CN101680009B - 提高脂肪酸衍生物的产量 - Google Patents

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Abstract

提供了产生来自脂肪酸生物合成途径的产物(脂肪酸衍生物)的基因工程细胞和微生物，以及它们的使用方法。所述产物特别是可以用作生物燃料。

Description

提高脂肪酸衍生物的产量
技术领域
本发明提供基因工程细胞和微生物以及它们的使用方法，所述微生物产生来自脂肪酸生物合成途径的产物(即脂肪酸衍生物)。这类产物特别适合作为生物燃料。
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2007年3月28日提交的美国临时申请序列号60/908,547、2007年11月21日提交的美国临时申请序列号60/989,798以及2007年5月18号提交的PCT申请PCT/US2007/011923的优先权，将这些申请均通过引用全文并入本文。
背景技术
随着技术的发展，与之相伴的是对燃料来源的依赖性的增加。这类燃料来源正变得日益有限和难以获得。随着化石燃料以空前的速度被烧掉，世界上的燃料需求可能不久以后就将超过目前的燃料供给。
因此，现在致力于利用可再生能源，诸如日光、水、风和生物质(biomass)。利用生物质产生非石油来源的新的燃料资源(即生物燃料)已成为一种可供选择的方案。生物燃料是一种由烷烃和酯类构成的可生物降解的、清洁燃烧的燃料。生物柴油即是一种示例性的生物燃料。生物柴油可以采用纯的形式(被称为“纯”生物柴油)，或者以任何浓度与常规的石化柴油混合用于大部分内燃柴油发动机中。
与基于石油的柴油相比，生物柴油提供了包括燃烧过程中排放量(例如，一氧化碳、硫、芳香烃、烟灰颗粒)下降在内的许多有趣和有吸引力的有益特点。因其基于可再生的生物材料，生物柴油还能维持平衡的二氧化碳循环。生物柴油无毒、可完全生物降解，而且因为燃点高，易燃性低因此非常安全。此外，生物柴油提供良好的润滑性能， 从而减少发动机的磨损。
目前生产生物柴油的方法涉及将来自植物油原料的三酰甘油进行酯交换，植物油原料，比如在欧洲是油菜，在北美是大豆，在东南亚是棕榈油。因此工业规模的生物柴油生产在地理和季节上局限于植物油原料的产地。酯交换过程产生脂肪酯(fatty esters)混合物，其可以作为生物柴油。酯交换过程中的一种不希望的副产品是甘油。要作为生物柴油使用，必须从上述异质产物中进一步纯化脂肪酯。这最终会增加生物柴油的产量，但增加了脂肪酯生产的成本和所需能量。而且，植物油原料不是高效的能量来源，因为它们需要广大的种植面积。例如，因为只有菜子油产生用于生物柴油，油菜生物质的其他部分不被使用，从油菜产生生物柴油的产量仅有1300L/公顷。此外，某些植物油原料，比如油菜和大豆的种植需要经常进行农作物轮种以防止土地养分耗尽。
因此，需要在经济和能量方面高效的生物燃料，以及由可再生能量来源比如生物质生产所述生物柴油的方法。
发明概述
本发明涉及从重组细胞中产生脂肪酸衍生物。通常，通过表达或超表达编码脂肪酸衍生物酶的至少一个基因来产生脂肪酸衍生物。此外，可以对重组细胞中编码酰基辅酶A(CoA)脱氢酶的基因进行修饰，从而使该基因的表达弱化。
本发明的一个方面提供了重组细胞，所述重组细胞包含至少下述之一：(a)至少一个编码脂肪酸衍生物酶的基因，修饰该基因，从而使其超表达；和(b)编码酰基辅酶A脱氢酶的基因，修饰该基因，从而使其表达弱化。所述修饰的编码脂肪酸衍生物酶的基因可以是编码酰基辅酶A合酶、硫酯酶、酯合酶、醇酰基转移酶、醇脱氢酶、酰基辅酶A还原酶或脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶的基因。在一个实施方案中，修饰的基因编码酰基辅酶A合酶、硫酯酶和酯合酶。在某些实施方案中，酰基辅酶A合酶和硫酯酶以及/或者酯合酶是修饰的。在某些实施方案中，细胞还包含编码转运蛋白的基因。
本发明的重组或宿主细胞可以是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、大肠杆菌(E.coli)、节杆菌(Archrobacter)、粘红酵母(Rhodotorula glutinins)、不动杆菌(Acinetobacter)、解脂假丝酵母、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、弗尼斯氏弧菌(Vibrio furnissii)、藤黄微球菌(Micrococcusleuteus)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)或者枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞，例如节杆菌AK 19、不动杆菌(Acinetobacter sp.)菌株M-1、大肠杆菌B、大肠杆菌C、大肠杆菌K或者大肠杆菌W细胞。在其他实施方案中，重组细胞是蓝细菌(Cyanobacteria)细胞，例如集胞蓝菌(Synechocystis sp.)PCC6803或细长聚球菌(Synechococcuselongatus)PCC7942细胞。还有一些实施方案中，重组细胞是植物、动物或人细胞。可选地，重组细胞是来自细菌、酵母或丝状真菌的微生物细胞。
本发明第二方面提供了能产生脂肪酸衍生物的重组细胞，其中所述细胞经修饰从而包括至少一个编码脂肪酸衍生物酶的外源核酸序列。所述外源核酸序列可以编码酰基辅酶A合酶、硫酯酶、酯合酶、醇酰基转移酶、醇脱氢酶、酰基辅酶A还原酶或脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶。在某些实施方案中，细胞经修饰从而包括至少两个编码脂肪酸衍生物酶的外源核酸序列，例如第一外源核酸序列编码酰基辅酶A合酶，第二外源核酸序列编码硫酯酶或酯合酶。在其他实施方案中，编码脂肪酸衍生物酶的基因经修饰从而优化用于在重组细胞内表达的密码子。
在一个实施方案中，重组细胞包含修饰的编码酰基辅酶A合酶的基因，如fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EA Vl 5023、fadDl、fadD2、RPCJ074、fadDD35、fadDD22、faa3p，或编码蛋白质ZP_01644857的基因。酰基辅酶A合酶基因的实例有来自结核分枝杆菌(M.tuberculosis)HR7Rv的fadDD35[NP_217021]、来自枯草芽孢杆菌的yhfL[NP_388908]、来自铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)PAO1的fadD1[NP_251989]、来自嗜麦芽窄食单胞菌R551-3的编码蛋白质ZP_01644857的基因或者来自酿酒酵母的faa3p[NP_012257]。
在第二个实施方案中，重组细胞包含修饰的编码硫酯酶的基因，如tesA、′tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatB[M141T]、fatA或fatA1。
在第三个实施方案中，重组细胞包含修饰的编码酯合酶的基因，如获得自不动杆菌(Acinetobacter spp.)、博克岛食烷菌(Alcanivoraxborkumensis)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、酿酒酵母、智人(Homosapiens)、西蒙得木(Simmondsiachinensis)、高山被孢霉(Mortierellaalpine)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、Alcanivorax jadensis、博克岛食烷菌、不动杆菌(Acinetobacter sp.)HO1-N或混浊红球菌(Rhodococcus opacus)的酯合酶基因。酯合酶基因的实例包括wax/dgat，即来自西蒙得木、不动杆菌菌株ADP1、博克岛食烷菌、铜绿假单胞菌、Fundibacter jadensis、拟南芥或真养产碱杆菌(Alkaligenes eutrophus)的双功能酯合酶/酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶。
在一个实施方案中，本发明的重组细胞还包含pdh、pαnk、aceEF、fabli、fabD、fabG、acpP和fabF基因中的至少一个，基因经过修饰以便表达或超表达。在第二个实施方案中，重组细胞还包含fadE、gpsA、ldhA、pflB、adhE、pta、poxB、ackA和ackB基因中的至少一个，基因经修饰，其表达弱化。在第三个实施方案中，重组细胞还包含plsB和sfa的至少一个修饰的基因。
在其他实施方案中，编码酰基辅酶A脱氢酶的基因缺失。
本发明的重组细胞相对非重组细胞，例如否则相同的非重组细胞或者种系和表型类似的细胞，产生更多的酰基辅酶A。
本发明还提供了本文公开的重组细胞所产生的组合物。包含由重组细胞产生的脂肪酸衍生物的组合物包含少于或者等于约50ppm的砷，约30ppm、约25ppm，或者在约10-50ppm的砷；少于或等于约200ppm的钙、约150ppm的钙、约119ppm的钙或者约50-200ppm的钙；少于或等于约200ppm的氯、约150ppm的氯、约119ppm的氯或者在约50-200ppm的氯；少于或等于约50ppm的铜、约30ppm的铜、约23ppm或者约10-50ppm的铜；少于或等于约300ppm的铁、约200ppm的铁、约136ppm的铁或者约50-250ppm的铁；少于或等于约50ppm的铅、约25ppm的铅或者约10-50ppm的铅；少于或等于约50 ppm的锰、约30ppm的锰、约23ppm的锰或者约10-50ppm的锰；少于或等于约50ppm的镁、约30ppm镁、约23ppm的镁或者约10-50ppm的镁；少于或等于约0.5ppm的汞、约0.1ppm的汞、约0.06ppm的汞或者约0.01-0.2ppm的汞；少于或等于约50ppm的钼、约30ppm的钼、约23ppm的钼或者约10-50ppm的钼；少于或等于约2％的氮；约1％的氮、约0.5％的氮或者约0.1-1％的氮；少于或等于约200ppm的钾、约150ppm的钾、约103ppm或者约50-200ppm的钾；少于或等于约300ppm的钠、约200ppm的钠、约140ppm的钠或者约50-300ppm的钠；少于或等于约1ppm的硫、少于或等于约1％的硫，约0.14％的硫或者约0.05-0.3％的硫；少于或等于约50ppm的锌、约30ppm的锌、约23ppm的锌或者约10-50ppm的锌；或者少于或等于约700ppm的磷、约500ppm的磷、约350ppm的磷或者约100-700ppm的磷。
在一个方面，由本发明的重组细胞产生的组合物所包含的脂肪酸，在碳链中从所述脂肪酸衍生物还原末端的7位(在C7和C8之间)有双键。在某些实施方案中，组合物包含C5-C25脂肪酯，或C10-C20脂肪酯，或者C12-C18脂肪酯。在其他实施方案中，所述脂肪酸衍生物包含直链脂肪酸衍生物、支链脂肪酸衍生物和环状部分。仍然在一些实施方案中，脂肪酸衍生物是不饱和(例如单不饱和)或饱和的。
在其他方面，组合物包含由醇和酰基辅酶A产生的脂肪酯，其中所述醇的长度为至少约1个、约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约10个、约12个、约14个、约16个或约18个碳；酰基辅酶A的长度为至少约2个、约4个、约6个、约8个、约10个、约12个、约14个、约16个、约18个、约20个、约22个、约24个或约26个碳。在某些实施方案中，产生脂肪酯的醇和酰基辅酶A差别约2个、约4个、约6个、约8个、约10个、约12个或约14个碳原子。
在一个实施方案中，由本发明的重组细胞产生的组合物其现代碳分数(fractionof modern carbon)为约1.003到约1.5。
本发明的其他方面提供了在重组细胞中产生脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括：a)获得重组细胞；b)培养重组细胞，以及c)产生 脂肪酸衍生物。
本发明的其他方面提供了提高重组细胞中脂肪酸衍生物产量的方法，所述方法包括将编码脂肪酸衍生物酶的外源核酸导入重组细胞，表达所述外源核酸，其中该核酸在重组细胞内的表达使脂肪酸衍生物的产量相对非重组细胞得以提高，所述非重组细胞如，否则相同的非重组细胞或具有类似谱系和表现型的细胞。在某些实施方案中，所述外源核酸编码酰基辅酶A合酶、硫酯酶或酯合酶。在其他实施方案中，将编码酰基辅酶A合酶、硫酯酶和酯合酶的外源核酸导入重组细胞。在其他实施方案中，提供了在重组细胞中提高脂肪酸衍生物产生水平的方法，所述方法包括：将核酸构建体导入宿主细胞，所述核酸构建体包含：a)编码核酸衍生物酶的核酸序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：13，和b)用于所述核酸序列表达的调节序列；表达所述核酸序列；以及获得脂肪酸衍生物。
本发明仍然在其方面提供了包含编码脂肪酸衍生物酶的核酸序列的重组构建体，其中所述核酸序列经修饰超表达所述编码脂肪酸衍生物酶的基因。在一个实施方案中，核酸序列经修饰超表达编码酰基辅酶A合酶、硫酯酶或酯合酶的基因。在第二个实施方案中，核酸序列经修饰超表达(1)编码酰基辅酶A的基因，和(2)编码硫酯酶或酯合酶的基因。在第三个实施方案中，核酸序列经修饰超表达编码(1)酰基辅酶A、(2)硫酯酶和(3)酯合酶的基因。在第四个实施方案中，构建体还包含编码酰基辅酶A脱氢酶的核酸序列，该核酸序列经修饰使酰基辅酶A脱氢酶的表达弱化。本发明还提供了包含这些重组构建体的载体。在某些实施方案中，所述载体还包含结构基因以便对转化的细胞进行选择。
本发明另一方面提供了提高宿主细胞中脂肪酸衍生物产量的方法，所述方法包含：用核苷酸序列转化宿主细胞，从而宿主细胞表达或超表达脂肪酸衍生物酶基因，其中宿主细胞内的脂肪酸衍生物产量相对未经转化的细胞得以提高。在这样的方法中，可以收获宿主细胞并裂解以获得所产生的脂肪酸衍生物。可选地，用编码转运蛋白的核苷酸序列转化宿主细胞，宿主细胞将脂肪酸衍生物释放到胞外。
本发明的再一方面提供了包含编码脂肪酸衍生物酶的核酸序列的载体，其中所述核酸序列可操纵地连接于能在宿主细胞中发挥作用的启动子，该核酸序列包含编码酰基辅酶A合酶的第一核酸序列和编码硫酯酶或酯合酶的第二核酸序列。所述载体还可以包含编码转运蛋白的核酸序列。在一个实施方案中，第二核酸序列编码硫酯酶，且载体还包含编码酯合酶的第三核酸序列。在第二个实施方案中，载体还包含编码转运蛋白的核酸序列。
本发明还有一方面提供了产生脂肪酸衍生物的方法，包括：(a)提供包含本发明的载体的宿主细胞；和(b)培养宿主细胞以产生脂肪酸衍生物。在某些实施方案中，由宿主细胞培养物收集上清液从而获得已产生的脂肪酸衍生物。本发明也提供了通过此类方法产生的脂肪酸衍生物。
一方面，根据本发明产生的脂肪酸衍生物可以用作生物燃料组合物。所述脂肪酸衍生物可以用作生物柴油、脂肪醇、脂肪酯、三酰甘油、汽油或喷气燃料(jet fuel)。
另一方面，本发明的重组细胞所产生的组合物包含脂肪酯或游离脂肪酸。例如，在一个实施方案中，游离脂肪酸的重量百分比是至少约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％或者约25％。在另一个实施方案中，所产生的脂肪酯的重量百分比是至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％或约90％。在另一个实施方案中，脂肪酯与游离脂肪酸的比率是约10∶1、约9∶1、约8∶1、约7∶1、约5∶1、约2∶1或约1∶1。
在一个实施方案中，根据本发明所产生的组合物包括脂肪酯，其中所述脂肪酯是十二酸乙酯、十三酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、顺式-9-十六烯酸乙酯、十六酸乙酯、十七酸乙酯、顺式-11-十八烯酸乙酯、十八酸乙酯或者其组合中的至少一种。
在第二个实施方案中，根据本发明所产生的组合物包括游离脂肪酸，其中所述游离脂肪酸是十二酸、十四酸、十五酸、顺式-9-十六烯酸、十六酸、顺式-11-十八烯酸或者其的组合中的至少一种。
这些实施方案的组合物还可以用作生物燃料，例如，作为生物柴油、脂肪醇、脂肪酯、三酰甘油、汽油或喷气燃料。
在某些实施方案中，本文公开的组合物含有的C12游离脂肪酸相对全部游离脂肪酸的重量百分比是至少约5％、10％或15％。在其他实施方案中，本文公开的组合物含有的C14游离脂肪酸相对全部游离脂肪酸的重量百分比是至少约20％、30％或40％。在其他实施方案中，本文公开的组合物含有的C15游离脂肪酸相对全部游离脂肪酸的重量百分比是至少约1％或2％。在其他实施方案中，本文公开的组合物含有的C16游离脂肪酸相对全部游离脂肪酸的重量百分比是至少约20％、30％或40％。在其他实施方案中，本文公开的组合物含有的C18游离脂肪酸相对全部游离脂肪酸的重量百分比是至少约15％、20％或25％。
在某些实施方案中，本文公开的组合物含有的C12脂肪酯相对全部脂肪酯的重量百分比是至少约1％、2％或3％。在其他实施方案中，本文公开的组合物含有的C14脂肪酯相对全部脂肪酯的重量百分比是至少约10％、15％或20％。在其他实施方案中，本文公开的组合物含有的C16脂肪酯相对全部脂肪酯的重量百分比是至少约30％、40％或50％。在其他实施方案中，本文公开的组合物含有的C18脂肪酯相对全部脂肪酯的重量百分比是至少约20％、30％或40％。
附图简述
图1是鉴定可以超表达或弱化从而使脂肪酸衍生物产量增加的各种基因的表格。这个表格还鉴定了可以经调节从而改变脂肪酸衍生物产物结构的各种基因。这些基因中的某些用于改变脂肪酸衍生物结构的基因，也能增加脂肪酸衍生物的产生。
图2是说明FAS生物合成途径的图示。
图3是说明β氧化途径的图示，包括由以下酶催化的步骤：(1)酰基辅酶A合酶(EC6.2.1-)；(2)酰基辅酶A脱氢酶(EC 1.3.99.3)；(3)烯酰-辅酶A水合酶(EC 4.2.1.17)；(4)3-羟丁酰辅酶A差向异构酶(EC5.1.2.3)；和(5)3-酮脂酰-辅酶A硫解酶(EC 2.3.1.16)。这个β氧化途径的最后反应释放乙酰辅酶A和短了两个碳的酰基辅酶A脂肪酸，准 备好再进行β氧化反应。
图4的示意图显示根据所提供的底物产生脂肪酯的生物合成途径。
图5的示意图显示产生脂肪醇的生物合成途径。
图6的示意图显示产生脂肪酯的生物合成途径。
图7描述了实施例5描述的菌株的脂肪醇产生，所述菌株共转化有pCDFDuet-1-fadD-acr1和含有各种硫酯酶基因的质粒。鉴定了饱和的C10、C12、C14、C16和C18脂肪醇。
图8描述了脂肪醇从生产菌株(production strain)的释放。当菌株培养在37℃，约50％所产生的脂肪醇从细胞中释放。
图9A-D描述了表达醇乙酰转移酶(AATs，EC 2.3.1.84)的生产宿主(productionhost)和表达酯合酶(EC 2.3.1.20、2.3.1.75)的生产宿主产生的辛酸辛酯(C8C8)的GS-MS谱。图9A显示菌株C41(DE3，ΔfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B)的乙酰乙酯提取物的GC-MS谱，其中pHZ1.43质粒表达ADP1酯合酶(EC2.3.1.20、EC2.3.1.75)。图9B显示菌株C41(DE3，AfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B)的乙酰乙酸酯提取物的GC-MS谱，其中pHZ1.43质粒表达SAAT。图9C显示菌株C41(DE3，ΔfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B)的乙酰乙酯提取物的GC-MS谱，其中pHZ 1.43质粒不含有ADP1(酯合酶)或者SAAT。图9D 显示C41(DE3，ΔfadE/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)所产生的C8C8的质谱和裂解模式(fragmentationpattern)，其中pHZ1.43质粒表达SAAT。
图10显示当来自不动杆菌ADP1(WSadp1)的酯合酶与来自萼距花(Cupheahookeriana)的硫酯酶基因在生产宿主中共表达时，产生的乙酯的分布。
图11描述了各种酯合酶在25℃产生的乙酯。所述乙酯由携带各种酯合酶的重组大肠杆菌菌株产生。重组菌株是1.C41(DE3，ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-tesA+pCDFDuet-1-fadD以及1pHZ 1.43；2.pHZ1，97_377；3.pHZ 1.97_atfA2；4.pHZ 1.97_376；5.pHZ 1.97_atfA1；6.没有质粒(对照)。
图12描述了各种大肠杆菌菌株产生的脂肪酸乙酯(FAEE)的酰基组成。所述重组菌株是1.C41(DE3，ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-tesA+pCDFDuet-1-fadD以及1pHZ 1.43；2.pHZ1，97_377；3.pHZ1.97_atfA2；4.pHZ1.97_376；5.pHZ1.97_atfA1；6.没有质粒(对照)。
图13描述了各种酯合酶在37℃制备的乙酯。乙酯是由携带各种酯合酶基因的重组大肠杆菌菌株产生的。所述重组菌株是1.C41(DE3，ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-tesA+pCDFDuet-1-fadD 以及1pHZ 1.43；2.pHZ1，97_377；3.pHZ1.97_atfA2；4.pHZ1.97_376；5.pHZ1.97_atfA1；6.没有质粒(对照)。
图14显示了转化体C41(DE3，ΔfadΔfabR)/pETDuet-1-tesA+pCDFDuet-1-fadD+pHZ 1.97_atfA2t的三个单菌落产生的游离脂肪酸(FFA)和脂肪酸乙酯(FAEE)的浓度。FFA被转化为脂肪酸乙酯(FAEE)，经GC/MS定量。
图15的示意图显示了FabA和FabB的对照区。FadR和FabR共有结合部位用粗体显示。垂直箭头指示可以进行突变从而改变fabA表达的位点。括弧指出了每个位点建议的碱基。构成典型大肠杆菌启动子-35和-10区的两个区域如括弧所示。还显示了使启动子与共有启动子序列更接近的建议突变。
图16A和16B是GC/MS分析的色谱。图16A描述转化了质粒pCDFDuet-1-fadD-WSadp1、pETDuet-1-’tesA的大肠杆菌菌株LS9001培养物的乙基提取物色谱。图16B显示用作参照的棕榈酸乙酯和油酸乙酯的色谱。
图17是质粒pOP-80的图谱。
图18是SEQ ID NO：1，pOP-80质粒的的全长DNA序列。
图19是SEQ ID NO：2，大肠杆菌密码子优化的fadD35基因(登录号NP_217021)的DNA序列。
图20是SEQ ID NO：3，大肠杆菌密码子优化的fadD1基因(登录号NP_251989)的DNA序列。
图21是SEQ ID NO：4，基于保存在NCBI的登录号为NC_000964 的DNA序列的BsyhfLBspHIF引物。
图22是SEQ ID NO：5，基于保存在NCBI的登录号为NC_000964的DNA序列的BsyhfLEcoR引物。
图23是SEQ ID NO：6，来自枯草芽孢杆菌的yhfL基因的DNA序列。
图24是SEQ ID NO：7，基于保存在NCBI的登录号为NC_001141的DNA序列的Scfaa3pPciF引物。
图25是SEQ ID NO：8，基于保存在NCBI的登录号为NC_001141的DNA序列的Scfaa3pPciI引物。
图26是SEQ ID NO：9，来自酿酒酵母FAA3基因的DNA序列(NP_012257)。
图27是SEQ ID NO：10，基于保存在NCBI的登录号为NZ_AAVZ01000044的DNA序列的Smprk59BspF引物。
图28是SEQ ID NO：11，基于保存在NCBI的登录号为NZ_AAVZ01000044的DNA序列的Smprk59HindR引物。
图29是SEQ ID NO：12，PrkBsp引物。
图30是SEQ ID NO：13，编码来自嗜麦芽窄食单胞菌R551-3的ZP_01644857蛋白质序列的DNA序列。
图31是SEQ ID NO：14，来自嗜麦芽窄食单胞菌ATCC 17679的ZP_01644857的蛋白质序列。
缩写和术语
提供下列关于术语和方法的解释是为了更好的描述本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发明。本文使用的单数形式“一种(a或an)”或者“这种(the)”包括复数含义，除非上下文明确的另外指出。例如，提及“一种细胞”或“这种细胞”包括一个或多数个这类细胞。措辞“或者”是指列举的可选择要素或者两个或更多个要素组合中的单个要素，除非上下文明确的另外指出。例如短语“硫酯酶活性或者脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶活性”是指硫酯酶活性、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶活性或者脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶活性和硫酯酶活性两者的组合。此外，贯穿本说明书，可以以基因或酶的缩写名称来提及基因或酶，但应当理解为这种缩写的基因或酶名称代表一类基因或酶。例如，“fadD”是指编码酶“FadD”的基因，以及编码酰基辅酶A合酶(EC 6.2.1.-)的基因。这种基因名称包括所有编码相同肽和具有相同生理功能的同源酶的基因。这种酶名称包括所有催化相同基本化学反应或者有相同活性的肽。图1提供了各种缩写的基因和肽名称、对其活性的描述、以及它们的酶学分类号。这些可用于鉴定具有相关活性的该类酶的其他成员及其相关基因，以用于产生脂肪酸衍生物。
除非另外解释，所有本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解具有相同的含义。尽管与本文描述的类似或者等同的方法和材料可用于本发明的实施或者试验，但下文描述了适合的方法和材料。所述材料、方法和实例只是说明性的，而不是用于限制。根据下面的发明详述和权利要求，本发明的其他特征是明显的。
登录号：贯穿本说明书的登录号来源于美国国立卫生研究院维护的NCBI数据库(国立生物技术信息中心)。所述登录号如该数据库在2007年3月27日提供的。
酶学分类号(EC)：EC编号由国际生物化学与分子生物学联合会命名委员会(NC-IUBMB，http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme)建立。本文提供的EC编号来自京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomics)维护的KEGG Ligand数据库，该数据库由东京大学部分资助。所述EC编号是2007年3月27日由该数据库提供的。
弱化：减弱、减少或消除。在一个实例中，降低特定的酶对不是产物或者反应物的组合物引起的反馈抑制或者抑制(非途径特异性反馈)的灵敏度，从而使得所述酶活性不受化合物存在的影响。在另一个实例中，fabH基因的表达是温度敏感的，可以改变其序列从而降低对温度波动的敏感性。当需要支链氨基酸时，可以将fabH基因的表达弱化。在另一个实例中，经过修饰活性更低的酶可以称作弱化的。
可以利用对编码酶的序列进行功能性修饰来弱化该酶的表达。序列修饰可以包括例如将基因序列或控制该基因序列的转录或翻译的序 列突变、缺失或插入一或多个核苷酸，所述修饰减少或者抑制基因产物的产生，或者导致基因产物没有功能。例如，大肠杆菌中fabR的功能性缺失减轻了脂肪酸生物合成途径的抑制，允许大肠杆菌产生更多的不饱和脂肪酸(UFAs)。在某些情况下，功能性缺失被描述成敲除突变。
还有其他方法可以弱化酶的表达。例如，弱化可以通过以下技术实现：修饰编码如上所述基因的序列；将基因置于活性较低的启动子的控制下；表达针对目的基因的干扰RNA、核酶或反义序列；通过改变物理或化学环境，比如温度、pH或溶液浓度，从而使得基因或基因产物不能达到最佳活性；或者通过本领域已知的任何其他技术。。
生物燃料：术语“生物燃料”是指来源于生物质的任何燃料。
生物质是可以转化为生物燃料的生物材料。生物质的一个示例性来源是植物材料。例如，玉米、甘蔗和柳枝稷可以作为生物质。生物质的另一个非限制性实例是动物材料，例如牛粪。生物质还包括工业、农业、林业和家庭废料。这类可以作为生物质的废料的实例是发酵废料、稻草、木材、污水、垃圾和剩饭。生物质还包括碳源，比如碳水化合物(例如糖)。
生物燃料可以取代基于石油的燃料。例如，生物燃料包括在运输燃料(例如汽油、柴油、喷气燃料等)、加热燃料以及发电燃料之内。生物燃料是一种可再生能源。生物燃料的非限制性实例是来源于生物质的生物柴油、烃(例如烷烃、烯烃、炔或芳香烃)、以及醇。
生物柴油：生物柴油是一种生物燃料。生物柴油可以作为来源于石油的柴油的替代品。生物柴油可以采用纯的形式(被称为“纯”生物柴油)，或者以任何浓度与常规的石化柴油混合用于内燃柴油发动机中。
生物柴油可以由烃或酯类构成。在一个实施方案中，生物柴油由脂肪酯，比如脂肪酸甲酯(FAME)或脂肪酸乙酯(FAEE)构成。在优选的实施方案中，构成这些FAME和FAEE的脂酰部分的碳链长度为约8-20、10-18或者12-16个碳。用作生物柴油的脂肪酯可能含有饱和或不饱和的碳链。
生物原油(biocrude)：生物原油是一种生物燃料。生物原油可以作 为来源于石油的燃料的替代品。此外，生物原油和石油原油一样，均可以转化为其他燃料，例如汽油、柴油、喷气燃料或燃料油(heating oil)。而且，生物原油与石油原油一样，可以转化为其他工业上有用的化学品，用于例如制药、化妆品、消费品、工业加工等。
生物原油可以包括例如烃、烃产品、脂肪酯以及/或者脂肪族酮。在优选的实施方案中，生物原油由烃，例如脂肪(例如，烷烃、烯烃、炔)或芳香烃构成。
碳源：通常指适合作为原核或者简单真核细胞生长的碳源的底物或者化合物。碳源可以是各种形式，包括但不限于多聚体、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽、气体(例如CO和CO2)等。这些包括，例如，各种单糖，如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖；寡糖，如果糖-寡糖和半乳糖-寡糖；多糖，如木糖和阿拉伯糖；二糖，如蔗糖、麦芽糖和松二糖；纤维素物质，如甲基纤维素和羧甲基钠纤维素；饱和或者不饱和的脂肪酸酯，如琥珀酸酯、乳酸酯和乙酸酯；醇，如乙醇等，或者它们的混合物。
此外，碳源还可以是光合作用产物，包括但不限于葡萄糖。
流体浊点：在该温度，溶解的固体不再完全可溶，聚集为第二相，使流体看上去浑浊。这个术语与结果不同的几种应用有关。
在石油工业中，浊点指的的是这样的温度，在该温度下，蜡或其他重烃在原油、提炼油或燃料中结晶，形成浑浊的外观。固化蜡的存在会影响流体的流动性能、堵塞滤清器/喷射器等的倾向、蜡在凉的表面上的沉积(例如管道或热交换器污垢)，甚至与水的乳化特性。浊点是在冷的操作温度时，油堵塞滤清器或小孔的趋势的指标。
非离子表面活性剂或乙二醇溶液的浊点是混合物开始分相并出现两个相，因此变得浑浊的温度。这一性态是含有聚环氧乙烷链的非离子表面活性剂的特性，聚环氧乙烷链在水中表现出相对温度性态的反向溶解，因此随着温度提高在某个点会“变浊(cloudout)”。表现这一性态的乙二醇被称为“浊点乙二醇”，并用作页岩抑制剂。盐度会影响浊点，在盐分越高的流体中浊点通常越低。
降低浊点的添加剂：可以加入组合物使如上所述的溶液的浊点降 低或下降的添加剂。
可检测的：其存在(existence或presence)能够得以确定的。例如，利用以下提供的方法，来自反应物的产物的产生(例如C18脂肪酸的产生)是可检测的。
内源的：用于本文提及核酸分子和特定的细胞或者微生物时，“内源的”是指位于细胞内的且不是利用重组工程技术导入细胞的核酸序列或者肽。例如，当细胞最初从自然界分离时，已经存在于所述细胞中的基因。即使调控序列，诸如能够激活转录或者翻译的启动子或者增强子序列已经通过重组技术被改变，基因仍被认为是内源的。
酯合酶：酯合酶是能够产生脂肪酯的肽。更具体地说，酯合酶是能够将硫酯转化为脂肪酯的肽。在优选的实施方案中，酯合酶将硫酯、酰基辅酶A转化为脂肪酯。
在可选的实施方案中，酯合酶利用硫酯和醇作为底物产生脂肪酯。酯合酶能够利用短链和长链酰基辅酶A作为底物。此外，酯合酶能够利用短链和长链醇作为底物。
酯合酶的非限制性实例是蜡合酶、蜡-酯合酶、酰基辅酶A：醇转酰基酶、酰基转移酶和脂酰辅酶A：脂肪醇酰基转移酶。示例性的酯合酶分类到酶分类号EC2.3.1.75中。图1提供了示例性的GenBank登录号。
外源的：用于本文提及核酸分子和特定的细胞时，“外源的”是指不是来源于自然界发现的特定细胞的任意核酸分子。例如，“外源DNA”可以指插入微生物基因组DNA序列的DNA序列，或者导入微生物的染色体外核酸序列。因此，一旦非天然存在的核酸分子被导入细胞，则其被认为是外源的。对特定细胞来说，天然存在的核酸分子也可以是外源的。例如，一旦从大肠杆菌DH5α细胞分离的完整编码序列被导入第二个大肠杆菌DH5α细胞，则该编码序列对于第二个细胞来说是外源核酸，即使它们都是DH5α细胞。
表达：基因中的可遗传信息，诸如DNA序列被转变为功能性基因产物，诸如蛋白或RNA的过程。
基因表达过程中的多个步骤可以被调节，包括转录步骤、翻译步骤以及所产生的蛋白质的翻译后修饰。基因调控使细胞能够控制其结 构和功能，是任何生物细胞分化、形态发生和多样性以及适应性的基础。基因调控还可以作为进化改变的基础，因为对基因表达的时机、位置和量的控制对生物中基因的功能(作用)有深远的影响。
表达的基因包括被转录为信使RNA(mRNA)然后被翻译为蛋白质的基因，以及被转录为RNA类型的基因，所述RNA类型如不被翻译为蛋白质的转移RNA(tRNA)、核醣体RNA(rRNA)和调节RNA)。
脂肪酯：脂肪酯属于酯类。在优选实施方案中，脂肪酯是任何由脂肪酸制备的酯，例如脂肪酸酯。
在一个实施方案中，脂肪酯含有A侧(即连接在羧酸氧上的碳链)和B侧(即包含亲本羧酸酯的碳链)。在优选实施方案中，当脂肪酯来源于脂肪酸生物合成途径时，A侧来自醇，B侧来自脂肪酸。
任何醇都可以用于形成脂肪酯的A侧。例如，醇可以来源于脂肪酸生物合成途径。可选地，可以通过非脂肪酸生物合成途径来产生醇。而且，醇可以是外源提供的。例如在脂肪酯是由生物产生的情况下，醇可以在发酵液中提供。可选地，在脂肪酯是由同时能产生醇的生物产生的情况下，可以提供外源的羧酸，诸如脂肪酸或乙酸。
包含A侧或B侧的碳链可以是任意长度。在一个实施方案中，酯的A侧在长度上为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、10、12。、14、16或18个碳。酯的B侧在长度上为至少约4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26个碳。A侧和/或B侧可以是直链或支链。支链可以有一或多个分支点。此外，支链可以包括环形分支。再者，A侧和/或B侧可以是饱和或不饱和的。如果是不饱和的，A侧和/或B侧可以有一或多个不饱和位点。
在一个实施方案中，脂肪酯是通过生物合成制备的。在这个实施方案中，首先脂肪酸被“激活”。“激活的”脂肪酸的非限制性实例是酰基辅酶A、酰基-ACP和酰基磷酸酯。酰基辅酶A可以是脂肪酸生物合成或降解的直接产物。此外，可以由游离脂肪酸、辅酶A和腺苷核苷酸三磷酸(ATP)合成酰基辅酶A。产生酰基辅酶A的酶的实例是酰基辅酶A合酶。
脂肪酸被激活后，可以容易地转移到受体亲核分子上。示例性的 亲核分子是醇、巯醇或磷酸酯。
在另一个实施方案中，所述脂肪酯可以来源于脂酰基硫酯和醇。
在一个实施方案中，所述脂肪酯是蜡。蜡可以来源于长链醇和长链脂肪酸。另一个实施方案中，脂肪酯是脂肪酸硫酯，例如脂酰辅酶A。在其他实施方案中，所述脂肪酸酯是脂肪酰基泛酸酯、酰基载体蛋白(ACP)或者脂肪磷酸酯。
脂肪酯有很多用途。例如，脂肪酯可以用作生物燃料或表面活性剂。
脂肪酸衍生物：术语“脂肪酸衍生物”包括部分由生产宿主生物的脂肪酸生物合成途径产生的产物。“脂肪酸衍生物”还包括部分由酰基-ACP或酰基-ACP衍生物产生的产物。脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸合酶，其可以按照本文的描述进行工程改造产生脂肪酸衍生物，以及在一些实例中其可以与其他酶一起表达，产生具有所需碳链特性的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括例如短链和长链醇、烃以及脂肪醇和酯，包括蜡、脂肪酸酯或脂肪酯。
脂肪酸衍生物酶(fatty acid derivative enzymes)：在脂肪酸衍生物产生过程中表达或超表达的所有酶在文中均统称为脂肪酸衍生物酶。这些酶可以是脂肪酸生物合成途径的一部分。脂肪酸衍生物合酶的非限制性实例包括脂肪酸合酶、硫酯酶、酰基辅酶A合酶、酰基辅酶A还原酶、醇脱氢酶、醇乙酰转移酶、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶以及酯合酶。脂肪酸衍生物酶将底物转化为脂肪酸衍生物。在某些实例中，底物可以是脂肪酸衍生物，脂肪酸衍生物酶将其转化为不同的脂肪酸衍生物。
脂肪醇形成肽：能够催化酰基辅酶A转化为脂肪醇的肽，包括脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR，EC 1.1.1*)、酰基辅酶A还原酶(EC1.2.1.50)或者醇脱氢酶(EC1.1.1.1)。此外，本领域普通技术人员应当理解某些脂肪醇形成肽也能催化其他反应。例如，某些酰基辅酶A还原酶肽除了脂肪酸以外，也接受其他底物。因此，这类非特异性的肽也包括在内。编码脂肪醇形成肽的核酸序列在本领域内是已知的，公众可以获取这类肽。图1中提供了示例性的GenBank登录号。
现代碳分数：现代碳分数(fM)是由国家标准和技术研究院(NIST)标准参考物质(SRMs)4990B和4990C定义的，分别称为草酸标准HOxI和HOxII。基本概念涉及14C/12CA同位素比率HOxI(参考AD1950)的0.95倍。这大概等同于经衰变修正的前工业革命时代的木头。对于当前的生物圈(植物材料)而言，fM约为1.1。
烃：包括含有碳(C)元素和氢(H)元素的化合物。所有烃均由碳骨架以及该骨架上连接的氢原子构成。有时，该术语被用作术语“脂肪烃”的简称。基本上存在3种类型的烃：(1)芳香烃，其具有至少约一个芳香环；(2)饱和烃，亦称为烷，其缺少双键、三键或者芳香键；和(3)不饱和烃，其在碳原子之间具有一个或者多个双键或者三键，包括：烯烃(例如二烯)和炔。
分离的：“分离的”生物学组分(诸如核酸分子、蛋白或者细胞)是已经基本上与该组分天然存在的其他生物学组分中分离或者纯化出来的生物学组分，如其他染色体和染色体外DNA序列；染色体和染色体外RNA；以及蛋白质。已经被“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术语还包含在生产宿主细胞中通过重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸分子和蛋白。
在一个实例中，分离的是指这样的天然存在的核酸分子，该核酸分子与它所来源的天然生物基因组中直接邻接的两个序列(即5′端的序列和3′端的序列)不再相邻。
微生物：包括来自古细菌域、细菌域和真核生物域的原核和真核微生物物种，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或者更高等的原生生物。术语“微生物细胞”和“微生物(microbes)”可以与名词微生物(microorganism)互换使用。
核酸分子：涵盖RNA和DNA序列，其包括但不限于cDNA、基因组DNA和mRNA。该名词包括合成的核酸分子，诸如那些化学合成或者重组产生的核酸分子。核酸分子可以是双链或者单链的。单链时，核酸分子可以是有义链或者反义链。此外，核酸分子可以是环状或者线性的。
可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列即是可操作地连接第二核酸序列。例如，如果启动子处于能够影响编码序列的转录或者表达的位置，则所述启动子是可操作地连接所述编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是相邻的，并且将两个蛋白编码区连接到相同的阅读框内。转录为串联的单个信使RNA的分离基因的结构用操纵子表示。例如在质粒载体中，将基因紧邻地置于单个启动子的转录调节下，则构成合成操纵子。
ORF(可读框)：不含任何终止密码子的一系列编码氨基酸的核苷酸三联体(即密码子)。这些序列通常被翻译为肽。
超表达：当肽在重组宿主细胞中的浓度比它在相同物种的非重组宿主细胞中的浓度高时。利用本领域已知的任何方法均可以实现超表达。例如，引起超表达可以通过改变宿主细胞基因组DNA序列的调控序列、向基因组DNA序列导入一或多个编码序列、改变与基因表达的调控有关的一或多个基因(例如，使阻抑物基因缺失或者产生活跃的激活剂)、导入染色体外核酸序列、通过导入稳定序列来增加转录的RNA的稳定性，以及这些方法的组合。
过量产生肽的重组微生物的实例包括表达编码酰基辅酶A合酶9(EC 6.2.1.-)的核酸序列的微生物。其他实例包括在硫酯酶肽(EC3.1.2.-)的内源编码序列上游导入了外源启动子序列的微生物。超表达还包括基因的翻译速率高于该基因的内源翻译速率。检测超表达的方法在本领域内公知的。例如可以利用rtPCR来评价转录的RNA水平，以及利用SDS-PAGE凝胶分析来评价蛋白水平。
分配系数：分配系数P定义为化合物在有机相中的平衡浓度除以平衡时水相(例如发酵液)中的浓度。在本文描述的两相系统的一个实施方案中，有机相由产生过程中的脂肪酸衍生物形成。但是在某些实例中，可以比如通过提供一层辛烷来促进产物的分离提供有机相。描述两相系统时，分配系数P通常以logP来讨论。logP为1的化合物将以10∶1分配到有机相中。logP为-1的化合物将以1∶10分配到有机相中。通过选择合适的发酵液和有机相，高logP值的脂肪酸衍生物即使在发酵罐中的浓度非常低，也会分离到有机相中。
生产宿主：生产宿主是用于产生本文所述产品的细胞。正如本文所公开的，生产宿主经修饰从而表达或超表达所选基因，或者所选基因的表达被弱化。生产宿主的非限制性实例包括植物、动物、人、细菌、酵母或丝状真菌细胞。
启动子和增强子：真核生物中的转录调控信号包含“启动子”和“增强子”元件。启动子和增强子由短的DNA序列构成，这些序列与参与转录的细胞蛋白特异性地相互作用(Maniatis et al.，Science236：1237，1987)。已经从包括酵母、昆虫、哺乳动物和植物细胞的基因的大量真核生物来源分离到了启动子和增强子元件。还从病毒中分离到启动子和增强子元件。在原核生物中也发现了类似的控制元件，比如启动子和增强子。选择特定启动子和增强子取决于用于表达目的蛋白的细胞类型。某些真核和原核启动子和增强子的生产宿主范围广范，而其他的仅在有限的生产宿主细胞中有功能(参见例如，Voss et al.，TrendsBiochem.Sci.，11：287，1986以及Maniatis等，1987，同前)。
术语“启动子元件”、“启动子”或者“启动子序列”是指象开关一样激活基因的表达的DNA序列。如果基因被活化，就说它被转录或者参与转录。转录涉及由基因合成mRNA。因此，启动子充当转录控制元件，并且为基因转录为mRNA提供起始位点。
纯化的：名词“纯化的”是指通过例如提取或分离从自然环境中移走的分子。“基本上纯的”分子60％不含至少约、优选不含至少约75％，更优选不含至少约90％与其天然结合的其他成分。本文中使用的术语“纯化的”或者“纯化”也指从样品中除去污染物。例如，除去污染物可以导致样品中目的脂肪酸衍生物的百分比提高。例如，在植物、细菌、酵母或哺乳动物生产宿主细胞中表达脂肪酸衍生物之后，通过除去生产宿主细胞蛋白质使脂肪酸衍生物得以纯化。纯化后，提高了样品中脂肪酸的百分比。
术语纯化的并不要求绝对的纯；它只是作为一个相对的名词。因此，例如，纯化的脂肪酸衍生物制品是指其中的产物比位于其细胞环境内的产物浓度更高的制品。例如，纯化的脂肪酯是指和与之相伴的细胞组分(例如，核酸、脂、糖和其他肽)基本上分离的脂肪酯。在另 一个实例中，纯化的脂肪酯制品是指基本上不含污染物(诸如那些发酵后可能存在的污染物)的脂肪酯制品。
例如，当按重量计至少约50％的样品由脂肪酯组成时，脂肪酯是纯化的。在另一个实例中，当至少约60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或者99％或者更高重量比的样品由脂肪酯组成时，脂肪酯是纯化的。
重组体：重组核酸分子具有非天然存在的序列，具有将两个否则是分开的序列片段通过人工组合制备的序列，或者以上两者。例如可以通过化学合成或者通过诸如遗传工程技术人工操作核酸分子的分离片段，实现这种人工组合。重组体还用于描述这样的核酸分子，这些核酸分子已进行过人工操作，但包含的调控序列和编码区与分离所述核酸的生物中见到的相同。重组蛋白是来源于重组核酸分子的蛋白质。
重组或转化细胞是通过例如分子生物学技术导入了重组核酸分子，诸如酰基辅酶A合酶编码核酸序列的细胞。转化涵盖将核酸分子导入比如细胞的所有技术，包括但不限于用病毒载体进行转染、接合、用质粒载体进行转化，以及通过电穿孔、脂质体转染和微粒枪轰击(particle gun acceleration)来导入裸DNA。
序列同一性：用序列间共有的序列同一性来表示两个核酸序列或者两个氨基酸序列之间的相似性。序列同一性一般以同一性百分比来表示。同一性百分比越高，两个序列越相似。用于本发明，术语“同一性”和“相似性”可以互换。
比对序列以进行比较的方法是本领域公知的。各种程序和比对算法描述于：Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2：482，1981；Needleman&Wunsch，J.MoI.Biol.48：443，1970；Pearson&Lipman，Proc.Natl.Acad.ScL USA 85：2444，1988；Higgins&Sharp，Gene73：237244，1988；Higgins&Sharp，G4-5/OS 5：151-153，1989；Corpet et al，NucleicAcidsResearch 16：10881-10890，1988；Huang et al.，05/058：155-165，1992；以及Pearson et al.，Methods in Molecular Biology 24：307-331，1994中。Altschul etal.，J.MoI.Biol.215：403-410，1990提供了对序列表达方法和同源性计算的详细考虑。
NCBI基础局部序列比对搜索工具(Basic Local Alignment SearchTool，BLASTM；Altschul et al.，J.MoI.Biol.215：403-410，1990)可以从包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)在内的多个来源获取，与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联用。BLASTTM可以由互联网上的NCBI网址接入。如本文所用的，序列同一性通常是用设定为默认参数BLASTTM软件的确定。例如，可以利用blastn(2.0版本)软件，使用默认参数(例如，期望值＝10，矩阵＝BLOSUM62，筛选(filter)＝DUST(Tatusov andLipmann，in preparationas of December 1，1999；和Hancock and Armstrong，Compiit.Appl.Biosci.10：67-70，1994)，缺口存在罚分(gap existence cost)＝11，每残基缺口罚分(per residue gap cost)＝1，以及λ比率＝0.85)。比较两个多肽时，可以使用blastp(2.0版本)软件，默认参数(例如，期望值＝10，筛选＝SEG(Wootton and Federhen，Computers in Chemistry 17：149-163，1993)，矩阵＝BLOSUM62，缺口存在罚分＝11，每残基缺口罚分＝1，λ＝0.85)来确定两个核酸序列之间的序列同一性。
对于核酸序列的比较，采用BLASTTM程序的“Blast 2序列”功能(Blastn)，使用设定为默认参数(打开缺口的罚分(cost to open a gap)[默认值＝11]；延伸缺口罚分[默认值＝1]；期望值(E)[默认值＝10.0]；字长[默认值＝11]；单线描述值(number of one-linedescriptions)(V)[默认值＝100]；显示的比对数(B)[默认值＝100])的默认的BLOSUM62矩阵。当用这个方法进行评价时，与参照序列相似性越高的核酸序列会显示增加的序列同一性百分比，如至少约45％，至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
对于超过约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，采用BLASTTM程序的“Blast 2序列”功能，使用设定为默认参数(例如，缺口存在罚分为11，以及每残基缺口罚分为1)的默认BLOSUM62矩阵。当比对短肽(例如，少于约30个氨基酸)时，比对应当利用Blast 2序列功能，采用设定为默认参数(例如，打开缺口罚分为9，延伸缺口罚分为1)的PAM30矩阵进行。当用这个方法进行评价时，与参照序列相似性越高的蛋白 质会显示增加的同一性百分比，如至少约35％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约98％，或至少约99％的序列同一性。
表面活性剂：能够降低溶解有该物质的液体之表面张力的物质。它们通常由水溶性的头部和烃链或尾部组成。水溶性头部是亲水性的，可以是离子的或者非离子性的。烃链是疏水性的。表面活性剂被用于大量产品，包括去污剂和清洁剂，还可用作纺织品、皮革和纸的辅剂，用于化工工艺、化妆品和药物、食品业以及农业。此外，它们还可以用于辅助提取和分离处于难以接近环境的原油或者作为水乳胶。
根据用途的不同有4类表面活性剂。阴离子表面活性剂具有去污剂样活性，通常用于清洁用途。阳离子表面活性剂包含长链烃，通常被用于处理蛋白和合成的多聚体或者作为织物柔软剂和护发素的成分。两性表面活性剂也包含长链烃，一般用于洗发剂。非离子型表面活性剂通常用于清洁产品。
合酶：合酶是催化合成过程的酶。本文所用该术语包括合酶和合成酶。
转运蛋白：协助一或多个化合物进和/或出生物或者细胞器的运动的蛋白质。在某些实施方案中，生产宿主功能性地表达编码ATP结合盒(ABC)转运蛋白的外源DNA序列，从而所述生产宿主将脂肪酸衍生物运输到培养基中。许多生物中都有ABC转运蛋白，诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、拟南芥、真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophns)(后来重新命名为Ralstonia eutropha)或红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)。ABC转运蛋白的非限制性实例包括CER5、AtMRP5、AmiS2和AtPGP1。在优选实施方案中，ABC转运蛋白是CER5(例如AY734542).
在其他实施方案中，所述转运蛋白是选自下述的外排蛋白：来自大肠杆菌的AcrAB、ToIC、或AcrEF或者来自Thermosynechococcuselongatus BP-I的tll1618、tll1619和tll10139。
在其他实施方案中，转运蛋白是选自黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、秀丽隐杆线虫、结核分枝杆菌或酿酒酵母或任何本领 域公知的任一哺乳动物FATPs的脂肪酸转运蛋白(FATP)。
在允许产生产物的条件下：允许生产宿主产生所需产物的任何发酵条件，所述产物如酰基辅酶A，或脂肪酸衍生物，如脂肪酸、烃、脂肪醇、蜡或者脂肪酯。发酵条件通常包含许多参数。示例性的条件包括但不限于，温度范围、通气水平和培养基成分。上述条件的每一项单独和组合时允许生产宿主生长。
示例性的培养基包括培养液或者凝胶。通常，培养基包括可以被微生物直接代谢的碳源，如葡萄糖、果糖、纤维素等等。此外，可以在培养基中可以使用促进碳源的流通(例如，将淀粉或纤维素解聚成可发酵的糖)及随后的代谢的酶。
为了确定培养条件是否允许产物生成，将生产宿主培养约4、8、12、24、36或者48小时。在培养过程中或者培养后，收集并分析样品以确定培养条件是否允许产物生成。例如，可以检测培养生产宿主的样品或者培养基中的生产宿主是否存在所需产物。当分析产物是否存在时，可以使用诸如但不限于TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS以及以下实例提供的测定。
载体：被导入细胞从而产生转化细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在细胞中复制的核酸序列，诸如复制原点。载体还可以包括一种或多种选择性记基因和本领域已知的其他基因元件。
蜡：蜡由脂肪酯构成。在优选实施方案中，脂肪酯含有由中到长碳链构成的A侧和B侧。
除了脂肪酯以外，蜡可以包含其他成分。例如，蜡也可以包含烃、甾醇酯、脂肪醛、醇、酮、β-二酮、三酰甘油等。
发明详述
许多细胞或微生物可以利用脂肪酸作为能量来源，因此含有代谢脂肪酸产生能量的β-氧化途径。令人惊讶的是，发现超表达具有酰基辅酶A合酶活性(β-氧化途径中第一个发现的酶活性)的肽，和/或弱化β-氧化途径中的其他基因，会在维持细胞或微生物的生存力的同时，提高所产生的酰基辅酶A的量。同样，超表达具有酰基辅酶A合酶活 性的肽，结合超表达形成脂肪酸衍生物的肽，可以提高脂肪酸衍生物的产量。
脂肪酸衍生物可用作生物燃料和特种化学品(specialty chemicals)，后者可以用于制备其他产品，诸如营养补充剂、多聚体、石蜡替代品和个人护理用品。此外，本文公开的教导使得可以产生具有特定分枝点、饱和度以及碳链长度的脂肪酸衍生物。
可以用作生产宿主来产生脂肪酸衍生物的微生物的非限制性实例包括细菌、酵母菌或丝状真菌。其他合适的生产宿主的非限制性实例包括植物、动物或人细胞。
可以由本文所述的生产宿主来产生醇(短链、长链、支链或不饱和的)。这些醇可以直接作为燃料或者可以用于产生脂肪酯。脂肪酯单独或者与本文描述的其他脂肪酸衍生物组合作为燃料。
同样，由本文所述的生产宿主产生的烃可以作为生物燃料。这些烃基燃料可以设计成含有分枝点、限定的饱和度和特定的碳链长度。当单独用作生物燃料或者与其他脂肪酸衍生物组合时，烃可以与添加剂或其他传统燃料(例如，醇、来源于三甘油酯的柴油和基于石油的燃料)组合。
Knothe，Fuel Processing Technology 86：1059-1070，2005中描述了各种脂肪酸酯的十六烷值(CN)、粘度、熔点和燃烧热，该文献通过引用全文并入本文。利用本文提供的教导，可以将生产宿主工程改造为产生Knothe所述的任何脂肪酯。
I.脂肪酸衍生物的制备和提高产量的修饰
可以将用于产生酰基辅酶A和/或脂肪酸衍生物的生产宿主进行重组修饰从而包括超表达肽的核酸序列。例如，可以修饰生产宿主来提高酰基辅酶A的产量，减少脂肪酸衍生物和脂肪酸生物合成途径中的中间体如酰基辅酶A的代谢，或者减少脂肪酸生物合成途径中特定点的反馈抑制。除了修饰本文描述的基因外，也可以将其他细胞资源转为过量产生脂肪酸，例如可以弱化乳酸酯、琥珀酸酯和/或乙酸酯途径，而过超表达乙酰辅酶A羧化酶(acc)。对本文描述的生产宿主的修饰可以通过基因组改变、添加重组表达系统或者其组合来实现。
图2-图6展示了所涉及的脂肪酸生物合成途径。以下A-G部分描述了这些途径中的步骤。途径中的不同步骤由不同酶催化。每个步骤都是超表达基因产生更多酶，从而驱使产生更多脂肪酸和脂肪酸衍生物的潜在位点。该途径所需的编码酶的基因也可以重组加入缺乏该基因的生产宿主。最后，为了提高目的产品的产量，可以弱化或阻断会与产生脂肪酸和脂肪酸衍生物的途径竞争的步骤。
A.乙酰辅酶A-丙二酰辅酶A到酰基-ACP
脂肪酸合酶(FAS)是一组催化酰基链起始和延伸的肽(Marrakchi etal.，BiochemicalSociety，30：1050-1055，2002)。酰基载体蛋白(ACP)与FAS途径中的酶一起控制所产生的脂肪酸的长度、饱和度和分支情况。该途径中的步骤由脂肪酸生物合成(fab)和乙酰辅酶A羧化酶(acc)基因家族的酶催化。根据期望的产物，可以弱化或者超表达这些基因中的一或多个(有关每个酶的酶活性的详细描述及其酶学分类号，参见图1)。
1.脂肪酸生物合成途径：乙酰辅酶A或丙二酰辅酶A到酰基ACP
生产宿主中的脂肪酸生物合成途径使用前体乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A(图1)。该途径中的步骤由脂肪酸生物合成(fab)和乙酰辅酶A羧化酶(acc)基因家族的酶催化。Heathet al.，Prog.Lipid Res.40(6)：467-97(2001)中描述了这个途径，在此将该文献通过引用全文并入。
乙酰辅酶A被乙酰辅酶A羧化酶(Acc，由四个分开的基因accABCD编码的多亚基酶)羧化，形成丙二酰辅酶A。丙二酸基团由丙二酸-辅酶A：ACP转酰基酶(FabD)转移给ACP形成丙二酰ACP。然后发生缩合反应，丙二酰ACP与乙酰辅酶A结合形成β-酮脂酰ACP。β-酮脂酰ACP合酶III(FabH)启动FAS循环，而β-酮脂酰ACP合酶I(FabB)和β-酮脂酰ACP合酶II(FabF)参与随后的循环。
接下来重复这一轮步骤，直到制成合适长度的饱和脂肪酸。首先β-酮脂酰ACP被NADPH还原形成β-羟酰ACP。这个步骤由β-酮脂酰ACP还原酶(FabG)催化。然后β-羟酰ACP脱水形成反式-2-烯酰-ACP。β-羟酰ACP脱水酶/异构酶(FabA)或β-羟酰ACP脱水酶(FabZ)催化这个步骤。NADPH依赖性反式-2-烯酰-ACP还原酶I、II或III(分别为 FabI、FabK和FabL)还原反式-2-烯酰-ACP，形成酰基ACP。β-酮脂酰-ACP合酶I或β-酮脂酰-ACP合酶II(分别为FabB和FabF)催化的丙二酰-ACP和酰基-ACP的缩合起始随后的循环。
2.修饰脂肪酸生物合成途径以提高酰基ACP产量
可以对生产宿主生物进行工程改造以过量产生乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。这类生产宿主生物包括植物、动物或人细胞。微生物，如细菌、酵母菌或丝状真菌，可以用作生产宿主。可以作为生产宿主的微生物的非限制性实例包括大肠杆菌、酿酒酵母、解脂假丝酵母、大肠杆菌、节杆菌AK 19、粘红酵母、不动杆菌(Acinetobacter sp.)菌株M-1、解脂假丝酵母和其他产油微生物。可以对生产宿主组合或者单独地进行几种不同的修饰以实现乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A/脂肪酸和脂肪酸衍生物产量的提高。
例如，为了提高乙酰辅酶A产量，可以在生产宿主中表达以下基因中的一或多个：pdh、panK、aceEF(编码丙酮酸盐和酮戊二酸脱氢酶复合体中的E1p脱氢酶成分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶成分)、fabH、fabD、fabG、acpP、fabF。在其他实例中，可以在生产宿主中表达其他编码脂肪酰辅酶A还原酶和醛脱羰基酶的DNA序列。本领域公知的是，可以构建含有一或多个以上提及的基因的质粒，其中，这些基因受到组成型或者否则是可调控的启动子的控制。这些基因的示例性GenBank登录号是pdh(BAB34380，AAC73227，AAC73226)、panK(又称为coaA，AAC76952)、aceEF(AAC73227，AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、acpP(AAC74178)、fabF(AAC74179)。
此外，可以通过用条件复制的或者不复制的质粒转化，所述质粒含有相应基因的无效突变或者缺失突变，或者通过取代启动子或增强子序列，可以降低或者敲除工程微生物中fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA和/或ackB的表达水平。这些基因的示例性GenBank登录号是fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、ldhA(AAC74462)、pflb(AAC73989)、adhE(AAC74323)、pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)和ackB(BAB81430)。所得到的 工程生产宿主在合适的环境下生长时，乙酰辅酶A产量水平增加。
而且，通过用全新合成的质粒中包括的accABCD(例如登录号AAC73296，EC6.4.1.2)工程改造生产宿主，可以影响丙二酰辅酶A的过量产生。在全新合成的质粒中再包含编码酯酶的DNA序列(例如，登录号CAA89087、CAA98876)可以实现脂肪酸的过量产生。
结果，在某些实例中，乙酰辅酶A羧化酶被超表达使得其胞内浓度相对天然表达水平提高至少约2倍，优选至少约5倍，或者更优选至少约10倍。
此外，可以利用plsB(例如，登录号AAC77011)D311E突变提高可用的酰基辅酶A的量。
此外，可以在生产宿主中包含sfa基因(FabA的抑制基因，例如登录号AAN79592)的过超达以提高单不饱和脂肪酸的产量(Rock et al.，J.Bacteriology 178：5382-5387，1996)。
B.酰基-ACP到脂肪酸
1.脂肪酸生物合成途径：酰基ACP到脂肪酸
如上文所述，乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A经过几个步骤的加工形成酰基ACP链。酶sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶(PlsB)催化酰基基团从酰基ACP或酰基辅酶A到甘油-3-磷酸的sn-1位点的转移。因此，PlsB是磷脂合成即脂肪酸途径的一部分中的关键调节酶。抑制PlsB会导致长链酰基ACP水平增加，这个反馈将抑制该途径中的早期步骤(例如，accABCD、fabH和fabI)。通过例如硫酯酶超表达将这个调控解偶联，使得脂肪酸产量增加。tes和fat基因家族表达硫酯酶。FabI在体外也被长链酰基辅酶A抑制。
2.修饰脂肪酸生物合成途径产生需要的脂肪酸
为了工程改造产生均质脂肪酸衍生物群体的生产宿主，可以使一或多个内源基因弱化或功能性缺失，结果，可以表达一或多种硫酯酶。例如，可以通过弱化使用C18:1-ACP的硫酯酶C18(例如，登录号AAC73596和P0ADA1)并表达使用C10-ACP的硫酯酶C10(例如，登录号Q39513)来产生C10脂肪酸衍生物。这样产生相对均质的、碳链长度为10的脂肪酸衍生物群体。在另一个实例中，可以通过弱化产生非 C14脂肪酸的内源硫酯酶并表达登录号Q39473的硫酯酶(其使用C14-ACP)来产生C14脂肪酸衍生物。仍然在另一个实例中，通过表达使用C12-ACP的硫酯酶(例如登录号Q41635)并弱化产生非C12脂肪酸的硫酯酶来产生C12脂肪酸衍生物。利用本领域已知的方法，例如在细胞裂解后利用放射性前体、HPLC和GC-MS，可以验证乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和脂肪酸的过量产生。表1列出了可用于请求保护的方法和生产宿主的硫酯酶的非限制性实例。
表1：硫酯酶
登录号 生物来源 基因 产生的优选产物
AAC73596 大肠杆菌 不含前导序列的tesA C18:1
AAC73555 大肠杆菌 tesB
Q41635，AAA34215 加利福尼亚桂树(Umbellularia California) fatB C12:0
Q39513；AAC49269 萼距花 fatB2 C8:0-C10:0
AAC49269；AAC72881 萼距花 fatB3 C14:0-C16:0
Q39473，AAC49151 樟树(Cinnamonum camphorum) fatB C14:0
CAA85388 拟南芥 fatB[M141T]* C16:1
NP 189147；NP 193041 拟南芥 fatA C18:1
CAC39106 慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhiizobium japonicum) fatA C18:1
AAC72883 萼距花 fatA C18:1
AAL79361 向日葵(Helianthus annus) fatA
*Mayer et al.，BMC Plant Biology 7：1-11，2007.
C.脂肪酸到酰基辅酶A
1.脂肪酸转化为酰基辅酶A
酰基辅酶A合酶(ACS)通过一个两步机制将游离脂肪酸酯化成酰 基辅酶A。游离脂肪酸首先借助ATP焦磷酸解作用转化成酰基AMP中间体(腺苷酸)。然后腺苷酸中被活化的羰基碳与辅酶A的巯基偶合，释放出AMP和酰基辅酶A终产物。参见Shockey et al，Plant.Physiol.129：1710-1722，2002。
大肠杆菌ACS酶FadD和脂肪酸转运蛋白FadL是脂肪酸摄取系统的关键成分。FadL介导脂肪酸向细菌细胞内的运输，FadD介导酰基辅酶A酯的形成。当没有其他碳源可以利用时，细菌摄取外源脂肪酸，将其转化为酰基辅酶A酯，该物质与转录因子FadR结合，抑制fad基因的表达，这类基因编码负责脂肪酸转运(FabL)、激活(FadD)和β氧化(FadA、FadB、FadE和FadH)的蛋白。当有替代的碳源可以利用时，细菌合成脂肪酸作为酰基ACP，用于磷脂的合成，但它们不是β氧化的底物。因此，酰基辅酶A和酰基ACP均为脂肪酸的独立来源，会产生不同的终产物。参见Caviglia et al.，J.Biol.Chem.279(12)：1163-1169，2004。
2.提高脂肪酸转化为酰基辅酶A的修饰
可以利用已知的肽工程改造生产宿主来产生各种长度的可以转化为酰基辅酶A的脂肪酸。一种制备脂肪酸的方法涉及增加一种或者多种酰基辅酶A合酶肽(EC6.2.1.-)的表达或者表达它们更具活性的形式。
表2列出了能够被表达从而产生酰基辅酶A和脂肪酸衍生物的酰基辅酶A合酶。这些酰基辅酶A合酶经检验能够优化使用脂肪酰辅酶A作为底物的任何途径。利用生物信息学和合成基因，在生产菌株中表达了异源fadD基因，并评价了它们产生生物柴油和可能的生物原油的能力。
表2：酰基辅酶A合酶
基因名称/基因座 来源 NCBI ID 与大肠杆菌FadD的同一性％ 与大肠杆菌FadD的同一性％
fadD 大肠杆菌 NP_416319 - -
fadK 大肠杆菌 YP_416216 45 27
fadD 不动杆菌(Acinetobacter sp.)ADP1 YP_045024 51 70
fadD 流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)RdKW20 NP_438551 64 78
BH3103 嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)C-125 NP_243969 40 58
yhfL 枯草芽孢杆菌 NP_388908 39 57
Pfl-4354 荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)Pfo-1 YP_350082 52 71
EAV15023 睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosterone)KF-1 ZP_01520072 55 72
fadD1 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) NP_251989 54 72
fadD2 铜绿假单胞菌PAO1 NP_251990 55 72
fadD 埃特里根瘤菌(Rhizobium etli) CFN42 YP_533919 55 72
RPC 4074 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)BisB18 YP_533919 56 72
fadD1 茄科雷尔氏菌(Rasltonia Solanacearum)GMI 1000 NP_520978 56 72
fadDD35 结核分枝杆菌H37Rv NP_217021 28 46
fadDD22 结核分枝杆菌H37Rv NP_217464 23 42
PRK0059 嗜麦芽窄食单胞菌R551-3 ZP_01644857 59 75
根据它们与大肠杆菌FadD的相似性，选择以下同源基因进行合成和评价：
来自结核分枝杆菌H37Rv的fadDD35[NP_217021]，
来自枯草芽孢杆菌的yhfL[NP_388908]、来自铜绿假单胞菌PAO1的fadD1[NP_251989]，
来自酿酒酵母的fadD同源物Faa3p[NP_012257]。
可以用于产生酰基辅酶A以及脂肪酸衍生物的其他来自真核生物的脂肪酸酰基辅酶A合酶包括Shockey et al.，Plant.Physiol.129：1710-1722，2002(拟南芥)、Cavigliaet al.，J.Biol.Chem.279：1163-1169，2004(鼠)以及Knoll et al.，J.Biol.Chem.269(23)：16348-56，1994(酵母)中描述的那些。编码这些合酶的基因序列是本领域已知的。参见例如Johnson et al.，J.Biol.Chem.269：18037-18046，1994；Shockey et al.，Plant.Physiol.129：1710-1722，2002；Black et al.，J.Biol Chem.267：25513-25520，1992。这些真核酰基辅酶A合酶尽管与大肠杆菌fadD序列没有高同源性，但在fadD敲除的大肠杆菌中可以补充FadD活性。
D.酰基辅酶A到脂肪醇
1.酰基辅酶A到脂肪醇的转化
酰基辅酶A被NADH依赖性酰基辅酶A还原酶(例如，Acr1)还原为脂肪醛。然后脂肪醛被NADPH依赖性醇脱氢酶(例如，YqhD)还原为脂肪醇。可选地，脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR)催化酰基辅酶A还原为脂肪醇和CoASH。FAR使用NADH或NADPH作为这个四电子还原反应中的辅助因子。尽管产醇FAR反应经由醛中间体进行，但并不释放游离醛。因此，生醇FAR与执行酰基辅酶A的二电子反应并产生游离脂肪醛作为产物的那些酶完全不同(参见Cheng andRussell，J.Biol.Chem.，279(36)：37789-37797，2004；Metz et al.，PlantPhysiol.，122：635-644，2000)。
2.提高酰基辅酶A转化为脂肪醇的修饰
可以利用已知的多肽工程改造生产宿主以便由酰基辅酶A产生脂肪醇。一种制备脂肪醇的方法涉及增加脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(由基因如来自FAR的acr1，EC1.2.1.50/1.1.1编码)或者酰基辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)和醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)的表达或者表达它们更具活性的形式。图1提供了示例性的GenBank登录号。
可以将脂肪醇描述为烃基表面活性剂。为了产生表面活性剂，修饰生产宿主使得它能由可再生碳源产生表面活性剂。这类生产宿主包括第一外源DNA序列和第二外源DNA序列，所述第一外源DNA序列编码能够将脂肪酸转化为脂肪醛的蛋白，所述第二外源DNA序列编码能够将脂肪醛转化为醇的蛋白。在某些实例中，第一外源DNA序列编码脂肪酸还原酶。在一个实施方案中，第二外源DNA序列编码哺乳动物微粒体的醛还原酶或者长链醛脱氢酶。在另一个实例中，第一和第二外源DNA序列来自于节杆菌(Arthrobacter)AK 19、粘红酵母、不动杆菌(Acinetobacter sp.)菌株M-1或者解脂假丝酵母。在一个实施方案中，第一和第二异源DNA序列都来自于不动杆菌(Acinetobacter sp.)菌株M-1株或者解脂假丝酵母的多酶复合物。
编码将脂肪酸转化为长链醇且，可用于表面活性剂制备的蛋白的异源DNA序列的其他来源包括但不限于，高山被孢霉(ATCC 32222)、弯曲隐球菌(Crytococcus curvatus，又称为Apiotricum curvatum)、Alcanivorax jadensis(T9T＝DSM 12718＝ATCC 700854)、不动杆菌(Acinetobacter sp.)HO 1-N(ATCC 14987)和混浊红球菌(PD630DSMZ44193)。
在一个实例中，脂肪酸衍生物是饱和的或者不饱和的表面活性剂产物，其碳链长度为约6个到约36个碳原子、约8个到约30个碳原子、约10到约26个碳原子、约12到约20个碳原子或者约12到约16个碳原子。在另一个实例中，表面活性剂产物的碳链长度为约10到约18个碳原子或者约12到约14个碳原子。
用于产生表面活性剂的合适宿主可以是真核或者原核微生物。示例性的宿主包括已被工程改造表达乙酰辅酶A羧化酶的节杆菌(Arthrobacter)AK 19、粘红酵母、不动杆菌(Acinetobacter sp.)菌株M-1、拟南芥、解脂假丝酵母，酿酒酵母和大肠杆菌。也可以使用先天具有合成高水平的脂和油形式的表面活性剂前体的宿主，如经工程改造表达乙酰辅酶A羧化酶的混浊红球菌、节杆菌AK 19、粘红酵母和大肠杆菌，以及其他油质细菌、酵母和真菌。
E.脂肪醇到脂肪酯
可以利用已知的多肽工程改造生产宿主以产生各种长度的脂肪酯。一种制备脂肪酯的方法包括增加一种或者多种醇O-乙酰基转移酶肽(EC 2.3.1.84)的表达或者表达其更具活性的形式。这些肽通过将乙酰辅酶A和醇转化为辅酶A和酯催化醇的乙酰化。在某些实例中，醇 O-乙酰基转移酶肽可以与选定的硫酯酶肽、FAS肽和脂肪醇形成肽联合表达，从而可以控制碳链长度、饱和度和分枝度。在某些情况下，可以共表达bkd操纵子以便产生支链脂肪酸前体。
本文使用的醇O-乙酰基转移酶肽包括属于酶分类号EC 2.3.1.84的肽，以及能够催化乙酰辅酶A和醇转化形成辅酶A和酯的任意其他肽。此外，本领域普通技术人员理解醇O-乙酰基转移酶肽能催化其他反应。
例如，某些醇O-乙酰基转移酶肽除了脂肪醇或者乙酰辅酶A硫酯外，还会接受其他底物，诸如其他醇和其他酰基辅酶A硫酯。因此这类非特异性或者特异性不同的醇O-乙酰基转移酶肽也包括在内。醇O-乙酰基转移酶肽的序列是公开提供的。图1提供了示例性的GenBank登录号。用于表征具体醇O-乙酰基转移酶肽活性的测定是本领域公知的。还可以对O-乙酰基转移酶进行工程改造，使它们具有新的活性以及对供体酰基基团或者受体醇部分的新的特异性。可以通过本领域记载的合理的进化方法产生工程酶。
F.酰基辅酶A到脂肪酯
1.脂肪酯的产生
脂肪酯由酰基辅酶A：脂肪醇酰基转移酶(例如酯合酶)合成，该酶将长链脂肪醇经由酯键与脂酰辅酶A连接。已知酯合酶及其编码基因可以来自希蒙得木植物和细菌不动杆菌菌株ADP1(以前称为醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)ADP1)。细菌酯合酶是双功能酶，显示出酯合酶活性以及由二酰甘油底物和脂酰辅酶A形成三酰甘油的能力(酰基辅酶A：二甘油酰基转移酶(DGAT)活性)。基因wax/dgat编码酯合酶和DGAT。参见Chenget al.，J.Biol.Chem.279(36)：37798-37807，2004；Kalscheuer and Steinbuchel，J.Biol.Chem.278：8075-8082，2003。酯合酶还可以用于产生本文所述的某些能够作为燃料如生物柴油的脂肪酯。
2.产生脂肪酯的修饰
可以利用已知的多肽，对由酰基辅酶A和醇产生包括蜡在内的脂肪酯进行工程改造。一种制备脂肪酯的方法包括提高一或多种酯合酶 (EC2.3.1.20，2.3.1.75)的表达，或者是表达其更具活性的形式。公众可获得酯合酶肽序列。图1中提供了示例性的GenBank登录号。美国专利第7118896号中提供了鉴定酯合酶活性的方法，在此将该专利通过引用全文并入。
在具体实例中，如果需要的产物是酯基生物燃料，则修饰生产宿主从而其由可再生能源产生酯。这类生产宿主包括编码酯合酶的外源DNA序列，其被表达即赋予所述生产宿主由可再生能源合成饱和的、不饱和的或者支链脂肪酯的能力。在某些实施方案中，生物还可以表达编码以下示例性蛋白的DNA序列：脂肪酸延伸酶、酰基辅酶A还原酶、酰基转移酶、酯合酶、脂酰转移酶、二酰甘油酰基转移酶、酰基辅酶A蜡醇酰基转移酶。在可选的实施方案中，所述生物表达编码双功能酯合酶/酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶的DNA序列。例如，所述双功能酯合酶/酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶可以选自来自西蒙得木、不动杆菌菌株ADP1(以前称为醋酸钙不动杆菌ADP1)、博克岛食烷菌、铜绿假单胞菌、Fundibacterjadensis、拟南芥或真养产碱杆菌(后重新命名为Ralstonia eutropha)的多酶复合体。在一个实施方案中，脂肪酸延伸酶、酰基辅酶A还原酶或者蜡合酶来自真养产碱杆菌(后重新命名为Ralstonia eutropha)或其他在文献中已知能产生酯诸如蜡或脂肪酯的生物的多酶复合体。
编码可用于产生脂肪酯的酯合成蛋白的异源DNA序列的另外来源包括，但不限于高山被孢霉(例如，ATCC 32222)、弯曲隐球菌(又称为Apiotricum curvatum)、Alcanivoraxjadensis(例如T9T＝DSM 12718＝ATCC 700854)、不动杆菌菌株HO1-N(例如ATCC 14987)和混浊红球菌(例如PD630，DSMZ 44193)。
用于产生脂肪酯的有用生产宿主可以是真核或者原核微生物。产生脂肪酯的生产宿主的非限制性实例包括酿酒酵母、解脂假丝酵母、大肠杆菌、节杆菌AK 19、粘红酵母、不动杆菌菌株M-1、解脂假丝酵母和其他产油微生物。
在一个实例中，使用来自不动杆菌ADP1基因座AAO 17391的酯合酶(在Kalscheuer和Steinbuchel，J.Biol.Chem.278：8075-8082，2003 中有描述，在此将该文献通过引用并入)。在另一个实例中，使用来自希蒙得木基因座AAD38041的酯合酶。
任选地，使用酯输出蛋白(exporter)，如FATP家族的成员，可以用来协助酯释放入胞外环境。可以使用的酯输出蛋白的非限制性实例是来自黑腹果蝇基因座NP_524723的脂肪酸(长链)转运蛋白CG7400-PA同种型A。
G.酰基ACP、酰基辅酶A到烃
1.来自特定微生物的烃
已知多种微生物产生烃，如烷、烯烃和类异戊二烯。这些烃中许多来源于脂肪酸生物合成。通过控制天然生产宿主中与脂肪酸生物合成相关的基因，可以控制这些烃的产生。
例如，在布朗葡萄藻中，经由脂肪醛的脱羰作用可以实现烃的生物合成。脂肪醛由脂酰辅酶A还原酶还原脂酰硫酯产生。因此，通过工程改造布朗葡萄藻表达特定基因，如控制脂肪酸的链长的硫酯酶，所述脂肪酸进入烷生物合成途径，可以控制烷终产物的结构。在布朗葡萄藻中表达产生支链脂肪酸生物合成的酶将产生支链烷。导入影响脂肪酸去饱和的基因将产生烯烃。这些基因的组合还可以进一步控制生成的烃的最终结构。
为了产生更高水平的天然或者工程改造的烃，可以表达、超表达或者弱化参与脂肪酸及其前体生物合成或者降解为其他产物的基因。这些方法中的每一种都可用于在弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)M1和其他通过脂肪醇的还原产生烷的弗尼斯弧菌菌株中产生烷。除了弗尼斯弧菌外，可以使用其他利用脂肪酸途径的产烷生物。
这些方法中的每一种还可用于由藤黄微球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、Jeogalicoccussp.(ATCC8456)和相关微生物的许多菌株产生烯烃。这些微生物产生来源于脂肪酸前体头对头缩合的长链烯烃。利用本文描述的方法控制脂肪酸前体的结构和水平将形成不同链长、分支和饱和水平的烯烃。
还可以利用蓝细菌作为生产宿主产生脂肪酸衍生物，如脂肪醇、脂肪酸酯和烃。例如集胞蓝菌PCC6803和细长聚球菌PCC7942可以 作为生产宿主，并且可以利用常规的分子生物学技术进行工程改造(Thiel，Genetic analysis of cyanobacteria，in 1 THEMOLECULAR BIOLOGYOF CYANOBACTERIA，ADVANCES IN PHOTOSYNTHESIS AND RESPIRATION581-611(Kluwer AcademicPublishers 1994)；Koksharova&Wolk，Appl.Microbiol.Biotechnol.，58：123-137，2002)。可以在这些生物中容易地鉴定分离到脂肪酸生物合成基因(参见表18)。
并且，许多蓝细菌是烃如十七烷的天然生产者，因此含有可以被解除调控和超表达的烃生物合成基因，结合对其脂肪酸生物合成基因的操做，从而提高烃产量。
与其他细菌不同，某些蓝细菌(例如，集胞蓝菌PCC6803)的酯中含有多不饱和的脂肪酸(Murata，Plant cell Physiol.，33：933-941，1992)，因此具有产生多不饱和的脂肪酸衍生物的固有能力。最重要的是，蓝细菌是光合生物，通过采集阳光和固定二氧化碳来合成其全部细胞碳。所以，蓝细菌中产生的脂肪酸衍生物直接来源于CO2。
2.来自伯醇还原的烃
还可以利用还原伯醇的进化氧化还原酶产生烃。已知脂肪伯醇可用于在微生物如弗尼斯弧菌M1(Park，J.Bacteriol.，187：1426-1429，2005)中产生烷。可以用于由脂肪醇产生烃的氧化还原酶的一个实例是NAD(P)H依赖性氧化还原酶。合成的NAD(P)H依赖性氧化还原酶可以利用进化工程产生，并在生产宿主中表达以产生脂肪酸衍生物。
使脂肪醇还原酶“进化”从而具有所需活性的过程是公知的(Kolkman andStemmer，Nat Biotechnol.19：423-8，2001；Ness et al.，AdvProtein Chem.55：261-92，2000；Minshull and Stemmer，Curr Opin ChemBiol.3：284-90，1999；Huisman and Gray，Curr Opin Biotechnol.Aug；13：352-8，2002；以及美国专利公开号2006/0195947)。
通过标准方法，如易错PCR、位点特异性随机诱变、位点特异性饱和诱变或者定点特异性诱变，产生NAD(P)H依赖性氧化还原酶文库。此外，还可以通过“改组(shuffling)”天然存在的NAD(P)H依赖性氧化还原酶编码序列产生文库。文库在合适的宿主诸如大肠杆菌中表达。然后针对可以催化脂肪醇的还原的氧化还原酶的表达，分析表达 氧化还原酶文库不同成员的各个菌落。
例如，可以通过针对全细胞生物转化、细胞提取物或渗透化的细胞来分析每个细胞。也可以对从细胞中纯化的酶进行分析。通过分光光度或者荧光监测NAD(P)H的脂肪醇依赖性氧化来鉴定脂肪醇还原酶。通过GC/MS、TLC或者其他方法监测烷的产生。
采用这种方式鉴定的氧化还原酶用于产生烷、烯烃和相关的支链径。这可以在体外或者体内实现。后者通过在诸如本文描述的那些产生脂肪醇的生物体中表达进化的脂肪醇还原酶基因来实现。脂肪醇作为能产生烷的醇还原酶的底物。其他氧化还原酶也可以经工程改造从而能催化该反应，如那些使用分子氢、谷胱甘肽、FADH或者其他还原辅酶的氧化还原酶。
H.脂肪酸衍生物的释放一转运蛋白
转运蛋白将脂肪酸衍生物运出生产宿主。许多转运和外排蛋白能够分泌多种化合物，并且天然能够被修饰成对特定的脂肪酸衍生物种类具有选择性。合适的转运蛋白的非限制性实例是ATP结合盒(ATP-Binding Cassette，ABC)转运蛋白、外排蛋白以及脂肪酸转运蛋白(fatty acid transporter proteins，FATP)。合适的转运蛋白的其他非限制性实例包括来自生物如秀丽隐杆线虫、拟南芥、真养产碱杆菌、红平红球菌的ABC转运蛋白。可以使用的示例性ABC转运蛋白是CER5、AtMRP5、AmiS2或者AtPGP1。在优选的实施方案中，ABC转运蛋白是CER5(例如AY734542)。还可参见表1中鉴定的转运蛋白。可以将含有表达合适的转运蛋白的基因的载体插入蛋白质生产宿主来提高脂肪酸衍生物的释放。
还可以根据其内在的释放脂肪酸衍生物的能力来选择生产宿主。产物产生和释放到发酵液中的效率可以表达为胞内产物与胞外产物的比率。在某些实例中，所述比率可以是约5∶1、4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4或1∶5。
II.选择脂肪酸衍生物的碳链特性
可以按照需要产生具有特定分支点、饱和度、碳链长度和酯特性的脂肪酸衍生物。可以选择天然产生特定衍生物的微生物。可选地， 可以将表达能够产生特定脂肪酸衍生物的酶的基因插入生产宿主微生物。图1提供了可以单独或组合用于制备具有所需特性的脂肪酸衍生物的酶的非限制性实例。
在某些实例中，可以将来自不同物种或工程变体的外源FAS基因的表达导入生产宿主以生物合成脂肪酸，这些脂肪酸与天然生产宿主的脂肪酸在结构(长度、分支情况，不饱和度等)上不同。还可以选择或者工程改造这些异源基因产物使它们不受生产宿主细胞内的天然调控机制影响，从而能够控制所需商品产物的产生。例如，可以在生产宿主中表达来自枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、链霉菌(Stretomyces spp.)、雷尔氏菌(Ralstonia)、红球菌(Rhodococcus)、棒状杆菌(Corynebacteria)、短杆菌(Brevibacteria)、分枝杆菌(Mycobacteria)、产油酵母等的FAS酶。这类外源酶的表达能够改变所产生的脂肪酸的结构。
当生产宿主经工程改造产生具有特异不饱和程度、分支程度或者碳链长度的脂肪酸时，所得到的工程脂肪酸可以用于产生脂肪酸衍生物。由这类生产宿主产生的脂肪酸衍生物会表现出工程脂肪酸的特性。
例如，可以将生产宿主工程改造来产生支链短链脂肪酸，然后这些短链脂肪酸又可以被生产宿主用来产生支链短链脂肪醇。同样，可以通过将生产宿主工程改造来产生具有限定分支水平、不饱和度和/或碳链长度的脂肪酸，来制备烃，从而产生均质的烃群体。例如，当需要不饱和醇、脂肪酯或者烃时，可以工程改造生产宿主，产生低饱和水平的脂肪酸，另外可以对宿主进行修饰，使之表达其他去饱和酶，从而减少饱和产物的产量。
A.支链和环状部分
1.工程支链和环状脂肪酸衍生物
脂肪酸是产生脂肪酸衍生物的关键中间体。通过利用支链或者环状脂肪酸来制备脂肪酸衍生物，可以制备含有分支点、环状部分及其组合的脂肪酸衍生物。
例如大肠杆菌天然产生直链脂肪酸(sFAs)。为了工程改造大肠杆菌产生支链脂肪酸(brFAs)，可以将几个提供支链前体的基因(例如，bkd操纵子)导入生产宿主并表达，以便允许由支链前体(例如fabH)起始脂 肪酸的生物合成。可以表达或超表达bkd、ilv、icm和fab基因家族来产生支链脂肪酸衍生物。同样，为了产生环状脂肪酸，可以将能提供环状前体的基因导入生产宿主并表达，以允许由环状前体起始脂肪酸的生物合成。可以表达或超表达ans、chc和plm基因家族来产生环状脂肪酸。图1列举了可以用于所述方法和生产宿主的基因家族中的基因的非限制性实例。
此外，可以工程改造生产宿主使之表达编码用于延伸brFAs(ACP、FabF等)的蛋白质的基因，和/或缺失或弱化通常导致sFAs的相应大肠杆菌基因。对于这一点，将与导入的基因竞争的内源基因(例如fabH、fabF)缺失或弱化。
支链酰基辅酶A(例如，2-甲基-丁酰辅酶A、异戊酰辅酶A、异丁酰辅酶A等)是brFA的前体。在大多数含有brFA的微生物中，brFA是由支链氨基酸经过两步合成的(例如，异亮氨酸、亮氨酸和颉氨酸)(Kadena，Microbiol.Rev.55：288，1991)。可以工程改造生产宿主使之表达或超表达参与这两个步骤的一或多种酶来产生brFAs或者超表达brFAs。例如，生产宿主可以有能够完成产生brFA的一个步骤的内源酶，因此只需要重组导入编码参与第二个步骤的酶的基因。
2.支链脂肪酸和支链脂肪酸衍生物的形成
形成brFAs的第一个步骤是由支链氨基酸氨基转移酶产生相应的α-酮酸。生产宿主可以内源性地包括编码这类酶的基因或者可以重组导入这类基因。例如大肠杆菌内源性地表达此类酶IlvE(EC2.6.1.42；GenBank登录号YP_026247)。在某些生产宿主中，可以不表达异源支链氨基酸氨基转移酶。但是大肠杆菌IlvE或者任何其他支链氨基酸氨基转移酶(例如来自乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的IlvE(GenBank登录号AAF34406)、来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)的IlvE(GenBank登录号NP_745648)或者来自天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)的IlvE(GenBank登录号NP_629657))如果不是内源的，可以导入。如果氨基转移酶反应在所选生产宿主生物的brFA生物合成中是限速的，则可以超表达氨基转移酶。
第二个步骤是α-酮酸氧化去羰基成为相应的支链酰基辅酶A。该 反应由支链α-酮酸脱氢酶复合体(bkd；EC 1.2.4.4.)(Denoya et al.，J.Bacteriol.177：3504，1995)催化，所述复合体由E1α/β(脱羧酶)、E2(二氢硫辛酸转酰基酶)和E3(二氢硫辛酸脱氢酶)亚基构成。这些支链α-酮酸脱氢酶复合体与丙酮酸和α-酮戊二酸脱氢酶复合体类似。每种具有brFAs和/或能在支链氨基酸生长的微生物都可以作为来源，分离用于在生产宿主如大肠杆菌中表达的bkd基因。而且，大肠杆菌有E3成分，作为其丙酮酸脱氢酶复合体(lpd，EC1.8.1.4，GenBank登录号NP_414658)的一部分，因此仅表达E1α/β和E2bkd基因就够了。表3列举了来自几种微生物的bkd基因的非限制性实例，这些基因可以重组导入生产宿主并表达，从而提供支链酰基辅酶A前体。具有这类bkd基因的微生物也可以作为生产宿主。
表3：来自所选微生物的bkd基因
生物 基因 GenBank登录号
天蓝色链霉菌 bkdA1(E1α)bkdB1(E1β)bkdC1(E2) NP_628006NP_628005NP_638004
天蓝色链霉菌 bkdA2(E1α)bkdB2(E1β)bkdC2(E2) NP_733618NP_628019NP_628018
阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis) bkdA(E1a)bkdB(E1b)bkdC(E2) BAC72074BAC72075BAC72076
阿维链霉菌 bkdF(E1α)bkdG(E1β)bkdH(E2) BAC72088BAC72089BAC72090
枯草芽孢杆菌 bkdAA(E1α)bkdAB(E1β)bkdB(E2) NP_390288NP_390288NP_390288
恶臭假单胞菌 bkdA1(E1β)bkdA2(E1β)bkdC(E2) AAA65614AAA65615AAA65617
在另一个实例中，可以通过共表达巴豆酰辅酶A还原酶(Ccr，EC1.6.5.5，1.1.1.1)和异丁酰辅酶A变位酶(大亚基IcmA、EC5.4.99.2； 小亚基IcmB，EC5.4.99.2)在生产宿主，例如大肠杆菌中制备异丁酰辅酶A(Han and Reynolds，J.Bacteriol.179：5157，1997)。巴豆酰辅酶A是大肠杆菌和其他微生物中脂肪酸生物合成的中间体。表4给出了所选微生物中ccr和icm基因的非限制性实例。
表4：来自所选微生物的ccr和icm基因
生物 基因 GenBank登录号
天蓝色链霉菌 CcricmAicmB NP_630556NP_629554NP_630904
肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis) ccricmAicmB AAD53915AAC08713AJ246005
除了bkd基因的表达，brFA生物合成的起始利用β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶III(FabH，EC2.3.1.41)，该酶对支链酰基辅酶A有特异性(Li et al.，J.Bacteriol.187：3795-3799，2005)。表5列出了这类FabH酶的非限制性实例。可以在生产宿主中表达参与任何含有brFA的微生物中的脂肪酸生物合成的fabH基因。来自不天然产生brFA的生产宿主的Bkd和FabH酶可能不支持brFA的产生，因此可以重组表达Bkd和FabH。可以将含有bkd和fabH基因的载体插入此类生产宿主。同样，Bkd和FabH的内源产生水平可能不足以产生brFA，因此可以超表达它们。另外，可以表达或超表达脂肪酸生物合成途径的其他成分，如酰基载体蛋白(acyl carrier proteins，ACPs)和β-酮脂酰-酰基载体蛋白合酶II(fabF，EC 2.3.1.41)(表5列出了候选的酶的非限制性实例)。除了表达这些基因外，还可以将生产宿主中内源脂肪酸生物合成途径的某些基因弱化。可以将这样一些基因弱化从而提高brFA的产量，这些基因编码的酶会与产生brFA的该途径的酶竞争底物。例如，在大肠杆菌中最可能干扰brFA生物合成的是fabH(GenBank登录号NP_415609)和/或fabF基因(GenBank登录号NP_415613)。
表5：来自具有brFAs的所选微生物的FabH、ACP和fabF基因
生物 基因 GenBank登录号
天蓝色链霉菌 fabH1ACPfabF NP_626634NP_626635NP_626636
阿维链霉菌 fabH3fabC3(ACP)fabF NP_823466NP_823467NP_823468
枯草芽孢杆菌 fabH_AfabH_BACPfabF NP_389015NP_388898NP_389474NP_389016
嗜麦芽窄食单胞菌 SmalDRAFT_0818(FabH)SmalDRAFT_0821(ACP)SmalDRAFT_0822(FabF) ZP_01643059ZP_01643063ZP_01643064
嗜肺军团菌(Legionella pneumophila) FabHACPfabF YP_123672YP_123675YP_123676
如上文所提及的，通过联合表达支持brFA合成和醇合成的基因，可以制备支链醇。例如，当醇还原酶，如来自Acinetobacter baylyi ADP1的Acr1，与bkd操纵子共表达时，大肠杆菌可以合成异戊醇、异丁醇或2-甲基丁醇。同样，当Acr1与ccr/icm基因共表达时，大肠杆菌可以合成异丁醇。
3.环状脂肪酸和脂肪酸衍生物的形成
为了将诸如大肠杆菌这样的生产宿主转化为能够合成ω-环状脂肪酸(cyFA)的生物，向生产宿主中导入并表达能够提供环状前体环己基羰基辅酶A(CHC-辅酶A)(Cropp etal.，Nature Biotech.18：980-983，2000)。对于其他生产宿主，例如细菌、酵母和丝状真菌，类似的转化也是可能的。
在大肠杆菌中提供CHC辅酶A的基因的非限制性实例包括：来自山丘链霉菌(Streptomyces collinus)安三烯菌(ansatrienin)基因簇的ansJ、ansK、ansL、chcA和ansM(Chen et al.，Eur.J.Biochem.261：pp.1999， 1999)或者来自链霉菌HK803磷内酯霉素(phoslactomycin)B基因簇的plmJ、plmK、plmL、chcA和plmM(Palaniappan et al.，J.Biol.Chem.278：pp.35552，2003)以及山丘链霉菌(S.collinus)、阿维链霉菌(S.avermitilis)或者天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的chcB基因(Patton etal.Biochem.，39：7959-7604，2000)(参见表6的GenBank登录号)。然后可以表达以上表5列出的基因以便起始和延伸ω-环状脂肪酸。可选的，可以从制备cyFA的微生物中分离同源基因并在大肠杆菌中表达。
表6：合成CHC-CoA的基因
生物 基因 GenBank登录号
山丘链霉菌 ansJKansLchcAansMchcB U72144*AF268489
链霉菌HK803 pmlJKpmlLchcApmlM AAQ84158AAQ84159AAQ84160AAQ84161
天蓝色链霉菌 chcB/caiD NP_629292
阿维链霉菌 chcB/caiD NP_629292
*只有chcA在GenBank登录号U72144下有注释，ansJKLM参见Chen et al.(Eur.J.Biochem.261：98-107，1999)
表5所列的基因(fabH、ACP和fabF)足以起始和延伸ω-环状脂肪酸，因为它们的底物特异性很广。如果这些基因中的任意一种与表5的ansJKLM/chcAB或者pmlJKLM/chcAB基因的共表达不产生cyFAs，可以从产生cyFAs的微生物中分离fabH、ACP和/或fabF同源物(例如通过利用简并PCR引物或者异源DNA序列探针)，并共表达这些同源物。表7列出含有ω-环状脂肪酸的微生物的非限制性实例。
表7：包含ω-环状脂肪酸的微生物的实例
生物 参考
极小短小杆菌(Curtobacterium pusillum) ATCC19096
酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris) ATCC49025
酸热脂环芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius) ATCC27009
环庚基脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)* Moore，J.Org.Chem. 62：pp.2173，1997.
*利用环庚基羰基辅酶A和不利用环己基羰基辅酶A作为cyFA生物合成的前体
B.饱和度
脂肪酸是产生脂肪酸衍生物过程中的关键中间体。可以通过调节脂肪酸中间体的饱和度来控制脂肪酸衍生物的饱和度。可以表达或超表达sfa、gns和fab基因家族来控制脂肪酸的饱和度。图1列举了可以用于本发明的方法和生产宿主的这些基因家族中的基因的非限制性实例。
通过工程改造生产宿主超表达fabB，或者通过在低温(例如低于37℃)下培养生产宿主，可以工程改造生产宿主，产生不饱和脂肪酸。FabB偏好顺式-δ3癸烯酰ACP，并导致在大肠杆菌中产生不饱和脂肪酸。fabB的超表达导致产生显著百分比的不饱和脂肪酸(deMendoza etal.，J.Biol.Chem.，258：2098-101，1983)。可以将fabB插入天然不含有该基因的生产宿主并进行表达。然后，这些不饱和脂肪酸可以在生产宿主中作为中间体，所述生产宿主经工程改造产生脂肪酸衍生物，如脂肪醇、脂肪酯、蜡、石蜡、烷等。
可选地，可以将脂肪酸生物合成的阻抑物，例如fabR(GenBank登录号NP_418398)删除，这也导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸产生的增加(Zhang et al.，J.Biol.Chem.277：15558，2002.)。在其他生产宿主中可以进行类似的删除。通过超表达FabM(反式-2，顺式-3-癸烯酰基-ACP异构酶，GenBank登录号DAA05501)和受控表达肺炎链球菌(Sreptococcuspneumoniae)fabK(反式-2-烯酰基-ACP还原酶II，GenBank登录号NP_357969)(Marrakchiet al.，J.Biol.Chem.277：44809，2002)，并去除大肠杆菌fabI((反式-2-烯酰基-ACP还原酶，GenBank登录号NP_415804)，可以实现不饱和脂肪酸的进一步增加。此外，为了提高不饱和脂肪酸酯的百分比，生产宿主还可以超表达fabB (编码β-酮脂酰-ACP合酶I，登录号：BAA16180，EC：2.3.1.41)、Sfa(编码fabA的抑制物，登录号：AAC44390)以及gnsA和gnsB(两者均编码secG无效突变抑制因子，(即冷休克蛋白)，登录号：ABD18647.1，AAC74076.1)。在某些实例中，可以使内源fabF基因弱化，从而提高所产生的棕榈酸酯(C16:1)的百分比。
C.链长和酯特性
1.链长和奇数链长的制备
本文描述的方法允许产生各种长度的脂肪酸酯和脂肪酸衍生物。链长受硫酯酶的控制，该酶通过tes和fat基因家族的表达产生。通过表达特定的硫酯酶，可以产生具有所需碳链长度的脂肪酸和脂肪酸衍生物。表1列出了合适的硫酯酶的非限制性实例。可以将编码特定硫酯酶的基因导入生产宿主，从而产生特定碳链长度的脂肪酸或脂肪酸衍生物。内源硫酯酶的表达因而应当受到抑制。
在一个实施方案中，脂肪酸衍生物的碳链含有约4-36个碳原子、约6-32个碳原子、约10-30个碳原子、约10-18个碳原子、约24-32个碳原子、约26-30个碳原子、约26-32个碳原子、约5-10个碳原子、约10-16个碳原子或者约12-18个碳原子。在可选的实施方案中，脂肪酸衍生物碳链含有少于约20个碳原子、少于约18个碳原子或少于约16个碳原子。在另一个实施方案中，脂肪酸酯产物是具有24-46个碳原子的饱和或不饱和的脂肪酯产物。在一个实施方案中，脂肪酯产物具有24-32个碳原子。在另一个实施方案中，脂肪酯产物具有14-20个碳。在另一个实施方案中，脂肪酯是C18:1的甲基酯。在另一个实施方案中，脂肪酯是C16:1的乙基酯。在另一个实施方案中，脂肪酯是C16:1的甲基酯。仍然在另一个实施方案中，脂肪酸酯是辛醇的十八烷基酯。
某些微生物倾向于产生偶数或奇数碳链脂肪酸和脂肪酸衍生物。例如，大肠杆菌正常情况下产生偶数碳链脂肪酸和脂肪酸乙酯(FAEE)。令人惊讶的是，本文公开的方法可以用于改变所述产生。例如，可以使大肠杆菌产生奇数碳链脂肪酸和FAEE。
2.酯特性
酯包括可以称为A侧和B侧的。B侧由生产宿主中从头合成的脂肪酸提供。在宿主经另外工程改造产生醇包括脂肪醇的实施方案中，A侧也由生产宿主生物产生。仍然在其他实施方案中，A侧也可以提供于培养基中。通过选择所需硫酯酶基因，可以将B侧(当制备脂肪醇时，以及A侧)设计成具有某些碳链特性。这些特性包括分支点、不饱和度和需要的碳链长度。
当选择了特定的硫酯酶基因，在A侧和B侧均由生产宿主利用脂肪酸生物合成途径中间体产生的情况下，它们会有类似的碳链特性。例如，至少约50％、60％、70％或者80％所产生的脂肪酯，将具有长度相差约2、4、6、8、10、12或者14个碳的A侧和B侧。A侧和B侧还可以显示类似的分支和饱和程度。
除了产生提供给A侧的脂肪醇外，生产宿主还可以产生其他短链醇，如乙醇、丙醇、异丙醇、异丁醇和丁醇，所述短链醇可以利用本领域公知的技术附着到A侧。例如，可以由生产宿主生物产生丁醇。为了制备产丁醇的细胞，例如，可将菌株LS9001进一步工程改造，以便在pBAD24表达载体中、在prpBCDE启动子系统下，表达大肠杆菌K12的atoB(乙酰辅酶A乙酰基转移酶)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)的β-羟丁酰辅酶A脱氢酶、拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的巴豆酸酶、拜氏梭菌的丁酰辅酶A脱氢酶、黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)的辅酶A酰化醛脱氢酶(ALDH)，和编码丙酮丁醇棱菌(Clostridiumacetobutylicum)的醛-醇脱氢酶的adhE。其他生产宿主生物可以类似地修饰以产生丁醇或其他短链醇。例如，可以利用Kalscheuer等教导的方法(Microbiology 152：2529-2536，2006，通过引用并入本文)，在生产宿主中产生乙醇。
III.基因工程改造生产菌株以提高脂肪酸衍生物的产生
利用本领域公知的技术(非限制性实例包括电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、接合作用、转导等)，可以将参与产生脂肪酸衍生物的生物合成途径的异源DNA序列稳定地或者瞬时引入生产宿主细胞。为了稳定地转化，DNA序列还可以包 括选择标志，包括的非限制性实例，如抗生素抗性和弥补营养缺陷的基因。
本公开的各种实施方案利用包含异源DNA序列的表达载体，所述异源DNA序列编码参与代谢或者生物合成途径的蛋白。合适的表达载体包括，但不限于病毒载体(诸如杆状病毒载体)、噬菌体(phage)载体(如噬菌体(bacteriophage)载体)、质粒、噬菌粒、粘粒、Fosmids、细菌人工染色体、病毒载体(例如，基于以下病毒的病毒载体：痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒等)、基于P1的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体，和专门产生目的宿主(诸如大肠杆菌、豌豆假单胞菌(Pseudomonas pisum)和酿酒酵母)的任何其他载体。
有用的表达载体可以包括一种或者多种选择标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型特性。所述选择标记基因编码在选择性培养基中培养的转化的宿主细胞存活或者生长所必需的蛋白。没有用含有选择标记基因的载体转化的宿主细胞不能在培养基中存活。通常的选择基因编码以下蛋白：(a)赋予对抗生素或者其他毒素的抗性(例如，氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或者四环素)，(b)弥补营养缺陷型缺陷，或者(c)提供复合培养基没有的重要养分(例如，编码杆菌D-丙氨酸消旋物的基因)。在可选的实施方案中，选择标记基因是编码二氢叶酸还原酶或者赋予新霉素抗性(用于真核细胞培养)的基因，或者赋予四环素或者氨苄青霉素抗性的基因(用于原核生产宿主细胞，诸如大肠杆菌)。
表达载体中，编码生物合成途径基因的DNA序列可操作地连接于合适的表达调控序列(启动子，增强子等)，以指导所编码基因产物的合成。这类启动子可以来源于微生物或者病毒，包括CMV和SV40。根据所用的生产宿主/载体系统，表达载体中可以使用任意数量的合适的转录和翻译控制元件，包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等(参见例如，Bitter et al.，Methods in Enzymology，153：516-544，1987)。
用于原核生产宿主细胞的合适启动子包括，但不限于能够识别 T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子，λ噬菌体的PR和PL启动子，大肠杆菌的trp、recA、热休克和lacZ启动子，枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶和∑特异性启动子，杆菌噬菌体的启动子，链霉菌启动子，λ噬菌体的int启动子，pBR322β-内酰胺酶基因的bla启动子，和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子的综述可参见Glick，J.Ind.Microbiol.1：277，1987；Watson et al.，MOLECULAR BIOLOGY OFTHE GENE(基因的分子生物学)，第四版，Benjamin Cummins(1987)；和Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第二版，(Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989。用于真核生产宿主内的合适的真核启动子的非限制性实例来源于病毒，包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer etal.，J.Mol.Appl.Gen.1：273，1982)、疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355，1982)、SV40早期启动子(Benoist et al.，Nature(London)290：304，1981)、巨细胞病毒启动子(Foecking et al.，Gene 45：101，1980)、酵母gal4基因启动子(Johnston，et al.，PNAS(USA)79：6971，1982；Silver，et al.，PNAS(USA)81：5951，1984)；和IgG启动子(Orlandi etal.，PNAS(USA)86：3833，1989)。
生产宿主可以用编码生物合成途径基因产物的异源DNA序列进行遗传修饰，所述异源DNA序列可操作地连接于诱导型启动子。诱导型启动子是本领域公知的。合适的诱导型启动子的非限制性实例包括受蛋白、代谢物或者化学品影响的启动子。这些包括但不限于：牛白血病病毒启动子、金属硫蛋白启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRPpolIII启动子、四环素诱导型CMV启动子(如人即时早期CMV启动子)以及那些来自trp和lac操纵子的启动子。
在一些实例中，生产宿主用编码生物合成途径基因产物的异源DNA序列进行遗传修饰，所述异源DNA序列可操作地连接于组成型启动子。合适的组成型启动子是本领域已知的，包括组成型腺病毒主要晚期启动子、组成型MPSV启动子和组成型CMV启动子。
在一些实例中，修饰的生产宿主是用外源DNA序列进行遗传修饰的宿主，所述外源DNA序列编码参与生物合成途径的单个蛋白。 在其他实施方案中，修饰的生产宿主是用外源DNA序列进行遗传修饰的宿主，所述外源DNA序列编码两种或更多种参与生物合成途径的蛋白，例如，生物合成途径的第一和第二种酶。
当生产宿主经遗传修饰而表达两种或更多种参与生物合成途径的蛋白时，所述DNA序列的每一个都可以包含于单个或者分开的表达载体中。当这些DNA序列包含于单个表达载体中时，在一些实施方案中，核苷酸序列可操作地连接于常见的控制元件(例如，启动子)，所述常见控制元件控制所述单个表达载体中所有编码生物合成途径蛋白的DNA序列的表达。
当修饰的生产宿主用编码两种或更多种参与生物合成途径的蛋白的异源DNA序列进行遗传修饰时，所述DNA序列之一可操作地连接着诱导型启动子，而所述DNA序列的一个或者多个可操作地连接于组成型启动子。
在一些实施方案中，可以增加生物合成途径中间体的胞内浓度(例如，遗传修饰的宿主细胞的中间体浓度)以进一步提高终产物的产量。有许多方式可以增加中间体的胞内浓度，包括但不限于，增加培养基中生物合成途径底物的浓度；增强在生物合成途径中起作用的酶的催化活性；增加底物(例如，初始底物)的胞内量，所述底物是在生物合成途径中起作用的酶的底物等。
在一些实例中，脂肪酸衍生物或者中间体在细胞的细胞质中生成。有许多方式可以增加细胞质浓度，包括但不限于，将脂肪酸结合辅酶A形成酰基辅酶A硫酯。此外，通过增加细胞中辅酶A的生物合成，可以增加酰基辅酶A的浓度，诸如通过过表达与泛酸盐生物合成有关的基因(panD)或者敲除与谷胱甘肽生物合成有关的基因(谷胱甘肽合酶)。
调控序列、编码序列及其组合可以导入生产宿主的染色体或者进行改动。在某些实例中，所需重组序列整合进生产宿主基因组序列不需要使用诸如抗生素的选择性标记。在某些实例中，基因组改变包括用对调控不敏感的启动子替换天然启动子从而改变靶基因的控制序列。有无数方法可以实现这一点。例如，Valle和Flores，Methods Mol. Biol.267：113-122，2006描述了一种在大肠杆菌中超表达染色体基因的基于PCR的方法。另一种方法利用Court et al.(Proc.Nat.Acad.Sci.100：15748-15753，2003)开发的技术，基于使用单链寡核苷酸直接在染色体中产生特异突变。该技术基于超表达来自λ噬菌体的β蛋白从而增强基因重组。这个方法的优点在于可以使用70个碱基长(或更长)的合成寡核苷酸来产生点突变、插入和缺失，从而省略了任何克隆步骤。此外，该系统效率足够高，不需要标记来分离所需的突变。
利用这一方法，可以改变基因的调控区，以便产生更强的启动子和/或消除阻抑物的结合位点。以这样的方式，可以在生产宿主生物中超表达所需基因。
IV.发酵
A.生产效率的最大化
通过采用特定的发酵技术可以增强脂肪酸衍生物的产生和分离。一种使产量最大化同时降低成本的方法是增加碳源百分比，所述碳源被转变为烃类产物。
在正常的细胞生命周期中，碳被用于包括产生脂、糖、蛋白、有机酸和核酸在内的细胞功能。降低生长相关活性必需的碳的量可以增加碳源转变为产出物的功效。实现这一点可以通过首先增殖微生物到所需密度，诸如在对数生长期顶峰达到的密度。在这个时间点，可以利用复制检验点基因来终止细胞生长。具体来说，群体感应机制(quorum sensingmechanisms，综述于Camilli和Bassler Science311：1113，2006；Venturi FEMS MicrobioRev 30：274-291，2006；和Reading and Sperandio FEMS Microbiol Lett 254：1-11，2006)可用于激活基因诸如p53、p21或者其他检验点基因。在大肠杆菌中可以被激活以停止细胞复制和生长的基因包括umuDC基因，其超表达能够中止静止期到指数生长期的进展(Murli et al.，J.of Bact.182：1127，2000)。UmuC是DNA聚合酶，其可以进行对非编码损伤的跨损伤合成(大部分UV和化学诱变作用的机制基础)。umuDC基因产物用于跨损伤合成过程，并且还作为DNA损伤检验点。umuDC基因产物包括UmuC、UmuD、umuD’、UmuD’2C、UmuD’2和UmuD2。同时，可以激活产物生成基因，因此在 产生脂肪酸衍生物的同时，使用复制和维持途径的需求得以最小化。通过重新合成该基因与合适的终产物产生基因，在prpBCDE启动子系统下，还可以工程改造生产宿主微生物，以在pBAD24中表达来自大肠杆菌的umuC和umuD。
输入的碳转变为烃类产物的百分比是成本动因。该过程的效率越高(即输入的碳转变为脂肪酸酯或烃类产物的百分比更高)，则成本越低。对于含氧碳源(如葡萄糖和其他基于糖的来源)，氧必须以二氧化碳的形式释放。每释放2个氧原子，还释放1个碳原子，导致约34％(w/w)的最大理论代谢效率(对脂肪酸衍生的产物)。但是对于其他烃类产物和碳源来说，该数字是变化的。文献中通常的效率是约小于5％。经工程改造产生烃类产物的生产宿主可以具有大于1％、3％、5％、10％、15％、20％、25％和30％的效率。在一个实例中，生产宿主显示约10％至约25％的效率。在其他实例中，这类生产宿主显示约25％至约30％的效率。在其他实例中，这类生产宿主显示大于30％的效率。
可以将生产宿主另外工程改造表达重组纤维素小体，诸如PCT申请号PCT/US2007/003736(在此通过引用全文并入)中描述的那些，使得生产宿主利用纤维素物质作为碳源。例如，可以另外工程改造生产宿主使之表达转化酶(EC3.2.1.26)，因此可以利用蔗糖作为碳源。
同样，可以利用Ingram等人的美国专利第5,000,000号、第5,028,539号、第5,424,202号、第5,482,846号和第5,602,030号(在此均通过引用全文并入)中描述的方法将生产宿主工程改造，从而使得生产宿主可以有效地同化碳，并利用纤维素物质作为碳源。
在一个实例中，发酵室(fermention chamber)包括经历连续还原的发酵。在这种情况下，将产生稳定的还原环境。通过二氧化碳的释放(气态形式)保持电子平衡。增加NAD/H和NADP/H平衡的努力也有利于稳定电子平衡。
通过工程改造生产宿主表达NADH:NADPH转氢酶，也可以提高胞内NADPH的有效性。一种或者多种NADH:NADPH转氢酶的表达将糖酵解中产生的NADH转化为NADPH，其提高脂肪酸衍生物的产量。
B.小规模产烃
对于小规模产生烃产物，将含有pBAD24(带有氨苄抗性和终产物合成途径)和pUMVC1(带有卡那霉素抗性和乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A超表达系统)的大肠杆菌BL21(DE3)细胞于37℃在2L摇瓶中、在补充了75μg/mL氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的500ml LB培养液中＞200rpm震荡过夜培养。直到培养物的OD600大于0.8。达到OD600大于0.8时，给细胞补充25mM的丙酸钠(pH8.0)以激活工程基因系统进行生产，并通过激活UmuC和UmuD蛋白使细胞增殖停止。在30℃诱导6小时。温育后利用GC-MS检验培养基中的烃产物。
C.大规模产烃
对于产物的大规模产生，以10L、100L或更大的批量培养工程生产宿主，发酵并根据合适的质粒中编码的特异基因来诱导表达所需产物。
例如，将含有pBAD24(带有氨苄抗性和终产物合成途径)和pUMVC1(带有卡那霉素抗性和乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A超表达系统)的大肠杆菌BL21(DE3)细胞的500ml种子培养物在补充了75μg/mL氨苄霉素和50μg/ml卡那霉素的LB培养基(不含甘油)中37℃温育，用于进行10L发酵(5L种子100L发酵)，＞200rpm震荡，直到培养物的OD600大于0.8(通常16小时)。持续补充培养基使丙酸钠维持在25mM(pH8.0)，以激活工程基因系统进行生产，并通过激活umuC和umuD蛋白使细胞增殖停止。持续向培养基中补充葡萄糖，以将浓度维持在25g/100ml。
在首次诱导一个小时后，每小时移取总细胞体积的10％以下的等分试样，静置使烃产物浮到表面并自发进行分相。然后收集烃组分，将水相放回反应器。连续操作反应器。当OD600降到0.6以下，用由种子培养物新培养的批量取代细胞。
对于蜡酯产生，将蜡酯分离，在1M HCl中短暂清洗来裂解酯键，用蒸馏水充分洗涤，使回到pH7。
V.产后加工
可以将发酵期间产生的脂肪酸衍生物从发酵培养基中分离出来。 可以使用任何已知的从水介质中分离脂肪酸衍生物的技术。本文提供的一个示例性分离法是两相(双相)分离法。该方法涉及在足以产生脂肪酸衍生物的条件下发酵基因工程生产宿主，允许衍生物汇聚到有机相中并从水性发酵液分离有机相。该方法可以在分批以及连续发酵环境下实施。
双相分离利用脂肪酸衍生物的相对不混溶性来促进分离。不混溶是指化合物相对不能溶于水，由化合物的分配系数界定。本领域普通技术人员应当理解，通过选择发酵液和有机相使生成的脂肪酸衍生物具有高logP值，即使在发酵容器中的浓度非常低，脂肪酸衍生物也将进入有机相。
通过本文所述方法产生的脂肪酸衍生物在发酵液以及细胞质中是相对不混溶的。因此，脂肪酸衍生物会在胞内或者胞外于有机相中聚集。产物在有机相中的聚集将削弱脂肪酸衍生物对细胞功能的影响，将允许生产宿主产生更多的产物。
按照本文所述产生的脂肪醇、脂肪酯、蜡和烃使得能够制备均质化合物，其中至少约60％、70％、80％、90％或者95％所产生的脂肪醇、脂肪酯和蜡的碳链长度将相差少于约6个、少于约4个或者少于约2个碳。这些化合物还可以被制备为具有相对一致的饱和度，例如至少约60％、70％、80％、90％或者95％的脂肪醇、脂肪酯、烃和蜡是单不饱和、双不饱和或者三不饱和的。这些化合物可以直接用作燃料、个人护理添加剂、营养补剂。这些化合物还可以用作后续反应的原料以制备其他产物，所述后续反应如酯交换，氢化，催化裂化(通过氢化、高温分解(pyrolisis)或者这两者)，或者环氧化反应。
按照本文所述产生的脂肪醇、脂肪酯、蜡和烃含有低量的不需要或不希望的成分，包括但不限于重金属。在某些实施方案中，按照本文所述产生的脂肪醇、脂肪酯、蜡和烃含有低于约50ppm的砷、低于约300ppm的钙、低于约200ppm的氯、低于约50ppm的钴、低于约50ppm的铜、低于约300ppm的铁、低于约2％重量比的水，低于约50ppm的铅、低于约50ppm的锰、低于约0.2ppm的汞、低于约50ppm的钼、低于约1％重量比的氮、低于约200ppm的钾、低于约300ppm 的钠、低于约3％重量比的硫、低于50ppm的锌或者低于700ppm的磷。
在某些实施方案中，按照本文所述产生的脂肪醇、脂肪酯、蜡和烃含有约50％到约90％的碳、约5％到约25％的氢、或者约5％到约25％的氧。在其他实施方案中，按照本文所述产生的脂肪醇、脂肪酯、蜡和烃含有约65％到约85％的碳、约10％到约15％的氢、或者约10％到约20％的氧。
VI.燃料组分
本文所述的脂肪酸衍生物可以用作燃料。本领域普通技术人员应当理解，根据燃料的预定目的，可以制备和使用不同的脂肪酸衍生物。例如，对于预期在寒冷气候中使用的汽车燃料，可能希望支链脂肪酸衍生物。
利用本文所述的方法，可以产生具有所需燃料质量、包含相对均质的脂肪酸衍生物的燃料。这类基于脂肪酸衍生物的燃料可以用碳指纹法进行表征，与石油衍生的燃料或者源自甘油三酯的生物柴油相比，它们不含杂质。基于脂肪酸衍生物的燃料可以与其他燃料或者燃料添加剂组合，以产生具有所需性质的燃料。
本文描述的生产宿主和方法可以用于产生游离脂肪酸和脂肪酯。在某些实施方案中，生产宿主所产生的产物中游离脂肪酸的百分比是至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或25％。在某些实施方案中，生产宿主所产生的产物中脂肪酯的百分比是至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在某些实施方案中，生产宿主所产生的产物中脂肪酸酯与游离脂肪酸的比率是约10∶1、9∶1、8∶1、7∶1、5∶1、2∶1或1∶1。在其他实施方案中，生产宿主产生的脂肪酯是十二酸乙酯、十三酸乙酯、十四酸乙酯、十五酸乙酯、顺式-9-十六烯酸乙酯、十六酸乙酯、十七酸乙酯、顺式-11-十八烯酸乙酯、十八酸乙酯或其组合。在其他实施方案中，生产宿主产生的游离脂肪酸是十二酸、十四酸、十五酸、顺式-9-十六烯酸、十六酸、顺式-11-十八烯酸或其组合。
A.碳指纹
生物产生的脂肪酸衍生物代表了燃料如醇、柴油和汽油的新来源。一些利用脂肪酸衍生物制备的生物燃料还不是从可再生来源产生的，是新的组合物。根据双碳同位素指纹，可以将这些新的燃料与来自石化碳的燃料区分开来。此外，通过双碳同位素指纹(参见，美国专利第7,169,588号，在此通过引用全文并入，特别是第4栏第31行到第6栏8行)，可以确定生物来源的碳(例如葡萄糖相对甘油)的特定来源。
基于14C(fM)和双碳同位素指纹，可以将脂肪酸衍生物及与之相关的生物燃料、化学制品和混合物与它们的来源于石化碳的相似物完全区分开来。
本文描述的脂肪酸衍生物可以用于产生生物燃料和化学制品。根据双碳同位素指纹法，可以将本发明提供的新的基于脂肪酸衍生物的产物与完全来源于石化来源的物质区分开。能够区分这些产物的能力对于商业上跟踪这些物质很有用。例如，既含有“新的”又含有“旧的”碳同位素谱的燃料或化学制品可以与仅由“旧的”物质构成的燃料和化学制品区分开。因此，可以在商业上跟踪所述物质，或者根据其独特的性质鉴定为生物燃料。此外，其他竞争物质可以鉴定为生物来源的或者来源于石化来源。
在某些实例中，制备的生物燃料组合物包括δ13C为约-10.9到约-15.4的的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物占组合物中生物来源物质(即源自可再生资源如纤维素质和糖)的至少约85％。在其他实例中，所述生物燃料组合物包括具有以下式的脂肪酸衍生物：
X-(CH(R))nCH3
其中X代表CH3，-CH2OR1、-C(O)OR2或者-C(O)NR3R4；
对于每个n而言，R独立地是不存在的、H或者低级脂肪族；
n是从约8到34的整数，优选从约10到24；和
R1、R2、R3和R4独立地选自H和低级烷基。
通常，当R是低级脂肪族时，R代表分支的、不分支的或者环状低级烷基或者低级烯基部分。示例性的R基团包括，但不限于，甲基、异丙基、异丁基、仲-丁基、环戊烯基等。脂肪酸衍生物的特征还在于具有从约-10.9到约-15.4的δ13C，并且脂肪酸衍生物占组合物中生物 来源物质的至少约85％。在某些实例中，生物燃料组合物中脂肪酸衍生物的特征在于，现代碳分数(fM 14C)为至少约1.003、1.010或者1.5。
B.杂质
本文所述的脂肪酸衍生物可用于制备生物燃料。这些脂肪酸衍生物从脂肪酸直接制备，而不是通过甘油三酯的化学加工制备。因此，包括所述脂肪酸衍生物的燃料包含的杂质比通常衍生自甘油三酯的生物燃料的更少，如衍生自植物油和脂肪的燃料。
本文所述的粗脂肪酸衍生物生物燃料(在将脂肪酸衍生物与其他燃料如基于石油的燃料混合前)包含的转酯催化剂少于石化柴油或者生物柴油。例如，脂肪酸衍生物可以包含低于约2％、1.5％、1.0％、0.5％、0.3％、0.1％、0.05％或者0％的转酯催化剂或者源自转酯催化剂的杂质。
转酯催化剂的非限制性实例包括，氢氧化物催化剂，如NaOH、KOH和LiOH；和酸性催化剂，如无机酸催化剂和路易斯酸催化剂。催化剂和源自转酯催化剂的杂质的非限制性实例包括，锡、铅、汞、镉、锌、钛、锆、铪、硼、铝、磷、砷、锑、铋、钙、镁、锶、铀、钾、钠、锂及其组合。
同样，本文描述的粗脂肪酸衍生物生物燃料(在将脂肪酸衍生物与其他燃料诸如石化柴油或生物柴油混合前)包含的甘油(或者丙三醇)少于由甘油三酯制备的生物燃料。例如，脂肪酸衍生物可以包含重量比低于约2％、1.5％、1.0％、5％、0.3％、0.1％、0.05％或者0％的甘油。
源自脂肪酸衍生物的粗生物燃料包含的游离醇(即用于产生酯的醇)也少于由甘油三酯制备的生物柴油。这部分归因于生产宿主利用醇的效率。例如，脂肪酸衍生物包含重量比低于约2％、1.5％、1.0％、0.5％、0.3％，0.1％、0.05％或者0％的游离醇。
源自所述脂肪酸衍生物的生物燃料的特征还可以在于，其硫浓度低于石油衍生的柴油。例如，源自脂肪酸衍生物的生物燃料具有重量比低于约2％、1.5％、1.0％、0.5％、0.3％、0.1％、0.05％或者0％的硫。
C.添加剂
燃料添加剂用于提高燃料或者发动机的性能。例如，燃料添加剂 可用于改变冰点/胶凝点、浊点、润滑性、粘性、抗氧化性、引燃性、辛烷值和闪点。在美国，所有的燃料添加剂必须在环境保护署(Environmental Protection Agency)登记。通过联系EPA或者浏览该机构的网站可以公开获得出售燃料添加剂的公司和燃料添加剂的名称。本领域普通技术人员理解，本文描述的脂肪酸衍生物可以与一种或者多种这类添加剂混合以提供需要的质量。
本文描述的脂肪酸衍生物可以与其他燃料混合，诸如源自甘油三酯的生物柴油，各种醇诸如乙醇和丁醇，以及石油衍生的产物诸如汽油。
在一些实例中，制备具有低胶凝点的脂肪酸衍生物，如C16:1乙酯或者C18:1乙酯。可以将这种低胶凝点的脂肪酸衍生物与由甘油三酯制备的生物柴油混合，以便与由甘油三酯制备的生物柴油相比，降低所得燃料的总胶凝点。同样，可以将脂肪酸衍生物诸如C16:1乙酯或者C18:1乙酯与石油衍生的柴油混合以提供至少约5％且经常大于5％的生物柴油的混合物。在一些实例中，混合物包括至少约10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％重量比的脂肪酸衍生物。
例如，可以将生物燃料组合物制备成包括至少约20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或者95％的脂肪酸衍生物，所述脂肪酸衍生物包括8:0、10:0、12:0、14:0、14:1、16:0、16:1、18:0、18:1、18:2、18:3、20:0、20:1、20:2、20:3、22:0、22:1或者22:3的碳链。这类生物燃料组合物还可以包括至少一种选自以下物质的添加剂：可以将浊点降低到低于约5℃或者约0℃的浊点降低添加剂；表面活性剂；微乳剂；至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或者80％、85％、90％或者95％的来自甘油三酯的柴油燃料；石油衍生的汽油；或者来自石油的柴油燃料。
实施例
以下实施例描述了生产宿主产生特异性脂肪酸衍生物的工程改造。产生脂肪酸衍生物所涉及的生物合成途径如附图所示。
例如，图1是FAS途径示意图，显示直接参与酰基-ACP合成的 酶。为了增加脂肪酸衍生物诸如蜡、脂肪醇和烃的产量，可以超表达或者突变一种或者多种图1中的酶以减少反馈抑制从而增加所产生的酰基ACP的量。此外，代谢中间体产生基于非脂肪酸的产物(副反应)的酶可以被功能性缺失或者弱化以增加通过脂肪酸生物合成途径的碳通量。以下实施例中，描述了许多经工程改造增加脂肪酸产量的生产宿主。
图4、图5和图6显示了可以进行工程改造从而分别产生脂肪醇和脂肪酯的生物合成途径。如图5所示，利用属于文中指出的酶类的成员的几种不同多肽可以将各个底物(例如，乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、酰基ACP、脂肪酸和酰基辅酶A)转化为各产物(例如乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A、酰基ACP、脂肪酸和酰基辅酶A)。
以下实施例描述了已进行了工程改造或者可以进行工程改造从而产生特定脂肪醇、蜡、脂肪酯和烃的微生物。
实施例1.生产宿主的构建
示例性的生产宿主是LS9001。通过修饰购自Overexpress.com(Saint Beausine，France)的C41(DE3)使fadE基因(酰基辅酶A脱氢酶)功能性缺失，从而制备LS9001。
简单来说，利用引物YafV_NotI和Ivry_O1扩增fadE上游约830bp，利用引物Lpcaf_o1和LpcaR_Bam扩增fadE下游约960bp，制备了大肠杆菌的fadE敲除菌株。使用重叠PCR产生框内缺失完整fadE基因的构建体。将fadE缺失构建体克隆到温度敏感质粒pKOV3中，该质粒包含用于反选择的sacB基因，并按照Link等人(J.Bact.179：6228-6237，1997)的方法实现fadE的染色体缺失。所获菌株无法降解脂肪酸和脂酰辅酶A。该敲除菌株在本文中称为ΔfadE。
可以包括于生产宿主内的其他修饰包括，导入载有负责大肠杆菌中乙酰辅酶A羧化酶活性的4种基因(accA、accB、accC和accD，登录号：NP_414727，NP_417721，NP_417722，NP_416819，EC 6.4.1.2)的质粒。分两步将accABCD基因作为双顺反子(bicistronic)操纵子克隆入pACYCDuet-1(Novagen，Madison，WI)的NcoI/HindIII和NdeI/AvrII位 点，所获质粒称为pAS004.126。
可以包括于生产宿主内的其他修饰包括以下：超表达aceEF(编码丙酮酸盐和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1p脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分)和来自大肠杆菌、欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonas europaea)(ATCC 19718)、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、链霉菌(Stretomyces spp.)、雷尔氏菌、红球菌、棒状杆菌、短杆菌、分枝杆菌和产油酵母的fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(编码FAS)。同样，可以将生产宿主工程改造为表达豌豆(Pisumsavitum)的accABCD(编码乙酰辅酶A羧化酶)。但是，当生产宿主也产生丁醇时，较不希望表达豌豆同源物。
在某些生产宿主中，可以利用Link等人(J.Bacteriol.179：6228-6237，1997)的方法敲除或者弱化基因。可以被敲除或者弱化的基因包括gpsA(编码生物合成sn-甘油3-磷酸脱氢酶，登录号NP_418065，EC：1.1.1.94)、ldhA(编码乳酸脱氢酶，登录号NP_415898，EC：1.1.1.28)、pflb(编码甲酸盐乙酰基转移酶1，登录号：P09373，EC：2.3.1.54)、adhE(编码醇脱氢酶，登录号：CAA47743，EC：1.1.1.1，1.2.1.10)；pta(编码磷酸转乙酰酶，登录号：NP_416800，EC：2.3.1.8)、poxB(编码丙酮酸氧化酶，登录号：NP_415392，EC：1.2.2.2)、ackA(编码醋酸盐激酶，登录号：NP_416799，EC：2.7.2.1)及其组合。
同样，利用实施例1中描述的fadE缺失的方法，可以将PlsB[D311E]突变导入LS9001以弱化plsB。该突变减少了转向磷脂产生的碳的量(参见图1)。通过用谷氨酸的GAA密码子取代天冬氨酸311的GAC密码子，制备编码PlsB[D311E]的等位基因。通过基因合成制备发生改动的等位基因，并利用Link等人的方法(参见上文)将染色体plsB野生型等位基因替换为突变的plsB[D311E]等位基因。
为了经发酵商业化产生脂肪酸衍生物，将生产宿主内部调控途径优化以产生更多的所需产物。在许多情况下，通过超表达某些酶可以消除这种调控。表8列举了一些实例。
表8：其他可以优化用于产生脂肪酸衍生物的基因
实施例2.生产宿主的修饰
构建下列质粒用于表达用于合成脂肪酸衍生物的各种蛋白。利用标准分子生物学方法制备构建体。所有被克隆的基因均置于IPTG-诱导型启动子(例如，T7、tac或者lac启动子)的控制下。
将大肠杆菌的‘tesA基因(硫酯酶A基因，登录号NP_415027，不含前导序列(Choand Cronan，The J.of Biol.Chem.，270：4216-9，1995，EC：3.1.1.5，3.1.2.-)克隆入NdeI/AvrII消化的pETDuet-1(本文所述的pETDuet-1获自Novagen，Madison，WI)。将编码加利福尼亚桂树、萼距花和樟树的FatB型植物硫酯酶(TEs)的基因(登录号：UcFatB1＝AAA34215，ChFatB2＝AAC49269，ChFatB3＝AAC72881，CcFatB＝AAC49151)分别克隆入3种不同的载体：(i)NdeI/AvrII消化的pETDuet-1，(ii)XhoI/HindIII消化的pBluescript KS+(Stratagene，LaJolla，CA)(用于产生N端lacZ::TE融合蛋白)和(iii)XbaI/HindIII消化的pMAL-c2X(New England Lab，Ipswich，MA)(用于产生n端malE::TE融合)。将大肠杆菌的fadD基因(编码酰基辅酶A合成酶)克隆入 NcoI/HindIII消化的pCDFDuet-1衍生物，所述衍生物在其NdeI/AvrII位点内包含不动杆菌ADP1的acr1基因(酰基辅酶A还原酶)。表9总结了用于制备数个示例性生产菌株的质粒。本领域普通技术人员应当理解可以使用不同的质粒和基因组修饰获得类似的菌株。
表9：用于生产宿主的质粒一览
质粒 来源生物基因产物 登录号；EC号
pETDuet-1-tesA 大肠杆菌TesA 登录号：NP_415027，EC：3.1.1.5，3.1.2.-
pETDuet-1-TEucpBluescript-TEucpMAL-c2X-TEuc 加利福尼亚桂树UcFatB1 Q41635AAA34215
pETDuet-1-TEchpBluescript-TEchpMAL-c2X-TEch 萼距花ChFatB2ChFatB3 ABB71581AAC49269AAC72881
pETDuet-1-TEccpBluescript-TEccTEci 樟树CcFabB AAC49151
pETDuet-1-atFatA3 拟南芥 NP_189147
pETDuet-1-HaFatA1 向日葵 AAL769361
pCDFDuet-1-fadD-acr1 大肠杆菌 fadD：登录号 NP_416319，EC 6.2.1.3acr1：登录号 YP 047869
pETDuet-1-tesA 大肠杆菌TesA 登录号：NP_415027，EC：3.1.1.5，3.1.2.-
pETDuet-1-TEucpBluescript-TEucpMAL-c2X-TEuc 加利福尼亚桂树UcFatB1 Q41635AAA34215
pETDuet-1-TEchpBluescript-TEchpMAL-c2X-TEch 萼距花ChFatB2ChFatB3 ABB71581AAC49269AAC72881
pETDuet-1-TEccpBluescript-TEccTEci 樟树CcFatB AAC49151
pCDFDuet-1-fadD-acr1 大肠杆菌 fadD：登录号NP_416319，EC 6.2.1.3acr1：登录号YP_047869
选中的表达质粒含有兼容的复制子和抗生素抗性标记，这样的话可以建立4质粒表达系统。因此，可以用下述质粒共转化LS9001：(i) 任意TE表达质粒，(ii)FadD表达质粒，其也表达acr1和(iii)蜡合酶表达质粒。当用IPTG进行诱导时，所得菌株从碳源如葡萄糖产生脂肪醇的浓度将增加。
实施例3.脂肪醇在重组大肠杆菌菌株中的产生
通过在生产宿主中外源性表达硫酯酶基因和酰基辅酶A还原酶基因，产生脂肪醇。具体来说，将质粒pCDFDuet-1-fadD-acr1(酰基辅酶A还原酶)和pETDuet-1-′tesA(硫酯酶)转化入大肠杆菌菌株LS9001(实施例1中所述)，在添加100mg/L壮观霉素和50mg/L羧苄青霉素的LB板中挑选相应的转化体。将LS9001/pCDFDuet-1-fadD-acr1的4个转化体分别接种于3mL添加50mg/L羧苄青霉素和100mg/L壮观霉素的M9培养基中。包含所述转化体的样品25℃下在振荡器(250rpm)上培养，直到它们达到0.5OD600。然后，每种样品取1.5mL转移入包含30mL上述培养基的250mL烧瓶中。所获培养物在25℃的振荡器上生长，直到培养物达到0.5-1.0OD600。然后添加IPTG至终浓度1mM。细胞继续培养40小时。
然后将细胞以4000rpm离心沉淀，并将细胞沉淀悬浮于1.0mL甲醇中。然后将3mL乙酸乙酯与悬浮细胞混合。向混合物中添加3mLH2O，并用超声处理所述混合物20分钟。将所获样品以4000rpm离心5分钟，将包含脂肪醇的有机相(上层相)进行GC/MS分析。全部醇(包括十四醇、十六醇、十六碳烯醇和十八碳烯醇)的产量是约1-10mg/L。当以相同方式培养仅携带空载体的大肠杆菌菌株时，在乙酸乙酯提取物中只测量到0.2-0.5mg/L的脂肪醇。
实施例4.含有奇数碳链、不含重金属的脂肪酸(FA)和脂肪酸乙酯(FAEE)的制备
1.生物柴油样品#23-30的制备
通过生物反应器培养经工程改造产生脂肪酸酯的大肠杆菌菌株(C41DE3ΔfadEΔfabR‘TesA fadD adp1ws)来制备生物柴油样品#23-30(样品#23-30)。培养物的扩展利用了两阶段接种方案。第一个阶 段包括将1mL大肠杆菌产酯菌株冷冻管接种到带有挡板的250mL摇瓶中的50mL LB培养基(添加了100μg/L羧苄青霉素和100μg/L壮观霉素)中。将这个种子瓶于37℃温育7小时(终OD600＝4.5AU，pH 6.7)。之后取3mL一级培养物转入三个含有350ml缓冲的F1基本培养基的带挡板的2L瓶中的每一个，瓶中同样含有100μg/L羧苄青霉素和100μg/L壮观霉素。使用的摇瓶缓冲液是终浓度为200mM(pH 7.2)的Bis-Tris丙烷。随后将这些二级种子瓶37℃温育18小时(终OD600＝12AU，pH 5.5)，内容物用于接种三个14L生物反应器，接种后起始体积是6.5升经缓冲的F1基本培养基。这些生物反应器同样含有100μg/L羧苄青霉素和100μg/L壮观霉素。
最初这些14L生物反应器在37℃培养，利用搅拌和氧富集级联环(enrichmentcascade loops)将溶氧水平保持在30％饱和。用1MH2SO4和无水氨气将培养液的pH维持在7.2。当基础培养基中最初的5g/L装料被消耗尽时，开始进行主要由43％(w/v)葡萄糖构成的营养补料。然后在发酵持续期间，人工调节葡萄糖溶液的补料速度保证残留葡萄糖处于低水平(但不是没有)。培养物的光密度达到30AU时，用1mM IPTG(终浓度)诱导培养物。在该诱导点，将生物反应器的培养温度降到30度，向培养物中加入约15mL/L(在6.5到7升的基础上)乙醇，始终通过HPLC监测。周期性地向生物反应器中加入其他乙醇以保持残余浓度在约20mL/L。培养约60小时后收集生物反应器，从三个生物反应器中的每个收集到约10L培养液。
将这些培养液合并，用等体积的乙酸乙酯，在室温下搅拌提取两小时。然后将培养液提取物离心(3500rpm，30分钟)分出不同液层，移取有机层作进一步处理。经旋转蒸发(Büchi，R-200)将乙酸乙酯几乎全部从有机层除去(GC/FID证明＜0.3％残存)，剩下约90ml深色油样液体。液体命名为样品#23-30。
2.样品#23-30中FA和FAEE的定量
用配备30m×0.25mm(0.10μm膜)DB-5柱子的Agilent5975B MSD系统进行GC-MS。柱温为100℃等温30分钟。柱子被设置成以20℃/分钟的速度从100℃升到320℃。当达到最终温度时，柱在320℃保 持等温5分钟。质谱仪配备电子碰撞电离源。电离源温度设定为300℃。FAEE标准(例如，十二酸乙酯、十四酸乙酯、顺式-9-十六烯酸乙酯、十六酸乙酯、十八酸乙酯，全部＞99％)；脂肪酸甲酯(FAME)标准(例如，十二酸甲酯、十四酸甲酯、十五酸甲酯、顺式-9-十六烯酸甲酯、十六酸甲酯、顺式-11-十八烯酸甲酯，全部＞99％)；三甲基硅烷基重氮甲烷(TMSD，2M溶于己烷)；盐酸(37％)；甲醇(＞99.9％)；以及乙酸乙酯(＞99.9％)均购自Sigma-Aldrich，未经进一步纯化直接使用。
通过向1ml样品中加入50μL三甲基硅烷基重氮甲烷(TMSD)、8μL HCl和36μL甲醇使样品#23-30衍生化(derivatized)(1mg/mL溶于乙酸乙酯)。将混合物室温温育1小时。
定量前，用两种方法鉴定样品#23-30中的FAEE和FAME。第一种方法，将每种化合物的GC保留时间与已知标准物的保留时间进行比较。第二，通过将化合物的质谱与质谱库中的标准物的质谱匹配来证实每种化合物的鉴定。
当FAEE或FAME有标准物时，FAEE或FAME的定量可以通过制作校准曲线(浓度相对仪器反应)来确定。然后得到仪器反应与分析物浓度间的线性关系。取仪器反应并参照校准曲线从而确定样品中化合物的浓度。
当FAEE没有标准物时，用平均仪器反应时间来确定化合物的浓度。将所有已有校准曲线的斜度和截距平均。根据这些平均值，确定浓度和仪器反应之间的线性关系。然后，利用公式1，通过其仪器反应对照仪器反应与浓度之间的线性关系，确定未知化合物的浓度。
公式1：浓度＝(仪器反应-平均截距)/平均斜度
对FAME进行鉴定和定量后，根据FAME的浓度以及FA与FAME的分子量比率，确定相关游离脂肪酸的浓度。最后，将FAEE和FA以mg/L表示的浓度转化为生物柴油样品中的百分比(w/w％)。
表10列出了样品#23-30中的FAEE和FA的浓度。FAEE和FA的总浓度是80.7％。剩下的未知化合物可以通过LC/MS/MS方法分析。十五酸乙酯、顺式-9-十六烯酸乙酯、十六酸乙酯和顺式-11-十八烯酸乙酯是样品#23-30的主要成分。
表10：样品#23-30中FAEE和FA的百分比
*百分比是w/w％
令人惊讶的是，样品#23-30含有奇数FA和FAEE。可以进行进一步分析，诸如LC/MS/MS，来确认这些奇数碳链脂肪酸是由大肠杆菌产生的，而不是来自大肠杆菌自身的脂类。
3.样品#23-30的定量元素分析
已知重金属对于催化裂化过程中使用的催化剂是有害的。为了测量样品#23-30中的重金属水平，将样品#23-30送到GalbraithLaboratories，Inc，进行砷、钙、碳、氯、钴、铜、氢、铁、Karl Fisher水(Karl Fisher water)、铅、锰、镁、汞、钼、氮、钾、钠、硫、锌、氧和磷的定量元素分析。以下描述了制备和分析方法。结果如表11所示。除了碳(73.38％)、氯(91ppm)、氢(12.1％)、Karl Fisher水(0.998％)、汞(0.057ppm)、氧(14.53％)和磷(343ppm)，表11中的所有量均低于定量水平(LOQ)。因此，样品#23-30不含有高水平的所测量的这些重金属。
方法G-52，Rev6：微波消解样品用于进行金属分析
称适量样品到微波管中到最接近0.001g。然后向微波管中加入合适的试剂。如果可以观察到肉眼可见的反应，则允许反应停止，之后再盖上微波管。然后根据厂商的说明，将管子密封并放到微波中。每个管子的温度在5分钟内至少达到180±10℃。使其在最低180±10℃保持10分钟。在微波程序最后，取出前允许管子冷却至少5分钟。然后打开管子，转移到容量瓶中，用于通过合适的技术进行分析。
方法G-55，Rev3：Parr氧弹燃烧确定卤素
称取样品到燃烧杯中，加入矿物油作为助燃剂。为了测量氯(Cl)和溴(Br)，向氧弹中加入1％过氧化氢溶液。为了测量硫，加入0.01N氢氧化钠溶液。将样品和燃烧杯与合适的吸收溶液一起封闭于Parr氧燃烧弹中。用氧气净化燃烧弹，然后加压达到25-30atm氧气压，并点燃。之后，充分混合燃烧弹的内容物，转移到烧杯中，进行后续分析。
方法G-30B，Rev7：湿灰消解无机和有机化合物用于金属分析
样品用H2SO4烧焦。如果分析能够形成不溶性硫酸盐的金属，用HClO4和HNO3来烧焦有机物质。将样品烧焦后，加入HNO3使样品回流以溶解存在的金属。如果溶液变浑浊，加入HCl帮助完全消解。如果样品中有硅，可以使用HF，但这仅在硅不是目标分析物的情况下。所有用到的HF都只能容纳在Teflon容器中。将澄清的消解液定量转移到A级容量瓶中，加至终体积。然后分析样品。
方法ME-4A Rev2：通过离子色谱确定受抑制的阴离子
仪器 Dionex Model DX500
色谱柱 Dionex IonPac AS9-SC 4×250mm
洗脱液2.4mM Na2CO3 1.8mM NaHCO3
制备 水性样品可以这样分析。水溶性样品一般是取一定重量加入已知体积。其他水不溶的固体物质可以经萃取
来确定各种阴离子的可萃取量或者进行燃烧来确定元素如Cl或Br的总量。
校准 托架样品(bracket sapmle)浓度标准0.2mg/L-4.0mg/L
样品加入 自动注射(Hitachi Model AS7200)
确定 传导率的检测/线性回归
定量限度 溶液中一般是0.2mg/L
干扰 具有类似保留时间的阴离子，与主要的组成阴离子有重叠的峰
方法S-300Rev7：通过库仑滴定(Karl Fischer)确定水
本方法结合了库仑和卡氏滴定法。将样品与主要含有碘离子(I-)和二氧化硫的胺-甲醇混合物进行混合。允许在阳极经电解产生的碘与水反应。这种情况下，产生的碘遵循Faraday定律与电流量成正比。并且，因为1摩尔水与1摩尔碘配比反应，1mg水相当于10.71库仑电流。利用这个规律，湿度计直接根据电解所需的库仑数量确定水的量。这个过程包括直接加入和蒸馏器预处理技术。
方法E16-2，Rev(Trace E16-2A)：利用LECO SC-432DR测定硫
SC-432DR硫分析仪是一种非分散的红外、数控仪器，该仪器设计用于测量各种无机和有机物中的硫含量。将样品在纯氧中1350+50℃燃烧。硫被氧化为二氧化硫，并通过红外吸收定量。SC-432DR配备有两个探测器、高倍率红外池(high-range infrared cell)和低倍率红外池(low-range infrared cell)。
方法ME-2，Rev14：碳、氢和氮的确定
这个仪器在纯氧中在950℃下稳态燃烧样品，产生燃烧产物CO2、H2O和N2。PE-240在自求积分式稳态导热分析仪中自动分析这些产物。可以加入钨酐促进燃烧。对于难以燃烧的样品，可以延长燃烧时间(例如，硬烧模式(burn hard mode))。
方法ME-70，Rev 4：电感耦合等离子体原子发射光谱法
这个方法描述了利用同步光学系统和轴向或径向观察等离子体，经ICP-AES确定多元素。所述仪器通过光谱仪测量特征发射谱。将样品雾化，得到的气溶胶转移到等离子矩。通过高频感应耦合等离子体产生元素特异的发射谱。发射谱被光栅光谱仪分散，通过光敏设备监测发射线的强度。痕量元素定量需要进行背景校正。分析过程中，背景的测量必须与样品的分析物线相邻。背景强度测量所选择的在分析线的一侧或两侧的位置，要根据分析物线相邻的谱的复杂性来确定。在一种分析模式中，使用的位置应当尽量不受光谱干扰，并且应当反映出与在所测分析物波长发生的相同的背景强度变化。在线加宽的情况中，不需要进行背景校正，因为这时的背景校正实际上会使分析结果退化。
方法E80-2，Rev4：汞的确定(自动冷蒸汽技术)
这个程序基于EPA SW846方法7471A。冷蒸汽原子吸收基于原子吸收的一般理论，该理论认为分析物的自由原子从灯源吸收与分析物浓度成比例的能量。通过利用含有待测量金属的灯，得到吸收所需的确切波长，使干扰被极大地减轻。冷蒸汽原子吸收利用这个原理，用二价锡(II)氯化物(SnCl2)还原汞离子使汞原子释放。氮气携带原子通过光学池(optical cell)，汞灯在一端，探测器在另一端。因为采用了冷蒸汽法而不是火焰法，未被消化的有机化合物因其广泛的吸收波长而成为造成顾虑(interference concern)。
表11：样品#23-30的定量元素分析
元素 制备方法 分析方法 结果
砷 G-52 ME-70 ＜25ppm
钙 G-30B ME-70 ＜119ppm
碳 N/A ME-2 73.38％
氯 G-55 ME-4A 91ppm
钴 G-30B ME-70 ＜23ppm
铜 G-30B ME-70 ＜23ppm
氢 N/A ME-2 12.1％
铁 G-30B ME-70 ＜136ppm
Karl Fisher水 N/A S-300 0.998％
铅 G-52 ME-70 ＜25ppm
锰 G-30B ME-70 ＜23ppm
镁 G-30B ME-70 ＜23ppm
汞 G-52 E80-2 0.057ppm
钼 G-30B ME-70 ＜23ppm
氮 N/A ME-2 ＜0.5％
钾 G-30B ME-70 ＜103ppm
钠 G-30B ME-70 ＜140ppm
硫 N/A E16-2A ＜0.140％
锌 G-30B ME-70 ＜23ppm
氧 N/A 减去* 14.53％
磷 G-30B ME-70 343ppm
用“＜”表示的结果低于LOQ。*氧含量是从100％中减去所有其他元素观察到的结果确定的。
实施例5.脂肪醇在生产宿主的产生和释放
在仅依靠葡萄糖作为唯一碳源和能源生长的大肠杆菌中表达Acr1(酰基辅酶A还原酶)。大肠杆菌产生少量的脂肪醇，如十二醇(C12:0-OH)、十四醇(C14:0-OH)和十六醇(C16:0-OH)。在其他样品中，FadD(酰基辅酶A合成酶)与acr1一起在大肠杆菌中表达。观察到脂肪醇产量增加5倍。
其他样品中，在野生型大肠杆菌C41(DE3)和大肠杆菌C41(DE3ΔfadE)(缺失酰基辅酶A脱氢酶的菌株)中表达acr1、fadD、accABCD(乙酰辅酶A羧化酶)(如实施例1所述构建的携带accABCD的质粒)以及各种不同的硫酯酶(TEs)。这导致脂肪醇生成的额外增加并调节脂肪醇模式(参见图7)。例如，大肠杆菌′tesA(pETDuet-1-′tesA)在该系统的超表达实现C12:0-OH、C14:0-OH和C16:0-OH增加约60倍，其中C14:0-OH是主要的脂肪醇。当表达ChFatB3酶(pMAL-c2X-TEcu中来自萼距花的FatB3)，获得非常类似的结果。当表达UcFatB1酶(pMAL-c2X-TEuc中来自加利福尼亚桂树的FatB1)时，脂肪醇生成增加约20倍，并且C12:0-OH是主要的脂肪醇。
ChFatB3和UcFatB1表达还分别导致产生显著量的不饱和脂肪醇C16:1-OH和C14:1-OH。在利用tesA表达产生的样品上清液中也发现了脂肪醇的存在(图8)。在37℃发现上清和细胞沉淀中脂肪醇的量近似相等，而在25℃发现约25％的脂肪醇在上清液中。
实施例6.使用多种酰基辅酶A还原酶产生脂肪醇
本实施例描述了使用多种酰基辅酶A还原酶产生脂肪醇。脂肪醇可以是终产物。可选地，生产宿主细胞还可以表达/超表达酯合酶以产生脂肪酯。
将来自各种来源的编码脂肪酰基辅酶A还原酶(表12)的四个基因中的每一个均针对大肠杆菌表达进行密码子优化，并由Codon Devices，Inc.(Cambridge，MA)合成。合成基因中的每一个均作为NdeI-AvrII片段克隆到pCDFDuet-1-fadD(实施例3中描述)中。将每个携带这些酰基辅酶A还原酶基因以及大肠杆菌fadD基因的质粒转化到购自 Over-expression.com的大肠杆菌菌株C41(DE)中。
将重组菌株于在37℃在3mL LB培养液(添加100mg/L壮观霉素)中过夜培养。取0.3mL过夜培养物转移到30mL新鲜的M9培养基(含有100mg/L壮观霉素)中，在25℃培养。培养物达到OD6000.5时，加入IPTG至终浓度1mM。给各培养物提供0.1％的溶于水的三种脂肪酸之一(pH 7.0)。提供的三种脂肪酸是十二酸钠、四烷酸钠(sodiummyristate)或者棕榈酸钠。没加脂肪酸的培养物包括在内作为对照。诱导后，培养物在相同温度在25℃再培养40小时。
发酵结束时利用GC-MS，按照以上实施例3和实施例4所述的，对脂肪醇产量进行确定。表13显示了由相应脂肪酸所产生的脂肪醇。结果表明这三种酰基辅酶A还原酶即Acr1、AcrM和BmFAR可以将所有三种脂肪酸都转化为相应的脂肪醇。结果还表明当底物是十四酸酯和棕榈酸酯时，hFAR和JjFAR都有活性。但是当底物是十二酸时只有少量活性或者没有活性。mFAR1和mFAR2仅对十四酸酯表现出低活性，对其他两种脂肪酸没有活性。
表12：酰基辅酶A还原酶
酰基辅酶A还原酶 蛋白质ID(登录号) 蛋白质来源
mFAR1 AAH07178 小家鼠
mFAR2 AAH55759 小家鼠
JjFAR AAD38039 西蒙得木
BmFAR BAC79425 家蚕
Acr1 AAC45217 不动杆菌(A.baylyi ADP1
AcrM BAB85476 不动杆菌M1
hFAR AAT42129 智人
表13：脂肪醇产量
注：a这种情况中仅对十六醇进行了定量，b加入的脂肪酸/产生的脂肪醇c产生的脂肪醇的峰面积。
实施例7.中链脂肪酯
醇乙酰转移酶(AATs，EC 2.3.1.84)，其负责各种植物中酰基乙酸酯的产生，可用于产生中等链长的脂肪酯，如辛酸辛酯、辛酸癸酯、癸酸癸酯等。从中链醇(如C6、C8)合成和中链酰基辅酶A(或者脂肪酸，如C6或者C8)的脂肪酯的熔点相对低。例如，己酸己酯具的熔点为-55℃，而辛酸辛酯的熔点为-18℃到-17℃。这些化合物的低熔点使它们成为生物燃料的良好候选物。
实施例8.中链脂肪酯
本实施例中，将编码硫酯酶的SAAT基因与大肠杆菌的fadD和acr1(来自不动杆菌ADP1的醇还原酶)在生产宿主C41(DE3，ΔfadE)中共表达。发酵液中提供了辛酸。这导致辛酸辛酯的生成。同样，当在生产宿主中表达不动杆菌ADP1的蜡合酶基因而不是SAAT基因时，产生辛酸辛酯。
利用DNA 2.0(Menlo Park，CA 94025)合成重组SAAT基因。合成的DNA基于公开的基因序列(登录号AF 193789)，并经修饰去除了NcoI 位点。将合成的SAAT基因(作为BamHI-HindIII片段)克隆入用BamHI和HindIII线性化的pRSET B(Invitrogen，Calsbad，California)。将所获质粒pHZ1.63A与pAS004.114B共转化于大肠杆菌生产宿主，该宿主载带有大肠杆菌的fadD基因和不动杆菌(A.baylyi)ADP1的acr1基因。将转化体培养于3mL含有2％葡萄糖的M9培养基中。在IPTG诱导和添加0.02％辛酸后，在25℃继续培养40小时。然后，向全培养物中添加3mL乙酰乙酸酯，并用混合器混合几次。利用GC/MS分析乙酰乙酸酯相。
令人惊讶的是，在乙酰乙酸酯提取物中没有发现酰基乙酸酯。但是，发现了辛酸辛酯。然而，不含SAAT基因的对照菌株[C41(DE3，ΔfadE)/pRSET B+pAS004.114B]未产生辛酸辛酯。菌株[C41(DE3，ΔfadE)/pHZ1.43B+pAS004.114B]也产生辛酸辛酯，其中pHZ1.43载有不动杆菌ADP1的蜡合酶基因(参见图9A-D)。
SAAT活性产生辛酸辛酯这一发现使制备中链蜡诸如辛酸辛酯、辛基癸酸成为可能，它们的熔点低，是取代基于甘油三酯的生物柴油的生物燃料的良好候选物。
实施例9.脂肪酯在大肠杆菌菌株LS9001中的产生
通过工程改造大肠杆菌生产宿主表达脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶、硫酯酶和酯合酶，产生脂肪酯。因此，生产宿主产生酯的A侧和B侧两者，而两侧的结构均受硫酯酶基因表达的影响。
利用不动杆菌ADP1的基因组DNA作为模板，通过下列引物扩增不动杆菌ADP1的酯合酶(称为WSadp1，登录号AA017391，EC：2.3.175)，所述引物是(1)WSadp1_NdeI，5’-TCATATGCGCCCATTACATCCG-3’和(2)WSadp1_Avr，5’-TCCTAGGAGGGCTAATTTAGCCCTTTAGTT-3’。
将PCR产物用NdeI和AvrII消化，并被克隆入pCOALDeut-1产生pHZ 1.43。随后，将携带WSadp1的质粒与pETDuet-1′tesA和pCDFDuet-1-fadD-acr1共转化入大肠杆菌菌株LS9001，并在添加50mg/L卡那霉素、50mg/L羧苄青霉素和100mg/L壮观霉素的LB板中 挑选转化体。
将3个转化体接种于3mL LBKCS(添加50mg/L卡那霉素、50mg/L羧苄青霉素、100mg/L壮观霉素和10g/L葡萄糖的LB培养液)，在37℃摇床(250rpm)上培养。当培养物达到0.5OD600时，将1.5mL每种培养物转移到250mL含有50mL LBKCS的烧瓶中。然后在37℃的振荡器(250rpm)上温育烧瓶，直至培养物达到0.5-1.0OD600。然后添加IPTG至1mM的终浓度。将所述诱导的培养物在37℃振荡器上再温育40-48小时。
然后将培养物放入50mL锥形管中，将细胞以3500×g离心10分钟。然后将细胞沉淀与5mL乙酸乙酯混合。利用GC/MS分析乙酸乙酯提取物。脂肪酯(包括C16C16、C14:1C16、C18: 1C18:1、C2C14、C2C16、C2C16:1、C16C16:1和C2C18:1)的胞内产量是约10mg/L。当以相同方式培养只载有空载体的大肠杆菌菌株时，在乙酸乙酯提取物中只发现了0.2mg/L的脂肪酯。
实施例10.脂肪-乙酯在生产宿主中的产生和释放
用携带不动杆菌(A.baylyi)的蜡合酶基因(质粒pHZ1.43)、萼距花的硫酯酶基因(质粒pMAL-c2X-TEcu)和大肠杆菌的fadD基因(质粒pCDFDuet-1-fadD)的质粒转化LS9001菌株。
将重组菌株培养于25℃、3mL含有50mg/L卡那霉素、100mg/L羧苄青霉素和100mg/L壮观霉素的M9培养基中生长。在IPTG诱导后，将培养基的终浓度调节为1％乙醇和2％葡萄糖。
IPTG诱导后让培养物生长40小时。通过在3500×g离心10分钟，从消耗的培养基分离细胞。将细胞沉淀重悬浮于3mL M9培养基。然后用1体积的乙酸乙酯提取细胞悬液和消耗的培养基。对来自细胞悬液和上清液的所的得乙酸乙酯相进行GC-MS分析。
C16乙酯是最主要的酯(与对这种硫酯酶的预期一致，参见表1)，并且生成脂肪酸酯的20％从细胞释放(参见图10)。含有pCOLADuet-1(蜡合酶基因的空载体)、pMAL-c2X-TEuc(含有加利福尼亚桂树的fatB)和pCDFDuet-1-fadD(大肠杆菌的fadD基因)的对照大肠杆菌菌株 C41(DE3，ΔfadE)未能产生可检测量的脂肪乙酯。利用商品化的棕榈酸乙酯作为参照定量脂肪酸酯。
除了向发酵液中添加甲醇或者异丙醇以外，还利用本文描述的方法制备脂肪酯，产生预期的脂肪酯。
实施例11.各种硫酯酶对重组大肠杆菌菌株产生的脂肪乙酯组合物的影响。
同时表达硫酯酶FatB3(萼距花)、TesA(大肠杆菌)和FatB(加利福尼亚桂树)与蜡合酶(不动杆菌(A.baylyi))。用pHZ1.43的NotI-AvrII片段替换NotI-AvrII片段(携带acr1基因)构建了称为pHZ1.61的质粒，从而使得fadD和ADP1蜡合酶位于同一质粒中，并且两条编码序列均处于分离的T7启动子控制下。pHZ1.61的构建使利用两质粒系统而不是实施例8描述的三质粒系统成为可能。然后将pHZ1.61与载有上述不同硫酯酶基因的各种质粒中的一种共转化大肠杆菌C41(DE3，ΔfadE)。
利用本文描述的技术测定这些转化体产生的总脂肪酸乙酯(上清液和胞内的脂肪酸乙酯)。脂肪酸乙酯的产量和组成概述于表14。
表14：重组大肠杆菌C41(DE3，ΔfadE)/pHZ1.61和携带各种硫酯酶基因的质粒产生的脂肪酸乙酯的产量(mg/L)和组成。
硫酯酶 C2C10 C2C12:1 C2C12 C2C14:1 C2C14 C2C16:1 C2C16 C2C18:1 总
‘TesA 0.0 0.0 6.5 0.0 17.5 6.9 21.6 18.1 70.5
ChFatB3 0.0 0.0 0.0 0.0 10.8 12.5 11.7 13.8 48.8
ucFatB 6.4 8.5 25.3 14.7 0.0 4.5 3.7 6.7 69.8
pMAL 0.0 0.0 0.0 0.0 5.6 0.0 12.8 7.6 26.0
注：‘TesA，pETDuet-1-‘tesA；chFatB3，pMAL-c2X-TEcu；ucFatB，pMAL-c2X-TEuc；pMAL，pMAL-c2X，用于本研究的硫酯酶的空载体。
实施例12.利用各种酯合酶产生生物柴油
根据NCBI GenBank报导的DNA序列，经小修饰，合成四个编码酯合酶的基因。所述修饰包括在不改变相应氨基酸序列的情况下，除去存在的内部NcoI、NdeI、HindIII和AvrII位点。合成的4个目标基因5’端 有NdeI位点，在3’端有AvrII位点。然后将所述序列克隆到pCOLADuet-1(Novagene)中的NdeI和AvrII位点，产生pHZ1.97-376、pHZ1.97-377、pHZ1.97-atfA1和pHZ1.97-atfA2。以下表15列出了携带4个目的基因之一的质粒和各自的GenBank登录号和GenPeptide登录号。
表15：酯合酶
质粒 LS9ID DNA序列的原始来源 GenBank# GenPeptide登录号
pHZ1.97-376 FES376(376) 海杆菌 (Marinobacter aquaeolei)VT8 CP000514.1 ABM17275
pHZ1.97-377 FES377(377) 海杆菌VT8 CP000514.1 ABM20141
pHZ1.97-atfA1 FESA1(AtfA1) 博克岛食烷菌SK2 NC_008260.1 YP_694462
pHZ1.97-atfA2 FESA2(AtfA2) 博克岛食烷菌SK2 NC_008260.1 YP_693524
将4个质粒中的每个都转化到大肠杆菌C41(DE3，ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-tesA+pCDFDuet-1-fadD中。挑出每次的转化三个转化体进行发酵，检测它们合成脂肪酸乙酯的能力。发酵如实施例9所述，但在两个不同温度(25℃或37℃)下进行。菌株C41(DE3，ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-tesA+pCDFDuet-1-fadD+pHZ 1.43(表达ADP1酯合酶)用作阳性对照，C41(DE3，ΔfadEΔfabR)/pETDuet-1-tesA+pCDFDuet-1-fadD作为阴性对照。
将4个酯合酶基因中的每个在大肠杆菌菌株中表达，该菌株的fadE和fabR活性弱化，并且超表达‘tesA和fadD，使得各个菌株在25℃产生约250mg/L的FAEE。这与表达ADP1的阳性对照产生的量相同。相反，阴性对照菌株在相同条件下、25℃产生少于50mg/L的FAEE(图11)。由这四种酯合酶产生的FAEE的脂肪酰基组成与ADP1酯合酶产生的FAEE脂肪酰基组成类似(图12)。
37℃下进行发酵的结果表明，携带pHZ1.97_aftA2的菌株和携带pHZ1.97_376的菌株比携带pHZ1.43的阳性对照产生更多的FAEE(图13)。携带pHZ1.97_aftA2的菌株和携带pHZ1.97_376的菌株还产生大量游离脂肪酸。而携带pHZ.143的菌株没有累积游离脂肪酸(图14)。 这些结果表明这四种酯合酶能够接受乙醇和广泛的酰基辅酶A作为底物。
实施例13.使用真核酯合酶产生生物柴油
本实施例描述了来自酿酒酵母的酯合酶的克隆和表达。采用标准分子生物学技术制备质粒。
表16：带有eeb1的质粒
命名 载体骨架 构建
pGL10.59 pCOLADuet-1(Novagen) eeb1*基因插入BamHI和HindIII位点之间(KanR)
pGL10.104 pMAL c2x(NEB) eeb1*基因插入BamHI和HindIII位点之间(AmpR)
pMAL-c2X-TEuc pMAL c2x(NEB) 参见上文表8
pCDFDuet-1-acr1 pCDFDuet-1(Novagen) 参见上文表8
*酿酒酵母基因eeb1(GenBank登录号YPL095C)由酿酒酵母基因组DNA序列PCR扩增，所用引物引入了5’BamHI和3’HindIII位点。
用大肠杆菌C41(DE3ΔfadE)生产宿主表达各种质粒。将大肠杆菌细胞培养于M9基本培养基(根据说明，6g/L Na2HPO4、3g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl、1mg/L硫胺(维生素B1)、1mM MgSO4、0.1mM CaCl2、0.4％(w/v)或2％(w/v)葡萄糖)。所有脂肪酸储备液通过将脂肪酸钠或钾盐溶于蒸馏的去离子水(pH7.0)制备。辛酸储备液购自Sigma，St.Louis，MO。
用含有质粒pCDFDuet-1-acr1、pMAL-c2X-TEuc(ucFatB)和pGL10.59(eeb1)的C41(DE3ΔfadE)菌株进行发酵。对照菌株是携带pCDFDuet-1-acr1、pMAL-c2X-TEuc和pCOLADuet-1空载体的C41(DE3ΔfadE)菌株。挑选每次转化的三个菌落接种M9+0.4％葡萄糖起子培养物(starter cultures)，所述培养物中添加了羧苄青霉素(100μg/mL)、壮观霉素(100μg/mL)和卡那霉素(50μg/mL)。将培养物于37℃过夜培养。将起子培养物1∶100稀释接种3mL M9培养基+0.4％葡萄糖建立制备培养物。将制备培养物于37℃培养至OD600＝0.6，然后用1mM IPTG诱导，添加1％乙醇，在25℃再培养40小时。用等体积的乙酸乙酯经剧烈涡旋30秒来提取总细胞培养物。取有机相，采用检测FAEE的alkane_1_splitless_ctc.m方法在GC/MS中运行，所述方法描述于上文实施例4的第2部分“样品#23-30中FA和FAEE的定量”。
任何样品中都没有检测到FAEE峰。为了确定是否恰当地表达了Eeb1，经SDS-PAGE分析IPTG诱导的和没有诱导的培养物。未能检测到对应Eeb1(～52kDa)大小的条带。这表明对于该特定质粒系统，Eeb1未被很好地表达。
使用不同表达载体进行了另外的表达试验。将基因克隆到载体pMALc2x中，该载体将靶蛋白表达为麦芽糖结合蛋白(maltose bindingprotein，MBP)融合体。对全细胞裂解物进行的SDS-PAGE分析揭示，用1mM IPTG诱导的培养物产生了与Eeb1-MBP融合体(～92kDa)对应的大小适当的条带。未经诱导的细胞中不存在该条带。
用携带质粒pCDFDuet-1-acr1和pGL10.104(eeb1)的C41(DE3ΔfadE)大肠杆菌菌株评价Eeb1的酶活性。带有pCDFDuet-1-acr1和pMALc2x的C41(DE3 ΔfadE)作为对照菌株。从每次转化中挑出3个菌落，用来接种添加了羧苄青霉素(100μg/mL)和壮观霉素(spectinomycin)(100μg/mL)的M9+0.4％葡萄糖过夜起子培养物。用起子培养物的1∶100稀释液接种10mL M9+0.4％葡萄糖制备培养物。将制备培养物在37℃培养，直到OD600＝0.4-0.5，然后用1mM IPTG诱导，添加1％乙醇，并添加辛酸(0.01％或0.02％终体积)或十二烷酸(0.02％终体积)。发酵在25℃继续24小时。向培养物中加入1/10体积的12M HCl和等体积乙酸乙酯，并涡旋30秒进行提取。如上所述，经GC/MS分析样品。
GC/MS数据显示，表达Eeb1、添加了辛酸和醇的细胞可以检测到对应辛酸乙酰酯的峰。载体对照菌株也显示C2C8峰，但是比Eeb1表达细胞的峰小。
添加0.02％十二烷酸的细胞生长情况不好，因此进行了以下使用 0.01％或0.005％十二烷酸的研究。为了检测Eeb1在合成脂肪酸酯中利用乙醇以外的醇的能力，使用相同的菌株进行发酵：带有pCDFDuet-1-acr1和pGL10.104的C41(DE3ΔfadE)。细胞如前所述进行培养。在诱导时，给细胞添加0.02％辛酸和1％甲醇、乙醇、丙醇或者异丙醇。还给细胞添加了0.01％或0.005％癸酸和1％乙醇。发酵在诱导后于25℃继续24小时。为了进行GC/MS，将培养物离心分出沉淀和上清液。将沉淀重悬浮于等体积的新鲜M9+0.4％葡萄糖培养液中。如上所述对重悬浮的沉淀和上清液进行提取，经GC/MS分析。
所有上清液样品均含有大量脂肪酸，且未检测到脂肪酸酯。同样，载体对照沉淀样品不含峰。但是，添加C10脂肪酸的细胞显示了峰，经鉴定为癸酸。
来源于表达Eeb1并添加C8脂肪酸和丙醇或乙醇的细胞的沉淀样品显示出对应丙酰或乙酰酯的小峰。添加甲醇或异丙醇的细胞未检测到峰。添加0.01％或0.005％C10脂肪酸和乙醇的培养物也产生了C2C10FAEE，其存在于沉淀样品中。
结果表明Eeb1能够利用辛酸或癸酸合成FAEE，也能够利用甲醇产生辛酸甲酯。但是，这些化合物是高等挥发性的，GC/MS数据可能不能准确地反映真实滴度。为了更准确地测量形成的产物，使用十六烷覆盖层来协助捕获这些挥发性更高的FAEE。
利用带有pCDFDuet-1-acr1和pGL10.104的菌株C41(DE3ΔfadE)，添加不同链长脂肪酸来评价Eeb1利用各种脂肪酸底物的活性。如前所述培养细胞，但在OD600＝0.8-0.9时进行诱导以促进诱导后细胞生长更好。在此时，给细胞添加1％乙醇和0.02％C8脂肪酸或者0.01％的以下脂肪酸：C10、C12、C14和C16。添加C8或C10脂肪酸的培养物用20％总体积的十六烷覆盖。发酵在25℃再进行24小时。为了分析产物，用培养物1/10体积的HCl和与培养物等体积的乙酸乙酯如上述对全培养物(不将上清与沉淀分开)进行提取。用hex_1_splitless_ctc.m程序直接将十六烷样品注射到GC/MS中，该程序描述于上文实施例4的第2部分“样品#23-30中FA和FAEE的定量”中。
载体对照均未显示任何FAEE峰。对于添加C8和C10的细胞，十六烷样品中可以检测到大的C2C8和C2C10峰，但乙酸乙酯样品中没有。这表明十六烷能够成功捕获挥发性的FAEE。对于其他乙酸乙酯样品，可以检测到C2C12和C2C14 FAEE的小峰，但没有C2C16峰。因此，Eeb1利用链长为C8-C14的脂肪酸产生乙酸乙酯。相比长链脂肪酸，Eeb1更偏好C8和C10。
实施例14.重组序列整合到基因组中产生超表达大肠杆菌fabA和/或fabB基因的宿主菌株
已知fabR基因的产物作为fabA和fabB基因表达的阻抑物。还知道FadR是相同基因的激活剂。Zhang et al.，J.Biol.Chem.277：15558-15565，2002公开了FabR及其预测的共有结合序列。图15显示了共有结合序列以及它们相对大肠杆菌的fabA和fabB基因的位置。
制备了大肠杆菌fabR敲除菌株。使用引物TrmA_R_NotI和FabR_FOP扩增fabR上游约1000bp，用引物SthA_F_Bam和FabR_ROP扩增fabR下游约1000bp(见表D)。采用重叠PCR制备了用于完整fabR基因框内缺失构建体。将fabR缺失构建体克隆到温度敏感质粒pKOV3中，该质粒含有用于反选择的SacB，按照Church及其同事的方法(Link et al.，J.Bact.179：6228-6237，1997)，制备fabR染色体缺失。
表17：fabR敲除引物
引物名称 引物序列(5’到3’)
TrmA_R-_Not ATAGTTTAGCGGCCGCAAATCGAGCTGGATCAGGATTA
FabR_FOP AGGATTCAGACATCGTGATGTAATGAAACAAGCAAATCAAGATAGA
SthA_F_Bam CGCGGATCCGAATCACTACGCCACTGTTCC
FabR_ROP TTGATTTGCTTGTTTCATTACATCACGATGTCTGAATCCTTG
实施例15.生产宿主的构建
表18鉴定了本文所述的许多基因的同源物，已知它们在产生生物 柴油、脂肪醇和烃的微生物中表达。为了增加诸如表18中鉴定的那些微生物的脂肪酸的产生，从而增加烃的产生，可以表达异源基因，如来自大肠杆菌的基因。本领域普通技术人员还应当理解，也可以利用本文描述的方法超表达或者弱化对于表18提供的微生物来说是内源性的基因。此外，可以在内源性产烃的微生物中表达、超表达或者弱化表18中所述的基因，以产生具有确定碳链长度、饱和点和分支点的特定烃。
表18：烃生产宿主
生物 基因名称 登录号/Seq ID/基因座 EC号
脱硫脱硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)G20 accA YP_388034 6.4.1.2
脱硫脱硫弧菌G22 accC YP_388573/YP_388033 6.3.4.14，6.4.1.2
脱硫脱硫弧菌G23 accD YP_388034 6.4.1.2
脱硫脱硫弧菌G28 fabH YP_388920 2.3.1.180
脱硫脱硫弧菌G29 fabD YP_388786 2.3.1.39
脱硫脱硫弧菌G30 fabG YP_388921 1.11100
脱硫脱硫弧菌G31 acpP YP_388922/YP_389150 3.1.26.3，1.6.5.3，1.6.99.3
脱硫脱硫弧菌G32 fabF YP_388923 2.3.1.179
脱硫脱硫弧菌G33 gpsA YP_389667 1.1.1.94
脱硫脱硫弧菌G34 ldhA YP_388173/YP_390177 1.1.1.27，1.1.1.28
梨火疫病菌(微球菌)(Erwinia(micrococcus)amylovora) accA 942060-943016 6.4.1.2
梨火疫病菌(微球菌) accB 3440869-3441336 6.4.1.2
梨火疫病菌(微球菌) accC 3441351-3442697 6.3.4.14，6.4.1.2
梨火疫病菌(微球菌) accD 2517571-2516696 6.4.1.2
梨火疫病菌(微球菌) fadE 1003232-1000791 1.3.99.-
梨火疫病菌(微球菌) plsB(D311E) 333843-331423 2.3.1.15
梨火疫病菌(微球菌) aceE 840558-843218 1.2.4.1
梨火疫病菌(微球菌) aceF 843248-844828 2.3.1.12
梨火疫病菌(微球菌) fabH 1579839-1580789 2.3.1.180
梨火疫病菌(微球菌) fabD 1580826-1581749 2.3.1.39
梨火疫病菌(微球菌) fabG CAA74944 1.1.1.100
梨火疫病菌(微球菌) acpP 1582658-1582891 3.1.26.3，1.6.5.3，1.6.99.3
梨火疫病菌(微球菌) fabF 1582983-1584221 2.3.1.179
梨火疫病菌(微球菌) gpsA 124800-125810 1.1.1.94
梨火疫病菌(微球菌) ldhA 1956806-1957789 1.1.1.27，1.1.1.28
Kineococcus radiotoleransSRS30216 accA ZP_00618306 6.4.1.2
Kineococcus radiotoleransSRS30216 accB ZP_00618387 6.4.1.2
Kineococcus radiotoleransSRS30216 accC ZP_00618040/ZP_00618387 6.3.4.14，6.4.1.2
Kineococcus radiotoleransSRS30216 accD ZP_00618306 6.4.1.2
Kineococcus radiotoleransSRS30216 fadE ZP_00617773 1.3.99.-
Kineococcus radiotoleransSRS30216 plsB(D311E) ZP_00617279 2.3.1.15
Kineococcus radiotoleransSRS30216 aceE ZP_00617600 1.2.4.1
Kineococcus radiotoleransSRS30216 aceF ZP_00619307 2.3.1.12
Kineococcus radiotoleransSRS30216 fabH ZP_00618003 2.3.1.180
Kineococcus radiotoleransSRS30216 fabD ZP_00617602 2.3.1.39
Kineococcus radiotoleransSRS30216 fabG ZP_00615651 1.1.1.100
Kineococcus radiotoleransSRS30216 acpP ZP_00617604 3.1.26.3，1.6.5.3，1.6.99.3
Kineococcus radiotoleransSRS30216 fabF ZP_00617605 2.3.1.179
Kineococcus radiotoleransSRS30216 gpsA ZP_00618825 1.1.1.94
Kineococcus radiotoleransSRS30216 ldhA ZP_00618879 1.1.1.28
深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum) accA YP_425310 6.4.1.2
深红红螺菌 accB YP_427521 6.4.1.2
深红红螺菌 accC YP_427522/YP_425144/YP_427028/YP_426209/YP_427404 6.3.4.14，6.4.1.2
深红红螺菌 accD YP_428511 6.4.1.2
深红红螺菌 fadE YP_427035 1.3.99.-
深红红螺菌 aceE YP_427492 1.2.4.1
深红红螺菌 aceF YP_426966 2.3.1.12
深红红螺菌 fabH YP_426754 2.3.1.180
深红红螺菌 fabD YP_425507 2.3.1.39
深红红螺菌 fabG YP_425508/YP_425365 1.1.1.100
深红红螺菌 acpP YP_425509 3.1.26.3，1.6.5.3，1.6.99.3
深红红螺菌 fabF YP_425510/YP_425510/YP_425285 2.3.1.179
深红红螺菌 gpsA YP_428652 1.1.1.94
1.1.1.27
深红红螺菌 ldhA YP_426902/YP_428871 1.1.1.28
弗尼斯弧菌 accA 1，16 6.4.1.2
弗尼斯弧菌 accB 2，17 6.4.1.2
弗尼斯弧菌 accC 3，18 6.3.4.14，6.4.1.2
弗尼斯弧菌 accD 4，19 6.4.1.2
弗尼斯弧菌 fadE 5，20 1.3.99.-
弗尼斯弧菌 plsB(D311E) 6，21 2.3.1.15
弗尼斯弧菌 aceE 7，22 1.2.4.1
弗尼斯弧菌 aceF 8，23 2.3.1.12
弗尼斯弧菌 fabH 9，24 2.3.1.180
弗尼斯弧菌 fabD 10，25 2.3.1.39
弗尼斯弧菌 fabG 11，26 1.1.1.100
弗尼斯弧菌 acpP 12，27 3.1.26.3，1.6.5.3，1.6.99.3
弗尼斯弧菌 fabF 13，28 2.3.1.179
弗尼斯弧菌 gpsA 14，29 1.1.1.94
弗尼斯弧菌 ldhA 15，30 1.1.1.27，1.1.1.28
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 accA ZP_01643799 6.4.1.2
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 accB ZP_01644036 6.4.1.2
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 accC ZP_01644037 6.3.4.14，6.4.1.2
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 accD ZP_01644801 6.4.1.2
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 fadE ZP_01645823 1.3.99.-
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 plsB(D311E) ZP_01644152 2.3.1.15
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 aceE ZP_01644724 1.2.4.1
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 aceF ZP_01645795 2.3.1.12
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 fabH ZP_01643247 2.3.1.180
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 fabD ZP_01643535 2.3.1.39
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 fabG ZP_01643062 1.1.1.100
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 acpP ZP_01643063 3.1.26.31.6.5.3，1.6.99.3
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 fabF ZP_01643064 2.3.1.179
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 gpsA ZP_01643216 1.1.1.94
嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3 ldhA ZP_01645395 1.1.1.28
集胞蓝细菌PCC6803 accA NP_442942 6.4.1.2
集胞蓝细菌PCC6803 accB NP_442182 6.4.1.2
集胞蓝细菌PCC6803 accC NP_442228 6.3.4.14，6.4.1.2
集胞蓝细菌PCC6803 accD NP_442022 6.4.1.2
集胞蓝细菌PCC6803 fabD NP_440589 2.3.1.39
集胞蓝细菌PCC6803 fabH NP_441338 2.3.1.180
集胞蓝细菌PCC6803 fabF NP_440631 2.3.1.179
集胞蓝细菌PCC6803 fabG NP_440934 1.1.1.100，3.1.26.3
集胞蓝细菌PCC6803 fabZ NP_441227 4.2.1.60
集胞蓝细菌PCC6803 fabl NP_440356 1.3.1.9
集胞蓝细菌PCC6803 acp NP_440632
集胞蓝细菌PCC6803 fadD NP_440344 6.2.1.3
细长聚球菌PCC7942 accA YP_400612 6.4.1.2
细长聚球菌PCC7942 accB YP_401581 6.4.1.2
细长聚球菌PCC7942 accC YP_400396 6.3.4.14，6.4.1.2
细长聚球菌PCC7942 accD YP_400973 6.4.1.2
细长聚球菌PCC7942 fabD YP_400473 2.3.1.39
细长聚球菌PCC7942 fabH YP_400472 2.3.1.180
细长聚球菌PCC7942 fabF YP_399556 2.3.1.179
细长聚球菌PCC7942 fabG YP_399703 1.1.1.100，3.1.26.3
细长聚球菌PCC7942 fabZ YP_399947 4.2.1.60
细长聚球菌PCC7942 fabl YP_399145 1.3.1.9
细长聚球菌PCC7942 acp YP_399555
细长聚球菌PCC7942 fadD YP_399935 6.2.1.3
对于表18，登录号来自于GenBank，截止到2007年4月15号的159.0发布，EC编号来自于KEGG，截止到2007年4月42.0发布(加上每日更新直至并包括05/09/07)，梨火疫病菌菌株Ea273的结果来自于Sanger测序中心，截止到5/9/07的完整鸟枪序列，欧文氏菌(Erwinia)的位置代表Sanger假染色体上的位置，弗尼斯弧菌M1的序列来自于LS9VFM1假染色体，v2建成(v2build)，截止到9/28/06，并且包括完整的基因，还可能包括侧翼序列。
实施例16.其他示例性生产菌株
表19提供了其他示例性生产菌株。描述了两种产生脂肪酸、脂肪醇和蜡酯的示例性生物合成途径。例如，表19提供了产生脂肪酸的实施例1和实施例2。实施例1中用于产生脂肪酸的生产宿主菌株是经工程改造具有合成酶活性(以各行中指示基因的“x”表示)的生产宿主细胞(见“x”指示乙酰辅酶A羧化酶、硫酯酶和酰基辅酶A合酶活性)。生产宿主细胞可以选自细菌、酵母和真菌。还可以将这些基因转化到经修饰含有一或多个图1所述的基因操作的生产宿主细胞内。如图19所示，可以利用指出的外源基因产生其他生产宿主。
表19：用于制备基因工程生产菌株的基因组合
实施例17.利用其他酰基辅酶A合酶过量产生酰基辅酶A
可以通过合成来自结核分枝杆菌HR7Rv(NP_217021，FadDD35)、枯草芽孢杆菌(NP_388908，YhfL)、酿酒酵母(NP_012257，Faa3p)和铜绿假单胞菌PAO1(NP_251989)的所需序列的密码子优化基因，在大肠杆菌中表达大肠杆菌fadD的同源物。可以设计合成基因使之包含NcoI和HindII相容突出端(compatable overhangs)。然后如上所述，将酰基辅酶A合酶克隆到经NcoI/HindIII消化的pTrcHis2载体中(InvitrogenCorp.，Carlsbad，California)，并在大肠杆菌菌株MG1655ΔfadE中表达。在大肠杆菌中表达后，酰基辅酶A的产量会提高。
脂肪酸衍生物(如FAEE)也可以这样产生，即用pTrcHis2载体中的各种酰基辅酶A与衍生自pCL1920的相容质粒共转化大肠杆菌菌株MG1655ΔfadE，后一个质粒含有来自不动杆菌(A.baylyi)的酯合酶或者来自萼距花的硫酯酶基因。所得生产宿主在含有乙醇的培养基中如上文所述培养时将产生FAEE。
实施例18.利用其他酰基辅酶A合酶过量产生酰基辅酶A
许多大肠杆菌FadD同源物的DNA序列或蛋白质序列已知。但是，仅有少数的生物化学特性已有描述。参见例如，Knoll et al.，J.Biol.Chem.269(23)：16348-56，1994；Shockey et al.，Plant Physiol.132：1065-1076，2003。而且，它们是否能以显著量的活性形式表达用于商业目的还不清楚。为了探索将异源酰基辅酶A合酶产生酯的可能性，如下所述克隆并表达了几种酰基辅酶A合酶基因。虽然本实施例描述了用单个质粒给生产宿主转化硫酯酶、酯合酶和酰基辅酶A合酶基因，但可以选择将这些基因整合到一个质粒中转化生产宿主。
1)pOP-80质粒的构建
为了超表达基因，用限制性酶AflII和SfoI(New England BioLabsInc.Ipswich，MA)消化携带强转录启动子的商品载体pCL1920(Lerner&Inouye，(1990)NAR 18：4631)，构建基于商品pCL1920的低拷贝质粒。所述消化步骤产生三个DNA序列片段。利用凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Inc.Valencia，CA)将3737bp的片段进行凝胶纯化。同时，用引物LF302(5’-atatgacgtcGGCATCCGCTTACAGACA-3’)和LF303(5’-aattcttaagTCAGGAGAGCGTTCACCGACAA-3’)经PCR扩增含有来自商品质粒pTrcHis2(Invitrogen，Carlsbad，CA)的trc启动子和lacI区域的DNA序列片段。这两个引物还在PCR产物末端分别引入ZraI(gacgtc)和AflII(cttaag)酶的识别位点。扩增后，用PCR纯化试剂盒(Qiagen，Inc.Valencia，CA)纯化PCR产物，并根据供应商的推荐用ZraI和AflII消化(New England BioLabs Inc.，Ipswich，MA)。消化后，将PCR产物凝胶纯化，与来源于pCL1920的3737bp DNA序列片段连接。用连接混合物转化TOP 10化学感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad， CA)后，在含有100μg/mL壮观霉素的Luria琼脂板上挑选转化体。37℃过夜培养后可以看到许多菌落。将存在于这些菌落中的质粒纯化，经限制酶分析，然后测序。保留了以此方式产生的一个质粒，命名为pOP-80，并用于进一步的表达试验。pOP-80的图谱如图17所示。
对质粒pOP-80中有关区域的DNA序列进行了确认。发现在两个片段连接的接合处每个末端丢失了3-4个碱基，这可能是因为外切核酸酶活性污染了限制酶之一所致。这些小的缺失有可能对任何相关质粒功能均无影响。将得到的质粒用于本实施例所述的所有表达试验。质粒的完整序列如SEQ ID NO：1(图18)所公开。
2)来自结核分枝杆菌HR7Rv的fadD35的克隆
利用以登录号NP_217021保存在NCBI的fadD35基因的蛋白质序列，由DNA 2.0Inc.(Menlo Park，CA)合成了大肠杆菌密码子优化的基因。合成基因在5’末端含有独特的NcoI位点，在3’末端含有独特的EcoRI位点。DNA 2.0Inc.提供的合成基因克隆在质粒pJ201：16084中。用NcoI和EcoRI消化这种质粒，释放fadD35基因。该片段的序列如SEQ ID NO：1所示。得到的DNA序列片段(SEQ ID NO：2，图19)与先用NcoI和EcoRI消化过的pOP-80连接。将连接混合物转化到TOP10化学感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，然后将细胞涂布在含有100μg/mL壮观霉素的Luria琼脂板上，37℃培养过夜。对第二天出现的菌落进行筛选，鉴定到含有正确质粒的菌株。该质粒命名为pDS9。
3)来自铜绿假单胞菌PAO1的fadD1的克隆
利用以登录号NP_121989保存在NCBI的fadD1基因的蛋白质序列，由DNA 2.0Inc.(Menlo Park，CA)合成了大肠杆菌密码子优化的基因。合成基因在5’末端含有独特的BspHI位点，在3’末端含有独特的EcoRI位点。DNA 2.0Inc.提供的合成基因克隆在质粒pJ201：16083中。用BspHI和EcoRI消化这种质粒释放fadD1基因。该片段的序列如SEQID NO：3(图20)所示。得到的DNA序列片段与先用NcoI和EcoRI消化过的pOP-80连接。将连接混合物转化到TOP10化学感受态细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中，然后将细胞涂布在含有100μg/mL壮观 霉素的Luria琼脂板上，37℃培养过夜。对第二天出现的菌落进行筛选，鉴定到含有正确质粒的菌株。该质粒命名为pDS8。
4)来自枯草芽孢杆菌的yhfL的克隆
用枯草芽孢杆菌I168染色体DNA序列作为模板，和根据以登录号NC_000964保存在NCBI的DNA序列设计的两个引物，经PCR，扩增yhfL基因。两个引物的序列是：
BsyhfLBspHIF：5’-CATCATGAATCTTGTTTC-3’(SEQ ID NO：4，图21)
BsyhfLEcoR：5’-CGGAATTCTTATTGGGGCAAAATATC-3’(SEQID NO：5，图22)
这两个引物在5’末端引入BspHI识别位点，在3’端引入EcoRI识别位点。用ZeroBlunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)将PCR产物直接克隆到pCR-BluntII-TOPO载体中。携带yhfL基因的质粒命名为pDS1。为了亚克隆yhfL，用BspHI和EcoRI消化质粒pDS1。将得到的DNA序列片段(SEQ ID NO：6，图23)凝胶纯化，克隆到先用NcoI和EcoRI消化的pOP-80中。携带克隆到pOP-80中的枯草芽孢杆菌yhfL基因的质粒命名为pDS4。
5)来自酿酒酵母的faa3p(NP_012257)的克隆
用商品酿酒酵母染色体DNA序列ATCC 204508D(美国典型培养物保藏中心American Type Culture Collection，Manassas，VA)作为模板，和根据以登录号NC_001141保存在NCBI的DNA序列设计的两个引物，经PCR，扩增faa3p基因。两个引物的序列是：
Scfaa3pPciF：5’-CGACATGTCCGAACAACAC-3’(SEQ ID NO：7，图24)
Scfaa3pPciI：5’-GCAAGCTTCTAAGAATTTTCTTTG-3’(SEQ IDNO：8，图25)
两个引物在5’末端引入PciI识别位点，在3’端引入HindIII识别位点。
用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)将PCR产物直接克隆到pCR-Blunt II-TOPO载体中。携带faa3p基因的质粒命名为pDS2。为了亚克隆faa3p，用PciI和HindIII消化质粒pDS2。经DNA序列片段(SEQ ID NO：9，图26)凝胶纯化，并克隆到先用NcoI和HindIII消化的pOP-80中。携带克隆到pOP-80中的酿酒酵母faa3p基因的质粒命名为pDS5。
6)嗜麦芽窄食单胞菌R551-3的ZP_01644857的克隆
作为基因座NZ_AAVZ01000044的一部分，蛋白质ZP_01644857的结构基因序列可从NCBI获得。用嗜麦芽窄食单胞菌R551-3染色体DNA序列作为模板，和根据保藏存的DNA序列设计的两个引物，经PCR扩增所述基因。两个引物的序列是：
Smprk59BspF：5’-AGTCATGAGTCTGGATCG-3’(SEQ ID NO：10，图27)
Smprk59HindR：5’-GGAAGCTTACGGGGCGGGCG-3’(SEQ IDNO：11，图28)
这两个引物在5’末端引入BspHI识别位点，在3’端引入HindIII识别位点。
用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)将PCR产物直接克隆到pCR-Blunt II-TOPO载体中。携带编码蛋白质ZP_01644857的基因的质粒命名为pDS3。为了协助该基因的进一步亚克隆，用引物PrkBsp-(5’-GCGAACGGCCTGGTCTTTATGAAGTTCGGTGG-3’)(SEQ IDNO：12，图29)和QuikChange多点定位诱变试剂盒(QuikChange MultiSite-Directed mutagenesis kit，Stratagene，La Jolla，CA)，通过定位诱变将内部的BspHI位点除去。经DNA测序确认突变正确后，用BspHI和HindIII消化所得质粒，并命名为pDS6。DNA序列片段(SEQ IDNO：13，图30)经凝胶纯化，克隆到先用NcoI和HindIII消化的pOP-80中。携带克隆到pOP-80中的编码蛋白质ZP_01644857的基因的质粒命名为pDS7。ZP_01644857的蛋白序列如SEQ ID NO：14(图31)所示。
7)产生脂肪酯的菌株的构建
首先分别用携带大肠杆菌tesA基因的pETDuet-1-tesA质粒(实施例2中描述)和携带atfA2酯合酶基因的pHZ1.97质粒(实施例12描述)转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。两个基因都在可以受IPTG诱导的T7启动子控制下。携带两个质粒的两个独立转化体用带有异源fadD基因的重组质粒转化，在含有100μg/mL羧苄青霉素、50μg/mL卡那霉素和100μg/mL壮观霉素的Luria琼脂板上挑选。检测带有三个质粒的三个独立菌落的脂肪酸酯产生。
8)利用来自嗜麦芽窄食单胞菌R551-3的ZP_01644857产生的脂肪酯的分析
为了评价来自嗜麦芽窄食单胞菌R551-3的蛋白质ZP_01644857在生产宿主产生脂肪酯的用途，用携带大肠杆菌tesA基因的质粒pETDuet-1-tesA(实施例2中描述)、携带atfA2酯合酶基因的质粒pHZ1.97(实施例12描述)以及携带编码蛋白质ZP_01644857的基因的质粒pDS7(本实施例上面描述)转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。如实施例13所述将生产宿主发酵产生脂肪酯。作为对照，将含有质粒pETDuet-1-tesA、pHZ1.97和pCL1920的第二个大肠杆菌菌株BL21(DE3)ΔfadE作为生产宿主产生脂肪酯。
下文的表20显示了这些生产宿主的脂肪酯产量。
表20.产生ZP_01644857的生产宿主的脂肪酸酯产量
酯类型： C2C12:1mg/L C2C12:0mg/L C2C14:1mg/L C2C14:0mg/L C2C16:1mg/L C2C16:0mg/L C2C18:1mg/L C2C18:0mg/L 总计mg/c
对照a 0.0 0.0 0.0 1.78 9.80 5.65 33.7 0.00 50.93
fadDZP_01644857b 1.49 3.57 3.68 33.22 52.77 43.09 91.11 10.08 239.01
a对照：含有质粒pETDuet-1-tesA、pHZ1.97和pCL1920的菌株BL21(DE3)DfadE。
b含有质粒pETDuet-1-tesA、pHZ1.97和pDS7的菌株BL21(DE3)D fadE。
c这些数值代表3个培养物的均值。
实施例19.β-氧化的下调
本实施例描述了大肠杆菌菌株MG1655ΔfadEΔydiO的构建。
可以通过弱化上文所述的任何β-氧化酶反应(见图3)来消除或弱化脂肪酸的降解。例如，可以用引物扩增ydiO上游，并用其他引物扩增ydiO下游来进一步工程改造大肠杆菌菌株MG1655ΔfadE。然后可以利用重叠PCR构建完整ydiO基因框内缺失的构建体。然后将ydiO 缺失构建体克隆到温度敏感型质粒pKOV3中，该质粒含有用于反选择的sacB基因，按照Link et al.，J.Bact.179：6228-6237，1997的方法，制备ydiO染色体缺失。所得菌株不能降解脂肪酸和脂肪酰辅酶A。Campbell et al.，Mol.Microbiol.47：793-805，2003中描述了产生fadE和ydiO双敲除的其他方法。
还可能通过使用不含有β-氧化途径的生产宿主来避免脂肪酸降解。例如，链球菌的几个种已被测序，未发现任何参与β-氧化的基因。
实施例20.其他酯合酶的鉴定
本实施例提供了其他一些酯合酶，以及使用这些合酶产生脂肪酯的方法。
利用生物信息学鉴定到另外一些酯合酶。这些酯合酶含有与其他已知基序不同的基序，如ADP1中发现的基序。下文表21指出了基序中的差异。
表21：酯合酶基序的比较
ADP1-基序 HHAXVDGV NDVVLA GALRXYL PLXAMVP ISNVPGP REPLYXNGA
假定的蛋白BCG 3544c[牛型结核分枝杆菌(MycobacteriumbovisBCGstr.Pasteur1173P2)]gi/121639399 HHSLIDGY NDVALA GGLRRFL SLIVVLP VSNVPGP EDVLYLRGS
功能未知的蛋白UPF0089[Mycobacteriumgilvum PYR-GCK]gi/145221651 HHALVDGY NDVALA GGLRKFL SLIAFLP VSNVPGP REPLYFNGS
功能未知的蛋白UPF0089[Mycobacteriumvanbaalenii PYR-1]gi/120406715 HHALVDGY NDVALA GGLRKFL SLIAFLP VSNVPGP REPLYFNGS
鉴定的序列可以采用标准分子生物学技术进行克隆。这些序列可以用本文描述的载体克隆，并用于制备各种脂肪酯。基序还可以用于鉴定其他酯合酶。
实施例21.产物表征
为了表征和定量脂肪醇和脂肪酯，采用了电子碰撞质谱(MS)与气相色谱(GC)联合的检测法。首先用过量的的N-三甲基硅烷(TMS)咪唑将脂肪醇样品衍生化以增加检测灵敏度。脂肪酯不需要衍生化。将脂肪醇-TMS衍生物和脂肪酯溶于合适的挥发性溶剂如乙酸乙酯中。
利用以下方法在30m DP-5毛细管柱上分析样品。无分流注射1μL到GC/MS柱后，烘箱保持在100℃3分钟。以20℃/分钟的速率将温度升至320℃。烘箱在320℃再保持5分钟。载气氦气的流速是1.3mL/分钟。MS四极在50-550m/z扫描。将产物峰的保留时间和裂解谱与可靠参照进行比较以证实峰的身份。
例如，十六烷酸乙酯在10.18分钟洗脱(图16A和图16B)。很容易观察到284质量单位的母离子。更多的是质谱裂解期间产生的子离子。这包括最普遍的80质量单位的子离子。衍生化脂肪醇十六醇-TMS在10.29分钟洗脱，可以观察到313的母离子。最普遍的离子是299质量单位的M-14离子。
利用如上所述的GC/MS方法，通过注射各种浓度的合适可靠参照进行定量。利用这个信息绘制了应答(总离子计数)相对浓度的标准曲线。
等同体
虽然本文中明确公开了本发明的具体实例，以上说明书和文中的实施例只是说明性的，而非限制性的。在参阅本说明书包括实施例后，本发明的许多变化对本领域技术人员来说是显而易见的。本发明的全部范围应该参考实施例、它们的等同体的全部范围以及说明书和这些变化来确定。
本申请引用的所有出版物、专利、专利申请以及其他参考文献在此通过引用全文并入，如同每个出版物、专利、专利申请或其他参考文献都特别和单独指出通过引用并入。

Claims (41)

1.用于产生脂肪醇的重组微生物细胞，其包含编码酰基辅酶A合酶即fadD的基因、编码酰基辅酶A还原酶的基因和编码硫酯酶的基因，其中所述基因被超表达。
2.如权利要求1所述的重组微生物细胞，还包含编码乙酰辅酶A羧化酶的基因。
3.如权利要求1所述的重组微生物细胞，其中硫酯酶是tesA、‘tesA、fatB、fatB1、fatB2或fatB3。
4.如权利要求1所述的重组微生物细胞，其中酰基辅酶A还原酶是acr1、acrM或BmFAR。
5.如权利要求1所述的重组微生物细胞，其中所述基因是外源的。
6.如权利要求1所述的重组微生物细胞，其中所述细胞是酿酒酵母、解脂假丝酵母、大肠杆菌、节杆菌、粘红酵母、不动杆菌、解脂假丝酵母、布朗葡萄藻、弗尼斯氏弧菌、藤黄微球菌、嗜麦芽窄食单胞菌或枯草芽孢杆菌细胞。
7.如权利要求6所述的重组微生物细胞，其中所述细胞是节杆菌AK 19细胞、不动杆菌菌株M-1细胞、大肠杆菌B细胞、大肠杆菌C细胞、大肠杆菌K细胞或者大肠杆菌W细胞。
8.如权利要求1所述的重组微生物细胞，其中所述细胞是蓝细菌细胞。
9.如权利要求8所述的重组微生物细胞，其中所述蓝细菌细胞是集胞蓝菌PCC6803细胞或细长聚球菌PCC7942细胞。
10.如权利要求1所述的重组微生物细胞，其中所述细胞是来自细菌、酵母或者丝状真菌的微生物细胞。
11.能产生脂肪醇的重组微生物细胞，其中所述细胞经修饰包括一个或多个外源核酸序列，所述外源核酸序列包括酰基辅酶A合酶即fadD基因、酰基辅酶A还原酶基因和硫酯酶基因。
12.如权利要求11所述的重组微生物细胞，其中所述外源核酸序列还包括乙酰辅酶A羧化酶基因。
13.如权利要求11所述的重组微生物细胞，其中所述细胞是来自细菌、酵母或者丝状真菌的微生物细胞。
14.如权利要求11所述的重组微生物细胞，其中所述外源核酸序列来自节杆菌、粘红酵母、不动杆菌、博克岛食烷菌或者解脂假丝酵母。
15.如权利要求11所述的重组微生物细胞，其中所述细胞是节杆菌AK 19细胞、不动杆菌菌株M-1细胞、大肠杆菌B细胞、大肠杆菌C细胞、大肠杆菌K或者大肠杆菌W细胞。
16.如权利要求1所述的重组微生物细胞，其中所述基因经修饰从而在所述重组细胞中的表达被优化。
17.如权利要求1所述的重组微生物细胞，其中所述酰基辅酶A合酶基因是fadD、fadD1、fadD2、fadDD35或fadDD22。
18.如权利要求17所述的重组微生物细胞，其中所述酰基辅酶A合酶基因是来自结核分枝杆菌HR7Rv的fadDD35登录号NP_217021、或来自铜绿假单胞菌PAO1的fadD1登录号NP_251989。
19.如权利要求1所述的重组微生物细胞，其中所述硫酯酶基因是tesA、‘tesA、tesB、fatB、fatB1、fatB2、fatB3、fatA或fatA1。
20.如权利要求1所述的重组微生物细胞，其还包含pdh、panK、aceEF、fabH、fabD、fabG、acpP和fabF基因中的至少一个，所述基因经修饰表达或超表达。
21.如权利要求1所述的重组微生物细胞，其还包含fadE、gpsA、ldhA、pflB、adhE、pta、poxB、ackA和ackB基因中的至少一个，所述基因经修饰表达弱化。
22.如权利要求1所述的重组微生物细胞，其还包含经修饰的plsB和sfa基因中的至少一个。
23.如权利要求1或2所述的重组微生物细胞，其中编码酰基辅酶A脱氢酶的基因缺失。
24.在重组细胞中产生脂肪醇的方法，其包括：
a)获得权利要求1所述的重组微生物细胞；
b)在适合表达的条件下，培养所述重组微生物细胞，以及
c)产生脂肪醇。
25.在重组细胞中产生脂肪醇的方法，其包括：
a)获得权利要求2所述的重组微生物细胞；
b)在适合表达的条件下，培养所述重组微生物细胞，以及
c)产生脂肪醇。
26.提高重组微生物细胞中脂肪醇产量的方法，其包括将一个或多个编码至少一种脂肪酸衍生物酶的外源核酸序列导入细胞，以及表达所述外源核酸序列，其中所述核酸序列在所述重组微生物细胞中的表达导致脂肪醇的产量相对非重组细胞得以提高，其中所述外源核酸序列编码酰基辅酶A合酶即fadD、酰基辅酶A还原酶和硫酯酶。
27.包含一个或多个编码至少一种脂肪酸衍生物酶的核酸序列的重组构建体，其中所述核酸序列经修饰超表达编码酰基辅酶A合酶即fadD、酰基辅酶A还原酶和硫酯酶的基因。
28.如权利要求27所述的重组构建体，其中所述核酸序列经修饰超表达所述基因。
29.如权利要求27所述的重组构建体，其中所述构建体还包含编码酰基辅酶A脱氢酶的核酸序列，所述核酸序列经修饰使得酰基辅酶A脱氢酶的表达弱化。
30.包含权利要求27-29中任一项所述重组构建体的载体。
31.如权利要求30所述的载体，其中所述载体还包含用于选择转化细胞的结构基因。
32.提高微生物生产宿主细胞中脂肪醇产量的方法，其包括：
用编码酰基辅酶A合酶即fadD、酰基辅酶A还原酶和硫酯酶的核苷酸序列转化所述生产宿主细胞，从而所述生产宿主细胞表达或超表达酰基辅酶A合酶即fadD、酰基辅酶A还原酶和硫酯酶，其中脂肪醇在生产宿主细胞中的产量相对未转化的生产宿主细胞得以提高。
33.如权利要求32所述的方法，其中收获并裂解所述生产宿主细胞以获得所产生的脂肪醇。
34.如权利要求32所述的方法，其中用编码转运蛋白的核苷酸序列转化所述生产宿主细胞，并且所述生产宿主细胞将脂肪醇释放到胞外。
35.包含一个或多个编码至少一种脂肪酸衍生物酶的核酸序列的载体，所述核酸序列可操作地连接于在微生物宿主细胞中发挥作用的启动子，其中所述核酸序列包含编码酰基辅酶A合酶即fadD的第一核酸序列、编码酰基辅酶A还原酶的第二核酸序列和编码硫酯酶的第三核酸序列。
36.如权利要求35所述的载体，其中所述载体还包含编码乙酰辅酶A羧化酶的第四核酸序列。
37.如权利要求36所述的载体，其还包含编码转运蛋白的核酸序列。
38.制备脂肪醇的方法，其包括：
(a)提供包含权利要求35所述载体的微生物生产宿主细胞，以及
(b)培养所述微生物生产宿主细胞以产生脂肪醇。
39.制备脂肪醇的方法，其包括：
(a)提供包含权利要求36所述载体的微生物生产宿主细胞，以及
(b)培养所述微生物生产宿主细胞以产生脂肪醇。
40.如权利要求38所述的方法，其中收集来自微生物生产宿主细胞培养物的上清液从而获得所产生的脂肪醇。
41.如权利要求39所述的方法，其中收集来自微生物生产宿主细胞培养物的上清液从而获得所产生的脂肪醇。
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