KR101283222B1

KR101283222B1 - 세균성 장 질환 치료용 5-하이드록시메틸-옥사졸리딘-1-온 유도체

Info

Publication number: KR101283222B1
Application number: KR1020107025774A
Authority: KR
Inventors: 크리스티안 후브쉬웨를렌; 한스 로셔
Original assignee: 액테리온 파마슈티칼 리미티드
Priority date: 2008-05-09
Filing date: 2009-05-08
Publication date: 2013-07-11
Also published as: MY156304A; NZ589734A; JP2011519914A; BRPI0911991B8; JP4819980B2; HRP20120791T1; ES2390405T3; SI2296651T1; HK1155086A1; CA2723232C; ZA201008841B; AU2009245351A1; PT2296651E; WO2009136379A1; EP2296651B1; BRPI0911991A2; CY1113197T1; RU2010149994A; AU2009245351B2; BRPI0911991B1

Abstract

본 발명은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 선택된 세균에 의해 야기되는 장 질환의 예방 또는 치료용 화학식 I의 화합물(이때 A는 N 또는 CH이며; n은 0 또는 1임); 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다.

Description

세균성 장 질환 치료용 5-하이드록시메틸-옥사졸리딘-1-온 유도체{5-HYDROXYMETHYL-OXAZOLIDIN-2-ONE DERIVATIVES FOR TREATING BACTERIAL INTESTINAL DISEASES}

본 발명은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 의한 장 질환을 예방 또는 치료하기 위한 특정 5-하이드록시메틸-옥사졸리딘-2-온 유도체의 용도에 관한 것이다.

클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 일부 균주들은 설사를 일으키는 독소를 만든다. 이들 독소를 생산하는 균주의 발견은 항생체의 이용과 연관되기도 한다.

이들 균주들중, 두 가지 엔테로록신(A 와 B)을 생산하는 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 혐기성, 포자 형성, 그람-양성 세균은 설사를 일으킬 뿐만 아니라, 생명을 위협하는 가막성 대장염(pseudomembranous colitis)과 같은 좀더 심각한 장 이상의 원인이 된다. 이 균은 현재 선진국에서 병원 및 장기 요양원에서 가장 흔한 감염성 설사의 원인이다. 지난 몇 년간, 이와 같은 발병은 점진적으로 증가되어, 북미 및 유럽에서 현재 심각한 임상적 문제가 된다. 위험 인자에는 항생제의 사전 치료, 나이, 세포독성 화학요법 또는 기관 이식으로 인한 면역기능이 제 기능을 못하는 것들이 포함된다.

클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) 관련 질환(CDAD)을 위한 현재 치료는 반코마이신 또는 메트로니다졸이다. 그러나, 이 두 가지 모두 높은 재발률이 관찰되었고, 독소 및 포자 생산은 저지되지 않는다. 더욱이, 반코마이신 또는 메트로니다졸을 이용한 치료는 장에서 반코마이신-저항성 엔테로코커스 종(E. faecalis 및 E. faecium) 그리고 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 균주(차례로 VRE 및 VRSA)의 출현을 촉진시킨다( 참고W.N. Al - Nassir et al., Antimicrob . Agents Chemother ., published ahead of print on 28 April 2008). 장구균(Enterococci)은 위장관에 상주하는 그람-양성 구균이다. 그러나, 이들 균들 또한 심장내막염 및 뇨도관, 혈류 및 상처 감염을 일으키는 심각한 병인균이 될 수도 있다. 일단 획득되면, VRE에 의한 장 콜로니형성은 수년간 지속될 수 있고, 콜로니화된 환자의 잠재적 감염에 대한 저장소 및 VRE를 다른 환자로 전파되기 위한 저장소로 작용할 수 있다. VRE는 C. 디피실(C. difficile)에 감염된 환자에서 공동-감염되는 것으로 보이며, 또는 혈액학 및 종양학 환자와 같은 특정 고위험군 환자, 중환자실의 환자, 장기요양시설의 환자, 장기이식을 받은 환자에서 좀더 흔하게 감염을 일으킬 수 있다.

따라서, C. 디피실(difficile)에 대한 강력한 활성을 가지는, 독소 부하, 포자 생산을 상당히 감소시킬 수 있고, VRE를 극복할 수 있고, 장 세균총에는 최소한의 영향을 끼지는 화합물을 동정함으로써, CDAD 및 특히 관련 감염의 경우에 더 나은 치료법이 필요하다.

WO 03/032962, WO 2004/096221 및 WO 2005/058888에서는 옥사졸리딘 모이어티, 및 l-사이클로프로필-6-플로오르-4-옥소-l,4-디하이드로-퀴노린-3-카르복실산 또는 l-사이클로프로필-6-플로오르-4-옥소-l,4-디하이드로-[1,8]나프티리딘-3-카르복실산을 포함하는 항균 화합물을 개시한다.

게다가, 아래에서 정의된 화학식 I의 화합물 및 이들의 항균 활성은 PCT 출원 PCT/IB2007/054557에서 이미 설명된 바 있다.

도 1은 C. 디피실(C. difficile) NC 13366 (병원에서 높은 유병률의 원인이 되는 독소-과다생산 NAPI/027-타입 균주)의 정지상 고밀도 세포 배양물의 상청액에서 독소 A의 생산을 분석하기 위하여 웨스턴 블랏 플레이트를 보여준다.

이하에서 본 발명의 다양한 구체예가 제공된다:

i) 제 1 주요 구체예에 따르면, 본 발명은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)이 원인이 되는 장 질환을 예방 또는 치료하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염에 관련된다

이때,

A는 N 또는 CH이며; 그리고

n은 0 또는 1이다;

다음 단락들에서는 여기에서 이용된 다양한 용어의 정의를 제공하는데, 이들 정의는 더 넓은 또는 더 좁은 의미를 정의가 명시적으로 제공되지 않는 한, 명세서 및 청구범위를 통하여 일관되게 적용된다.

질환과 관련되어 이용된 “예방하는”, “예방하다” 또는 “예방”은 이들 질환이 환자 또는 동물에서 발생하지 않는 것을 의미하거나, 또는 동물 또는 환자가 이 질환에 영향을 받기는 하지만, 질환의 증상중 일부 또는 전부가 감소되거나 없는 상태를 의미한다.

질병을 언급하면서 이용되는 “치료하는”, “치료하다” 또는 “치료”는 환자 또는 동물에서 해당 질병이 치료되거나, 또는 동물 또는 환자가 여전히 해당 질환에 영향을 받기는 하지만, 질환의 증상중 일부 또는 전부가 감소되거나 없어진 상태를 의미한다.

“약리학적으로 수용가능한 염”은 비-독성, 무기 또는 유기 산 및/또는 염기 첨가 염을 말한다. "Salt selection for basic drugs", Int. J. Pharm. (1986), 33, 201-217을 참고한다.

"할로겐" 은 플로오르, 염소, 브롬 또는 요오드, 바람직하게는 플로오르, 염소 또는 브롬이며, 더 바람직하게는 플로오르 또는 염소를 지칭한다.

본 명세서에서 수치 “X” 앞에 있는 “약(about)”은 온도에 사용되지 않는 한, X-X의 10%부터 X+X의 10% 범위내 정수를 지칭하며, 바람직하게는 X-X의 5%부터 X+X의 5% 범위내 정수를 지칭한다. 특히, 온도의 경우에, 온도 “Y”앞에 붙은 “약”은 본 출원에서 Y-Y의 10℃부터 Y+Y의 10℃ 범위내 정수를 지칭하며, 바람직하게는 Y-Y의 5℃부터 Y+Y의 5℃ 범위내 정수를 지칭한다. 그 외에 “실온”은 25℃의 온도를 말한다.

ii) 바람직하게는, 구체예 i)에서 정의된 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 장독성 균주들과 연관된 설사 질환을, 장에서 반코마이신-저항성 장구균(VRE)의 농도 증가 없이, 효과적으로 예방 또는 치료할 것이다.

iii) 좀더 바람직하게는, 구체예 i)에서 정의된 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 장독성 균주와 연관된 설사 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 것이며, 장에서 VRE 농도를 감소시킬 것이다.

iv) 바람직하게는, 구체예 i) 내지 iii)중 하나에서 정의된 바와 같은, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염에서, A는 CH가 된다.

v) 바람직하게는 구체예 i) 내지 iv)중 하나에서 정의된 바와 같은, 화학식 I의 화합물, 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염에서, n은 1이 된다.

vi) 구체예 i) 내지 iii)의 바람직한 하위-구체예에 따르면, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염은 다음에서 선택될 것이다:

- 1-사이클로프로필-6-플로오르-7-{4-[2-플로오르-4-((R)-5-하이드록시메틸-2-옥소-옥사졸리딘-3-일)-페녹시메틸]-4-하이드록시-피페리딘-1-일}-4-옥소-1,4-디하이드로-퀴노린-3-카르복실산;

- 1-사이클로프로필-6-플로오르-7-{4-[2-플로오르-4-((R)-5-하이드록시메틸-2-옥소-옥사졸리딘-3-일)-페녹시메틸]-4-하이드록시-피페리딘-1-일}-4-옥소-1,4-디하이드로-[1,8]나프티리딘-3-카르복실산;

- 1-사이클로프로필-6-플로오르-7-{3-[2-플로오르-4-((R)-5-하이드록시메틸-2-옥소-옥사졸리딘-3-일)-페녹시메틸]-3-하이드록시-피롤리딘-l-일}-4-옥소-l,4-디하이드로-퀴노린-3-카르복실산;

그리고 이의 약학적으로 수용가능한 염.

vii) 구체예 i) 내지 iii)의 바람직한 하위-구체예에 따르면, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염은 1-사이클로프로필-6-플로오르-7-{4-[2-플로오르-4-((R)-5-하이드록시메틸-2-옥소-옥사졸리딘-3-일)-페녹시메틸]-4-하이드록시-피페리딘-l-일}-4-옥소-l,4-디하이드로-퀴노린-3-카르복실산 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염이 될 것이다.

viii) 구체예 i) 내지 vii)중 한 측면에 따르면, 본 발명은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)이 일으키는 장 질환을 치료하기 위하여, 구체예 i) 내지 vii) 중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물들 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염에 관련될 것이다.

ix) 구체예 viii)의 한 가지 바람직한 측면에 따르면, 본 발명은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) (특히, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)의 독소 생산 균주에 의해)이 일으키는 장 질환을 치료하기 위하여, 구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염에 관련될 것이다.

x) 구체예 i) 내지 vii)중 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 선택된 세균이 일으키는 장 질환을 예방하기 위하여, 구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다.

xi) 구체예 x)의 한 가지 바람직한 측면에 따르면, 본 발명은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) (특히, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)의 독소 생산 균주에 의해)이 원인이 되는 장 질환을 예방하기 위하여, t구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염에 관한 것이다.

xii) 바람직하게는, 구체예 i) 내지 xi)에서 언급된 장질환이 예방되는 환자들은 기타 항생제로 치료받거나 또는 항바이러스 요법으로 치료받는 환자, 세포독성 화학요법과 같은 면역기능 이상이 있는 환자 또는 장기이식환자, 나이가 많은(65세 또는 그 이상) 환자 또는 중환자실의 환자 또는 장기요양원의 환자들이 될 것이다.

xiii) 본 발명의 또 다른 구체예는 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 선택된 세균에 의해 야기되는 장 질환을 환자에서 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로써, 이와 같은 방법은 구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 이들 화합물의 약학적으로 수용가능한 염의 효과량을 장질환을 예방 또는 치료하는데 충분한 시간동안 환자에 투여하는 것을 포함한다.

xiv) 바람직하게는, 구체예 xiii)의 방법은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 장독소 균주와 연관된 설사 질환을, 장에서 반코마이신-저항성 장구균(VRE)의 농도를 증가시키지 않으면서, 효과적으로 예방 또는 치료할 것이다.

xv) 더욱 바람직하게는, 구체예 xiii)의 방법은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 장독소 균주와 연관된 설사 질환을 효과적으로 예방 또는 치료하며, 장에서 VRE 농도를 감소시킬 것이다.

xvi) 구체예 xiii) 내지 xv)의 한 가지 측면에 따르면, 본 발명은 환자에서 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 선택된 세균에 의해 야기되는 장 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 이들 화합물의 약학적으로 수용가능한 염의 효과량을 장질환의 치료에 충분한 시간동안 환자에 투여하는 것을 포함한다.

xvii) 구체예 xvi)의 한 가지 바람직한 측면에 따르면, 본 발명은 환자에서 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) (특히, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)의 독소 생산 균주에 의해)이 원인이 되는 장 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

xviii) 구체예 xiii) 내지 xv)의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 환자에서 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 선택된 세균에 의해 야기되는 장 질환을 예방하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 이들 화합물의 약학적으로 수용가능한 염의 효과량이 장질환을 예방하는데 충분한 시간동안 환자에 투여하는 것을 포함한다.

xix) 구체예 xviii)의 한 가지 측면에 따르면, 본 발명은 환자에서 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) (특히, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)의 독소 생산 균주에 의해)이 원인이 되는 장 질환을 예방하는 방법에 관한 것이다.

xx) 바람직하게는, 구체예 xiii) 내지 xix)의 방법을 받게 되는 환자들은 기타 항생제로 치료받거나 또는 항바이러스 요법으로 치료받는 환자, 세포독성 화학요법과 같은 면역기능 이상이 있는 환자 또는 장기이식환자, 나이가 많은(65세 또는 그 이상) 환자 또는 중환자실의 환자 또는 장기요양원의 환자들이 될 것이다.

xxi) 본 발명의 또 다른 측면은 구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 이 화합물의 약학적으로 수용가능한 염을 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 선택된 세균에 의해 야기되는 장 질환의 예방 또는 치료용 약물 제조에 이용하는 용도에 관한 것이다.

xxii) 구체예 xxi)의 한 측면에 따르면, 본 발명은 구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 이 화합물의 약학적으로 수용가능한 염을 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 선택된 세균에 의해 야기되는 장 질환의 치료용 약물 제조에 이용하는 용도에 관한 것이다.

xxiii) 구체예 xxii)의 한 가지 바람직한 측면에 따르면, 치료될 장 질환은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) (특히, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)의 독소 생산 균주에 의해)에 의해 야기되는 것일 것이다.

xxiv) 구체예 xxi)의 또 다른 측면에서, 본 발명은 구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 이 화합물의 약학적으로 수용가능한 염을 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 선택된 세균에 의해 야기되는 장 질환의 예방용 약물 제조에 이용하는 용도에 관한 것이다.

xxv) 구체예 xxiv)의 한 가지 바람직한 측면에 따르면, 치료될 장 질환은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) (특히, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)의 독소 생산 균주에 의해)에 의해 야기되는 것일 것이다.

xxvi) 바람직하게는, 구체예 xxi) 내지 xxv)의 하나에 따라 제조된 약물이 이용될 환자들은 기타 항생제로 치료받거나 또는 항바이러스 요법으로 치료받는 환자, 세포독성 화학요법과 같은 면역기능 이상이 있는 환자 또는 장기이식환자, 나이가 많은(65세 또는 그 이상) 환자 또는 중환자실의 환자 또는 장기요양원의 환자들이 될 것이다.

xxvii) 본 발명의 또 다른 측면은 동물(가령, 개, 고양이, 돼지, 소 또는 말)에서 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 선택된 세균에의해 야기되는 장 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것인데, 이 방법은 구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 이들 화합물의 약학적으로 수용가능한 염의 효과량을 장질환을 예방 또는 치료하는데 충분한 시간동안 환자에 투여하는 것을 포함한다.

xxviii) 구체예 xxvii)의 한 측면에 따르면, 동물(가령, 개, 고양이, 돼지, 소 또는 말)에서 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 선택된 세균에의해 야기되는 장 질환을 치료하는 방법에 관한 것인데, 이 방법은 구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 이들 화합물의 약학적으로 수용가능한 염의 효과량이 장질환을 치료하는데 충분한 시간동안 환자에 투여되는 것을 포함한다.

xxix) 구체예 xxvii)의 또 다른 측면에 따르면, 동물(가령, 개, 고양이, 돼지, 소 또는 말)에서 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 선택된 세균에의해 야기되는 장 질환을 예방하는 방법에 관한 것인데, 이 방법은 구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 이들 화합물의 약학적으로 수용가능한 염의 효과량을 장질환을 예방하는데 충분한 시간동안 환자에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 구체예 i) 내지 xxix)에 따라 예방 또는 치료될 장질환은 특히, 설사, 대장염, 가막성대장염을 포함한다. 바람직하게는, 이와 같은 장 질환은 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) (특히, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)의 독소 생산 균주에 의해)에 의해 야기되는 것일 것이다.

본 발명의 구체예 i) 내지 xxix)에 따라 이용된 화학식 I의 화합물의 가장 적합한 투여 경로는 경구 경로일 것이다. 투여는 매일(가령, 하루에 1회 내지 4회) 투여될 수 있거나 또는 좀더 덜 빈번하게(가령, 2일에 한번 또는 일주일에 한번 또는 두 번) 투여될 수도 있다.

구체예 i) 내지 vii)중 하나에서 정의된 바와 같은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염의 정확한 투약은 의사 또는 수의사에 의해 결정될 수 있지만, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약리학적으로 수용가능한 염은 일일 환자 체중 kg당 0.5 내지 50 mg(예를 들면, 화학식 I의 화합물 또는 이의 약리학적으로 수용가능한 염은 일일 환자 체중 kg당 1 내지 5 mg)이 3일 내지 15일(가령, 7일 내지 14일 동안) 하루에 한 번 또는 두 번 투여되는 것이 바람직할 것이다.

구체예 i) 내지 vii) 중 하나에서 정의된 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염을 포함하는 약학 조성물의 생산은 당업자에 친숙한 방법으로 얻을 수 있는데(참고, 예를 들면, Remington , The Science and Practice of Pharmacy, 21 st Edition (2005), Part 5, " Pharmaceutical Manufacturing " [ published by Lippincott Williams & Wilkins]) 예를 들면, 설명된 화학식 I의 화합물 또는 이의 약리학적으로 수용가능한 염과, 선택적으로 다른 치료요법적으로 가치있는 물질과 복합하여, 적절한 비-독성, 비활성, 치료요법적으로 양립가능한 고형 또는 액상형 캐리어 물질화, 필요에 따라 통상의 약리학적으로 어주번트와 함께 생약투약형으로 만들어진다.

화학식 I의 화합물들은 본 발명에 따른 하기에서 설명된 과정에 따라 제조될 수 있다.

화학식 I의 화합물의 제조

약어:

다음의 약어들은 명세서 및 실시예를 통하여 사용된다:

AcOH 아세트산

AD-mix α 1,4-비스(디하이드로퀴닌)프탈라진, K₃Fe(CN)₆, K₂CO₃ 및

K₂OsO₄.2H₂O

AD-mix β l,4-비스(디하이드로퀴니딘)프탈라진, K₃Fe(CN)₆, K₂CO₃ 및

K₂OsO₄.2H₂O

Alloc 알릴옥시카르보닐

aq. 수용성

Boc tert-부톡시카르보닐

t-BuOK tert-부틸레이트 칼륨

Cbz 벤질옥시카르보닐

CDAD 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) 관련된 설사

CFU 콜로니 형성 단위

CLSI Clinical Laboratory Standards Institute

DBU l,8-디아자바이사이클로[5.4.0]운데-7-엔

DCM 디클로로메탄

DIAD 디이소프로필 아조디카르복실레이트

DIPEA N, N-디이소프로필에틸아민

DMF N, N-디메틸포름아미드

DMSO 디메틸술폭시드

EA 에틸 아세테이트

EDC 1-(디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드

하이드로클로라이드

ESI 전자 분무 이온화

에테르(Et₂O) 디에틸 에테르

FC 섬광 크로마토그래피

h 시간

Hex n-헥산

IC50 효과를 50% 감소시키는 농도

LZD-R 리네졸리드-저항성

MeCN 아세토니트릴

MCPBA 메타-클로로퍼벤조산

MIC 세균 생장을 저해시키기 위한 최저 저해 농도

MIC90 균주의 90%이상의 생장을 저해시키기 위한 최저 저해 농도

MRSA 메티실린 저항성 스타필로코커스 아우레우스

MeOH 메탄올

MS 질량 분광학

NaOMe 메틸레이트 나트륨

NMP N-메틸피롤리디논

OD595 595 nM에서 측정된 광학 밀도

org. 유기

Pd/C 또는 Pd(OH)₂/C 팔라디움 또는 목탄상에 디하이드록시팔라디움

PPh₃ 트리페닐포스핀

rt 실온

sat. 포화된

SiO₂ 실리카 겔

TBDMSCl tert-부틸디메틸실일 클로라이드

TEA 트리에틸아민

TFA 트리플로오르아세트산

THF 테트라하이드로푸란

TMSCl 트리메틸실일 클로라이드

전반적인 제법:

화학식 I의 화합물은

a) 하기 화학식 II의 화합물과 하기 화학식 III의 화합물을 유기 용매(가령, DMF)에서 K₂CO₃ 와 같은 무기 염기 또는 TEA와 같은 유기 염기 존재하에서, 약 10℃ 내지 100℃(좀더 바람직하게는 약 40℃ 내지 80℃) 범위에서 반응시키고;

이때, n 과 A는 화학식 I에서 정의된 바와 같고, R¹은 (C₁-C₃)알킬술포닐 (예를 들면, 메틸술포닐), 트리플로오르메틸술포닐 또는 아릴술포닐 (가령, 페닐- 또는 p-톨일 술포닐)이다;

또는

b) 상기 화학식 II의 화합물과 하기 화학식 IV의 화합물을 반응시키고, 이때, 화학식 IV의 화합물은 유기 용매(가령, DMF)에서 무기 염기(K₂CO₃ 와 같은 MaOMe와 같은 알칼리 메틸레이트 또는 NaH와 같은 알칼리 하이드리드) 또는 TEA와 같은 유기 염기 존재하에서, 화학식 III의 화합물로 처리하여 수득될 수 있다;

또는

c) 하기 화학식 V의 화합물과 하기 화학식 VI의 화합물을 유기 용매(가령, NMP)에서 TEA 또는 DIPEA와 같은 유기 염기 존재하에서, 약 10℃ 내지 100℃, 좀더 바람직하게는 약 40℃ 내지 80℃) 범위에서 반응시키고;

이때, A는 화학식 I에서 정의된 바와 같고, Y는 할로겐이며, 그리고 R² 은 수소, BF₂ 또는 B(OC(=O)(C₁-C₄)알킬)₂, (C₁-C₅)알킬 (가령, 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필 또는 tert-부틸), 알릴, 아릴-(C₁-C₅)알킬 (가령, 벤질, p-니트로벤질 또는 p-메톡시벤질), 트리-(C₁-C₅)알킬실일 (가령, 트리메틸실일 또는 tert-부틸디메틸실일) 또는 디아릴-(C₁-C₅)알킬실일 (가령, tert-부틸디페닐실일)이다; .

또는

d) 가수분해, 비누화반응 또는 수소화분해(hydrogenolysis) 반응(예를 들면, Protecting groups , Kocienski, P.J., Thieme (1994)을 참고)을 통하여 첨가반응 화학식 VII의 화합물을 이에 상응하는 화학식 I의 화합물로 전환시켜, 제조될 수 있다

이때, R³ 는 (C₁-C₅)알킬 (가령, 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필 또는 tert-부틸), 아릴-(C₁-C₅)알킬 (가령, 벤질, p-니트로벤질 또는 p-메톡시벤질), 알릴, 트리-(C₁-C₅)알킬실일 (가령, 트리메틸실일 또는 tert-부틸디메틸실일) 또는 디아릴-(C₁-C₅)알킬실일 (가령, tert-부틸디페닐실일)이며, n 및 A는 화학식 I에서 정의된 바와 같다.

상기 공정에 관련하여, 다음과 같은 내용이 명시되어야 한다:

● 변이체 a)에 대하여, 화학식 III의 화합물은 이의 에스테르, 예를 들면, 화학식 III_E의 화합물로 대체될 수 있을 것이다

이때, n, A 및 R¹ 은 화학식 III에서 정의된 바와 같고, 그리고 R⁴는 알킬, 알릴 또는 아릴알킬을 나타내는데, 화학식 III_E의화합물과 화학식 II의 화합물 반응후 에스테르 탈보호 단계가 이어질 수 있다(에스테르 탈보호단계를 실시하는 일반적 방법은 Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994)을 참고한다);

● 변이체 a)에 있어서, 화학식 II의 화합물은 이의 실일 에테르 가령, 화학식 II_PG의 화합물로 대체될 수 있다

이때, PG² 는 트리-(C₁-C₅)알킬실일 (가령, 트리메틸실일 또는 tert-부틸디메틸실일) 또는 디아릴-(C₁-C₅)알킬실일 (가령, tert-부틸디페닐실일)과 같은 알코올 기능의 실일 보호기를 나타내며, 탈보호 단계는 화학식 III 또는 III_E의 화합물과 화학식 II_PG의 화합물의 반응후에 일어난다(이와 같은 방법을 실시하기 위한 일반적 방법은 Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994)을 참고로 한다);

● 변이체 c)에 대해, 화학식 V의 화합물은 화학식 Vp의 화합물로 대체될 수 있는데;

이때, n은 화학식 V에서 정의된 바와 같고, PG² 는 알킬실일 또는 디아릴알킬실일 기 가령, 트리메틸실일, tert-부틸디메틸실일 또는 tert-부틸디페닐실일과 같은 알코올 기능의 실일 보호기를 나타내며, 적절한 탈보호 단계는 화학식 Vp 또는 III_E의 화합물과 화학식 VI의 화합물의 반응후에 일어난다(이와 같은 방법을 실시하기 위한 일반적 방법은 Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994)을 참고로 한다);

● 변이체 c)에 대해, 이때 R²가 H가 아닌 경우, 단, 가수분해는 산성 작업하는 동안 이미 일어나는 R² 가 BF₂ 또는B(OC(=O)(C₁-C₄)알킬)₂ 인 경우를 제외하고, 추가적인 에스테르 탈보호단계가 요구된다(이와 같은 방법을 실시하기 위한 일반적 방법은 Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994)을 참고로 한다).

따라서, 수득된 화학식 I의 화합물은 필요한 경우, 이의 염, 특히 약리학적으로 수용가능한 염으로 전환될 수도 있다.

게다가, 화학식 I의 화합물이 거울상체 혼합물의 형태로 수득되는 경우, 거울상체는 당업자에 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다(예를 들면, 부분이성질체의 형성 및 분리에 의해 또는 키랄 정지상에서 크로마토그래피에 의해). 화학식 I의 화합물이 부분이성질체 혼합물의 형태로 수득되면, 이들은 실리카겔 크로마토그래피, HPLC 및 결정화 기술의 적절한 복합에 의해 분리될 수 있다.

다양한 합성 중간생성물의 제조

화학식 II 의 화합물의 제조

화학식 II의 화합물은 AcOH와 같은 용매에서, 0℃ 내지 80℃사이에서, 물 또는 AcOH내에 HBr 용액 존재하에 가수분해, 또는 0℃ 내지 40℃ 범위에서 THF, MeOH 또는 EA와 같은 용매내에서 팔라디움 또는 목탄상에 플라티늄과 같은 귀금속 촉매상에서 화학식 VIII의 화합물의 수소첨가반응에 의해 수득될 수 있다.

화학식 III 의 화합물의 제조

화학식 III의 화합물은 아래 과정 1에 요약된 바와 같이 준비될 수 있다.

과정 1

과정 1에서, R² 는 H, 알킬, 알릴 또는 아릴알킬이며, 기타 다른 기호들은 이전과 동일하다.

화학식 III의 화합물(이때, R¹는 SO₂R⁵이며, R⁵는 알킬, 트리플로오르메틸 또는 페닐 또는 p-톨일과 같은 아릴임)은 화학식 III_A 의 화합물(이때, R¹ 는 H임)로부터 -10℃ 내지 50℃ 사이에서 DCM 또는 THF와 같은 용매내에서 TEA와 같은 유기 염기 존재하에 술포닐 클로라이드와 반응에 의해 수득될 수 있다(과정 1). 화학식 III_A의 화합물은 THF, DMF 또는 NMP와 같은 용매내에서 40℃ 내지 100℃ 사이에서 TEA 또는 DIPEA와 같은 유기 염기 존재하에 화학식 IX의 피페리딘 또는 피롤리딘과 화학식 VI의 화합물의 반응에 의해 준비될 수 있다. R² 가 벤질이라면, 화학식 IIIs의 카르복실산은 Protecting groups , Kocienski , P.J., Thieme (1994) (가령, Pd/C상에서 수소첨가반응)에서 설명된 것과 같은 표준 과정에 따라 유리될 수 있다.

화학식 V의 화합물의 준비

화학식 V의 화합물은 하기 과정 2에서 요약된 바와 같이 준비될 수 있다.

과정 2

화학식 V의 화합물은 화학식 XI의 화합물(이때, PG³은 알콕시카르보닐과 같은 아미노 보호기(가령, Boc), 벤질옥시카르보닐(가령, Cbz), Alloc 또는 벤질을 나타냄)의 탈보호에 의해 수득될 수 있다. 이와 같은 2차 아민의 보호/탈보호 연속과정을 실행하는 일반적인 방법은 Protecting groups, Kocienski, P. J., Thieme (1994)을 참고한다.

화학식 XI의 화합물은 화학식 II의 화합물과 화합물 X(이때 R¹ 는 SO₂R⁵이며, R⁵ 는 알킬, 트리플로오르메틸 또는 페닐 또는 p-톨일과 같은 아릴임)의 반응에 의해 수득되거나, 또는 화학식 II의 화합물과 화학식 X의 화합물로부터 유도된 상응하는 에폭시드와의 반응에 의해 수득될 수 있다. 상기 에폭시드는 -10℃ 내지 40℃ 사이에서 THF, 에테르 또는 DCM과 같은 용매내에서 K₂CO₃ 와 같은 무기 염기 또는 TEA, 피리딘 또는 DBU와 같은 유기 염기로 처리하면 화학식X의 화합물(이때 R¹ 은 SO₂R⁵ 임)로부터 수득될 수 있다. 화학식 X의 화합물(이때 R¹ 는 H임)은 상업적으로 이용가능하거나(예를 들면, 화합물 X, 이때 PG³ = Boc, n = 1 및 R¹ = H, 또는 화학식 X의 화합물(PG³ = Boc, n = 0)로부터 유도된 에폭시드), 또는 나중에 설명되는 것과 같이 만들어질 수도 있다. 대안으로, 화학식 XI의 화합물은 Mitsunobu 조건하에서 화학식 II의 화합물과 화학식 X의 화합물(이때, R¹는 H 임)의 반응에 의해 수득될 수 있다.

화학식 VI 의 화합물의 준비

화학식 VI의 화합물(이때 R²는 수소, Me 또는 Et임)은 시판되는 것이다(예를 들면, 화합물(이때 A = CH, Y = Cl 및 R²= H, Me 또는 Et, 또는 Y = F 및 R²= BF₂임) 또는 화합물(이때 A = N, Y = Cl 및 R² = H 또는 Et임). 화학식 VI의 화합물(이때, R² 는 B(OC(=O)(C₁-C₄)알킬)₂ 임)은 WO 88/07998에 따라, 화학식 VI(이때 R² 는 H이다)으로부터 수득될 수 있다. 화학식 VI의 다른 화합물들은 표준 방법에 따라, 화학식 VI의 화합물(이때 R²는 H이다)로부터 수득될 수도 있다.

화학식 VII 의 화합물의 준비

화학식 VII의 화합물은 화학식 V의 화합물과 화학식 VI의 화합물의 반응에서 설명된 것과 동일한 조건하에, 화학식 V의 화합물 또는 대안으로, 화학식 Vp의 화합물(이전에 정의된 것과 같은)을 화학식 VI의 화합물과 커플링시킴으로써, 수득될 수 있을 것이고, 이때 화합물 VI의 화합물은 이전에 정의된 것과 같지만, 단, R²는 (C₁-C₅)알킬 (가령, 메틸, 에틸, n-프로필, iso-프로필 또는 tert-부틸), 아릴-(C₁-C₅)알킬 (가령, 벤질, p-니트로벤질 또는 p-메톡시벤질), 알릴, 트리-(C₁-C₅)알킬실일 (가령, 트리메틸실일 또는 tert-부틸디메틸실일) 또는 디아릴-(C₁-C₅)알킬실일 (가령, tert-부틸디페닐실일)을 나타낸다. 화학식 Vp의 화합물이 이용된다면, 탈보호 단계는 커플링 반응후에 실시될 수 있을 것이다.

화학식 VIII 의 화합물의 준비

화학식 VIII의 화합물은 WO 2004/096221에 따라 준비될 수 있다.

화학식 IX 의 화합물의 준비

화학식 IX의 화합물은 화학식 X (R¹ = H)의 화합물의 탈보호반응, 가령, 상응하는 Boc 보호된 화합물을 TFA로 처리하거나 또는 Pd/C상에서 상응하는 Cbz 보호된 화합물의 수소화반응에 의해 수득될 수 있을 것이다.

화학식 X의 화합물의 준비

화학식 X의 화합물은 하기 과정 3에서 요약된 바와 같이, 화학식 XII의 메틸리덴 유도체로부터 만들어질 수 있을 것이다.

과정 3

화학식 Xb의 화합물, 가령, 화학식 X(이때 R¹ 은 SO₂R⁵이다)의 화합물은 화학식 Xa(이때, R¹는 H이다)의 화합물로부터 화학식 III_A의 화합물을 화학식 IIIs의 화합물로 전환시킬 때 이용된 것과 동일한 방법을 이용하여 준비된다. 화학식 Xa의 화합물은 화학식 XII의 공지의 메틸리딘 유도체 (가령, n = O 그리고 PG³ = 벤질, Boc 또는 벤질옥시카르보닐인 화합물 - EP 241206 및 EP 550025 참고; 또는 n = l 그리고 PG³ = 벤질, Boc 인 화합물은 시판된다)로부터 수득되거나, 또는 오스뮴 테트라옥시드 촉매화된 cis-디하이드로실화반응에 의해 또는 비대칭 버젼(AD-mix α 또는 β를 이용한 샤프리스 이수산화반응)(J. Am. Chem. Soc. (1988), 110, 1968)에 의해 수득될 수 있다. 화학식 Xc의 화합물, 가령, 화학식 Xb의 화합물들로부터 유도된 에폭시드는 화학식 Xb의 화합물들을 K₂CO₃ 또는 NaH와 같은 무기 염기 또는 TEA 또는 DBU와 같은 유기 염기로 분자내 고리 닫음에 의해 수득되거나, 또는 MCPBA와 같은 과산으로 화학식 XII의 화합물의 메틸리덴 이중 결합의 에폭시드화반응에 의해 수득될 수 있다. 대안으로, 화학식 Xc의 화합물은 20℃ 내지 100℃ 사이에서 MeCN과 같은 극성 용매내에서 수산화칼륨과 같은 알칼리 수산화물 존재하에 대응하는 옥소 유도체 (n = 0 또는 1 그리고 PG³ = Cbz 또는 Boc인 경우, 시판됨)와 트리메틸술포옥소니움 요오드화물 또는 트리메틸술포니움 요오드화물과 반응되어 수득될 수 있다(J. Am. Chem. Soc. (1965), 87, 1353-1364 and Tetrahedron Lett. (1987), 28, 1877-1878).

다음의 실시예는 본 발명의 특정 구체예를 설명하는 것이며, 이는 어떠한 방식으로던 제한시킴없이 본 발명을 더 자세하게 설명한다.

실시예

모든 온도는 ℃로 나타낸다. 비-키랄 상에서 모든 분석학적 그리고 예비 HPLC 조사는 RP-C 18 계 컬럼을 이용하여 실시된다. 분석학적 HPLC 조사는 각각 ~2.5 분 및 ~3.5 분의 사이클-타임으로 두 가지 상이한 기구로 실행된다. 다른 명시가 되지 않는 한, MS에 나타낸 수치는 메인 피크 ((M+H)+ 그리고 +/- 0.5 단위)의 변이에 상응한다. NMR 스펙트럼에서, 커플링 상수 J는 Hz로 제공된다.

표준 작업 과정

적절한 org. 용매 (대응 실시예 참고)에서 희석시킨 후, org. 상이 분리되고, 물과 소금물로 연속하여 세척된다. 반응이 수용성 용매(가령, MeOH, THF 또는 DMF)에서 실행되는 경우, 복합된 aq. 층들은 작업을 실행하는데 이용된 것과 동일한 용매로 역-세척된다. 복합된 org. 상들은 MgSO₄ 상에서 건조되고, 여과되었다. 여과물은 감압하에서 기화된다.

표준 크로마토그래피 과정:

정제안된 물질은 최소 용리액(대응 실시예 참고)에 용해되고, SiO₂상에서 크로마토그래피된다. 관련 분획물을 모으고, 감압하에서 기화되었다.

실시예 1: l- 사이클로프로필 -6- 플로오르 -7-{4-[2- 플로오르 -4-(( R )-5- 하이드 록시메틸-2-옥소- 옥사졸리딘 -3-일)- 페녹시메틸 ]-4- 하이드록시 -피페리딘-l-일}-4-옥소-l,4- 디하이드로 - 퀴노린 -3- 카르복실산 :

1.i. (R)-3-(3- 플로오르 -4- 하이드록시 - 페닐 )-5- 하이드록시메틸 - 옥사졸리딘 -2-온:

(R)-3-(4-벤질옥시-3-플로오르-페닐)-5-하이드록시메틸-옥사졸리딘-2-온(6.34 g, WO 2004/096221에 따라 준비됨)의 THF/MeOH (1:1; 200 ml) 용액은 하룻밤동안 Pd/C 10% (1 g) 상에서 수소첨가되었다. 촉매은 여과로 걸러내고, 여과물은 감압하에서 기화되었고, 잔유물은 EA내에서 교반되었다. 결정은 여과로 수득되었고, 무색의 고체 3.16 g (70% 산출율)이 제공되었다.

¹H NMR (DMSO_d6; δ ppm): 3.5 (m, 1H), 3.64 (m, 1H), 3.74 (dd, J = 8.8, 6.4, 1H), 3.99 (t, J = 8.8, 1H), 4.64 (m, 1H), 5.16 (t, J = 5.6, 1H), 6.93 (dd, J = 9.7, 8.8, 1H), 7.08 (ddd, J = 8.8, 2.6, 1.2, 1H), 7.45 (dd, J = 13.5, 2.6, 1H), 9.66 (s, 1H). MS (ESI): 228.1.

1. ii . 4-[2- 플로오르 -4-((R)-5- 하이드록시메틸 -2-옥소- 옥사졸리딘 -3- 일 )- 페녹시메틸 ]-4- 하이드록시 -피페리딘-l- 카르복실산 벤질 에스테르:

중간생성물 l.i (1.27 g) 및 l-옥사-6-아자-스피로[2.5]옥탄-6-카르복실산 벤질 에스테르 (1.60 g; US 4244961에 따라 준비됨)의 용액을 DMF (15 ml)에 용해시키고, Na₂CO₃ (1.16 g)으로 처리하였다. 혼합물은 100℃에서 하룻밤동안 가열되었다. 작업후 수득된 잔유물(DCM)은 EA내에서 교반되었고, 고체는 여과를 통하여 수거되었고, EA 및 Hex으로 연속하여 세척되어, 2.52 g (94.5% 산출율)의 베이지색 고체가 수득되었다.

¹H NMR (DMSO_d6; δ ppm): 1.57 (m, 4H), 3.14 (m, 2H), 3.54 (m, 1H), 3.64 (m, 1H), 3.79 (m, 5 H), 4.03 (t, J = 9.1, 1 H), 4.66 (m, 1 H), 4.78 (s, 1 H), 5.05 (s, 2 H), 5.16 (t,J = 5.6, 1 H), 7.18 (m, 2 H), 7.32 (m, 5 H), 7.55 (d, J = 12, 1 H).

MS (ESI): 475.0.

1. iii . (R)-3-[3- 플로오르 -4-(4- 하이드록시 -피페리딘-4- 일메톡시 )- 페닐 ]-5- 하이드록시메틸 - 옥사졸리딘 -2-온:

중간생성물 l. ii (2.5 g)의 EA/MeOH (1:1; 100 ml) 현탁액은 48시간 동안 Pd/C 상에서 수소첨가되었다. 현탁액은 40℃에서 가열되었고, 촉매는 여과에 의해 걸러졌다. 여과물은 감압하에서 기화되어, 황색 분말 1.61 g (89% 산출율)이 수득되었다.

¹H NMR (DMSO_d6; δ ppm): 1.4-1.63 (m, 4H), 2.67 (m, 2H), 2.83 (m, 2H), 3.53 (dd, J = 4.0, 12.0, 1H); 3.66 (dd, J = 3.3, 12.0, 1H), 3.71 (s, 2H); 3.80 (m, 1H), 4.05 (t, J = 9.0,1H), 4.48 (s, 1H), 4.68 (m, 1H), 5.20 (s, 1H), 7.20 (m, 2H), 7.57 (d, 1H).

MS (ESI): 341.5.

l. iv . l- 사이클로프로필 -6- 플로오르 -7-{4-[2- 플로오르 -4-((R)-5- 하이드록시메틸 -2-옥소- 옥사졸리딘 -3-일)-페녹시메틸]-4- 하이드록시 -피페리딘-l- 일 }-4-옥소-l,4- 디하이드로 - 퀴노린 -3- 카르복실산:

중간생성물 l. iii (200 mg), 7-클로로-l-사이클로프로필-6-플로오르-l,4-디하이드로-4-옥소-3-퀴노린카르복실산 붕소 디아세테이트 복합물(241 mg; WO 88/07998에 따라 준비됨) 및 DIPEA (100 μl)의 NMP (2 ml) 용액은 5시간 동안 85℃에서 교반되었다. 반응 혼합물은 감압하에서 기화되었고, 잔유물은 MeOH (3 ml)내에서 5M HCl로 취하였고, 교반되었다. 생성된 고체는 여과를 통하여 수거되었으며, MeOH 으로 세척되어, 230 mg (67% 산출율)의 황색 고체가 수득되었다.

¹H NMR (DMSO_d6; δ ppm): 1.66-1.35 (m, 4H), 1.75 (d, J = 12.8, 2H), 1.95 (m, 2H), 3.33 (t broad, J = 11.0, 2H), 3.57 (m, 3H), 3.67 (dd, J = 12.3, 3.3, 1H), 3.83 (m, 2H), 3.92 (s, 2H), 4.06 (t, J = 9.0, 1H), 4.69 (m, 1H), 7.24 (m, 2H), 7.60 (m, 2H), 7.90 (d, J = 13.3, 1H), 8.66 (s, 1H). MS (ESI): 585.9.

실시예 2: l- 사이클로프로필 -6- 플로오르 -7-{4-[2- 플로오르 -4-(( R )-5- 하이드록시메틸 -2-옥소- 옥사졸리딘 -3- 일 )- 페녹시메틸 ]-4- 하이드록시 -피페리딘-l- 일 }-4-옥소-l,4- 디하이드로 -[l,8] 나프티리딘 -3-카르복실산:

7-클로로-l-사이클로프로필-6-플로오르-l,4-디하이드로-4-옥소-l,8-나프티리딘-3-카르복실산 (166 mg; 시판) 및 중간생성물 l. iii (200 mg)의 NMP (5 ml) 용액은 TEA (0.32 ml) 및 TMSCl으로 처리되었고, 5시간 동안 85℃에서 가열되었다. 반응 혼합물은 감압하에서 기화되었고, 잔유물은 MeOH (3 ml)내 5M HCl로 취입되었고, 30분간 교반되었다. 용액은 감압하에서 기화되었고, 잔유물은 EA에서 취입되었다. 생성된 고체는 여과를 통하여 수거되었고, EA로 세척되어, 271 mg (78% 산출율)의 황색 고체가 수득되었다.

¹H NMR (DMSO_d6; δ ppm): 0.89-1.27 (m, 4H); 1.78 (d, J = 12.8, 2H); 1.90-2.04 (m, 2H); 3.53-3.88 (m, 6H); 3.88 (s, 2H), 4.06 (t, J = 9.0, 1H), 4.42 (d broad, J = 13.2, 2H), 4.44 (m, 1H); 7.11 (m, 2H); 7.55 (d, J = 14.5, 1H); 8.05 (d, J = 13.5, 1H); 8.60 (s, 1H). MS (ESI): 586.8.

실시예 3: l- 사이클로프로필 -6- 플로오르 -7-{( RS )-3-[2- 플로오르 -4-(( R )-5- 하이드록시메틸 -2-옥소-옥사졸리딘-3- 일 )- 페녹시메틸 ]-3- 하이드록시 - 피롤리딘 -l- 일 }-4-옥소-l,4- 디하이드로 - 퀴노린 -3- 카르복실산:

3.i. 디알릴 - 카르밤산 벤질 에스테르:

벤조일 클로라이드 (15.5 ml)는 0℃에서 30분간에 걸쳐 디알릴아민 (12.3 ml) 및 TEA (21 ml)의 DCM (100 ml) 용액에 점적되었다. 반응 혼합물은 16시간 동안 실온에서 교반되었다. 작업(DCM)후에 수득된 잔유물은 크로마토그래피 (Hex/EA 95:5)에 의해 정제되어, 무색 액체 20.71 g (88% 산출율)가 수득되었다.

¹H NMR (DMSO_d6; δ ppm): 3.83 (dt, J = I and J = 6, 4H); 5.05-5.18 (m, 6H); 5.70-5.86 (m, 2H); 7.27-7.48 (m, 5H).

3. ii . 2, 5- 디하이드로 -피롤-l- 카르복실산 벤질 에스테르:

벤질리덴-비스(트리사이클헥실포스핀)디클로로루테늄(5 g)은 질소에서, 실온에서, 중간생성물 3.i (17.56 g)의 DCM (1.5ℓ) 용액에 첨가되었다. 반응 혼합물은 2시간 동안 40℃에서 교반되었고, 진공에서 농축되었다. 잔유물은 FC (Hex/EA 90:10)에 의해 정제되어, 14.08 g (91% 산출율)의 황색 액체가 수득되었다.

¹H NMR (DMSO_d6; δ ppm): 4.05-4.16 (m, 4H); 5.08 (s, 2H); 5.81-5.92 (m, 2H); 7.27-7.41 (m, 5H).

3. iii . ( RS )-3- 하이드록시 - 피롤리딘 -l- 카르복실산 벤질 에스테르:

보란의 THF (9 ml) 1M 용액은 중간생성물 3. ii (1.81 g)의 THF (25 ml) 용액에 질소하에, 0℃에서 첨가되었다. 반응 혼합물은 실온에서 16시간 동안 교반되었고, 0℃로 냉각되었다. 20% NaOH (1.8 ml)가 조심스레 점적된 후, 이어서 35% aq. 과산화수소(1.2 ml)가 첨가되었다. 혼합물은 30분간 0℃에서 30분간 교반되었고, 실온에서 2시간동안 교반되었다. Et₂O 및 aq. 40% 중아황산나트륨 용액이 첨가되었고, 반응 혼합물은 15분간 왕성하게 교반되었다. 작업후(Et₂O)에 수득된 잔유물은 FC (Hex/EA 5 :5 내지 3 :7)에 의해 정제되어, 1.01 g (51 % 산출율)의 무색 오일이 수득되었다.

¹H NMR (DMSO_d6; δ ppm): 1.67-1.82 (m, 1H); 1.82-1.96 (m, 1H); 3.16-3.25 (m, 1H); 3.28-3.44 (m, 3H); 4.20-4.29 (broad, 1H); 4.92 (d, J = 3, 1H); 5.06 (s, 2H); 7.27-7.41 (m, 5H).

3. iv . 3-옥소- 피롤리딘 -l- 카르복실산 벤질 에스테르:

중간생성물 3. iii (1.10 g)의 DCM (8 ml) 용액은 0℃로 냉각되고, DIPEA (2.5 ml)가 점적된 후, 삼산화황 피리딘 복합체(1.79 g)의 DMSO (6.5 ml) 용액이 첨가되었다. 반응 혼합물은 1시간 동안 0℃에서 교반되었고, 물(6 ml)이 첨가되어 진정되었다. aq. 층은 Et₂OZHeX (1 :1, 3 x 5 ml)으로 추출되었고, 복합된 org. 층들은 진공에서 농축되었다. 작업(Et₂O/Hex 1:1)후에 수득된 잔유물은 FC (Hex/EA 5:5)에 의해 정제되어, 1.05 g (96% 산출율)의 황색을 띈 오일이 수득되었다.

¹H NMR (DMSO_d6; δ ppm): 2.48-2.61 (m, 2H); 3.61-3.80 (m, 4H); 5.09 (s, 2H); 7.27-7.41 (m, 5H).

3. v. 3-메틸렌- 피롤리딘 -1- 카르복실산 벤질 에스테르:

t-BuOK (617 mg)은 질소하에 실온에서, 메틸 트리페닐포스포니움 브롬화물(1.98 g)의 THF (10 ml) 현탁액에 부분적으로 첨가되었다. 황색 현탁액은 실온에서 1시간 동안 교반되었고, 그리고 -10℃로 냉각되었다. 중간생성물 3. iv (1.05 g) 의 THF (2 ml) 용액이 10분간에 걸쳐 점적되었고, 반응 혼합물은 2시간동안 실온이 되도록 하였다. sat. aq. NH4Cl (1 ml)이 첨가되어 반응이 진정되었고, EA로 희석되었다. 작업(EA)후 수득된 잔유물은 크로마토그래피(Hex/EA 90:10)에 의해 정제되어, 633 mg (64% 산출율)의 황색을 띈 액체가 제공되었다.

¹H NMR (DMSO_d6; δ ppm): 2.48-2.61 (m, 2H); 3.36-3.53 (m, 2H); 3.84-4.01 (m, 2H); 4.97-5.03 (m, 2H); 5.08 (s, 2H); 7.27-7.41 (m, 5H).

3. vi . l-옥사-5- 아자 - 스피로[2.4]헵탄 -5- 카르복실산 벤질 에스테르:

중간생성물 3.v (7.21 g)의 DCM (400 ml) 용액은 실온에서 MCPBA (20.1 g) 및 NaHCO₃ (22.3 g)으로 처리되었다. 반응물은 실온에서 2시간 동안 교반되었고, DCM (200 ml)으로 희석되었고, 그리고 Na₂SO₃ (45 g)의 수용액(400 ml)에 부었다. 혼합물은 10분간 교반되었고, org. 층은 분리되었다. 작업후(DCM) 수득된 잔유물은 FC (Hex/EA 6:4)에 의해 정제되어, 4.37 g (56% 산출율)의 황색 오일이 수득되었다.

¹H NMR (DMSO_d6; δ ppm): 1.70-1.83 (m, 1H); 2.22-2.37 (m, 1H); 2.90-2.94 (m, 1H); 2.95-2.99 (m, 1H); 3.15 (t, J = 11, 1H); 3.39-3.77 (m, 3H); 5.09 (s, 2H); 7.27-7.41 (m, 5H).

3. vii . ( RS )-3-[2- 플로오르 -4-((R)-5- 하이드록시메틸 -2-옥소- 옥사졸리딘 -3- 일 )- 페녹시메틸 ]-3- 하이드록시 - 피롤리딘 -1- 카르복실산 벤질 에스테르:

K₂CO₃ (274 mg)는 중간생성물 l.i (300 mg) 및 중간생성물 3. vi (338 mg)의 DMF (3 ml) 현탁액에 첨가되었다. 반응 혼합물은 80℃에서 3시간 동안 교반되었고, 용매는 진공에서 제거되었다. 작업후(DCM) 수득된 잔유물은 FC (DCM/MeOH 95:5)에 의해 정제되어, 531 mg (87% 산출율)의 베이지색 포말이 수득되었다.

¹H NMR (DMSO_d6; δ ppm): 1.80-1.92 (m, 1H); 1.96-2.08 (m, 1H); 3.32-3.59 (m, 5H); 3.66 (ddd, J = 3, J = 6 and J = 13, 1H); 3.80 (dd, J = 6 and J = 9, 1H); 3.97-4.09 (m, 3H); 4.64-4.72 (m, 1H); 5.07 (s, 2H); 5.19 (t, J = 6, 1H); 5.23 (s, 1H); 7.18-7.23 (m, 2H); 7.27-7.38 (m, 5H); 7.57 (dd, J = 2 and J = 14, 1H). MS (ESI): 460.9.

3. viii . (R)-3-[3- 플로오르 -4-(( RS )-3- 하이드록시 - 피롤리딘 -3- 일메톡시 )- 페닐 ]-5- 하이드록시메틸 -옥사졸리딘-2-온:

중간생성물 3. vii (259 mg)의 THF/MeOH (1:1; 20 ml) 용액은 실온에서 20시간 동안 10% Pd/C (60 mg)상에서 수소첨가되었다. 반응 혼합물은 진공에서 농축되었고, DCM/MeOH 90:10 (20 ml)에서 취입되었고, 실온에서 30분간 교반되었다. 촉매는 여과로 걸러내었고, 여과물은 진공에서 농축되어, 184 mg (100% 산출율)의 오렌지색 포말이 수득되었다.

MS (ESI): 327.3.

3. ix . l- 사이클로프로필 -6- 플로오르 -7-{( RS )-3-[2- 플로오르 -4-((R)-5- 하이드록시메틸 -2-옥소- 옥사졸리딘 -3- 일 )- 페녹시메틸 ]-3- 하이드록시 - 피롤리딘 -1- 일 } -4-옥소-l,4- 디하이드로 - 퀴노린 -3- 카르복실산:

중간생성물 3. viii (226 mg) 및 7-클로로-l-사이클로프로필-6-플로오르- l,4-디하이드로-4-옥소-3-퀴노린카르복실산 보론 디아세테이트 복합물(270 mg; WO 88/07998에 따라 준비됨)의 NMP (5 ml) 용액은 DIPEA (120 μl)으로 처리되고, 60℃에서 2시간 동안 교반되었다. 반응 혼합물은 진공에서 농축되었고, 잔유물은 MeOH (2 ml)내에 5M HCl에서 취입되었다. 용액은 실온에서 1시간 동안 교반되었고, 진공에서 농축되었고, 잔유물은 FC (DCM/MeOH/AcOH 95:4:1 내지 90:9:1)에 의해 정제되었다. 포말 잔유물은 MeOH (2 ml)내에 취입되었고, 1시간 동안 교반되었고, 여과되었다. 결정이 수거되었고, 진공에서 건조되어, 23 mg (6% 산출율)의 베이지색 고체가 수득되었다.

¹H NMR(DMSO_d6; δ ppm): 1.10-1.34 (m, 4H); 1.98-2.10 (m, 1H); 2.14-2.26 (m, 1H); 3.48-3.70 (m, 3H); 3.71-3.89 (m, 5H); 4.05 (t, J = 9, 1H); 4.09-4.18 (m, 2H); 4.66-4.74 (m, 1H); 5.19 (t, J = 6, 1H); 5.40 (s, 1H); 7.09 (d, J = 8, 1H); 7.18-7.31 (m, 2H); 7.59 (dd, J = 2 and J = 14, 1H); 7.82 (d, J = 14, 1H); 8.59 (s, 1H); 15.52 (s, 1H). MS (ESI): 572.3.

실시예 4: 클로스트리디움 디피실 ( Clostridium difficile ) 또는 클로스트리디움 페르프링겐스( Clostridium perfringens )의 기준 균주에 대응하여 본 발명의 화합물들의 in vitro 항균 활성:

4.i. 실험 방법:

최소 저해 농도(MICs)는 브로스 미소희석 분석(a broth microdilution assay)에 의해 결정되었다. 최종 농도가 0.5 mg/L의 비타민 K₁ 및 5 mg/L 헤민이 보충된 부루셀라 브로스가 테스트 매질로 이용되었다. 간략하게 설명되면, 화합물의 원액 용액은 DMSO (5.12 mg/ml)으로 준비하고, 50% DMSO/50% H₂O에서 5 μl 범위의 2배 연속 희석액은 45 μl 보충된 부루셀라 브로스가 포함된 96-웰 미량적정 플레이트에 분배되고, 5분간 교반되었다. 접종물을 준비하기 위하여, 5% 레이크 양 혈액, 5 μg의 헤민/ml, 그리고 1 μg의 비타민 K₁/ml 이 보충된 부루셀라 한천에서 24시간 생장된 C. 디피실 콜로니는 보충된 부루셀라 브로스에 현탁되었고, 그리고 0.5 McFarland 표준에 맞는 밀로도 조정되었다. 96-웰 플레이트의 웰에 접종시키기 위하여 현탁액의 50-배 희석물 50㎕가 이용되고, 웰장 약 10⁴ 콜로니 형성 단위(CFU)가 수득되었다. 최종 DMSO 농도는 2.5%였다. 최종 농도 범위는 0.03 - 16 μg /mL였다. 플레이트는 37℃에서 48시간 동안 혐기성 조건하에서 배양되었다. 배양후, 플레이트는 OD₅₉₅ (Ultramark, Biorad Laboratories)에서 플레이트 판독기에서 판독되었다. MICs는 기준 웰과 비교하여 생장 저해가 90%를 초과되는 최저 농도에서 처음 판독되었다. 또한 판독기 거울의 도움으로 눈으로 플레이트를 점검하였고, MICs는 시각적으로 생장이 없다는 것이 확인되었다.

4. ii . 결과:

실시예 1-3의 화합물들은 C. 디피실(Clostridium difficile)의 세가지 균주 또는 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens)의 생장을 저해시키는 이들의 활성에 대해 in vitro에서 테스트되었다. 수득된 결과는 하기 표 1에 요약되었다.

테스트된 화합물	C. difficile ATCC 43596에 대한 MIC (㎍/㎖)	C. difficile ATCC 9689에 대한 MIC (㎍/㎖)	C. difficile NC 13366에 대한 MIC (㎍/㎖)	C. perfringens DSM 756에 대한 MIC (㎍/㎖)
시프로플록사신	8	8	>16	0.25
리네졸리드	8	2	1	4
실시예 1	0.125	0.125	0.06	≤0.03
실시예 2	0.06	0.125	0.03	≤0.03
실시예 3	0.25	0.5	0.25	0.125

실시예 1-3의 화합물들은 테스트된 C. difficile 및 C. perfringens의 균주에 대해 강력란 in vitro 활성을 보여주었다. 강력한 활성은 퀴놀린-저항성 과독성 균주 NC 13366에 대해서도 관측되었다. 실시예 1 및 2의 화합물은 실시예 3의 화합물보다 약간 더 활성이 높았고, 그리고 모든 실시예 화합물들은 시프로플락사신 및 리네졸리드보다 분명히 활성이 더 높았다.

실시예 5: 클로스트리디움 디피실( Clostridium difficile )의 임상 분리물 모음에 대항하여 실시예 1의 화합물의 in vitro 항균 활성:

5. i. 실험 방법:

민감성 테스트에는 형기성(MII-A6)에 대한 CLSI-추천 기준 한천 희석 방법이 이용되었다. 5% 레이크 양 혈액, 5 μg의 헤민/ml, 그리고 1 μg의 비타민 K₁/ml 이 보충된 부루셀라 한천이 테스트 배지다. 테스트 화합물들은 연속적으로 희석되어, 용융 보충된 한천에 첨가되었다. 생장 기준은 약물이 없는 플레이트 상에서 실시되었다. 테스트 하기 전, 모든 분리체는 농축된 부루셀라 한천 플레이트상에서 2회 계대되었다. 세균 콜로니는 브루셀라 브로스에 현탁되었다. Steers 복제기로 어플라이한 후 스팟당 약 10⁴-10⁵ CFU가 되는 0.5 McFarland 표준에 등가가 되도록 각 접종물을 준비하기 위하여 Viteck 비색계가 이용되었다. 플레이트는 37℃에서 48시간 동안 혐기성 조건에서 배양되었다. 최저 저해 농도 (MIC)는 약물이 없는 기준과 비교하였을 때 시각적 생장이 완전하게 저해된 농도이다. 모든 항생제가 준비되고, 기준으로 반코마이신 및 메트로니다졸과 함께 테스트되었다.

5. ii . 결과:

실시예 1의 화합물은 in vitro에서 209가지 다양한 C. difficile의 임상 분리체 모음의 생장을 저해시키는 이들의 활성에 대해 테스트되었다. 실시예 1의 화합물의 MIC90 (균주의 90% 또는 그 이상의 생장을 저해시키는 최소 저해 농도)가 0.25 μg/ml이었고, 수득된 MICs의 범위는 0.06 내지 0.5 μg/ml였다. 이 값은 반코마이신, 메트로니다졸 및 리네졸리드(차례로 MIC90값은 2μg/ml, 1μg/ml 및 8 μg/ml임)의 것보다 평균적으로 훨씬 더 활성이 있는 값이다.

실시예 6: 호기성 그램 양성 세균에 대한 본 발명의 화합물의 in vitro 항균활성

6. i. 실험 방법:

최저 저해 농도(MICs)는 Clinical Laboratory Standards Institute [CLSI, formerly NCCLS, 1997]의 지침에 따라 브로스 미소희석 분석에 의해 측정되었다. 간략하게 설명하면, 화합물의 원액은 DMSO (5.12 mg/ml)에서 준비되고, 양이온-조정된 Mueller-Hinton Broth II (CaMHB)에서 연속적으로 희석되었고, 그리고 Biomek 2000 페핏팅 로봇(Beckman Coulter)의 도움으로 미량적정 플레이트에 분배되었다. 최종 DMSO 농도는 2.5% 또는 그 미만이다. 일반적으로 3-6 x lO⁵ CFU/ml의 농도를 얻도록 플레이트에 접종되었다. 37℃, 18-24시간 동안 배양된 후, 플레이트들은 플레이트 판독기에서 OD₅₉₅ (Ultramark, Biorad Laboratories)에서 판독되었다. MICs는 기준 웰과 비교하여 생장 저해가 90%를 초과되는 최저 농도에서 처음 판독되었다. 또한 판독기 거울의 도움으로 눈으로 플레이트를 점검하였고, MICs는 시각적으로 생장이 없다는 것이 확인되었다.

6.ii. 결과:

실시예 1의 화합물은 그램-양성 호기성 세균의 생장을 저해시키는 이의 활성에 대해 테스트되었다. 수득된 결과는 하기 표 2에 요약되었다.

요약하면, 실시예 1의 화합물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), S. aureus MRSA, 엔테로코커스 파세칼리스(Enterococcus faecalis), 및 엔테로코커스 파시움(Enterococcus faecium)의 균주에 대항하여 강력한 in vitro 활성을 가졌다. 이 화합물은 반코마이신, 시프로플록사신 또는 리네졸리드에 저항성인 균주에 대해 활성이 있었다.

실시예 7: 특정 혐기성 세균 균주에 대항하여 실시예 1의 화합물의 in vitro 항균 활성:

실시예 5 (5.i 참고)에서 설명되는 실험 방법이 이용되어, 실시예 1 (Ex. 1)의 화합물은 정상적인 장 세균총에 역할을 하는 것으로 알려진 또는 추측되는 특정 혐기성 세균의 생장을 저해시키는 능력 및 C. difficile 과다 생장에 대항한 보호에 대해 이의 역할 유지에 대해 in vitro에서 테스트되었다(이하 집합적으로 “공생 장내 세균”으로 통칭함). 기준으로, WO 2005/058888 (Rl)의 실시예 5의 화합물(R1), 그리고 시프로플록사신(CP)도 함께 테스트되었다. 수득된 MICs의 결과는 하기 표 3에 제공된다.

요약하면, 실시예 1의 화합물은 C. difficile에 대항한 활성과 비교하였을 때 공생 장내 세균에 대해 감소된 활성을 보여주었다. 인간 보호성 장내 세균총의 가장 중요한 구성부인 박테로이드(Bacteroides spp.)의 경우, 활성이 30 내지 200배 낮았다. 이와 같이 장내 세균총에서 중요한 세균에는 관대하면서 장내에서 C. difficile을 선택적으로 죽일 수 있는 선택성 활성 능력을 가진다.

또한, WO 2005/058888의 실시예 5의 화합물과 비교하였을 때, 실시예 1의 화합물은 테스트된 박테로이드(Bacteroides spp.)에 대해 대부분의 경우에 2 내지 4배 낮은 활성을 보였고, 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) A-1259 또는 피네골디아 마그나(Finegoldia magna) A-1254 균주에 대해 4배 낮은 활성을 보였고, 테스트된 비피도박테리움 종(Bifidobacterium spp .)에 대해서는 4 내지 8배 낮은 활성을 보였고, 그리고 락토바실러스 악시도필러스(Lactobacillus acidophilus) A-1255 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis) A-1256 균주에 대해서는 4 내지 8배 낮은 활성을 보였다.

따라서, 실시예 5 of WO 2005/058888 (Rl)의 실시예 5의 화합물과 비교하였을 때, 실시예 1의 화합물은 공생 장내 세균에 대해 상당히 낮은 활성을 가지며, 이는 장에서 C. difficile를 선택적으로 사멸시키는 장점을 말한다.

실시예 8: C. 디피실 ( C. difficile ) 독소 생산에 실시예 1의 화합물의 효과

8. i. 실험 방법:

과다독성생산 C. difficile 균주 NC 13366은 37℃에서 24시간 동안 보충된 부루셀라 브로스에서 약 1 x 10⁸ CFU/ml의 세포 밀도로 혐기성으로 생장시켰다. 세균은 원심분리에 의해 세척되었고, 1 μg/ml 및 8 μg/ml의 농도로 항생제를 포함하는 보충된 부루셀라 브로스의 동일 용량에 현탁시켰다. 기준에는 항생제가 없다. 배양물은 37℃에서 혐기성으로 추가 배양되었다. 5일 시점에, 배양물 현탁액이 수거되었고, 하기에서 설명된 것과 같이, 독소 A와 독소 B에 대해 분석되었다. 독소 A는 NuPage Large Protein Analysis System (Invitrogen LPOOOl, 키트 지시에 따라)를 이용하여 웨스턴 블랏팅에 의해 탐지되었다. Western Breeze anti Mouse Immunodetection kit (Invitrogen WB7103)로 항-CdTA 생쥐 단클론 항체 (PCG4.1, Biodesign C70517M)가 이용되었다.

CHO세포에서 세포-라운딩 활성에 대해 C. 디피실(difficile)의 상청액을 테스트함으로써, C. 디피실(difficile) 세포독성 독소(독소 B)는 반정량적으로 테스트되었다. CHO 세포는 96-웰 평편 바닥 플레이트(1 x 10⁵ cells/well)에 접종되었고, 3시간 동안 흡착되도록 하였다.

여과 멸균된 상청액의 적절한 희석액은 세포에 첨가되었고, 5% CO₂내에서 37℃에서 추가 배양되었다. 20시간 후에, 인버트 현미경을 이용하여 세포 라운딩이 측정되었다. 독소 역가는 >90% 세포 라운딩을 결과하는 상청액의 최대 희석 10-배 희석물로 정의된다.

콜로니 형성 단위(CFU)는 테스트 샘플의 적정 희석물을 보충된 부루셀라 한천상에 도말하고, 혐기성 조건하에, 37℃에서 48시간 배양후에 콜로니를 카운트하였다.

8. ii . 결과:

도 1에 나타낸 결과를 수득하기 위하여 8.1에서 설명된 실험 방법이 이용되었다. 1일 시점(D1)에서, 배양물은 실시예 1 (Ex. 1)의 화합물, 반코마이신(V), 메트로니다졸(M)(1 μg/ml 및 8 μg/ml)로 처리되거나 또는 처리없이 남겨두었다(U); 5일 시점에(D5), 상청액에서 독소 A의 내용물이 분석되었고, Dl에서 관측된 것과 비교되었다(도 1 참고). 고밀도, 5일된 독소생산 C. 디피실(C. difficile)의 정지 상 배양물에서 실시예 1의 화합물은 1 μg/ml 및 8 μg/ml의 농도에서, 처음부터(de novo) 독소 A 생산을 차례로 2x MIC 및 16x MIC으로 저해시켰다(도 1 참고). 대조적으로, 메트로니다졸 및 반코마이신은 이들 조건에서 독소 A 생산을 저해시키지 않거나 아주 약하게 저해시켰다.

세포 상청액은 또한 8.i에서 설명된 세포계 세포 라운딩 분석을 이용하여 세포독성 독소 B에 대해 분석되었다. 실시예 1의 화합물로 처리된 배양물의 상청액의 활성은 처리안된 기준과 비교되었을 때, >90% 로 감소되었다. 대조적으로, 반코마이신-처리된 배양물의 상청액의 활성은 감소되지 않았거나(1 μg/ml에서) 또는 겨우 30% 감소되었다(8 μg/ml에서).

요약하면, 실시예 1의 화합물은 고밀도 정지상 배양물 및 사멸이 없을 경우에서도 C. 디피실 독소 A 및 B의 합성을 효과적으로 중단시키는 능력을 보유하는데, 이와 같은 활성은 C. 디피실(C. difficile) 감염의 치료에 현재 이용되는 약물인, 반코마이신 및 메트로니다졸에는 없다.

실시예 9: C. 디피실 ( C. difficile ) 포자 형성에서 실시예 1의 화합물의 효과:

9.i. 실험 방법:

C. 디피실(C. difficile) A-1050 (ATCC 43596)는 보충된 부루셀라 브로스에서 대수적 생장이 되도록 생장되었다(혐기성 조건하에, 37℃에서 6-7시간). 배양물은 2배 희석 단계에서 다양한 농도의 항생제가 포함된 보충된 부루셀라 브로스 1㎖이 포함된 튜브에서 1:50으로 희석되었다. 튜브는 혐기성 조건하에서, 37℃에서 4일간 추가 배양되었다. MIC는 눈으로 확인되는 생장(탁도)을 완전하게 저해하는 농도로 정의되었다. 0.5x MIC는 시각적으로 확인되는 생장을 허용하는 약물의 최대 농도였다.

전체 세포의 콜로니 형성 단위(CFUs) 평가는 4% 난황 현탁액 및 1% 용해된 말 혈액(Lab M)이 포함된 Brazier 한천상에서 배양물의 약 10배 희석액을 도말하여 실행되었다. 혐기성 조건하에 48시간 동안, 37℃에서 배양된 후 콜로니 카운트되었다. 포자 카운트는 1시간 동안 실온에서 50% 에탄올로 처리하여 생장하는 세포를 선택적으로 사멸시키고, 상기에서 설명된 Braziers 한천상에서 하위 CFU 카운트하여 실시되었다.

9. ii . 결과:

C. 디피실(C. difficile)은 포자 형성 유기체로써, 포자는 병원 환경에서 장시간 지속될 수 있다. 포자는 통상의 살균 과정에 매우 저항성이 크다. 따라서, 포자는 C. 디피실(C. difficile) 감염의 전파 및 지속에 중요한 역할을 한다. C. 디피실(C. difficile)의 in vitro 생장하는 배양물은 실시예 1의 화합물, 반코마이신 또는 메트로니다졸의 다양한 준-MIC 농도로 처리되었고, 37℃, 혐기 배양 4일 후, 포자 생산에 대한 효과가 조사되었다(9.i). 0.5x the MIC의 농도에서, 실시예 1의 화합물로 처리하면 포자 카운트가 낮았다(전체 세포 카운트의 포자 <1%). 대조적으로, 처리안된 배양물 및 0.5x MIC의 농도에서 메트로니다졸 또는 반코바이신으로 처리된 배양물은 높은 포자형성률을 보였다(전체 세포 카운트의 포자 >90%). 이는 실시예 1의 화합물이 반코마이신 또는 메트로니다졸보다 더 효과적으로 C. 디피실(C. difficile) 감염 처리 동안 포자 생산을 감소시키는 능력을 가진다는 것을 나타낸다.

실시예 10: C. 디피실 ( C. difficile ) 햄스터 모델에서 본 발명 화합물의 in vivo 활성:

10.i. 실험 방법:

Golden Syrian 헴스터에 클린다마이신 포스페이트 (10 mg/kg s.c)가 1회 제공되었고, 하루뒤, 동물에게 독성 생산 C. 디피실(C. difficile ) 균주 10465를 10⁵ CFU으로 위관영양을 통하여 감염시켰다. 동물의 대부분(~95%)에서 전격성 결장염(fulminant colitis)이 일어났고, C. 디피실(C. difficile ) 투여후 1 내지 2일간 발달되었다. 치료안되면, 결장염은 신속하게 진행되어, 심각한 결장염, 맹장의 출혈성 괴사 및 사망에 이르게된다. 실시예 1의 화합물은 3가지 약량 수준(10 mg/kg, 30 mg/kg, 100 mg/kg; n = 10 per group)에서 현탁액으로 경구 투여되었다. 반코마이신(50 mg/kg)은 기준으로 이용되었다. 동물은 5일간 일일 1회 처치되었고, 그 후, 추가 21일간 관찰하에 두었다.

동물들은 발병률, 설사의 존부에 대해 일일 3회 관찰되었다. 연구의 최종점은 생존이다. 빈사 상태[상당기간 체중 감소로 여윈 상태로됨, 24-48시간동안 식욕감퇴, 장시간 기면(3일 이상), 마비 징후, 피부 짓무름 또는 외상, 구부린 자세, 팽창된 복부]에 있는 것으로 판단되는 동물들은 펜토바르비탈 나트륨으로 1회 주사하여 안락사시켰다.

10. ii . 결과:

실시예 1의 화합물의 치료요법적 유용성은 10.i의 프로토콜에 따라 테스트되었다. 모든 감염된, 처치받지 않은 동물은 감염후 2 내지 5일 사이에 죽었지만, 10mg/kg, 30 mg/kg 또는 100 mg/kg의 실시예 1의 화합물로 치료를 받은 모든 동물은 5일 처리 기간 동안 생존하였다. 최저 수준의 약량에서, 동물의 40%는 처리후 21일의 재발 국면에서 생존하였으나, 30mg/kg 및 100 mg/kg에서 동물의 80% 및 100% 재발없이 생존하였다. 반코마이신 50 mg 약량은 기준으로 이용되었다. 이와 같은 결과는 실시예 1의 화합물이 반코마이신과 필적할정도로 C. 디피실(C. difficile) 감염을 치료할 수 있는 능력이 있다는 것을 설명한다.

Claims

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클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에서 선택되는 세균에 의해 유발되는 장 질환을 예방 또는 치료하기 위한 제약학적 조성물에 있어서, 1-사이클로프로필-6-플로오르-7-{4-[2-플로오르-4-((R)-5-하이드록시메틸-2-옥소-옥사졸리딘-3-일)-페녹시메틸]-4-하이드록시-피페리딘-1-일}-4-옥소-1,4-디하이드로-퀴노린-3-카르복실산 또는 이의 약학적으로 수용가능한 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 제 5 항에 있어서, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)에 의해 유발되는 장 질환을 치료 또는 예방하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 제 5 항에 있어서, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)의 독소 생산 균주에 의해 유발되는 장 질환을 치료 또는 예방하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 제 5 항에 있어서, 장에서 반코마이신-저항성 장내구균의 농도 증가없이, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 장내 독소생산 균주와 연관된 설사 질환을 치료 또는 예방하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
청구항 제 5 항에 있어서, 장에서 반코마이신-저항성 장내구균의 농도를 감소시키고, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 장내 독소생산 균주와 연관된 설사 질환을 치료 또는 예방하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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