯氧基甲基]-3-羟基-吡咯烷-1-甲酸苄基酯：

将K₂CO₃(274毫克)添加至中间体1.i(300毫克)及中间体3.vi(338毫克)存于DMF(3毫升)的悬浮液中。将反应混合物在80℃下搅拌3小时并在真空下除去溶剂。藉由FC(DCM/MeOH95∶5)对处理(DCM)后所得残余物实施纯化，以得到531毫克(87％产率)浅褐色泡沫体。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：1.80-1.92(m，1H)；1.96-2.08(m，1H)；3.32-3.59(m，5H)；3.66(dd d，J＝3，J＝6及J＝13，1H)；3.80(d d，J＝6及J＝9，1H)；3.97-4.09(m，3H)；4.64-4.72(m，1H)；5.07(s，2H)；5.19(t，J＝6，1H)；5.23(s，1H)；7.18-7.23(m，2H)；7.27-7.38(m，5H)；7.57(d d，J＝2及J＝14，1H)。

MS(ESI)：460.9。

3.viii.(R)-3-[3-氟-4-((RS)-3-羟基-吡咯烷-3-基甲氧基)-苯基]-5-羟基甲基-

唑烷-2-酮：

在室温下将中间体3.vii(259毫克)溶于THF/MeOH(1∶1；20毫升)的溶液在10％Pd/C(60毫克)上氢化20小时。将反应混合物在真空下浓缩，吸收于DCM/MeOH 90∶10(20毫升)中并在室温下搅拌30分钟。过滤催化剂并在真空下浓缩滤液，以得到184毫克(100％产率)橙色泡沫体。

MS(ESI)：327.3。

3.ix.1-环丙基-6-氟-7-{(R S)-3-[2-氟-4-((R)-5-羟基甲基-2-氧代-

中间体3.viii(226毫克)及7-氯-1-环丙基-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-3-喹啉甲酸硼二乙酸盐复合物(270毫克；根据WO88/07998来制备)溶于NMP(5毫升)的溶液用DIPEA(120微升)处理并在60℃下搅拌2小时。将反应混合物在真空下浓缩并将残余物吸收于存于MeOH(2毫升)的5M HCl中。将溶液在室温下搅拌1小时，在真空下浓缩并藉由FC(DCM/MeOH/AcOH95∶4∶1至90∶9∶1)对残余物实施纯化。将泡沫体状残余物吸收于MeOH(2毫升)中，搅拌1小时并实施过滤。收集结晶并在真空下干燥以得到23毫克(6％产率)浅褐色固体。

¹H NMR(DMSO_d6；δppm)：1.10-1.34(m，4H)；1.98-2.10(m，1H)；2.14-2.26(m，1H)；3.48-3.70(m，3H)；3.71-3.89(m，5H)；4.05(t，J＝9，1H)；4.09-4.18(m，2H)；4.66-4.74(m，1H)；5.19(t，J＝6，1H)；5.40(s，1H)；7.09(d，J＝8，1H)；7.18-7.31(m，2H)；7.59(d d，J＝2及J＝14，1H)；7.82(d，J＝14，1H)；8.59(s，1H)；15.52(s，1H)。

MS(ESI)：572.3。

实施例4：本发明化合物对难辨梭菌或产气荚膜梭菌的参考菌株的活体外抗菌活性：

4.i.实验方法：

最小抑制浓度(MIC)是藉由培养液微量稀释法(brothmicrodilution method)分析来测定。将补充有最终浓度为0.5毫克/升维生素K₁及5毫克/升氯化血红素的布鲁氏菌属(Brucella)培养液用作测试培养基。简言之，在DMSO(5.12毫克/毫升)中制备化合物的原液，且将5微升一系列于50％DMSO/50％H₂O中的两倍连续稀释液分配至含有45微升补充布鲁氏菌属培养液的96孔微量滴定板中并振荡5分钟。为了制备接种物，将补充有5％已溶羊血、5微克氯化血红素/毫升及1微克维生素K₁/毫升的布鲁氏菌属琼脂上生长的难辨梭菌的24小时菌落悬浮于补充布鲁氏菌属培养液中并调节至符合0.5McFarland标准的密度。使用50微升此悬浮液的50倍稀释液对96-孔板的孔实施接种，产生约10⁴个菌落形成单位(CFU)/孔。最终DMSO浓度为2.5％。最终浓度范围为0.03-16微克/毫升。将这些板在厌氧条件下于37℃下培育48小时。培育后，这些板在板读数器中读数OD₅₉₅(Ultramark，BioradLaboratories)。首先在最低浓度下读取MIC，表明与对照孔相比＞90％的生长受到抑制。亦可借助于读数镜目视检测板，并藉由不存在可见生长确定MIC。

4.ii.结果：

在活体外测试实施例1-3的化合物抑制难辨梭菌或产气荚膜梭菌的三种参考菌株生长的活性。所得结果总结于下文表1中。

表1

实施例1-3的化合物对所测试难辨梭菌及产气荚膜梭菌的菌株表现出潜在的活体外活性。对耐喹诺酮(quinolone)的超强毒性菌株NC13366亦可观察到较强的活性。实施例1及2的化合物具有比实施例3化合物稍强的活性且所有实施例化合物都具有比环丙沙星及利奈唑胺明显强的活性。

实施例5：实施例1化合物对收集的难辨梭菌的临床分离物的活体外抗菌活性：

5.i.实验方法：

使用针对厌氧菌(M11-A6)的CLSI推荐参考琼脂稀释方法进行敏感性测试。补充有5％已溶羊血、5微克氯化血红素/毫升及1微克维生素K₁/毫升的布鲁氏菌属琼脂(brucella agar)为测试培养基。将测试化合物连续稀释并添加至熔融补充琼脂中。在不含药物的板上实施生长对照。测试前，在富含布鲁氏菌属琼脂的板上对所有分离物实施两次传代培养。将细菌群落悬浮于布鲁氏菌属培养液中。使用Vitek比色计进行标标准化以0.5 McFarland标准当量制备每一接种物，即施加Steers replicator后为约10⁴-10⁵CFU/斑点。将这些板在厌氧条件下于37℃下培育48小时。最小抑制浓度(MIC)是与不含药物的对照相比完全抑制可见生长的浓度。制备所有抗生素并与作为对照的万古霉素及甲硝唑一起进行测试。

5.ii结果：

测试实施例1化合物对总共209种难辨梭菌临床分离物的活体外生长的抑制活性。实施例1化合物表现出MIC90(抑制90％或更多菌株生长的最小抑制浓度)为0.25微克/毫升，所得MIC介于0.06-0.5微克/毫升之间。其平均起来比MIC90分别为2、1及8微克/毫升的万古霉素、甲硝唑及利奈唑胺更具活性。

实施例6：本发明化合物对好氧革兰氏阳性细菌的活体外抗菌活性：

6.i.实验方法：

最小抑制浓度(MIC)是藉由培养液微量稀释法分析按照临床实验室标准委员会[CLSI，以前称为NCCLS，1997]的指南来测定。简言之，在DMSO(5.12毫克/毫升)中制备化合物原液，连续稀释于阳离子调节的Mueller-Hinton Broth II(CaMHB)中，并借助于Biomek 2000 pipeting robot(Beckman Coulter)将其分配在微量滴定板中。DMSO的最终浓度为2.5％或更低。对板实施接种以达成通常3-6x10⁵CFU/毫升的浓度。在37℃下培育18-24小时后，这些板在板读数器中读数OD₅₉₅(Ultramark，Biorad Laboratories)。首先在最低浓度下读取MIC，表明与对照孔相比＞90％的生长受到抑制。亦可借助于读数镜目视检查板，且藉由不存在可见生长来确定MIC。

6.ii.结果：

测试实施例1化合物抗革兰氏阳性好氧细菌。所得结果总结于下文表2中。

表2

总而言之，实施例1化合物对金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌MRSA、粪肠球菌及屎肠球菌的菌株具有潜在的活体外活性。其对耐万古霉素、环丙沙星或利奈唑胺的菌株亦具有活性。

实施例7：实施例1化合物对特定厌氧细菌菌株的活体外抗菌活性：

使用在实施例5中所述的实验方法(参见5.i)，活体外测试实施例1化合物(实施例1)抑制某些厌氧细菌生长的能力，这些厌氧细菌已被认知或怀疑在正常肠菌群中具有重要作用且在抗难辨梭菌过度生长的保护中仍保持其重要作用(下文统称为“共生肠细菌”)。作为参考，在同一时间对WO 2005/058888(R1)的实施例5化合物及环丙沙星(CP)进行测试。如此所得的MIC示于下文表3中。

表3

总而言之，与难辨梭菌相比，实施例1化合物对共生肠细菌表现出降低的活性。对于拟杆菌属(Bacteroides spp.)(其是人类保护性肠菌群的重要成员)而言，活性降低30-200倍。此选择性活性为选择性杀死肠内难辨梭菌同时不伤害肠菌群的重要细菌提供可能。

除此以外，当与WO 2005/058888的实施例5化合物比较时，在多数情况下实施例1化合物对所测试拟杆菌属的活性降低2-4倍，对粘液真杆菌A-1259或大芬戈尔德菌A-1254菌株的活性降低4倍，对所测试双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)的活性降低4-8倍，且对嗜酸乳杆菌A-1255及雷特氏乳球菌A-1256菌株的活性降低8倍。

因此，当与WO 2005/058888(R1)的实施例5化合物比较时，实施例1化合物对共生肠细菌的活性明显降低，表明选择性杀死肠内难辨梭菌的优点。

实施例8：实施例1化合物对难辨梭菌毒素产生的影响：

8.i.实验方法：

使高产毒性难辨梭菌菌株NC13366在补充布鲁氏菌属培养液中于37℃下厌氧生长24小时至细胞密度约1x108CFU/毫升。藉由离心洗涤细菌且将其再悬浮于相同体积的补充布鲁氏菌属培养液中，该培养液分别含有1微克/毫升及8微克/毫升的抗生素。对照样不含抗生素。在37℃下进一步厌氧培育培养物。第5天，收集培养物上清液并如下文所述针对毒素A及毒素B进行分析。

毒素A是藉由免疫印迹法使用NuPage Large ProteinAnalysis System(Invitrogen LP0001，根据试剂盒说明书)来检测。使用含有抗CdTA小鼠单克隆抗体(PCG4.1，BiodesignC70517M)的Western Breeze anti mouse immunodetection kit(Invitrogen WB7103)。

难辨梭菌细胞毒性毒素(毒素B)是藉由测试难辨梭菌培养物上清液在CHO细胞内的细胞圆形化活性来半定量检测。将CHO细胞接种至96-孔平底板(1x105个细胞/孔)中并使其附着3小时。将过滤灭菌上清液的适当稀释液添加至细胞中并在37℃下于5％CO2中进一步培育。培育20小时后，使用倒置显微镜测定细胞圆形化。将毒素效价定义为使得＞90％细胞圆形化的上清液的最高连续10倍稀释液。

菌落形成单位(CFU)是藉由将测试样品的适当稀释液铺板于补充布鲁氏菌属琼脂上，并在厌氧条件下于37℃下培育48小时后的菌落计数来测定。

8.ii.结果：

用来分析难辨梭菌NC 13366(高产毒性NAPI/027型菌株，其会在医院中导致高死亡率发病)的静态高密度细胞培养物上清液中毒素A产生的免疫印迹板的略图示于图1中。

使用在段落8.i处所述的实验方法来获得图1中所示的结果。第1天(D1)，用实施例1化合物(实施例1)、万古霉素(V)、甲硝唑(M)以1及8微克/毫升处理培养物或者不加处理(U)；第5天(D5)，对上清液中毒素A的含量进行分析并与D1观察的结果相比较(参见图1)。在产生毒素的难辨梭菌的高密度5天静态培养物中，实施例1化合物以1及8微克/毫升的浓度即以2及16x的MIC完全抑制毒素A产生(参见图1)。而甲硝唑及万古霉素在该条件下未抑制毒素A产生或仅微弱地进行抑制。

培养物上清液的细胞毒性毒素B亦可藉由使用在段落8.i处所述的基于细胞的细胞圆形化分析来进行分析。用实施例1化合物处理的培养物上清液的活性与未经处理对照样相比降低至＞90％。而经万古霉素处理的培养物上清液的活性未降低(在1微克/毫升)或仅降低30％(在8微克/毫升)。

总而言之，实施例1化合物能够有效终止难辨梭菌毒素A及B的合成，甚至在高密度静态培养物中及不杀死的情况下亦如此，但对于万古霉素及甲硝唑、目前用来治疗难辨梭菌感染的较佳药物情况并非如此。

实施例9：实施例1化合物对难辨梭菌芽孢形成的影响：

9.i.实验方法：

使难辨梭菌A-1050(ATCC 43596)在补充布鲁氏菌属培养液中生长至对数生长期，产生符合McFarland 0.5标准的浊度(6-7小时，在37℃下，于厌氧条件下)。在含有1毫升补充布鲁氏菌属培养液(含有不同浓度抗生素)的管中于2倍稀释步骤中以1∶50稀释培养物。使管在厌氧条件下于37℃下进一步培育4天。将MIC定义为完全抑制可见生长(浊度)的浓度。0.5xMIC是容许可见生长的药物的最高浓度。

全部细胞的菌落形成单位(CFU)的评价是藉由将培养物的适当10倍稀释液铺板于含有4％蛋黄悬浮液及1％溶解马血(Lab M)的Brazier′s琼脂上来实施。在厌氧条件下于37℃下培育48小时后，对菌落计数。藉由在室温下用50％乙醇处理1小时选择性杀死营养细胞且随后在如详见上文的Braziers′琼脂上CFU计数来实施芽孢计数。

9.ii.结果：

难辨梭菌是芽孢形成生物体且芽孢可长时间存在于医院环境中。芽孢对普通消毒程序耐性极大。因此，芽孢在难辨梭菌感染的传播及持续中具有重要作用。难辨梭菌的活体外生长培养物用不同的低于MIC浓度的实施例1化合物、万古霉素或甲硝唑处理，且在37℃下厌氧培育4天后研究其对芽孢产生的影响(参见段落9.i)。在表示0.5x MIC的浓度下，用实施例1化合物处理产生低芽孢计数(芽孢数＜总细胞计数的1％)。而未经处理的培养物及用甲硝唑或万古霉素以0.5x MIC的浓度处理的培养物表现出高芽孢形成率(芽孢数＞总细胞计数的90％)。此表明，实施例1化合物在治疗难辨梭菌感染期间具有减少芽孢产生的能力，且比万古霉素或甲硝唑更有效。

实施例10：难辨梭菌仓鼠模型中本发明化合物的活体内活性：

10.i.实验方法：

给予叙利亚金仓鼠(Golden Syrian hamster)单次注射克林霉素磷酸酯(10毫克/公斤，皮下注射)，且1天后藉由强饲法使动物感染10⁵CFU的产生毒素的难辨梭菌菌株10465。结果大部分(约95％)动物爆发性大肠炎且在给予难辨梭菌1-2天后出现。未经治疗的，大肠炎发展迅速且转变为严重大肠炎、盲肠出血性坏死并死亡。作为悬浮液以三个剂量(10毫克/公斤、30毫克/公斤及100毫克/公斤；n＝10/组)经口给予实施例1化合物。使用万古霉素(50毫克/公斤)作为对照。每天给动物治疗一，持续5天，且之后在观察下再维持21天。

每天观察动物三次，确定发病率及存在或不存在腹泻。研究最终终点是存活。藉由单次注射戊巴比妥钠使判断处于垂死状态[长时间体重减轻发展至瘦弱状态，食欲减退24-48小时，长时间昏睡(3天以上)，出现瘫痪、皮肤溃烂或创伤迹象，缩成一团，腹部肿胀]的动物无痛致死。

10.ii结果：

使用段落10.i的方案测试实施例1化合物的治疗用途。所有受感染未经治疗的动物都在感染后2与5天之间死亡，而所有用10、30或100毫克实施例1化合物/公斤治疗的动物在5天治疗阶段期间存活。在最低剂量时，40％的动物在治疗后21天的复发期存活，而在30及100毫克/公斤组中，80及100％的动物存活而不复发。使用50毫克剂量的万古霉素作为对照。该结果表明，实施例1化合物与万古霉素相比具有治疗患有难辨梭菌感染的动物的能力。