ES2390405T3

ES2390405T3 - Derivados de 5-hidroximetil-oxazolidin-2-ona para el tratamiento de enfermedades intestinales bacterianas

Info

Publication number: ES2390405T3
Application number: ES09742552T
Authority: ES
Inventors: Christian Hubschwerlen; Hans Locher
Original assignee: Actelion Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Actelion Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2008-05-09
Filing date: 2009-05-08
Publication date: 2012-11-12
Anticipated expiration: 2029-05-08
Also published as: KR101283222B1; RU2010149994A; CA2723232C; CA2723232A1; EP2296651B1; TW200948808A; MY156304A; JP4819980B2; NZ589734A; TWI447115B; EP2296651A1; AU2009245351A1; KR20100137569A; WO2009136379A1; PL2296651T3; BRPI0911991A2; CN102014903A; JP2011519914A; SI2296651T1; BRPI0911991B1

Abstract

Un compuesto de fórmula I en la que A es N o CH; y n es 0 ó 1; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades intestinales que están causadas por bacterias seleccionadas de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus.

Description

Derivados de 5–hidroximetil–oxazolidin–2–ona para el tratamiento de enfermedades intestinales bacterianas

La presente invención se refuere al uso de ciertos derivados de 5–hidroximetil–oxazolidin–2–ona para la prevención o el tratamiento de enfermedades intestinales que son causadas por Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus.

Ciertas cepas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus producen toxinas que causan diarrea. Frecuentemente, la incidencia de estas cepas productoras de toxinas está relacionada con el uso de antibióticos.

Entre estas cepas, Clostridium difficile, una bacteria anaeróbica grampositiva formadora de esporas que produce dos entero–toxinas (A y B), no sólo causa diarrea sino también afecciones intestinales más serias tal como colitis pseudomembranosa que es una amenaza letal. Actualmente es la fuente más común de diarrea infecciosa en hospitales y en las instalaciones de cuidados médicos de largo plazo en el mundo industrializado. Durante los últimos años, su incidencia a aumentado progresivamente y ahora es un problema clínico significativo en América del Norte y en Europa. Los factores de riesgo incluyen tratamiento previo con antibióticos, edad y un sistema inmune comprometido que resulta por ejemplo de una quimioterapia citotóxica o del transplante de órganos.

El tratamiento actual para diarrea asociada con Clostridium difficile (CDAD) es ya sea vancomicina o metronidazol. Sin embargo, en ambos casos se observan altas tasas de recaída y no se evita la producción de toxinas y de esporas. Más aún, el tratamiento con vancomicina o metronidazol es un factor adicional de promoción de la aparición de cepas resistentes a la vancomicina de Enterococcus spp. (E. faecalis y E. faecium) yde Staphylococcus aureus (VRE y VRSA, respectivamente) en el intestino (véase W.N. Al–Nassir et al., Antimicrob. Agents Chemother., publicado antes de impresión el 28 de abril de 2008). Los Enterococci son cocci Gram positivos que se encuentran de manera natural en el tracto gastrointestinal. Sin embargo, también pueden convertirse en patógenos significativos, causando endocarditis e infecciones del tracto urinario, sistema sanguíneo y de heridas. Una vez adquirida, la colonización intestinal por VRE puede durar varios años, sirviendo como una reserva para una infección potencial del paciente colonizado y para la propagación de VRE a otros pacientes. El VRE puede aparecer como una co–infección en pacientes infectados con C. difficile, o de manera más común causa infección en ciertos pacientes de alto riesgo tales como los pacientes hematológicos y oncológicos, los pacientes en las unidades de cuidado intensivo, los pacientes de edad avanzada y en las instalaciones de cuidados médicos de largo plazo, y en pacientes que han recibido transplantes de órganos sólidos.

Por lo tanto, existe una necesidad de un mejor tratamiento para los casos de CDAD y las infecciones relacionadas, en particular mediante la identificación de compuestos con una fuerte actividad contra C. difficile que reduzca de manera significativa la carga de toxina, la producción de esporas y que supere la VRE y que a la vez tenga un impacto reducido en la flora intestinal comensal.

En los documentos WO 03/032962, WO 2004/096221 y WO 2005/058888 se divulgan compuestos antibacterianos que contienen una fracción oxazolidina y un ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–4–oxo–1,4–dihidro–quinolin–3–carboxílico

o ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–4–oxo–1,4–dihidro–[1,8]naftiridin–3–carboxílico.

Además, los compuestos de fórmula I tal como se lo define anteriormente y su actividad antibacteriana han sido previamente descritos en la publicación PCT N° PCT/IB2007/054557.

A continuación se presentan diversas realizaciones de la invención:

i) De acuerdo con su primera realización principal, la presente invención se refiere a los compuestos de fórmula I

OF

F O N

O

O [CH2]n

ON

A OH N

HO OH

I

en la que

A es N o CH; y

n es 0 ó 1;

o las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, para uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades intestinales que son causadas por bacterias seleccionadas de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus.

Los siguientes párrafos proporcionan definiciones de diversos términos empleados en este texto y están destinadas a ser aplicadas de manera uniforme a través de la memoria descriptiva y reivindicaciones salvo que otra definición expresamente presentada proporcione un significado más amplio o más restrictivo.

El término “previniendo”, “prevenir” o “prevención”, empleado en referencia a una enfermedad significa, ya sea que dicha enfermedad no ocurre en el paciente o animal, o que, a pesar de que el animal o paciente están afectados por la enfermedad, parte o todos los síntomas de la enfermedad se ven, ya sea reducidos, o están ausentes.

El término “tratando”, “tratar”, o “tratamiento” empleado en referencia a una enfermedad significa ya sea que la enfermedad es curada en el paciente o animal, o que, a pesar de que el animal o paciente permanece afectado por la enfermedad, parte o todos los síntomas de la enfermedad se ven, ya sea disminuidos o eliminados.

El término “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a sales de adición de ácidos o báses, no tóxicas, orgánicas o inorgánicas. Se puede hacer referencia a “Salt selection for basic drugs”, Int. J. Pharm. (1986), 33, 201–

217.

El término “halógeno” se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo, y preferentemente a flúor o cloro.

Salvo respecto de las temperaturas, el término “alrededor de” ubicado antes de un valor numérico “X” se refiere en esta solicitud a un intervalo que se extiende desde X menos 10% de X hasta X más 10% de X, y preferentemente a un intervalo que se extiende desde X menos 5% de X hasta X más 5% de X. En el caso particular de las temperaturas, el término “alrededor de” ubicado antes de una temperatura “Y” se refiere en esta solicitud a un intervalo que se extiende desde la temperatura Y menos 10 °C hasta Y más 10 °C, y preferentemente a un intervalo que se extiende desde la temperatura Y menos 5 °C hasta Y más 5 °C; además, la temperatura ambiente significa en la presente solicitud 25 °C.

ii) Preferentemente, el compuesto de fórmula I tal como se lo define en la realización i), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, permitirá la prevención o el tratamiento efectivos de enfermedades de diarrea asociadas con cepas entero–tóxicas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus sin aumentar la concentración de enterococos resistentes a vancomicina (VRE) en el intestino.

iii) Más preferentemente, el compuesto de fórmula I tal como se lo define en la realización i), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, permitirá la prevención o el tratamiento efectivos de enfermedades de diarrea asociadas con cepas entero–tóxicas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus y la reducción de la concentración de VRE en el intestino.

iv) Preferentemente, los compuestos de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a iii), o la sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, serán tales que A es CH.

v) También preferentemente, los compuestos de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a iv), o la sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, serán tales que n es 1.

vi) De acuerdo con sub–realizaciones preferidas de las realizaciones i) a iii), el compuesto de fórmula I o sus sales farmacéuticamente aceptables serán seleccionados de entre:

–: ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{4–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)–fenoximetil]–4–hidroxi– piperidin–1–il}–4–oxo–1,4–dihidro–quinolin–3–carboxílico;

–: ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{4–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)–fenoximetil]–4–hidroxi– piperidin–1–il}–4–oxo–1,4–dihidro–[1,8]naftiridin–3–carboxílico;

–: ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{3–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)–fenoximetil]–3–hidroxi– pirrolidin–1–il}–4–oxo–1,4–dihidro–quinolin–3–carboxílico;

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

vii) De acuerdo con subrealizaciones más preferidas de las realizaciones i) a iii), el compuesto de fórmula I o su sal farmacéuticamente aceptable será ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{4–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo– oxazolidin–3–il)–fenoximetil]–4–hidroxi–piperidin–1–il}–4–oxo–1,4–dihidro–quinolin–3–carboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

viii) De acuerdo con un aspecto de las realizaciones i) a vii), la presente invención se refiere a los compuestos de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o la sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para uso en el tratamiento de enfermedades intestinales que son causadas por bacterias seleccionadas de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus.

ix) De acuerdo con un aspecto preferido de la realización viii), la presente invención se refiere a los compuestos de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o la sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para uso en el tratamiento de enfermedades intestinales que son causadas por Clostridium difficile (de manera destacable por una cepa de Clostridium difficile que produzca una toxina).

x) De acuerdo con otro aspecto principal de las realizaciones i) a vii), la presente invención se refiere a los compuestos de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o la sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para uso en la prevención de enfermedades intestinales que son causadas por bacterias seleccionadas de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus.

xi) De acuerdo con un aspecto preferido de la realización x), la presente invención se refiere a los compuestos de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o la sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para uso en la prevención de enfermedades intestinales que son causadas por Clostridium difficile (de manera destacable por una cepa de Clostridium difficile que produzca una toxina).

xii) Preferentemente, los pacientes en los cuales las enfermedades intestinales mencionadas en las realizaciones i) a xi) están destinadas a ser prevenidas, serán pacientes tratados con otros antibióticos o con terapias antivirales, pacientes con un sistema inmune comprometido tal como con quimioterapia citotóxica o pacientes de transplante de órganos, pacientes de edad avanzada (65 o más años), o pacientes de unidades de cuidado intensivo o de instalaciones de cuidados médicos de largo plazo.

xiii) Aún otra realización principal de esta invención se refiere al uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad intestinal en un paciente, enfermedad que es causada por una bacteria seleccionada de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus, comprendiendo dicho uso la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o de una sal farmacéuticamente aceptable de un tal compuesto, durante un período suficiente para la prevención o el tratamiento de la enfermedad intestinal.

xiv) Preferentemente, el uso de la realización xiii) permitirá la prevención o el tratamiento efectivos de enfermedades de diarrea asociadas con cepas enterotoxigénicas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus sin aumentar la concentración de enterococos resistentes a vancomicina (VRE) en el intestino.

xv) Más preferentemente, el método de la realización xiii) permitirá la prevención o el tratamiento efectivos de enfermedades de diarrea asociadas con cepas enterotoxigénicas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus y la reducción de la concentración de VRE en el intestino.

xvi) De acuerdo con un aspecto de las realizaciones xiii) a xv), la presente invención se refiere a un uso en el tratamiento de una enfermedad intestinal en un paciente, enfermedad que es causada por una bacteria seleccionada de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus, uso que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o de una sal farmacéuticamente aceptable de un tal compuesto, durante un período suficiente para el tratamiento de la enfermedad intestinal.

xvii) De acuerdo con un aspecto preferido de la realización xvi), la presente invención se refiere a un uso en el tratamiento de una enfermedad intestinal en un paciente, enfermedad que es causada por Clostridium difficile (de manera destacable por una cepa de Clostridium difficile que produce una toxina).

xviii) De acuerdo con otro aspecto de las realizaciones xiii) a xv), la presente invención se refiere a un uso en la prevención de una enfermedad intestinal en un paciente, enfermedad que es causada por una bacteria seleccionada de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus, uso que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o de una sal farmacéuticamente aceptable de un tal compuesto, durante un período suficiente para prevenir la enfermedad intestinal.

xix) De acuerdo con un aspecto preferido de la realización xviii), la presente invención se refiere a un uso en la prevención una enfermedad intestinal en un paciente, enfermedad que es causada por Clostridium difficile (de manera destacable por una cepa que de Clostridium difficile que produce una toxina).

xx) Preferentemente, los pacientes sometidos a un uso de una de las realizaciones xiii) a xix) serán pacientes tratados con otros antibióticos o con terapias antivirales, pacientes con un sistema inmune comprometido tales como pacientes de quimioterapia citotóxica o pacientes de transplante de órganos, pacientes de edad avanzada (65 o más años), o pacientes de unidades de cuidado intensivo o de instalaciones de cuidados médicos de largo plazo.

xxi) Aún un aspecto adicional de esta invención se refiere a el uso de un compuesto de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o de una sal farmacéuticamente aceptable de un tal compuesto, para la producción de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de una enfermedad intestinal que es causada por una bacteria seleccionada de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus.

xxii) De acuerdo con un aspecto de la realización xxi), la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o de una sal farmacéuticamente aceptable de un tal compuesto, para la producción de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad intestinal que es causada por una bacteria seleccionada de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus.

xxiii) De acuerdo con un aspecto preferido de la realización xxii), la enfermedad intestinal destinada a ser tratada será causada por Clostridium difficile (de manera destacable por una cepa de Clostridium difficile que produzca una toxina).

xxiv) De acuerdo con otro aspecto de la realización xxi), la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o de una sal farmacéuticamente aceptable de un tal compuesto, para la producción de un medicamento destinado a la prevención de una enfermedad intestinal que es causada por una bacteria seleccionada de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus.

xxv) De acuerdo con un aspecto preferido de la realización xxiv), la enfermedad intestinal destinada a ser prevenida es causada por Clostridium difficile (de manera destacable por una cepa de Clostridium difficile que produzca una toxina).

xxvi) Preferentemente, los pacientes para los cuales el medicamento producido de acuerdo con una de las realizaciones xxi) a xxv) está destinado, serán pacientes tratados con otros antibióticos o con terapias antivirales, pacientes con un sistema inmune comprometido tal como bajo quimioterapia citotóxica o pacientes de transplante de órganos, pacientes de edad avanzada (65 o más años), o pacientes de unidades de cuidado intensivo o de instalaciones de cuidados médicos de largo plazo.

xxvii) Otro aspecto de esta invención se refiere a un paraíso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad intestinal en un animal (por ejemplo, en un perro, gato, cerdo, vaca o caballo), enfermedad causada por una bacteria seleccionada de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus, uso que comprende la administración a dicho animal de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o de una sal farmacéuticamente aceptable de un tal compuesto, durante un período suficiente para el tratamiento de la enfermedad intestinal.

xxviii) De acuerdo con un aspecto de la realización xxvii), la presente invención se refiere a un paraíso en el tratamiento de una enfermedad intestinal en un animal (por ejemplo, en un perro, gato, cerdo, vaca o caballo), enfermedad que es causada por una bacteria seleccionada de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus, uso que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o de una sal farmacéuticamente aceptable de un tal compuesto, durante un período suficiente para el tratamiento de la enfermedad intestinal.

xxix) De acuerdo con otro aspecto de la realización xxvii), la presente invención se refiere a un uso en la prevención de una enfermedad intestinal en un animal (por ejemplo, en un perro, gato, cerdo, vaca o caballo), enfermedad que es causada por una bacteria seleccionada de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus, uso que comprende la administración a dicho paciente de una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o de una sal farmacéuticamente aceptable de un tal compuesto, durante un período suficiente para prevenir la enfermedad intestinal.

Las enfermedades intestinales destinadas a ser prevenidas o tratadas de acuerdo con las realizaciones i) a xxix) de esta invención comprenden, de manera destacable, diarrea, colitis y colitis pseudomembranosa. Preferentemente, dichas enfermedades intestinales serán causadas por Clostridium difficile (y de manera especial por una cepa de Clostridium difficile que produce una toxina).

La vía de administración más adecuada para los compuestos de fórmula I usados de acuerdo con las realizaciones i) a xxix) de la presente invención será la vía oral. La administración puede ser diaria (por ejemplo, una a cuatro veces 5 de manera diaria) o puede ser menos frecuente (por ejemplo, una vez cada dos días o dos veces por semana).

A pesar de que las dosis de administración exactas de un compuesto de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii), o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, deberán ser determinadas por el médico o veterinario tratante, se espera que una cantidad entre 0,5 y 50 mg de un compuesto de fórmula I o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo por kg de peso corporal del paciente por día (por ejemplo una cantidad

10 entre 1 y 5 mg del compuesto de fórmula I o de la sal farmacéuticamente aceptable del mismo por kg de peso corporal del paciente por día) administrada una o dos veces por día durante un período de 3 a 15 días (por ejemplo, por un período de 7 a 14 días) sea apropiada.

La producción de composiciones farmacéuticas que contengan los compuestos de fórmula I tal como se lo define en una de las realizaciones i) a vii) o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos puede llevarse a cabo de una 15 manera que sea familiar para cualquier persona experimentada en la técnica (véase por ejemplo Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición (2005), Parte 5, “Pharmaceutical Manufacturing” [publicado por Lippincott Williams & Wilkins]) llevando el compuesto de fórmula I descrito o sus sales farmacéuticamente aceptables, opcionalmente en combinación con otras substancias de valor terapéutico, a una forma de administración galénica con materiales portadores sólidos o líquidos no tóxicos, inertes adecuados,

20 terapéuticamente compatibles, y, si se desea, con los adyuvantes farmacéuticos habituales.

Los compuestos de fórmula I pueden ser producidos de acuerdo con la presente invención empleando los procedimientos descritos a continuación.

Preparación de los compuestos de fórmula I

Abreviaturas:

25 Las siguientes abreviaturas son empleadas en esta memoria descriptiva y ejemplos: AcOH ácido acético

AD–mix a 1,4–bis(dihidroquinin)ftalazina, K3Fe(CN)6,K2CO3 yK2OsO4.2H2O

AD–mix a 1,4–bis(dihidroquinidin)ftalazina, K3Fe(CN)6, K2CO3 yK2OsO4.2H2O Alloc aliloxicarbonilo

30 aq. acuoso Boc terc–butoxicarbonilo t–BuOK terc–butilato de potasio Cbz benciloxicarbonilo CDAD diarrea asociada a Clostridium difficile

35 CFU unidades formadoras de colonia CLSI Clinical Laboratory Standards Institute DBU 1,8–diazabiciclo[5.4.0]undec–7–eno DCM diclorometano DIAD azodicarboxilato de diisopropilo

40 DIPEA N,N–diisopropiletilamina DMF N,N–dimetilformamida DMSO dimetilsulfóxido AcOEt acetato de etilo EDC clorhidrato de 1–(dimetilaminopropil)–3–etilcarbodiimida ESI Ionización por electropulverización éter o Et2O dietiléter FC cromatografía flash h hora Hex n–hexano CI50 concentración que reduce el efecto en un 50% LZD–R r esistente a linezolida MeCN acetonitrilo MCPBA ácido meta–cloroperbenzóico CIM concentración inhibidora mínima para inhibir el crecimiento bacterial CIM90 concentración inhibidora mínima para inhibir el crecimiento de � 90% de las cepas MRSA Staphylococcus aureus resistente a meticilina MeOH metanol EM Espectroscopía de masas NaOMe metilato de sodio NMP N–metilpirrolidinona DO595 densidad óptica medida a 595 nm org. orgánico Pd/C o Pd(OH)2/C paladio o dihidroxipaladio en carbón PPh3 trifenilfosfina rt temperatura ambiente sat. saturado SiO2 gel de sílice TBDMSCl cloruro de terc–butildimetilsililo TEA trietilamina TFA ácido trifluoroacético THF tetrahidrofurano TMSCl cloruro de trimetilsililo

Métodos generales de preparación:

Los compuestos de fórmula I pueden ser producidos de acuerdo con la presente invención mediante a) la reacción del compuesto de fórmula II

OF

II

con un compuesto de fórmula III

F

O

[CH2]n

HO

O

N

R1 O

A

N OH

5 III en la que n y A son tal como se define en la fórmula I y R1 es (C1–C3)alquilsulfonilo (por ejemplo, metilsulfonilo), trifluorometilsulfonilo o arilsulfonilo (por ejemplo fenil– o p–tolil–sulfonilo) preferentemente entre alrededor de 10 °C y 100 °C (más preferentemente entre alrededor de 40 °C y 80 °C), en presencia de una base inorgánica tal como K2CO3 o de una base orgánica tal como TEA en un disolvente orgánico (por ejemplo DMF); 10 o b) mediante la reacción de un compuesto de fórmula II con un compuesto de fórmula IV F [CH2]n

O O

O A N OH

N

IV

en el que n y A son tal como se define en la fórmula I, tal como se describe en la sección a). Dichos compuestos de

15 fórmula IV pueden obtenerse mediante el tratamiento de compuestos de fórmula III en presencia de una base orgánica (por ejemplo TEA) o de una base inorgánica (por ejemplo K2CO3 o un metilato alcalino tal como NaOMe o un hidruro alcalino tal como NaH) en un disolvente orgánico (por ejemplo DMF);

o

c) mediante la reacción de un compuesto de fórmula V

O F HO [CH2]n

NH

O

N

O

HO

V en la que n es tal como se define en la fórmula I, con un compuesto de fórmula VI

OO F

Y

III

en la que A es tal como se define en la fórmula I, Y es halógeno y R2 es hidrógeno, BF2 o B(OC(=O)(C1–C4)alquil)2, (C1–C5)alquilo (por ejemplo metilo, etilo, n–propilo, iso–propilo o terc–butilo), alilo, aril–(C1–C5)alquilo (por ejemplo bencilo, p–nitrobencilo o p–metoxibencilo), tri–(C1–C5)alquilsililo (por ejemplo trimetilsililo o terc–butildimetilsililo) o 10 diaril–(C1–C5)alquilsililo (por ejemplo terc–butildifenilsililo), preferentemente entre alrededor de 10 °C y 100 °C, más preferentemente entre alrededor de 40 °C y 80 °C en presencia de una base orgánica, tal como TEA o DIPEA, en un

disolvente orgánico, por ejemplo NMP; o d) mediante la conversión de un compuesto de fórmula VII

15 HO

VII

OO

OR3

en la que R3 es (C1–C5)alquilo (por ejemplo metilo, etilo, n–propilo, iso–propilo o terc–butilo), aril–(C1–C5)alquilo (por ejemplo bencilo, p–nitrobencilo o p–metoxibencilo), alilo, tri–(C1–C5)alquilsililo (por ejemplo trimetilsililo o terc– butildimetilsililo) o diaril–(C1–C5)alquilsililo (por ejemplo terc–butildifenilsililo) y n y A son tal como se define en la fórmula I en el compuesto de fórmula I correspondiente mediante hidrólisis, saponificación o hidrógenolisis (por ejemplo tal como se revisa en Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994)).

Respecto del procedimiento anterior, se debe hacer notar lo siguiente:

• a propósito de la variante a), el compuesto de fórmula III también podría ser reemplazado por un éster del mismo, i.e. un compuesto de fórmula IIIE

F [CH2]n

O HO N

O R1 O

A N OR4

IIIE

en la cual n, A y R1 son tal como se define en la fórmula III y R4 representa alquilo, alilo o arilalquilo, caso en el cual una etapa de desprotección de éster seguiría a la reacción del compuesto de fórmula IIIE con el compuesto de fórmula II (los métodos generales para llevar a cabo la desprotección de ésteres han sido recopilados en Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994));

• a propósito de la variante a), el compuesto de fórmula II también podría ser reemplazado por un éter de sililo del mismo, i.e. un compuesto de fórmula IIPG

15 IIPG

en la que PG2 representa un grupo protector sililo para una función alcohol tal como un tri–(C1–C5)alquilsililo (por ejemplo trimetilsililo o terc–butildimetilsililo) o diaril–(C1–C5)alquilsililo (por ejemplo terc–butildifenilsililo), caso en el cual una etapa de desprotección seguiría a la reacción del compuesto de fórmula III o IIIE con el compuesto de fórmula IIPG (los métodos generales para llevar a cabo tales reacciones han sido recopilados en Protecting

20 groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994));

• a propósito de la variante c), el compuesto de fórmula V también podría ser reemplazado por un compuesto de fórmula Vp

O F HO [CH2]n

NH

O N

O PG2 O

VP

en la que n es tal como se define en la fórmula V y PG2 representa un grupo protector de una función alcohol (por ejemplo un grupo alquilsililo o diarilalquilsililo tal como trimetilsililo, terc–butildimetilsililo o terc– butildifenilsililo), caso en el cual la etapa apropiada de desprotección seguiría a la reacción del compuesto de fórmula VP con el compuesto de fórmula VI (los métodos generales para llevar a cabo tales reacciones han sido recopilados en Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994));

• a propósito de la variante c), cuando R2 no es H, se requiere una etapa adicional de desprotección de éster (los métodos generales para llevar a cabo tales reacciones han sido recopilados en Protecting groups, Kocienski,

5 P.J., Thieme (1994)), salvo para los casos en los que R2 es BF2 o B(OC(=O)(C1–C4)alquil)2 en los cuales la hidrólisis ya tiene lugar durante el procesamiento ácido.

Los compuestos de fórmula I así obtenidos pueden, si se desea, ser convertidos en sus sales, y de manera destacable en sus sales farmacéuticamente aceptables.

De manera adicional, cuando los compuestos de fórmula I se obtengan en la forma de mezclas de enantiómeros, los

10 enantiómeros pueden ser separados empleando métodos conocidos por las personas experimentadas en la técnica (por ejemplo mediante la formación y separación de sales diatereoméricas o mediante cromatografía empleando una fase estacionaria quiral). Cuando los compuestos de fórmula I sean obtenidos en la forma de mezclas de diastereómeros se los puede separar mediante una combinación adecuada de técnicas de cromatografía usando gel de sílice, HPLC y cristalización.

15 Preparación de los diversos intermedios de síntesis:

Preparación del compuesto de fórmula II

El compuesto de fórmula II puede ser obtenido mediante la hidrogenación del compuesto de fórmula VIII

VIII

20 sobre un catalizador de metal noble tal como paladio en carbón en un disolvente tal como THF, MeOH oAcOEtentre 0 °C y 40 °C o mediante hidrólisis en presencia de una solución de HBr en agua o AcOH entre 0 °C y 80 °C en un disolvente tal como AcOH.

Preparación de los compuestos de fórmula III

Los compuestos de fórmula III pueden prepararse tal como se resume en el Esquema 1 a continuación. F O F [CH2]n Y

O

O [CH2]nHO

HO NH + A

O HO N

R1ON OR2

A N OR8

IX VI IIIA: R1=H

IIIS: R1=SO2R5

Esquema 1

En el Esquema 1, R2 es H, alquilo, alilo o arilalquilo, y los demás símbolos son tal como se ha definido previamente.

Los compuestos de fórmula III en los cuales R1 es SO2R5, siendo R5 alquilo, trifluorometilo o arilo tal como fenilo o p– tolilo pueden obtenerse (Esquema 1) a partir de los compuestos de fórmula IIIA en los cuales R1 es H mediante la 30 reacción con los cloruros de sulfonilo correspondientes en presencia de una base orgánica tal como TEA en un disolvente tal como DCM o THF entre –10 °C y 50 °C. Los compuestos de fórmula IIIA pueden prepararse mediante la reacción de los compuestos de fórmula VI con las piperidinas o pirrolidinas de formula IX en presencia de una base orgánica tal como TEA o DIPEA entre 40 °C y 100 °C en un disolvente tal como THF, DMF o NMP. Si R2 es

bencilo, el ácido carboxílico de fórmula IIIS puede ser liberado de acuerdo con procedimientos estándar tal como se describe en Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994) (por ejemplo hidrogenación empleando Pd/C).

Preparación de los compuestos de fórmula V

Los compuestos de fórmula V pueden prepararse tal como se resume en el Esquema 2 a continuación.

OF OF

HO [CH2]n

[CH2]n

HO

N PG3

O

N PG3 O

N

OH + R1O

O

HO

IIX XI

O F HO [CH2]n NH

O N

O HO

5 V

Esquema 2

Los compuestos de fórmula V pueden obtenerse mediante la desprotección de los compuestos de fórmula XI en los cuales PG3 representa un grupo amino protector tal como alcoxicarbonilo (por ejemplo Boc), benciloxicarbonilo (por ejemplo Cbz), Aloc o bencilo. Los métodos generales para llevar a cabo tales secuencias de protección/

10 desprotección de aminas secundarias han sido recopilados en Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994).

Los compuestos de fórmula XI pueden obtenerse mediante la reacción de un compuesto de fórmula II con los compuestos de fórmula X en la que R1 es SO2R5, siendo R5 alquilo, trifluorometilo o arilo tal como fenilo o p–tolilo, o mediante la reacción de un compuesto de fórmula II con los epóxidos correspondientes derivados de los compuestos de fórmula X. Dichos epóxidos pueden obtenerse a partir de los compuestos de fórmula X, en la que R1 es SO2R5 15 luego de tratamiento con ya sea una base orgánica tal como TEA, piridina o DBU o con una base inorgánica tal como K2CO3 en un disolvente tal como THF, éter o DCM entre –10 °C y 40 °C. Los compuestos de fórmula X en la que R1 es H están ya sea disponibles en el comercio (por ejemplo compuestos X en los cuales PG3 = Boc, n = 1 y R1 = H, o el epóxido derivado de los compuestos de fórmula X en los cuales PG3 = Boc, n = 0), o pueden prepararse tal como se explica más adelante. De manera alternativa, los compuestos de fórmula XI pueden obtenerse mediante

20 la reacción del compuesto de fórmula II con los compuestos de fórmula X en los cuales R1 es H bajo condiciones de Mitsunobu.

Preparación de los compuestos de fórmula VI

Los compuestos de fórmula VI en la que R2 es hidrógeno, Me o Et están disponibles en el comercialmente (por ejemplo compuestos en los cuales A = CH, Y = Cl y R2 = H, Me o Et, o Y = F y R2= BF2, o compuestos en los cuales

25 A = N, Y = Cl y R2 = H o Et). Los compuestos de fórmula VI en la que R2 es B(OC(=O)(C1–C4)alquil)2 pueden obtenerse a partir de los compuestos de fórmula VI en los cuales R2 es H de acuerdo con WO 88/07998. Los demás compuestos de fórmula formula VI pueden obtenerse de acuerdo con métodos convencionales a partir de los compuestos de fórmula VI en la que R2 es H.

Preparación de los compuestos de fórmula VII

30 Los compuestos de fórmula VII pueden obtenerse mediante el acoplamiento de compuestos de fórmula V o, de manera alternativa, compuestos de fórmula VP tal como se ha definido previamente con compuestos de fórmula VI tal como se ha definido anteriormente salvo que R2 representa (C1–C5)alquilo (por ejemplo metilo, etilo, n–propilo, iso–propilo o terc–butilo), aril–(C1–C5)alquilo (por ejemplo bencilo, p–nitrobencilo o p–metoxibencilo), alilo, tri–(C1– C5)alquilsililo (por ejemplo trimetilsililo o terc–butildimetilsililo) o diaril–(C1–C5)alquilsililo (por ejemplo terc–

35 butildifenilsililo), bajo las mismas condiciones que aquellas descritas para la reacción de los compuestos de fórmula V con los compuestos de fórmula VI. Si se emplean los compuestos de fórmula VP, la etapa de desprotección se puede llevar a cabo después de la reacción de acoplamiento.

Preparación de los compuestos de fórmula VIII

El compuesto de fórmula VIII puede obtenerse de acuerdo con WO 2004/096221.

Preparación de los compuestos de fórmula IX

Los compuestos de fórmula IX pueden obtenerse mediante la desprotección de los compuestos de fórmula X (R1 = H), por ejemplo mediante tratamiento de los compuestos correspondientes Boc protegidos con TFA o mediante hidrogenación de los compuestos correspondientes Cbz protegidos empleando Pd/C.

Preparación de los compuestos de fórmula X

Los compuestos de fórmula X pueden prepararse a partir de derivados metilideno de formula XII tal como se resume en el Esquema 3 a continuación.

O: [CH2]n N PG3 [CH2]n N PG3 R1 HO O [CH2]n N PG3

Xc: XII Xa:R1=H

Xb:R1=SO2R5

Esquema 3

Los compuestos de fórmula Xb, i.e. los compuestos de fórmula X en la que R1 es SO2R5, se preparan a partir de los compuestos correspondientes de fórmula Xa en los cuales R1 es H empleando los mismos métodos empleados para la conversión de los compuestos de formula IIIA en compuestos de fórmula IIIS. Los compuestos de fórmula Xa se obtienen ya sea a partir de los derivados metilideno conocidos de fórmula XII (por ejemplo aquellos en los cuales n= 0 y PG3 = bencilo, Boc o benciloxicarbonilo – véase EP 241206 y EP 550025; o aquellos en los cuales n = 1 y PG3 = bencilo, Boc, que están disponibles en el comercio) ya sea mediante cis–dihidroxilación catalizada con tetróxido de osmio o mediante su versión asimétrica (dihidroxilación de Sharpless empleando AD–mix a o 1)tal como se describe en J. Am. Chem. Soc. (1988), 110, 1968. Los compuestos de fórmula Xc, i.e. el derivado epóxido de los compuestos de fórmula Xb se obtienen ya sea mediante cierre intramolecular del anillo de los compuestos de fórmula Xb con una base inorgánica tal como K2CO3 o NaH o con una base orgánica tal como TEA o DBU, o mediante epoxidación del doble enlace metilideno de los compuestos de fórmula XII con un perácido tal como MCPBA. De manera alternativa, los compuestos de fórmula Xc también pueden obtenerse mediante la reacción de los derivados oxo correspondientes (disponibles en el comercio cuando n = 0 ó 1 y PG3 = Cbz o Boc) con yoduro de trimetilsulfoxonio o yoduro de trimetilsulfonio en presencia de un hidróxido alcalino tal como hidróxido de potasio en un disolvente polar tal como MeCN entre 20 y 100 °C (tal como se describe en J. Am. Chem. Soc. (1965), 87, 1353– 1364 y Tetrahedron Lett. (1987), 28, 1877–1878).

En los siguientes Ejemplos se describen realizaciones particulares de la invención, lque sirven para ilustrar la invención con mayor detalle sin limitar su alcance de ninguna manera.

Ejemplos

Todas las temperaturas se presentan en °C. Todas las investigaciones de HPLC analíticas y preparativas en fases no quirales se llevan a cabo empleando columnas basadas en RP–C18. Las investigaciones de HPLC analítica se llevan a cabo en dos instrumentos diferentes con tiempos de ciclo de ~2,5 min y ~3,5 min respectivamente. Salvo que se indique de otra manera, los valores indicados para las EM corresponden a los picos principales ((M+H)+ con una variación de +/– 0,5 unidades). En los espectros de RMN, las constantes de acoplamiento J se presentan en Hz.

Procedimiento estándar de procesamiento:

Después de dilución en el disolvente orgánico apropiado (véase el texto correspondiente en el Ejemplo), la fase orgánica es separada y secuencialmente lavada con agua y con solución salina. En el caso en que la reacción se lleve a cabo en un disolvente soluble en agua (por ejemplo, MeOH, THF o DMF), las fases acuosas combinadas se vuelven a extraer con el mismo disolvente empleado para realizar el procesamiento. Las fases orgánicas combinadas se secan empleando MgSO4 y se filtran. El filtrado se evapora bajo presión reducida.

Procedimiento estándar de cromatografía:

El material crudo se disuelve en el mínimo de eluyente (véase el texto correspondiente en el Ejemplo) y se somete a cromatografía empleando SiO2. Las fracciones relevantes son retiradas y evaporadas bajo presión reducida.

Ejemplo 1: ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{4–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)– fenoximetil]–4–hidroxi–piperidin–1–il}–4–oxo–1,4–dihidro–quinolin–3–carboxílico:

1.i. (R)–3–(3–fluoro–4–hidroxi–fenil)–5–hidroximetil–oxazolidin–2–ona:

Una solución de (R)–3–(4–benciloxi–3–fluoro–fenil)–5–hidroximetil–oxazolidin–2–ona (6,34 g, preparada de acuerdo con WO 2004/096221) en THF/MeOH (1:1; 200 ml) se hidrogena empleando Pd/C 10% (1 g) durante toda la noche. El catalizador se retira mediante filtración, el filtrado se evapora bajo presión reducida y el residuo se agita en EA. Los cristales son recolectados mediante filtración, obteniéndose 3,16 g (70% de rendimiento) de un sólido incoloro.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 3,5 (m, 1H), 3,64 (m, 1H), 3,74 (dd, J = 8,8, 6,4, 1H), 3,99 (t, J = 8,8, 1H), 4,64 (m, 1H), 5,16 (t, J = 5,6, 1H), 6,93 (dd, J = 9,7, 8,8, 1H), 7,08 (ddd, J = 8,8, 2,6, 1,2, 1H), 7,45 (dd, J = 13,5, 2,6, 1H), 9,66 (s, 1H).

EM (ESI): 228,1.

1.ii. bencil éster de ácido 4–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)–fenoximetil]–4–hidroxi– piperidin–1–carboxílico:

Una solución del intermedio 1.i (1,27 g) y bencil éster de ácido 1–oxa–6–aza–spiro[2.5]octan–6–carboxílico (1,60 g; preparado de acuerdo con US 4.244.961) se disuelve en DMF (15 ml) y se trata con Na2CO3 (1,16 g). La mezcla se calienta a 100 °C durante toda la noche. El residuo obtenido después del procesamiento (DCM) se agita en EA, y el sólido se recoge mediante filtración y secuencialmente se lava con AcOEt y con Hex, obteniéndose 2,52 g (94,5% de rendimiento) de un sólido beige.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 1,57 (m, 4H), 3,14 (m, 2H), 3,54 (m, 1H), 3,64 (m, 1H), 3,79 (m, 5 H), 4,03 (t, J = 9,1, 1 H), 4,66 (m, 1 H), 4,78 (s, 1 H), 5,05 (s, 2 H), 5,16 (t, J = 5,6, 1 H), 7,18 (m, 2 H), 7,32 (m, 5 H), 7,55 (d, J = 12, 1 H).

EM (ESI): 475,0.

1.iii. (R)–3–[3–fluoro–4–(4–hidroxi–piperidin–4–ilmetoxi)–fenil]–5–hidroximetil–oxazolidin–2–ona:

Una suspensión del intermedio 1.ii (2,5 g) en EA/MeOH (1:1; 100 ml) es hidrogena empleando Pd/C durante 48 h. La suspensión se caienta a 40 °C y el catalizador se retira mediante filtración. El filtrado se evapora empleando presión reducida obteniendo 1,61 g (89% de rendimiento) de un polvo amarillo.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 1,4–1,63 (m, 4H), 2,67 (m, 2H), 2,83 (m, 2H), 3,53 (dd, J = 4,0, 12,0, 1H); 3,66 (dd, J = 3,3, 12,0, 1H), 3,71 (s, 2H); 3,80 (m, 1H), 4,05 (t, J = 9,0, 1H), 4,48 (s, 1H), 4,68 (m, 1H), 5,20 (s, 1H), 7,20 (m, 2H), 7,57 (d, 1H).

EM (ESI): 341,5.

1.iv. ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{4–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)–fenoximetil]–4– hidroxi–piperidin–1–il}–4–oxo–1,4–dihidro–quinolin–3–carboxílico:

Una solución del intermedio 1.iii (200 mg), complejo diacetato de boro ácido 7–cloro–1–ciclopropil–6–fluoro–1,4– dihidro–4–oxo–3–quinolincarboxílico (241 mg; preparado de acuerdo con WO 88/07998) y DIPEA (100 !l) en NMP (2 ml) se agita a 85 °C durante 5 h. La mezcla de reacción se evapora bajo presión reducida y el residuo se recoge en HCl 5 M en MeOH (3 ml) y se agita. El sólido resultante se recoge mediante filtración y lavado con MeOH para obtener 230 mg (67% de rendimiento) de un sólido amarillo.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 1,66–1,35 (m, 4H), 1,75 (d, J = 12,8, 2H), 1,95 (m, 2H), 3,33 (t amplio, J = 11,0, 2H), 3,57 (m, 3H), 3,67 (dd, J = 12,3, 3,3, 1H), 3,83 (m, 2H), 3,92 (s, 2H), 4,06 (t, J = 9,0, 1H), 4,69 (m, 1H), 7,24 (m, 2H), 7,60 (m, 2H), 7,90 (d, J = 13,3, 1H), 8,66 (s, 1H).

EM (ESI): 585,9.

Ejemplo 2: ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{4–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)– fenoximetil]–4–hidroxi–piperidin–1–il}–4–oxo–1,4–dihidro–[1,8]naftiridin–3–carboxílico:

Una solución de ácido 7–cloro–1–ciclopropil–6–fluoro–1,4–dihidro–4–oxo–1,8–naftiridin–3–carboxílico (166 mg; producto comercial) y del intermedio 1.iii (200 mg) en NMP (5 ml) se trata con TEA (0,32 ml) y TMSCl y se calienta a 85 °C durante 5 h. La mezcla de reacción se evapora bajo presión reducida y el residuo se recoge en HCl 5 M en MeOH (3 ml) y se agita durante 30 min. La solución se evapora bajo presión reducida y el residuo se recoge en EA. El sólido resultante se recoge mediante filtración y se lava con EA, obteniéndose 271 mg (78% de rendimiento) de un sólido amarillo.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 0,89–1,27 (m, 4H); 1,78 (d, J = 12,8, 2H); 1,90–2,04 (m, 2H); 3,53–3,88 (m, 6H); 3,88 (s, 2H), 4,06 (t, J = 9,0, 1H), 4,42 (d amplio, J = 13,2, 2H), 4,44 (m, 1H); 7,11 (m, 2H); 7,55 (d, J = 14,5, 1H); 8,05 (d, J = 13,5, 1H); 8,60 (s, 1H).

EM (ESI): 586,8.

Ejemplo 3: ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{(RS)–3–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)– fenoximetil]–3–hidroxi–pirrolidin–1–il}–4–oxo–1,4–dihidro–quinolin–3–carboxílico:

3.i. bencil éster de ácido dialil–carbámico:

Se agrega cloruro de benzoilo (15,5 ml) gota a gota durante 30 min a una solución de dialilamina (12,3 ml) y TEA (21 ml) en DCM (100 ml) a 0 °C. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 16 h. El residuo obtenido después del procesamiento (DCM) se purifica mediante cromatografía (Hex/EA 95:5) para proveer 20,71 g (88% de rendimiento) de un líquido incoloro.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 3,83 (dt, J = 1 y J = 6, 4H); 5,05–5,18 (m, 6H); 5,70–5,86 (m, 2H); 7,27–7,48 (m, 5H).

3.ii. bencil éster de ácido 2,5–dihidro–pirrole–1–carboxílico:

Se agrega benciliden–bis(triciclohexilfosfin)diclororutenio (5 g) a una solución del intermedio 3.i (17,56 g) en DCM (1,5 l) a temperatura ambiente bajo nitrógeno. La mezcla de reacción se agita a 40 °C durante 2 h y se concentra in vacuo. El residuo se purifica mediante FC (Hex/EA 90:10) para proveer 14,08 g (91% de rendimiento) de un líquido amarillo.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 4,05–4,16 (m, 4H); 5,08 (s, 2H); 5,81–5,92 (m, 2H); 7,27–7,41 (m, 5H).

3.iii. bencil éster de ácido (RS)–3–hidroxi–pirrolidin–1–carboxílico:

Se agrega una solución 1 M de borano en THF (9 ml) a una solución del intermedio 3.ii (1,81 g) en THF (25 ml) a 0 °C bajo nitrógeno. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 16 h y es enfriada a 0 °C. Se agrega cuidadosamente NaOH 20% (1,8 ml) gota a gota seguido de peróxido de hidrógeno acuoso al 35% (1,2 ml). La mezcla se agita a 0 °C durante 30 min y a temperatura ambiente durante 2 h. Se añaden Et2O y una solución acuosa al 40% de bisulfito de sodio y la mezcla de reacción se agita vigorosamente durante 15 min. El residuo obtenido después del procesamiento (Et2O) se purifica mediante FC (Hex/EA 5:5 hasta 3:7) para proveer 1,01 g (51% de rendimiento) de un aceite incoloro.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 1,67–1,82 (m, 1H); 1,82–1,96 (m, 1H); 3,16–3,25 (m, 1H); 3,28–3,44 (m, 3H); 4,20– 4,29 (amplio, 1H); 4,92 (d, J = 3, 1H); 5,06 (s, 2H); 7,27–7,41 (m, 5H).

3.iv. bencil éster de ácido 3–oxo–pirrolidin–1–carboxílico:

Una solución del intermedio 3.iii (1,10 g) en DCM (8 ml) se enfría a 0 °C y se agrega DIPEA (2,5 ml) gota a gota, seguido de una solución de complejo piridina trióxido de azufre (1,79 g) en DMSO (6,5 ml). La mezcla de reacción se agita a 0 °C durante 1 h y se apaga mediante la adición de agua (6 ml). La fase acuosa se extracta con Et2O/Hex (1:1, 3 x 5 ml) y las fases orgánicas combinadas se concentran in vacuo. El residuo obtenido después del procesamiento (Et2O/Hex 1:1) se purifica mediante FC (Hex/EA 5:5) proporcionando 1,05 g (96% de rendimiento) de un aceite amarillento.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 2.48–2.61 (m, 2H); 3.61–3.80 (m, 4H); 5.09 (s, 2H); 7.27–7.41 (m, 5H).

3.v. bencil éster de ácido 3–metilen–pirrolidin–1–carboxílico:

Se agrega t–BuOK (617 mg) en una porción a una suspensión blanca de bromuro de metil trifenilfosfonio (1,98 g) en THF (10 ml) a temperatura ambiente bajo nitrógeno. La suspensión amarilla se agita a temperatura ambiente durante 1 h y luego se enfría a –10 °C. Se agrega gota a gota una solución del intermedio 3.iv (1,05 g) en THF (2 ml) durante 10 min y la mezcla de reacción se deja entibiar hasta temperatura ambiente durante 2 h. La reacción se apaga mediante la adición de NH4Cl acuoso saturado (1 ml) y se diluye con EA. El residuo obtenido después del procesamiento (EA) se purifica mediante cromatografía (Hex/EA 90:10) para proveer 633 mg (64% de rendimiento) de un líquido amarillento.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 2,48–2,61 (m, 2H); 3,36–3,53 (m, 2H); 3,84–4,01 (m, 2H); 4,97–5,03 (m, 2H); 5,08 (s, 2H); 7,27–7,41 (m, 5H).

3.vi. bencil éster de ácido 1–oxa–5–aza–spiro[2.4]heptan–5–carboxílico:

Una solución del intermedio 3.v (7,21 g) en DCM (400 ml) es tratada con MCPBA (20,1 g) y NaHCO3 (22,3 g) a temperatura ambiente. La reacción se agita a temperatura ambiente durante 2 h, se diluye con DCM (200 ml) y se vierte en una solución de Na2SO3 (45 g) en agua (400 ml). La mezcla se agita durante 10 min y la fase orgánica se separa. El residuo obtenido después del procesamiento (DCM) se purifica mediante FC (Hex/EA 6:4) para proveer 4,37 g (56% de rendimiento) de un aceite amarillo.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 1,70–1,83 (m, 1H); 2,22–2,37 (m, 1H); 2,90–2,94 (m, 1H); 2,95–2,99 (m, 1H); 3,15 (t, J = 11, 1H); 3,39–3,77 (m, 3H); 5,09 (s, 2H); 7,27–7,41 (m, 5H).

3.vii. bencil éster de ácido (RS)–3–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)–fenoximetil]–3–hidroxi– pirrolidin–1–carboxílico:

Se agrega K2CO3 (274 mg) a una suspensión del intermedio 1.i (300 mg) y del intermedio 3.vi (338 mg) en DMF (3 ml). La mezcla de reacción se agita a 80 °C durante 3 h y el disolvente se retira in vacuo. El residuo obtenido después del procesamiento (DCM) se purifica mediante FC (DCM/MeOH 95:5) para proveer 531 mg (87% de rendimiento) de una espuma beige.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 1,80–1,92 (m, 1H); 1,96–2,08 (m, 1H); 3,32–3,59 (m, 5H); 3,66 (ddd, J = 3, J = 6 y J = 13, 1H); 3,80 (dd, J = 6 y J = 9, 1H); 3,97–4,09 (m, 3H); 4,64–4,72 (m, 1H); 5,07 (s, 2H); 5,19 (t, J = 6, 1H); 5,23 (s, 1H); 7,18–7,23 (m, 2H); 7,27–7,38 (m, 5H); 7,57 (dd, J = 2 y J = 14, 1H).

EM (ESI): 460,9.

3.viii. (R)–3–[3–fluoro–4–((RS)–3–hidroxi–pirrolidin–3–ilmetoxi)–fenil]–5–hidroximetil–oxazolidin–2–ona:

Una solución del intermedio 3.vii (259 mg) en THF/MeOH (1:1; 20 ml) se hidrogena empleando Pd/C 10% (60 mg) durante 20 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se concentra in vacuo, se recoge en DCM/MeOH 90:10 (20 ml) y se agita a temperatura ambiente durante 30 min. El catalizador se retira mediante filtración y el filtrado se concentra in vacuo para proveer 184 mg (100% de rendimiento) como una espuma naranja.

EM (ESI): 327,3.

3.ix. ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{(RS)–3–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)–fenoximetil]– 3–hidroxi–pirrolidin–1–il}–4–oxo–1,4 dihidro–quinolin–3–carboxílico:

Una solución del intermedio 3.viii (226 mg) y complejo diacetato de boro ácido 7–cloro–1–ciclopropil–6–fluoro–1,4– dihidro–4–oxo–3–quinolincarboxílico (270 mg; preparada de acuerdo con WO 88/07998) en NMP (5 ml) es tratada con DIPEA (120 \agitada a 60 °C durante 2 h. La mezcla de reacción se concentra in vacuo y el residuo se recoge en HCl 5 M en MeOH (2 ml). La solución se agita a temperatura ambiente durante 1 h, concentrada in vacuo y el residuo se purifica mediante FC (DCM/MeOH/AcOH 95:4:1 hasta 90:9:1). El residuo espumoso se recoge en MeOH (2 ml), agitado durante 1 h y filtrado. Los cristales se recogen y se secan in vacuo obteniendo 23 mg (6% de rendimiento) de un sólido beige.

RMN de 1H (DMSOd6; 8 ppm): 1,10–1,34 (m, 4H); 1,98–2,10 (m, 1H); 2,14–2,26 (m, 1H); 3,48–3,70 (m, 3H); 3,71– 3,89 (m, 5H); 4,05 (t, J = 9, 1H); 4,09–4,18 (m, 2H); 4,66–4,74 (m, 1H); 5,19 (t, J = 6, 1H); 5,40 (s, 1H); 7,09 (d, J = 8, 1H); 7,18–7,31 (m, 2H); 7,59 (dd, J = 2 y J = 14, 1H); 7,82 (d, J = 14, 1H); 8,59 (s, 1H); 15,52 (s, 1H).

EM (ESI): 572,3.

Ejemplo 4: Actividad antibacteriana in vitro de los compuestos de la invención respecto de cepas de referencia de Clostridium difficile o Clostridium perfringens:

4.i. Método experimental:

Se determinan las concentraciones inhibidoras mínimas (CIM) mediante un ensayo de microdilución de medio de cultivo. Como medio de ensayo se emplea medio Brucella suplementado con una concentración final de 0,5 mg/l de vitamina K1 y 5 mg/l de hemina. Brevemente, se preparan soluciones madre de los compuestos en DMSO (5,12 mg/ml), y 5 1l de una serie de diluciones seriales de dos–veces en 50% DMSO/50% H2O se disponen en placas de

microtitulación de 96 pocillos que contienen 45 1l de medio Brucella suplementado y se agitan durante 5 min. Para preparar el inóculo se suspenden colonias de 24 horas de edad de C. difficile cultivadas en agar Brucella suplementado con 5% de sangre de ovejas laked, 5 1g de hemina/ml, y 1 1g de vitamina K1/ml en medio de cultivo Brucella suplementado y se ajustan a una densidad que coincida con 0,5 del estándar de McFarland. 50 1l de una 5 dilución de 50–veces de esta suspensión es empleada para inocular los pocillos en la placa de 96 pocillos, lo que resulta en aproximadamente 104 unidades formadoras de colonias (CFU) por pocillo. La concentración final en DMSO es de 2,5%. El intervalo de concentración final es des 0,03 – 16 1g /mL. Las placas se incuban bajo condiciones anaeróbicas durante 48 h a 37 °C. Después de la incubación las placas son leídas en un lector de placas a DO595 (Ultramark, Biorad Laboratories). Las CIM son inicialmente leídos a la concentración más baja que

10 presenta >90% de inhibición del crecimiento en comparación con los pocillos de control. Las placas también son revisadas de manera visual con la ayuda de un espejo de lectura, y las CIM son confirmados por la ausencia de crecimiento visible.

4.ii. Resultados:

Los compuestos de los Ejemplos 1–3 son ensayados in vitro para véase su actividad en la inhibición del crecimiento

15 de tres cepas de referencia de C. difficile o Clostridium perfringens. Los resultados obtenidos están resumidos en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1

Compuesto ensayado: CIM respecto de C. difficile ATCC 43596 (1g/ml) CIM respecto de C. difficile ATCC 9689 (1g/ml) CIM respecto de C. difficile NC 13366 (1g/ml) CIM respecto de C. perfringens DSM 756 (1g/ml)

Ciprofloxacina: 8 8 > 16 0,25

Linezolida: 8 2 1 4

Ejemplo 1: 0,125 0,125 0,06 : 0,03

Ejemplo 2: 0,06 0,125 0,03 : 0,03

Ejemplo 3: 0,25 0,5 0,25 0,125

Los compuestos de los Ejemplos 1–3 presentan una potente actividad in vitro de frente a las cepas de C. difficile y

20 de C. perfringens ensayadas. También se observa una fuerte actividad de frente a la cepa hiper–virulenta NC13366 resistente a quinolona. Los compuestos de los Ejemplos 1 y 2 son levemente más activos que el compuesto del Ejemplo 3 y todos los compuestos Ejemplo son claramente más activos que ciprofloxacina y linezolida.

Ejemplo 5: actividad antibacteriana in vitro del compuesto del Ejemplo 1 de frente a una colección de Clostridium difficile aislada clínicamente:

25 5.i. Método experimental:

Se emplea el método de referencia recomendado por el CLSI de dilución de agar para anaerobios (M11–A6) para el ensayo de susceptibilidad. El medio de ensayo es agar Brucella suplementado con 5% de sangre de oveja laked,5 1g de hemin/ml, y 1 1g de vitamina K1/ml. Los compuestos de ensayo son diluidos en serie y se añaden al agar suplementado fundido. Se preparan controles de crecimiento en placas libres de fármacos. Antes de los ensayos, 30 todos los aislados son sub–cultivados dos veces en placas de agar brucella enriquecido. Las colonias bacterianas se suspenden en medio de cultivo brucella. Se emplea estandarización con un colorímetro Vitek para preparar cada inóculo al equivalente de 0,5 del estándar de McFarland, aproximadamente 104–105 CFU por punto después de la aplicación con un replicador Steers. Las placas se incuban en condiciones anaeróbicas durante 48 h a 37 °C. La concentración inhibidora mínima (MIC) es la concentración que inhibe completamente el crecimiento visible en

35 comparación con el control libre de fármacos. Todos los antibióticos son preparados y ensayados en conjunto con vancomicina y metronidazol como controles.

5.ii. Resultados:

El compuesto del Ejemplo 1 es ensayado por su actividad para inhibir el crecimiento de una colección de 209 diversos C. difficile aislados de manera clínica in vitro. El compuesto del Ejemplo 1 presenta un MIC90 40 (concentración mínima inhibidora para inhibir el crecimiento de 90% de las cepas o más) de 0,25 1g/ml, los CIM

obtenidos se encuentran en el rango desde 0,06 hasta 0,5 1g/ml. En promedio es más activo que vancomicina, metronidazol y linezolida, que tiene CIM90 of 2, 1 y 8 1g/ml, respectivamente.

Ejemplo 6: actividad antibacteriana in vitro de los compuestos de la invención de frente a bacterias aeróbicas Gram–positivas:

5 6.i. Método experimental:

Se determinan las concentraciones inhibidoras mínimas (CIM) mediante un ensayo de microdilución de medio de cultivo de acuerdo con las pautas del Clinical Laboratory Standards Institute [CLSI, antiguamente NCCLS, 1997]. Brevemente, se preparan soluciones stock de los compuestos en DMSO (5,12 mg/ml), diluidas de manera serial en medio de cultivo II de Mueller–Hinton (CaMHB) ajustado en cationes, y dispuesto en placas de microtitulación con la 10 ayuda de un robot de pipeteo Biomek 2000 (Beckman Coulter). La concentración final de DMSO es de 2,5% o menor. Las placas se inoculan para obtener una concentración generalmente de 3–6x105 CFU/ml. Después de incubación a 37 °C durante 18–24 h, las placas se leen en un lector de placas a DO595 (Ultramark, Biorad Laboratories). Las CIM son inicialmente leídos a la concentración más baja, presentando un >90% de inhibición de crecimiento en comparación con los pocillos de control. Las placas también se revisan de manera visual con la

15 ayuda de un espejo de lectura, y los CIM se confirman mediante la ausencia de un crecimiento visible.

6.ii. Resultados:

El compuesto del Ejemplo 1 se ensayó de frente a bacterias aerobias Gram–positivas. Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2

Cepa: CIM medida para vanco– micina (!9/ml) CIM medida para ciproflo– xacina (!9/ml) CIM medida para line– zolida (!9/ml) CIM medida para el compuesto del Ejemplo 1 (!9/ml)

S. aureus ATCC 29213: 1 0,25 2 0,25

S. aureus A–798 (MRSA): 1 > 16 2 0,25

S. aureus ATCC 43300 (MRSA): 1 0,25 2 0,25

S. aureus S1 (LZD–R): 1 0,25 > 32 1

E. faecalis ATCC 29212: 1 2 2 0,25

E. faecalis H 4060: > 32 > 16 2 0,25

E. faecalis H 6279: > 32 > 16 2 0,25

E. faecalis H 6897: > 32 > 16 4 1

E. faecalis H 7094: > 32 > 16 4 0,5

E. faecalis H 7460: > 32 > 16 16 1

E. faecium ATCC 19434: 1 8 2 0,25

E. faecium H 9070: > 32 > 16 2 1

E. faecium H 7969: > 32 > 16 4 1

E. faecium H 7966: > 32 > 16 1 0,5

E. faecium H 7965: > 32 > 16 2 0,5

E. faecium H 7937: > 32 > 16 1 0,25

E. faecium A 962: > 32 > 16 4 0,5

E. faecium A 949: > 32 > 16 2 1

E. faecium L1 (LZD–R): 0,5 > 16 > 32 2

En resumen, el compuesto del Ejemplo 1 presenta una potente actividad in vitro de frente a cepas de Staphylococcus aureus, S. aureus MRSA, Enterococcus faecalis, y Enterococcus faecium. Es activo frente a cepas que resisten a la vancomicina, ciprofloxacino o linezolida.

5 Ejemplo 7: actividad antibacteriana in vitro del compuesto del Ejemplo 1 frente a cepas bacterianas anaerobias particulares:

Empleando el método experimental descrito en el Ejemplo 5 (véase 5.i), el compuesto del Ejemplo 1 (Ej. 1) es probado in vitro por la capacidad de inhibir el crecimiento de ciertas bacterias anaeróbicas que son conocidas o de las cuales se sospecha que juegan un ron en la flora normal del intestino y en el mantenimiento de su papel en la

10 protección frente a un sobre crecimiento de C. difficile (de aquí en adelante llamada las “bacterias comensales del intestino”). Como referencias, el compuesto del Ejemplo 5 de WO 2005/058888 (R1) y ciprofloxacino (CP) se ensayaron al mismo tiempo. Las CIM así obtenidos se muestran a continuación en la Tabla 3.

Tabla 3

Cepas: CIM [!9/ml ]

R1: Ej, 1 CP

Clostridium difficile A–1179: NC 13366 �0,06 �0,06 >32

Fusobacterium necrophorum A–1260: DSM 20698 1 1 4

Bacteroides ovatus A–991: ATCC 8483 8 16 16

Bacteroides fragilis A–992: ATCC 25285 2 8 8

Bacteroides thetaiotaomicron A–990: ATCC 29741 4 8 16

Bacteroides vulgatus A–989: ATCC 8482 1 2 32

Bacteroides fragilis A–502: T 7403 2 4 8

Bacteroides fragilis A–348: T 8673 1 2 8

Bacteroides fragilis A–217: B 6306 2 4 8

Bacteroides fragilis A–501: B 8039 4 4 32

Bacteroides fragilis A–294: T 9174 2 4 8

Bacteroides fragilis A–293: B 2518 2 4 8

Cepas: CIM [!9/ml ]

R1: Ej, 1 CP

Bacteroides fragilis A–260: T 9865 1 4 8

Eubacterium limosum A–1259: DSM 20698 0,125 1 2

Finegoldia magna A–1254: DSM 20470 �0,06 0,25 2

Bifidobacterium adolescentis A–1257: DSM 20083 �0,06 0,5 2

Bifidobacterium bifidum A–1258: DSM 20456 0,125 0,5 4

Lactobacillus acidophilus A–1255: DSM 20079 �0,06 0,5 32

Lactococcus lactis A–1256: DSM 20069 �0,06 0,5 1

En resumen, el compuesto del Ejemplo 1 presenta una actividad reducida respecto de las bacterias comensales en comparación con C. difficile. Para Bacteroides spp., que son miembros importantes de la flora protectora humana del intestino, la actividad es 30 a 200 veces menor. Esta actividad selectiva ofrece el potencial de una destrucción

5 selectiva de C. difficile en el intestino mientras se evitan importantes bacterias de la flora intestinal.

Además, cuando se lo compara con el compuesto del Ejemplo 5 de WO 2005/058888, el compuesto del Ejemplo 1 presenta en la mayor parte de los casos 2 a 4 veces menos de actividad frente a la Bacteroides spp. ensayada, 4 veces menos actividad frente a las cepas Eubacterium limosum A–1259 o Finegoldia magna A–1254, 4 a 8 veces menos activa frente al Bifidobacterium spp. ensayado y 8 veces menos activa frente a las cepas Lactobacillus

10 acidophilus A–1255 y Lactococcus lactis A–1256.

Por lo tanto, cuando se compara con el compuesto del Ejemplo 5 de WO 2005/058888 (R1), el compuesto del Ejemplo 1 es significativamente menos activo frente a las bacterias comensales del intestino, lo que indica una ventaja en cuanto a la destrucción selectiva de C. difficile en el intestino.

Ejemplo 8: Efecto del compuesto del Ejemplo 1 en la producción de toxinas de C. difficile:

15 8.i. Método experimental:

La cepa hipertoxigénica C. difficile NC13366 se cultiva de manera anaeróbica en medio Brucella suplementado durante 24 horas a 37 °C hasta una densidad celular de aproximadamente 1x108 CFU/ml. Las bacterias son lavadas mediante centrifugación y resuspendidas en el mismo volumen de medio Brucella suplementado que contiene antibióticos a 1 y 8 1g/ml, respectivamente. El control no contiene antibiótico. Los cultivos son incubados

20 adicionalmente de manera anaeróbica a 37 °C. En el día 5 se recolectan los sobrenadantes de los cultivos y se los ensaya respecto a toxina A y respecto a toxina B tal como se describe más adelante.

Se detecta la toxina A mediante Western Blotting usando un sistema de ensayo para análisis de proteínas grandes NuPage (Large Protein Analysis System) (Invitrogen LP0001, de acuerdo con las instrucciones del kit). Se emplea el juego de inmunodetección Western Breeze anti ratón (Invitrogen WB7103) con anticuerpos monoclonales anti CdTA

25 de ratón (PCG4.1, Biodesign C70517M).

Se detecta la toxina citotóxica de C. difficile (toxina B) de manera semi–cuantitativa mediante el ensayo de los sobrenadantes de los cultivos de C. difficile por la actividad de rounding de células (cell–rounding, células que se hacen redondas) en células CHO. Las células CHO se siembran en placas de 96 pocillos de fondo plano (1x105 células/ pocillo) y se deja que se adhieran durante 3 h. Se añaden las diluciones apropiadas de los sobrenadantes

30 esterilizados mediante filtración a las células y se las incuba adicionalmente a 37 °C, en 5% de CO2. Después de 20 h de incubación se determina el rounding celular empleando un microscopio invertido. El título de las toxinas es definido como la más alta dilución serial de 10 veces de sobrenadante que produce más que un 90% de rounding celular.

Las unidades formadoras de colonias (CFU) se determinan mediante el plaqueado de las diluciones apropiadas de las muestras de ensayo en agar Brucella suplementado y conteo de colonias después de 48 horas de incubación a 37 °C bajo condiciones anaeróbicas.

8.ii. Resultados:

La vista general de una placa de Western Blot para analizar la producción de toxina A en el sobrenadante de cultivos celulares estáticos de alta densidad de C. difficile NC 13366 (una cepa hiper–productora de toxina de tipo NAPI/027 que causa violentos episodios en hospitales con alta mortalidad) se muestra en la Figura 1.

El método experimental mencionado en el párrafo 8.i es empleado para obtener el resultado mostrado en la Figura 1. En el día 1 (D1), los cultivos se tratan con ya sea el compuesto del Ejemplo 1 (Ex. 1), vancomicina (V), metronidazol (M) a 1 y 8 1g/ml � se dejan sin tratamiento (U); en el día 5 (D5), se analizan los contenidos de la toxina A en los sobrenadantes y se los compara con aquellos observados en D1 (véase Figura 1). En los cultivos en fase estacionaria de alta densidad de cinco días de edad de C. difficile toxigénica, el compuesto del Ejemplo 1 inhibe de novo la producción de toxina A empleando concentraciones de 1 y 8 1g/ml, i.e a 2 y 16x la CIM (véase la Figura 1). En contraste, el metronidazol y la vancomicina no inhibieron la producción de toxina A bajo estas condiciones o sólo lo hacieron de manera débil.

Los sobrenadantes del cultivo también fueron analizados respecto a la toxina B citotóxica mediante el uso del ensayo de rounding de células basado en células mencionado en el párrafo 8.i. Las actividades de los sobrenadantes de los cultivos tratados con el compuesto del Ejemplo 1 se redujeron en más que un 90% en comparación con el control sin tratamiento. En contraste, las actividades de los sobrenadantes de los cultivos tratados con vancomicina no se redujeron (a 1 1g/ml) � sólo se redujeron en un 30% (a 8 1g/ml).

En resumen, el compuesto del Ejemplo 1 tiene la capacidad de detener de manera eficiente la síntesis de las toxinas A y B de C. difficile incluso en cultivos estáticos de alta densidad y en ausencia de muerte celular, lo que no es el caso para vancomicina y metronidazol, los fármacos de preferencia actualmente empleados para el tratamiento de infecciones de C. difficile.

Ejemplo 9: Efecto del compuesto del Ejemplo 1 en la formación de esporas de C. difficile:

9.i. Método experimental:

Se cultiva C. difficile A–1050 (ATCC 43596) hasta crecimiento logarítmico en medio de cultivo Brucella suplementado, lo que resulta en que la turbidez alcance 0,5 del estándar de McFarland (6–7 h a 37 °C bajo condiciones anaeróbicas). Los cultivos son diluidos 1:50 en tubos que contienen 1 ml de medio de cultivo Brucella suplementado que contiene los antibióticos a diversas concentraciones en pasos de dilución de 2 veces. Los tubos se incubaron adicionalmente durante 4 días a 37 °C bajo condiciones anaeróbicas. La CIM se define como la concentración que inhibe completamente el crecimiento visible (turbidez). 0,5x CIM es la concentración más alta del fármaco que deja el crecimiento visible.

La evaluación de las unidades formadoras de colonias (CFUs) de las células totales se lleva a cabo mediante el plaqueo de diluciones de 10 veces apropiadas de los cultivos en agar de Brazier que contiene 4% de suspensión de yema de huevo y 1% de sangre de caballo lisada (Lab M). Las colonias se contaron después de incubación a 37 °C durante 48 h bajo condiciones anaeróbicas. Los conteos de esporas se llevaron a cabo mediante la muerte selectiva de células vegetativas mediante tratamiento con 50% de etanol durante 1 h a temperatura ambiente y el conteo posterior de CFU en agar de Braziers tal como se indica anteriormente.

9.ii.: Resultados:

C.: difficile es un organismo formador de esporas y las esporas pueden persistir por largo tiempo en el ambiente hospitalario. Las esporas son muy resistentes a los procedimientos de desinfección habituales. Por lo tanto, las esporas juegan un papel importante en la transmisión y en la persistencia de las infecciones con C. difficile.Se tratan cultivos de C. difficile in vitro con diversas concentraciones inferiores a la CIM del compuesto del Ejemplo 1, vancomicina o metronidazol y se investiga el efecto sobre la producción de esporas después de 4 días de incubación anaeróbica a 37 °C (véase párrafo 9.i). A una concentración que representa 0,5x de la CIM, el tratamiento con el compuesto del Ejemplo 1 produjo bajos conteos de esporas (<1% de esporas del conteo de células totales). En contraste, los cultivos no tratados y los cultivos tratados con metronidazol o vancomicina a concentraciones de 0,5x de CIM presentaron altas tasas de esporulación (>90% de esporas del conteo de células totales). Esto indica que el compuesto del Ejemplo 1 tiene la capacidad de reducir la producción de esporas durante el tratamiento de una infección con C. difficile de manera más eficiente quela vancomicina o el metronidazol.

Ejemplo 10: Actividad in vivo de un compuesto de la invención en el modelo de C. difficile en hámster:

10.i. Método experimental:

Se aplicó una única inyección de fosfato de clindamicina (10 mg/kg s.c.), a hámsteres Golden Syrian, y un día después los animales se infectaron mediante sonda esogáfica con 105 CFU de cepa C. difficile toxigénica 10465. Se 5 produce una colitis fulminante en la mayoría de de los animales (~95%) y se desarrolla 1 a 2 días después de la administración de C. difficile. Sin tratamiento, la colitis progresa rápidamente y se convierte en colitis severa, necrosis hemorrágica del intestino ciego y muerte. El compuesto del Ejemplo 1 se administró de manera oral como una suspensión a tres niveles de dosificación (10 mg/kg, 30 mg/kg y 100 mg/kg; n = 10 por grupo). Se emple´p vancomicina (50 mg/kg) como un control. Los animales se tratanron una vez diariamente durante 5 días y a

10 continuación se mantuvieron en observación durante 21 días adicionales.

Los animales se observaron tres veces diariamente en lo referente a la morbidez y la presencia o ausencia de diarrea. El punto final del estudio que la supervivencia. Los animales para los cuales se juzó que estbán en un estado moribundo [período extendido de pérdida de peso que progresa a un estado escuálido, anorexia durante 24– 48 h, letargo prolongado (más que 3 días), signos de parálisis, erosiones cutáneas o trauma, postura encorvada,

15 abdomen distendido] se sacrificaron mediante una única inyección de pentobarbital sódico.

10.ii. Resultados:

La utilidad terapéutica del compuesto del Ejemplo 1 es ensayó empleando el protocolo del párrafo 10.i. Todos los animales infectados no tratados muerieron entre 2 y 5 días después de la infección, mientras que todos los animales tratados con 10, 30 ó 100 mg/kg del compuesto del Ejemplo 1 sobrevivieron durante el período de tratamiento de 5

20 días. Al nivel de dosis más bajo, 40% de los animales sobrevive la fase de recaída 21 días después del tratamiento, mientras que en los grupos de 30 y 100 mg/kg 80 y 100% de los animales sobrevivieron sin una recaída. Como control se empleado vancomicina con una dosis de 50 mg. Estos resultados demuestran que el compuesto del Ejemplo 1 tiene la capacidad de tratar animales infectados con C. difficile de manera comparable a vancomicina.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula I

I

en la que

A es N o CH; y

n es 0 ó 1;

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades intestinales que están causadas por bacterias seleccionadas de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus.
2.

Un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para el uso mencionado en la reivindicación 1, en el que A es CH.
3.

Un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para el uso mencionado en la reivindicación 1 en el que n es 1.
4.

Un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1, seleccionado de entre:

–

ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{4–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)–fenoximetil]–4–hidroxi– piperidin–1–il}–4–oxo–1,4–dihidro–quinolin–3–carboxílico;

–

ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{4–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)–fenoximetil]–4–hidroxi– piperidin–1–il}–4–oxo–1,4–dihidro–[1,8]naftiridin–3–carboxílico; y

–

ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{3–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)–fenoximetil]–3–hidroxi– pirrolidin–1–il}–4–oxo–1,4–dihidro–quinolin–3–carboxílico;

o una sal farmacéuticamente aceptable de un tal compuesto, para uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades intestinales que son causadas por bacterias seleccionadas de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus.
5.

Un compuesto de fórmula I de acuerdo con la reivindicación 1 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que es ácido 1–ciclopropil–6–fluoro–7–{4–[2–fluoro–4–((R)–5–hidroximetil–2–oxo–oxazolidin–3–il)–fenoximetil]–4– hidroxi–piperidin–1–il}–4–oxo–1,4–dihidro–quinolin–3–carboxílico o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la prevención o el tratamiento de enfermedades intestinales que son causadas por bacterias seleccionadas de entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus.
6.

Un compuesto de fórmula I de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades intestinales que son causadas por Clostridium difficile.
7.

Un compuesto de fórmula I tal de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades intestinales que son causadas por una cepa de Clostridium difficile que produce una toxina.
8.

Un compuesto de fórmula I de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, o una sal farmacéuticamente

5 aceptable del mismo, para uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades de diarrea asociadas con cepas entero–toxigénicas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus sin el aumento de la concentración de enterococos resistentes a vancomicina en el intestino.
9. Un compuesto de fórmula I de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades de diarrea asociadas con cepas

10 entero–toxigénicas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens o Staphylococcus aureus y la reducción de la concentración de enterococos resistentes a vancomicina en el intestino.
10. El uso de un compuesto de fórmula I de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, o de una sal farmacéuticamente aceptable de un tal compuesto, para la producción de un medicamento destinado a la prevención

o al tratamiento de una enfermedad intestinal que es causada por una bacteria seleccionada de entre Clostridium 15 difficile, Clostridium perfringens y Staphylococcus aureus.
11.

El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medicamento fabricado está destinado al tratamiento de una enfermedad intestinal.
12.

El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medicamento fabricado está destinado a la prevención de la enfermedad intestinal.

20 13. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medicamento fabricado también está destinado a no aumentar la concentración de enterococos resistentes a vancomicina en el intestino.
14. El uso de acuerdo la reivindicación 10, en el que el medicamento fabricado también está destinado a reducir la concentración de enterococos resistentes a la vancomicina en el intestino.

Figura 1