PT2296651E - Derivados de 5-hidroximetil-oxazolidina-2-ona para o tratamento de doenças intestinais bacterianas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE 5—HIDROXIMETIL—OXAZOLIDINA—2—ONA PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS INTESTINAIS BACTERIANAS" A presente invenção diz respeito a determinados derivados de 5-hidroximetil-oxazolidina-2-ona para a prevenção ou tratamento de doenças intestinais que são causadas por Clostridium difficile, Clostridium perfringens, ou Staphylococcus aureus.

Determinadas estirpes de Clostridium difficile, Clostridium perfringens ou Staphylococcus aureus são produtoras de toxinas que causam diarreia. A ocorrência destas estirpes que produzem toxinas é frequentemente associada com o uso de antibióticos.

Entre estas estirpes, Clostridium difficile, uma bactéria anaeróbica, gram-positiva, formadora de esporos que produz duas enterotoxinas (A e B) causa não somente diarreia mas também condições intestinais mais graves tais como colite pseudomembranosa que apresenta perigo de morte. Ela é atualmente a fonte mais comum de diarreia infecciosa em hospitais e em instituições de tratamento de longo prazo no mundo industrializado. No decorrer dos últimos anos, a sua incidência aumentou progressivamente e agora representa um problema clinico significativo na América do Norte e na Europa. Os fatores de risco incluem um tratamento anterior com antibióticos, idade e um sistema imune comprometido resultante, por exemplo, de quimioterapia citotóxica ou de transplante de órgão. 2 0 tratamento atual para diarreia associada com Clostridium dlfficile (CDAD) consiste ou em vancomicina ou em metronidazol. Nos dois casos, no entanto, altas taxas de recaída são observadas e a produção de toxinas e esporos não é prevenida. Além disso, o tratamento com vancomicina ou com metronidazol é um fator adicional para promover a emergência de estirpes de Enterococcus spp (E. faecalis e E. faecium) e de Staphylococcus aureus (VRE e VRSA, respectivamente) resistentes a vancomicina no intestino (veja W.N. Al-Nassir et al., Antimicrob. Agents Chemother., publicado antes de ser impresso no dia 28 de abril de 2008) . Os enterococos são cocos gram-positivos que são habitantes normais no trato gastrintestinal. No entanto, eles podem também se transformar em patógenos significativos, produzindo endocardite e infecções no trato urinário, corrente sanguínea e em feridas. Uma vez adquirida a infecção, a colonização intestinal por VRE pode durar ao longo de vários anos, servindo como um reservatório para uma infecção potencial do paciente colonizado e para a disseminação de VRE a outros pacientes. VRE pode aparecer como uma co-infecção em pacientes infectados com C. difficile, ou mais habitualmente causar infecção em determinados pacientes de alto risco tais como pacientes de hematologia e oncologia, pacientes em unidades de tratamento intensivo, pacientes idosos em instituições de cuidados de longo prazo e pacientes que receberam transplantes de órgãos sólidos.

Portanto, existe a necessidade de um tratamento melhor para casos de CDAD e infecções correlatas, especialmente, identificando-se compostos com uma atividade intensa contra C. difficile que reduzam significativamente 3 a carga da toxina, a produção de esporos e que superem VRE tendo ao mesmo tempo um impacto reduzido sobre a flora intestinal comensal. WO 03/032962, WO 2004/096221 e WO 2005/058888 divulgam compostos antibacterianos contendo uma fração oxazolidina e um ácido l-ciclopropil-6-fluoro-4-oxo-l,4-di-hidro-quinolina-3-carboxílico ou ácido l-ciclopropil-6-fluoro-4-oxo-l,4-di-hidro-[1,8]naftiridina-3-carboxílico.

Além disso, os compostos da Fórmula I conforme serão definidos abaixo e a sua atividade antibacteriana já foram descritos anteriormente no pedido PCT No. PCT/1B2007/054557.

Diversas modalidades da presente invenção serão apresentadas mais adiante:

i) De acordo com a sua primeira principal modalidade, a presente invenção se refere aos compostos da Fórmula I

em que A é N ou CH; e n é 0 ou 1; ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, para a prevenção ou o tratamento de doenças intestinais que são causadas por bactérias selecionadas entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens ou Staphylococcus aureus. 4

Os parágrafos a seguir dão definições de diversos termos usados no presente documento e que são destinados a se aplicar uniformemente em todo o relatório e as reivindicações a não ser que uma definição expressamente determinada em contrário tenha um significado mais amplo ou mais restrito. 0 termo "prevenção", "prevenir" usado com referência a uma doença significa ou que a doença não ocorre no paciente ou no animal, ou que, embora o animal ou paciente seja afetado pela doença, parte ou a totalidade dos sintomas da doença ou são reduzidos ou ausentes. 0 termo "tratamento" "tratar" usado com referência a uma doença significa ou que a doença é curada no paciente ou no animal ou que, embora o animal ou paciente permaneça afetado pela doença, parte ou a totalidade dos sintomas da doença ou são reduzidos ou eliminados. 0 termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" se refere a sais de adição de ácido e/ou base inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Pode-se fazer referência a "Salt selection for basic drugs", Int. J. Pharm. (1986), 33, 201- 217. O termo "halogênio" se refere a flúor, cloro, bromo ou iodo, e de preferência a flúor ou cloro. A não ser que seja usado no que diz respeito a temperaturas, o termo "about" colocado antes de um valor numérico "X" se refere no presente pedido a um intervalo que se estende de X menos 10% de X a X mais 10% de X, e de preferência, a um intervalo que se estende de X menos 5% de X a X mais 5% de X. No caso especifico de temperaturas, o termo "aproximadamente" colocado antes de uma temperatura 5 "Y" se refere no presente pedido a um intervalo que se estende da temperatura Y menos 10°C a Y mais 10°C, e, de preferência, a um intervalo que se estende de Y menos 5°C a Y mais 5°C; além disso, temperatura ambiente significará no pedido de patente presente 25°C. ii) É preferível que o composto da Fórmula I conforme definido na modalidade i), ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, permita uma prevenção ou tratamento eficaz de doenças diarreicas associadas com estirpes enterotoxigénicas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens ou Staphylococcus aureus sem aumentar a concentração de enterococos resistentes a vancomicina (VRE) no intestino. iii) É mais preferível que o composto da Fórmula I conforme definido na modalidade i) ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, permita uma prevenção ou tratamento eficaz de doenças diarreicas associadas com estirpes enterotoxigénicas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens, ou Staphylococcus aureus e a redução da concentração de VRE no intestino. iv) É preferível que os compostos da Fórmula I conforme definido em uma das modalidades i) a iii), ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, sejam tais que A seja CH. v) É preferível também que os compostos da fórmula I conforme definidos em uma das modalidades i) a iv) , ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, sejam tais que n seja 1. vi) De acordo com sub-modalidades preferidas das modalidades i) a iii), o composto da fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, será selecionado entre: 6 ácido l-ciclopropil-6-fluoro-7-{4-[ 2-fluoro-4- ((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)-fenoximetil]-4-hidróxi-piperidina-l-il}-4-oxo-l,4-di-hidro-quinolina-3-carboxílico; ácido 1-ciclopropi1-6-fluoro-7-{4-[ 2-fluoro-4- ((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)-fenoximetil]-4-hidróxi-piperidina-l-il}-4-oxo-l,4-di-hidro-[1,8]naftiridina-3-carboxílico; ácido l-ciclopropil-6-fluoro-7-{3-[2-fluoro-4- ((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)-fenoximetil]-3-hidróxi-pirrolidina-l-il}-4-oxo-l,4-di-hidro-quinolina-3-carboxílico; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. vii) De acordo com sub-modalidades mais preferidas das modalidades i) a iii), o composto da Fórmula I, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, será o ácido 1-ciclopropil-6-fluoro-7-{4-[2-fluoro-4-((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)-fenoximetil]-4-hidróxi-piperidina-l-il}-4-oxo-l,4-di-hidro-quinolina-3-carboxilico, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. viii) De acordo com um aspecto das modalidades i) a vii), a presente invenção se referirá aos compostos da Fórmula I conforme definido em uma das modalidades i) a vii), ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, para o tratamento de doenças intestinais que são causadas por bactérias selecionadas entre Clostridium difficile,

Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus. ix) De acordo com um aspecto preferido da modalidade viii), a presente invenção se referirá aos compostos da Fórmula I conforme definido em uma das modalidades i) a vii), ou seus sais farmaceuticamente 7 aceitáveis, para o tratamento de doenças intestinais que são causadas por Clostridium difficile (principalmente por uma estirpe de Clostridium difficile produtora de toxina). x) De acordo com um outro aspecto principal das modalidades i) a vii), a presente invenção se referirá aos compostos da Fórmula I conforme definido em uma das modalidades i) a vii), ou aos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, para a prevenção das doenças intestinais que são causadas por bactérias selecionadas entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus. xi) De acordo com um aspecto preferido da modalidade x) , a presente invenção se referirá aos compostos da Fórmula I conforme definida em uma das modalidades i) a vii), ou aos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, para a prevenção de doenças intestinais que são causadas por Clostridium difficile (principalmente para uma estirpe de Clostridium difficile produtora de toxina). xii) É preferível que os pacientes em que se pretende prevenir as doenças intestinais mencionadas nas modalidades i) a xi) sejam pacientes tratados com outros antibióticos ou com terapias antivirais, pacientes com um sistema imunocomprometido tais como pacientes submetidos a quimioterapia citotóxica ou a transplante de órgãos, pacientes idosos (65 anos de idade ou mais), ou pacientes de unidades de tratamento intensivo ou de instalações de tratamento a longo prazo. xiii) Uma outra modalidade principal da presente invenção se refere a um método de prevenção ou de tratamento de um paciente com uma doença intestinal que seja causada por bactérias selecionadas entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus, 8 compreendendo o método a administração aos paciente de uma quantidade eficaz de um composto da Fórmula I conforme definido em uma das modalidades i) a vii), ou de um sal farmaceuticamente aceitável de tal composto, durante um período suficiente para prevenir ou tratar a doença intestinal. xiv) É preferível que o método da modalidade xiii) permita uma prevenção efetiva ou tratamento efetivo de doenças diarreicas associadas com estirpes enterotoxigénicas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens, ou Staphylococcus aureus sem aumentar a concentração de enterococos resistentes a vancomicina (VRE) no intestino. xv) É mais preferível que o método da modalidade xiii) permita uma prevenção eficaz ou um tratamento eficaz de doenças diarreicas associadas com estirpes enterotoxigénicas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens, ou Staphylococcus aureus e redução da concentração de VRE no intestino. xvi) De acordo com um aspecto das modalidades xiii) a xv) , a presente invenção se referirá a um método para o tratamento num paciente de uma doença intestinal que é causada por bactérias selecionadas entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus, compreendendo o método referido a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um composto da Fórmula I conforme definido em uma das modalidades i) a vii) ou de um sal farmaceuticamente aceitável de tal composto durante um período de tempo suficiente para tratar a doença intestinal. 9 xvii) De acordo com um aspecto preferido da modalidade xvi), a presente invenção se referirá a um método de tratamento num paciente de uma doença intestinal que é causada por Clostridium difficile (principalmente por uma estirpe de Clostridium difficile produtora de toxina). xviii) De acordo com um outro aspecto das modalidades xiii) a xv) , a presente invenção se referirá a um método de prevenção num paciente de uma doença intestinal que é causada por bactérias selecionadas entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus, compreendendo o método a administração ao paciente de uma quantidade eficaz de um composto da fórmula I conforme definida em uma das modalidades i) a vii) ou de um sal f armaceuticamente aceitável de tal composto, durante um periodo de tempo suficiente para prevenir a doença intestinal. xix) De acordo com um aspecto preferido da modalidade xviii), a presente invenção se referirá a um método de prevenção num paciente de uma doença intestinal que é causada por Clostridium difficile (principalmente por uma estirpe de Clostridium difficile produtora de toxina). xx) É preferível que os pacientes submetidas a um método de uma das modalidades xiii) a xix) sejam pacientes tratados com outros antibióticos ou com terapias antivirais, pacientes com um sistema imunocomprometido tais como pacientes submetidos a quimioterapia citotóxica ou a transplante de órgãos, pacientes idosos (65 anos de idade ou mais) ou pacientes de unidades de tratamento intensivo ou de instalações de tratamento a longo prazo. xxi) Um outro aspecto da presente invenção se refere ao uso de um composto da Fórmula I conforme definido 10 em uma das modalidades i) a vii) ou de um sal farmaceuticamente aceitável de tal composto, para a fabricação de um medicamento destinado a prevenir ou tratar uma doença intestinal que é causada por bactérias selecionadas entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus. xxii) De acordo com um aspecto da modalidade xxi), a presente invenção se referirá ao uso de um composto da Fórmula I conforme definido em uma das modalidades i) a vii), ou de um sal f armaceut icamente aceitável de tal composto, para a fabricação de um medicamento destinado a tratar uma doença intestinal que é causada por bactérias selecionadas entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens, e Staphylococcus aureus. xxiii) De acordo com um aspecto preferido da modalidade xxii), a doença intestinal destinada a ser tratada será causada por Clostridium difficile (principalmente por uma estirpe de Clostridium difficile produtora de toxina). xxiv) De acordo com um outro aspecto da modalidade xxi), a presente invenção se referirá ao uso de um composto da Fórmula I conforme definido em uma das modalidades i) a vii), ou de um sal farmaceuticamente aceitável de tal composto, para a fabricação de um medicamento destinado a prevenir uma doença intestinal que é causada por bactérias selecionadas entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus.

Clostridium por xxv) De acordo com um aspecto preferido da modalidade xxiv), a doença intestinal destinada a ser prevenida será causada por Clostridium difficile 11 (principalmente por uma estirpe de Clostridium difficile produtora de toxina). xxvi) É preferível que os pacientes para os quais o medicamento fabricado de acordo com uma das modalidades xxi) a xxv) será destinado serão pacientes tratados com outros antibióticos ou com terapias antivirais, pacientes com um sistema imunocomprometido, tais como pacientes submetidos a quimioterapia citotóxica ou a transplante de órgãos, pacientes idosos (65 anos de idade ou mais) ou pacientes de unidades de tratamento intensivo ou de instalações de tratamento a longo prazo. xxvii) Um outro aspecto da presente invenção se refere a um método de prevenção ou tratamento num animal (tal como um cão, um gato, um porco, uma vaca ou um cavalo) de uma doença intestinal causada por bactérias selecionadas entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus, compreendendo o referido método a administração ao referido animal de uma quantidade efetiva de um composto da Fórmula I conforme definido em uma das modalidades i) a vii), ou de um sal farmaceuticamente aceitável de tal composto, durante um período de tempo suficiente para o tratamento da doença intestinal. xxviii) De acordo com um aspecto da modalidade xxvii), a presente invenção se referirá a um método de tratamento num animal (tal como um cão, um gato, um porco, uma vaca ou um cavalo) , de uma doença intestinal que é causada por bactérias selecionadas entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus, compreendendo o referido método a administração ao referido paciente de uma quantidade efetiva de um composto da Fórmula I conforme definido em uma das modalidades i) a 12 vii), ou de um sal f armaceut icamente aceitável de tal composto, durante um período suficiente para o tratamento da doença intestinal. xxix) De acordo com um outro aspecto da modalidade xxvii), a presente invenção se referirá a um método de prevenção num animal (tal como um cão, um gato, um porco, uma vaca ou um cavalo,) de uma doença intestinal que é causada por bactérias selecionadas entre Clostridium difficile, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus, compreendendo o referido método a administração ao referido paciente de uma quantidade efetiva de um composto da Fórmula I conforme definido em uma das modalidades i) a vii), ou de um sal f armaceuticamente aceitável de tal composto, durante um período de tempo suficiente para prevenir a doença intestinal.

As doenças intestinais destinadas a serem prevenidas ou tratadas de acordo com as modalidades i) a xxix) da presente invenção compreendem principalmente diarreia, colite e colite pseudomembranosa. É preferível que as doenças intestinais sejam causadas por Clostridium difficile (principalmente por uma estirpe de Clostridium difficile produtora de toxina). A via de administração mais adequada para os compostos da Fórmula I usados de acordo com as modalidades i) a xxix) da presente invenção será a via oral. A administração pode ser diária (por exemplo, uma a quatro vezes diariamente) ou pode ser menos frequente (por exemplo, uma vez a cada dois dias ou uma ou duas vezes por semana).

Embora as doses de administração exatas de um composto da Fórmula I conforme definido numa das 13 modalidades i) a vii), ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, terão que ser determinadas pelo clinico ou veterinário responsável, espera-se que uma quantidade entre 0. 5 e 50 mq do composto da Fórmula I, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, por kg de peso corporal do paciente por dia (uma quantidade, por exemplo, entre 1 e 5 mg do composto da Fórmula I, ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável, por kg de peso corporal de paciente por dia) administrada uma ou duas vezes ao dia durante um período de 3 a 15 dias (por exemplo, durante um período de 7 a 14 dias) será adequado. A produção das composições farmacêuticas contendo os compostos da Fórmula I conforme definido em uma das modalidades i) a vii), ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, pode ser efetuada de um modo que será familiar aos versados na técnica (veja, por exemplo, Remington, The Science e Practice of Pharmacy, 21a. Edição (2005), Parte 5, "Pharmaceutical Manufacturing" [publicado por Lippincott Williams & Wilkins]) levando o composto descrito da Fórmula 1, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, opcionalmente em combinação com outras substâncias terapeuticamente valiosas em uma forma de administração galénica juntamente com materiais veículos adequados não tóxicos, inertes terapeuticamente compatíveis, sólidos ou líquidos, e, se for desejado, adjuvantes farmacêuticos habituais.

Os compostos da Fórmula I podem ser fabricados de acordo com a presente invenção usando os procedimentos descritos a seguir.

PREPARAÇÃO DE COMPOSTOS DA FÓRMULA I

Abreviaturas 14

As abreviaturas abaixo são usadas em todo 0 relatório e : nos exemplos: AcOH ácido acético mistura AD oí 1, 4-bis(di-hidroquinina)-ftalazina, K3Fe(CN) 6, K2C03 e K20s04.2H20 mistura AD β 1,4-bis(di-hidroquinina)-ftalazina, K3Fe (CN) 6, K2C03 e K20s04.2H20 Alloq aliloxicarbonilo aq. aquosa Boc terc-butoxicarbonilo t-BuOK tec-butilato de potássio Cbz benziloxicarbonilo CDAD diarreia associada com Clostridium difficile CFU unidades formadoras de colónia CLSI Clinicai Laboratory Standards Institute DBU 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno DCM diclorometano DIAD azodicarboxilato de diisopropilo DIPEA N,N-diisopropiletilamina DMF N,N-dimetilformamida DMSO dimetilsulfóxido EA acetato de etilo EDC cloridrato de 1-(dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida ESI Ionização de Pulverização Eletrónica éter ou Et 20 éter dietilico FC cromatografia flash h hora Hex n-hexano IC50 concentração que reduz 0 efeito em 50% 15 15 LZD-R MeCN MCPBA MIC MIC90 MRSA MeOH EM NaOMe NMP OD595 org. Pd/C ou Pd(OH)2/C PPh3 temperatura ambiente saturado Si02 TBDMSC1 TEA TFA THF TMSC1 resistente a linezolida acetonitrilo ácido meta-cloroperbenzóico concentração inibidora minima para inibir o crescimento bacteriano concentração inibidora minima para inibir o crescimento de > 90% de estirpes Staphylococcus aureus resistente meticilina metanol

Espectroscopia de massa metilato de sódio N-metilpirrolidinona densidade ótica medida a 595 nM orgânico paládio ou di-hidróxi-paládio sobre carvão trifenilfosfina temperatura ambiente saturado gel de silica cloreto de terc-butildimetilsililo trietilamina ácido trifluoracético tetra-hidrofurano cloreto de trimetilsililo Métodos de Preparação gerais:

Os compostos da Fórmula I podem ser fabricados de acordo com a presente invenção 16

a) fazendo-se reagir o composto da Fórmula II 16 d"' Y /f~

-LJ

“OH

com um composto da Fórmula III

M em que n e A são conforme definido na Fórmula I e R1 é alquil (C1-C3)-sulf onilo (metilsulf onilo, por exemplo), trifluormetilsulfonilo ou arilsulfonilo (fenil- ou p-tolil-sulfonilo, por exemplo) de preferência entre aproximadamente 10°C e 100°C (sendo mais preferível entre aproximadamente 40°C e 80°C), na presença de uma base inorgânica, tal como K2CO3, ou uma base orgânica tal como TEA, num solvente orgânico (DMF, por exemplo); ou

b) fazendo-se reagir um composto da Fórmula II com um composto da Fórmula IV

IV 17 em que n e A são conforme definido na Fórmula I, conforme descrito na seção a) . Os referidos compostos da Fórmula IV podem ser obtidos por tratamento de compostos da Fórmula III na presença de uma base orgânica (TEA, por exemplo) ou de uma base inorgânica (K2C03, por exemplo, ou um metiloto alcalino tal como NaOMe ou um hidreto alcalino tal como NaH) num solvente orgânico (DMF, por exemplo); ou

c) fazendo-se reagir um composto da Fórmula V

em que n é conforme definido na Fórmula I, com um composto da Fórmula III $ ¥ .A >sS.»S^ ν;· 'Ni;'’··' Λ em que A é conforme definido na Fórmula I, Y é halogénio e R2 é hidrogénio, BF 2 ou B(OC(=0)-alquilo(Ci— C4))2, alquilo (C2—C5) (metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo ou terc-butilo, por exemplo), alilo, aril-(Ci-C5)alquilo (benzilo, p-nitrobenzilo ou p-metoxibenzilo, por exemplo), tri-alquil(C1-C5)-sililo (trimetilsililo ou terc-butil-dimetilsililo, por exemplo) ou diaril-alquil(C1-C5)-sililo (terc-butildifenilsililo, por exemplo), de preferência entre aproximadamente 10°C e 100°C, sendo mais preferível entre aproximadamente 40°C e 80°C na presença de 18 uma base orgânica, tal como TEA ou DIPEA, num solvente orgânico, tal como NMP, por exemplo; ou d)convertendo-se um composto da Fórmula VI1

vu em que R3 é alquilo (C1-C5) (metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo ou terc-butilo, por exemplo), aril-alquilo(Ci-C5) (benzilo, p-nitrobenzilo ou p-metoxibenzilo, por exemplo), alilo, tri-alquil(C1-C5)-sililo (trimetilsililo ou terc-butildimetilsililo, por exemplo) ou diaril-alquil(C1-C5)-sililo (terc-butil-difenilsililo, por exemplo) e n e A são conforme definido na Fórmula I, no composto correspondente da Fórmula I por hidrólise, saponificação ou hidrogenólise (conforme resenhado em Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994), por exemplo).

No que diz respeito ao processo acima, deve ser observado o seguinte:

- no que diz respeito à variante a) , o composto da Fórmula II poderia também ser substituído por um seu éster, isto é, um composto da Fórmula IIIE 19

em que η, A e R1 são conforme definido na Fórmula III e R4 representa alquilo, alilo ou arilalquilo, sendo que neste caso uma etapa de desproteção do éster se seguiria à reação do composto da Fórmula IIIE com o composto da Fórmula II (os métodos gerais para se conduzir a etapa de desproteção do éster já foram resenhados em Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994));

- no que diz respeito à variante a) , o composto da Fórmula II poderia também ser substituído por um seu éter silílico, isto é, um composto da Fórmula IIPG

em que PG2 representa um grupo protetor de sililo para uma função álcool tal como um tri-alquil(C1-C5)-sililo (trimetilsililo ou terc-butildimetilsililo, por exemplo) ou diaril-alquil(C1-C5)-sililo (terc-butil-difenilsililo, por exemplo), sendo que neste caso, uma etapa de desproteção se seguiria à reação do composto da Fórmula III ou IIIE com o composto da Fórmula IIPG (métodos gerais para a condução de tais reações foram resenhados em Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994)); 20

no que diz respeito à variante c), o composto da Fórmula V poderia também ser substituído por um composto da Fórmula VP

Vs- em que n é conforme definido na Fórmula V e PG2 representa um grupo protetor para uma função álcool (um grupo alquil-sililo ou diaril-alquilsililo tal como trimetilsililo, terc-butildimetilsililo ou terc-butil-difenilsililo, por exemplo), sendo que neste caso uma etapa adequada de desproteção se seguiria à reação do composto da Fórmula Vp com o composto da Fórmula VI (métodos gerais para a condução de tais reações foram resenhados em Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994)); - no que diz respeito à variante c) , quando R2 não for H, uma etapa adicional de desproteção do éster é necessária (métodos gerais para a condução de tais reações foram resenhados em Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994)), exceto para os casos em que R2 for BF2 ou B (OC (=0)-alquilo (Ci-C4) ) 2»· em que a hidrólise tem lugar já durante a elaboração ácida.

Os compostos da Fórmula I assim obtidos podem, se for desejado, ser convertidos nos seus sais, e principalmente nos seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

Além disso, sempre que os compostos da Fórmula I forem obtidos na forma de misturas de enantiómeros, os enantiómeros podem ser separados usando-se métodos conhecidos dos versados na técnica (por formação e separação de sais diastereoméricos por cromatografia sobre 21 uma fase estacionária quiral) . Sempre que os compostos da Fórmula I forem obtidos na forma de misturas de diastereómeros, eles podem ser separados por uma combinação adequada de cromatografia sobre gel de sílica, HPLC e técnicas de cristalização.

Preparação de diversos intermediários de síntese: Preparação do composto da Fórmula II 0 composto da Fórmula II pode ser obtido por hidrogenação do composto da Fórmula VIII

sobre um catalisador de metal nobre tal como paládio ou platina sobre carvão, num solvente tal como THF, MeOH ou EA, a uma temperatura entre 0°C e 40°C ou por hidrólise na presença de uma solução de HBr em água ou AcOH, a uma temperatura entre 0°C e 80°C, num solvente tal como AcOH.

Preparação dos compostos da Fórmula III Os compostos da Fórmula III podem ser preparados conforme resumido no Esquema 1 abaixo.

Esquema 1 22

No Esquema 1, R2 é H, alquilo, alilo ou arilalquilo, e os demais símbolos são conforme já determinado. Os compostos da Fórmula III, em que R1 é SO2R5, R5 sendo alquilo, trifluormetilo ou arilo como fenilo ou p-tolilo, podem ser obtidos (Esquema 1) a partir dos compostos da Fórmula IIIA, em que R1 é H, por reação com os cloretos de sulfonilo correspondentes na presença de uma base orqânica tal como TEA, num solvente tal como DCM ou THF, a uma temperatura entre -10°C e 50°C. Os compostos da Fórmula IIIA podem ser preparados por reação dos compostos da Fórmula VI com as piperidinas ou pirrolidinas da Fórmula IX na presença de uma base orqânica tal como TEA ou DIPEA, a uma temperatura entre 40°C e 100°C, num solvente tal como THF, DMF ou NMP. Se R2 for benzilo, o ácido carboxilico da Fórmula IIIA pode ser liberado de acordo com procedimentos padrão conforme descrito em Protecting groups, Kocienski, P.J., Thieme (1994) (hidrogenação sobre Pd/C, por exemplo).

Preparação dos compostos da Fórmula V

Os compostos da Fórmula V podem ser preparados conforme resumido no Esquema 2 abaixo. 23

cr X

f / HOi^feN\ /.....\ . X W/

θ'—' V

Esquema 2

Os compostos da Fórmula V podem ser obtidos por desproteção dos compostos da Fórmula XI em que PG representa um grupo protetor de amino tal como alcóxi-carbonilo (Boc, por exemplo), benziloxicarbonilo (CBZ, por exemplo), Alloc ou benzilo. Os métodos gerais para a condução de tais sequências de proteção/desproteção de aminas secundárias foram resenhados em Protecting groups, Kocienski, P. J., Thieme (1994).

Os compostos da Fórmula XI podem ser obtidos fazendo-se reagir um composto da Fórmula II com os compostos da Fórmula X em que R1 é SO2R5, R5 sendo alquilo, trifluormetilo ou arilo tal como fenilo ou p-tolilo, ou fazendo-se reagir um composto da Fórmula II com os epóxidos correspondentes derivados dos compostos da Fórmula X. Tais epóxidos podem ser obtidos dos compostos da Fórmula X, em que R1 é SO2R5, por tratamento ou com uma base orgânica tal como TEA, piridina ou DBU ou com uma base inorgânica tal como K2CO3, num solvente tal como THF, éter ou DCM, a uma temperatura entre -10°C e 40°C. Os compostos da Fórmula X em que R1 é H ou são disponíveis no comércio (compostos X 24 em que PG = Boc, η = 1 e R1 = H, por exemplo, ou o epóxido derivado de compostos da Fórmula X em que PG3 = Boc, n = 0) ou então podem ser preparados conforme será explicado mais adiante. Alternativamente, os compostos da Fórmula XI podem ser obtidos por reação do composto da Fórmula II com os compostos da Fórmula X em que R1 é H em condições Mitsunobu.

Preparação dos compostos da Fórmula VI Os compostos da Fórmula VI, em que R é hidrogénio, Me ou Et, são disponíveis no comércio (compostos em que A = CH, Y = Cl e R2 = H, Me ou Et, ou Y = F e R2 = BF2, por exemplo, ou compostos em que A = N, Y = Cl e R2 = H ou Et) . Os compostos da Fórmula VI em que R2 é B(OC(=0)(C1-C4)alquilo)2 podem ser obtidos a partir de compostos da Fórmula VI em que R2 é H de acordo com WO 88/07998. Os demais compostos da Fórmula VI podem ser obtidos de acordo com métodos padrão a partir de compostos da Fórmula VI em que R é H.

Preparação dos compostos da Fórmula VII

Os compostos da Fórmula VII podem ser obtidos acoplando-se compostos da Fórmula V ou, alternativamente, compostos da Fórmula VP, conforme definido acima, com compostos da Fórmula VI, conforme já definido, exceto pelo fato de que R2 representa alquilo (Ci-C5) (metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo ou terc-butilo, por exemplo), aril-alquilo(Ci-C5) (benzilo, p-nitrobenzilo ou p-metoxibenzilo, por exemplo), alilo, tri-alquil(C1-C5)-sililo (trimetilsililo ou terc-butil-dimetilsililo, por exemplo) ou diaril-alquil(C1-C5)-sililo (terc-butil-difenilsililo, 25 por exemplo), nas mesmas condições já descritas para a reação dos compostos da Fórmula V com os compostos da Fórmula VI. Se forem usados os compostos da Fórmula Vp, a etapa de desproteção pode ser conduzida depois da reação de acoplamento.

Preparação dos compostos da Fórmula VIII 0 composto da Fórmula VIII pode ser obtido de acordo com WO 2004/096221.

Preparação dos compostos da Fórmula IX Os compostos da Fórmula IX podem ser obtidos pela desproteção dos compostos da Fórmula X (R1 = H) , por tratamento dos compostos correspondentes protegidos por Boc com TFA ou por hidrogenação dos compostos correspondentes protegidos por Cbz sobre Pd/C.

Preparação dos compostos da Fórmula X Os compostos da Fórmula X podem ser preparados a partir de derivados de metilideno da Fórmula XII conforme resumido no Esquema 3 abaixo.

Xe

XÍI

HO

Xk Es “ SQ*R'*

Esquema 3 26

Os compostos da Fórmula Xb, isto é, os compostos da Fórmula X em que R1 é SO2R5, são preparados a partir dos compostos correspondentes da Fórmula Xa em que R1 é H usando-se os mesmos métodos usados para a conversão dos compostos da Fórmula IIIA nos compostos da Fórmula IIIS. Os compostos da Fórmula Xa ou são obtidos de derivados conhecidos de metilideno da Fórmula XII (aqueles em que n = 0 e PG = benzilo, Boc ou benzilóxi-carbonilo, por exemplo, - veja EP 241206 e EP 550025; ou aqueles em que η = 1 e PG = benzilo, Boc que são comerciais) ou por cis-di-hidroxilação catalisada por tetróxido de ósmio ou por sua versão assimétrica (di-hidroxilação Sharpless usando mistura AD cx ou β) conforme descrito em J. Am. Chem. Soc. (1988), 110, 1968 . Os compostos da Fórmula Xc, isto é, os derivados epoxídicos de compostos da Fórmula Xb são obtidos ou por fechamento do anel intramolecular de compostos da Fórmula Xb com uma base inorgânica tal como K2CO3 ou NaH ou uma base orgânica tal como TEA ou DBU, ou por epoxidação da ligação metilideno dupla dos compostos da Fórmula XII com um perácido tal como MCPBA. Alternativamente, compostos da Fórmula Xc podem também ser obtidos pela reação dos derivados oxo correspondentes (comercial quando n = 0 ou 1 e PG = Cbz ou Boc) com iodeto de trimetil-sulfoxónio ou com iodeto de trimetil-sulfónio na presença de um hidróxido alcalino, tal como hidróxido de potássio, em um solvente polar tal como MeCN entre 20 e 100°C (conforme descrito em J. Am. Chem. Soc. (1965), 87, 1353-1364 e Tetrahedron Lett. (1987), 28, 1877-1878).

Modalidades especificas da presente invenção são descritas nos exemplos abaixo, servindo para ilustrar a 27 invenção com mais detalhes sem limitar de nenhum modo o seu âmbito.

EXEMPLOS

Todas as temperaturas são dadas em °C. Todas as investigações por HPLC analítica ou preparatórias sobre fases não quirais são conduzidas usando-se colunas RP à base de C18. Investigações de HPLC analíticas são conduzidas em dois instrumentos diferentes com tempos de ciclo de ~2,5 minutos e ~3,5 minutos respectivamente. A não ser que seja declarado em contrário, os valores indicados para EM correspondem aos picos principais ((M+H)+ com uma variação de +/- 0,5 unidade). Nos espectros RMN as constantes de acoplamento J são dadas em Hz.

Procedimento de elaboração padrão:

Depois da diluição em um solvente orgânico adequado (veja texto do Exemplo correspondente), a fase orgânica é separada e lavada em sequência com água e salmoura. No caso de reação conduzida em um solvente hidrossolúvel (tal como MeOH, THF ou DMF, por exemplo), as fases aquosas combinadas são retro-lavadas com o mesmo solvente usado para conduzir a elaboração. As fases orgânicas combinadas são secadas sobre MgSCq e filtradas. Faz-se evaporar o filtrado a pressão reduzida.

Procedimento padrão de cromatografia: frações 0 material bruto é dissolvido no mínimo de eluente (veja texto do Exemplo correspondente) e cromatografado sobre Si02. Combinam-se as relevantes e faz-se evaporar a pressão reduzida. 28

Exemplo 1: Ácido l-ciclopropil-6-fluoro-7—{4-[2-fluoro-4-((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)— fenoximetil]-4-hidróxi-piperidina-l-il}-4-oxo-l,4-di—hidro-quinolina-3-carboxílico: 1. i . (R)-3- (3-fluoro-4-hidróxi-fenil)-5- hidroximetil-oxazolidina-2-ona:

Uma solução de (R)-3-(4-benzilóxi-3-fluoro-fenil)-5-hidroximetil-oxazolidina-2-ona (6,34 g, preparada de acordo com WO 2004/096221) em THF/MeOH (1:1; 200 mL) foi hidrogenada sobre Pd/C 10% (1 g) de um dia para o outro. O catalisador foi filtrado fora, fez-se evaporar o filtrado a pressão reduzida e o resíduo foi agitado em EA. Os cristais foram coletados por filtração, resultando em 3,16 g (rendimento de 70%) de um sólido incolor. RMN ΧΗ (DMSOde; δ ppm) : 3,5 (m, 1H) , 3,64 (m, 1H) , 3,74 (dd, J = CO co 6, \—1 3,99 (t, J = 00 00 i—1 4, 6 4 (m, \—1 5, 16 (t, J = LO II 1H), 6,93 (dd, J = 9,7, 8, 8, 1H) , oo o (ddd, J = = 8, 8, 2,6, 1,2, 1H), 7, 45 (dd, J = 13, 5, 2,6, \—1 9,66 (s, 1H) . MS (ESI): 228,1. l.ii. Éster benzílico do ácido 4-[2-fluoro-4-((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina~3-il)-fenoximetil]-4-hidróxi-piperidina-1-carboxílico:

Uma solução do intermediário l.i (1,27 g) e éster benzílico do ácido l-oxa-6-aza-espiro[2.5]octano-6-carboxílico (1,60 g; preparado de acordo com US 4244961) foram dissolvidos em DMF (15 mL) e tratados com Na2C03 (1,16 g). A mistura foi aquecida a 100°C de um dia para o outro. O resíduo obtido depois da elaboração (DCM) foi agitado em EA, e o sólido foi coletado por filtração e 29 lavado em sequência com EA e Hex, resultando em 2,52 g (rendimento de 94, 5%) de um sólido bege • RMN (DMSOd6; δ ppm) : 1,57 (m, 4H) , 3,14 (m, 2H) , 3,54 (m, 1H) , 3,64 (m, 1H), 3, 79 (m , 5 h; 1, 4, 03 (t, J = 9,1, 1 H), 4, 66 (m , 1 H), 4, 78 (s, 1 H), 5,05 (s, 2 H), 5,16 (t, J = 5,6, 1 H), 7,18 (m, 2 H), 7,32 (m, 5 H) , 7,55 (d, J = 12 , 1 H) . MS (ESI) : 475,0. 1.iii. (R)-3-[3-fluoro-4-(4-hidróxi-piperidina-4- ilmetóxi)-fenil]-5-hidroximetil-oxazolidina-2-ona:

Uma suspensão do intermediário l.ii (2,5 g) em EA/MeOH (1:1; 100 mL) foi hidrogenada sobre Pd/C durante 48 horas. A suspensão foi aquecida a 40°C e o catalisador foi filtrado fora.

Fez-se o filtrado evaporar a pressão reduzida resultando em 1,61 g (rendimento de 89%) de um pó amarelo. RMN λΕ (DMSOd6; δ ppm) : 1,4-1,63 (m, 4H) , 2,67 (m, 2H), 2,83 (m, 2H), 3,53 (dd, J = 4,0, 12,0, 1H); 3,66 (dd, J = 3,3, 12,0, 1H), 3,71 (s, 2H); 3,80 (m, 1H), 4,05 (t, J = 9,0, 1H), 4,48 (s, 1H), 4,68 (m, 1H), 5,20 (s, 1H), 7,20 (m, 2H), 7,57 (d, 1H). MS (ESI): 341,5. l.iv. Ácido l-ciclopropil-6~fluoro~7-{4-[2-fluoro-4-((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidian-3-il)-fenoximetil]-4-hidróxi-piperidina-l-il}-4-oxo-l,4-di-hidro-quinolina-3-carboxílico:

Uma solução do intermediário l.iii (200 mg), complexo de ácido 7-cloro-l-ciclopropil-6-fluoro-1,4-di-hidro-4-oxo-3-quinolina carboxilico e diacetato de boro 30 (241 mg; preparado de acordo com WO 88/07998) e DIPEA (100 pL) em NMP (2 mL) foi agitada a 85°C durante 5 horas. Fez-se evaporar a mistura de reação a pressão reduzida e o resíduo foi absorvido em HC1 a 5M em MeOH (3 mL) e agitado. O sólido resultante foi coletado por filtração e lavado com MeOH, resultando em 230 mg (67% de rendimento) de um sólido amarelo. RMN XH (DMSOd6; δ ppm) : 1,66 -1,35 (m, 4H) , 1, 75 (d, J = 1 2,8, 2H), 1,95 (m, 2H) , 3,33 (t largo, J = 11,0, 2H) , 3,57 (m, 3H), 3,67 (dd , J = 12,3, 3, 3, 1H), 3, 83 (m, 2H) , 3,92 (s, 2H), 4,06 (t, r J = 9,0, 1H ), 4,69 (m , 1H) , 7,24 (m, 2H) , 7,60 (m, 2H) , 7, 90 (d, J = 13,3, 1H) , 8,66 (s, 1H). MS (ESI) : 585, 9.

Exemplo 2: Ácido l-ciclopropil-6-fluoro-7-{4-[2-fluoro-4-((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)-fenoximetil]-4-hidróxi-piperidina-l-il}-4-oxo-l, 4-di-hidro-[1,8]naftiridina-3-carboxílico:

Uma solução de ácido 7-cloro-l-ciclopropil-6-fluoro-1,4-di-hidro-4-oxo-l,8-naftiridina-3-carboxílico (166 mg; comercial) e intermediário l.iii (200 mg) em NMP (5 mL) foi tratada com TEA (0,32 mL) e com TMSC1 e aquecida a 85°C durante 5 horas. Fez-se evaporar a mistura de reação sob pressão reduzida e o resíduo foi absorvido em HC1 a 5M em MeOH (3 mL) e agitado durante 30 minutos. Fez-se a solução evaporar a pressão reduzida e o resíduo foi absorvido em EA. O sólido resultante foi coletado por filtração e lavado 271 mg (rendimento de 78%) de um sólido amarelo. 31 RMN ΧΗ (DMSOd6; δ ppm) : 0, 89-1,27 (m, 4H) ; 1,78 (d, J = 12,8, 2H) ; 1,90-2,04 (m, 2H) ; 3,53-3,88 (m, 6H) ; 3,88 (s, 2H), 4,06 (t, J = 9,0, 1H) , 4,42 (d largo, J = 13,2, 2H), 4,44 (m, 1H) ; 7,11 (m, 2H) ; 7,55 (d, J = 14,5, 1H); 8,05 (d, J = 13,5, 1H); 8,60 (s, 1H). MS (ESI): 586,8.

Exemplo 3: Ácido l-ciclopropil-6-fluoro-7-{(RS)-3-[2-fluoro-4-((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)-fenoximetil]-3-hidróxi-pirrolidina-l-il}-4-oxo-l,4-di-hidro-quinolina-3-carboxílico; 3.i. Éster benzílico do ácido dialil-carbâmico:

Cloreto de benzoílo (15,5 mL) foi acrescentado gota a gota durante 30 minutos a uma solução de dialilamina (12,3 mL) e TEA (21 mL) em DCM (100 mL) a 0°C. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. O resíduo obtido depois da elaboração (DCM) foi purificado por cromatografia (Hex/EA 95:5) resultando em 20,71 g (rendimento de 88%) de um líquido incolor. RMN ΤΗ (DMSOde; δ ppm): 3.83 (dt, J = I e J = 6,4H); 5,05-5,18 (m, 6H); 5,70-5,86 (m, 2H); 7,27-7,48 (m, 5H) . 3.ii. Éster benzílico do ácido 2,5-di-hidro-pirrolo-1-carboxílico:

Benzilideno-bis(triciclo-hexil-fosfina)-dicloro ruténio (5 g) foi acrescentado a uma solução do intermediário 3.i (17,56 g) em DCM (1,5 1) à temperatura ambiente sob nitrogénio. A mistura de reação foi agitada a 40°C durante 2 horas e concentrada a vácuo. O resíduo foi 32 purificado por FC (Hex/EA 90:10) resultando em 14,08 g (rendimento de 91%) de um liquido amarelo. RMN XH (DMSOd6; δ ppm) : 4,05-4,16 (m, 4H) ; 5,08 (s, 2H); 5,81-5,92 (m, 2H); 7,27-7,41 (m, 5H). 3.iii. Éster benzílico do ácido (RS)-3-hidróxi-pirrolidina-l-carboxilico:

Uma solução a 1M de borano em THF (9 mL) foi acrescentada a uma solução do intermediário 3.ii (1,81 g) em THF (25 mL) a 0°C sob nitrogénio. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas e foi resfriado a 0°C. NaOH a 20% (1,8 mL) foi cuidadosamente acrescentado gota a gota sendo seguido por peróxido de hidrogénio em solução aquosa a 35% (1,2 mL). A mistura foi agitada a 0°C durante 30 minutos e à temperatura ambiente durante 2 horas. Et2<0 e uma solução aquosa a 40% de bissulfito de sódio foram acrescentados e a mistura de reaçao foi agitada vigorosamente durante 15 minutos. 0 resíduo obtido depois de elaboração (Et20) foi purificado por FC (Hex/EA 5:5 a 3:7) resultando em 1,01 g (rendimento de 51 %) de um óleo incolor. RMN 1R (DMSOde; δ ppm) : 1,67-1,82 (m, 1H); 1,82- 1, 96 (m, 1H) ; 3, 16-3,25 (m, 1H) ; 3,28-3,44 (m, 3H); 4,20- 4, 29 (largo, 1H) ; 4, 92 (d, J = 3, 1H); 5,06 (s, 2H); 7,27- 7,41 (m, 5H). 3.iv. Éster benzílico do ácido 3-oxo-pirrolidino-1-carboxílico:

Uma solução do intermediário 3.iii (1,10 g) em D CM (8 mL) foi resfriada até 0°C e DIPEA (2,5 mL) foi 33 acrescentado gota a gota, seguido por uma solução de complexo de trióxido de enxofre piridina (1,79 g) em DMSO (6,5 mL) . A mistura de reação foi agitada a 0°C durante 1 hora e foi extinta com a adição de água (6 mL) . A fase aquosa foi extraída com Et20/Hex (1:1, 3x5 mL) e as fases orgânicas combinadas foram concentradas a vácuo. 0 resíduo obtido depois da elaboração (Et20/Hex 1:1) foi purificado por FC (Hex/EA 5:5) resultando em 1,05 g (rendimento de 96%) de um óleo amarelado RMN 1R (DMSOd6; δ ppm) : 2,48-2,61 (m, 2H) ; 3,61- 3,80 (m, 4H); 5,09 (s, 2H); 7,27-7,41 (m, 5H). 3.v. Éster benzilico do ácido 3-metileno-pirrolidino-1-carboxílico: t-BuOK (617 mg) foi acrescentado em uma porção a uma suspensão branca de brometo metil-trifenil-fosfónio (1,98 g) em THF (10 mL) à temperatura ambiente sob nitrogénio. A suspensão amarela foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, sendo então resfriada até -10°C. Uma solução do intermediário 3. iv (1,05 g) em THF (2 mL) foi acrescentada gota a gota durante 10 minutos e deixou-se a mistura de reação se aquecer até a temperatura ambiente durante 2 horas. A reação foi extinta pela adição de solução aquosa saturada de NH4C1 (1 mL) e diluída com EA. O resíduo obtido depois da elaboração (EA) foi purificado por cromatografia (Hex/EA 90:10) resultando em 633 mg (rendimento de 64%) de um líquido amarelado. RMN XH (DMSOd6; δ ppm): 2,48-2,61 (m, 2H) ; 3,36- 3,53 (m, 2H) ; 3,84-4,01 (m, 2H) ; 4, 97-5, 03 (m, 2H) ; 5,08 (s, 2H); 7,27-7,41 (m, 5H). 34 3.vi. Éster benzílico do ácido l-oxa-5-aza-espiro[2.4]heptano-5-carboxílico:

Uma solução do intermediário 3.v (7,21 g) em DCM (400 mL) foi tratada com MCPBA (20,1 g) e NaHCC>3 (22,3 g) à temperatura ambiente. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas, diluída com DCM (200 mL) e vertida em uma solução de Na2S03 (45 g) em água (400 mL). A mistura foi agitada durante 10 minutos e a fase orgânica foi separada. O resíduo obtido depois da elaboração (DCM) foi purificado por FC (Hex/EA 6:4) resultando em 4,37 g (rendimento de 56%) de um óleo amarelo. RMN ΤΗ (DMSOde; δ ppm) : 1, 70-1, 83 (m, 1H) ; 2,22- 2,37 (m, 1H) ; 2, 90-2,94 (m, 1H) ; 2,95-2,99 (m, 1H) ; 3,15 (t, J = 11, 1H); 3,39-3,77 (m, 3H); 5,09 (s, 2H); 7,27-7,41 (m, 5H). 3.vii. Éster benzílico do ácido (RS)-3-[2-fluoro-4- ((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)-fenoximetil]-3-hidróxi-pirrolidina-l-carboxílico: K2CO3 (274 mg) foi acrescentado a uma suspensão do intermediário l.i (300 mg) e intermediário 3.vi (338 mg) em DMF (3 mL) . A mistura de reação foi agitada a 80°C durante 3 horas e o solvente foi removido a vácuo. O resíduo obtido depois da elaboração (DCM) foi purificado por FC (DCM/MeOH 95:5) resultando em 531 mg (rendimento de 87%) de uma espuma bege. RMN ΤΗ (DMSOd6 ; δ ppm) : 1,80- -1,92 (m, 1H) ; 1 , 96- 2,08 (m, 1H) ; 3,32-3,59 (m, 5H) ; 3,66 (ddd, J = 3, J = 6 e J = 13, 1H); 3,80 (dd, J = 6 e J = 9 , 1H) ; 3, 97-4,0 9 (m, 3H) ; 4,64-4,72 : (m, 1H); 5, 0 7 (s, 2H) ; 5, 19 (t, J = 6, 1H) ; 35 5,23 (s, 1H) ; 7,18-7,23 (m, 2H) ; 7,27-7,38 (m, 5H) ; 7,57 (dd, J = 2 e J = 14, 1H). MS (ESI) : 460, 9 . 3 .viii . (R) -3-[3-fluoro-4- ( (RS) -3-hidróxi- pirrolidina-3-ilmetóxi)-fenil]-5-hidroximetil-oxazolidina-2-ona:

Uma solução do intermediário 3.vii (259 mg) em THF/MeOH (1:1; 20 mL) foi hidrogenada sobre 10% Pd/C (60 mg) durante 20 horas à temperatura ambiente. A mistura de reação foi concentrada a vácuo, absorvida em DCM/MeOH 90:10 (20 mL) e agitada à temperatura ambiente durante 30 min. O catalisador foi filtrado fora e o filtrado concentrado a vácuo resultando em 184 mg (rendimento de 100%) de uma espuma cor de laranja. MS (ESI): 327,3. 3.ix. Ácido l~ciclopropil-6-fluoro-7-{(RS)-3-[2-fluoro-4- ((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)-fenoximetil]-3-hidróxi-pirrolidina-l-il}-4-oxo-l, 4-di-hidro-quinolina-3-carboxílico:

Uma solução do intermediário 3.viii (226 mg) e complexo de ácido 7-cloro-l-ciclopropil-6-fluoro-1,4-di-hidro-4-oxo-3-quinolina-carboxílico e diacetato de boro (270 mg; preparado de acordo com WO 88/07998) em NMP (5 mL) foi tratada com DIPEA (120 pL) e agitada a 60°C durante 2 horas. A mistura de reação foi concentrada a vácuo e o residuo foi absorvido em HC1 a 5M em MeOH (2 mL). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, concentrada a vácuo e o residuo foi purificado por FC (DCM/MeOH/AcOH 95:4:1 a 90:9:1). O residuo espumoso foi 36 absorvido em MeOH (2 mL), agitado durante 1 hora e filtrado. Os cristais foram coletados e secados a vácuo resultando em 23 mg (rendimento de 6%) de um sólido bege. RMN ΧΗ (DMSOd6; δ ppm) : 1,10-1,34 (m, 4H) ; 1,98-2,10 (m, 1H); 2,14-2,26 (m, 1H); 3,48-3,70 (m, 3H); 3,71-3,89 (m, 5H); 4,05 (t, J = 9, 1H); 4,09-4,18 (m, 2H); 4,66-4,74 (m, 1H); 5,19 (t, J = 6, 1H); 5,40 (s, 1H) ; 7,09 (d, J = 8, 1H); 7,18-7,31 (m, 2H); 7,59 (dd, J = 2 e J = 14, 1H); 7,82 (d, J = 14, 1H) ; 8,59 (s, 1H) ; 15,52 (s, 1H) . MS (ESI): 572,3.

Exemplo 4: Atividade antibacteriana in vitro dos compostos da invenção contra as estirpes de referência de Clostridium difficile ou de Clostridium perfringens: 4.i. Método experimental

As concentrações inibidoras mínimas (MICs) foram determinadas por um ensaio de microdiluição de caldo. Caldo de Brucella suplementado com uma concentração final de 0,5 mg/L de Vitamina KT e 5 mg/L de hemina foi usado como o meio de teste, resumindo foram preparadas soluções base dos compostos em DMSO (5,12 mg/mL) e 5 pL de uma série de diluições em série duplas em 50 % de DMSO/50 % de H2O foram dispensados em placas de microtitulação de 96 poços contendo 45 pL de caldo de Brucella suplementado e foram agitados durante 5 minutos. Para se preparar os inóculos, colónias de C. difficile de 24 horas de idade cultivadas sobre agar de Brucella suplementado com sangue ovino a 5 %, 5 pg de hemina/mL e 1 pg de vitamina Κι/mL foram suspensos em caldo de Brucella suplementado e ajustadas para uma densidade que correspondesse a 0,5 de padrão McFarland. 50 pL de uma diluição de 50 vezes desta suspensão foram usados 37

para inocular os poços da placa de 96 poços resultando em aproximadamente 104 unidades formadoras de colónia (CFU) por poço. A concentração final de DMSO foi de 2,5 %. A faixa de concentrações finais foi de 0,03 - 16 pg/mL. As placas foram incubadas em condições anaeróbicas durante 48 horas a 37°C. Depois da incubação, fez-se a leitura das placas em um leitor de placas a OD595 (ultramark, Biorad Laboratories). As MICs foram inicialmente lidas a concentração mínima mostrando > 90 % de inibição de crescimento em comparação com poços de controlo. As placas foram também verificadas visualmente com o auxílio de um espelho de leitura e as MICs foram confirmadas pela ausência de crescimento visual. 4.ii. Resultados:

Os compostos dos Exemplos 1-3 foram testados in vitro para a sua atividade em inibir o crescimento de três estirpes de referência de C. difficile ou de Clostridium perfringens. Os resultados obtidos estão resumidos na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1 MIC MIC MIC MIC referente referente referente referente a a a a Composto C. C. C. C. testado difficile difficile difficile perfringens ATCC 43596 A TCC 9689 NC 13366 DSM 756 (pg/mL) (pg;mL) (pg/mL) (pg/mL) Ciprofloxacina 8 8 > 16 0,25 Linezolid 8 2 1 4 38

Exemplo 1 0, 125 0, 125 0, 06 < 0,03 Exemplo 2 0, 06 0, 125 0, 03 < 0,03 Exemplo 3 0,25 0,5 0,25 0,125

Os compostos dos exemplos 1-3 mostraram uma atividade potente in vitro contra as estirpes de C. difficile e C. perfringens testadas. Uma atividade intensa foi também observada contra uma estirpe hipervirulenta resistente a quinolona NC13366. Os compostos dos Exemplos 1 e 2 eram ligeiramente mais ativos do que o composto do exemplo 3 e todos os compostos do exemplo eram nitidamente mais ativos do que a ciprofloxacina e linezolida.

Exemplo 5: Atividade antibacteriana in vitro do composto do exemplo 1 contra uma coleção de isolados clínicos de Clostridium difficile: 5.1. Método experimental:

Foi usado o método de diluição em agar de referência recomendado por CLSI para anaeróbios (M11-A6) para se testar a suscetibilidade. Agar de Brucella suplementado com sangue ovino a 5%, 5 pg de hemina/mL e 1 pg de vitamina K1;/mL foi o meio de teste. Os compostos de teste foram diluídos em série e acrescentados ao agar suplementado fundido. Os controlos de crescimento foram colocados em placas isentas de droga. Antes do teste, todos os isolados foram sub-cultivados duas vezes em placas de agar com Brucella enriquecida. As colónias bacterianas foram suspensas em caldo de brucella. A padronização com um colorímetro Vitek foi usada para a preparação de cada inoculo ao equivalente de um padrão de 0,5 McFarland, aproximadamente 104 - 105 CFU por ponto depois da aplicação 39

com um replicador Steers. As placas foram incubadas em condições anaeróbicas durante 48 horas a 37°C. A concentração inibidora minima (MIC) foi a concentração que inibiu completamente o crescimento visível em comparação com o controlo isento de droga. Todos os antibióticos foram preparados e testados juntamente com vancomicina e metronidazol como controleos. 5.11. Resultados: 0 composto do Exemplo 1 foi testado para a sua atividade de inibir o crescimento de uma coleção de 209 diversos isolados clínicos de C. dlfflclle in vitro. O composto do Exemplo 1 apresentou uma MIC90 (concentração inibidor mínima para inibir o crescimento de 90 % de estirpes ou mais) de 0,25 pg/mL, as MICs obtidas variavam de 0,06 a 0,5 pg/mL. Em média ele foi mais ativo do que a vancomicina, metrondazol e linezolida, que tinham MIC90s de 2, 1 e 8 pg/mL, respectivamente.

Exemplo 6: atividade in vitro antibacteriana dos compostos da invenção contra bactéria Gram-positiva aeróbica: 6.1. Método experimental:

As concentrações inibitórias mínimas (MICs) foram determinadas através de um ensaio de microdiluição de caldo seguindo as linhas de direção do Instituto de Padrões Clínicos e Laboratoriais [CLSI, anteriormente NCCLS, 1997]. De maneira resumida, soluções de estoque dos compostos foram preparadas em DMSO (5,12 mg/ml), diluídas em série em Caldo Mueller-Hinton de cátion ajustado II (CaMHB), e dispensadas em placas de microtitulação com a ajuda de um 40 robô de pipetagem Biomek 2000 (Beckman Coulter). A concentração final de DMSO foi de 2,5% ou abaixo. As placas foram inoculadas para atingirem uma concentração, em geral, de 3-6xl05 CFU/ml. Após incubação a 37°C por 18 a 24 horas, as placas foram lidas num leitor de placas a OD595 (Ultramark, Biorad Laboratories). As MICs foram inicialmente lidas na concentração mais baixa que mostra >90% de inibição de crescimento comparada às cavidades de controlo. As placas também foram visualmente checadas com o auxilio de um espelho de leitura, e as MICs foram confirmadas pela ausência de crescimento visual. 6.11. Resultados: O composto do Exemplo 1 foi testado para Bactéria aeróbica Gram-positiva. Os resultados obtidos são sumarizados na Tabela 2 doravante.

Tabela 2

Estirpe MIC medido para vancomicina (pg/ml) MIC medido para ciproflaxacina (pg/ml) MIC medido para linezolida (pg/ml) MIC medido para o composto do Exemplo 1 (pg/ml) S. aureus ATCC 29213 1 0,25 2 0,25 41

Estirpe MIC medido para vancomicina (pg/ml) MIC medido para ciproflaxacina (pg/ml) MIC medido para linezolida (pg/ml) MIC medido para o composto do Exemplo 1 (pg/ml) S. aureus A-79 8 (MRSA) 1 > 16 2 0,25 S. aureus ATCC 43300 (MRSA) 1 0,25 2 0,25 S. aureus SI (LZD-R) 1 0,25 > 32 1 E. faecalis ATCC 29212 1 2 2 0,25 E. faecalis H 4060 > 32 > 16 2 0,25 E. faecalis H 6279 > 32 > 16 2 0,25 42

Estirpe MIC medido para vancomicina (pg/ml) MIC medido para ciproflaxacina (pg/ml) MIC medido para linezolida (pg/ml) MIC medido para o composto do Exemplo 1 (pg/ml) E. faecalis H 6897 > 32 > 16 4 1 E. faecalis H 7094 > 32 > 16 4 0,5 E. faecalis H 7460 > 32 > 16 16 1 E. faecium ATCC 19434 1 8 2 0,25 E. faecium H 9070 > 32 > 16 2 1 E. faecium H 7969 > 32 > 16 4 1 E. faecium H 7 9 6 6 > 32 > 16 1 0,5 43

Estirpe MIC medido para vancomicina (pg/ml) MIC medido para ciproflaxacina (pg/ml) MIC medido para linezolida (pg/ml) MIC medido para o composto do Exemplo 1 (pg/ml) E. faecium H 7965 > 32 > 16 2 0,5 E. faecium H 7937 > 32 > 16 1 0,25 E. faecium A 962 > 32 > 16 4 0,5 E. faecium A 949 > 32 > 16 2 1 E. faecium LI (LZD-R) 0,5 > 16 > 32 2

Em resumo, o composto do Exemplo 1 teve atividade in vitro potente contra estirpes de Staphylococcus aureus, S. aureus MRSA, Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium. 0 mesmo foi ativo contra estirpes resistentes à vancomicina, ciprofloxacina ou linezolida. 44

Exemplo 7: atividade in vitro antibacteriana do composto do Exemplo 1 contra estirpes bacterianas anaeróbicas particulares:

Através do uso do método experimental descrito no Exemplo 5 (vide 5.i), o composto do Exemplo 1 (Ex. 1) foi testado in vitro para a capacidade de inibição do crescimento de certa bactéria anaeróbica que é conhecida ou suspeita de ter uma função na flora intestinal normal e na manutenção de sua função na proteção contra o crescimento exagerado de C. difficile (doravante denominada em grupo "a bactéria intestinal comensal"). Como referências, o composto do Exemplo 5 da WO 2005/058888 (Rl) e ciprofloxacina (CP) foram testados ao mesmo tempo. As MICs obtidas desta forma são mostradas na Tabela 3 a doravante.

Tabela 3

Estirpes MIC (pg/ml) Rl Ex. 1 CP Clostridium difficile A-1179 NC 13366 < 0,06 < 0, 06 > 32 Fusobacterium necrophorum A-1260 DSM 20698 1 1 4 Bacteroides ovatus A-991 ATCC 8483 8 16 16 Bacteroides fragilis A-992 ATCC 25285 2 8 8 Bacteroides thetaiotaomicron A-990 ATCC 29741 4 8 16 Bacteroides vulgatus A-989 ATCC 8482 1 2 32 Bacteroides fragilis A-502 T 2 4 8 45

Estirpes MIC (pg/ml) Ri Ex. 1 CP 7403 Bacteroides fragilis A-348 T 8673 1 2 8 Bacteroides fragilis A-217 B 6306 2 4 8 Bacteroides fragilis A-501 B 8039 4 4 32 Bacteroides fragilis A-294 T 9174 2 4 8 Bacteroides fragilis A-293 B 2518 2 4 8 Bacteroides fragilis A-260 T 9865 1 4 8 Eubacterium limosum A-1259 DSM20698 0, 125 1 2 Finegoldia magna A-1254 DSM20470 < 0,06 0,25 2 Bifidobacterium adolescentis A-1257 DSM 20083 < 0,06 0,5 2 Bifidobacterium bifidum A-1258 DSM20456 0,125 0,5 4 Lactobacillus acidophilus A-1255 DSM 20079 <0,06 0,5 32 Lactococcus lactis A-1256 DSM 20069 < 0,06 0,5 1

Em resumo, o composto do Exemplo 1 mostrou atividade reduzida levando em consideração a bactéria intestinal comensal comparado a C. difficile. Para 46

Bacteroides spp., que são membros importantes da flora intestinal protetora humana, as atividade é 30 a 200 vezes inferior. Esta atividade seletiva oferece o potencial para extermínio seletivo de C. difficile no intestino ao poupar bactérias importantes da flora intestinal.

Além disso, quando comparado ao composto do Exemplo 5 da WO 2005/058888, o composto do Exemplo 1 mostrou na maioria dos casos 2 a 4 vezes menos atividade contra as Bacteroides spp. testadas, 4 vezes menos atividades contra as estirpes de Eubacterium limosum A-1259 ou Finegoldia magna A 1254, 4 a 8 vezes menos atividade contra a Bifidobacterium spp. testada e 8 vezes menos atividade contra as estirpes de Lactobacillus acidophilus A-1255 e Lactococcus lactis A-1256.

Portanto, quando comparado ao composto do Exemplo 5 da WO 2005/058888 (Rl), o composto do Exemplo 1 foi menos ativo significantemente contra a bactéria intestinal comensal, que indica uma vantagem para extermínio seletivo de C. difficile no intestino.

Exemplo 8: efeito do composto do Exemplo 1 na produção de toxinas de C. difficile: 8.i. Método experimental: A estirpe de C. difficile hipertoxigénica NC 13366 foi anaerobicamente cultivada em caldo Brucella suplementado por 24 horas a 37°C para uma densidade de célula de aproximadamente lxlO8 CFU/ml. A bactéria foi lavada por centrifugação e resuspendida no mesmo volume de caldo Brucella suplementado que contém antibióticos a 1 e 8 pg/ml, respectivamente. O controlo não continha antibiótico. As culturas foram adicionalmente incubadas 47 anaerobicamente a 37°C. No dia 5, foram coletados supernadantes de cultura e analisados para toxina A e toxina B conforme descrito posteriormente no presente documento. A toxina A foi detectada através de Western Blotting com o uso do Sistema de Análise de Proteína Grande NuPage (Invitrogen LP0001, de acordo com as instruções do kit). 0 kit de imunodetecção anti-camundongo Western Breeze (Invitrogen WB7103) com anticorpos monoclonais de camundongos anti CdTA (PCG4.1, Biodesign C70517M) foi usado. A toxina citotóxica de C. difficile (toxina B) foi semiquantitativamente detectada através de testagem de supernadantes de culturas de C. difficile para atividade de contorno de célula em células CHO. As células CHO foram cultivadas em placas de fundo plano com 96 cavidades (lxlO5 células/cavidade) e permitidas para ligarem-se por 3 horas.

As diluições apropriadas de supernadantes de filtro esterilizados foram adicionadas às células e incubadas adicionalmente a 37°C, em 5% C02. Após 20 horas de incubação, o contorno de célula foi determinado com o uso de um microscópio invertido. O título da toxina foi definido como a diluição em 10 vezes da série mais elevada do supernadante resultando em contorno de célula >90%.

As unidades que formam colónia (CFU) foram determinadas através do plaqueamento de diluições apropriadas de amostras de testagem em Agar Brucella suplementado e contagem de colónia após 48 horas de incubação a 37°C sob condições anaeróbicas. 8.ii Resultados: 48 A percepção de uma placa de Western Blot para analisar a produção de toxina A em supernadantes de culturas de célula de alta densidade estática de C. difficile NC 13366 (uma estirpe do tipo NAPI/027a hiperprodutora de toxina que causou ataques em hospitais com alta mortalidade) é mostrada na Figura 1. 0 método experimental mencionado no parágrafo 8.i foi usado para obter o resultado mostrado na Figura 1. No dia 1 (Dl), as culturas foram tratadas com o composto do Exemplo 1 (Ex. 1), vancomicina (V) , metronidazole (M) ale 8 yg/ml ou deixadas sem tratamento (U) ; no dia 5 (D5), os conteúdos de toxina A nos supernadantes foram analisados e comparados àqueles observados no Dl (vide Figura 1) . Em culturas de fase estacionária de cinco dias de alta densidade de C. difficile toxigénico, o composto do Exemplo 1 inibiu de novo a produção de toxina A a concentrações de 1 e 8 pg/ml, isto é, a 2 e 16x a MIC (vide Figure 1). Em contraste, a metronidazole e vancomicina nao inibiram a produção de toxina A sob estas condições ou apenas o fizeram fracamente. Os sobrenadantes da cultura também foram analisados para a toxina B citotóxica através do uso de um ensaio de contorno de células com base celular mencionado no parágrafo 8.i. As atividades dos supernadantes de culturas tratadas com o composto do Exemplo 1 foram reduzidas a >90% comparadas ao controlo não tratado. Em contraste, as atividades de supernadantes de culturas tratadas com vancomicina não foram reduzidas (a 1 pg/ml) ou reduzidas a apenas 30% (a 8 pg/ml).

Em resumo, o composto do Exemplo 1 tem a capacidade de interromper de forma eficaz a síntese de 49 toxinas A e B de C. difficile mesmo em culturas estáticas de alta densidade e na ausência de extermínio, que não é o caso para vancomicina e metronidazole, os fármacos favorecidos usados atualmente para o tratamento de infecções de C. difficile.

Exemplo 9: efeito do composto do Exemplo 1 na formação de esporos de C. difficile: 9.i. Método experimental: C. difficile A-1050 (ATCC 43596) foi cultivada para crescimento logarítmico em caldo Brucella suplementado resultando em turvação que corresponde ao padrão McFarland 0,5 (6 a 7 horas a 37°C sob condições anaeróbicas) . As culturas foram diluídas a 1:50 em tubos que contêm lml de caldo Brucella suplementado que contém os antibióticos a várias concentrações em etapas de diluição de 2 vezes. Os tubos foram incubados adicionalmente por 4 dias a 37°C sob condições anaeróbicas. A MIC foi definida com a concentração que inibiu completamente o crescimento visível (turvação) . 0,5x MIC foi a concentração mais elevada de fármaco que permite crescimento visível. A estimativa de unidades que formam colónia (CFUs) de células total foi realizada através de plaqueamento apropriado de diluições de 10 vezes das culturas em Agar de Brazier que contém 4% de suspensão de gema de ovo e 1% de sangue de cavalo lisado (Lab M) . As colónias foram contadas após incubação a 37°C por 48 horas sob condições anaeróbicas. A contagem de esporos foi feita através de exterminação seletiva de células vegetais ao tratar com etanol a 50% por 1 hora à temperatura ambiente e 50 a contagem de CFU subsequente em Agar de Braziers conforme detalhado acima. 9. ii Resultados: C. difficile é um organismo que forma esporos e os esporos podem persistir por um longo período de tempo no meio hospitalar. Os esporos são muitos resistentes aos procedimentos comuns de desinfecção. Portanto, os esporos têm função importante na transmissão e persistência de infecções de C. difficile. Durante crescimento in vitro, as culturas de C. difficile foram tratadas com várias concentrações sub-MIC do composto do Exemplo 1, vancomicina ou metronidazole e investigadas para o efeito na produção de esporos após 4 dias de incubação anaeróbica a 37°C (vide parágrafo 9.i). A uma concentração que representa 0,5x a MIC, o tratamento com o composto do Exemplo 1 resultou em baixa contagem de esporos (<1% de esporos de contagem total de células) . Em contraste, as culturas não tratadas e as culturas tratadas com metronidazole ou vancomicina a concentrações de 0,5x a MIC, mostraram taxas de criação de esporos (>90% de esporos de contagem de células total). Isto indica que o composto do Exemplo 1 teve o potencial para reduzir a produção de esporos durante o tratamento de infecção de C. difficile de forma mais eficaz que vancomicina ou metronidazole.

Exemplo 10: atividade in vivo de um composto da invenção no modelo de hamster de C. difficile: lO.i. Método experimental: 51

Foi dada aos hamsters sírios dourados uma única injeção de fosfato de clindamicina (10 mg/kg s.c), e os animais de um dia depois foram infectados através de engorda com 105 CFU de estirpe de C difficile toxigénica 10465. Uma colite fulminante ocorre na maioria (95%) dos animais e se desenvolve 1 a 2 dias após a administração de C. difficile. Quando não tratada, a colite progride rapidamente e se transforma em colite severa, necrose hemorrágica do ceco e morte. O composto do Exemplo 1 foi oralmente administrado como uma suspensão a três níveis de dosagem (10 mg/kg, 30 mg/kg e 100 mg/kg; n = 10 por grupo). Foi usada a vancomicina (50 mg/kg) como um controlo. Os animais foram tratados uma vez ao dia por 5 dias e, mais tarde, mantidos em observação por 21 dias adicionais.

Os animais foram observados três vezes ao dia para morbidade e presença ou ausência de diarreia. O ponto final do estudo foi a sobrevivência. Os animais julgados em estado moribundo [período estendido de perda de peso em progresso para um estado de emagrecimento, anorexia por 24 a 48 horas, letargia prolongada (mais de 3 dias), sinais de paralisia, trauma ou erosões na pele, postura curvada, abdómen distendido] foram eutanizados através de uma única injeção de pentobarbital de sódio. 10.ii. Resultados: A utilidade terapêutica do composto do Exemplo 1 foi testada com o uso do protocolo do parágrafo 10.i. Todos os animais não tratados infectados morreram entre 2 a 5 dias após a infecção enquanto os animais tratados com 10, 30 ou 100 mg/kg do composto do Exemplo 1 sobreviveram durante o período de tratamento de 5 dias. No nível de 52 dosagem inferior, 40% dos animais sobreviveram a fase de reincidência de 21 dias após o tratamento, enquanto nos grupos de 30 e 100 mg/kg, 80 e 100% dos animais sobreviveram sem reincidência. A vancomicina com uma dose de 50 mg foi usado como um controlo. Estes resultados demonstraram que o composto do Exemplo 1 tem a capacidade de tratar os animais com infecções de C. difficile comparável à vancomicina. 53

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Ά presente listagem de referências citadas pela requerente é apresentada meramente por razões de conveniência para o leitor. Não faz parte da patente de invenção europeia. Embora se tenha tomado todo o cuidado durante a compilação das referências, não é possível excluir a existência de erros ou omissões, pelos quais o EPO não assume nenhuma responsabilidade.

Patentes de invenção citadas na descrição • WO 03032962 A [0006] • WO 2004096221 A [0006] [0028] [0036] • WO 2005058888 A [0006] [0058] [0060] [0061] • WO 8807998 A [0026] [0039] [0049] • EP 241206 A [0031] • EP 550025 A [0031] • US 4244961 A [0037]

Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição • W.N. Al-Nassir et al. Antimicrob. Agents Chemother.,28 April 2008 [0004] • Salt selection for basic drugs. Int. J. Pharm., 1986,vol. 33, 201-217 [0008] • Pharmaceutical Manufacturing. Remington. The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins, 2005 [0012] • Kocienski, P.J. Protecting groups. Thieme, 1994 [0015] [0016] [0022] [0024] 54

Kocicnski, P.J. Protecting groups. Thieme, 1994 [0016] J. Am. Chem. Soc., 1988, vol. 110, 1968 [0031] J. Am. Chem. Soc., 1965, vol. co 1353-1364 [0031] Tetrahedron Lett., 1987, vol. 28, 1877-1878 [0031]

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto da Fórmula I í rV/ % \ Λ'x x j\ /"Λ J <f em que A é N ou CH; e n é 0 ou 1; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a prevenção ou o tratamento de doenças intestinais que são causadas por bactérias selecionadas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens ou Staphylococcus aureus.

2. Composto da Fórmula I, de acordo com a reivindicação 1 para o uso mencionado na reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que A é CH.

3. Composto da Fórmula I, de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para o uso mencionado na reivindicação 1, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que n é 1.

4. Composto da Fórmula I, de acordo com a reivindicação 1, o qual é selecionado entre: ácido l-ciclopropil-6-fluoro-7-{4-[2-fluoro-4- ((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)-fenoximetil]-4-hidróxi-piperidina-l-il}-4-oxo-l,4-di-hidro-quinolina-3-carboxílico; ácido 1-ciclopropi1-6-fluoro-7-{4-[2-fluoro-4- ((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)-fenoximetil]-4-hidróxi-piperidina-l-il}-4-oxo-l,4-di-hidro-[1,8]— naftiridina-3-carboxílico e 2 ácido l-ciclopropil-6-fluoro-7-{3-[2-fluoro-4- ((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)-fenoximetil]-3-hidróxi-pirrolidina-l-il}-4-oxo-l,4-di-hidro-quinolina-3-carboxílico; ou um sal farmaceuticamente aceitável de tal composto, para a prevenção ou o tratamento de doenças intestinais que são causadas por bactérias selecionadas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens ou Staphylococcus aureus.

5. Composto da Fórmula I, de acordo com a reivindicação 1 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, que consiste no ácido l-ciclopropil-6-fluoro-7-{4-[2-fluoro-4-((R)-5-hidroximetil-2-oxo-oxazolidina-3-il)- fenoximetil]-4-hidróxi-piperidina-l-il}-4-oxo-l,4-di-hidro-quinolina-3-carboxílico ou num seu sal farmaceuticamente aceitável, para a prevenção ou o tratamento de doenças intestinais que são causadas por bactérias selecionadas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens ou Staphylococcus aureus.

6. Composto da Fórmula I, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, para a prevenção ou o tratamento de doenças intestinais que são causadas por Clostridium difficile. 1. Composto da Fórmula I, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, para a prevenção ou o tratamento de doenças intestinais que são causadas por uma estirpe de Clostridium difficile produtora de toxina.

8. Composto da Fórmula I, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, para a prevenção ou o tratamento de doenças 3 diarreicas associadas com estirpes enterotoxigénicas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens ou Staphylococcus aureus sem aumentar a concentração de enterococos resistentes a vancomicina no intestino.

9. Composto da Fórmula I, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, para a prevenção ou o tratamento de doenças diarreicas associadas com estirpes enterotoxigénicas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens ou Staphylococcus aureus e a redução da concentração de enterococos resistentes a vancomicina no intestino.

10. Uso de Composto da Fórmula I, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, ou de um sal farmaceuticamente aceitável de tal composto, para a fabricação de um medicamento destinado a prevenir ou tratar uma doença intestinal que é causada por bactérias selecionadas de Clostridium difficile, Clostridium perfringens e Staphylococcus aureus.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, em que o medicamento fabricado é destinado a tratar a doença intestinal.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 10, em que o medicamento fabricado é destinado a prevenir a doença intestinal.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 10, em que o medicamento fabricado é também destinado a não aumentar a concentração de enterococos resistentes a vancomicina no intestino.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 10, em que o medicamento fabricado é também destinado a reduzir a 4 4 no concentração de enterococos resistentes a vancomicina intestino.