CN101970450B - 新蛇菊苷a衍生产物和制备方法 - Google Patents

新蛇菊苷a衍生产物和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明的示例性实施方式包括用于降解新蛇菊苷A的方法和由其衍生的新蛇菊苷A衍生产物。具体地，本发明涉及用于降解新蛇菊苷A组合物以获得适合用作增甜剂组合物的新蛇菊苷A衍生产物的方法。

Description

新蛇菊苷A衍生产物和制备方法
发明领域
本发明一般涉及新蛇菊苷A的衍生产物和用于制备新蛇菊苷A衍生产物的方法。
发明背景
新蛇菊苷A是具有以下化学结构的高效二萜类糖苷增甜剂：
新蛇菊苷与其它甜菊糖醇糖苷一起从甜叶菊(Stevia rebaudiana)(Bertoni)植物(“甜菊糖甙”)中分离和提取，其在商业上种植于日本、新加坡、台湾、马来西亚、南韩、中国、以色列、印度、巴西、澳大利亚和巴拉圭。其是具有优于多种其它无热量的增甜剂的功能和感觉特征的天然无热量的增甜剂。甜菊糖甙的加工形式可以比糖有效70至400倍；甜菊糖甙也具有苦的组分。在甜菊糖甙中存在的四种主要的二萜类糖苷增甜剂中，新蛇菊苷A已经被鉴定为品尝后最低收敛、苦味最低且持续最短。然而，新蛇菊苷A仍然展现了使之区别于糖的味道和味觉特征。因此，可以期望改进新蛇菊苷A以获得用作增甜组合物但比新蛇菊苷A展现出更期望的味道和/或时间特征的新的化合物。
发明概述
本发明的示例性实施方式通过提供用于制备用作增甜组合物的新蛇菊苷A衍生产物的方法和从其产生的新蛇菊苷A衍生产物满足了上面确定的需要。
具体地，本文提供的实施方式包括通过在约50℃至约110℃加热新蛇菊苷A溶液和无机酸，持续足以完成反应的时间来制备新蛇菊苷A衍生产物的方法，和由此获得新蛇菊苷A衍生产物。
在其它实施方式中，提供了包含新蛇菊苷A衍生产物的增甜剂。新蛇菊苷A衍生产物包括具有化学式I的新蛇菊苷A衍生化合物：
其中R1可以是单糖、包含两种或三种糖的寡糖、烷基或羟基；
其中R2可以是氢、羟基或烷氧基；
其中R3可以是氢、羟基、烷氧基、烯基、炔基，直链的、支链的或环状的烷基、烯基或炔基，取代的或未取代的芳基、杂芳基、杂环或酰基；
其中x可以是单键或双键；其中n是0或1；且
其中当x是单键，n是1时，R2可以是氢、羟基或烷氧基；且其中当x是双键时，n是0。
在式I的新蛇菊苷A衍生产物的具体实施方式中，其中x是单键且n是1，新蛇菊苷A衍生产物包括具有化学式IA的新蛇菊苷A衍生化合物：
其中R1可以是单糖、包含两种或三种糖的寡糖、烷基或羟基；
其中R2可以是氢、羟基或烷氧基；且
其中R3可以是氢、羟基、烷氧基、烯基、炔基，直链的、支链的或环状的烷基、烯基或炔基，取代的或未取代的芳基、杂芳基、杂环或酰基。
在式I的新蛇菊苷A的衍生产物的另一具体实施方式中，其中x是双键且n是0，新蛇菊苷A衍生产物包括具有化学式IB的新蛇菊苷A衍生化合物：
其中R1可以是单糖、包含两种或三种糖的寡糖、烷基或羟基；且
其中R3可以是氢、羟基、烷氧基、烯基、炔基，直链的、支链的或环状的烷基、烯基或炔基，取代的或未取代的芳基、杂芳基、杂环或酰基。
在另一实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物包括具有以下化学式的新蛇菊苷A衍生化合物：
其中R4可以是单糖。
在又一实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物包括具有以下化学式的新蛇菊苷A衍生化合物。
其中R1可以是单糖、包含两种或三种糖的寡糖、烷基或羟基；
其中R3可以是氢、羟基、烷氧基、烯基、炔基、直链的、支链的或环状的烷基、烯基、炔基，取代的或未取代的芳基、杂芳基、杂环或酰基。
在又一实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物包括具有以下化学式的新蛇菊苷A衍生化合物：
根据下面详细的说明书、附图和权利要求，本发明的其它目标、特征和优势将是明显的。除非另外定义，否则本文使用的所有的技术术语和缩写与科学术语和缩写具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。虽然类似或等同于本文描述的方法和组合物的方法和组合物可以用于本发明的实践，但是描述了合适的方法和组合物，且不期望任何这些方法和组合物限制本发明。
发明详述
现在将对提供的本发明的实施方式做出详细的引用。通过本发明的实施方式的说明提供各个实施例，并且不限制本发明。实际上，在本发明中可以做出多种改进和变型而不偏离本发明的精神或范围，这对于本领域技术人员是显然的。例如，作为一个实施方式的一部分说明和描述的特征可以在另一实施方式上使用以产生更进一步的实施方式。因此，期望本发明涵盖在所附权利要求和它们的等同要求的范围内的这些改进和变型。
简洁地描述，本发明的实施方式包括新蛇菊苷A衍生产物和用于制备新蛇菊苷A衍生产物的方法。具体地，本文提供的实施方式包括适合用作增甜剂的新蛇菊苷A衍生产物。
I.制备新蛇菊苷A衍生产物的方法
在具体的实施方式中，提供了制备新蛇菊苷A衍生产物的方法。
用于制备新蛇菊苷A衍生产物的方法一般包括：制备包含新蛇菊苷A化合物和无机酸或碱的粗制的或基本上纯的新蛇菊苷A组合物的溶液，加热或加压(或其组合)该溶液到足以使新蛇菊苷A化合物反应的温度和压力，持续足以获得新蛇菊苷A衍生产物的时间，并回收该新蛇菊苷A衍生产物。在一种实施方式中，足以使新蛇菊苷A化合物反应的温度的范围从约50℃至约110℃，更具体地从约65℃至约95℃，且又更具体地从约75℃至约85℃。本领域普通技术人员已知的任何合适的加热方法可以用于加热该溶液，其非限制性的实例包括日光或升高的环境温度。在一种实施方式中，足以使新蛇菊苷A化合物反应的时间的范围从约0.5小时至约24小时。
适合用于本文的实施方式的无机酸的非限制性实例包括：磷酸、亚磷酸、多磷酸、盐酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸二氢钠及其组合。适合用于本文的实施方式的无机碱的非限制性实例包括：氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸镁、碳酸钙及其组合。不期望受任何理论的限制，认为使用酸将引起烯烃的水合和/或酯的分解，而使用碱将引起皂化反应，其需要加入无机酸以重新形成羧酸。
如本文所用，粗制新蛇菊苷A组合物包括按干重计少于约80％新蛇菊苷A化合物、按干重计少于约70％或少于按干重计约60％的新蛇菊苷A化合物的纯度水平。
如本文所用，基本上纯的新蛇菊苷A组合物包括按干重计等于或大于80％新蛇菊苷A化合物多至按干重计约100％，按干重计大于约90％，按干重计大于约97％A，按干重计大于约98％，或按干重计大于约99％的新蛇菊苷A化合物的纯度水平。如此处所用，纯度表示在粗制或纯的形式中新蛇菊苷A化合物或新蛇菊苷A衍生化合物的重量百分比。纯化粗制新蛇菊苷A化合物以获得基本上纯的新蛇菊苷A组合物的方法在下文中描述。
产生的新蛇菊苷A衍生产物基本上包括上清液和沉淀的混合物。在具体的实施方式中，回收新蛇菊苷A衍生产物的步骤包括分离上清液、沉淀或其组合。使用任何合适的固-液分离技术可以回收新蛇菊苷A衍生产物。例如，可以通过从沉淀中倾析上清液，将上清液和沉淀的衍生产物彼此分离。其它分离技术可以使用离心力，其非限制性的实例包括垂直和水平的多孔篮式离心(perforated basket centrifuge)、固体沉降式离心(solid bowlcentrifuge)、沉降式离心、卧式刮刀卸料离心(peeler type centrifuge)、卧式活塞推料离心(pusher type centrifuge)、Heinkel式离心、盘式层叠离心和气旋式分离。此外，上清液和沉淀中新蛇菊苷A衍生产物的分离可以通过任何的压力、真空和重力过滤方法提高，所述方法包括，但不限于，使用带式、鼓式、nutsche型、叶式、板式、Rosenmund型、火花型和袋式的过滤器和压滤机。
回收的上清液新蛇菊苷A衍生产物任选地可以用含水的有机溶液澄清，而回收的沉淀新蛇菊苷A衍生产物任选地可以被溶解在含水有机溶液(例如，甲醇、乙醇、异丙醇、正丙醇或混合物)中。
本领域普通技术人员应当理解：新蛇菊苷A衍生产物在其制备之后通常不是以纯的形式存在。因此，在具体的实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物可以包括按新蛇菊苷A衍生化合物的重量计从约0.5％至约50％的量或其间的任何量(即，约0.5％至约45％、约0.5％至约40％、约0.5％至约35％、约0.5％至约30％、约0.5％至约25％、约0.5％至约15％、约0.5％至约10％、约0.5％至约5％等等)。
在其它具体的实施方式中，制备新蛇菊苷A衍生产物的方法进一步包括纯化新蛇菊苷A衍生产物。例如，新蛇菊苷A衍生产物可以通过正相和/或反相柱色谱法从上清液或沉淀纯化。用于纯化新蛇菊苷A衍生产物的合适的柱可以由本领域普通技术人员不经过度实验来确定。在具体实施方式中，产生的新蛇菊苷A衍生产物的级分可以被再处理(例如，使用柱色谱法或其它纯化方法)以进一步纯化新蛇菊苷A衍生产物。在又一其它实施方式中，产生的新蛇菊苷A衍生产物的级分可以使用本领域普通技术人员已知的任何合适的浓缩方法(例如，高效液相色谱法)来浓缩。
因此，具体的实施方式可以包括具有期望的纯度水平的新蛇菊苷A衍生产物。例如，在一种实施方式中新蛇菊苷A衍生产物可以包括按新蛇菊苷A衍生化合物的重量计(在干燥基础上)约50％至约99.5％、约75％至约99.5％、约80％至约99.5％、约85％至约99.5％、约90％至约99.5％、约95％至约99.5％、约97％至约99.5％、约98％至约99.5％，或约99％至约99.5％。
如本文所用，短语“新蛇菊苷A衍生产物”与“新蛇菊苷A降解产物”同义并包括单个新蛇菊苷A衍生化合物和新蛇菊苷A衍生化合物的组合两者。例如，产生的新蛇菊苷A衍生产物的具体实施方式可以包括单个新蛇菊苷A衍生化合物、两种新蛇菊苷A衍生化合物的组合、三种新蛇菊苷A衍生化合物的组合、四种或更多新蛇菊苷A衍生化合物的组合，以及类似物。产生的新蛇菊苷A衍生产物也可以包括残余的新蛇菊苷A(即，未降解的新蛇菊苷A)。
II.新蛇菊苷A衍生产物
在具体实施方式中，提供了具有化学式I的新蛇菊苷A衍生化合物：
其中R1可以是单糖、包含两种或三种糖的寡糖、烷基或羟基；
其中R2可以是氢、羟基或烷氧基；
其中R3可以是氢、羟基、烷氧基、烯基、炔基，直链的、支链的或环状的烷基、烯基或炔基，取代的或未取代的芳基、杂芳基、杂环或酰基；
其中x可以是单键或双键；
其中n是0或1；且
其中当x是单键，n是1时，R2可以是氢、羟基或烷氧基；且其中当x是双键时，n是0。
本领域普通技术人员应当理解本文提供的新蛇菊苷A衍生产物的实施方式可以具有通过(R，S)表示的多个立构中心，如参考具有化学式I的新蛇菊苷A衍生化合物所说明：
本文预期新蛇菊苷A衍生化合物的实施方式包含一个或多个立构中心，取决于原子在空间的排列和方向，各个立构中心可以处于R或S构型。除非另外表明，否则应当理解本文提供的新蛇菊苷A衍生化合物的实施方式可以包括任何合适的立体化学构型。例如，在具体实施方式中，具有化学式I的新蛇菊苷A衍生化合物具有以下化学结构：
在式I的新蛇菊苷A衍生产物的一种实施方式中，其中x是单键且n是1，新蛇菊苷A衍生化合物具有化学式IA：
其中R1可以是单糖、包含两种或三种糖的寡糖、烷基或羟基；
其中R2可以是氢、羟基或烷氧基；且
其中R3可以是氢、羟基、烷氧基、烯基、炔基，直链的、支链的或环状的烷基、烯基或炔基，取代的或未取代的芳基、杂芳基、杂环或酰基。
在式IA的新蛇菊苷A衍生化合物的子实施方式中，其中R1包括包含三种糖的寡糖，R2包括羟基，且R3包括羧基-取代的糖类，新蛇菊苷A衍生产物包括具有化学式II的新蛇菊苷A衍生化合物：
在式IA的新蛇菊苷A衍生化合物的另一子实施方式中，其中R1包括包含三种糖的寡糖，R2包括羟基，且R3包括羧基，新蛇菊苷A衍生产物包括具有化学式III的新蛇菊苷A衍生化合物：
在式I的新蛇菊苷A衍生化合物的一种实施方式中，其中x是双键且n是0，新蛇菊苷A衍生化合物具有化学式IB：
其中R1可以是单糖、包含两种或三种糖的寡糖、烷基或羟基；且
其中R3可以是氢、羟基、烷氧基、烯基、炔基，直链的、支链的或环状的烷基、烯基或炔基，取代的或未取代的芳基、杂芳基、杂环或酰基。
在式IB的新蛇菊苷A衍生产物的子实施方式中，其中R1是包含三种糖的寡糖，且R3包括羧基-取代的糖类，新蛇菊苷A衍生产物包括具有化学式IV的新蛇菊苷A衍生化合物：
在式IB的新蛇菊苷A衍生产物的另一子实施方式中，其中R1是包含三种糖的寡糖且R3是羧基，新蛇菊苷A衍生产物包括具有化学式V的新蛇菊苷A衍生化合物：
如上文所描述，新蛇菊苷A衍生产物可以具有本领域普通技术人员已知的任何合适的立体化学构型。例如，具有化学构型II、III、IV和V的前面的化合物的具体立体化学构型可以分别包括具有化学式II’、III’、IV’和V’的立体化学构型的化合物：
在另一实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物包括具有化学式VI的化合物：
其中R4可以是单糖。
在化学式VI的新蛇菊苷A衍生产物的子实施方式中，其中R4是葡萄糖，新蛇菊苷A衍生产物包括具有化学式VII的新蛇菊苷A衍生化合物：
在另一实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物包括具有化学式VIII的新蛇菊苷A衍生化合物：
其中R1可以是单糖、包含两种或三种糖的寡糖、烷基或羟基；且
其中R3可以是氢、羟基、烷氧基、烯基、炔基，直链的、支链的或环状的烷基、烯基、炔基，取代的或未取代的芳基、杂芳基、杂环或酰基。
在式VIII的新蛇菊苷A衍生产物的子实施方式中，其中R1是甲基且R3是葡萄糖，新蛇菊苷A衍生产物包括具有化学式IX的新蛇菊苷A衍生化合物：
在又一实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物包括具有化学式X的新蛇菊苷A衍生化合物：
如上文所描述，前面所述的新蛇菊苷A衍生产物可以具有本领域普通技术人员已知的任何合适的立体化学构型。例如，具有化学式VII、IX和X的化合物的具体立体化学构型可以分别包括具有化学式VII’、IX’和X’的立体化学构型的化合物：
如之前所列，具体的实施方式包括前面所述的任何期望的纯度水平的新蛇菊苷A衍生产物。例如，在一种实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物可以包括任何合适的纯度水平的具有化学式I的新蛇菊苷A衍生化合物、具有化学式II的新蛇菊苷A衍生化合物、具有化学式III的新蛇菊苷A衍生化合物、具有化学式IV的新蛇菊苷A衍生化合物、具有化学式V的新蛇菊苷A衍生化合物、具有化学式VI的新蛇菊苷A衍生化合物、具有化学式VII的新蛇菊苷A衍生化合物、具有化学式VIII的新蛇菊苷A衍生化合物、具有化学式IX的新蛇菊苷A衍生化合物、具有化学式X的新蛇菊苷A衍生化合物，或其任何组合。
例如，在一种实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物可以包括按具有化学式II的新蛇菊苷A衍生化合物的重量计(在干燥基础上)约50％至约99.5％、约75％至约99.5％、约80％至约99.5％、约85％至约99.5％、约90％至约99.5％、约95％至约99.5％或任何其间的量。在一种实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物可以包括按具有化学式III的新蛇菊苷A衍生化合物的重量计(在干燥基础上)约50％至约99.5％、约75％至约99.5％、约80％至约99.5％、约85％至约99.5％、约90％至约99.5％、约95％至约99.5％或任何其间的量。在一种实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物可以包括按具有化学式IV的新蛇菊苷A衍生化合物的重量计(在干燥基础上)约50％至约99.5％、约75％至约99.5％、约80％至约99.5％、约85％至约99.5％、约90％至约99.5％、约95％至约99.5％或任何其间的量。在一种实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物可以包括按具有化学式V的新蛇菊苷A衍生化合物的重量计(在干燥基础上)约50％至约99.5％、约75％至约99.5％、约80％至约99.5％、约85％至约99.5％、约90％至约99.5％、约95％至约99.5％或任何其间的量。在一种实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物可以包括按具有化学式VII的新蛇菊苷A衍生化合物的重量计(在干燥基础上)约50％至约99.5％、约75％至约99.5％、约80％至约99.5％、约85％至约99.5％、约90％至约99.5％、约95％至约99.5％或任何其间的量。在一种实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物可以包括按具有化学式IX的新蛇菊苷A衍生化合物的重量计(在干燥基础上)约50％至约99.5％、约75％至约99.5％、约80％至约99.5％、约85％至约99.5％、约90％至约99.5％、约95％至约99.5％或任何其间的量。在一种实施方式中，新蛇菊苷A衍生产物可以包括按具有化学式X的新蛇菊苷A衍生化合物的重量计(在干燥基础上)约50％至约99.5％、约75％至约99.5％、约80％至约99.5％、约85％至约99.5％、约90％至约99.5％、约95％至约99.5％或任何其间的量。
III.新蛇菊苷A的纯化
可以从甜菊植物提取的其原始形式或纯的形式的粗制新蛇菊苷A组合物获得新蛇菊苷A衍生产物。在具体实施方式中，使用以下公开的方法在其衍生之前纯化新蛇菊苷A组合物：2007年5月21日提交的美国专利申请第11/751,627号，其要求2006年6月19日提交的美国临时申请第60/805,216号的优先权，和2007年2月12日提交的美国临时申请第60/889,318号，其公开内容以其整体通过引用并入本文
简单地描述，粗制新蛇菊苷A组合物可以通过重结晶纯化。通过HPLC鉴定的主要杂质是甜甙A、蛇菊苷、甜菊双糖甙(steviolbioside)、新蛇菊苷B、新蛇菊苷C、新蛇菊苷D和新蛇菊苷F。新蛇菊苷D杂质可以通过增加含水有机重结晶溶剂中的水量而除去；然而，结晶溶剂中过多的水含量将引起新蛇菊苷A回收的降低。新蛇菊苷B杂质可以通过使粗制新蛇菊苷A组合物在含水有机溶液中成浆或通过用阴离子交换树脂处理粗制新蛇菊苷A溶液而显著减少。因此，纯化方法取决于粗制新蛇菊苷A原材料中存在的杂质。
在示例性实施方式中，可以通过合并粗制新蛇菊苷A组合物与含水有机溶液以形成新蛇菊苷A溶液来纯化新蛇菊苷A组合物。含水有机溶液包括按重量计约10％至约25％的量的水和至少一种有机溶剂。可选地，含水有机溶液包括按重量计约15％至约20％的量的水和至少一种有机溶剂。
如本文所用，含水有机溶剂指水和至少一种有机溶剂的混合物。有机溶剂的非限制性实例包括醇、丙酮和乙腈。如本文所用，醇指连接至少一个羟基部分的任何直链的、支链的或环状的；取代的或未取代的烷基、烯基或炔基。醇的非限制性实例包括乙醇、甲醇、异丙醇、1-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇和异丁醇。
在示例性实施方式中，含水有机溶液包括水和至少一种有机溶剂的混合物。在另一示例性实施方式中，至少一种有机溶剂包括醇，该醇包含乙醇、甲醇或其混合物。在示例性的实施方式中，其中至少一种有机溶剂包括乙醇和甲醇的混合物，该乙醇和甲醇在含水有机溶剂中以重量比在约20份至约1份乙醇对约1份甲醇的范围合并。在另一示例性实施方式中，该乙醇和甲醇在含水有机溶剂中以重量比在约3份至约1份乙醇比约1份甲醇的范围合并。
在示例性实施方式中，新蛇菊苷A溶液包含重量比在约10份至约4份含水有机溶剂比约1份粗制新蛇菊苷A组合物的范围的含水有机溶剂和粗制新蛇菊苷A组合物。在另一示例性实施方式中，新蛇菊苷A溶液包含重量比在约5份至约3份含水有机溶剂比约1份粗制新蛇菊苷A组合物的范围的含水有机溶液和粗制新蛇菊苷A组合物。
在示例性的实施方式中，该方法在约室温进行。在另一实施方式中，该方法进一步包括加热新蛇菊苷A溶液的步骤。在一种实施方式中，加热新蛇菊苷A溶液的步骤包括将新蛇菊苷A溶液的温度加热至约20℃至约70℃的范围内，更期望地在约20℃至约50℃的范围内，且又更期望地在约20℃至约40℃的范围内。在另一实施方式中，加热新蛇菊苷A溶液的步骤包括将新蛇菊苷A溶液加热至回流温度。加热新蛇菊苷A溶液的步骤包括将新蛇菊苷A溶液加热约0.25小时至约8小时。在另一示例性实施方式中，其中用于纯化新蛇菊苷A的方法包括加热新蛇菊苷A溶液的步骤，该方法进一步包括冷却新蛇菊苷A溶液的步骤。在一种实施方式中，冷却新蛇菊苷A溶液的步骤包括将新蛇菊苷A溶液的温度冷却至约4℃至约25℃的范围内。冷却新蛇菊苷A溶液的步骤包括将新蛇菊苷A溶液冷却约0.5小时至约24小时。
用于纯化新蛇菊苷A的方法进一步包括在单个步骤中从新蛇菊苷A溶液结晶出基本上纯的新蛇菊苷A组合物的步骤，所述新蛇菊苷A组合物包括按干重计大于约95％的量的新蛇菊苷A化合物。在其它示例性的实施方式中，基本上纯的新蛇菊苷A组合物包括按干重计大于约97％的新蛇菊苷A化合物，按干重计大于约98％，按干重计大于约99％的新蛇菊苷A化合物的纯度水平的新蛇菊苷A。在单个结晶步骤中新蛇菊苷A溶液可以被搅拌或不搅拌。
在示例性的实施方式中，该方法进一步包括将新蛇菊苷A溶液在合适的温度用基本上纯的足以促进新蛇菊苷A结晶以形成纯的新蛇菊苷A的新蛇菊苷A晶体接种的步骤(任选的步骤)。足以促进基本上纯的新蛇菊苷A结晶的新蛇菊苷A的量包括按溶液中存在的新蛇菊苷A的重量计约0.0001％至约1％的量的新蛇菊苷A。在另一实施方式中，足以促进新蛇菊苷A结晶以形成基本上纯的新蛇菊苷A的组合物的新蛇菊苷A的量包括按重量计约0.01％至约1％的量的新蛇菊苷A。接种步骤的合适温度包括在约18℃至约35℃的范围内的温度。
在另一示例性实施方式中，该方法进一步包括分离和洗涤基本上纯的新蛇菊苷A组合物的步骤。基本上纯的新蛇菊苷A组合物可以通过多种使用离心力的固液分离技术从含水有机溶液中分离，所述技术包括但不限于，垂直和水平的多孔篮式离心、固体沉降式离心、沉降式离心、卧式刮刀卸料离心、卧式活塞推料离心、Heinkel式离心、盘式层叠离心和气旋式分离。此外，分离科通过任何压力、真空和重力过滤方法提高，其包括，但不限于，使用带式、鼓式、nutsche型、叶式、板式、Rosenmund型、火花型和袋式的过滤器和压滤机。新蛇菊苷A固液分离装置的运行可以是连续的、半连续的或成批处理方式。基本上纯的新蛇菊苷A组合物也可以在分离装置上使用各种含水有机溶剂及其混合物洗涤。基本上纯的新蛇菊苷A组合物可以在分离装置上使用多种气体(包括但不限于氮气和氩气)部分地和全部地干燥，以蒸发残余的液体溶剂。使用液体、气体或通过溶解固体或保持固体形式的机械方法，可以自动地或手动地从分离装置移出基本上纯的新蛇菊苷A组合物。
在又一示例性实施方式中，该方法进一步包括干燥基本上纯的新蛇菊苷A组合物的步骤。本领域技术人员已知的这样的方法，且该方法包括，但不限于，使用旋转真空干燥器、流化床干燥器、旋转隧道式干燥器，板式干燥器、托盘式干燥器、Nauta型干燥器、喷雾干燥器、快速干燥器、微米(micron)干燥器、盘式干燥器、高低速浆式干燥器和微波干燥器。在示例性实施方式中，干燥步骤包括在范围在40℃至约60℃内的温度下使用氮气或氩气吹扫来干燥基本上纯的新蛇菊苷A组合物持续约5小时至约100小时以除去残余溶剂。
在再一示例性实施方式中，其中粗制新蛇菊苷A混合物包括基本上无新蛇菊苷D杂质，该方法进一步包括在干燥基本上纯的新蛇菊苷A组合物之前将基本上纯的新蛇菊苷A组合物用含水有机溶剂成浆。浆液是包含固体和含水有机溶剂或有机溶剂的混合物，其中该固体包括基本上纯的新蛇菊苷A组合物，且在含水有机溶剂或有机溶剂中是仅略溶。在一种实施方式中，基本上纯的新蛇菊苷A组合物和含水有机溶剂以范围在约15份至约1份的含水有机溶剂比约1份基本上纯的新蛇菊苷A组合物的重量比存在于浆液中。在一种实施方式中，浆液保持在室温。在另一实施方式中，成浆的步骤包括将浆液加热至范围在约20℃至约40℃的温度。将基本上纯的新蛇菊苷A组合物成浆约0.5小时至约24小时。
在又一另一示例性实施方式中，该方法进一步包括从浆液的含水有机溶剂中分离基本上纯的新蛇菊苷A组合物的步骤和洗涤基本上纯的新蛇菊苷A组合物，随后干燥基本上纯的新蛇菊苷A组合物的步骤。
如果期望进一步纯化，纯化本文描述的新蛇菊苷A的方法可以重复，或基本上纯的新蛇菊苷A组合物可以使用可选的纯化方法，诸如柱色谱法进一步纯化。
如本文所用，纯度表示存在于原始形式或纯化形式的新蛇菊苷A组合物中新蛇菊苷A的重量百分比。在一种实施方式中，新蛇菊苷A组合物包括特定纯度的新蛇菊苷A，且组合物的剩余物包含其他甜菊糖醇苷类或任何非新蛇菊苷A的成分的混合物。组合物的纯度可以使用本领域普通技术人员已知的方法测定。一种这种方法包括高效液相色谱法(HPLC)。本领域普通技术人员也应当理解样品中的湿气可以影响纯度测量的准确性。因此，特别期望组合物是基本上干的。如本文所用，基本上干的组合物包括按重量计上至约10％的湿气。
III.新蛇菊苷A衍生产物的应用
新蛇菊苷A衍生产物可以独立地使用，或与合适的载体或填充剂结合使用，所述载体或填充剂如在2006年11月2日由Prakash等提交的美国专利申请第11/555,962号中所描述，其公开内容以其整体通过引用并入本文。此外，新蛇菊苷A衍生产物的时间和/或味道特征可以通过以下改良：合并新蛇菊苷A衍生产物与一种或多种甜味提高组合物以改进味道和味觉特征，从而更类似于糖。增甜剂和甜味提高组合物的组合被描述在美国专利申请第11/561,148号和第11/561,158号中，两者在2006年11月17日由Prakash等提交，其公开内容以其整体通过引用并入本文。此外，新蛇菊苷A衍生产品可以在可变甜的组合物中独立地使用，或与其它天然和/或合成的增甜剂和任选地甜味提高组合物结合使用。
如本文所用，“口服吸收的组合物”和“可变甜组合物”是同义的，且意指与人或动物的口腔接触的物质，包括被放入口中和随后从口中吐出的物质和被饮入、食用、吞咽或其它方式摄取，且当在基本上可接受的范围内使用时对于人或动物消耗是安全的物质。这些组合物包括食物、饮料、药物、烟草、营养制品、口服保健/化妆产品，以及类似物。这些产品的非限制性的实例包括非碳酸饮料和碳酸饮料，诸如可乐、姜汁无酒精饮料、无醇啤酒(root beer)、苹果汁、果味软饮料(例如，柑橘味软饮料，诸如柠檬汽水(lemon-lime)或橙)、粉状软饮料，以及类似物；来源于水果或蔬菜的果汁，果汁包括压榨果汁或类似物，包含果粒的果汁、水果饮料、水果汁饮料、含果汁的饮料、果味饮料、蔬菜汁、含蔬菜的汁和含水果和蔬菜的混合汁；运动饮料，能量饮料，纯水和类似的饮料(例如，天然味道或合成味道的水)；茶类饮料和喜欢类型的饮料，诸如咖啡、可可、黑茶、绿茶、乌龙茶以及类似的饮料；含乳成分的饮料，诸如乳制饮料、含乳成分的咖啡、牛奶咖啡、奶茶、水果牛奶饮料、可饮用的酸奶酪、乳酸菌饮料或类似饮料；乳制品；面包产品；点心，诸如酸乳酪、果冻、可饮用果冻、布丁、巴伐利亚乳酪、牛奶冻、蛋糕、核仁巧克力饼、奶油冻以及类似点心；在饮茶时间或餐后可食用的甜味食品；冷冻食物；冷的甜食，例如，冰激凌类，诸如冰激凌、冰奶、冰乳以及类似物(其中增甜剂和其它类型的原材料被加入到奶制品中，且产生的混合物被搅拌和冷冻的食品)，和冰甜食，诸如冰冻果子露、糖水冰品以及类似物(其中各种其它类型的原材料被加入到含糖液体中，并将产生的混合物搅拌和冷冻的食品)；冰激凌；一般甜食，例如烘焙的甜食和蒸甜食诸如蛋糕、咸饼干、饼干、充有豆馅的包子；年糕和小吃；桌面产品；一般糖果甜食，诸如口香糖(例如包括基本上水不溶的、口香糖基质的组合物，口香糖基质所述诸如糖胶或其替代物，包括jetulong、guttakay橡胶或某些可食用的天然合成树脂或蜡)，硬糖、软糖、薄荷、奶油杏仁糖、豆形胶质软糖以及类似糖果；调料包括果味调料、巧克力味调料以及类似调料；可食用凝胶；奶酪，包括黄油奶酪、面粉糊、生奶油和类似物；果酱，包括草莓果酱，橘子酱和类似物或其它淀粉产品；香料；一般作料，包括炙肉、烤鸡、烤肉以及类似食物上使用的调料，以及番茄酱、调味、面条汤以及类似物；宠物、动物和兽医产品；加工的农产品，畜产品或海产品；加工的肉制品，诸如香肠以及类似物；甑煮食品、泡菜、酱油煮沸中的防腐剂、美食、小菜；零食，诸如马铃薯片、小甜点或类似物；谷类产品；口服施用或在口腔中使用的药物或类药品(例如，维他命、咳嗽糖浆、止咳糖、可咀嚼药片、氨基酸、苦味药物或药剂，酸化剂或类似物)，其中药物可以是处于固体、液体、凝胶或气体形式，诸如丸剂、片剂、喷雾剂、胶囊、糖浆、滴剂、含片、粉剂以及类似物；个人护理产品，诸如在口腔使用的其它口用组合物，诸如口气清新剂、含漱剂、口腔清洗剂、牙膏、牙齿上光剂(tooth polish)、洁牙剂、口腔喷雾、牙齿美白剂以及类似物；食品添加剂；烟草产品，包括有烟和无烟的烟草产品，诸如鼻烟、香烟、烟斗烟草和雪茄烟，和所有形式的烟草，诸如烟丝填充物、叶、茎、柄、均匀加工的叶，再生的粘合剂和从烟草尘再生的烟草，片、丸或其它形式的细粉或醚源，由无烟材料制成的烟草替代品，蘸烟草(dip)或咀嚼烟草；动物饲料；以及营养制品，其包括可以提供药用或健康益处的任何食物或部分食物，所述药用或健康益处包括疾病(例如，心血管疾病和血液中高水平的胆固醇、糖尿病、骨质疏松症、炎症或自身免疫疾病)的预防和治疗。
大致地，存在于甜味组合物中的增甜剂的量取决于可变甜组合物的具体类型及其期望的甜度而大范围变化。本领域普通技术人员可以容易地分辨置入可变甜组合物中的增甜剂的合适的量。在具体的实施方式中，增甜剂可以约0.5mg至约50mg增甜剂/千克或升可变甜组合物的范围内的量加入到变甜的组合物中。在其它具体的实施方式中，使用下文附随的实施例中提供的示例性感觉数据和计算的效力，本领域技术人员可以确定新蛇菊苷A衍生产物达到期望的甜度的量。
本发明通过以下实施例被进一步说明，其决不能被解释为对其范围的限制。相反，应当清楚地理解：在阅读其中的说明之后，本领域技术人员可以理解拥有各种其它实施方式、改进方案和其等同方案，而不偏离本发明的精神和/或所附权利要求的范围。除非另外说明，否则％是按重量计。
实施例
实施例1
通过将新蛇菊苷A组合物(5g＞97％纯度)溶解在pH 2的0.1M磷酸溶液(200mL)中制备新蛇菊苷A的溶液。将制备的溶液在80±5℃下降解24h。降解之后，将上清液从剩余的白色沉淀中倒出，然后用25-50mL的甲醇(MeOH)使其澄清。将沉淀单独溶解在100mL的MeOH中并用水稀释至200mL的总体积。
使用Synergi Hydro柱和三元流动相系统保持在55℃进行上清液和沉淀的初步分析。用于分析的条件概括在表2中。使用配有Waters 996光电二极管阵列(PDA)检测器或ESA Corona电雾式检测器(CAD)的Waters 2695Alliance系统进行HPLC分析。使用Phenomenex Synergi Hydro(4.6×250mm)柱进行最终样品分析。
表2：用于QC HPLC方法的条件
从上面描述的初步分析中确定降解之后目标组分的保留时间和它们的相对浓度并概括在表3中。
表3：衍生的新蛇菊苷A样品组合物
  样品组分   tR(min)   RRT   面积百分比(％)
  新蛇菊苷A   11.00   1.0   1.2
  样品“a”   5.64   0.51   2.5
  样品“b”   11.78   1.07   29.7
  样品“c”   10.78   0.98   3.3
  样品“d”   19.31   1.76   40.3
将从衍生的新蛇菊苷A的上清液和沉淀中分离的上清液和沉淀用配有设置在215nm的UV-Vis检测器的Waters Delta Prep LC Model 2000/4000处理。使用Waters Symmetry C18(10μm)柱(77×250mm)用预混合的流动相(A)75∶25水/乙腈(MeCN)和(B)60∶40水/MeCN进行反相HPLC分离，并使用两种Azko Novel Kromasil二氧化硅(10μm)柱(77×250mm和77×300mm)进行正相分离。该方法由从100％A至100％B的60分钟梯度和150mL/min的流速组成。随着上清液和沉淀的溶解，使用线内20μm不锈钢过滤器将溶液直接注加到制备柱上。在纯化中，收集具有分析物的以下组成的三种制备级分：(1)衍生产物1，(2)衍生产物2和3以及残余的新蛇菊苷A的混合物，以及(3)衍生产物4和残余的新蛇菊苷A的混合物。四种衍生产物的化学结构如下。第一个数字表示实例标识(例如，衍生产物1、2、3或4)而罗马数字表示上面列出的相应的化学式编号。
从沉淀中初步分离衍生产物4，同时从上清液中初步分离剩余的分析物(1、2和3)。
将从制备纯化中收集的级分通过固相萃取(SPE)进一步浓缩。将水溶液直接加载到用95∶5水/MeCN平衡的77-mm Symmetry C18柱上。将该柱用一个柱体积的95∶5水/MeCN洗涤，然后以15∶85水/MeCN将样品从该柱洗脱。随后使用Buchi旋转蒸发仪模型R-114在30-35℃在真空中浓缩级分。使用Kinetics Flexi-Dry Personal或Savant SuperModulo冷冻干燥器将样品冻干至少12小时。
纯化各个衍生产物之后，将各个化合物用1H、13C、COSY(相关光谱)，和HSQC(异核单量子相关)、核磁共振谱法(NMR)以及质谱分析(MS)表征。NMR数据在具有10μm流通池的反检测毛细探针的Bruker DRX 500MHz仪器上产生。将从100μg至0.5mg的大小范围内的各个衍生产物的样品溶解在0.5mL的CD3OD中，且图谱参照残余溶剂信号(对于CD3ODδH3.30，δC 49.0)。用安装有Turbo离子喷射电离源的Sciex API 2000LC/MS/MS三重四极质谱仪产生质谱数据。各衍生产物用1∶1∶0.01乙腈-H2O-HOAc稀释，并通过使用上面携带的注射泵灌注来导入。将样品稀释以产生良好s/n，通常0.1mg/mL。
衍生产物1的纯化
使用上面描述的反相获得的分析物的第一级分提供纯度＞95％(曲线下面积，AUC)的衍生产物1。随后将溶液在真空中浓缩并冻干。在最终冻干之前，将样品溶解在250mL的80∶20水/乙醇(EtOH)中并滤过不锈钢滤网以从样品中除去微粒。
衍生产物1被鉴定为13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-16-羟基异贝壳杉烷-18-酸β-D-吡喃葡萄糖酯。1H NMR(500MHz，CD3OD)δ0.86(m，1H，C1-H)，0.90(m，1H，C9-H)，0.98(s，3H，C20-H)，1.07(m，1H，C3-H)，1.10(m，1H，C5-H)，1.20(s，3H，C19-H)，1.25(s，3H，C17-H)，1.36(m，1H，C7-H)，1.42(d，J＝13.7Hz，1H，C15-H)，1.43(m，1H，C2-H)，1.58(m，1H，C7-H)，1.58(d，J＝13.7Hz，1H，C15-H)，1.64(m，1H，C11-H)，1.74(m，1H，C12-H)，1.79(m，1H，C6-H)，1.80(m，1H，C11-H)，1.83(m，1H，C1-H)，1.84(m，1H，C14-H)，1.92(m，1H，C2-H)，1.97(m，1H，C6-H)，1.98(m，1H，C12-H)，2.02(d，J＝11.5Hz，1H，C14-H)，2.05(d，J＝11.9Hz，1H，C3-H)，3.15(m，1H，C40-H)，3.27(m，1H，C34-H)，3.37(m，1H，C22-H)，3.65(m，1H，C28-H)，3.73(m，1H，C29-H)，4.67(d，J＝7.8Hz，1H，C33-H)，4.70(d，J＝8.2Hz，1H，C27-H)，4.88(d，J＝7.8Hz，1H，C39-H)，5.37(d，J＝8.2Hz，1H，C21-H)；13C NMR(125MHz，CD3OD)δ16.0，19.8，20.5，22.1，22.8，28.6，30.6，38.7，41.5，42.3，43.0，44.7，55.7，56.1，58.1，75.1，75.7，78.7，79.9，87.5，87.9，95.4，96.9，103.6，103.9，178.3；C44H72O24的MS(ESI)计算值：985.03，实测值：([M]+)985.5，([M]-)983.6。
衍生产物2和3的纯化
将包含衍生产物2和3的分析物的第二级分和残余的新蛇菊苷A冻干。通过将250-mg等份试样溶解到25mL的50∶50水/EtOH中制备亲液体(lyophiliate)用于再处理。通过使用预先装好的Waters Symmetry C18柱(50×250mm)和73∶27水/MeCN的等度流动相条件的反相再次纯化处理溶液。将流速保持在70mL/min。从再次纯化中收集三种纯化的级分：(1)衍生产物3，(2)未降解的新蛇菊苷A和(3)衍生产物2。将分离的衍生产物2和3级分在真空中浓缩并随后冻干。在最终冻干之前，将各个样品溶解在150mL的水中并滤过不锈钢滤网以从样品中除去微粒。
衍生产物2被鉴定为13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]异贝壳杉-15-烯-18-酸β-D-吡喃葡萄糖酯。1H NMR(500MHz，CD3OD)δ0.85(m，1H，C1-H)，0.86(m，1H，C9-H)，0.97(s，3H，C20-H)，1.05(m，1H，C3-H)，1.11(m，1H，C5-H)，1.21(s，3H，C19-H)，1.42(m，1H，C2-H)，1.48(m，1H，C7-H)，1.50(m，2H，C6-H，C11-H)，1.6(m，1H，C7-H)，1.62(m，1H，C12-H)，1.66(m，2H，C11-H，C12-H)，1.67(m，1H，C14-H)，1.71(s，3H，C17-H)，1.83(m，1H，C6-H)，1.84(m，1H，C1-H)，1.96(m，1H，C2-H)，2.13(d，J＝12.2Hz，1H，C3-H)，2.22(d，J＝9.6Hz，1H，C14-H)，3.25(m，1H，C40-H)，3.27(m，1H，C34-H)，3.35(m，1H，C22-H)，3.38(m，2H，C30-H，C41-H)，3.46(m，1H，C23-H)，3.61(m，1H，C28-H)，3.73(m，1H，C29-H)，4.64(d，J＝8.5Hz，1H，C27-H)，4.66(d，J＝7.8Hz，1H，C33-H)，4.80(d，J＝8.2Hz，1H，C39-H)，5.12(s，1H，C15-H)，5.39(d，J＝8.9Hz，1H，C21-H)；13C NMR(125MHz，CD3OD)δ12.1，15.8，19.9，21.5，28.7，30.5，38.8，40.5，41.6，48.4，48.9，57.9，75.2，79.9，87.2，95.4，96.9，103.4，104.0，136.9；C44H70O23的MS(ESI)计算值：967.01，实测值：([M]+967.4，([M]″)965.8。
衍生产物3被鉴定为13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-16-羟基异贝壳杉烷-18-酸。1H NMR(500MHz，CD3OD)δ0.86(m，1H，C1-H)，0.93(t，J＝7.8Hz，1H，C9-H)，0.98(s，3H，C20-H)，1.0(m，1H，C3-H)，1.04(m，1H，C12-H)，1.07(m，1H，C5-H)，1.17(s，3H，C19-H)，1.27(s，3H，C17-H)，1.37(m，1H，C7-H)，1.42(m，1H，C2-H)，1.42(d，J＝13.7Hz，1H，C15-H)，1.58(m，1H，C7-H)，1.60(d，J＝13.7Hz，1H，C15-H)，1.65(m，1H，C11-H)，1.8(m，1H，C12-H)，1.82(m，1H，C6-H)，1.84(m，1H，C14-H)，1.85(m，1H，C11-H)，1.86(m，1H，C1-H)，1.94(m，1H，C2-H)，1.97(m，1H，C6-H)，1.98(d，J＝10.0Hz，1H，C14-H)，2.12(d，J＝12.6Hz，1H，C3-H)，3.12(dd，J＝8.2和8.9Hz，1H，C40-H)，3.25(m，1H，C34-H)，3.64(m，1H，C28-H)，3.74(t，J＝8.5Hz，1H，C29-H)，4.66(d，J＝7.8Hz，1H，C33-H)，4.75(d，J＝7.8Hz，1H，C27-H)，4.91(d，J＝8.2Hz，1H，C39-H)；C38H62O19的MS(ESI)计算值：822.89，实测值：([M]+)823.6，([MY)821.7。
衍生产物4的纯化
在浓缩包含衍生产物4和残余的新蛇菊苷A的分析物级分之后，在溶液中形成白色沉淀。使用定性Whatman 1号滤纸在真空过滤该溶液。将过滤残渣(filtrand)在40℃干燥约5小时。通过在超声处理下将250-mg的等分试样溶解在13∶87二氯甲烷(DCM)/EtOH中制备用于再处理的样品。在注入前，用庚烷将样品进一步稀释至250mL。使用Asko Novel Kromasil二氧化硅(10μm)柱(77mm)用含0.1％乙酸的70∶30庚烷/EtOH的等度条件处理该溶液。将流速保持在140mL/min。将分离的衍生产物4级分在真空中浓缩并随后冻干。在最终冻干之前，将样品溶解在350mL的13∶87DCM/EtOH中并滤过不锈钢滤网以从样品中除去微粒。
衍生产物4被鉴定为13-[(2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]异贝壳杉-15-烯-18-酸。1H NMR(500MHz，CD3OD)δ0.86(m，2H，C1-H，C9-H)，0.99(s，3H，C20-H)，1.02(m，1H，C3-H)，1.08(m，1H，C5-H)，1.17(s，3H，C19-H)，1.42(m，1H，C2-H)，1.50(m，2H，C7-H，C11-H)，1.52(m，1H，C6-H)，1.58(m，1H，C7-H)，1.68(m，1H，C12-H)，1.69(m，1H，C11-H)，1.72(s，3H，C17-H)，1.83(m，1H，C6-H)，1.86(m，1H，C1-H)，1.90(m，1H，C2-H)，2.10(d，J＝11.9Hz，1H，C3-H)，2.23(d，J＝10.0Hz，1H，C14-H)，3.13(t，J＝7.8Hz，1H，C40-H))，3.26(m，1H，C34-H)，3.35(m，1H，C41-H)，3.39(m，1H，C30-H).3.60(m，1H，C28-H)，3.72(t，J＝7.9Hz，1H.C29-H)，4.65(d，J＝7.8Hz，1H，C33-H)，4.66(d，J＝7.8Hz，1H，C27-H)，4.82(d，J＝7.8Hz，1H，C39-H)，5.14(s，1H，C15-H)；13C NMR(125MHz，CD3OD)δ12.2，16.1，19.9，21.6，29.0，30.4，38.7，40.4，41.8，41.2，44.4，47.9，48.8，57.4，70.0，75.1，76.0，80.1，87.5，91.4，96.6，103.4，104.0，137.0，143.7，181.4；C38H60O8的MS(ESI)计算值：804.87，实测值：([M]+)805.6，([M]-)803.6。
衍生产物甜度的表征
这些新蛇菊苷A衍生产物被表征为具有较强的增甜效力。具体地，测定500ppm、1,000ppm和5,000ppm的新蛇菊苷A衍生产物3和4的甜度效力，并发现新蛇菊苷A衍生产物3和4的甜度效力与等甜度水平的蔗糖相比为约100至约300倍，而发现500ppm、1,000ppm和5,000ppm的新蛇菊苷A衍生产物1和2具有约5至25倍的等甜度水平的蔗糖的甜度效力。此外，新蛇菊苷A衍生产物3和4展现了类似于糖的纯甜味。因此，新蛇菊苷A衍生产物适合用作可甜化组合物的增甜剂。
实施例2
用pH 2的0.1M磷酸水溶液(200mL)制备新蛇菊苷A(100mg，＞97％纯度)溶液。将溶液加热至80℃持续24小时。然后使用LC-MS(液相色谱-质谱)分析衍生混合物的样品。用具有以正模式运行的离子喷射电离源的Sciex API 150EX单四极，和在50℃和3.5bar运行的Sedere Sedex 75ELSD(蒸发光散射检测器)进行LC-MS分析。概括在表4中的LC-MS方法使用Waters dC18(4.6×250mm，5μm)柱。
表4：用于分析衍生混合物的LC-MS方法
ELSD检测到在10.58、15.52和20.22分钟的单峰，其分别代表衍生产物1、4和5。衍生产物2和3在12.80-13.00分钟产生宽的和较不明确的峰。包括实施例1中描述的NMR和MS方法在内的随后的表征证实了这些峰分配。
用HPLC进行各个样品的纯化。使用Phenomenex Prodigy C18(10×250mm)柱(10μm)，且表5概括了用于HPLC方法的条件。用ELSD线上的小量注入显示类似于由LC-MS观察到的色谱类型。为了分离，将ELSD脱线，并将降解混合物溶解在15mL MeCN-H2O(1∶1)中。将降解混合物经每次2.0mL的8次注入的过程分离。
表5：分离衍生产物5的HPLC方法的条件
表5中的HPLC方法仅产生4个峰，其在11.4、12.9、14.6和18.2分钟出现。随后的表征显示衍生产物1和4分别对应11.4和14.6分钟的峰。收集了10.6mg的衍生产物1和4.6mg的衍生产物4。衍生产物5在18.2分钟被洗脱，且收集了4.2mg。如上文所描述，衍生产物5的结构用NMR和MS说明。衍生产物5的结构被鉴定为：
衍生产物5被鉴定为13-甲基-16-氧代-17-去甲异贝壳杉烷-18-酸β-D-吡喃葡萄糖酯。1H NMR(500MHz，CD3OD)δ0.81(s，3H，C17-H)，0.94(s，3H，C20-H)，0.97(m，1H，C1-H)，1.08(m，1H，C3-H)，1.22(m，1H，C5-H)，1.23(m，4H，C11-H，C19-H)，1.24(m，1H，C9-H)，1.38(m，1H，C2-H)，1.43(m，1H，C12-H)，1.45(m，1H，C14-H)，1.49(m，1H，C7-H)，1.53(m，1H，C12-H)，1.56(m，1H，C14-H)，1.68(m，2H，C7-H，C11-H)，1.71(m，1H，C1-H)，1.84(m，1H，C15-H)，1.90(m，3H，C2-H，C6-H)，2.18(d，J＝13.7Hz，1H，C3-H)，2.63(dd，J＝3.3，18.9Hz，1H，C15-H)，3.33(m，1H，C22-H)，3.68(dd，J＝3.0，12.2Hz，1H，C26-H)，3.82(d，J＝12.2Hz，1H，C26-H)，5.39(d，J＝8.2Hz，1H，C21-H)；13CNMR(125MHz，CD3OD)δ13.8，19.6，19.9，21.2，22.4，28.8，38.6，38.4，40.6，42.2，49.2，54.9，55.5，58.3，62.2，95.3；C26H40O8计算值([M]+)480.59.实测值：MS(ESI)：([M]+)481.1，([M]-)479.0。
12.4分钟的HPLC峰表示衍生产物2和3以及未降解的新蛇菊苷A。因此，第二种HPLC方法被用于分离衍生产物2和3。第二种HPLC方法是上面描述的第一种方法的改进。第二种方法使用应用了40分钟的80∶20(A∶B)至70∶30(A∶B)的非常浅的梯度(shallow gradient)。将第一种HPLC方法中的12.4分钟收集的物质的10mg等分试样溶解在2.0mL的MeOH中，且每次运行注入1.0mL的这一溶液。进行两次注入，并收集和干燥通过ELSD和UV观察到的两个峰。32.4和35.4分钟的峰分别对应衍生产物3和2。这样的第二种HPLC方法产生3mg的衍生产物3和3.3mg的衍生产物2。包括NMR和MS的上面描述的随后的表征技术被用于证实所有的峰分配。
实施例3
用新蛇菊苷A制备模拟饮料样品以模拟商业上软饮料中使用的配方。通过用推进式混合器在不锈钢壶中合并预冷的去离子水、干燥成分、磷酸和新蛇菊苷A(500mg/L)至pH 2.8制备模拟饮料。然后将模拟饮料冷装入容器中，碳酸化并盖封。将模拟饮料样品在40℃储存10周。模拟饮料样品的储存产生两种另外的衍生产物：衍生产物6和7。
通过首先混合5瓶的10-周模拟饮料溶液(总体积250mL)，并用在减压下操作的旋转蒸发器干燥样品，将衍生产物6和7从10-周模拟饮料溶液中分离。一系列液相色谱步骤被用于分离衍生产品6和7。在通过HPLC分离之前，将浓缩的物质溶解在6.0mL的H2O中。HPLC分析用Phenomenex Prodigy C18柱(250×10mm，10μm)进行。用于HPLC分析的条件在表6中概括。
表6：用于HPLC分析的条件
观察到衍生产物6在20.9分钟时被洗脱，且观察到衍生产物7在28.3分钟时被洗脱。在N2下收集和干燥两个HPLC峰。各峰用LC-MS分析。LC-MS分析用装有以阴离子模式运行的离子喷射电离源的Sciex API150MCA单四极进行。使用在50℃和3.5bar运行的Sedere Sedex 75ELS检测器。使用Phenomenex Synergi Hydro RP柱(4.6×250mm，410μm)进行样品的分析。表7概括了LC-MS方法。
表7：用于衍生产物6和7的LC-MS方法
虽然LC-MS证实了衍生产物7的纯度，但衍生产物6包含残余的新蛇菊苷A。因此，使用上面描述的相同的柱的第二轮HPLC分离被用于收集衍生产物6的纯样品。表8概括了用于分离衍生产物6的纯样品的第二种HPLC方法。
表8：用于衍生产物6的分离的HPLC方法
在第二次HPLC分析中，衍生产物6在21.2分钟被洗脱。收集并干燥样品用于分析。用上文描述的NMR和MS表征衍生产物6和7。衍生产物6和7的结构被确定为：
衍生产物6被鉴定为13-[(3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]异贝壳杉-16-烯-18-酸β-D-吡喃葡萄糖酯。1H NMR(500MHz，CD3OD)δ0.85(m，1H，C1-H)，0.98(m，1H，C9-H)，0.99(s，3H，C20-H)，1.06(m，1H，C3-H)，1.12(d，J＝11.5Hz，1H，C5-H)，1.21(s，3H，C19-H)，1.42(m，1H，C2-H)，1.43(m，1H，C7-H)，1.46(m，1H，C12-H)，1.54(d，J＝12.2Hz，1H，C14-H)，1.55(m，1H，C7-H)，1.67(m，1H，C11-H)，1.81(m，1H，C11-H)，1.83(m，1H，C6-H)，1.87(m，1H，C1-H)，1.94(m，1H，C2-H)，2.02(m，1H，C12-H)，2.05(m，1H，C15-H)，2.08(m，1H，C6-H)，2.14(d，J＝16.3Hz，1H，C15-H)，2.16(d，J＝12.6Hz，1H，C3-H)，2.27(d，J＝12.2Hz，1H，C14-H)，3.13(t，J＝7.8Hz，1H，C40-H))，3.26(m，1H，C34-H)，3.35(m，2H，C22-H，C41-H)，3.39(m，1H，C30-H)，3.72(t，J＝7.9Hz，1H，C29-H)，4.65(d，J＝7.8Hz，1H，C33-H)，4.82(s，1H，C17-H，d，J＝7.8Hz，1H，C39-H)，5.11(s，1H，C17-H)，5.36(d，J＝8.2Hz，1H，C21-H)；13CNMR(125MHz，CD3OD)δ12.2，16.1，19.9，21.6，29.0，30.4，38.7，40.4，41.8，41.2，44.4，47.9，48.8，57.4，70.0，75.1，76.0，80.1，87.5，91.4，96.6，103.4，104.0，137.0，143.7，181.4；C38H60O18计算值([M]+)804.87，实测值：MS(ESI)：([M]+)805.6，([M]-)8031.6。
衍生产物7被鉴定为13-羟基-异贝壳杉-16-烯-18-酸β-D-吡喃葡萄糖酯。1H NMR(500MHz，CD3OD)δ0.85(m，1H，C1-H)，0.98(m，1H，C9-H)，0，99(s，3H，C20-H)，1.06(m，1H，C3-H)，1.12(d，J＝11.5Hz，1H，C5-H)，1.21(s，3H，C19-H)，1.42(m，1H，C2-H)，1.43(m，1H，C7-H)，1.46(m，1H，C12-H)，1.54(d，J＝12.2Hz，1H，C14-H)，1.55(m，1H，C7-H)，1.67(m，1H，C11-H)，1.81(m，1H，C11-H)，1.83(m，1H，C6-H)，1.87(m，1H，C1-H)，1.94(m，1H，C2-H)，2.02(m，1H，C12-H)，2.05(m，1H，C15-H)，2.08(m，1H，C6-H)，2.14(d，J＝16.3Hz，1H，C15-H)，2.16(d，J＝12.6Hz，1H，C3-H)，2.27(d，J＝12.2Hz，1H，C14-H)，3.26(m，1H，C34-H)，3.35(m，1H，C22-H)，3.37(m，1H，C28-H)，4.54(d，J＝7.4Hz，1H，C27-H)，4.56(d，J＝7.4Hz，1H，C33-H)，4.82(s，1H，C17-H)，5.11(s，1H，C17-H)，5.36(d，J＝8.2Hz，1H，C21-H)；13C NMR(125MHz，CD3OD)δ16.0，19.9，22.9，28.6，38.7，41.6，42.4，45.0，48.4，54.8，58.4，95.5，98.9，104.6，105.1；C38H60O18；计算值([M]+)804.87。实测值：MS(ESI)：([M]+)805.3，([M]-)803.5。
实施例4
通过比较具有特定量的蔗糖的水样品与具有等量的新蛇菊苷A衍生产物的第二种水样品的甜度强度，分析前面所述的新蛇菊苷A衍生产物的甜度强度。产生的感觉数据和计算的效力在下面的表9中提供。
表9：新蛇菊苷A衍生产物甜味强度
感觉数据显示新蛇菊苷A衍生产物具有蔗糖的甜度强度的至少30倍至120倍的范围内的甜度强度。例如，重量百分比3.6的新蛇菊苷A衍生产物1(II)的水溶液比相同重量百分比的蔗糖水溶液至少甜30倍。因此，认为：衍生产物1(II)、2(IV)、3(III)和4(V)可以与新蛇菊苷A、蛇菊苷或其它甜菊糖醇苷类混合以调整增甜剂的味道。衍生产物1(II)、2(IV)、3(III)和4(V)也可以与其它天然的无热量的增甜剂混合，所述增甜剂诸如罗汉果苷IV、罗汉果苷V、罗汉果增甜剂、monatin、竹芋蛋白、甜味蛋白、奇果甜素、仙茅甜蛋白或其混合物。通过混合新蛇菊苷A衍生产物与这些增甜剂，可以降低和/或消除通常属于这些增甜剂的不期望的味道或后味。
还评价新蛇菊苷A衍生产物1(II)、2(IV)、3(III)和4(V)的甜度品质，并在室温下将其与新蛇菊苷A、新蛇菊苷B、新蛇菊苷F和蔗糖的甜度品质对比。对于各个性质，增甜剂获得基于15分的开放的直线标度评分。表10显示每增甜剂两次重复试验之后的平均分数和计算的各性质的ANOVA。多重比较检验Fisher′s LSD 5％，辅助分数的比较分析。用相同字母标记具体性质的样品在95％置信水平无显著差别。
如前述结果说明，新蛇菊苷A衍生产物1(II)、2(IV)、3(III)和4(V)具有与蔗糖无显著差别的多种感觉性质(即，新蛇菊苷A衍生产物2(IV)和4(V)具有与蔗糖无显著差别的8个特征)。最值得注意地，新蛇菊苷A衍生产物2(IV)的总味道和甜味与蔗糖相当，显示其可能是容易接受的无热量增甜剂替代品。
虽然已经就其具体实施方式详细描述本发明，应当理解，本领域技术人员在完成对前述内容的理解之后，可以容易地构思出这些实施方式的改变方案、变型方案和等同方案。因此，本发明的范围应当由所附权利要求及其任何等同要求的范围评价。

Claims (20)

1.一种增甜剂，所述增甜剂包含具有以下化学式的化合物：
2.如权利要求1所述的增甜剂，所述增甜剂包含具有以下化学结构的化合物：
3.如权利要求1或2所述的增甜剂，其中所述增甜剂具有大于50％的纯度。
4.如权利要求1或2所述的增甜剂，其中所述增甜剂具有大于75％的纯度。
5.如权利要求1或2所述的增甜剂，其中所述增甜剂具有大于85％的纯度。
6.如权利要求1或2所述的增甜剂，其中所述增甜剂具有大于95％的纯度。
7.如权利要求1或2所述的增甜剂，其中所述增甜剂具有大于97％的纯度。
8.如权利要求1或2所述的增甜剂，其中所述增甜剂具有大于99％的纯度。
9.一种增甜剂，所述增甜剂包含具有以下化学式的化合物：
10.如权利要求9所述的增甜剂，所述增甜剂包含具有以下化学结构的化合物：
11.如权利要求9或10所述的增甜剂，其中所述增甜剂具有大于50％的纯度。
12.如权利要求9或10所述的增甜剂，其中所述增甜剂具有大于75％的纯度。
13.如权利要求9或10所述的增甜剂，其中所述增甜剂具有大于85％的纯度。
14.如权利要求9或10所述的增甜剂，其中所述增甜剂具有大于95％的纯度。
15.如权利要求9或10所述的增甜剂，其中所述增甜剂具有大于97％的纯度。
16.如权利要求9或10所述的增甜剂，其中所述增甜剂具有大于99％的纯度。
17.一种增甜剂组合物，所述增甜剂组合物包括：
包含至少一种天然碳水化合物增甜剂、至少一种多元醇、至少一种天然高效增甜剂或其组合的至少一种增甜剂；和
具有以下化学式的新蛇菊苷A衍生产物：
18.如权利要求17所述的增甜剂组合物，其中所述至少一种天然碳水化合物增甜剂包括高果糖玉米糖浆、蔗糖、果糖、葡萄糖、D-塔格糖、海藻糖、异麦芽酮糖醇、糊精、环糊精、D-半乳糖、鼠李糖、丙二醇、乙二醇或其组合。
19.如权利要求17所述的增甜剂组合物，其中所述至少一种多元醇包括赤藓糖醇、麦芽糖醇、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇或其组合。
20.如权利要求17所述的增甜剂组合物，其中所述至少一种天然高效增甜剂包括：新蛇菊苷A、新蛇菊苷B、新蛇菊苷C、新蛇菊苷D、新蛇菊苷E、新蛇菊苷F、甜甙A、甜甙B、悬钩子甙、甜菊糖甙、蛇菊苷、罗汉果甙IV、罗汉果甙V、罗汉果增甜剂、赛门苷、monatin及其盐、仙茅甜蛋白、甘草酸及其盐、竹芋蛋白、摩尼糖蛋白、马槟榔甜素、甜味蛋白、hernandulcin、叶甜素、菝葜苷、根皮苷、三叶苷、百元参苷、水龙骨甜素、polypodoside A、pterocaryoside A、pterocaryoside B、倍半萜甙、糙苏苷I、巴西甘草甜素I、三萜甙A、甜茶树苷I或其组合。
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