CN101189223A - 丙型肝炎病毒抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明总的说来涉及抗病毒化合物，更具体的说，涉及这样的化合物，所述化合物抑制由丙型肝炎病毒(HCV)编码的NS3蛋白酶(在本文中还称为“丝氨酸蛋白酶”)的功能，本发明还涉及含上述化合物的组合物，以及抑制NS3蛋白酶的功能的方法。
Description
本公开内容总的说来涉及抗病毒化合物，更具体的说，涉及这样的化合物，所述化合物抑制由丙型肝炎病毒(HCV)编码的NS3蛋白酶(在本文中还称为“丝氨酸蛋白酶”)的功能，含上述化合物的组合物，以及抑制NS3蛋白酶的功能方法。
HCV是一种主要的人类病原体，其估计感染了全世界1.7亿人，约为人类免疫缺陷性病毒I型所感染的数目的5倍。这些HCV感染的个体中的绝大部分形成了严重的渐进性肝病，包括肝硬化和肝细胞癌。(Lauer，G.M.；Walker，B.D.N.Engl.J.Med.2001，345，41-52)。
不久，最有效的HCV疗法使用了α-干扰素和三氮唑核苷的结合，这在40％的病人中获得了持续的疗效(Poynard，T.等Lancet 1998，352，1426-1432)。最近的临床结果显示了聚乙二醇α-干扰素优于未改性的α-干扰素作为单一疗法(Zeuzem，S.等N.Engl.J.Med.2000，343，1666-1672)。然而，即使凭借包含聚乙二醇修饰的(pegylated)α-干扰素和三氮唑核苷的结合的实验性治疗方案，绝大部分病人没有持续减少病毒负载量。因而，存在着明确的且未得到满足的开发有效的用于治疗HCV传染的治疗方法的需要。
HCV是一种正链RNA病毒。基于推断的氨基酸序列和5’非翻译区中广泛的相似性的比较，已经将HCV分类为黄病毒科中单独的种。全部黄病毒科的成员都已封装了病毒体，这些病毒体包含正链RNA基因组，其通过单个连续的可译框架的翻译编码了全部已知的病毒特定的蛋白质。
在HCV基因组中，在核苷酸和所编码的氨基酸序列内存在着显著的异质性。已经表征了六种主要的基因型，并且描述了50种以上的亚型。在全世界，HCV的主要基因型在其分布方面不同，并且尽管大量研究了基因型对发病机理和治疗方法的可能的作用，但是HCV的遗传异质性的临床意义仍然难以捉摸。
单链HCV RNA基因组在长度上约为9500个核苷酸，并且具有编码约3000个氨基酸的单个大型多蛋白的单个可译框架(ORF)。在受感染细胞中，这种多蛋白在多个位点被细胞蛋白酶和病毒蛋白酶裂解从而产生结构性和非结构性(NS)蛋白质。就HCV来说，成熟的非结构性蛋白质(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的产生受到两种病毒蛋白酶的影响。第一种蛋白酶在NS2-NS3连接点处裂解；第二种蛋白酶是含于NS3的N-末端范围内的丝氨酸蛋白酶，并且介导NS3下游的全部随后的裂解，在NS3-NS4A裂解位点处为顺式，对于其余的NS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B位点，为反式。NS4A蛋白质似乎起到多种功能，作为NS3蛋白酶的辅助因子并且可能有助于NS3和其它病毒复制酶组分的膜定位。NS3蛋白质与NS4A的络合形成对于有效的多蛋白加工来说是必需的，强化了在所有位点处的溶蛋白性裂解。NS3蛋白质还显示出核苷三磷酸酶和RNA解旋酶活性。NS5B是一种依赖于RNA的RNA聚合酶，其涉及HCV的复制。
本公开内容的第一方面提供通式(I)的化合物
或者其药学可接受的盐，其中
L不存在或者是-C(O)-；
R1是杂芳基或杂环基，其中杂芳基和杂环基任选地被一个、两个、三个、四个、五个或六个独立地选自以下的取代基取代：烷氧基、烷氧羰基、烷氧基羰氧基、烷基、烷基硫烷基(alkylsulfanyl)、芳基、芳基烷氧基、羧基、氰基、环烷基、卤素、卤烷氧基、卤代烷基，杂芳氧基、杂芳基、杂芳基羰基、杂环基、羟基、巯基、-NRaRb、(NRaRb)烷基和(NRcRd)羰基；
R2选自氢、链烯基、烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷基、烷基氨基烷基、氨基烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、二烷基氨基烷基、卤代烷氧基烷基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基和杂环基烷基；
R3选自氢和R5-NH-C(O)-；
R4选自氢、链烯基、烷基、环烷基、卤代链烯基和卤代烷基；
R5选自烷基、芳基、芳基烷基、羧基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷氧基烷基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基和杂环基烷基；
Ra和Rb之一选自氢、烷氧羰基、烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、芳基烷基、芳基羰基、芳基磺酰基、环烷基、甲酰基和(NRcRd)羰基，而另一个选自氢、烷基和环烷基；
Rc和Rd各自独立地选自氢和烷基；
和
W选自羟基和-NH-SOn-R6，其中n是1或2并且R6选自烷基、芳基、环烷基、(环烷基)烷基、杂芳基、杂环基和-NRaRb。
在第一方面的一个实施方案中，本公开内容提供了通式(I)的化合物，其中R3是氢。
在第一方面的另一实施方案中，本公开内容提供了通式(I)的化合物，其中R3是R5-NH-C(O)-。
在第一方面的另一实施方案中，本公开内容提供了通式(I)的化合物，其中R3是R5-NH-C(O)-；和W是-NH-SOn-R6。
在第一方面的另一实施方案中，本公开内容提供了通式(I)的化合物，其中R3是R5-NH-C(O)-；W是-NH-SOn-R6和L是-C(O)-。
在第一方面的另一实施方案中，本公开内容提供了通式(I)的化合物，其中R3是R5-NH-C(O)-；W是-NH-SOn-R6；L是-C(O)-；和R1是
其中
R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、烷氧基、烷氧羰基、烷氧基羰氧基、烷基、烷基硫烷基、芳基、芳基烷氧基、羧基、氰基、环烷基、卤素、卤烷氧基、卤代烷基、杂芳氧基、杂芳基、杂芳基羰基、杂环基、羟基、巯基、-NRaRb、(NRaRb)烷基和(NRcRd)羰基。
在第一方面的另一实施方案中，本公开内容提供了通式(I)的化合物，其中R3是R5-NH-C(O)-；W是-NH-SOn-R6；L是-C(O)-；和R1是
其中R7、R8、R9、R10、R11和R12之一是卤素并且其余的是氢。
在第一方面的另一实施方案中，本公开内容提供了通式(I)的化合物，其中R3是R5-NH-C(O)-；W是-NH-SOn-R6；并且L不存在。
在第一方面的另一实施方案中，本公开内容提供了通式(I)的化合物，其中R3是R5-NH-C(O)-；W是-NH-SOn-R6；L不存在；和R1是
其中R7、R8、R9和R10独立地选自氢、烷氧基、烷氧羰基、烷氧基羰氧基、烷基、烷基硫烷基、芳基、芳基烷氧基、羧基、氰基、环烷基、卤素、卤烷氧基、卤代烷基、杂芳氧基、杂芳基、杂芳基羰基、杂环基、羟基、巯基、-NRaRb、(NRaRb)烷基和(NRcRd)羰基。
在第一方面的另一实施方案中，本公开内容提供了通式(I)的化合物，其中R3是R5-NH-C(O)-；W是-NH-SOn-R6；L不存在；和R1是
其中
X选自N和CR12；
Y选自N和CH；和
R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、烷氧基、烷氧羰基、烷氧基羰氧基、烷基、烷基硫烷基、芳基、芳基烷氧基、羧基、氰基、环烷基、卤素、卤烷氧基、卤代烷基、杂芳氧基、杂芳基、杂芳基羰基、杂环基、羟基、巯基、-NRaRb、(NRaRb)烷基和(NRcRd)羰基。
本公开内容的第二方面提供了通式(II)的化合物
或者其药学可接受的盐，其中
R1选自
L不存在或者是-C(O)-；
X选自N和CR12；
Y选自N和CH；和
R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立地选自氢、烷氧基、芳基、卤素和杂芳基；
R2选自烷氧基烷基、烷基、芳基、环烷基、(环烷基)烷基和杂芳基烷基；
R3选自氢和R5-NH-C(O)-；
R4是链烯基或烷基；
R5选自链烯基、烷基、芳基、环烷基和杂芳基烷基；
R6选自芳基、环烷基、杂芳基和-NRaRb；和
Ra和Rb是烷基。
在第二方面的一个实施方案中，本公开内容提供了通式(II)的化合物，其中R3是氢。
在第二方面的另一实施方案中，本公开内容提供了通式(II)的化合物，其中R3是R5-NH-C(O)-。
在第三方面中，本公开内容提供了一种组合物，其包括通式(I)的化合物或者其药学可接受的盐和药学可接受的载体。
在第三方面的另一实施方案中，本公开内容提供了一种组合物，其包括通式(I)的化合物或者其药学可接受的盐、药学可接受的载体、干扰素和三氮唑核苷。
在第三方面的另一实施方案中，本公开内容提供了一种组合物，其包括通式(I)的化合物或者其药学可接受的盐、药学可接受的载体和具有抗HCV活性的第二化合物。
在第三方面的另一实施方案中，具有抗HCV活性的第二化合物是干扰素。
在第三方面的另一实施方案中，所述干扰素选自干扰素α-2B、聚乙二醇修饰的干扰素α、组合干扰素、干扰素α-2A和淋巴细胞样干扰素τ。
在第三方面的另一实施方案中，具有抗HCV活性的第二化合物选自白介素2、白介素6、白介素12、强化I型辅助性T细胞响应的形成的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特(Imiqimod)、三氮唑核苷、次黄嘌呤核苷5′-单磷酸盐(monophospate)脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚烷乙胺。
在第四方面中，本公开内容提供了一种抑制HCV丝氨酸蛋白酶的功能的方法，其包括使HCV丝氨酸蛋白酶与通式(I)的化合物或者其药学可接受的盐接触。
在第五方面中，本公开内容提供了一种治疗在患者体内HCV感染的方法，其包括将治疗有效量的通式(I)的化合物或者其药学可接受的盐给予患者。
在第五方面的一个实施方案中，所述化合物有效抑制HCV丝氨酸蛋白酶的功能。
在第五方面的另一实施方案中，所述方法还包括在通式(I)的化合物或者其治疗可接受的盐之前、之后或者和其同时给予具有抗HCV活性的第二化合物。
在第六方面的另一实施方案中，具有抗HCV活性的第二化合物是干扰素。
在第六方面的另一实施方案中，所述干扰素选自干扰素α-2B、聚乙二醇修饰的干扰素α、组合干扰素、干扰素α-2A和淋巴细胞样干扰素τ。
在第六方面的另一实施方案中，所述方法还包括在通式(I)的化合物或者其治疗可接受的盐之前、之后或者和其同时给予具有抗HCV活性的第二化合物，其中具有抗HCV活性的第二化合物选自白介素2、白介素6、白介素12、强化I型辅助性T细胞响应形成的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特(Imiqimod)、三氮唑核苷、次黄嘌呤核苷5′-单磷酸盐(monophospate)脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚烷乙胺。
在第七方面中，本公开内容提供了通式(I)的化合物或者其药学可接受的盐在制造用于治疗患者体内HCV感染的药物中的用途。
在第八方面中，本公开内容提供了含通式(I)的化合物或者其药学可接受的盐和药学可接受的载体的组合物在制造用于治疗患者体内HCV感染的药物中的用途。
除非在本文中另外具体指出的，以下所述的术语将具有如下定义。
如本文中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”等包括复数对象，除非上下文明确要求以外。
术语“链烯基”，如本文中所用，是指含至少一个碳-碳双键的2-8个碳原子的直链或支链基团。
术语“烷氧基”，如本文中所用，是指通过氧原子连接于母体分子部分的烷基。
术语“烷氧基烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个烷氧基取代的烷基。
术语“烷氧羰基”，如本文中所用，是指通过羰基连接于母体分子部分的烷氧基。
术语“烷氧基羰基烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个烷氧羰基取代的烷基。
术语“烷氧基羰氧基”，如本文中所用，是指通过氧原子连接于母体分子部分的烷氧羰基。
术语“烷基”，如本文中所用，是指衍生自含1-8个碳原子的直链或支链饱和烃的基团。
术语“烷基氨基”，如本文中所用，是指-NRxRy，其中Rx和Ry之一是氢和另一个是烷基。
术语“烷基氨基烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个烷基氨基取代的烷基。
术语“烷基羰基”，如本文中所用，是指通过羰基连接于母体分子部分的烷基。
术语“烷基硫烷基”，如本文中所用，是指通过硫原子连接于母体分子部分的烷基。
术语“烷基磺酰基”，如本文中所用，是指通过磺酰基连接于母体分子部分的烷基。
术语“氨基”，如本文中所用，是指-NH2。
术语“氨基烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个氨基取代的烷基。
术语“芳基”，如本文中所用，是指苯基或者双环稠环系统，其中环中的一个或两个是苯基。双环稠环系统包括稠合到四-六元的芳族或者非芳族碳环的苯基。本公开内容的芳基可以通过基团中任何可取代的碳原子连接于母体分子部分。芳基典型的实例包括但不局限于茚满基、茚基、萘基、苯基和四氢萘基。本公开内容的芳基可以任选地被一个、两个、三个、四个或者五个独立地选自以下的取代基取代：烷氧基、烷基、第二芳基、羧基、羧基烷氧基、羧基烷基、氰基、卤素、卤烷氧基、卤代烷基、杂芳基、杂环基、羟基、羟烷基、硝基、-NRaRb、(NRaRb)烷氧基、(NRaRb)烷基、(NRcRd)羰基和氧代；其中第二芳基、杂芳基和杂环基可以进一步任选地被一个、两个、三个、四个或者五个独立地选自以下的取代基取代：烷氧基、烷基、氰基、卤素、卤烷氧基和硝基。
术语“芳基烷氧基”，如本文中所用，是指通过氧原子连接于母体分子部分的芳基烷基。
术语“芳基烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个芳基取代的烷基。
术语“芳基羰基”，如本文中所用，是指通过羰基连接于母体分子部分的芳基。
术语“芳基磺酰基”，如本文中所用，是指通过磺酰基连接于母体分子部分的芳基。
术语“羰基”，如本文中所用，是指-C(O)-。
术语“羧基”，如本文中所用，是指-CO2H。
术语″羧基烷氧基″，如本文中所用，是指通过氧原子连接于母体分子部分的羧基烷基。
术语“羧基烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个羧基取代的烷基。
术语“氰基”，如本文中所用，是指-CN。
术语“环烷基”，如本文中所用，是指具有3-7个碳原子和0个杂原子的饱和单环、双环或三环烃环系统。环烷基的典型实例包括但不局限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基和二环[3.1.1]庚基。本公开内容的环烷基可以任选地被一个或两个未被取代的(环烷基)烷基或者卤代烷基取代。
术语“(环烷基)烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个环烷基取代的烷基。
术语“二烷基氨基”，如本文中所用，是指-NRxRy，其中Rx和Ry是相同或者不同的烷基。
术语“二烷基氨基烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个二烷基氨基取代的烷基。
术语“甲酰基”，如本文中所用，是指-C(O)H。
术语“卤”或“卤素”，如本文中所用，是指F、Cl、Br或I。
术语“卤代链烯基”，如本文中所用，是指被一个、两个、三个或四个卤素原子取代的链烯基。
术语“卤烷氧基”，如本文中所用，是指通过氧原子连接于母体分子部分的卤代烷基。
术语“卤代烷氧基烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个卤烷氧基取代的烷基。
术语“卤代烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个、三个或四个卤素原子取代的烷基。
术语“杂芳基”，如本文中所用，是指芳族五元或六元环，其中至少一个原子选自N、O和S，其余原子是碳。术语“杂芳基”还包括双环系统，其中杂芳基环稠合到四至六元芳族或者非芳族环，其含有0、1或2个附加的选自N、O和S的杂原子。杂芳基通过基团中任何可取代的碳或氮原子连接于母体分子部分。杂芳基的典型实例包括但不局限于苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、萘啶基、噁二唑基、噁唑基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹啉基、噻唑基、噻吩基和三唑基。除非另作说明，本公开内容的杂芳基可以任选地被一个、两个、三个、四个或者五个独立地选自以下的取代基取代：烷氧基、烷氧羰基、烷基、烷基羰基、芳基、氰基、卤素、卤烷氧基、卤代烷基、第二杂芳基、杂环基、硝基、-NRaRb和氧代；其中芳基、第二杂芳基和杂环基可以进一步任选地被一个、两个、三个、四个或者五个独立地选自以下的取代基取代：烷氧基、烷基、氰基、卤素、卤代烷基、卤烷氧基和硝基。
术语“杂芳基烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个杂芳基取代的烷基。
术语“杂芳基羰基”，如本文中所用，是指通过羰基连接于母体分子部分的杂芳基。
术语“杂芳氧基”，如本文中所用，是指通过氧原子连接于母体分子部分的杂芳基。
术语“杂环基”，如本文中所用，是指环状、非芳族、饱和或者部分不饱和的三、四、五、六或七元环，其中至少一个原子选自氧、氮和硫。术语“杂环基”还包括双环系统，其中杂环基环稠合到四至六元芳族或者非芳族碳环或者四至六元非芳族的含有1或2个选自氮、氧和硫的杂原子的环。本公开内容的杂环基通过基团中任何可取代的碳或氮原子连接于母体分子基团。杂环基的典型实例包括但不局限于氮杂环丁基、苯并间二氧杂环戊烯基、苯并噻唑基、二氮杂
基、二氢苯并二氧杂环己烯基、二氢苯并呋喃基、二氢吲哚基、二氢吡啶基、1，3-二氧杂环己烷基、1，4-二氧杂环己烷基、吗啉基、哌嗪基、哌啶基、吡咯烷基、四氢吡啶基、四氢异喹啉基和硫代吗啉基。除非另作说明本公开内容的杂环基可以任选地被一个、两个、三个、四个或者五个独立地选自以下的取代基取代：烷氧基、烷基、芳基、芳基烷氧基、氰基、环烷基、卤素、卤烷氧基、卤代烷基、杂芳基、第二杂环基、羟基、硝基、-NRaRb和氧代；其中芳基、芳基烷氧基的芳基部分、杂芳基和第二杂环基可以进一步任选地被一个、两个、三个、四个或者五个独立地选自以下的取代基取代：烷氧基、烷基、氰基、卤素、卤烷氧基、卤代烷基和硝基。
术语“杂环基烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个杂环基取代的烷基。
术语“羟基”，如本文中所用，是指-OH。
术语“羟烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个羟基取代的烷基。
术语“巯基”，如本文中所用，是指-SH。
术语“硝基”，如本文中所用，是指-NO2。
术语“-NRaRb”，如本文中所用，是指通过氮原子连接于母体分子部分的两个基团Ra和Rb。Ra和Rb独立地选自氢、烷氧羰基、烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、环烷基、甲酰基和(NRcRd)羰基。
术语“(NRaRb)烷氧基”，如本文中所用，是指通过氧原子连接于母体分子部分的(NRaRb)烷基。
术语“(NRaRb)烷基”，如本文中所用，是指被一个、两个或三个-NRaRb基团取代的烷基。
术语“-NRcRd”，如本文中所用，是指通过氮原子连接于母体分子部分的两个基团Rc和Rd。Rc和Rd各自独立地选自氢和烷基。
术语“(NRcRd)羰基”，如本文中所用，是指通过羰基连接于母体分子部分的-NRcRd基团。
术语“氧代”，如本文中所用，是指(＝O)。
术语“磺酰基”，如本文中所用，是指-SO2-。
在本文中所述公开内容的描述应当与化学键合的定律和法则相一致进行解释。例如，可能需要去除氢原子以便在任何给定位置容纳取代基。
另外，对于所有的原子，在本公开内容中所述的结构被理解为表达了适当的化合价。例如，以下结构，虽然没有显示氢原子，但被理解为描述了化合物二甲胺：
同样，在以如下方式描述结构时：
应当理解的是，取代基，即R7、R8、R9、R10、R11和R12可以连接于双环系统的任何一个环中的任何可取代的原子。
还应当理解的是，除非另作说明，否则一个取代基可以在该取代基上的任何并且全部合适的连接点处被连接。
还应当理解的是，本公开内容所涵盖的化合物是化学稳定的那些。
本公开内容的化合物可以以药学可接受的盐存在。术语“药学可接受的盐”，如本文中所用，是指本公开内容的化合物的盐或者两性离子形式(其是水或油可溶的或者可分散的)，其在合理的医疗诊断范围内，适用于与患者的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、变态反应或者其它问题或并发症，与合理的受益/风险比例相称，并且有效用于其目的用途。所述盐可以在化合物的最终分离和提纯期间或者单独地通过使合适的氮原子与合适的酸反应来制备。典型的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡萄糖甙、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、均三甲基苯磺酸盐、甲烷磺酸盐、萘磺酸盐(naphthylenesulfonate)、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟醋酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐。可被使用以形成药学可接受的加成盐的酸的实例包括无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及有机酸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。
可以在化合物的最终分离和纯化期间通过使羧基与合适的碱如金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐或者与氨或者有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备碱加成盐。药学可接受的盐的阳离子包括锂、钠、钾、钙、镁和铝，以及无毒的季胺阳离子如铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N，N-二甲苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己胺、普鲁卡因、二苄胺、N，N-二苄基苯乙基胺和N，N′-二苄基乙二胺。用于形成碱加成盐的其它典型的有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪。
如本文中所用，术语“抗HCV活性”是指化合物是一种核苷类似物和/或能够有效抑制一种或多种选自如下目标物的功能：HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解旋酶、HCV NS4B蛋白质、HCV输入、HCV组装、HCV输出、HCV NS5A蛋白质和IMPDH。
术语“本公开内容的化合物”和等价表述是指包含通式(I)的化合物和其药学可接受的对映异构体、非对映异构体和盐。同样地，所提及的中间体，是指包含其中上下文允许的它们的盐。
术语“患者”包括人和其它哺乳动物。
术语“药物组合物”是指一种组合物，其包括本公开内容的化合物以及与之组合的至少一种额外的药物载体，即，助剂、赋形剂或载体如稀释剂、防腐剂、填料、流动调节剂、崩解剂、湿润剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、增香剂、芳香剂、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分配剂，这取决于给药方式和剂型的性质。例如可以使用Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版Mack Publishing Company，Easton，PA(1999)中所列的成分。
在本文中所用的短语“药学可接受的”是指那些属于合理的医疗诊断范围内的化合物、材料、组合物和/或剂型，它们适合于接触患者的组织而没有过度的毒性、刺激性、变态反应或者其它问题或者并发症，并且它们相称于合理的风险/效益比。
术语“治疗”是指(i)防止在可能易感染于某种疾病、病症和/或状况但还未被诊断为患病的患者中防止所述疾病、病症或状况的发生；(ii)抑制疾病、病症或状况，即阻止其发展；和/或(iii)减轻疾病、病症或状况，即引起疾病、病症和/或状况衰退。
在谈及氨基酸或氨基酸衍生物时，所述的术语“残基”是指通过消去羧基的羟基和α-氨基酸基团的一个氢而从相应的α-氨基酸衍生的基团。例如，术语Gln、Ala、Gly、Ile、Arg、Asp、Phe、Ser、Leu、Cys、Asn、Sar和Tyr分别是指L-谷氨酰胺、L-丙氨酸、甘氨酸、L-异亮氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-亮氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬酰胺、肌氨酸和L-酪氨酸的“残基”。
在谈及氨基酸或氨基酸残基时，所述的术语“侧链”是指连接于α-氨基酸的α-碳原子的基团。例如，R-基团侧链对于甘氨酸来说是氢，对于丙氨酸来说是甲基，对于缬氨酸来说是异丙基。对于α-氨基酸的特定的R-基团或侧链，参考A.L.Lehninger的《生物化学》中的内容(参见第4章)。
在命名本发明的化合物中所用的情况下，标识P1′、P1、P2、P2*、P3和P4，如本文中所用，映射了相对于天然肽裂解底物的结合而结合的蛋白酶抑制剂的氨基酸残基的相对位置。在天然底物中在P1和P1′之间发生裂解，其中非主要位置表示从肽天然裂解位点的C-末端开始向N-末端延伸的氨基酸；然而，主要位置从裂解位点标识的N-末端开始并且向C-末端延伸。例如，P1′是指远离裂解位点的C-末端的右手端的第一位置(即，N-末端第一位置)；然而，P1从C-末端裂解位点的左手边开始计数，P2：C-末端的第二位置，等)。(参见Berger A.&Schechter I.，Transactiibs of the Royal Society London series(1 970)，B257，249-264]。
下图显示了用于本发明化合物的标识。
不对称中心存在于本发明的化合物中。例如，该化合物可以包括以下通式的P1环丙基单元
其中C1和C2各自表示环丙基环的位置1和2处的不对称碳原子。由于在化合物的其它部分未承受其它可能的不对称中心，这两个不对称中心的存在意味着化合物可以以非对映异构体的外消旋混合物的形式存在，例如如下的非对映异构体，其中R4的构型或者相对于酰胺为顺式或者相对于羰基为顺式，如下图所述。
(1R，2S) (1S，2R)
R4相对于羰基为顺式 R4相对于羰基为顺式
(1R，2R) (1S，2S)
R4相对于酰胺为顺式 R4相对于酰胺为顺式
应当理解的是本公开内容包括全部立体化学异构形式，或其混合物，它们具有抑制HCV蛋白酶的能力。化合物的单独的立体异构体可以从市售可得的原料合成制备，所述原料含有手性中心，或者通过下述方法来制备：制备对映异构体产物的混合物，随后分离，如转化为非对映异构体的混合物，随后分离或重结晶，色层技术，或者在手性色谱柱上直接分离对映异构体。特定的立体化学的原料化合物是市售可得的或者可通过本领域已知的技术来制备和拆分。
本公开内容的某些化合物也可以以不同的稳定的构型形式存在，这些形式是可分离的。由于围绕非对称单键的阻旋作用造成的扭转不对称性，例如因为位阻或者环的阻力，可以允许不同的构象异构体的分离。本公开内容包括这些化合物中的每种构象异构体和其混合物。
本公开内容的某些化合物可以以两性离子的形式存在，并且本公开内容包括这些化合物中的每种两性离子形式和其混合物。
当有可能，对用于治疗而言，治疗有效量的通式(I)的化合物，以及其药学可接受的盐，可以以粗制化学品的形式给药时，可能的是活性成分表现为药物组合物。因此，本公开内容进一步地提供药物组合物，其包括治疗有效量的通式(I)的化合物或者其药学可接受的盐，和一种或多种药学可接受的载体、稀释剂或者赋形剂。术语“治疗有效量”，如本文中所用，是指每种活性组份的总量足以显示出有意义的对患者的益处，例如持续减少病毒量。当应用于单独给药的单独的活性成分时，这一术语是指单独的成分。当应用于结合物时，这一术语是指产生治疗效果的活性成分的总量，无论是联合给药、连续给药还是同时给药。通式(I)的化合物和其药学可接受的盐是如上所述的。一种或多种载体、一种或多种稀释剂或者一种或多种赋形剂必须在与制剂的其它成分相容并且对其受体无害的意义上是可接受的。根据本公开内容的另一方面，还提供一种用于制备药物制剂的方法，包括混合通式(I)的化合物或者其药学可接受的盐和一种或多种药学可接受的载体、稀释剂或者赋形剂。
药物制剂可以表示为单位剂量形式，其每单位剂量包含预定量的活性成分。在用于预防和治疗HCV介导的疾病的单一疗法中，如下剂量水平的本公开内容的化合物是典型的：约0.01-约250毫克/公斤(“mg/kg”)体重/天，优选为约0.05-约100mg/kg体重/天。典型地，本公开内容的药物组合物将以约1-约5次/日，或者以连续输注的形式给药。上述给药方式可用于慢性或急性治疗。可以与载体材料相结合以生产出单一剂型的活性成分的数量将会变化，这取决于所治疗的状况、状况的严重程度、给药次数、给药途径、所用化合物的代谢速率、治疗时间以及患者的年龄、性别、体重和状况。优选的单位剂量制剂含有日剂量或者子剂量，如上文所述的，或者其合适的分数的活性成分的那些。通常，治疗始于明显小于化合物最佳剂量的小剂量。其后，剂量以小的增量增加，直到在这种情况下达到最佳效果。通常，所述化合物最令人想望地以如下的浓度水平给药，即所述浓度水平将通常提供有效的抗病毒结果而没有引起任何不良的或者有害的副作用。
当本公开内容的组合物包括本公开内容的化合物和一种或多种额外的治疗药剂或者预防药剂的结合时，所述化合物和额外的药剂通常以单一疗法范围中通常给予的剂量的约10-150％，更优选约10-80％的剂量水平存在。
药物制剂可以适应于通过任何合适的途径给药，例如口服(包括经颊或舌下)途径、直肠途径、经鼻途径、局部(包括经颊、舌下或经皮)途径、阴道途径或者肠胃外(包括皮下、皮内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、静脉内、或者皮内注射或输注)途径。上述制剂可以通过药学领域中任何已知的方法制备，例如通过使活性成分与一种或多种载体或者赋形剂结合。
适于口服给药的药物制剂可以以离散单元的形式呈现，如胶囊或片剂；粉末或颗粒；在水或非水液体中的溶液或悬浮液；可食用的泡沫或甜食(whip)；或者水包油液体乳液或油包水乳液。
例如，对于以片剂或胶囊形式的口服给药来说，活性药物组分可以与口服无毒的药学可接受的惰性载体如乙醇、丙三醇、水等结合。粉末是这样制备的：将化合物粉碎至合适的细度并且与同样粉碎的药物载体如可食用的碳水化合物如淀粉或甘露糖醇混合。香料、防腐剂、分散剂和着色剂也可以存在。
胶囊是这样制备的：制备如上所述的粉末混合物并且填充形成的明胶壳。可以将助流剂和润滑剂如胶态氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇添加到粉末混合物，然后进行充填操作。还可以添加崩解剂或增溶剂如琼脂、碳酸钙或碳酸钠以在摄取胶囊时改善药物的可用性。
此外，当期望或者需要的时候，合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂也可以被加入到混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然的糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成树胶如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇等。用于这些剂型的润滑剂包括油酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不局限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土(betonite)、黄原胶等。片剂是这样配制的，例如，制备粉末混合物、粒化或预压片、添加润滑剂和崩解剂、以及压成片剂。粉末混合物是这样制备的，将化合物(适当粉碎的)与下列物质混合：如上所述的稀释剂或碱，以及任选地粘合剂如羧甲基纤维素、藻酸盐、胶凝剂(gelating)、或聚乙烯基吡咯烷酮、溶液延缓剂如石蜡、再吸收促进剂如季盐和/或和吸收剂如膨润土(betonite)、高岭土或磷酸二钙。通过用粘合剂如糖浆、淀粉糊、阿拉伯胶浆(acadia mucilage)或者纤维素或聚合材料的溶液润湿并且强制通过筛网，粉末混合物可以被粒化。作为粒化的备选方案，可以使粉末混合物通过压片机，结果是侵入颗粒中的有缺陷形式的预压片(slug)。通过添加硬脂酸、硬脂酸盐、滑石或矿物油可以使颗粒润滑，从而防止粘到压片模具上。经润滑的混合物然后被压成片剂。本公开内容的化合物还可以与自由流动的惰性载体结合并且直接压成片剂而无需经过粒化或预压片的步骤。可以提供透明或不透明的防护涂层，其包括虫胶的密封涂层、糖或聚合物材料的涂层、和蜡的抛光涂层。可以将染料添加到这些涂层中以区别不同的单位剂量。
口服液如溶液、糖浆和酏剂可以以剂量单位形式制备，以便给定的数量含有预定量的化合物。糖浆可以通过将化合物溶解在适当调味的水溶液中而制备，而酏剂通过使用无毒载体来制备。还可以添加增溶剂和乳化剂如乙氧基异硬脂醇和聚氧化乙烯山梨糖醇醚、防腐剂、调味添加剂如薄荷油或天然甜味料、或糖精或其他的人工甜味料等。
在合适的情况下，可以将用于口服的剂量单位制剂进行微囊密封。还可以制备制剂以延长或持续释放，例如通过将颗粒材料涂敷或嵌入在聚合物、蜡等中。
通式(I)的化合物和其药学可接受的盐还可以以脂质体输送系统如小单层泡囊、大单层泡囊和多层泡囊的形式给予。脂质体可以由多种磷脂(phopholipids)如胆固醇、十八胺或磷酸卵磷酯(phophatidylcholines)形成。
通式(I)的化合物和其药学可接受的盐也可通过利用单克隆抗体作为单独的载体来输送，所述化合物分子结合到上述单克隆抗体上。所述化合物也可与作为可靶定药物载体的可溶性聚合物结合。上述聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、多羟基丙基甲基丙烯酰胺苯酚、多羟基乙基天冬酰胺苯酚、或被棕榈酰(palitoyl)残基取代的聚环氧乙烷聚赖氨酸。此外，所述化合物可以与一类可用于实现药物受控释放的可生物降解的聚合物结合，例如，聚乳酸、聚ε-己内酯、多羟基丁酸、聚原酯(polyorthoesters)、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚腈基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两性的嵌段共聚物。
适于经皮给药的药物制剂可以以不连续的贴片的形式呈现，所述贴片意图与受体的表皮保持接触达较长时间。例如，活性成分可以从贴片中通过离子电渗法释放，其一般性地描述于Pharmaceutical Research，3(6)，318(1986)。
适于局部给药的药物制剂可以配制成软膏、乳剂、悬浮液、洗液、粉末、溶液、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶或油剂。
对于治疗眼睛或其它外部组织例如口和皮肤来说，制剂优选以局部软膏或乳剂的形式施加。当配制成软膏时，活性成分可以与石蜡族软膏基质或者水可混溶的软膏基质一起使用。或者，活性成分可以与水包油乳剂基质或者油包水基质一起配制在乳剂中。
适于眼部局部给药的药物制剂包括滴眼剂，其中活性成分溶解或者悬浮在合适的载体，特别是水性溶剂中。
适于在口腔中局部给药的药物制剂包括锭剂、软锭剂和含漱剂。
适于直肠给药的药物制剂可以以栓剂或者灌肠剂的形式呈现。
适于经鼻给药的药物制剂，其中载体是固体，包括粒径例如为20-500微米的粗(course)粉末，其以其中采取鼻吸的方式进行给药，即通过从靠近鼻子的粉末容器中快速通过鼻部通道吸入。用于以鼻喷雾剂或滴鼻剂的形式给药的其中载体是液体的合适的制剂包括活性成分的水性溶液或者油溶液。
适于通过吸入给药的药物制剂包括细颗粒粉尘或烟雾，其可以借助于各种型式的计量的、剂量增压的气溶胶、喷雾器或吹入器形成。
适于阴道给药的药物制剂可以以阴道环、棉球、乳剂、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾剂制剂的形式呈现。
适于肠胃外给药的药物制剂包括含水和无水的无菌的注射液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和soutes，其可以使制剂与所意图的受体的血液等渗压；和含水和无水的无菌的悬浮液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。所述制剂可以存在于单位计量或多计量容器中，例如密封的安瓿或小瓶中，并且可以存储在冷冻干燥(冻干)条件下，仅仅需要添加无菌的液体载体，例如注射用水，然后再即刻使用。即刻注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。
应当理解的是，除了上述特别提及的成分之外，所述制剂还可以包括本领域常规的其它药剂，注意的是所讨论的制剂的种类，例如适于口服的那些可以包括增香剂。
本申请中所使用的缩写，特别是以下所述的方案和实施例中包括的，是本领域技术人员众所周知的。一些所用的缩写如下：
Acca 1-氨基环丙基羧酸；
BINAP 2，2′-双(二苯基膦基)-1，1′-联萘；
Boc、BOC或boc 叔丁氧羰基；
BOC-HYP-OH 反式-N-(叔丁氧羰基)-4-羟基-L-脯氨酸；
CDI 1，1′-羰二咪唑；
dba 二亚苄基丙酮；
DBU 1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯；
DCE 1，2-二氯乙烷；
DCM 二氯甲烷；
DEAD 偶氮二羧酸二乙酯；
DIEA 二异丙基乙胺；
DMAP 4-二甲基氨基吡啶；
DMF N，N-二甲基甲酰胺；
DMSO 二甲基亚砜；
Fmoc 9-芴甲氧羰基；
DPPA 二苯基磷酰基叠氮；
Et 乙基；
EtOAc 乙酸乙酯；
Et3N 三乙胺；
Et2O 二乙醚；
HATU O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；
HBTU O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐；
HOAt 1-羟基-7-氮杂苯并三唑；
HOBT或HOBt 1-羟基苯并三唑水合物；
LiHMDS 六甲基二硅叠氮化锂；
Me 甲基；
MeOH 甲醇；
NMM N-甲基吗啉；
OAc 乙酸根；
Ph 苯基；
Ph3PO 三苯基氧化膦；
PoPd或POPd (叔丁基)2P(OH)2·PdCl2；
PyBOP 苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷鏻六氟磷酸盐；
PyBrop 溴代三吡咯烷鏻六氟磷酸盐；
TBAF 氟化四丁铵；
TBME或MTBE 叔丁基甲醚；
tBu 叔丁基；
TFA 三氟乙酸；和
THF 四氢呋喃。
本公开内容的化合物可以通过本领域技术人员已知的方法制造，参见，例如美国专利No.6,323,180和美国专利申请20020111313 A1。提供下文中所述的如下方法是为了说明性的目的，并且不意欲限制权利要求的范围。应该认识到，制备如下化合物可能是优选的或者必需的，即对于所述化合物，其中使用常规保护基来保护某些官能团，然后去除保护基以提供本公开内容的化合物。根据本公开内容有关保护基的使用的细节是本领域技术人员已知的。
本公开内容的化合物可以例如根据如方案I中所举例说明的一般性方法来合成(其中CPG是羧基保护基和APG是氨基保护基)
方案I
简而言之，P1、P2和P3可以通过众所周知的肽耦联技术连接。P1、P2和P3基团可以以任何顺序连接在一起，只要最终的化合物相应于本公开内容的肽。例如，P3可以连接到P2-P1；或者P1连接到P3-P2。
通常肽是这样延长的，去保护N-末端残基的α-氨基并且使用所述方法通过肽键耦合下一个适当的N-受保护的氨基酸的未保护的羧基。重复这种去保护和耦合方法，直到获得所期望的序列。这种耦合可以使用组分氨基酸以逐步方式进行，如方案I中所描述的。
使用标准耦合方法如叠氮方法、混合碳酸-羧酸酐(氯甲酸异丁酯)方法、碳二亚胺(二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、或者水溶性的碳二亚胺)方法、活性酯(对硝基苯基酯、N-羟基丁二酸亚氨基酯)方法、伍德瓦德化学试剂K-方法、羰二咪唑方法、磷化学试剂或者氧化还原法，可以在两个氨基酸之间、在氨基酸和肽之间或者在两个肽片段之间进行耦合。这些方法中的一些(特别是碳二亚胺方法)可以通过添加1-羟基苯并三唑或者4-DMAP来强化。这些耦合反应可以在溶液(液相)中或者在固相中进行。
更明确地，耦合步骤涉及在耦合剂存在下，一种反应物的自由羧基与其它反应物自由氨基的脱水耦合以形成连接酰胺键。上述耦合剂的描述见于有关肽化学的普通教科书中，例如，M.Bodanszky，″PeptideChemistry″，2nd rev ed.，Springer-Verlag，Berlin，Germany，(1993)。合适的耦合剂的实例是N，N′-二环己基碳二亚胺、在N，N′-二环己基碳二亚胺存在下的1-羟基苯并三唑或者N-乙基-N’-[(3-二甲基氨基)丙基]碳二亚胺。实用的并且有用的耦合剂是市售可得的(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐，其以本身形式或者在1-羟基苯并三唑或者4-DMAP存在下。另一实用的并且有用的耦合剂是市售可得的2-(1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓四氟化碳。又一实用的并且有用的耦合剂是市售可得的O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐。
耦合反应在惰性溶剂，例如二氯甲烷、乙腈或者二甲基甲酰胺中进行。添加过量的叔胺，例如二异丙基乙胺、N-甲基吗啉、N-甲基吡咯烷或者4-DMAP以保持反应混合物的pH值为约8。反应温度通常为0℃-50℃，反应时间通常为15分钟-24小时。
在耦合反应期间，组分氨基酸的官能团通常必须受到保护，以便避免形成不需要的键。可以使用的保护基例如列于以下文献中：Greene，″Protective Groups in Organic Chemistry″，John Wiley&Sons，New York(1981)和″The Peptides：Analysis，Synthesis，Biology″，Vol.3，AcademicPress，New York(1981).
待耦合到增长肽链上的每个氨基酸的α-氨基必须进行保护(APG)。可以使用在本领域中已知的任何保护基。上述基团的实例包括：1)酰基如甲酰基、三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、和对甲苯磺酰基；2)芳族氨基甲酸酯基团如苄氧基羰基(Cbz或者Z)和被取代的苄氧基羰基、和9-芴基甲氧羰基(Fmoc)；3)脂族氨基甲酸酯基团如叔丁氧羰基(Boc)、乙酯基、二异丙基甲氧基羰基、和烯丙氧基羰基；4)环状氨基甲酸烷基酯基团如环戊氧基羰基和金刚烷基氧基羰基；5)烷基如三苯甲基和苄基；6)三烷基甲硅烷基如三甲基甲硅烷；和7)含硫羟基团如苯基硫羟基羰基和二硫代丁二酰基。在某些实施方案中，α-氨基保护基是Boc或者Fmoc。适当地保护肽合成的许多氨基酸衍生物是市售可得的。
在下一个氨基酸耦合之前，新添加的氨基酸残基的α-氨基保护基被裂解。当使用Boc基团时，所选的方法是纯的或者二氯甲烷中的三氟乙酸，或者在二氧杂环己环或者乙酸乙酯中的HCl。然后，在耦合之前或者在原位，使用碱性溶液如含水缓冲剂或者叔胺/二氯甲烷或者乙腈或者二甲基甲酰胺来中和所得的铵盐。当使用Fmoc基团时，所选的化学试剂是哌啶或者被取代的哌啶/二甲基甲酰胺，但是可以使用任何的仲胺。在0℃-室温(rt或者RT，通常为20-22℃)的温度下进行去保护。
在使用任何以上所述的基团制备肽的期间，具有侧链官能性的任何氨基酸必须受到保护。本领域技术人员将理解对于这些侧链官能性的合适的保护基的选择和使用取决于氨基酸以及在肽中其它保护基的存在。上述保护基的选择对于下述方面来说是重要的：该基团不许在去保护和α-氨基耦合期间被去除。
例如，当Boc被用作α-氨基保护基时，以下侧链保护基是合适的：对甲苯磺酰基(也称作tosyl)部分可用于保护氨基酸如Lys和Arg的氨基侧链；乙酰胺基甲基、苄基(Bn)、或者叔丁基磺酰基部分可用于保护半胱氨酸的含硫醚的侧链；苄基(Bn)醚可用于保护丝氨酸、苏氨酸或者羟脯氨酸的含羟基的侧链；和苄基酯可用于保护天冬氨酸和谷氨酸的含羧基的侧链。
当Fmoc被选择用于α-胺保护时，通常基于叔丁基的保护基是可接受的。例如，Boc可用于赖氨酸和精氨酸，叔丁基醚可用于丝氨酸、苏氨酸和羟脯氨酸，叔丁基酯可用于天冬氨酸和谷氨酸。三苯甲基(也称作Trityl)部分可用于保护半胱氨酸的含硫醚的侧链。
一旦肽的延长完成，去除全部保护基。当使用液相合成时，以选择保护基所要求的任何方式去除保护基。这些方法对于本领域技术人员来说是众所周知的。
C-末端残基的α-羧基通常以酯的形式进行保护(CPG)，该酯可被裂解以获得羧酸。可以使用的保护基包括：1)烷基酯如甲基、三甲基甲硅烷基乙基和叔丁基的，2)芳基烷基酯如苄基和被取代的苄基的，或者3)可通过温和碱性处理或者温和还原方式裂解的酯如三氯乙基和苯甲酰甲基酯。在肽耦合剂存在下，所得的α-羧酸与R6SO2NH2耦合。
本公开内容的化合物可以通过许多方法制备，包括以下实施例中所描述和美国专利No.6,323,180和公开的美国专利申请US 2002 0111313A1所描述的那些。
方案II进一步地显示了一般性过程，其中通式(I)的化合物(2)是通过三肽羧酸中间体(1)与P1`磺酰胺的耦合形成的。所述耦合反应需要羧酸(1)与耦合化学试剂如羰基二咪唑在溶剂如THF中进行处理，所述溶剂可被加热至回流，然后在溶剂如THF或者二氯甲烷中，在碱如DBU存在下，将(1)所形成的衍生物添加到P1`磺酰胺中。
方案II
形成通式(I)的化合物的另一过程示于方案III中。其中，使用方案I中所用的过程，P1`磺酰胺单元耦合到P1单元。所得的P1-P1`部分然后能够在其氨基末端去保护。在这种一般性的实例中，使用了Boc保护基，但是本领域技术人员将认识到许多合适的氨基保护基可以用于这种过程。使用酸如三氟乙酸，在溶剂如二氯乙烷中可以去除所述Boc保护基，以便提供去保护的胺，形式为TFA盐。所述TFA胺盐可以直接用于随后的耦合反应或者作为备选方案，所述TFA胺盐可以首先被转化为HCl胺盐，这种HCl胺盐用于如方案III所示的所述耦合反应中。使用耦合化学试剂如HATU，在溶剂如二氯甲烷中，可以实现所述HCl胺盐(3)与羧基末端，P4-P3-P2中间体进行耦合，从而提供通式(4)的化合物。
方案III
形成通式(I)的化合物的另一过程示于方案IV中。在此，使用耦合剂如PyBOP，在碱如二异丙胺存在下，并且在溶剂如二氯甲烷中，P1-P1`末端胺(1)的盐酸盐被耦合到P2单元的自由羧基。在两步骤过程中，所得的P2-P1-P1`中间体可以转化为通式(I)的化合物(4)，其中第一步是，使用酸如TFA，在溶剂如二氯甲烷中，P2胺末端的去保护。使用标准耦合剂如PyBOP，在碱如二异丙胺存在下并且使用溶剂如二氯甲烷，所得的三氟乙酸盐可以与P4-P3单元的羧基末端耦合，从而获得通式(4)的化合物。
方案IV
上述方案中使用的P4-P3-P2中间体可以，借助一般性方案V中所示的这种过程的进一步描述，如前所述地形成。其中，P4-P3中间体(1)的自由自由羧基末端可以被耦合到P2单元的氨基末端，从而获得P4-P3-P2二肽(2)。通过酯基的皂化可以使P4-P3-P2中间体的羧基末端去保护，从而获得P4-P3-P2，形式为自由羧酸(3)。使用本文中所述的方法，中间体，如(3)，可以转化为通式(I)的化合物。
方案V
通式(I)的化合物还可以被转化为如本文所述的其它的通式(I)的化合物。这种过程的实例示于方案VI中，其中通式(1)的化合物，其在P4位置带有羟基，被转化为通式(2)的化合物，其中所述化合物在P4位置带有氨基甲酸根基团。(1)至(2)的转化可以这样进行：在溶剂如THF中由碱如氢化钠处理(1)，然后添加异氰酸酯化学试剂从而提供(2)。如前所述，本领域技术人员将认识到中间体(1)可被用作用于制备其它的通式(I)的化合物的原料。
方案VI
使用一种上文中概述的并且在下文中更详细描述的一般性过程，在通式(I)化合物的形成中，P1`末端被结合到分子中。在一些实例中，P1`单元，其是环烷基或者烷基磺酰胺，是市售可得的或者可以从相应的烷基或者环烷基磺酰氯通过与氨处理所述磺酰氯来制备。或者，使用方案VII中概述的一般性过程可以合成这些磺酰胺。其中，例如通过用叔丁胺处理，市售可得的3-氯丙基磺酰氯(1)被转化为合适的受保护的磺酰胺。然后，在低温下，在溶剂如THF中，通过用2当量的碱如丁基锂进行处理，将所得的磺酰胺(2)转化为相应的环烷基磺酰胺。通过用酸处理，可以使所得的环烷基磺酰胺去保护，从而提供所期望的未保护的环烷基磺酰胺。
方案VII
在一些情况中，形成通式(I)的化合物中所用的P1单元是市售可得的，否则使用本文中所述的方法来合成，并且随后使用本文中所描述的方法来结合到通式(I)的化合物中。按照方案VIII中概述的一般性过程，可以合成被取代的P1环丙基氨基酸。
在碱存在下，用1，4-二卤代丁烯(2)处理市售可得的或者易于合成的亚胺(1)提供了所得的亚胺(3)。(3)的酸水解然后提供了(4)，其具有相对于羧基为顺式的烯丙基取代基，作为主要产物。(4)的胺部分可使用Boc基团受到保护，从而提供了全部受保护的氨基酸(5)。这种中间体是一种外消旋体，其可以通过酶促过程进行拆分，其中(5)的酯部分由蛋白酶裂解从而提供了相应的羧酸。无意拘泥于任何特定理论，据信这种反应是有选择性的，其中一种对映异构体以比其镜象快很多的速率进行反应，这提供了中间外消旋体的动态拆分。在本文中所述的实施例中，对于结合到通式(I)的化合物的更优选的立体异构体是(5a)，其具有(1R，2S)立体化学构型。在酶存在下，这种对映异构体没有经受酯裂解并由此这种对映异构体(5a)从反应混合物中回收。然而，不太优选的对映异构体(5b)，其具有(1S，2R)立体化学构型，经受了酯的裂解，即水解，从而提供游离酸(6)。当该反应完成后，通过常规方法，如水性溶液萃取方法或者色谱方法(chromotography)，酯(5a)可以与酸产物(6)分离。
方案VIII
制备P2中间体和通式(I)的化合物的方法示于以下方案中。应当注意到在很多情况下反应描述的是仅仅中间体的一个位置。然而，应将理解的是上述反应可用于在该中间体内将变体提供给其它位置。此外，在特定实施例中给出的所述中间体、反应条件和方法广泛适用于具有其它取代型式的化合物。本文中的实施例遵循于下面所概述的一般性方案。一般性和具体性的实(施)例是非限制性的，例如异喹啉核显示作为一般性方案(方案IX)的一部分，然而，该途径表示一种可行的形成备选作为异喹啉单元的替换品(如喹啉或者喹唑啉)的杂环取代基的过程。
方案IX
方案IX显示了N-受保护的C4-羟脯氨酸部分与杂环的耦合而形成中间体(4)以及通过如本文所述的肽延长过程使所述中间体(4)随后变体为通式(I)的化合物(5)。应当注意到，在第一步骤，C4-羟脯氨酸基团与杂芳基单元的耦合中，使用了碱。本领域技术人员将认识到这种耦合可以通过使用碱如叔丁醇钾或者氢化钠在溶剂如DMF或者DMSO或者THF中来完成。这种耦合到异喹啉环系统出现在C1位置(异喹啉环系统的编号示于方案IX的中间体2中)并且被在该过程中被替换的氯基团所指。应当注意到，可以在这一位置使用备选的离去基团，如中间体(3)中所示的氟离子离去基团。使用本文中所述的文献方法，从相应的氯代化合物可以获得所述氟代中间体(3)。
还应该注意的是，方案IX的中间体如(2)中的一个或多个环杂原子的位置也是可变的，正如本文中所述的术语“杂环”所限定的。
在如方案X的步骤1中所述的Mitsunobu反应中提供了如上所述对于C4-羟脯氨酸耦合到芳族和杂芳族化合物的方法的备选方案。在该一般性反应方案中，C4-羟脯氨酸衍生物被耦合到喹唑啉环系统。该反应使用了在质子惰性溶剂如THF或者二氧环己环中的化学试剂如三苯基膦和DEAD(二乙基偶氮二羧酸酯)并且可用于形成芳基和杂芳基醚。要注意，在该耦合反应的过程中，C4-羟脯氨酸衍生物中的C4手性中心的立体化学构型被反转，由此必需使用在C4位置具有(S)立体化学构型的C4-羟脯氨酸衍生物作为原料。应当注意到，Mitsunobu反应的许多变体和改进已经描述于文献中。
方案X
在本文中的实施例的子集中，异喹啉被结合到最终的化合物中并且特定地结合到所述化合物的P2区域中。本领域技术人员将认识到许多一般性方法可用于合成异喹啉。此外，使用本文中所述的过程，通过这些方法形成的所述异喹啉可以容易地结合进通式(I)的最终化合物中。一种用于合成异喹啉的一般性方法示于方案XI中，其中在4个步骤的过程中，以如结构(2)的一般性形式显示的肉桂酸衍生物被转化为1-氯代异喹啉。所述氯代异喹啉可随后用于耦合反应以获得如本文所述的C4-羟脯氨酸衍生物。肉桂酸转化为氯喹啉始于在碱存在下用烷基氯代甲酸酯处理肉桂酸。所得的酸酐然后用叠氮化钠处理，这导致形成该方案中所示的酰叠氮(3)。备选方法可用于从羧酸形成酰叠氮，例如，所述羧酸可以在碱存在下，在非质子溶剂如二氯甲烷中用二苯基磷酰基叠氮(DPPA)处理。在反应序列的下一步骤中，酰叠氮(3)被转化为相应的如该方案中所示的异喹诺酮(4)。在高沸点溶剂如二苯甲烷中，酰叠氮被加热至大约190℃的温度。该反应是一般性的并且提供了中等至优良的从相应的肉桂酸衍生物获得被取代的异喹诺酮的收率。应当注意的是所述肉桂酸衍生物是可以市购的或者可以由相应的苯甲醛(1)衍生物通过与丙二酸或者其衍生物的直接缩合以及通过使用Wittig反应而获得。方案XI的中间体异喹诺酮(4)可以通过用氯氧化磷处理而转化为相应的1-氯代异喹啉。该反应是一般性的并且可被用于如本文中所示的异喹诺酮、喹诺酮或者其它杂环中的任一种，从而将羟基取代基转化为相应的氯代化合物，当所述羟基与所述杂环环系统中的氮原子共轭的时候。
方案XI
参考文献：N.Briet等人，Tetrahedron，2002，5761
合成异喹啉环系统的另一方法是Pomeranz-Fritsh方法。这种一般性方法概述于方案XII中。该过程始于苯甲醛衍生物(1)转化为官能化的亚胺(2)。然后，在升温下，通过由酸处理，将所述亚胺转化为异喹啉环系统。方案XII的这种异喹啉合成是一般性的，并且应当注意到该过程特别适用于获得在C8位置被取代的异喹啉中间体。在如所示的两步过程中，中间体异喹啉(3)可以转化为相应的1-氯喹啉(5)。该序列中的第一步是在非质子溶剂如二氯甲烷中通过用间-氯代过苯甲酸处理异喹啉(3)来形成异喹啉N-氧化物(4)。通过在回流的氯仿中用氯氧化磷处理，可以将中间体(4)转化为相应的1-氯喹啉。要注意的是，该两步过程是一般性的并且可被用于分别从相应的异喹啉和喹啉获得氯代异喹啉和氯喹啉。
方案XII
Pomeranz-Fritsch合成
K.Hirao，R.Tsuchiya，Y.Yano，H.Tsue，Heterocycles 42(1)1996，415-422
合成异喹啉环系统的另一方法示于方案XIII中。在该过程中，用强碱如叔丁基锂在溶剂如THF中在低温下处理邻-烷基苯甲酰胺衍生物(1)。然后，向该反应混合物中添加腈衍生物，其经受与衍生自(1)的去质子化的阴离子的加成反应，结果形成(2)。该反应是一般性的并且可用于形成被取代的异喹啉。通过本文中所述的方法，方案XIII的中间体(2)可被转化为相应的1-氯喹啉。
方案XIII
合成异喹啉的另一方法示于方案XIV中。如上所述，使用叔丁基锂进行中间体(1)的去质子化。然而，在本方法中，所述中间体阴离子是由酯捕获的，结果形成如以下所示的中间体(2)。在随后的反应中，酮(2)与乙酸铵在升温下缩合，结果形成了喹诺酮(3)。该反应是一般性的，并且可用于形成被取代的异喹诺酮，其然后可被转化为相应的如本文所述的1-氯代异喹啉。
方案XIV
形成异喹啉的又一方法示于方案XV中。在该过程的第一步骤中，邻-烷基芳基亚胺衍生物如(1)经受去质子化条件(仲-丁基锂，THF)并且通过添加活化的羧酸衍生物如Weinreb酰胺来淬灭所得的阴离子。在升温下通过与乙酸铵的缩合，所得的酮亚胺(2)可转化为相应的异喹啉。该方法是一般性的并且可用于合成被取代的异喹啉。通过本文中所述的方法，所述异喹啉可被转化为相应的1-氯喹啉。
方案XV
L.Flippin，J.Muchowski，JOC，1993，2631-2632
本文中所述的并且被结合到通式(I)的化合物中的杂环可以被进一步官能化。对于本领域技术人员来说很明显的是，所述杂环的额外的官能化可以在这些官能性结合到通式(I)的化合物中之前或之后进行。以下方案举例说明了这一点。例如，方案XVI显示了在醇溶剂中，通过用醇钠或醇钾物质处理(1)(其中所述醇盐在室温下衍生自所述醇溶剂)，使1-氯-6-氟异喹啉转化为相应的1-氯-6-烷氧基-异喹啉物质。有时可能需要对反应加热以促使其完成。使用本文中所述的技术，可以将所述氯喹啉结合到通式(I)的化合物中。
方案XVI
方案XVII提供了通过使用钯介导的耦合反应来改性如本文中限定的杂环的一般性实例。可以使用所述耦合以便在环系统的每个位置处使杂环官能化，这使得所述环适当地被活化或者官能化，例如通过氯化物，如该方案中所示。该序列始于1-氯代异喹啉(1)，其通过用间-氯代过苯甲酸的处理，可以转化为相应的N-氧化物(2)。在回流的氯仿中通过用氯氧化磷处理，所述中间体(2)可以转化为相应的1，3-二氯异喹啉(3)。通过本文中所述的方法，中间体(3)可以与N-Boc-4-羟脯氨酸耦合，从而提供中间体(5)，如该方案中所示。在钯化学试剂和碱存在下，在溶剂如THF或者甲苯或者DMF中，中间体(5)可以经受与芳基硼酸的Suzuki耦合，从而提供C3-芳基异喹啉中间体(6)。还可以将杂芳基硼酸用于该Pd介导的耦合过程以提供C3-杂芳基异喹啉。通过本文中所述的方法，中间体(6)可以转化为最终的通式(I)的化合物。
方案XVII
还可以在稍后的形成通式(I)的化合物的合成阶段使用钯介导的杂芳基系统与芳基或者杂芳基单元的耦合，如方案XVIII所示。其中，使用前述过程的杂芳基卤代部分的醇盐置换，三肽酰基磺酰胺中间体(1)被耦合到1-氯-3-溴异喹啉(2)，从而提供中间体(3)。如本文所述，(1)和(2)的耦合在催化剂如氯化镧存在下是最有效率的。中间体(3)的异喹啉环系统可以进一步地通过以下方法官能化：使用Suzuki耦合(过程1：在钯催化剂如四(三苯基膦)钯和碱如碳酸铯存在下，在溶剂如DMF中，使(3)受作用于杂芳基或者芳基硼酸)或者Stille耦合(过程2：在溶剂如甲苯中，在钯催化剂如四(三苯基膦)钯存在下，使(3)受作用于杂芳基或者芳基锡衍生物)。
方案XVIII
还可以使用钯反应以使C4-氨基脯氨酸单元与官能化的杂环耦合。方案XX显示了在钯催化剂和碱存在下，在溶剂如甲苯中，中间体(1)与官能化的异喹啉耦合。使用本文中所述的方法，中间体，如(3)，可以转化为通式(I)的化合物。
方案XIX
使用[4+2]环化加成反应还可能形成官能化的异喹啉环系统。例如，如方案XX所示，在环化加成反应中使用异氰酸乙烯酯(1)和通式(2)的化合物提供了官能化的异喹诺酮(3)。使用本文中所述的方法，所述异喹啉可以结合到通式(I)的化合物。
方案XX
实施例
本公开内容现将结合某些实施方案来描述，所述实施方案不意欲限制其范围。相反地，本公开内容覆盖全部如能够被包括在权利要求范围内的备选方案、变体和等价物。因而，以下实施例将举例说明本公开内容的一种实践，应理解的是这些实施例的目的是举例说明某些实施方案并且它们的呈现是为了提供被认为是其方法和概念性方面的最有用和最易于理解的描述的内容。
溶液百分比表示了重量-体积关系，溶液比表示了体积-体积关系，除非另有说明。核磁共振(NMR)光谱是在Bruker300、400或者500MHz光谱仪上记录的；化学位移(δ)是以ppm报道的。通过本领域技术人员众所周知的方法在硅胶(SiO2)上进行快速色谱法(参见J.Org.Chem.1978，43，2923)。
以下实施例中描述的本发明的化合物和化学中间体是根据以下方法制备的。在本申请的整个实施例部分中，实施例编号和化合物编号不是连续的。
部分A：
I.制备P1中间体：
2.拆分N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯
拆分A
向设置在12升带塞反应器中的磷酸钠缓冲剂的水溶液(0.1M，4.25L，pH值为8)中(其被维持在39℃并且在300rpm下搅拌)，添加511克的Alcalase 2.4L(约425mL)(Novozymes North America Inc.)。当混合物的温度达到39℃时，pH值调节为8.0，通过添加50％NaOH水溶液来实现。850mL的DMSO中的外消旋的N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的溶液然后在40分钟内被添加。反应温度然后被维持在40℃达24.5小时，其间，使用50％NaOH水溶液在1.5小时和19.5小时的时间点处将混合物的pH值调节为8.0。24.5小时后，测量酯的对映体过量为97.2％，将反应冷却至室温(26℃)并且搅拌过夜(16小时)，其后测量酯的对映体过量为100％。然后用50％NaOH调节反应混合物的pH值至8.5，所得混合物用MTBE萃取(2×2L)。然后将合并的MTBE萃取物用5％NaHCO3(3×100mL)、水(3×100mL)洗涤并且真空浓缩，获得对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，为浅黄色固体(42.55g；纯度：97％@210nm，不含酸；100％对映异构体过量(″ee″)。
从萃取过程获得的水层然后用50％H2SO4酸化至pH值为2，并且用MTBE(2×2L)萃取。然后将MTBE萃取物用水(3×100mL)洗涤并且浓缩，获得酸，为浅黄色固体(42.74g；纯度：99％@210nm，不含酯)。
1R，2S-酯 1S，2R-酸
拆分B
向24孔板的孔(容量：10mL/孔)中的0.5mL 100mM Heps·Na缓冲剂(pH值8.5)添加0.1mL的Savinase 16.0L(来自Bacillus clausii的蛋白酶)(Novozymes North America Inc.)和在0.1mL的DMSO中的外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(10mg)的溶液。将该板密封并且在250rpm下在40℃下进行培养。18小时后，如下测量酯的对映体过量为44.3％：去除0.1mL的反应混合物并且与1mL乙醇充分混合；离心后，用手性HPLC分析10微升(“μL”)的上层清液。向剩余的反应混合物中添加0.1mL的DMSO，在40℃在250rpm下再培养该板3天，然后向孔中添加4mL的乙醇。离心后，用手性HPLC分析10μL的上层清液并且测量酯的对映体过量为100％。
拆分C
向24孔板的孔(容量：10mL/孔)中的0.5mL 100mM Heps·Na缓冲剂(pH值8.5)中添加0.1mL的Esperase 8.0L(来自Bacillus halodurans的蛋白酶)(Novozymes North America Inc.)和在0.1mL的DMSO中的外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(10mg)的溶液。将该板密封并且在250rpm下在40℃下进行培养。18小时后，如下测量酯的对映体过量为39.6％：去除0.1mL的反应混合物并且与1mL乙醇充分混合；离心后，用手性HPLC分析10μL的上层清液。向剩余的反应混合物中添加0.1mL的DMSO，在40℃在250rpm下再培养该板3天，然后向孔中添加4mL的乙醇。离心后，用手性HPLC分析10μL的上层清液并且测量酯的对映体过量为100％。
以如下方式进行样品分析：
1)样品制备：约0.5mL的反应混合物与10体积的乙醇充分混合。离心后，将10μL的上层清液注射到HPLC柱上。
2)转化率测量：
柱：YMC ODS A，4.6×50mm，S-5μm
溶剂：A，1mM HCl水溶液；B，乙腈；
梯度：30％B，1分钟；30％-45％B，0.5分钟；45％B，1.5分钟；45％-30％的B，0.5分钟。
流速：2mL/分钟
UV检测：210nm
停留时间：酸，1.2分钟；酯，2.8分钟。
3)酯的对映体过量测量：
柱：CHIRACEL OD-RH，4.6×150mm，S-5μm
流动相：乙腈/50mM的HClO4水溶液(67/33)
流速：0.75mL/分钟。
UV检测：210nm。
停留时间：(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸，5.2分钟；外消旋体(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，18.5分钟和20.0分钟；(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，18.5分钟。
拆分D
5L的0.3M磷酸钠缓冲剂(pH值为8)在38℃被维持在20L的带塞的反应器中，在130rpm下搅拌。4升的Alcalase 2.4L(Novozymes NorthAmerica Inc.)和1升的去离子水被添加到反应器中。当混合物的温度接近于38℃时，使用10N NaOH将pH值调节至7.8。在1小时内经由加料漏斗，将5升DMSO中的外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的溶液(500克)添加到反应器中。然后调节反应温度到48℃。21小时后，酯的对映体过量为99.3％。在24小时，停止加热，使反应缓慢冷却至室温(约25℃)并且搅拌过夜。然后用10N NaOH调节反应混合物的pH值至8.5，混合物用MTBE萃取(2×4L)。将合并的MTBE萃取物用5％NaHCO3(3×400mL)、水(3×400mL)洗涤并且浓缩，获得对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，为浅黄色晶体(259g；纯度：96.9％@210nm，不含酸；100％ee)。
拆分E
10L的0.1M磷酸钠缓冲剂(pH值为8)在40℃被维持在20L的带塞反应器中，在360rpm下搅拌。1.5L的Alcalase 2.4L(Novozymes NorthAmerica Inc.)被添加到反应器。当混合物的温度接近于38℃时，使用10NNaOH将pH值调节至8.0。在1小时内经由加料漏斗，将2L DMSO中的外消旋的N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的溶液(200克)添加到反应器中。然后调节反应温度到40℃。3小时后，用10N NaOH调节pH值至8.0。21小时后，反应被冷却至25℃。然后用10N NaOH调节反应混合物的pH值至8.5，混合物用MTBE萃取(2×5L)。合并的MTBE萃取物用5％NaHCO3(3×500mL)和水(3×200mL)洗涤，浓缩而获得110g的黄色油。在室温下将所述油放置在清洁真空(house vacuum)中并且获得对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，为无色长棒状晶体(101g；纯度：97.9％@210nm，不含酸；100％ee)。
对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的晶体结构已经由单晶分析表征(X射线NB#：52795-093，参考代码：634592N1)。因缺乏已知的手性中心或者较大的原子，没有测定绝对构型。沿结晶α-轴的链结构在酰胺基和羰基氧原子之间经由分子间氢键形成(N...O 3.159
).。
N-Boc-(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的结构：
晶体数据 实验部分：
分子式：C13H21N1O4 结晶
晶系：正交晶 结晶源：MTBE
间隔基：P212121 晶体描述：无色棒状
a＝5.2902(1)
α＝90° 晶体尺寸(mm)：0.12×0.26×0.30
b＝13.8946(2)
β＝90° 数据采集
c＝19.9768(3)
γ＝90° 温度(K)：293
V＝1468.40(4)
θ最大(°)：65.2(Cu Kα)
Z＝4 dx＝1.155gcm-3 所测量的反射数：7518
对于晶胞参数的反射数： 独立的反射数：2390(Rint＝0.0776)
6817
对于晶胞参数的θ范围 所观察的反射数(I≥2σ)：2284(°)：2.2-65.2
吸收系数(mm-1)：0.700 吸收修正(T最小-T最大)：0.688-1.000
拆分F
5L的0.2M硼酸钠缓冲剂(pH值为9)在45℃被维持在20L的带塞的反应器中并且在400rpm下搅拌。将3L的去离子水和4L的Savinase16L，EX型(Novozymes North America Inc.)添加到反应器中。当混合物的温度接近于45℃时，使用10N NaOH将pH值调节至8.5。在40分钟内经由加料漏斗，将2L DMSO中的外消旋N-Boc-(1R，2S)/(1S，2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的溶液(200克)添加到反应器中。然后调节反应温度到48℃。2小时后，用10N NaOH调节pH值至9.0。在18小时，酯的对映体过量到达72％，pH值用10N NaOH调节至9.0。在24小时，温度降低至35℃。在42小时，温度上升至48℃，pH值用10N NaOH调节至9.0。在48小时，停止加热，使反应缓慢冷却至室温(约25℃)并且搅拌过夜。在66小时，反应混合物的pH值是8.6。用MTBE(2×4L)萃取混合物。将合并的MTBE萃取物用5％NaHCO3(6X300mL)、水(3X300mL)洗涤并且浓缩，获得对映体纯的N-Boc-(1R，2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，为浅黄色晶体(101A g；纯度：95.9％@210nm，不含酸；98.6％ee)。
3.制备手性(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐
在室温下，在N2气氛下，借助200mL的4N HCl/二氧己环(Aldrich)，搅拌N-Boc-(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(8.5g，33.3mmol)达3小时。在减压下除去溶剂，保持温度低于40℃。这产出了6.57g(约100％)的(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐，为淡黄色固体。
1H NMR(300MHz，CD3OD)δ1.31(t，J＝7.0Hz，3H)，1.69-1.82(m，2H)，2.38(q，J＝8.8Hz，1H)，4.29(q，J＝7.0Hz，2H)，5.22(d，J＝10.3Hz，1H)，5.40(d，J＝17.2Hz，1H)，5.69-5.81(m，1H).MS m/z 156(M++1)。
4.制备N-Boc-(1R，2S)-1-氨基-2-环丙基环丙烷羧酸乙酯
用乙酸钯(5mg，0.022mmol)处理醚(10ml)中的N-Boc-(1R，2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸(255mg，1.0mmol)的溶液。将该橙/红色溶液放置在N2气氛下。在1小时内，滴加过量的醚中的重氮甲烷。在室温搅拌所得溶液18小时。使用氮气流，去除过量的重氮甲烷。通过旋转蒸发浓缩所得的溶液，得到粗产物。快速色谱法(10％乙酸乙酯/己烷)提供了210mg(78％)的N-Boc-(1R，2S)-1-氨基-2-环丙基环丙烷羧酸乙酯，为无色油。LC-MS(停留时间：2.13，类似于方法A，差别在于梯度时间3分钟，Xterra MS C18 S7 3.0×50mm柱)，MS m/e 270(M++1)。
5.1-叔丁氧基羰基氨基-环丙烷羧酸是市售可得的
6.制备1-氨基环丁烷羧酸甲酯·盐酸盐
将1-氨基环丁烷羧酸(100mg，0.869mmol)(Tocris)溶解在10mL的甲醇中。鼓入HCl气体2小时。搅拌反应混合物18小时，然后真空浓缩，获得144mg的黄色油。用10mL的二乙醚研磨，得到100mg的标题产物，白色固体。
1H NMR(CDCl3)δ2.10-2.25(m，1H)，2.28-2.42(m，1H)，2.64-2.82(m，4H)，3.87(s，3H)，9.21(br s，3H)。
7.制备外消旋的(1R，2R)/(1S，2S)1-氨基-2-乙基环丙烷羧酸叔丁基
酯
对于羧基来说乙基为顺式
步骤1：制备2-乙基环丙烷-1，1-二羧酸二叔丁基酯，如下所示
向50％NaOH水溶液(92.4g，在185mL H2O中)中的苄基三乙基氯化铵(21.0g，92.2mmol)的悬浮液添加1，2-二溴丁烷(30.0g，138.9mmol)和二叔丁基丙二酸酯(20.0g，92.5mmol)。在室温下强力搅拌反应混合物18小时，然后添加冰和水的混合物。粗产物用二氯甲烷(3x)萃取，顺序地用水(3x)、盐水洗涤，并且合并有机萃取物。干燥(MgSO4)有机层，过滤和真空浓缩。所得剩余物进行快速色谱分析(100g SiO2，3％二乙醚/己烷)，得到标题产物(18.3g，67.8mmol，73％收率)，在下一个反应中其被直接使用。
步骤2：制备外消旋的2-乙基环丙烷-1，1-二羧酸叔丁基酯，如下所
示
在0℃，将步骤1的产物(18.3g，67.8mmol)添加到干醚(500ml)中的叔丁醇钾(33.55g，299.0mmol)的悬浮液中，然后是H2O(1.35mL，75.0mmol)并且在室温下强力搅拌过夜。将反应混合物倒入冰和水的混合物中并且用二乙醚(3x)洗涤。在0℃用10％棕檬酸水溶液酸化水层并且用乙酸乙酯(3x)萃取。合并的有机层用水(2×)、盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩，得到标题产物，为浅黄色油(10g，46.8mmol，69％收率)。
步骤3：制备(1R，2R)/(1S，2S)2-乙基-1-(2-三甲基硅烷基乙氧基羰基
氨基)环丙烷羧酸叔丁基酯，如下所示
向步骤2的产物(10g，46.8mmol)和3g的新近活化的4
分子筛/干燥苯(160mL)的悬浮液中，添加三乙胺(7.50mL，53.8mmol)和DPPA(11mL，10.21mmol)。使反应混合物回流3.5小时，然后添加2-三甲基甲硅烷-乙醇(13.5mL，94.2mmol)，使反应混合物回流过夜。过滤反应混合物，用二乙醚稀释，用10％棕檬酸水溶液、水、饱和NaHCO3水溶液、水(2×)、盐水(2×)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤和真空浓缩。将残余物由10g的Aldrich聚异氰酸酯清除剂树脂悬浮在120mL的二氯甲烷中，在室温下搅拌过夜并且过滤，得到标题产物(8g，24.3mmol；52％)，浅黄色油：
1H NMR(CDCl3)δ0.03(s，9H)，0.97(m，5H)，1.20(br m，1H)，1.45(s，9H)，1.40-1.70(m，4H)，4.16(m，2H)，5.30(br s，1H)。
步骤4：制备外消旋的(1R，2R)/(1S，2S)1-氨基-2-乙基环丙烷羧酸叔丁
基酯，如下所示
乙基相对于羧基是顺式的
向步骤3的产物(3g，9mmol)添加THF(9.3mL，9.3mmol)中的1.0MTBAF溶液，混合物被加热回流1.5小时，冷却至室温，然后用500mL的乙酸乙酯稀释。连续地用水(2×100mL)、盐水(2×100mL)洗涤溶液，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩，得到标题中间体。
II.制备P1′中间体
1.制备环丙基磺酰胺
方法1(两种方法之一)：
向冷却至0℃的100ml的THF的溶液中鼓入气态氨，直到达到饱和。向该溶液中添加5g(28.45mmol)的环丙基磺酰氯(购自ArrayBiopharma)的50mLTHF溶液，将该溶液升温至室温过夜，并且再搅拌1天。浓缩混合物直到1-2ml的溶剂剩余，施加到30g的SiO2填料(用30％-60％乙酸乙酯/己烷洗脱)，得到3.45g(100％)的环丙基磺酰胺，白色固体。
1H NMR(甲醇-d4)δ0.94-1.07(m，4H)，2.52-2.60(m，1H)；13C NMR(甲醇-d4)δ5.92，33.01。
方法2(两种方法之二)：
步骤1：制备N-叔丁基-(3-氯代)丙基磺酰胺
将叔丁胺(3.0mol，315.3mL)溶解在THF(2.5L)中。该溶液冷却至-20℃。慢慢地添加3-氯丙烷磺酰氯(1.5mol，182.4mL)。使反应混合物升温至室温并且搅拌24小时。过滤混合物，在真空中浓缩该滤液。将残余物溶解在二氯甲烷(2.0L)中。所得溶液用1N HCl(1.0L)、水(1.0L)、盐水(1.0L)洗涤并且用Na2SO4干燥。将其过滤并且真空浓缩，得到浅黄色固体，其从己烷中结晶，获得产物，白色固体(316.0g，99％)。
1H NMR(CDCl3)δ1.38(s，9H)，2.30-2.27(m，2H)，3.22(t，J＝7.35Hz，2H)，3.68(t，J＝6.2Hz，2H)，4.35(br，1H)。
步骤2：制备环丙烷磺酸叔丁基酰胺
在-78℃，向N-叔丁基-(3-氯代)丙基磺酰胺(2.14g，10.0mmol)/THF(100ml)的溶液中添加正丁基锂(2.5M在己烷中，8.0mL，20.0mmol)。在1小时内使反应混合物升温至室温。在真空中除去挥发物。剩余物在乙酸乙酯和水(200mL，200mL)之间分配。分离的有机相用盐水洗涤，用Na2SO4干燥，过滤和真空浓缩。残余物从己烷中再结晶而得到期望产物，白色固体(1.0g，56％)。
1H NMR(CDCl3)δ0.98-1.00(m，2H)，1.18-1.19(m，2H)，1.39(s，9H)，2.48-2.51(m，1H)，4.19(br，1H)。
步骤3：制备环丙基磺酰胺
在室温搅拌环丙烷磺酸叔丁基酰胺(110.0g，0.62mol)/TFA(500ml)的溶液16小时。在真空中除去挥发物。残余物从乙酸乙酯/己烷(60mL/240mL)中再结晶而得到期望产物，白色固体(68.5g，91％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.84-0.88(m，2H)，0.95-0.98(m，2H)，2.41-2.58(m，1H)，6.56(br，2H)。
2.制备C1取代的环丙基磺酰胺
2a.制备N-叔丁基-(1-甲基)环丙基-磺酰胺
步骤1：制备N-叔丁基-(3-氯代)丙基磺酰胺。
如上所述进行制备。
步骤2：制备N-叔丁基-(1-甲基)环丙基-磺酰胺。
将N-叔丁基-(3-氯代)丙基磺酰胺(4.3g，20mmol)溶液溶解在干THF(100ml)中并且冷却至-78℃。慢慢地向该溶液中添加正丁基锂(17.6mL，44mmol，2.5M，在己烷中)。移走干冰浴，在1.5小时内使反应混合物升温至室温。然后将该混合物冷却至-78℃，添加正丁基锂的溶液(20mmol，8mL，2.5M，在己烷中)。反应混合物升温至室温，在2小时内再冷却至-78℃，并且添加甲基碘的纯溶液(5.68g，40mmol)。使反应混合物升温至室温过夜，然后在室温下用饱和NH4Cl(100ml)猝灭。用乙酸乙酯(100ml)萃取。有机相用盐水(100ml)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩，得到黄色油，其从己烷中结晶而得到产物，为浅黄色固体(3.1g，81％)：
1H NMR(CDCl3)δ0.79(m，2H)，1.36(s，9H)，1.52(m，2H)，1.62(s，3H)，4.10(br s，1H)。
步骤3：制备1-甲基环丙基磺酰胺
将N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺(1.91g，10mmol)溶液溶解在TFA(30ml)中，在室温下搅拌反应混合物16小时。在真空中除去溶剂，得到黄色油，其从乙酸乙酯/己烷(1∶4，40mL)中结晶，而得到实施例3，1-甲基环丙基磺酰胺，白色固体(1.25g，96％)：
1H NMR(CDCl3)δ0.84(m，2H)，1.41(m，2H)，1.58(s，3H)，4.65(br s，2H)。
C4H9NO2S的分析计算值：C，35.54；H，6.71；N，10.36。实测值：C，35.67；H，6.80；N，10.40。
2b.制备1-苄基环丙基磺酰胺
步骤1：制备N-叔丁基-(1-苄基)环丙基-磺酰胺。
使用N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的合成中所述的方法获得所述化合物，收率为60％，不同之处在于使用1.05当量的溴化苄，然后用10％乙酸乙酯/己烷进行研磨：
1H NMR(CDCl3)δ0.92(m，2H)，1.36(m，2H)，1.43(s，9H)，3.25(s，2H)，4.62(br s，1H)，7.29-7.36(m，5H)。
步骤2：制备1-苄基环丙基磺酰胺
使用1-甲基环丙基磺酰胺的合成中所述的方法，由N-叔丁基(1-苄基)环丙基磺酰胺获得所述化合物，收率为66％，随后由最低量的10％乙酸乙酯/己烷来重结晶：
1H NMR(CDCl3)δ0.90(m，2H)，1.42(m，2H)，3.25(s，2H)，4.05(s，2H)，7.29(m，3H)，7.34(m，2H)；13C NMR(CDCl3)δ11.1，36.8，41.9，127.4，128.8，129.9，136.5。
2c.制备1-丙基环丙基磺酰胺
使用所述制备1-甲基环丙基磺酰胺的过程来制备所述化合物，不同之处在于在该过程的第二步中使用丙基卤化物替甲基碘。
2d.制备1-烯丙基环丙基磺酰胺
步骤1：制备N-叔丁基-(1-烯丙基)环丙基磺酰胺
根据N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的合成中所述的方法获得所述化合物，收率为97％，不同之处在于1.25当量的烯丙基溴被用作亲电试剂。该化合物直接用于下一反应而无需提纯：
1H NMR(CDCl3)δ0.83(m，2H)，1.34(s，9H)，1.37(m，2H)，2.64(d，J＝7.3Hz，2H)，4.25(br s，1H)，5.07-5.10(m，2H)，6.70-6.85(m，1H)。
步骤2：制备1-烯丙基环丙基磺酰胺
根据1-甲基环丙基磺酰胺的合成中所述的方法，从N-叔丁基-(1-烯丙基)环丙基磺酰胺获得该化合物1-烯丙基环丙基磺酰胺，收率为40％。使用2％甲醇/二氯甲烷作为洗脱液在SiO2上通过柱色谱法提纯化合物：
1H NMR(CDCl3)δ0.88(m，2H)，1.37(m，2H)，2.66(d，J＝7.0Hz，2H)，4.80(s，2H)，5.16(m，2H)，5.82(m，1H)；13C NMR(CDCl3)δ11.2，35.6，40.7，119.0，133.6。
2e.制备1-(1-环己烯基)环丙基-磺酰胺
步骤1：制备N-叔丁基-[1-(1-羟基)环己基]-环丙基磺酰胺
使用N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的合成所述的方法获得该化合物，收率为84％，不同之处在于，使用1.30当量的环己酮，然后由最低量的20％乙酸乙酯/己烷来重结晶：
1H NMR(CDCl3)δ1.05(m，4H)，1.26(m，2H)，1.37(s，9H)，1.57-1.59(m，6H)，1.97(m，2H)，2.87(br s，1H)，4.55(br s，1H)。
步骤2：制备1-(1-环己烯基)环丙基-磺酰胺
使用1-甲基环丙基磺酰胺的合成所述的方法，由N-叔丁基-[1-(1-羟基)环己基]-环丙基磺酰胺获得该化合物1-(1-环己烯基)-环丙基磺酰胺，收率为85％，随后由最低量的乙酸乙酯和己烷来重结晶：
1H NMR(DMSO-d6)δ0.82(m，2H)，1.28(m，2H)，1.51(m，2H)，1.55(m，2H)，2.01(s，2H)，2.16(s，2H)，5.89(s，1H)，6.46(s，2H)；13C NMR(DMSO-d6)δ11.6，21.5，22.3，25.0，27.2，46.9，131.6，132.2；LR-MS(ESI)：200(M+-1)。
2f.制备1-苯甲酰环-丙基磺酰胺
步骤1：制备N-叔丁基-(1-苯甲酰基)环丙基-磺酰胺
使用N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的合成所述的方法获得该化合物，收率为66％，不同之处在于1.2当量的苯甲酸甲酯被用作亲电试剂。使用30％-100％二氯甲烷/己烷在SiO2上通过柱色谱法提纯化合物：
1H NMR(CDCl3)δ1.31(s，9H)，1.52(m，2H)，1.81(m，2H)，4.16(br s，1H)，7.46(m，2H)，7.57(m，1H)，8.05(d，J＝8.5Hz，2H)。
步骤2：制备1-苯甲酰环-丙基磺酰胺
使用1-甲基环丙基磺酰胺的合成所述的方法，由N-叔丁基(1-苯甲酰基)环丙基磺酰胺获得该化合物，收率为87％，随后由最低量的乙酸乙酯/己烷来重结晶：
1H NMR(DMSO-d6)δ1.39(m，2H)，1.61(m，2H)，7.22(s，2H)，7.53(t，J＝7.6Hz，2H)，7.65(t，J＝7.6Hz，1H)，8.06(d，J＝8.2Hz，2H)；13C NMR(DMSO-d6)δ12.3，48.4，128.1，130.0，133.4，135.3，192.0。
2g.制备N-叔丁基-(1-苯基氨基羧基)-环丙基磺酰胺
使用N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺的合成所述的方法，使用1当量的苯基异氰酸酯，获得该化合物，收率为42％，随后由最低量的乙酸乙酯/己烷来重结晶
1H NMR(CDCl3)δ1.38(s，9H)，1.67-1.71(m，4H)，4.30(br s，1H)，7.10(t，J＝7.5Hz，1H)，7.34(t，J＝7.5Hz，2H)，7.53(t，J＝7.5Hz，2H)。
3.制备C1取代的环丙烷磺酰胺N-Boc保护基的使用
3a.制备环丙基磺酰胺叔丁基氨基甲酸酯，在制备C1取代的环丙基
磺酰胺中的关键中间体
步骤1：制备3-氯丙基氨磺酰
将3-氯丙烷磺酰氯溶液(55g，310.7mmol)溶解在THF(200ml)中并且在30分钟内滴加到被冷却到0℃的NH4OH(200ml)溶液中。将反应混合物升温至室温，搅拌1小时，用二氯甲烷(4X500mL)将水层分配数次。将合并的二氯甲烷层用1N HCl(150ml)、水(150ml)洗涤，用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩。从最低量的己烷中的二氯甲烷中再结晶出粗制固体，得到3-氯丙基氨磺酰，白色固体(45.3g，93％)。1H NMR(CDCl3)δ2.34(m，2H)，3.32(t，J＝7.3Hz，2H)，3.70(t，J＝6.2Hz，2H)，4.83(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ27.10，42.63，52.57。
步骤2：制备3-氯丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯
在30分钟内，向冷却至0℃的二氯甲烷(350mL)中的3-氯丙基氨磺酰(30.2g，191.5mmol)、三乙胺(30.2mL，217.0mmol)和4-DMAP(2.40g，19.6mmol)溶液中缓慢地滴加二氯甲烷(250ml)中的二叔丁基二碳酸酯(47.2g，216.9mmol)的溶液。使反应混合物升温至室温，搅拌额外的3小时，用1N HCl(300mL)、水(300mL)、盐水(300mL)分配，用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到粗产物。用70mL的己烷中的5％二氯甲烷研磨该材料，得到3-氯丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯，为灰白色固体(47.2g，96％)：
1H NMR(CDCl3)δ1.51(s，9H)，2.33(m，2H)，3.60(t，J＝7.3Hz，2H)，3.68(t，J＝6.21Hz，2H)；13C NMR(CDCl3)δ26.50，27.95，42.37，50.40，84.76，149.53。
步骤3：制备环丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯
在氩气气氛下，将正丁基锂溶液(74.7mL，119.5mmol，1.6M，在己烷中)溶解在干THF(105mL)中并且冷却至-78℃。在20-30分钟内，向该溶液中逐滴添加干THF(105mL)中的3-氯丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯(14g，54.3mmol)溶液。移走干冰浴，在2小时内使反应混合物升温至室温。用冰醋酸(3.4mL)冷浸反应混合物，真空浓缩，在二氯甲烷(100ml)和水(100ml)之间分配。用盐水(100ml)洗涤有机相，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩，得到环丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯，为蜡状的灰白色固体(12.08g，100％)：
1H NMR(CDCl3)δ1.10(m，2H)，1.34(m，2H)，1.50(s，9H)，2.88(m，1H)，7.43(s，1H)。13C NMR(CDCl3)δ6.21，28.00，31.13，84.07，149.82。
3b.制备1-甲氧基-甲基环丙基-磺酰胺
步骤1：制备1-甲氧基甲基环丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯
向冷却至-78℃的溶于THF(30ml)的环丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯(1.0g，4.5mmol)溶液中，添加正丁基锂(6.4mL，10.2mmol，1.6M，在己烷中)，并且搅拌反应混合物1小时。向该溶液中添加氯甲基甲醚(0.40mL，5.24mmol)的纯溶液，在一整夜使该混合物缓慢升温至室温。使用1N HCl水溶液，将溶液pH值调节至3，然后用乙酸乙酯(4×50mL部份)进行萃取。将合并的萃取物干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到1-甲氧基甲基环丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯，为蜡状的固体(1.20g，100％)，其直接用于下一反应而无需进一步提纯：
1H NMR(CDCl3)δ1.03(m，2H)，1.52(s，9H)，1.66(m，2H)，3.38(s，3H)，3.68(s，2H)，7.54(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ11.37，28.29，40.38，58.94，73.43，83.61，149.57。
步骤2：制备1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺
将1-甲氧基甲基环丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯(1.14g，4.30mmol)溶液溶解在50％TFA/二氯甲烷(30ml)溶液中，在室温下搅拌16小时。在真空中除去溶剂，在80g的SiO2上，对残余物进行色谱分析(用0％-60％乙酸乙酯/己烷洗脱)，得到1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺，白色固体(0.55g，77％，两个步骤的总计)：
1H NMR(CDCl3)δ0.95(m，2H)，1.44(m，2H)，3.36(s，3H)，3.65(s，2H)，4.85(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ11.17，40.87，59.23，74.80；LRMSm/z 183(M++NH4)。
3c.制备1-环丙基甲基环丙基磺酰胺
步骤1：制备1-环丙基甲基环丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯
根据描述于1-甲氧基甲基环丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯的合成中的方法，获得1-环丙基甲基环丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯，收率为92％，不同之处在于1.10当量的环丙基甲基溴被用作亲电试剂。该化合物直接用于下一反应而无需提纯：
1H NMR(CDCl3)δ0.10(m，2H)，0.51(m，2H)，0.67(m，1H)，1.10(m，2H)，1.49(s，9H)，1.62(m，2H)，1.87(d，J＝7.0Hz，2H)。
步骤2：制备1-环丙基甲基-环丙基磺酰胺
根据1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺的合成所述的方法，从1-环丙基甲基环丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯获得该化合物，收率为65％。使用0％-60％乙酸乙酯/己烷作为洗脱液在SiO2上通过柱色谱法提纯化合物：
1H NMR(CDCl3)δ0.15(m，2H)，0.51(m，2H)，1.01(m，2H)，1.34(m，3H)，1.86(d，J＝7.0Hz，2H)，4.83(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ4.65，7.74，11.26，35.62，41.21；LRMS m/z 193(M++NH4)。
3d.制备1-丙基氨甲酰基环丙烷-磺酰胺
步骤1：制备1-丙基氨甲酰基环丙烷磺酰胺叔丁基氨基甲酸酯
根据1-甲氧基甲基环丙基磺酰基胺叔丁基-氨基甲酸酯的合成所述的方法，获得了该化合物，粗产物收率为100％，不同之处在于1.10当量的异氰酸正丙酯被用作亲电试剂。该化合物直接用于下一反应而无需提纯：
1H NMR(CDCl3)δ0.10(m，2H)，0.51(m，2H)，0.67(m，1H)，1.10(m，2H)，1.49(s，9H)，1.62(m，2H)，1.87(d，J＝7.0Hz，2H)。
步骤2：制备1-丙基氨甲酰基环丙烷-磺酰胺
根据1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺的合成所述的方法，从1-丙基氨甲酰基环丙烷磺酰胺叔丁基氨基甲酸酯获得该化合物，优化的收率为50％，不同之处在于因为从最低量的二氯甲烷/己烷中再结晶出该材料，所以没有使用色谱法：
1H NMR(CDCl3)δ0.15(m，2H)，0.51(m，2H)，1.01(m，2H)，1.34(m，3H)，1.86(d，J＝7.0Hz，2H)，4.83(s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ4.65，7.74，11.26，35.62，41.21；LRMS m/z 193(M++NH4)。
3e.制备1-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)氨甲酰基环丙烷磺酰胺
步骤1：制备1-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)氨甲酰基环丙烷磺酰胺叔丁
基氨基甲酸酯
根据1-甲氧基甲基环丙基磺酰基胺叔丁基氨基甲酸酯的合成所述的方法，获得了该化合物，粗产物收率为100％，不同之处在于1.20当量的3，5-二甲基异噁唑-4-异氰酸酯被用作亲电试剂。该化合物直接用于下一反应而无需提纯。
步骤2：制备1-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)氨甲酰基环丙烷磺酰胺
使用30mL(120mmol)的4N HCl/二氧己环从1.62g(4.52mmol)的1-(3，5-二甲基异噁唑-4-基)氨甲酰基环-丙烷磺酰胺叔丁基氨基甲酸酯获得该化合物，收率为50％(580mg)，搅拌过夜，浓缩，在Biotage 40M柱上进行色谱提纯(用0％-5％甲醇/二氯甲烷洗脱)：
1H NMR(甲醇-d4)δ1.57(m，2H)，1.61(m 2H)，2.15(s，3H)，2.30(s，3H)，4.84(s，3H)；13C NMR(甲醇-d4)δ9.65，10.94，15.01，46.11，114.82，159.45，165.55，168.15；LRMS m/z 260(M++H)。
4.从环烷基溴制备环烷基磺酰胺
4a.从环丁基溴制备环丁基磺酰胺
向冷却至-78℃的30mL的无水二乙醚(二乙醚)中的5.0g(37.0mmol)的环丁基溴溶液中添加44mL(74.8mmol)的1.7M叔丁基锂/戊烷，在1.5小时内将溶液缓慢升温至-35℃。将该混合物缓慢经导管添加到冷却至-40℃的100ml己烷中的5.0g(37.0mmol)的最新蒸馏的磺酰氯溶液中，在1小时内升温至0℃并且小心地进行真空浓缩。将该混合物再溶解在二乙醚中，用一些冰冷水洗涤一次，干燥(MgSO4)，过滤，小心地进行浓缩。将该混合物再溶解在20mL的THF中，滴加到500mL的THF中的饱和NH3，并且使其搅拌过夜。在真空中将该混合物浓缩成粗制黄色固体，用1-2滴甲醇将其从最低量的二氯甲烷/己烷中再结晶，而得到1.90g(38％)的环丁基磺酰胺，白色固体。
1H NMR(CDCl3)δ1.95-2.06(m，2H)，2.30-2.54(m，4H)，3.86(p，J＝8Hz，1H)，4.75(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ16.43，23.93，56.29。
C4H8NSO2的HRMSm/z(M-H)-的计算值为134.0276，实测值为134.0282。
4b.制备环戊基磺酰胺
将醚中的18.5mL(37.0mmol)的2M环戊基氯化镁溶液滴加到冷却至-78℃的100ml己烷中的3.0mL(37.0mmol)最新蒸馏的磺酰氯(获自Aldrich)溶液中。在1小时内将混合物升温至0℃，然后小心地进行真空浓缩。将该混合物再溶解在二乙醚(200ml)中，用一些冰冷水(200ml)洗涤一次，干燥(MgSO4)，过滤，小心地进行浓缩。将该混合物再溶解在35mL的THF中，滴加到500mL的THF中的饱和NH3，并且使其搅拌过夜。在真空中浓缩该混合物至粗制的黄色固体，使用70％乙酸乙酯-己烷作为洗脱液，将残余物滤过50g的硅胶，然后浓缩该溶液。用1-2滴甲醇将残余物从最低量的二氯甲烷/己烷中再结晶，而得到2.49g(41％)的环戊基磺酰胺，白色固体。
1H NMR(CDCl3)δ1.58-1.72(m，2H)，1.74-1.88(m，2H)，1.94-2.14(m，4H)，3.48-3.59(m，1H)，4.80(br s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ25.90，28.33，63.54；MS m/e 148(M-H)-。
4c.制备环己基磺酰胺
将二乙醚中的18.5mL(37.0mmol)的2M环己基氯化镁(TCI Americas)溶液滴加到冷却至-78℃的100ml己烷中的3.0mL(37.0mmol)最新蒸馏的磺酰氯溶液中。在1小时内将混合物升温至0℃，然后小心地进行真空浓缩。将该混合物再溶解在二乙醚(200ml)中，用一些冰冷水(200ml)洗涤一次，干燥(MgSO4)，过滤，小心地进行浓缩。将该混合物再溶解在35mL的THF中，滴加到500mL的THF中的饱和NH3，并且使其搅拌过夜。在真空中浓缩该混合物至粗制的黄色固体，使用70％乙酸乙酯-己烷作为洗脱液，将残余物滤过50g的硅胶，然后进行浓缩。用1-2滴甲醇将残余物从最低量的二氯甲烷/己烷中再结晶，而得到1.66g(30％)的环己基-磺酰胺，白色固体。
1H NMR(CDCl3)δ1.11-1.37(m，3H)，1.43-1.56(m，2H)，1.67-1.76(m，1H)，1.86-1.96(m，2H)，2.18-2.28(m，2H)，2.91(tt，J＝12，3.5Hz，1H)，4.70(br s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ25.04，25.04，26.56，62.74；MS m/e 162(M-1)-。
4d.制备新戊基磺酰胺
遵循制备环己基磺酰胺的方法，将49mL(37mmol)的二乙醚中的0.75M新戊基氯化镁(Alfa)转化为1.52g(27％)的新戊基磺酰胺，白色固体。
1H NMR(CDCl3)δ1.17(s，9H)，3.12(s，2H)，4.74(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ29.46，31.51，67.38；MS m/e 150(M-1)-。
4e.制备环丁基甲基磺酰胺
使12.3g(83mmol)的环丁基甲基溴化物(Aldrich)和13.7g(91mmol)的碘化钠/150mL的丙酮溶液回流过夜，然后冷却至室温。滤出无机固体，在环境条件下和在150托在80℃分别蒸馏出丙酮和环丙基甲基碘(8.41g，46％)。
冷却至-78℃的4.0g(21.98mmol)的环丁基甲基碘/30mL的无水二乙醚(二乙醚)溶液经导管添加到17mL(21.98mmol)的1.3M仲-丁基锂/环己烷溶液中并且搅拌该溶液5分钟。向该混合物中，经导管添加冷却至-78℃的3.0g(21.98mmol)最新蒸馏的磺酰氯/110mL的己烷溶液，在1小时内混合物升温至室温，然后小心地进行真空浓缩。将该混合物再溶解在二乙醚中，用一些冰冷水洗涤一次，干燥(MgSO4)，过滤，小心地进行浓缩。将该混合物再溶解在30mL的THF中，滴加到500mL的THF中的饱和NH3，并且使其搅拌过夜。在真空中将该混合物浓缩成粗制黄色固体，用1-2滴甲醇将其从最低量的二氯甲烷/己烷中再结晶，而得到1.39g(42％)的环丁基甲基磺酰胺，白色固体。
1H NMR(CDCl3)δ1.81-2.03(m，4H)，2.14-2.28(m，2H)，2.81-2.92(m，1H)，3.22(d，J＝7Hz，2H)，4.74(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ19.10，28.21，30.64，60.93；MS m/e 148(M-1)-。时间：1.73，方法B)，818(M++H)
4.f制备环丙基甲基磺酰胺
使用用于制备环丁基甲基磺酰胺的方法，由环丙基甲基溴(Aldrich)制备环丙基甲基磺酰胺(参见JACS 1981，p.442-445)。
1H NMR(CDCl3)δ0.39-0.44(m，2H)，0.67-0.76(m，2H)，1.13-1.27(m，1H)，3.03(d，J＝7.3Hz，2H)，4.74(brs，2H)；13C NMR(CDCl3)δ4.33，5.61，59.93；MSm/e134(M-1)。
4g.制备2-噻吩磺酰胺
使用下述文献的方法由2-噻吩磺酰氯(购自Aldrich)来制备：JustusLiebigs Ann.Chem.，501，1933，p.174-182。
4h.制备4-溴苯磺酰胺
通过用THF中的饱和氨处理市售可得的4-溴基磺酰氯来制备4-溴苯基磺酰胺。
5.制备磺酰胺的一般性方法
通过将水(1当量)/THF添加至冷的(-20℃)搅拌的氯代异氰酸磺酰酯(1当量)/THF溶液并且使所得溶液升温至0℃来制备中间体氨磺酰氯。向该溶液中添加无水三乙胺(1当量)，随后添加必需的仲胺(1当量)。将反应混合物升温至室温，然后过滤，将滤液浓缩，获得所期望的磺酰胺。
III.制备P1′-P1中间体
1a.制备环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基环丙烷羰基)酰胺HCl
盐
步骤1：制备1(R)-叔丁氧基羰基氨基-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸
向1(R)-叔丁氧基羰基氨基-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(3.28g，13.2mmol)/THF(7mL)和甲醇(7mL)溶液中添加LiOH(1.27g，53.0mmol)/水(14mL)的悬浮液。在室温下搅拌该混合物过夜，并且用1N NaOH(15mL)和水(20ml)淬灭。所得混合物用乙酸乙酯(20ml)洗涤，有机相用20mL0.5N NaOH萃取。将合并的水相用1N HCl酸化，直到pH值为4，并且用乙酸乙酯(3×40ml)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到标题化合物，白色固体(2.62g，87％)。
1H NMR：(DMSO-d6)
1.22-1.26(m，1H)，1.37(s，9H)，1.50-1.52(m，1H)，2.05(q，J＝9Hz，1H)，5.04(d，J＝10Hz，1H)，5.22(d，J＝17Hz，1H)，5.64-5.71(m，1H)，7.18，7.53(s，NH(旋转异构体)，12.4(br s，1H))；LC-MS(停留时间：1.67分钟，方法B)，MS m/z 228(M++H)。
步骤2：制备环丙烷磺酸(1-(R)-叔丁氧基羰基氨基-2-(S)-乙烯基环丙
烷羰基)-酰胺
在氮气下将步骤1的产物(2.62g，11.5mmol)和CDI(2.43g，15.0mmol)/THF(40ml)溶液加热回流50分钟。冷却溶液至室温并且通过套管转移到环丙基磺酰胺(1.82g，15.0mmol)/THF(10ml)溶液中。向所得溶液添加DBU(2.40mL，16.1mmol)并且继续搅拌20小时。混合物用1NHCl淬灭至pH值为1并且THF真空浓缩。悬浮液用乙酸乙酯(2X50mL)萃取并且合并的有机萃取物被干燥(Na2SO4)，过滤和浓缩。由己烷-乙酸乙酯(1∶1)的再结晶进行纯化，获得标题化合物(2.4g)，白色固体。母液通过Biotage 40S柱提纯(洗脱，9％丙酮/二氯甲烷)，获得第二批标题化合物(1.1g)。将两批合并(总收率92％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.96-1.10(m，4H)，1.22(dd，J＝5.5，9.5Hz，1H)，1.39(s，9H)，1.70(t，J＝5.5Hz，1H)，2.19-2.24(m，1H)，2.90(m，1H)，5.08(d，J＝10Hz，1H)，5.23(d，J＝17Hz，1H)，5.45(m，1H)，6.85，7.22(s，NH(旋转异构体)；LC-MS(停留时间：1.70分钟，方法B)，MS m/z 331(M++H)。
步骤3：制备环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基环丙烷羰基)酰胺
HCl盐
在室温搅拌步骤2的产物(3.5g，10.6mmol)/二氯甲烷(35mL)和TFA(32mL)溶液1.5小时。在真空中除去挥发物并且将残余物悬浮在1NHCl/二乙醚(20ml)中，真空浓缩。重复该过程一次。由戊烷研磨所得混合物并且过滤，得到标题化合物，为吸湿性灰白色固体(2.60g，92％)。
1H NMR：(DMSO-d6)
1.01-1.15(m，4H)，1.69-1.73(m，1H)，1.99-2.02(m，1H)，2.38(q，J＝9Hz，1H)，2.92-2.97(m，1H)，5.20(d，J＝11Hz，1H)，5.33(d，J＝17Hz，1H)，5.52-5.59(m，1H)，9.17(br s，3H)；LC-MS(停留时间：0.24分钟，方法B)，MS m/z 231(M++H)。
1b.制备P1-P1′磺酰胺衍生物
向(1R，2S)1-叔丁氧基羰基氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸(217mg，1.194mmol)/THF(5ml)溶液添加CDI(290mg，1.791mmol)，并且反应混合物在回流条件下加热45分钟。在另一圆底烧瓶中，LiHMDS(1.0M溶液，在己烷中，2.4mL，2.4mmol)被添加到N-乙基甲基磺酰胺(330mg，2.388mmol)/THF(5ml)溶液并且在室温搅拌反应混合物1小时。将两种反应混合物添加在一起并且在室温下搅拌2小时。添加水以淬灭反应并且用乙酸乙酯萃取反应溶液。分离有机层并且用MgSO4干燥。过滤和浓缩该溶剂，获得粗产物，其由制备性HPLC提纯以获得所期望的N-Boc受保护的N-酰基磺酰胺。然后，在将化合物溶解在4N HCl/二氧己环(2ml)溶液中并且在室温下搅拌4小时的时候，去除了Boc保护基。将溶液蒸发，以HCl盐的形式获得淡褐色的油。(112mg，33％收率)。
1H NMR(400Mz，CD3OD)δ..1.16(t，J＝7.21Hz，3H)，1.68(dd，J＝10.03，7.83Hz，1H)，2.15(m，1H)，2.37(m，1H)，2.89(s，3H)，3.30(m，2H)，5.31(d，J＝10.27Hz，1H)，5.42(d，J＝17.12Hz，3H)，5.68(m，1H).LC-MS(停留时间：0.883分钟)，MS m/z 270(M+Na+)。
部分B：
制备通式I的化合物和实施例
实施例1
步骤1a
向间甲氧基苯胺(300g，2.44mol)和苯酰乙酸乙酯(234.2g，1.22mol)/甲苯(2.0L)溶液添加HCl(4.0N/二氧己环，12.2mL，48.8mmol)。使用Dean-Stark装置使所得溶液回流6.5小时(收集到约56mL的水溶液)。将混合物冷却至室温，用HCl水溶液(10％，3×500ml)、NaOH水溶液(1.0N，2×200ml)、水(3×200mL)分配多次，干燥(MgSO4)有机层，过滤，真空浓缩，获得油状的残余物(329.5g)。使用Dean-Stark装置(收集到约85mL液体)，在油浴(280℃)中加热粗产物80分钟。将反应混合物冷却至室温，用CH2Cl2(400mL)研磨固体残余物，过滤所得悬浮液，用更多CH2Cl2(2×150mL)洗涤滤饼。在真空中干燥所得固体(50℃；1托；1天)，获得了分析纯产物，为浅棕色固体(60.7g，20％，总计)。
1H NMR(DMSO-d6)δ3.86(s，3H)，6.26(s，1H)，6.94(dd，J＝9.0，2.4Hz，1H)，7.21(d，J＝2.4Hz，1H)，7.55-7.62(m，3H)，7.80-7.84(m，2H)，8.00(d，J＝9.0Hz，1H)，11.54(s，1H)；13C NMR(DMSO-d6)δ55.38，99.69，107.07，113.18，119.22，126.52，127.17，128.97，130.34，134.17，142.27，149.53，161.92，176.48.LC-MS(MS m/z 252(M++1)。
步骤1b
将步骤1a的产物(21.7g，86.4mmol)悬浮在POCl3(240mL)中。将悬浮液回流2小时。在真空中去除POCl3后，在乙酸乙酯(1L)和冷的NaOH水溶液(由1.0N 200mL NaOH和20mL 10.0N NaOH形成)之间分配残余物并且搅拌15分钟。用水(2X200ml)、盐水(200ml)洗涤有机层，干燥(MgSO4)，真空浓缩，获得期望产物(21.0g，90％)，为浅棕色固体。
1H NMR(DMSO-d6)δ3.97(s，3H)，7.36(dd，J＝9.2，2.6Hz，1H)，7.49-7.59(m，4H)，8.08(d，J＝9.2Hz，1H)，8.19(s，1H)，8.26-8.30(m，2H)；13CNMR(DMSO-d6)δ55.72，108.00，116.51，119.52，120.48，124.74，127.26，128.81，130.00，137.58，141.98，150.20，156.65，161.30.LC-MS(MS m/z270(M++1)。
步骤1c
在0℃向Boc-4R-羟脯氨酸(16.44g，71.1mmol)/DMSO(250ml)悬浮液中添加t-BuOK(19.93g，177.6mmol)。搅拌所形成的混合物1.5小时，然后分为3份在1小时内添加步骤1b的产物(21.02g，77.9mmol)。搅拌反应1天，倒入冷水(1.5L)中并且用二乙醚(4×200ml)洗涤。酸化该水溶液至pH值4.6，过滤，获得白色固体，在真空中干燥而获得产物(32.5g，98％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.32，1.35(二s(旋转异构体)9H)，2.30-2.42(m，1H)，2.62-2.73(m，1H)，3.76(m，2H)，3.91(s，3H)，4.33-4.40(m，1H)，5.55(m，1H)，7.15(dd，J＝9.2，2.6Hz，1H)，7.37(d，J＝2.6Hz，1H)，7.42-7.56(m，4H)，7.94-7.99(m，1H)，8.25，8.28(2s，2H)，12.53(brs，1H)；LC-MS，MS m/z 465(M++1)。
实施例2
A3/B)HCl (1R，2S)/(1S，2R)
方法A：R＝H(来自步骤Al) 步骤2a(总的制备)
方法B：R＝Ph(Aldrich) 来自方法A(步骤A1-A3)或
方法B(一步法)
步骤2a
通过各种以下方法来制备期望产物：
方法A
步骤A1
将甘氨酸乙酯盐酸盐(303.8g，2.16mol)悬浮在叔丁基甲基醚(1.6L)中。添加苯甲醛(231g，2.16mol)和无水硫酸钠(154.6g，1.09mol)并且使用冰-水浴冷却混合物至0℃。在30分钟内滴加三乙胺(455mL，3.26mol)并且在室温下搅拌混合物48小时。通过添加冰冷水(1L)淬灭反应并且分离有机层。用叔丁基甲基醚(0.5L)萃取水相并且用饱和NaHCO3水溶液(1L)和盐水(1L)的混合物洗涤合并的有机相。溶液用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，获得392.4g的期望产物，为浓黄色油，其被直接用于下一步中。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.32(t，J＝7.1Hz，3H)，4.24(q，J＝7.1Hz，2H)，4.41(d，J＝1.1Hz，2H)，7.39-7.47(m，3H)，7.78-7.81(m，2H)，8.31(s，1H)。
在60分钟内，向叔丁醇锂(84.06g，1.05mol)/干燥甲苯(1.2L)的悬浮液中滴加步骤A1的产物(100.4g，0.526mol)和反-1，4-二溴-2-丁烯(107.0g，0.500mol)/干燥甲苯(0.6L)的混合物。添加完成后，通过添加水(1L)和叔丁基甲基醚(TBME，1L)淬灭深红色混合物。分离水相并且用TBME(1L)再次萃取。合并有机相，添加1N HCl(1L)，在室温下搅拌混合物2小时。分离有机相并且用水(0.8L)萃取。然后合并水相，用盐(700g)饱和，添加TBME(1L)，将混合物冷却至0℃。然后通过滴加10N NaOH使搅拌的混合物碱化至pH值14，分离有机层，用TBME(2×500mL)萃取水相。将合并的有机萃取物干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，至体积为1L。向该溶液中添加二叔丁基二碳酸酯(131.0g，0.6mol)并且在室温下搅拌混合物4天。将额外的二叔丁基二碳酸酯(50g，0.23mol)添加到反应中，使混合物回流3小时，然后使其冷却至室温过夜。反应混合物用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，获得80g的原料。通过快速色谱法提纯该残余物(2.5Kg的SiO2，用1％-2％CH3OH/CH2Cl2洗脱)，获得57g(53％)的外消旋产物，为黄色油，其放置在冰箱中时固化。
1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.26(t，J＝7.1Hz，3H)，1.46(s，9H)，1.43-1.49(m，1H)，1.76-1.82(br m，1H)，2.14(q，J＝8.6Hz，1H)，4.18(q，J＝7.2Hz，2H)，5.12(dd，J＝10.3，1.7Hz，1H)，5.25(br s，1H)，5.29(dd，J＝17.6，1.7Hz，1H)，5.77(ddd，J＝17.6，10.3，8.9Hz，1H)；MS m/z 254.16(M+-1)。
步骤A3
将步骤A2的产物(9.39g，36.8mmol)溶解在4N HCl/二氧己环(90ml，360mmol)中并且在室温下搅拌2小时。浓缩反应混合物，以定量的收率获得期望产物(7g，100％)。
1H NMR(CD3OD)δ1.32(t，J＝7.1，3H)，1.72(dd，J＝10.2，6.6Hz，1H)，1.81(dd，J＝8.3，6.6Hz，1H)，2.38(q，J＝8.3Hz，1H)，4.26-4.34(m，2H)，5.24(dd，10.3，1.3Hz，1H)5.40(d，J＝17.2，1H)，5.69-5.81(m，1H)。
方法B
在-78℃向叔丁醇钾(11.55g，102.9mmol)/THF(450mL)溶液添加市售可得的甘氨酸乙酯的N，N-二苄基亚胺(25.0g，93.53mmol)/THF(112mL)。反应混合物升温至0℃，搅拌40分钟，然后冷却至-78℃。向该溶液中添加反-1，4-二溴-2-丁烯(20.0g，93.50mmol)。在0℃搅拌该混合物1小时，冷却至-78℃。添加叔丁醇钾(11.55g，102.9mmol)，混合物立即升温至0℃，真空浓缩前再搅拌1小时。将粗产物溶解在二乙醚(530mL)，中，。添加1N HCl水溶液(106mL，106mmol)，在室温下搅拌所得的两相混合物3.5小时。分离各层并且用二乙醚(2×)洗涤水层并且用饱和NaHCO3水溶液碱化。用二乙醚(3x)萃取水溶液并且用盐水洗涤合并的有机萃取物，干燥(MgSO4)，过滤，真空浓缩，获得游离胺。用4N HCl溶液/二氧己环(100ml，400mmol)处理该材料，浓缩而得到期望产物，为褐色半固体(5.3g，34％收率)，与获自方法A的物料相同，区别在于存在少量的未经确认的芳族杂质(8％)。
步骤2b
在0℃在10分钟内分3个部分向步骤1c的产物(11.0g，23.7mmol)、步骤2a的产物(5.40g，28.2mmol)和NMM(20.8mL；18.9mmol)/500mL的50％CH2Cl2/THF溶液添加耦合化学试剂溴代三吡咯烷鏻六氟磷酸盐(Pybrop)(16.0g，34.3mmol)。在室温搅拌该溶液1天，然后用pH值4.0的缓冲剂(4X50mL)洗涤。用饱和NaHCO3水溶液(100ml)洗涤有机层，水冲洗物用乙酸乙酯(150ml)萃取，用pH值4.0缓冲剂(50ml)和饱和NaHCO3水溶液(50ml)反洗有机层。干燥(MgSO4)有机溶液，过滤，浓缩，使用Biotage 65M柱提纯(用50％乙酸乙酯/己烷洗脱)，获得了超过7.5g的期望产物的(1R，2S)和(1S，2R)P1异构体的1∶1混合物(50％总计)，或者在Biotage 65M柱上洗脱，使用慢的15％-60％乙酸乙酯/己烷梯度，获得3.54g(25％)的高Rf洗脱(1R，2S)P1异构体和3.54g(25％)的低Rf洗脱(1S，2R)P1异构体。
(1R，2S)P1异构体的数据：
1H NMR(CDCl3)δ1.21(t，J＝7Hz，3H)，1.43(s，9H)，1.47-1.57(m，1H)，1.88(m，1H)，2.05-2.19(m，1H)，2.39(m，1H)，2.88(m，1H)，3.71-3.98(m，2H)，3.93(s，3H)，4.04-4.24(m，2H)，4.55(m，1H)，5.13(d，J＝10Hz，1H)，5.22-5.40(m，1H)，5.29(d，J＝17Hz，1H)，5.69-5.81(m，1H)，7.02(brs，1H)，7.09(dd，J＝9，2Hz，1H)，7.41-7.52(m，4H)，7.95(d，J＝9Hz，1H)，8.03，8.05(2s，2H)；13C NMR(CDCl3)δ：14.22；22.83，28.25，33.14，33.58，39.92，51.84，55.47，58.32，61.30，75.86，81.27，98.14，107.42，115.00，117.84，118.27，122.63，123.03，127.50，128.72，129.26，133.39，140.06，151.23，159.16，160.34，161.35，169.78，171.68.LC-MS(MS m/z 602(M++1)。
(1S，2R)P1异构体的数据：
1H NMRδ1.25(t，J＝7Hz，3H)，1.44(s，9H)，1.46-1.52(m，1H)，1.84(m，1H)，2.12-2.21(m，1H)，2.39(m，1H)，2.94(m，1H)，3.82(m，2H)，3.97(s，3H)，4.05-4.17(m，2H)，4.58(m，1H)，5.15(d，J＝10.8Hz，1H)，5.33(d，J＝17Hz，1H)，5.30-5.43(m，1H)，5.72-5.85(m，1H)，7.05(s，1H)，7.13(dd，J＝9，2Hz，1H)，7.46-7.60(m，4H)，7.98(d，J＝9，1H)，8.06-8.10(m，2H).LC-MS MS m/z 602(M++1)。
备选方案步骤2b
步骤2a的产物(7.5g，39.1mmol)与二异丙基乙胺(32.5mL，186mmol)/二氯甲烷(150ml)合并。向所得混合物添加HOBT水合物(6.85g，44.7mmol)和步骤1c的产物(17.3g，37.3mmol)，随后是HBTU(16.96g，44.7mmol)。立即出现了轻微的放热，在室温下搅拌该混合物过夜。然后真空浓缩混合物并且再溶解在乙酸乙酯(600mL)中。用水(2X200mL)、然后用10％碳酸氢钠水溶液(2X200mL)、然后用水(150ml)并且最后用盐水(150ml)洗涤该溶液。有机物用无水硫酸镁干燥并且过滤，在真空中浓缩该滤液，获得米黄色玻璃状固体。在Biotage Flash 75M筒(66％己烷/乙酸乙酯)上通过快速色谱法在多批(7g，每批)中进行纯化，获得(1R，2S)P1异构体，作为最初的洗脱异构体(总计9.86g，44.0％收率)，随后洗脱(1S，2R)P1异构体作为第二洗脱异构体(总计10.43g，46.5％收率)。总共回收了1.97g的混合级分，两种非对映异构体的总转化率为99.3％。
(1R，2S)P1异构体的数据：
1H NMR(甲醇-d4)δ1.23(t，J＝7.2Hz，3H)，1.4(s，4H)，1.45(s，6H)，1.73(dd，J＝7.9，1.5Hz，0.4H)，1.79(dd，J＝7.8，2.4Hz，0.6H)，2.21(q，J＝8.2Hz，1H)，2.44-2.49(m，1H)，2.66-2.72(m，0.4H)，2.73-2.78(m，0.6H)，3.93-3.95(m，2H)，3.96(s，3H)，4.10-4.17(m，2H)，4.44(q，J＝7.8Hz，1H)，5.13(d，J＝10.7Hz，1H)，5.31(d，J＝17.7Hz，0.4H)，5.32(d，J＝17.4Hz，0.6H)，5.49(bs，1H)，5.66-5.82(m，1H)，7.16(dd，J＝9.2，2.5Hz，1H)，7.26(s，1H)，7.42(d，J＝2.4Hz，1H)，7.48-7.55(m，3H)，8.02-8.05(m，3H)；LC-MS(MS m/z 602(M++1)；
(1S，2R)P1异构体的数据：
1H NMR(甲醇-d4)δ1.23(t，J＝7.2Hz，3H)，1.40(s，3.5H)，1.43(s，6.5H)，1.8(dd，J＝7.2，5.3Hz，0.4H)，1.87(dd，J＝7.8，5.7Hz，0.6H)，2.16(q，J＝8.9Hz，0.6H)，2.23(q，J＝8.85Hz，0.4H)，2.42-2.50(m，1H)，2.67-2.82(m，1H)，3.87-3.95(m，2H)，3.96(s，3H)，4.07-4.19(m，3H)，4.41-4.47(m，1H)，5.09-5.13(m，1H)，5.30(dd，J＝17.09，0.92Hz，1H)，5.48(s，1H)，5.70-5.77(m，1H)，7.15(dd，J＝9.16，2.44Hz，1H)，7.25(s，1H)，7.41(d，J＝2.14Hz，1H)，7.48-7.55(m，3H)，8.02-8.05(m，3H)；LC-MS(MS m/z 602(M++1)。
步骤2c
用1N NaOH(50mL，50mmol)/THF(150ml)和甲醇(80ml)的混合物处理步骤2b的(1R，2S)P1异构体(9.86g，16.4mmol)12小时。在真空中浓缩该混合物直到仅仅水相剩余。添加水(100ml)并且慢慢地添加1N HCl直到pH值为3。然后用乙酸乙酯(3X200mL)萃取混合物，并且用盐水洗涤合并的有机萃取物，用无水硫酸钠干燥，并且过滤。在真空中浓缩该滤液，获得期望产物，为白色粉末(9.2g，98％收率)。
1H NMR(CD3OD)δ1.41(s，2H)，1.45(s，9H)，1.77(dd，J＝7.9，5.5Hz，1H)，2.16-2.21(m，1H)，2.44-2.51(m，1H)，2.74-2.79(m，1H)，3.93-3.96(m，2H)，3.98(s，3H)，4.44(t，J＝7.9Hz，1H)，5.11(d，J＝9.5Hz，1H)，5.30(d，J＝17.1Hz，1H)，5.52(s，1H)，5.79-5.86(m，1H)，7.22(dd，J＝9.16，2.14Hz，1H)，7.32(s，1H)，7.43(d，J＝2.14Hz，1H)，7.54-7.60(m，3H)，8.04(dd，J＝7.8，1.4Hz，2H)，8.08(d，J＝9.1Hz，1H)；LC-MS(MS m/z 574(M++1)。
实施例3
步骤3a
步骤2c的产物(7.54g，13.14mmol)与CDI(3.19g，19.7mmol)和DMAP(2.41g，19.7mmol)/无水THF结合，所得混合物加热回流45分钟。使略不透明的混合物冷却至室温，向其添加环丙基磺酰胺(1.91g，15.8g)。添加DBU(5.9mL，39.4mmol)后，混合物变澄清。搅拌褐色溶液过夜。然后真空浓缩混合物成油，并且将其再溶解于乙酸乙酯(500ml)中。用pH值4的缓冲剂(3X200mL)洗涤溶液，合并的缓冲剂冲洗物用乙酸乙酯(200ml)反萃取。合并的有机物用盐水(150ml)洗涤，用无水硫酸钠干燥并且过滤。在真空中浓缩滤液，获得米黄色固体。通过快速色谱法在Biotage Flash 75M筒(25％己烷/乙酸乙酯)上提纯粗产物，获得期望产物(5.85g，66％收率)。
1H NMR(CD3OD)δ1.03-1.09(m，2H)，1.15-1.28(m，2H)，1.40-1.44(m，2H)，1.46(s，9H)，1.87(dd，J＝8.1，5.6Hz，1H)，2.21-2.27(m，1H)，2.36-2.42(m，1H)，2.65(dd，J＝13.7，6.7Hz，1H)，2.93-2.97(m，1H)，3.90-3.96(m，2H)，4.00(s，3H)，4.40(dd，J＝9.5，7.0Hz，1H)，5.12(d，J＝10.4Hz，1H)，5.31(d，J＝17.4Hz，1H)，5.64(s，1H)，5.73-5.80(m，1H)，7.30(dd，J＝9.2，2.1Hz，1H)，7.40(s，1H)，7.47(s，1H)，7.61-7.63(m，3H)，8.04-8.05(m，2H)，8.15(d，J＝9.5Hz，1H)；LC-MS(MS m/z 677(M++1)。
步骤3b
用4.0M HCl/1，4-二氧己环(50mL，200mmol)处理步骤3a的产物(5.78g，8.54mmol)过夜。在真空中浓缩反应混合物并且在50℃将其置于真空干燥炉中数天。获得了期望产物，为米黄色粉末(5.85g，定量)。
1H NMR(甲醇-d4)δ1.03-1.18(m，3H)，1.26-1.30(m，1H)，1.36-1.40(m，2H)，1.95(dd，J＝8.2，5.8Hz，1H)，2.37(q，J＝8.9Hz，1H)，2.51-2.57(m，1H)，2.94-2.98(m，1H)，3.09(dd，J＝14.6，7.3Hz，1H)，3.98(d，J＝3.7Hz，1H)，3.99(s，1H)，4.08(s，3H)，4.80(dd，J＝10.7，7.6Hz，1H)，5.15(dd，J＝10.2，1.4Hz，1H)，5.32(dd，J＝17.1，1.2Hz，1H)，5.61-5.69(m，1H)，5.99(t，J＝3.7Hz，1H)，7.51(dd，J＝9.3，2.3Hz，1H)，7.59(d，J＝2.4Hz，1H)，7.65(s，1H)，7.72-7.79(m，3H)，8.09(dd，J＝7.0，1.5Hz，2H)，8.53(d，J＝9.2Hz，1H)；LC-MS(MS m/z 577(M++1)。
实施例4
向含PS-DIEA树脂(Argonaut Technologies，0.047g，0.175mmol)的反应容器添加适当地被取代的羧酸(如下所述)(0.044mmol)/DMF(0.25mL)溶液，随后添加步骤3b的产物(0.020g，0.029mmol)/DMF(0.50mL)溶液，随后添加HATU(0.017g，0.044mmol)/DMF(0.25mL)溶液。在室温下摇晃混合物3天。向反应中添加PS-三胺(trisamine)树脂(ArgonautTechnologies，0.025g，0.086mmol)，在室温下摇晃混合物18小时。过滤反应混合物，在真空中浓缩该滤液，获得粗产物，其是由制备性HPLC提纯的，从而获得期望产物，形式为三氟乙酸盐。
实施例4，化合物1
由制备性HPLC提纯，并且以单三氟乙酸盐的形式分离：
1H NMR(CD3OD)δ1.06-1.14(m，2H)，1.18-1.23(m，1H)，1.26-1.32(m，1H)，1.46(dd，J＝9.5，5.2Hz，1H)，1.96(dd，J＝7.9，5.2Hz，1H)，2.33(q，J＝8.5Hz，1H)，2.40-2.46(m，1H)，2.69(s，1H)，2.69-2.72(m，1H)，3.86(d，J＝12.5Hz，1H)，3.93(dd，J＝12.5，2.1Hz，1H)，4.09(s，3H)，4.69(dd，J＝9.5，7.6Hz，1H)，5.17-5.19(m，2H)，5.35-5.39(dd，J＝17.1，0.9Hz，1H)，5.63(s，1H)，5.74-5.81(m，1H)，6.73-6.81(m，3H)，7.18(d，J＝7.0Hz，1H)，7.25(s，1H)，7.41(m，1H)，7.51(d，J＝2.1Hz，1H)，7.72-7.77(m，3H)，7.84(d，J＝9.2Hz，1H)，7.98-7.99(m，3H)；LC-MS(MS m/z 711(M++1)。
实施例4，化合物2
由制备性HPLC提纯，并且作为两种异构体的混合物以单三氟乙酸盐的形式分离。LC-MS(MS m/z 691(M++1)。
实施例4，化合物3
由制备性HPLC提纯，并且以双三氟乙酸盐的形式分离。
1H NMR(CD3OD)δ1.04-1.19(m，4H)，1.24-1.29(m，2H)，1.42(dd，J＝9.3，5.3Hz，1H)，1.92(dd，J＝8.1，5.3Hz，1H)，2.27(q，J＝8.7Hz，1H)，2.44-2.50(m，1H)，2.70(s，1H)，2.74-2.79(m，1H)，2.93-2.98(m，1H)，3.12-3.24(m，3H)，4.05(s，3H)，4.21(dd，J＝3.5，12.3Hz，1H)，4.48(d，J＝12.2Hz，1H)，4.61-4.70(m，2H)，5.15(dd，J＝1.5，10.4Hz，1H)，5.33(dd，J＝17.4，1.5Hz，1H)，5.71-5.79(m，1H)，5.84-5.91(m，1H)，7.35(s，1H)，7.39-7.43(m，1H)，7.53(d，J＝2.4Hz，1H)，7.58(s，1H)，7.67-7.75(m，4H)；LC-MS(MS m/z 715(M++1)。
实施例4，化合物4
由制备性HPLC提纯并且以单三氟乙酸盐的形式分离。LC-MS(MSm/z 717(M++1)。
实施例4，化合物5
由制备性HPLC提纯，并且以单三氟乙酸盐的形式分离：
1H NMR(CD3OD)δ0.91(d，J＝6.4Hz，3H)，0.98(d，J＝6.7Hz，3H)，1.02-1.05(m，1H)，1.06-1.10(m，2H)，1.15-1.18(m，1H)，1.20-1.30(m，2H)，1.43(dd，J＝9.3，5.3Hz，1H)，1.91(dd，J＝8.1，5.3Hz，1H)，2.05-2.10(m，1H)，2.25(q，J＝8.9Hz，1H)，2.41-2.48(m，1H)，2.70(s，1H)，2.70-2.75(m，1H)，2.92-2.98(m，1H)，4.06(s，3H)，4.14(dd，J＝12.5，3.1Hz，1H)，4.36(d，J＝12.5Hz，1H)，4.63(dd，J＝10.2，6.9Hz，1H)，5.14(d，J＝10.4Hz，1H)，5.32(d，J＝17.1，1H)，5.73-5.81(m，1H)，5.85-5.88(m，1H)，7.44(dd，J＝9.2，2.1Hz，1H)，7.53(d，J＝2.1Hz，1H)，7.61(s，1H)，7.70-7.77(m，3H)，8.05-8.09(m，2H)，8.27(dd，J＝9.2，2.8Hz，1H)；LC-MS(MS m/z 677(M++1)。
实施例4，化合物6
由制备性HPLC提纯，并且以单三氟乙酸盐的形式分离：LC-MS(MS m/z 691(M++1)。
实施例4，化合物7
向实施例3b的双三氟乙酸(根据实施例3a中所示的方案制备，51.0mg，0.063mmol)/二氯甲烷(2ml)溶液添加DIEA(66μL，0.378mmol)、HATU(36mg，0.126mmol)、HOAt(13.0mg，0.126mmol)、和(S)-(-)-2-羟基-3，3-二甲基丁酸(13.0mg，0.126mmol)。在室温下搅拌16小时后，浓缩溶剂并且通过反相制备性HPLC提纯所得的褐色粘性油，获得期望产物(单三氟乙酸盐)，白色固体(45.5mg，89％收率)。
1H NMR(CD3OD)δ0.99(s，9H)，1.06-1.09(m，2H)，1.22-1.25(m，2H)，1.43(dd，J＝9.8，5.5Hz，1H)，1.90(dd，J＝8.2，5.5Hz，1H)，2.24(q，J＝8.7Hz，1H)，2.39-2.44(m，1H)，2.72(dd，J＝13.7，7.6Hz，1H)，2.91-2.96(m，1)，4.04(s，1H)，4.07(s，3H)，4.16(dd，J＝13.1，3.4Hz，1H)，4.48(dd，J＝13.1，1.2Hz，1H)，4.64(dd，J＝10.2，6.9Hz，1H)，5.14(dd，J＝10.4，1.5Hz，1H)，5.31(dd，J＝17.2，1.2Hz，1H)，5.71-5.78(m，1H)，5.86(bs，1H)，7.48(dd，J＝9.3，2.3Hz，1H)，7.55(d，J＝2.4Hz，1H)，7.65(s，1H)，7.72-7.79(m，3H)，8.07(dd，J＝8.2，1.2Hz，1H)，8.28(d，J＝9.2Hz，1H)；LC/MS(MH+，691)
实施例5，化合物1
向实施例4的化合物7单三氟乙酸盐(50.0mg，0.062mmol)/THF(1ml)溶液添加NaH(11.5mg，0.279mmol)，随后叔丁基异氰酸酯(24.6mg，0.248mmol)。在室温下搅拌14小时后，反应用乙酸乙酯(5ml)稀释并且用饱和NH4Cl(2ml)洗涤。用2×3mL乙酸乙酯萃取水层。将合并的有机层用MgSO4干燥，过滤，浓缩至留下约1mL的溶剂。添加己烷(15mL)，产生白色沉淀，其被过滤并且用冷的己烷洗涤，获得白色固态产物(45.2mg，92％收率)。
1H NMR(CD3OD)δ1.06(s，9H)，1.09(s，9H)，1.19-1.25(m，3H)，1.31-1.42(m，2H)，1.88(t，J＝6.7Hz，1H)，2.20-2.27(m，1H)，2.40-2.45(m，1H)，2.72-2.76(m，1)，2.94(br s，1H)，4.06(s，4H)，4.64(br s，2H)，5.13(d，J＝9.8Hz，1H)，5.30(t，J＝1.7Hz，1H)，5.65-5.72(m，1H)，5.84(br s，1H)，7.37(d，J＝9.8Hz，1H)，7.52(s，1H)，7.63(s，1H)，7.72-7.78(m，3H)，8.06(d，J＝7.0Hz，2H)，8.51(d，J＝9.5Hz，1H)；LC/MS(MH+，(790)。
实施例5，化合物2
通过使异丙基异氰酸酯替代实施例5，化合物1的方法中的叔丁基异氰酸酯，制备期望产物。
LC/MS(MH+，776)。
实施例5，化合物3
通过使环戊基异氰酸酯替代实施例5，化合物1的方法中的叔丁基异氰酸酯，制备期望产物。
1H NMR(CD3OD)δ1.05(br s，1H)，1.07(s，9H)，1.1-1.16(m，2H)，1.23-1.24(m，2H)，1.28-1.37(m，2H)，1.41(dd，J＝9.5，5.5Hz，1H)，1.50(brs，5H)，1.89(dd，J＝8.2，5.8Hz，1H)，2.23(t，J＝8.9Hz，1H)，2.40-2.45(m，1H)，2.76(dd，J＝12.8，6.4Hz，1H)，2.92-2.97(m，1H)，4.82(s，4H)，5.14(dd，J＝10.4，1.5Hz，1H)，5.29(d，J＝17.1Hz，1H)，5.65-5.73(m，1H)，5.85(br，s，1H)，7.38(dd，J＝9.2，1.8Hz，1H)，7.53(d，J＝2.4Hz，1H)，7.64(s，1H)，7.72-7.79(m，4H)，8.07(d，J＝7.0Hz，2H)，8.50(d，J＝9.2Hz，1H).LC/MS(MH+，(802)。
实施例5，化合物4
通过使异氰酸苯酯替代实施例5，化合物1的方法中的叔丁基异氰酸酯，制备期望产物。
1H NMR(CD3OD)δ1.13-1.18(m，1H)，1.24(s，9H)，1.32-1.38(m，3H)，1.51(dd，J＝9.8，5.8Hz，1H)，1.95-2.00(m，1H)，2.30-2.61(m，1H)，2.89(dd，J＝13.1，1.8Hz，1H)，3.03-3.08(m，1H)，4.17(s，4H)，4.77(dd，J＝10.4，7.0Hz，1H)，4.87(t，J＝5.9Hz，1H)，4.89(d，J＝5.5Hz，1H)，4.99(d，J＝5.2Hz，1H)，5.24(dd，J＝10.4，1.8Hz，1H)，5.39(d，J＝17.4Hz，1H)，5.75-5.83(m，1H)，5.98(br s，1H)，7.10(m，1H)，7.27(s，4H)，7.40(d，J＝9.2Hz，1H)，7.62(d，J＝2.1Hz，1H)，7.76(d，J＝5.2Hz，1H)，7.82-7.89(m，4H)，8.18(d，J＝9.5Hz，2H)，8.60(d，J＝9.2Hz).LC/MS(MH+，810)。
实施例5，化合物5
通过使4-甲氧基苯基异氰酸酯替代实施例5，化合物1的方法中的叔丁基异氰酸酯，制备期望产物。
LC/MS(MH+，840)。
实施例5，化合物6
通过使4-甲氧基-2-甲基苯基异氰酸酯替代实施例5，化合物1的方法中的叔丁基异氰酸酯，制备期望产物。
LC/MS(MH+，854)。
实施例5，化合物7
通过使4-N，N-二甲基氨基苯基异氰酸酯替代实施例5，化合物1的方法中的叔丁基异氰酸酯，制备期望产物。
LC/MS(MH+，854)。
实施例6
向Boc-HYP-OH(231mg，1.0mmol)/DMSO(10ml)溶液添加叔丁醇钾(336mg，3.0mmol)。在环境温度搅拌所形成的溶液1小时，然后添加2-氯代异喹啉(180mg，1.1mmol)。在环境温度搅拌最终溶液12小时，用冰水淬灭，用1M HCl酸化至pH值4，用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。用盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩。通过制备性HPLC提纯残余物，获得272mg(76％)的期望产物，为灰白色泡沫。
1H NMR(CD3OD)δ1.42，1.44(旋转异构体，1∶2，9H)，2.39-2.44(m，1H)，2.68-2.72(m，1H)，3.80-3.90(m，2H)，4.44-4.52(m，1H)，5.78(b，1H)，7.31-7.33(m，1H)，7.58(t，J＝7.8Hz，1H)，7.71(t，J＝7.5Hz，1H)，7.81(d，J＝8.0Hz，1H)，7.95(d，J＝6.0Hz，1H)，8.19(d，J＝8.0Hz，1H)；LC/MS(MH+，359)。
步骤7a
向1(R)-叔丁氧基羰基氨基-2(S)-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(通过描述于WO 03/099274中所述的方法制备，3.28g，13.2mmol)/THF(7mL)和甲醇(7mL)溶液中添加LiOH(1.27g，53.0mmol)/水(14mL)的悬浮液。在室温下搅拌该混合物过夜，并且用1N NaOH(15mL)和水(20ml)淬灭。所得混合物用乙酸乙酯(20ml)洗涤，有机相用20mL 0.5N NaOH萃取。将合并的水相用1N HCl酸化至pH值为4，并且用乙酸乙酯(3×40ml)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，浓缩，得到所期望的化合物，白色固体(2.62g，87％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.22-1.26(m，1H)，1.37(s，9H)，1.50-1.52(m，1H)，2.05(q，J＝9Hz，1H)，5.04(d，J＝10Hz，1H)，5.22(d，J＝17Hz，1H)，5.64-5.71(m，1H)，7.18，7.53(s，NH(旋转异构体)，12.4(br s，1H)；LC/MS(MH+，228)。
步骤7b
在氮气下将步骤7a的产物(2.62g，11.5mmol)和CDI(2.43g，15.0mmol)/THF(40ml)溶液加热回流50分钟。冷却溶液至室温并且通过套管转移到环丙烷磺酸酰胺(1.82g，15.0mmol)/THF(10ml)溶液中。向所得溶液添加DBU(2.40mL，16.1mmol)并且继续搅拌20小时。混合物用1N HCl淬灭至pH值为1并且在真空中蒸发THF。悬浮液用乙酸乙酯(2×50mL)萃取并且合并的有机萃取物被干燥(Na2SO4)，过滤和浓缩。由己烷-乙酸乙酯(1∶1)的再结晶进行纯化，获得所期望的化合物(2.4g)，白色固体。母液通过Biotage 40S柱提纯(洗脱，9％丙酮/二氯甲烷)，获得第二批所期望的化合物(1.1g)。将两批合并(总收率92％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ0.96-1.10(m，4H)，1.22(dd，J＝5.5，9.5Hz，1H)，1.39(s，9H)，1.70(t，J＝5.5Hz，1H)，2.19-2.24(m，1H)，2.90(m，1H)，5.08(d，J＝10Hz，1H)，5.23(d，J＝17Hz，1H)，5.45(m，1H)，6.85，7.22(s，NH(旋转异构体)；LC/MS(MH+，331)。
步骤7c
在室温搅拌步骤7b的产物(3.5g，10.6mmol)/二氯甲烷(35mL)和TFA(32mL)溶液1.5小时。在真空中除去挥发物并且将残余物悬浮在1NHCl/二乙醚(20ml)中，真空浓缩。重复该方法一次。由戊烷研磨所得混合物并且过滤，得到期望产物，为吸湿性灰白色固体(2.60g，92％)。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.01-1.15(m，4H)，1.69-1.73(m，1H)，1.99-2.02(m，1H)，2.38(q，J＝9Hz，1H)，2.92-2.97(m，1H)，5.20(d，J＝11Hz，1H)，5.33(d，J＝17Hz，1H)，5.52-5.59(m，1H)，9.17(br s，3H)；LC/MS(MH+，(231)。
步骤7d
向步骤6的产物(358mg，1.0mmol)、步骤7c的产物(293mg，1.1mmol)和HATU(570mg，1.5mmol)/DCM(10ml)的冰冷混合物中添加二异丙基乙胺(387mg，3.0mmol)。使所形成的溶液升温至环境温度达12小时，用乙酸乙酯(200ml)稀释，用5％柠檬酸(2X50mL)和盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤和浓缩。用甲醇(10ml)研磨残余物，获得了470mg(82％)的期望产物。
1H NMR(DMSO-d6)δ1.00-1.09(m，4H)，1.35-1.38(m，10H)，1.69-1.84(m，1H)，2.11-2.66(m，3H)，2.89-2.93(m，1H)，3.62-3.89(m，2H)，4.31(t，J＝8.1Hz，1H)，5.12(d，J＝10.8Hz，1H)，5.27(d，J＝16.8Hz，1H)，5.58-5.70(m，1H)，5.76(b，1H)，7.43(d，J＝5.7Hz，1H)，7.66(t，J＝7.4Hz，1H)，7.79(t，J＝7.5Hz，1H)，7.92(d，J＝8.1Hz，1H)，8.02(d，J＝10Hz，1H)，8.13(d，J＝8.1Hz，1H)，9.02(s，1H)；LC/MS(MH+，571)。
步骤7e
向步骤7d的产物(435mg，0.76mmol)/二氯甲烷(5ml)的冰冷溶液中添加TFA(5ml)。使所形成的溶液升温至环境温度2小时，并且在真空中除去溶剂。用1M HCl/二乙醚研磨残余物，通过过滤收集，用二乙醚洗涤，获得了400mg(97％)的期望产物，为白色固体。
LC/MS(MH+，471)。
实施例8
通过使实施例7e和(S)-(-)-2-羟基-3，3-二甲基丁酸在步骤7b方法中分别取代步骤7c的产物和步骤6的产物来制备期望产物。
1H NMR(CD3OD)δ0.98(s，9H)，1.05-1.09(m，2H)，1.21-1.27(m，2H)，1.39-1.44(m，1H)，1.87-1.91(m，1H)，2.20-2.31(m，2H)，2.53-2.62(m，1H)，2.90-2.99(m，1H)，4.02-4.08(m，2H)，4.31(d，J＝12Hz，1H)，4.60-4.66(m，1H)，5.11-5.15(m，1H)，5.29(d，J＝17Hz，1H)，5.66-5.79(m，1H)，5.88(b，1H)，7.34(d，J＝6.0Hz，1H)，7.58(t，J＝8.9Hz，1H)，7.72(t，J＝8.7Hz，1H)，7.82(d，J＝8.1Hz，1H)，7.97(d，J＝5.7Hz，1H)，8.17(d，J＝8.4Hz，1H)，9.24(s，1H)；LC/MS(MH+，585)。
实施例9
向实施例8的产物(12mg，0.02mmol)/THF(1ml)的冰冷溶液中添加NaH(60％，24mg，0.08mmol)。在这一温度搅拌该混合物1小时，然后添加环戊基异氰酸酯(9mg，0.08mmol)。在0℃再搅拌该最终溶液1小时，然后用5％柠檬酸淬灭并且用乙酸乙酯(10ml)萃取。用5％柠檬酸和盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩。通过制备性HPLC提纯残余物，获得5mg(36％)的期望产物，为白色固体。
1H NMR(CD3OD)δ1.06(s，9H)，1.23-1.89(m，10H)，2.21-2.30(m，2H)，2.60-2.69(m，1H)，2.92-2.99(m，1H)，3.66-3.70(m，1H)，3.99-4.03(m，1H)，4.51-4.60(m，2H)，4.76(s，1H)，5.12(d，J＝10Hz，1H)，5.28(d，J＝17.5Hz，1H)，5.65-5.75(m，1H)，5.87(b，1H)，7.33(d，J＝6.0Hz，1H)，7.54(t，J＝8.9Hz，1H)，7.72(t，J＝8.7Hz，1H)，7.81(d，J＝8.1Hz，1H)，7.95(d，J＝5.7Hz，1H)，8.34(d，J＝8.4Hz，1H)，8.99(s，1H)；LC/MS(MH+，696)。
实施例50：制备化合物50。
步骤1：
在0℃向3-甲氧基肉桂酸(11.04g，62mmol)和三乙胺(12.52g，124mmol)/丙酮(80ml)滴加氯甲酸乙酯(大约1.5当量)。在这一温度搅拌1小时后，滴加NaN3水溶液(6.40g，100mmol/35mLH2O)并且在环境温度搅拌反应混合物16小时。将水(100ml)添加到混合物中，并且在真空中除去挥发物。所得的浆液用甲苯(3×50mL)萃取，合并的有机层用MgSO4干燥，过滤和浓缩。在190℃将干燥溶液滴加至加热的二苯甲烷(50ml)和三丁胺(30ml)的溶液中。添加期间蒸馏出甲苯。在完成添加后，将反应温度升高到210℃达2小时。冷却后，通过过滤收集沉淀产物，用己烷(2×50mL)洗涤，干燥而得到期望产物，为白色固体(5.53g，51％)(NicolasBriet等，Tetrahedron，2002，5761-5766)。
LC-MS，MS m/z 176(M++H)。
步骤2：
6-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮(5.0g、28.4mmol)/POCl3(10ml)被加热以温和地回流3小时，然后使混合物真空浓缩(Nicolas Briet等，Tetrahedron，2002，5761-5766)。将残余物倾倒入冰水(20ml)中并且通过添加10MNaOH使得pH值为10。用CHCl3萃取所得混合物。用盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩。通过快速色谱法(1∶1己烷-EtOAc)提纯残余物，从而提供4.41g(80％)的期望产物，为白色固体。
1H NMR(CD3OD)δppm 3.98(s，3H)，7.34-7.38(m，2H)，7.69(d，J＝5.5Hz，1H)，8.10(d，J＝6.0Hz，1H)，8.23(d，J＝9.5Hz，1H)；
LC-MS，MS m/z 194(M++H)。
步骤3：
在环境温度向N-BOC-3-(R)-羟基-L-脯氨酸(892mg，3.89mmol)/DMSO(40ml)溶液中以单份的方式添加固体叔丁醇钾(1.34g，12.0mmol)。在室温搅拌该悬浮液30分钟，然后冷却至10℃。以单份的方式添加固体形式的1-氯-6-甲氧基-异喹啉(实施例50步骤2的产物)(785mg，4.05mmol)，并且在环境温度搅拌所得混合物12小时。用冰冷的5％柠檬酸(水溶液)淬灭混合物，然后用EtOAc(100ml)萃取。用EtOAc再一次萃取水相。用5％柠檬酸(水溶液)和盐水分别洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥并且过滤。在真空中浓缩该滤液至干燥而得到1.49g(99％)的期望产物，为灰白色泡沫。这种粗制物质用于下一个反应步骤而无需进一步提纯。
1H NMR(CD3OD)δ1.42，1.44(旋转异构体，9H)，2.38-2.43(m，1H)，2.66-2.72(m，1H)，3.80-3.87(m，2H)，3.92(s，3H)，4.44-4.52(m，1H)，5.73(b，1H)，7.16-7.18(m，2H)，7.24-7.25(m，1H)，7.87-7.88(m，1H)，8.07(d，J＝8.5Hz，1H)；
LC-MS，MS m/z 389(M++H)。
步骤4：
在0℃向实施例50，步骤3的产物(1.49g，3.84mmol)、HATU(2.19g，5.76mmol)和环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基环丙烷羰基)-酰胺HCl盐，实施例7步骤7c的产物(1.12g，4.22mmol)/CH2CL2(50ml)的混合物中添加DIPEA(1.29g，11.5mmol)。在环境温度搅拌12小时后，所得溶液用CH2CL2(50ml)稀释并且用冰5％柠檬酸(水溶液)洗涤。用5％柠檬酸(水溶液)和盐水分别洗涤有机层，用MgSO4干燥并且过滤。在真空中浓缩该滤液至干燥。残余物从甲醇中再结晶而得到1.60g(70％)的期望产物，为白色固体。
1H NMR(CD3OD)δ1.05-1.08(m，2H)，1.16-1.20(m，1H)，1.24-1.27(m，1H)，1.42-1.45(m，10H)，1.88(dd，J＝8.09，5.34Hz，1H)，2.24-2.30(m，2H)，2.53-2.57(m，1H)，2.94-2.98(m，1H)，3.80(d，J＝12.5Hz，1H)，3.86-3.89(m，1H)，3.93(s，3H)，4.40-4.42(m，1H)，5.13(d，J＝10.5Hz，1H)，5.32(d，J＝18.0Hz，1H)，5.72-5.81(m，2H)，7.17-7.20(m，2H)，7.26(d，J＝6.0Hz，1H)，7.88(d，J＝6.0Hz，1H)，8.07(d，J＝9.0Hz，1H)；LC-MS，MS m/z 601(M++H)。
步骤5：
向冰冷的实施例50、步骤4的产物(1.50g，2.50mmol)/CH2Cl2(10ml)的溶液添加TFA(10ml)。使所得溶液升温至环境温度，并且搅拌2小时。在真空中除去溶剂。用1M HCl/醚研磨残余物，过滤，用醚洗涤，而得到1.43g(99.8％)的期望产物，为吸湿性的白色固体。
1H NMR(CD3OD)δppm 1.03-1.208(m，4H)，1.26-1.31(m，1H)，1.37-1.40(m，1H)，1.95-1.97(m，1H)，2.32-2.37(m，1H)，2.42-2.48(m，1H)，2.95-2.99(m，1H)，3.88(d，J＝12.5Hz，2H)，3.98(s，3H)，4.40-4.42(m，1H)，5.16(d，J＝10.5Hz，1H)，5.33(d，J＝18.0Hz，1H)，5.62-5.69(m，1H)，5.97(b，1H)，7.30-7.34(m，2H)，7.47(d，J＝6.0Hz，1H)，7.90(d，J＝6.5Hz，1H)，8.34(d，J＝9.0Hz，1H)，9.14(b，1H)；LC-MS，MS m/z 501(M++H)。
步骤6：
向实施例50、步骤5的产物(0.50g，0.872mmol)、DIPEA(1.29g，11.5mmol)和(S)-(+)-a-羟基-3-甲基丁酸(0.156g，1.13mmol)/CH2Cl2(9mL)的混合物中，添加HATU(0.597g，1.57mmol)。在环境温度搅拌16小时后，通过真空过滤去除白色沉淀副产物HOAT并且用EtOAc(25mL)洗涤。浓缩液体滤液，将所得剩余物再溶解在EtOAc(75ml)中并且用2×10mL 0.1HCl水溶液洗涤。合并水层，并且用EtOAc(50ml)萃取。用10％Na2CO3(水溶液)和盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥并且过滤。在真空中浓缩该滤液至干燥。通过快速柱色谱法(SiO2，97∶3，DCM∶MeOH)提纯残余物而得到0.436g(88％)的化合物50，为白色泡沫状固体。
1H NMR(CD3OD)δppm 0.93(d，J＝6.72Hz，3H)，1.00(d，J＝6.72Hz，3H)，1.10(dd，J＝7.9，2.4Hz，2H)，1.23-1.30(m，2H)，1.45(dd，J＝9.3，5.4Hz，1H)，1.93(dd，J＝9.3，5.4Hz，1H)，2.06-2.12(m，1H)，2.28(q，J＝8.9Hz，1H)，2.37-2.43(m，1H)，2.69(dd，J＝13.7，6.4Hz，1H)，2.94-2.99(m，1H)，4.08(d，J＝5.5Hz，1H)，4.11(dd，J＝12.5，3.5Hz，1H)，4.32(d，J＝12.5Hz，1H)，4.65(dd，J＝10.1，7.0Hz，1H)，5.16(dd，J＝10.4，1.5Hz，1H)，5.34(dd，J＝17.2，1.4Hz，1H)，5.76-5.83(m，1H)，5.91(br s，1H)，7.33(dd，J＝9.2，2.4Hz，1H)，7.37(d，J＝2.5Hz，1H)，7.50(d，J＝6.1Hz，1H)，7.92(d，J＝6.4Hz，1H)，8.22(d，J＝9.2Hz，1H)；LC-MS，MS m/z 601(M++H)。
实施例51：制备化合物51。
化合物50 化合物51
向0℃的化合物50(0.249g，0.415mmol)/THF(5ml)溶液中，添加KH(用己烷预先洗涤，在真空中干燥，58.2mg，1.45mmol)。搅拌5分钟后，添加环戊基异氰酸酯(142.6mg，1.25mmol)。在环境温度在5小时内搅拌所得混合物，在这段时间，反应用EtOAc(40ml)稀释并且用1N HCl水溶液(3ml)洗涤。用EtOAc(15mL)萃取水层。用10％Na2CO3水溶液(5ml)和盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤并且浓缩。通过反相HPLC提纯粗制的混合物，得到黄色固体(95.6mg，31％，收率)。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.01(dd，J＝12.67，6.56Hz，6H)1.07-1.11(m，2H)1.19-1.36(m，4H)1.42(dd，J＝9.46，5.49Hz，1H)1.46-1.54(m，2H)1.58-1.78(m，4H)1.92(dd，J＝8.24，5.49Hz，1H)2.19-2.33(m，2H)2.37-2.47(m，1H)2.72(dd，J＝13.58，6.56Hz，1H)2.98(ddd，J＝12.82，8.09，4.73Hz，1H)3.38-3.44(m，1H)4.01(s，3H)4.02-4.08(m，1H)4.58-4.66(m，2H)4.70(d，J＝12.21Hz，1H)5.16(dd，J＝10.38，1.53Hz，1H)5.33(dd，J＝17.09，1.22Hz，1H)5.76(ddd，J＝17.24，10.22，9.16Hz，1H)5.88(s，1H)7.28(dd，J＝9.16，2.44Hz，1H)7.37(s，1H)7.50(d，J＝6.41Hz，1H)7.91(d，J＝6.41Hz，1H)8.35(d，J＝9.16Hz，1H)；LC-MS，MS m/z 712(M++H)。
实施例52：制备化合物52。
化合物52
通过与实施例50、步骤6中所述的相同方法制备化合物52，收率为67％，不同之处在于使用D-α-羟基戊酸代替(S)-(+)-α-羟基-3-甲基丁酸。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 0.90(d，J＝6.71Hz，6H)1.04-1.16(m，3H)1.18-1.24(m，1H)1.26-1.33(m，2H)1.43(dd，J＝9.31，5.34Hz，1H)1.85-1.96(m，2H)2.30(q，J＝8.85Hz，1H)2.45(ddd，J＝13.81，9.23，4.12Hz，1H)2.70(dd，J＝13.89，7.17Hz，1H)2.98(ddd，J＝12.74，8.01，4.58Hz，1H)4.01(s，3H)4.06(d，J＝5.80Hz，1H)4.14(dd，J＝12.36，3.20Hz，1H)4.33(d，J＝12.51Hz，1H)4.62(t，J＝8.24Hz，1H)5.16(dd，J＝10.38，1.22Hz，1H)5.35(dd，J＝17.09，1.22Hz，1H)5.73-5.84(m，1H)5.93(s，1H)7.33(dd，J＝9.16，2.14Hz，1H)7.38(d，J＝2.14Hz，1H)7.51(d，J＝6.41Hz，1H)7.92(d，J＝6.41Hz，1H)8.16(d，J＝9.16Hz，1H)。
LC-MS，MS m/z 601(M++H)。
实施例53：制备化合物53。
化合物53
通过与制备化合物51所述的相同方法由化合物52制备化合物53，收率为25％。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 0.81(d，J＝6.71Hz，3H)0.98(d，J＝6.41Hz，3H)1.05-1.15(m，2H)1.21-1.33(m，2H)1.35-1.44(m，2H)1.47(dd，J＝12.51，5.80Hz，1H)1.51-1.61(m，2H)1.63-1.75(m，2H)1.77-1.87(m，2H)1.87-1.95(m，1H)1.99-2.09(m，1H)2.37(q，J＝8.85Hz，1H)2.45(ddd，J＝13.89，9.16，4.73Hz，1H)2.76(dd，J＝13.89，7.78Hz，1H)2.95(ddd，J＝12.67，8.09，4.88Hz，1H)3.80-3.90(m，1H)3.97(s，3H)4.20-4.30(m，2H)4.62-4.70(m，2H)5.17(d，J＝11.29Hz，1H)5.33(d，J＝17.09Hz，1H)5.75(ddd，J＝17.24，10.07，8.70Hz，1H)5.89(s，1H)7.25(dd，J＝9.16，2.14Hz，1H)7.29(d，J＝2.14Hz，1H)7.39(d，J＝6.10Hz，1H)7.92(d，J＝6.10Hz，1H)8.10(d，J＝8.85Hz，1H)；LC-MS，MS m/z712(M++H)。
实施例54：制备化合物54。
化合物54
通过与制备化合物51所述相同的方法由化合物50制备化合物54，收率为70％，不同之处在于使用NaH和三氟甲基环丙基异氰酸酯(由三氟甲基环丙基羧酸经由Curtis重排制备，T.Shioiri等人JACS，1972，94，6203)分别代替KH和环戊基异氰酸酯。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 0.92-1.16(m，12H)1.18-1.35(m，3H)1.91(dd，J＝7.93，5.19Hz，1H)2.25(q，J＝8.75Hz，2H)2.37(ddd，J＝13.81，10.45，3.20Hz，1H)2.67(dd，J＝14.50，7.17Hz，1H)2.98(ddd，J＝12.74，8.16，5.04Hz，1H)3.98(s，3H)4.04(dd，J＝12.21，3.36Hz，1H)4.55-4.63(m，1H)4.69(d，J＝8.55Hz，1H)5.15(dd，J＝10.38，1.22Hz，1H)5.32(dd，J＝17.09，0.92Hz，1H)5.75(ddd，J＝17.09，9.92，9.31Hz，1H)5.87(s，1H)7.22(d，J＝9.16Hz，1H)7.30(s，1H)7.41(d，J＝6.10Hz，1H)7.90(d，J＝6.10Hz，1H)8.07(s，0.5H)8.33(d，J＝9.16Hz，1H)9.25(s，0.5H)；LC-MS，MS m/z 752(M++H)。
实施例55：制备化合物55。
化合物55
方案1.
步骤1
向0℃的KH(0.640g，16.0mmol)和THF(32mL)的浆液中添加(S)-(-)-a-羟基-3，3-二甲基丁酸(1.10g，7.98mmol)。移走冰浴并且在环境温度搅拌20分钟后，再将反应冷却到0℃并且逐滴用叔丁基异氰酸酯(2.03g，23.94mmol)处理。在室温下搅拌14小时后，用EtOAc(50ml)稀释反应，慢慢地用1N NaOH(25mL)淬灭，分离各层。用3×25mL H2O萃取有机层并且除去。用浓HCl将合并的水层酸化至pH值约为5，然后用3×50mL EtOAc萃取。合并的有机层用MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到黄色固体(1.8g，98％，收率)，其无需进一步提纯便使用。
1HNMR(CD3OD)δppm 1.05(s，9H)，1.33(s，9H)，4.60(s，1H)，4.84(s，1H)，10.50(br s，1H)；LC-MS，MS m/z 232(M++Na)。
方案2
S.Wang等，Synthesis 4，487-490，2003
步骤2
6-苯基-4-(噻吩-2-基)吡啶-2(1H)-酮(1.07mg，4.23mmol)(根据S.Wang等，Synthesis 4，487-490，2003)/磷酰氯(15mL)溶液被加热回流3天。在真空中除去过量磷酰氯，用冰-水研磨残余物。用NaOH水溶液使研磨物变为碱性并且将产物萃取到DCM中。有机层用盐水洗涤，干燥，滤过硅藻土，并且浓缩。通过快速柱色谱法提纯粗产物，得到白色固体产物(624mg，54％收率)。
1H NMR(CDCl3)δppm 7.16(dd，J＝5.13，3.7Hz，1H)，7.44-7.52(m，5H)，7.55(dd，J＝3.7，1.1Hz，1H)，7.79(d，J＝1.5Hz，1H)，8.02(dd，J＝8.1，1.5Hz，2H)；LC-MS，MS m/z 272(M++H)。
步骤3
向Boc-Hyp-OH(254mg，1.1mmol)/DMSO(5ml)溶液添加叔丁醇钾(295mg，2.5mmol)。在室温下搅拌1小时后，添加实施例55、步骤2的氯吡啶产物，并且在室温下搅拌所得混合物过夜。在EtOAc和柠檬酸水溶液之间分配反应混合物。用H2O和盐水洗涤有机相，然后用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩。粗制混合物的LC/MS显示了2.5∶1的产物：氯吡啶原料的混合物。通过快速柱色谱法(SiO2，90∶10，DCM∶MeOH)提纯粗制的混合物，获得固体产物(270mg，58％收率)。
1H NMR(CD3OD)δ1.45(s，9H)，2.37-2.42(m，1H)，2.63(q，J＝13.9Hz，1H)，3.79(d，J＝11.9Hz，1H)，3.88(d，J＝12.2Hz，1H)，4.41-4.46(m，1H)，5.70(br s，1H)，6.92(br s，1H)，7.15(d，J＝3.4Hz，1H)，7.40(t，J＝6.1Hz，1H)，7.45(q，J＝6.7Hz，2H)，7.51(d，J＝4.0Hz，1H)，7.65(br s，2H)，8.05(d，J＝7.0Hz，2H)；LC-MS，MS m/z467(M++H)。
步骤4
将实施例55、步骤3的产物(260mg，0.56mmol)与N-甲基吗啉(284mg，2.79mmol)、环丙烷磺酸(1-(R)-氨基-2-(S)-乙烯基环丙烷羰基)-酰胺HCl盐，实施例7、步骤7c的产物(202mg，0.61mmol)和HATU(276mg，0.73mmol)/DCM(5ml)结合。在室温下搅拌2小时后，将反应混合物倒入柠檬酸水溶液并且用EtOAc萃取产物。用碳酸氢盐水溶液和盐水洗涤有机层，然后用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩。粗制混合物通过快速柱色谱法(SiO2，1.5％MeOH/DCM)提纯，获得白色固体产物(250mg，66％收率)。NMR(CD3OD)δ1.07(q，J＝7.1Hz，2H)，1.18(dd，J＝9.5，4.3Hz，1H)，1.23-1.29(m，1H)，1.43(q，J＝6.1Hz，1H)，1.47(s，9H)，1.88(q，J＝5.5Hz，1H)，2.25(q，J＝8.5Hz，1H)，2.30(dd，J＝9.5，4.6Hz，1H)，2.51(dd，J＝13.5Hz，1H)，2.93-2.97(m，1H)，3.77(d，J＝11.9Hz，1H)，3.89(dd，J＝11.6，4.1Hz，1H)，4.32(t，J＝8.3Hz，1H)，5.12(d，J＝10.4Hz，1H)，5.31(d，J＝17.1Hz，1H)，5.76(br s，1H)，6.93(s，1H)，7.16(t，J＝4.3Hz，1H)，7.41(t，J＝6.9Hz，1H)，7.46(t，J＝7.5Hz，2H)，7.54(d，J＝4.9Hz，1H)，7.68(br s，2H)，8.06(d，J＝7.6Hz，2H)；LC-MS，MS m/z 678(M++H)。
步骤5
向实施例55、步骤4的产物(0.707g，1.04mmol)/1∶1DCM∶DCE(20ml)溶液中，添加TFA(10ml)。在室温下搅拌0.5小时后，将反应物真空浓缩。将所得剩余物再溶解在DCE(20ml)中并且再浓缩。然后将所得的褐色粘性油溶于DCM(3ml)中，并且将其滴加到快速搅拌的1NHCl/Et2O(100ml)溶液中。所得的沉淀物，灰白色固体(0.666g，98％收率)是通过真空过滤获得的并且用Et2O洗涤。
LC-MS，MS m/z 579(M++H)。
步骤6
向实施例55、步骤5的产物(0.200g，0.307mmol)和DIEA(0.139g，1.07mmol)/DCM(3ml)的混合物中，添加实施例55、步骤1的产物，随后添加HATU(0.140g，0.368mmol)。在室温下搅拌8小时后，去除溶剂并且用EtOAc(30ml)再溶解残余物，随后用2×3mL 1N HCl水溶液洗涤。用EtOAc(30ml)萃取水层。用10％Na2CO3水溶液和盐水洗涤合并的有机层，然后用MgSO4干燥，过滤，浓缩。通过快速柱色谱法(SiO2，97∶3和95∶5DCM∶MeOH)提纯所得的褐色粘性油，获得化合物55，为白色固体(0.170g，70％收率)。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.08(s，11H)1.22(s，9H)1.24-1.29(m，2H)1.42(dd，J＝9.46，5.49Hz，1H)1.90(dd，J＝8.24，5.49Hz，1H)2.25-2.37(m，2H)2.58(dd，J＝13.58，7.48Hz，1H)2.98(ddd，J＝12.82，8.09，4.73Hz，1H)4.09(dd，J＝11.75，3.81Hz，1H)4.41(d，J＝11.60Hz，1H)4.62(t，J＝8.39Hz，1H)4.74(s，1H)5.15(dd，J＝10.38，1.22Hz，1H)5.32(dd，J＝17.24，1.07Hz，1H)5.68-5.79(m，1H)5.91(s，1H)6.97(s，1H)7.20(dd，J＝4.88，3.66Hz，1H)7.45(t，J＝7.32Hz，1H)7.51(t，J＝7.32Hz，2H)7.57(d，J＝5.19Hz，1H)7.71(d，J＝3.05Hz，1H)7.74(d，J＝1.22Hz，1H)8.12(d，J＝7.32Hz，2H)；
LC-MS，MS m/z 792(M++H)。
实施例56：制备化合物56。
步骤1
实施例56步骤1的产物，是通过与实施例50、步骤4的产物相同的方法制备的，从代替实施例50、步骤3产物的Boc-HYP-OH开始。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.09(d，J＝7.63Hz，2H)1.16-1.22(m，1H)1.25-1.32(m，1H)1.42(dd，J＝9.46，5.49Hz，1H)1.47(s，1.7H)1.50(s，7.3H)1.88(dd，J＝8.09，5.34Hz，1H)1.94-2.03(m，1H)2.13(dd，J＝12.97，6.87Hz，1H)2.26(q，J＝8.85Hz，1H)2.97(ddd，J＝12.51，8.09，4.73Hz，1H)3.47(d，J＝11.60Hz，1H)3.56-3.62(m，1H)4.25(dd，J＝9.61，6.87Hz，1H)4.42(s，1H)5.15(d，J＝10.38Hz，1H)5.34(d，J＝17.09Hz，1H)5.74-5.85(m，1H)；LCMS，MS m/z＝442(M-H)-。
步骤2
向实施例56、步骤1的产物(1.0g，2.25mmol)/DCM(20ml)溶液中添加1，1′-羰基二咪唑(439mg，2.71mmol)。在室温下搅拌3小时后，添加4-氟代异吲哚啉(根据以下文献中所述的方法制备：L.M.Blatt等的PCT国际申请(2005)，244pp，WO 2005037214)(617mg，4.50mmol)，并且在室温下搅拌所得混合物过夜。反应混合物用EtOAc(100ml)稀释并且用2×10mL1N HCl水溶液洗涤。用2×50ml EtOAc萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩得到暗褐色粘性油。粗制混合物通过快速柱色谱法(SiO2，97∶3和95∶5DCM∶MeOH)提纯，获得灰色泡沫状的固体(1.3g，95％收率)。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm 1.29-1.37(m，2H)1.38-1.45(m，2H)1.47(s，9H)1.95-2.00(m，1H)2.07-2.14(m，1H)2.28-2.35(m，1H)2.37-2.46(m，1H)2.90-2.97(m，1H)3.65(d，J＝12.80Hz，1H)3.72(d，J＝12.50Hz，1H)4.26(t，J＝7.02Hz，1H)4.68(d，J＝9.46Hz，2H)4.77(d，J＝9.16Hz，2H)5.15(d，J＝10.38Hz，1H)5.29(d，J＝17.10Hz，1H)5.33(s，1H)5.73-5.84(m，1H)6.97(t，J＝8.70Hz，1H)7.01(d，J＝7.63Hz，1H)7.28(dd，J＝8.09，2.90Hz，1H)10.00(s，1H)；LC-MS，MS m/z 629(M++Na)。
步骤3
由实施例56步骤2的产物，通过与制备实施例55步骤5的产物所述的相同方法制备实施例56步骤3的产物，收率为94％。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.05-1.11(m，1H)1.11-1.17(m，1H)1.18-1.23(m，1H)1.27-1.34(m，1H)1.40(dd，J＝9.61，5.65Hz，1H)1.98(dd，J＝7.93，5.80Hz，1H)2.27-2.33(m，1H)2.36(q，J＝8.80Hz，1H)2.75(dd，J＝14.34，7.32Hz，1H)2.96-3.03(m，1H)3.65-3.75(m，2H)4.61-4.67(m，1H)4.78(s，2H)5.19(d，J＝10.38Hz，1H)5.36(d，J＝17.09Hz，1H)5.48(s，1H)5.64-5.73(m，1H)7.06(t，J＝8.70Hz，1H)7.17(dd，J＝16.17，7.63Hz，1H)7.37(q，J＝7.63Hz，1H)；LC-MS，MS m/z 507(M++H)。
步骤4
由实施例56步骤3的产物，通过与制备实施例55步骤6的产物所述的相同方法，制备实施例56、化合物56，收率为55％。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.02(s，5H)1.05-1.14(m，16H)1.22-1.28(m，2H)1.42(dd，J＝9.46，5.49Hz，1H)1.87-1.92(m，1H)2.15-2.22(m，1H)2.26(q，J＝8.85Hz，1H)2.44-2.52(m，1H)2.97(ddd，J＝12.82，8.09，4.73Hz，1H)3.82(d，J＝11.60Hz，1H)4.42(d，J＝11.29Hz，1H)4.53-4.64(m，2H)4.71-4.79(m，3H)5.15(dd，J＝10.38，1.22Hz，1H)5.32(dd，J＝17.09，1.22Hz，1H)5.35(s，1H)5.67-5.77(m，1H)6.51(d，J＝23.19Hz，1H)6.99-7.08(m，1.4H)7.16(d，J＝7.63Hz，0.6H)7.31-7.38(m，1H)；LC-MS，MS m/z 720(M++H)。
实施例57：制备化合物57。
步骤1
向顺式Boc-HYP-OH(4.95g，20.2mmol)和PPh3(10.6g，40.4mmol)/THF(100ml)溶液中，逐滴添加二乙基偶氮二羧酸酯(7.4g、42.4mmol)。在室温下搅拌15分钟后，添加4-羟基喹啉(3.7g，25.3mmol)。在含水整理(aqueous work up)后，产物被用作粗产物，其中对于下一步来说，仍然存在一些三苯基氧化膦副产物污染。
步骤2
向实施例57、步骤1的粗产物(假定为20.2mmol)/THF中，添加LiOH(2.54g，60.54mmol)/H2O(18mL)溶液。在室温搅拌该混合物2小时。然后用Et2O萃取反应混合物并且随后用H2O(50ml)洗涤有机层。将合并的水层用DCM(50ml)稀释并且酸化至pH值为4。摇晃混合物并且分离各层。用3×50ml DCM萃取水层。用盐水洗涤合并的DCM层，用MgSO4干燥，过滤和浓缩，获得淡橙色固体(5.8g，80％收率)。
LC-MS，MS m/z 360(M++H)。
步骤3
由实施例57、步骤2的产物，通过与制备实施例55步骤4的产物所述的相同方法制备实施例57步骤3的产物，收率为76％。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 0.81-0.98(m，2H)1.07(s，2H)1.23-1.31(m，1H)1.39(d，J＝6.41Hz，4H)1.46(s，9H)1.87(d，J＝2.75Hz，1H)2.06-2.20(m，1H)2.63-2.80(m，2H)3.96(d，J＝13.73Hz，1H)4.04(d，J＝11.90Hz，1H)4.43(q，J＝7.60Hz，1H)5.05(d，J＝9.16Hz，1H)5.26(d，J＝17.09Hz，1H)5.94(s，1H)5.96-6.05(m，1H)7.70(t，J＝7.63Hz，1H)7.90-8.00(m，2H)8.20(d，J＝8.24Hz，1H)8.79(s，1H)；LC-MS，MS m/z 572(M++H)
步骤4
由实施例57、步骤3的产物，通过与制备实施例55步骤5的产物所述的相同方法制备实施例57步骤4的产物，收率为83％。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.03-1.10(m，1H)1.10-1.17(m，1H)1.17-1.24(m，1H)1.27-1.35(m，1H)1.37-1.45(m，2H)1.99(dd，J＝7.78，5.65Hz，1H)2.40(q，J＝8.75Hz，1H)2.52-2.61(m，1H)2.95-3.03(m，1H)3.10(dd，J＝14.80，7.48Hz，1H)3.99(s，2H)5.19(d，J＝10.38Hz，1H)5.37(d，J＝17.09Hz，1H)5.63-5.74(m，1H)6.29(s，1H)8.00(t，J＝7.63Hz，1H)8.10(d，J＝8.24Hz，1H)8.28(t，J＝7.93Hz，1H)8.61(d，J＝8.24Hz，1H)9.28(s，1H)；LC-MS，MS m/z 472(M++H)。
步骤5
由实施例57、步骤4的产物，通过与制备实施例55步骤6的产物所述的相同方法制备实施例57的化合物57，收率为78％。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.02-1.08(m，3H)1.09(s，9H)1.07-1.14(m，9H)1.22-1.28(m，3H)1.30-1.34(m，1H)1.90(dd，J＝7.78，5.65Hz，1H)2.25(q，J＝8.65Hz，1H)2.36(t，J＝12.36Hz，1H)2.72(dd，J＝13.73，6.41Hz，1H)2.93-3.00(m，1H)4.02(dd，J＝11.90，2.14Hz，1H)4.60-4.77(m，1H)5.15(d，J＝10.38Hz，1H)5.31(d，J＝17.70Hz，1H)5.67-5.77(m，1H)5.98(s，1H)7.64(t，J＝7.02Hz，1H)7.90-7.99(m，2H)8.38(d，J＝7.93Hz，1H)8.80(s，1H)；LC-MS，MS m/z 685(M++H)。
实施例58：制备化合物58。
步骤1
向N-Boc-乙烯基环丙烷羧酸，实施例7步骤7a的产物(1.83g，8.05mmol)和THF(32mL)的溶液中，添加1，1′-羰基二咪唑(1.44g，8.86mmol)。在室温下搅拌3小时后，反应混合物用N，N-二甲基磺酰胺(1.0g、8.05mmol)随后DBU(2.45g，16.1mmol)处理，并且再在室温搅拌15小时。然后反应混合物用EtOAc(50ml)稀释并且用2×25mL 1N HCl水溶液洗涤。用2×50ml EtOAc萃取水层。用H2O(25mL)和盐水洗涤合并的有机部份，用MgSO4干燥，过滤，浓缩至浅黄色固体(2.6g，97％收率)，其无需进一步提纯即使用。
LC-MS，MS m/z 356(M++Na)。
步骤2
向实施例58、步骤2的产物(1.42g，4.26mmol)/1∶1DCM∶DCE(20ml)溶液中，添加TFA(10ml)。在室温下搅拌0.5小时后，去除溶剂和过量的TFA，将残余物再溶解在DCE(20ml)中，再次浓缩，得到黄色固体(1.46g，99％收率)。
LC-MS，MS m/z 234(M++H)。
步骤3
由实施例58、步骤2的产物，通过与制备实施例55步骤4的产物所述的相同方法制备实施例58步骤3的产物，收率为91％。
1H NMR(500MHz，CDCl3)δppm 1.38(dd，J＝7.78，4.43Hz，1H)1.46(s，9H)1.95(dd，J＝8.09，5.65Hz，1H)2.08(q，J＝8.65Hz，1H)2.49-2.55(m，2H)2.91(s，6H)3.77-3.87(m，2H)3.93(s，3H)4.38(t，J＝6.87Hz，1H)5.16(d，J＝10.38Hz，1H)5.29(d，J＝17.40Hz，1H)5.71-5.79(m，1H)5.80(s，1H)7.02(d，J＝2.44Hz，1H)7.13-7.16(m，J＝5.50Hz，1H)7.90(d，J＝5.80Hz，1H)8.02(d，J＝9.16Hz，1H)9.83(s，1H)；LC-MS，MSm/z 604(M++H)
步骤4
由实施例58、步骤3的产物，通过与制备实施例55步骤5的产物所述的相同方法制备实施例58步骤4的产物，收率为95％。
LC-MS，MS m/z 504(M++H)。
步骤5
由实施例58、步骤4的产物，通过与制备实施例55步骤6的产物所述的相同方法制备化合物58(实施例58)，收率为83％。
1H NMR(500MHz，MeOD)
ppm 1.08(s，9H)1.24(s，9H)1.32-1.39(m，1H)1.81-1.89(m，1H)2.17-2.30(m，2H)2.65(dd，J＝13.12，6.41Hz，1H)2.87-2.92(m，6H)3.91-3.96(m，3H)3.96-4.03(m，1H)4.53-4.63(m，2H)4.74(s，1H)5.15(dd，J＝10.38，1.83Hz，1H)5.29(d，J＝17.09Hz，1H)5.62-5.74(m，1H)5.82(d，J＝2.75Hz，1H)6.61(s，1H)7.11(d，J＝8.85Hz，1H)7.20(d，J＝2.44Hz，1H)7.23-7.29(m，1H)7.86-7.92(m，1H)8.29(d，J＝8.85Hz，1H)；LC-MS，MS m/z 717(M++H)。
实施例59：制备化合物59。
步骤1
由N-Boc-乙烯基环丙烷羧酸、实施例7步骤7a的产物和苯磺酰胺，通过与制备实施例58步骤1的产物所述的相同方法，制备实施例59步骤1的产物，收率为92％。
LC-MS，MS m/z 389(M++Na)。
步骤2
由实施例59步骤1的产物，通过与制备步骤、实施例58步骤2的产物所述的相同方法制备实施例59步骤2的产物，收率为86％。
LC-MS，MS m/z 267(M++H)。
步骤3
由实施例59、步骤2的产物，通过与制备实施例55步骤4的产物所述的相同方法制备实施例59步骤3的产物，收率为75％。
LC-MS，MS m/z 637(M++H)
步骤4
由实施例59步骤3的产物，通过与制备实施例55步骤5的产物所述的相同方法制备实施例59步骤4的产物，收率为87％。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.32(dd，J＝9.46，5.49Hz，1H)1.82(dd，J＝7.78，5.65Hz，1H)2.28(q，J＝8.44Hz，1H)2.44-2.52(m，1H)3.00(dd，J＝14.34，7.32Hz，1H)3.92(s，2H)4.01(s，3H)4.80(dd，J＝10.38，7.63Hz，1H)4.89(dd，J＝11.60，1.83Hz，1H)5.18(dd，J＝17.10，2.14Hz，1H)5.21-5.30(m，1H)6.00(s，2H)7.35(d，J＝2.14Hz，0.5H)7.37(d，J＝2.13Hz，0.5H)7.37-7.40(m，1H)7.52(d，J＝6.41Hz，1H)7.58(t，J＝7.78Hz，2H)7.70(t，J＝7.48Hz，1H)7.93(d，J＝6.41Hz，1H)8.01(d，J＝8.24Hz，2H)8.41(d，J＝8.85Hz，1H)；LC-MS，MS m/z 537(M++H)。
步骤5
由实施例59、步骤4的产物，通过与制备实施例55步骤6的产物所述的相同方法制备步骤化合物59(实施例59)，收率为85％。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.11(s，9H)1.26(s，9H)1.31(dd，J＝9.61，5.34Hz，1H)1.72(dd，J＝7.93，5.49Hz，1H)2.18(q，J＝8.55Hz，1H)2.22-2.31(m，1H)2.65(dd，J＝13.73，7.32Hz，1H)3.95(s，3H)4.00(dd，J＝10.99，2.44Hz，1H)4.55-4.64(m，2H)4.78(s，1H)4.94(d，J＝11.60Hz，1H)5.18(d，J＝17.09Hz，1H)5.33-5.45(m，1H)5.84(s，1H)7.12(d，J＝8.85Hz，1H)7.20(d，J＝2.44Hz，1H)7.27(d，J＝5.80Hz，1H)7.57(t，J＝7.63Hz，2H)7.68(t，J＝7.48Hz，1H)7.90(d，J＝5.80Hz，1H)8.01(d，J＝8.24Hz，2H)8.29(d，J＝8.85Hz，1H)；LC-MS，MS m/z 750(M++H)。
实施例60：制备化合物60。
步骤1
由N-Boc-乙烯基环丙烷羧酸、实施例7步骤7a的产物和1-甲基咪唑-4-磺酰亚胺，通过与制备实施例58步骤1的产物所述的相同方法，制备实施例60步骤1的产物，收率为79％。
LC-MS，MS m/z 371(M++Na)。
步骤2
由实施例60、步骤1的产物，通过与制备实施例58、步骤2的产物所述的相同方法制备实施例60步骤2的产物，收率为83％。
LC-MS，MS m/z 271(M++H)。
步骤3
由实施例60、步骤2的产物，通过与制备实施例55步骤4的产物所述的相同方法制备实施例60步骤3的产物，收率为76％。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.26(q，1H)1.33-1.38(m，1H)1.44(s，9H)1.76-1.87(m，1H)2.03-2.11(m，1H)2.51-2.70(m，2H)3.25(q，J＝7.53Hz，2H)3.71-3.79(m，4H)3.95(s，3H)4.33-4.47(m，1H)4.91(d，J＝11.30Hz，1H)5.15(d，J＝17.09Hz，1H)5.70(s，1H)5.72-5.82(m，1H)7.18(d，J＝9.16Hz，1H)7.21(s，1H)7.26(s，1H)7.68(s，1H)7.91(d，J＝5.80Hz，1H)8.06(d，J＝8.85Hz，1H)；LC-MS，MS m/z 641(M++H)。
步骤4
由实施例60、步骤3的产物，通过与制备实施例55、步骤5的产物所述的相同方法制备实施例60步骤4的产物，收率为85％。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.20(t，J＝7.02Hz，1H)1.35(dd，J＝9.46，5.80Hz，1H)1.38-1.42(m，4H)1.86(dd，J＝7.78，5.65Hz，1H)2.31(q，J＝8.55Hz，1H)2.40-2.49(m，1H)2.92(dd，J＝14.19，7.78Hz，1H)3.21-3.28(m，1H)3.71-3.79(m，1H)3.88(s，3H)3.99(s，3H)4.73(dd，J＝9.92，7.78Hz，1H)5.07(d，J＝10.38Hz，1H)5.27(d，J＝16.79Hz，1H)5.42-5.52(m，1H)5.97(s，1H)7.41(d，J＝6.10Hz，1H)7.93(d，J＝6.10Hz，1H)8.03(s，1H)8.18(s，1H)8.29(d，J＝8.85Hz，1H)；LC-MS，MSm/z 541(M++H)。
步骤5
由实施例60、步骤4的产物，通过与制备实施例55步骤6的产物所述的相同方法制备步骤化合物60(实施例60)，收率为91％。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 0.93(s，9H)1.11(s，9H)1.17-1.24(m，2H)1.63(t，J＝6.20Hz，1H)2.02(d，J＝7.30Hz，1H)2.20-2.35(m，1H)2.52(dd，J＝13.43，7.63Hz，1H)3.64(s，3H)3.82(s，3H)3.84-3.92(m，1H)4.43(d，J＝11.60Hz，1H)4.48(dd，J＝9.77，7.93Hz，1H)4.56(s，1H)4.81(d，J＝7.02Hz，1H)5.02(d，J＝16.79Hz，1H)5.69(s，1H)6.98(dd，J＝9.16，1.83Hz，1H)7.07(d，J＝2.44Hz，1H)7.13(d，J＝6.10Hz，1H)7.57(s，1H)7.78(d，J＝6.10Hz，1H)8.14(d，J＝8.85Hz，1H)；LC-MS，MS m/z 754(M++H)。
实施例61：制备化合物61。
化合物61(实施例61)的制备类似于化合物50。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 0.87(t，J＝7.32Hz，3H)0.95(d，J＝7.02Hz，3H)1.07-1.13(m，2H)1.13-1.19(m，1H)1.20-1.26(m，1H)1.28-1.35(m，1H)1.45(dd，J＝9.46，5.19Hz，1H)1.56-1.65(m，1H)1.78-1.87(m，1H)1.93(dd，J＝7.93，5.49Hz，1H)2.28(q，J＝8.75Hz，1H)2.37-2.46(m，1H)2.69(dd，J＝13.73，7.32Hz，1H)2.94-3.02(m，1H)3.98(s，3H)4.09(d，J＝6.41Hz，1H)4.16(dd，J＝12.21，3.66Hz，1H)4.31(d，J＝12.51Hz，1H)4.65(dd，J＝10.07，7.32Hz，1H)5.15(d，J＝10.38Hz，1H)5.34(d，J＝17.09Hz，1H)5.74-5.85(m，1H)6.10(s，1H)7.19(dd，J＝9.16，2.44Hz，1H)7.32(d，J＝2.14Hz，1H)7.40(d，J＝8.24Hz，2H)7.86(s，1H)8.10(d，J＝9.16Hz，1H)8.28(d，J＝8.85Hz，2H)；LC-MS，MSm/z 775(M++H)。
实施例62：制备化合物62。
化合物62(实施例62)的制备类似于化合物50。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 1.05-1.12(m，3H)1.18(dd，J＝13.12，10.07Hz，4H)1.22-1.27(m，1H)1.28-1.34(m，1H)1.45(dd，J＝9.46，5.19Hz，1H)1.59-1.72(m，4H)1.76(d，J＝14.04Hz，2H)1.92(dd，J＝8.09，5.34Hz，1H)2.27(q，J＝8.65Hz，1H)2.38-2.46(m，1H)2.69(dd，J＝13.73，7.32Hz，1H)2.93-3.02(m，1H)3.98(s，3H)4.07(d，J＝6.10Hz，1H)4.14(dd，J＝12.21，3.97Hz，1H)4.31(d，J＝12.21Hz，1H)4.65(dd，J＝10.07，7.32Hz，1H)5.15(d，J＝10.38Hz，1H)5.33(d，J＝17.09Hz，1H)5.75-5.85(m，1H)6.09(s，1H)7.18(dd，J＝9.00，2.59Hz，1H)7.31(d，J＝2.44Hz，1H)7.40(d，J＝8.24Hz，2H)7.85(s，1H)8.09(d，J＝9.16Hz，1H)8.27(d，J＝8.85Hz，2H)；LC-MS，MS m/z 801(M++H).
实施例63：制备化合物63。
化合物63(实施例63)的制备类似于化合物50。
1H NMR(500MHz，MeOD)δppm 0.98(s，3H)1.06(s，3H)1.08-1.13(m，2H)1.24-1.30(m，2H)1.45(dd，J＝9.46，5.49Hz，1H)1.92(dd，J＝7.93，5.49Hz，1H)2.28(q，J＝8.55Hz，1H)2.35-2.43(m，1H)2.68(dd，J＝13.73，7.32Hz，1H)2.94-3.01(m，1H)3.17(d，J＝8.85Hz，1H)3.31(s，3H)3.98(s，3H)4.21(dd，J＝12.36，3.81Hz，1H)4.31(d，J＝11.90Hz，1H)4.34(s，1H)4.65(dd，J＝9.46，7.32Hz，1H)5.15(d，J＝10.38Hz，1H)5.33(d，J＝18.62Hz，1H)5.72-5.82(m，1H)6.06(s，1H)7.18(dd，J＝9.16，2.44Hz，1H)7.31(d，J＝2.14Hz，1H)7.39(d，J＝8.24Hz，2H)7.85(s，1H)8.10(d，J＝9.16Hz，1H)8.27(d，J＝8.55Hz，2H)；LC-MS，MS m/z 805(M++H)。
以下实施例进一步描述P2中间体的制备。通过使用本文件中所述的或者参考的教导，这些中间体可用于制备通式I的化合物。
实施例70
制备中间体70；
步骤1：
将3，5-二甲基-4-硝基-异噁唑(1.42g，10.0mmol)、苯乙醛(1.32g，11.0mmol)/哌啶(1ml)和乙醇(10ml)的混合物加热回流16小时。冷却至环境温度后，通过过滤收集沉淀出的产物。用冷的乙醇充分地洗涤滤饼，获得1.20g(53％)的期望产物，为白色固体。
1H NMR(CDCl3)δ2.87(s，3H)，7.46-7.50(m，3H)，7.56(d，J＝8.5Hz，1H)，7.7-7.80(m，2H)；MS m/z 227(M++H)。
步骤2：
将3-甲基-5-苯基-异噁唑[4，5-b]吡啶4-氧化物(1.00g，4.40mmol)和POCl3(2.71g，17.7mmol)/氯仿(10ml)的溶液加热回流1小时。冷却至环境温度后，最终溶液用氯仿(50ml)稀释并且用NaHCO3(水溶液)(两个50ml的部分)和盐水洗涤，用MgSO4干燥，过滤和浓缩。通过快速色谱法(4∶1己烷-EtOAc)提纯残余物，从而获得790mg(73％)的期望产物，为白色固体。
1H NMR(CDCl3)δ2.72(s，3H)，7.46-7.54(m，3H)，7.91(s，1H)，8.00-8.03(m，2H)；
MS m/z 245，247(M++H).
中间体70可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例71
制备中间体71
步骤1：
将2-氨基-6-甲基吡啶(1.08g，10.0mmol)、苯酰乙酸乙酯(2.30g，12.0mmol)和多磷酸(6.00g，61.2mmol)的混合物加热至110℃达5小时。冷却至环境温度后，将混合物倒入冰水(20ml)并且用10M NaOH中和至pH值为7。用CHCl3萃取。用盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩。通过快速色谱法(1∶1己烷-EtOAc)提纯残余物，从而获得510mg(22％)的期望产物，为浅黄色固体。
1H NMR(CDCl3)δ3.08(s，3H)，6.64(d，J＝7.0Hz，1H)，6.71(s，1H)，7.42-7.52(m，5H)，8.04-8.06(m，2H)；MS m/z 237(M++H)。
步骤2：
将6-甲基-2-苯基-吡啶[1，2a]嘧啶-4-酮(489mg，2.07mmol)/熔融的二苯醚(5ml)溶液加热从而温和地回流5小时。冷却至环境温度后，用二乙醚(10ml)稀释所形成的悬浮液，过滤。用二乙醚充分地洗涤滤饼，从而获得450mg(92％)的期望产物，为淡褐色固体。
MS m/z 237(M++H)。
步骤3：
将7-甲基-2-苯基-1H-[1，8]萘啶-4-酮(450mg，1.91mmol)/POCl3(10ml)的悬浮液加热从而温和地回流3小时，然后真空浓缩。将残余物倒入冰水(20ml)并且用10M NaOH中和至pH值为10。然后用CHCl3萃取混合物，用盐水洗涤有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩。通过快速色谱法(2∶1己烷-EtOAc)提纯残余物，从而获得450mg(92％)的期望产物，为粉红色固体。
1H NMR(CD3OD)δ2.80(s，3H)，7.54-7.56(m，3H)，7.61(d，J＝8.4Hz，1H)，8.25-8.30(m，3H)，8.58(d，J＝8.4Hz，1H)；MS m/z 255，257(M++H)。
中间体71可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例72
制备中间体72
步骤1：
在0℃向4-甲氧基苯乙醇(1.52g，10.0mmol)/CH2Cl2(50ml)溶液中，以单份的方式添加Dess-Martin化学试剂(4.45g，10.5mmol)。使所形成的混合物升温至环境温度达1小时。分别用饱和Na2S2O3(水溶液)和1MNaOH、盐水洗涤。用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到1.50g(100％)的所期望的醛，为粘性油。这种产物被用作粗产物，无需更进一步的提纯。
步骤2：
将3，5-二甲基-4-硝基-异噁唑(142mg，1.0mmol)、4-甲氧基-苯乙醛(实施例3，步骤1)(180mg，1.1mmol)/哌啶(0.1mL)和乙醇(2ml)的溶液加热回流12小时。冷却至环境温度后，通过过滤收集沉淀出的产物。用冷的乙醇充分地洗涤滤饼，获得130mg(51％)的期望产物，为微带灰色的固体。
1H NMR(CDCl3)δ2.88(s，3H)，3.87(s，3H)，7.02(d，J＝8.5Hz，2H)，7.50(d，J＝9.0Hz，1H)，7.57(d，J＝9.0Hz，1H)，7.81(d，J＝8.5Hz，2H)；MSm/z 257(M++H)。
步骤3：
该产物通过与实施例70、步骤2中所述的相同方法制备。
1H NMR(CDCl3)δ2.70(s，3H)，3.87(s，3H)，7.00-7.03(m，2H)，7.84(s，1H)，7.96-7.98(m，2H)；MS m/z 275，277(M++H)。
中间体72可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例73
制备中间体73
步骤1和2：
该产物通过如实施例72、步骤1和2所述的相同方法制备，不同之处在于替代使用4-氟代苯乙醇。
MS m/z 245(M++H)。
步骤3：
该产物通过与实施例70的步骤2中所述的相同方法制备。
1H NMR(CDCl3)δ2.71(s，3H)，7.17-7.20(m，2H)，7.86(s，1H)，8.00-8.02(m，2H)；
MS m/z 263，265(M++H)。
中间体73可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例74
制备中间体74
步骤1和2：
该产物通过如实施例72、步骤1和2所述的相同方法制备，不同之处在于使用3-甲氧基-苯乙醇作为原料。
MS m/z 257(M++H)。
步骤3：
该产物通过与实施例70的步骤2中所述的相同方法制备。
1H NMR(CDCl3)δ2.72(s，3H)，3.90(s，3H)，7.00-7.02(m，1H)，7.41(t，J＝8.0Hz，1H)，7.55(d，J＝7.5Hz，1H)，7.59(d，J＝2.0Hz，1H)，7.89(s，1H)；MS m/z 275，277(M++H)。
中间体74可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例75
制备中间体75
步骤1和2：
该产物通过如实施例72、步骤1和2所述的相同方法制备，不同之处在于使用2-甲氧基-苯乙醇作为原料。
MS m/z 257(M++H)。
步骤3：
该产物通过与实施例70、步骤2中所述的相同方法制备。
1H NMR(CDCl3)δ2.721(s，3H)，3.88(s，3H)，7.03(d，J＝8.0Hz，1H)，7.11(t，J＝7.5Hz，1H)，7.41-7.44(m，1H)，7.79-7.81(m，1H)，8.04(s，1H)；MS m/z 275，277(M++H)。
中间体75可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例76
制备中间体76
中间体76是市售可得的
中间体76可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例77
制备中间体77
按照P.Ferrarini等在J Heterocyclic Chem，1983，p1053中的描述，制备中间体77。
中间体77可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例78
制备中间体78
按照R.Nesi等在Synth Comm.1992，22(16)，2349中所述的，制备中间体78。
中间体78可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例79
制备中间体79
步骤1：
向中压烧瓶(Chemglass)中的2-溴-5-甲氧基苯酸(1.68g，7.27mmol)/DMF(50ml)的溶液中，添加苄脒(1.25g，8.00mmol)、K2CO3(6.0g，43.6mmol)和铜粉(336mg，1.45mmol)。将反应混合物加热至180℃达1小时。通过真空过滤去除铜和过量的K2CO3，并且用MeOH洗涤。浓缩滤液并且将所得的粗产物通过快速柱色谱法(SiO2，5％MeOH/DCM)提纯，获得淡绿色固体(1.55g，84％收率)：
1H NMR(DMSO-d6)δ3.84(s，3H)，7.26(d，J＝7.8Hz，1H)，7.46(br s，5H)，7.57(s，1H)，8.38(br s，1H)；MS m/z(MH+)253。
步骤2：
向0℃的Boc-顺式羟脯氨酸-Ome(2.0g，8.15mmol)和3(2.26g，8.97mmol)/THF(82ml)的浆液中，添加Ph3P和二异丙基偶氮羧酸酯(1.98g，8.97mmol)。在室温下搅拌17小时后，用EtOAc(100ml)稀释反应混合物并且用H2O(50ml)洗涤。分离水层并且用EtOAc(2×50ml)反萃。用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到粘性油，其被再溶解在最小量的EtOAc中，并且添加己烷，将大部分的Ph3PO副产物进行沉淀。通过真空过滤去除Ph3PO，并且浓缩液体滤液。所得的粘性油通过快速柱色谱法(SiO2，4∶1hex：EtOAc)提纯，获得白色固体产物(1.76g，45％收率)：
1H NMR(60/40旋转异构体，CDCl3)δ1.47(s，9H)，2.49-2.55(m，1H)，2.73-2.83(m，1H)，3.80(s，1.8H)，3.81(s，1.2H)，3.96(s，3H)，4.03-4.09(m，1H)，4.54(t，J＝8.0Hz，0.6H)，4.66(t，J＝7.8Hz)，4.96-5.06(m，1H)，5.97(br s，0.6H)，6.04(br s，0.4H)，7.33(dd，J＝6.1，2.7Hz，1H)，7.46-7.51(m，4H)，7.91(d，J＝9.2Hz，1H)，8.49(t，J＝8.5Hz，2H)；13C NMR(旋转异构体，CDCl3)δ21.7，22.0，28.3，28.4，35.8，36.8，52.3，52.4，52.6，55.8，55.9，57.9，58.3，74.5，74.9，80.6，101.2，101.3，115.7，125.8，126.0，128.1，128.5，129.7，130.2，137.9，147.8，153.8，157.7，158.0，158.0，164.8，173.1，173.3；MS m/z(MH+)480。
中间体79可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例80
制备中间体80。
步骤1：
如实施例79所述
数据：
1H NMR(DMSO-d6)δ0.97-1.01(m，2H)，1.03-1.06(m，2H)，1.90-1.94(m，1H)，3.84(s，3H)，3.87(s，3H)，6.93(s，1H)，7.37(s，3H)，12.28(s，1H)；13C NMR(DMSO-d6)δ9.03，13.17，55.47，55.73，104.81，107.27，113.26，145.16，147.48，154.44，157.21，160.89；MS m/z(MH+)247。
步骤2：
如实施例79所述
数据：
1H NMR(CDCl3)δ1.00-1.04(m，2H)，1.07-1.11(m，2H)，1.43(s，5.4H)，1.46(s，3.6H)，2.17-2.21(m，1H)，2.37-2.43(m，1H)，2.62-2.69(m，1H)，3.75(s，1.8H)，3.78(s，1.2H)，3.92(d，J＝2.8Hz，1H)，4.00(s，3.6H)，4.01(s，2.4H)，4.48(t，J＝8.0Hz，0.6H)，4.59(t，J＝7.6Hz，0.4H)，5.7(br s，0.6H)，5.74(br s，0.4H)，7.18(s，1H)，7.20(s，1H)；13C NMR(CDCl3)δ9.6，9.7，18.1，28.3，28.4，35.8，36.7，52.2，52.4，56.3，57.8，58.2，74.0，74.5，80.5，80.6，101.0，101.1，106.3，108.6，148.8，149.1，153.8，155.4，164.4，165.9，172.9，173.2；LC-MS m/z(MH+)474。
中间体80可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例80
制备中间体81。
步骤1：
如实施例79所述，其中盐酸乙脒和2-溴-5-甲氧基苯酸被用作原料。
产物：
数据：
1H NMR(DMSO)δ2.31(s，3H)，3.85(s，3H)，7.36(d，J＝6.2Hz，1H)，7.37(s，1H)，7.51(d，J＝7.8Hz，1H)，12.15(s，1H)；13C NMR(DMSO)δ21.11，55.41，105.57，121.22，123.59，128.12，143.34，151.68，157.00，161.45；LC-MS m/e(MH+)191。
步骤2：
如实施例79所述。
数据：
1H NMR(CDCl3)δ1.43(s，5.4H)，1.45(s，3.6H)，2.38-2.45(m，1H)，2.62-2.71(m，1H)，2.66(s，1.8H)，2.68(s，1.2H)，3.77(1.8H)，3.79(s，1.2H)，3.92(s，3H)，3.93-3.98(m，2H)，4.49(t，J＝8.0Hz，0.6H)，4.61(t，J＝7.8Hz，0.4H)，5.82(t，J＝2.1Hz，0.6H)，5.89(t，J＝2.3Hz，0.4H)，7.26(dd，J＝4.7，3.2Hz，1H)，7.42(dd，J＝6.3，2.8Hz，1H)，7.75(d，J＝9.15Hz，1H)；13C NMR(CDCl3)δ26.1，28.3，28.4，35.8，36.7，52.2，52.2，52.4，52.5，55.755.8，57.9，58.2，74.1，74.7，80.6，101.0，101.2，114.9，125.6，125.9，128.6，147.3，153.8，154.5，157.6，157.6，161.2，164.6，173.0，173.3；LC-MS m/e(MH+)418。
中间体81可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例82
制备中间体82
步骤1：
如实施例79所述进行制备，并且使用2-溴-4，5-二甲氧基苯甲酸和三氟脒作为原料。
数据：
1H NMR(DMSO)δ3.92(s，3H)，3.94(s，3H)，7.33(s，1H)，7.50(s，1H)，13.40(br s，1H)；13C NMR(DMSO)δ55.8，56.1，104.9，108.7，150.2，155.0；LC-MS m/e(MH+)275.
步骤2：
如实施例79所述
产物：
数据：
1H NMR(CDCl3)δ1.42(s，3.6H)，1.44(s，5.4H)，2.42-2.49(m，1H)，2.67-2.73(m，1H)，3.37(s，1.2H)，3.78(s，1.8H)，3.97(t，J＝6.5Hz，1H)，4.02(s，2.4H)，4.04(s，3.6H)，4.48(t，J＝7.9Hz，0.6H)，4.60(t，J＝7.7Hz，0.4H)，5.86(br s，0.6H)，5.90(br s，0.4H)，7.27-7.29(m，1H)，7.38-7.44(m，1H)；13C NMR(CDCl3)δ8.2，28.3，35.7，36.7，52.1，52.2，52.4，56.5，57.8，58.2，75.5，76.0，80.7，100.8，107.6，111.0，119.7，148.2，150.2，151.4，153.8，154.5，156.4，165.1，172.7，173.0；LC-MS m/e(MH+)502。
中间体82可用于制备通式I的化合物，如下：
实施例83
制备中间体83
中间体83是市售可得的，并且可用于制备通式I的化合物。
实施例84
制备中间体84
中间体84是市售可得的，并且可用于制备通式I的化合物。
实施例85
制备中间体85
中间体85是市售可得的，并且可用于制备通式I的化合物。
实施例86
制备中间体86
制备中间体86的参考方案
步骤1：
搅拌3-苯基-丁-2-烯酸(16.2g)、二苯基磷酰叠氮化物(27.5g)和三乙胺(10.1g)/苯(100ml)的溶液1小时。通过硅胶填料过滤后，用苯洗涤并且浓缩，将残余物溶解在二苯甲烷(80ml)中并且回流3小时。冷却至室温后，通过填料收集固体，同时用苯洗涤并且干燥，得到10g(63％)的期望产物，为固体形式。
1H NMR(400MHz，CD3OD)δppm 2.30(s，3H)，7.00(s，1H)，7.54(m，1H)，7.77(m，2H)，8.33(d，J＝7.34Hz，1H)。
步骤2
将4-甲基-2H-异喹啉-1-酮(4.8g)/POCl3(50ml)溶液回流3小时。冷却和浓缩后，用5N NaOH使残余物碱化并且用CH2Cl2萃取。用盐水洗涤有机层并且用MgSO4干燥。过滤和浓缩后，使用5％乙酸乙酯/己烷通过Biotage的快速色谱法进行提纯，得到4.8g(90％)的期望产物，为固体形式。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 2.59(s，3H)，7.68(t，J＝7.70Hz，1H)，7.78(m，1H)，7.94(d，J＝8.31Hz，1H)，8.11(s，1H)，8.35(d，J＝8.31Hz，1H)。
制备中间体86的化学方法。
步骤1：
制备7-氟-6-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮。如本实施例的步骤1所示，使用19.6g的4-氟-3-甲氧基肉桂酸作为原料。获得9.5g产物(48％收率)。
数据：
1H NMR(400MHz，CD3COCD3)δppm 4.00(s，1H)，6.49(d，J＝7.34Hz，1H)，7.19(d，J＝7.09Hz，1H)，7.29(d，J＝8.07Hz，1H)，7.86(d，J＝11.74Hz，1H)。
步骤2：
制备1-氯-7-氟-6-甲氧基异喹啉：如本实施例的步骤2中所示，使用7-氟-6-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮(9g)作为原料。获得了7g的期望产物(70％收率)。
数据：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 4.04(s，3H)，7.17(d，J＝8.07Hz，1H)，7.48(d，J＝5.62Hz，1H)，7.94(d，J＝11.49Hz，1H)，8.20(d，J＝5.62Hz，1H)。
中间体86可用于制备通式I的化合物。
实施例87
制备中间体87。
步骤1：
如实施例86步骤1中的那些，但是使用3.82g的3-(4-氟-苯基)-3-甲氧基-丙烯酸作为原料。获得198mg产物(5％收率)。
产物：
数据：MS：(M+H)+194。
步骤2：
如实施例86步骤1中所述的，但是使用193mg的7-氟-4-甲氧基-2H-异喹啉-1-酮作为原料。获得199mg产物(94％收率)。
产物：
数据：
1H NMR(400MHz，CDCl3)δppm 4.05(s，3H)，7.49(m，1H)，7.78(s，1H)，7.86(dd，J＝9.66，2.57Hz，1H)，8.23(dd，J＝9.29，5.38Hz，1H)；MS：(M+H)+212。
中间体87可用于制备通式I的化合物。
实施例88
制备中间体88
中间体88可用于制备通式I的化合物。
实施例89
制备中间体89
在0℃向Boc-顺式HYP-OMe(122.6mg，0.5mmol)/THF(15mL)的溶液中，添加三苯基膦(196.7mg，0.75mmol)和苯并[d]异噁唑-3-醇(81mg，0.6mmol)。然后添加DEAD(0.118mL，0.75mmol)。将反应混合物升温至室温，并且搅拌3小时。然后浓缩溶剂并且通过制备性HPLC提纯残余物，得到无色稠油。(117mg，54％收率)
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ1.41(m，9H)，2.38(m，1H)，2.75(m，1H)，3.75(m，3H)，3.81(m，1H)，3.90(m，1H)，4.47(m，1H)，5.44(m，1H)，7.31(t，J＝7.46Hz，1H)，7.47(d，J＝8.56Hz，1H)，7.59(t，J＝7.83Hz，1H)，7.66(d，J＝8.07Hz，1H)。
LC-MS(停留时间，2.65分钟)，MS m/z 363(MH+)。
中间体89可用于制备通式I的化合物。
实施例90
制备中间体90
向2，4-二氯嘧啶(149mg，1mmol)/THF(5ml)的溶液中，添加四(三苯基膦)钯(23mg，2mol％)和0.5M的苯基溴化锌(2.1mL，1.05mmol)/THF的溶液。在50℃搅拌反应混合物过夜。然后将其添加到饱和的氯化铵溶液中并且用EtOAc萃取两次。合并有机层，用水洗涤并且干燥(MgSO4)。过滤，并且浓缩溶剂，得到黄色残余物，其通过制备性HPLC来提纯，得到浅黄色油，为2-氯-4-苯基-嘧啶。
中间体90可用于制备通式I的化合物。
实施例91
制备中间体91
向2，4-二氯嘧啶(149mg，1mmol)/THF(5ml)的溶液中，添加四(三苯基膦)钯(58mg，5mol％)和0.5M的2-吡啶基溴化锌(2.4mL，1.2mmol)/THF的溶液。在50℃搅拌反应混合物过夜。然后将其添加到饱和的氯化铵溶液中并且用EtOAc萃取两次。合并有机层，用水洗涤并且干燥(MgSO4)。过滤，随后浓缩溶剂，得到黄色残余物，其通过制备HPLC来提纯，得到浅黄色油作为产物。(中间体60，11mg，3.6％收率)
1H NMR(500MHz，CD3OD)δ7.61(m，1H)，8.07(m，1H)，8.36(d，J＝5.19Hz，1H)，8.50(d，J＝7.94Hz，1H)，8.75(d，J＝3.97Hz，1H)，8.82(d，J＝5.19Hz，1H).MS m/z 192(MH+)。
中间体91可用于制备通式I的化合物。
实施例92
制备中间体92
向2，4-二氯嘧啶(149mg，1mmol)/DMF(5ml)的溶液中，添加二氯双(三苯基膦)钯(II)(35mg，5mol％)和2-(三丁基甲锡烷基)噻吩(0.38mL，1.2mmol)。在70℃加热反应混合物3小时。然后向其中添加饱和的KF/甲醇(20ml)溶液，并且在室温下搅拌4小时。用少量硅胶浓缩反应混合物，使残余物滤过滤纸并且用EtOAc洗涤。然后浓缩滤液，通过制备性HPLC提纯残余物，得到灰白色固体作为产物。(110mg，35％收率)
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.20(dd，J＝5.01，3.79Hz，1H)，7.74(dd，J＝5.01，1.10Hz，1H)，7.77(d，J＝5.38Hz，1H)，7.98(dd，J＝3.79，1.10Hz，1H)，8.55(d，J＝5.38Hz，1H).MS m/z 197(MH+)。
中间体92可用于制备通式I的化合物。
实施例93
制备中间体93
向2，4-二氯嘧啶(149mg，1mmol)/DMF(5ml)的溶液中，添加二氯双(三苯膦)钯(II)(35mg，5mol％)和2-(三丁基甲锡烷基)呋喃(0.35mL，1.1mmol)。在70℃加热反应混合物3小时。然后向其中添加饱和的KF/甲醇(20ml)溶液，并且在室温下搅拌4小时。用少量硅胶浓缩反应混合物，使残余物滤过滤纸并且用EtOAc洗涤。然后浓缩滤液，通过制备性HPLC提纯残余物，得到淡褐色固体作为产物。(80mg，27％收率)
1H NMR(400MHz，CD3OD)δ6.68(dd，J＝3.67，1.71Hz，1H)，7.42(d，J＝3.67Hz，1H)，7.67(d，J＝5.13Hz，1H)，7.30(d，J＝1.71Hz，1H)，8.62(d，J＝5.14Hz，1H).MS m/z 181(MH+)。
中间体62可用于制备通式I的化合物。
实施例94
制备中间体94
向2，4-二氯嘧啶(149mg，1mmol)/DMF(5ml)的溶液中，添加二氯双(三苯基膦)钯(II)(35mg，5mol％)和2-(三丁基甲锡烷基)噻唑(412mg，1.1mmol)。在80℃加热反应混合物3小时。然后向其中添加饱和的KF/甲醇(20ml)溶液，并且在室温下搅拌4小时。用少量硅胶浓缩反应混合物，使残余物滤过滤纸并且用EtOAc洗涤。然后浓缩滤液，通过制备性HPLC提纯残余物，得到淡褐色固体作为产物。(9mg，3％收率)。
MS m/z 198(MH+)。
中间体63可用于制备通式I的化合物。
实施例95
制备中间体95
步骤1：
在0℃，向Boc-HYP-OH(1.0g，4.324mmol)/DMF(20ml)溶液中，添加NaH(0.38g的在矿物油中的60％的分散体，9.513mmol)。搅拌反应混合物1小时。然后添加2，4-二氯嘧啶(0.709g，0.0289mmol)。将反应混合物升温至室温并且搅拌过夜。然后将其用1N HCl溶液淬灭并且用EtOAc萃取。分离有机层，用盐水洗涤和干燥(MgSO4)。过滤，随后浓缩溶剂，得到粗产物，其然后通过制备性HPLC来提纯，得到无色油作为产物。(0.4g，27％收率)
1H NMR(CD3OD，300MHz)δ1.13(m，9H)，2.37(m，1H)，2.62(m，1H)，3.70-3.84(m，2H)，4.38(m，1H)，5.65(m，1H)，6.88(d，J＝5.86Hz，1H)，8.37(d，J＝5.86Hz，1H).MS m/z 344(MH+)。
步骤2：
向(2S，4R)4-(2-氯-嘧啶-4-基氧基)-吡咯烷-1，2-二羧酸1-叔丁基酯(0.34g，0.99mmol)/CH3CN(20ml)溶液中，添加(1R，2S)/(1S，2R)(1-环丙烷磺酰基-氨羰基-2-乙烯基-环丙基)-氨基甲酸(0.511g，1.48mmol)、DIEA(0.86mL，4.95mmol)和耦合化学试剂HOBt(0.226g，1.48mmol)和HBTU(0.561g，1.48mmol)。在室温搅拌该溶液过夜。然后将其浓缩，用水洗涤并且用乙酸乙酯萃取两次。用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩。然后通过制备性HPLC柱提纯它，得到黄色固体(A)。(0.33g，41％收率)。
MS m/z 655(MH+)。
步骤3
向中间体4(50mg，0.061mmol)/CH2Cl2(2.5ml)的溶液中，添加1，2，3，4-四氢异喹啉(0.011mL，0.0915mmol)和Et3N(0.021mL，0.153mmol)。在室温搅拌反应混合物过夜并且在40℃搅拌1天。除去溶剂，通过制备性HPLC提纯残余物，得到无色油。然后将其溶于4N HCl/二氧己环(1ml)中并且搅拌过夜。蒸发溶剂，得到无色油，形式为盐酸盐。(20mg，52％收率)。
MS m/z 553(MH+)。
步骤4
向4-[2-(3，4-二氢-1H-异喹啉-2-基)-嘧啶-4-基氧基]-吡咯烷-2-羧酸(1-环丙烷磺酰基氨基羰基-2-乙烯基环丙基)-酰胺盐酸盐(20mg，0.032mmol)/CH3CN(5ml)的溶液中，添加2-甲氧基羰基氨基-3，3-二甲基-丁酸(9.1mg，0.048mmol)、DIEA(0.028mL，0.16mmol)和耦合化学试剂HOBt(7.3mg，0.048mmol)和HBTU(18.2mg，0.048mmol)。在室温搅拌该溶液过夜。然后将其浓缩，用水洗涤并且用乙酸乙酯萃取两次。用盐水洗涤合并的有机层，用MgSO4干燥，过滤，浓缩，得到浅黄色油。然后通过制备性HPLC柱提纯它，得到作为TFA盐的无色油(中间体64)。(16mg，60％收率)
1H NMR(CD3OD，500MHz)δ...0.98-1.06(m，13H)，1.13(m，1H)，1.22-1.32(m，1H)，1.35-1.44(m，1H)，1.82(dd，J＝8.24，5.19Hz，0.5H)，1.90(dd，J＝8.24，5.49Hz，0.5H)，2.26(m，1H)，2.32-2.43(m，1H)，2.56(m，1H)，2.96(m，1H)，3.11(m，br，2H)，3.56(s，3H)，4.14(m，1H)，4.21(m，1H)，4.38(m，1H)，4.47(m，1H)，5.15(m，1H)，5.31(m，1H)，5.75(m，1H)，5.94(s，1H)，6.47(d，J＝7.02Hz，1H)，7.29(s，4H)，7.49(m，1H)，7.56(m，1H)，7.74(d，J＝8.24Hz，1H)，7.88(d，J＝8.24Hz，1H)，8.11(d，J＝7.02Hz，1H).MS m/z 724(MH+)。
中间体95可用于制备通式I的化合物。
实施例96
制备中间体96
向A(50mg，0.061mmol)/CH2Cl2(2.5ml)的溶液中，添加异吲哚啉(0.013mL，0.115mmol)和Et3N(0.026mL，0.19mmol)。在室温搅拌反应混合物2天。除去溶剂，通过制备性HPLC提纯残余物，得到无色油。然后将其溶于4N HCl/二氧己环(1ml)中并且搅拌过夜。蒸发溶剂，得到粗产物，其再次通过制备性HPLC来提纯，得到作为TFA盐的浅黄色固体。(8.5mg，14％收率)。MS m/z 539(MH+)。
中间体65可用于制备通式I的化合物。
实施例97
制备中间体97
向实施例95的A(50mg，0.061mmol)/CH2Cl2(2.5ml)的溶液中，添加吗啉(0.008mL，0.0915mmol)和Et3N(0.021mL，0.153mmol)。在室温搅拌反应混合物过夜并且在40℃搅拌1天。除去溶剂，通过制备性HPLC提纯残余物，得到无色油。然后将其溶于4N HCl/二氧己环(1ml)中并且搅拌过夜。蒸发溶剂，得到无色油，形式为盐酸盐。(12.6mg，36％收率)；MS m/z 507(MH+)。
中间体66可用于制备通式I的化合物。
实施例98
制备中间体98
A，较高的Rf， B，较低的Rf，
1(R)-2(S) 1(S)-2(R)
中间体98
步骤1：
在10分钟内，向市售可得的N-Boc-(4s)-(顺式)-羟脯氨酸-OMe(200mg，0.82毫摩尔)、三苯基膦(320mg，1.22毫摩尔)和1-萘酚(176mg，1.22毫摩尔)/2.5mL四氢呋喃的溶液中，滴加二乙基重氮二羧酸酯(190μl，1.22毫摩尔)/1.0mL THF的溶液。搅拌5.5天后，将反应物真空浓缩。在20X40cM制备性TLC板上对粗制的黄色油进行色谱分析(Analtech SiO2)，用6-1己烷-乙酸乙酯洗脱，得到期望产物，浅黄色油(150mg，33％)。
1H NMR(CDCl3，500MHz)δ1.44(s，9H)2.33(1H，m)，2.72(1H，m)，3.77and 3.38(2s，3H，旋转异构体)，3.88(dd，1H，J＝4.3，12.4Hz)，3.97(bd，1H)，4.53 and 4.62(2t，1H，J＝7.8Hz，旋转异构体)，5.10(bd，1H)，6.76(t，1H，J＝9.5Hz)，7.37(m，1H)，7.46(m，3H)，7.80(d，1H，J＝7.7Hz)，8.18(m，1H)；MS m/z 394(M+Na)+
步骤2：
向搅拌的Boc-(4R)-萘亚甲基-1-氧代)-Pro-OEt(150mg，0.40毫摩尔)/1.5mL THF和0.5mL水的溶液中，添加氢氧化锂(10mg)。在室温下搅拌溶液21小时，然后用0.5N NaHCO3进行稀释。用乙酸乙酯萃取该碱性溶液，然后酸化水层至pH值为2，这是通过滴加浓HCl实现的。然后再用乙酸乙酯萃取该酸化层。用硫酸镁干燥该第二乙酸乙酯层，过滤，然后真空浓缩，得到Boc-(4R)-萘亚甲基-1-氧代)-Pro-OH，为淡粉红色晶体(147mg，100％)。
1H NMR(CDCl3，500MHz)δ1.47and 1.48(2s，9H，rotamers)，2.40and 2.52(2m，1H)，2.68 and 2.78(2m，1H)，3.78-4.07(m，2H)，4.57 and 4.69(2t，1H，J＝7.6 and 8.0Hz，rotamers)，5.12(bd，1H)，6.77(dd，1H，J＝7.6，21.2Hz)，7.37(m，1H)，7.46(m，3H)，7.81(t，1H，J＝5.8Hz)，8.19(m，1H)；MSm/z 358(M+H)+
步骤3：
向Boc-((4R)-萘亚甲基-1-氧代)-Pro-OH(147mg，0.41毫摩尔)和外消旋(1R/2S)/(1S/2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐(79mg，0.41毫摩尔)/2.8ml二氯甲烷的溶液中，添加DIPEA(250μl，1.44毫摩尔)和TBTU(158mg，0.49毫摩尔)。在氮气下，搅拌所得溶液20小时，然后用40ml二氯甲烷稀释。有机层用水、1N NaHCO3、1N HCl、水和盐水洗涤。然后使用硫酸钠和真空浓缩来干燥该溶液。通过制备性TLC来提纯，得到两种分离的非对映异构体，较高Rf的非对映异构体A(P2[Boc(4R)-(萘亚甲基-1-氧代)脯氨酸]-P1(1R，2S乙烯基Acca)-OEt，78mg，38％)和较低Rf的非对映异构体B(P2[Boc(4R)-(萘亚甲基-1-氧代)脯氨酸]-P1(1S，2R乙烯基Acca)-OEt，91mg，45％)，为灰白色固体：
非对映异构体A：P2[Boc(4R)-(萘亚甲基-1-氧代)脯氨酸]-P1(1R，2S乙烯基Acca)-OEt：1H NMR(CDCl3，500MHz)δ1.24(t，3H)，1.43(s，9H)，1.52(m，1H)，1.84(m，1H)，2.02(m，1H)，2.14(m，1H)，2.81(m，1H)，3.88(m，2H)，4.11(q，1H，J＝7.15)，4.19(m，1H)，4.54(m，1H)，5.15(m，1H)，5.31(dd，1H，J＝17，0.8Hz)，5.77(m，1H)，6.83(m，1H)，7.36(t，1H，J＝7.8Hz)，7.46(m，3H)，7.78(d，1H，J＝7.6Hz)，8.14(d，1H，J＝8.15Hz)；
MS m/z 495(M+H)+
非对映异构体B，实施例10B：P2[Boc(4R)-(萘亚甲基-1-氧代)脯氨酸]-P1(1S，2R乙烯基Acca)-OEt：1H NMR(d1-CHCl3，500MHz)δ1.24(t，3H)，1.42(s，9H)，1.85(m，1H)，2.15(q，1H，J＝8.9Hz)，2.40(m，1H)，2.78(m，1H)，3.78(m，1H)，4.12(m，2H)，4.52(m，1H)，5.15(m，1H)，5.31(m，1H)，5.79(m，1H)，6.80(m，1H)，7.35(t，1H，J＝7.6Hz)，7.46(m，3H)，7.78(d，1H，J＝7.6Hz)，8.14(d，1H，J＝8.10Hz)。
MS m/z 495(M+H)+
中间体98可用于制备通式I的化合物。
生物学研究
在本公开内容中，使用了HCV NS3/4A蛋白酶复合物酶分析和细胞型HCV复制子分析，并且其制备、处理和确认如下：
重组体HCV NS3/4A蛋白酶复合物的产生
形成了HCV NS3蛋白酶复合物，其衍生自BMS菌株、H77菌株或者J4L6S菌株，如下所述。形成了这些提纯的重组体蛋白质，以供均质分析之用(见下文)，从而提供了本公开内容的化合物在抑制HCV NS3蛋白水解活性的有效性如何的指标。
来自HCV感染患者的血清获自Dr.T.Wright，San FranciscoHospital。HCV基因组(BMS菌株)的设计的全长cDNA(互补脱氧核糖核酸)模板是由DNA片段构造的，所述DNA片段是通过血清RNA(核糖核酸)的反转录-PCR(RT-PCR)并且使用根据其它基因型1a菌株之间的同源性选择的引子(primer)获得的。由整个基因组序列的测量结果，基因型1a被分配给HCV离析物，根据Simmonds等的分类法(参见P Simmonds，KA Rose，S Graham，SW Chan，F McOmish，BC Dow，EA Follett，PL Yap andhours Marsden，J.Clin.Microbiol.，31(6)，1493-1503(1993))。非结构区域NS2-5B的氨基酸序列显示出与HCV基因型1a(H77)的相同度大于97％，并且与基因型1b(J4L6S)的相同度为87％。传染性克隆，H77(1a基因型)和J4L6S(1b基因型)获自R.Purcell(NIH)，并且该序列公开在Genbank中(AAB67036，参见Yanagi，M.，Purcell，R.H.，Emerson，S.U.and Bukh，J.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(16)，8738-8743(1997)；AF054247，参见Yanagi，M.，St Claire，M.，Shapiro，M.，Emerson，S.U.，Purcell，R.H.andBukh，J，Virology 244(1)，161-172.(1998))。
H77和J4L6S菌株用于生产重组体NS3/4A蛋白酶复合物。操控DNA编码这些菌株的重组体HCV NS3/4A蛋白酶复合物(氨基酸1027-1711)，如P.Gallinari等所描述的(参见Gallinari P，Paolini C，Brennan D，Nardi C，Steinkuhler C，De Francesco R.Biochemistry.38(17)：5620-32，(1999))。简而言之，在NS4A编码区的3′-端，添加了三种赖氨酸增溶尾(solubilizing tail)。NS4A-NS4B裂解位点的P1位置中的半胱氨酸(氨基酸1711)被转变为甘氨酸，以避免赖氨酸标记的溶蛋白性裂解。此外，在氨基酸位置1454处，通过PCR而引入半胱氨酸至丝氨酸突变，从而防止NS3解旋酶域中的自溶性裂解。变体DNA片段在pET21b细菌表达载体中进行克隆(Novagen)并且NS3/4A复合物用大肠杆菌菌株BL21(DE3)表达(Invitrogen)，这遵循P.Gallinari等所述的实验设计(参见Gallinari P，Brennan D，Nardi C，Brunetti M，Tomei L，Steinkuhler C，DeFrancesco R.，J Virol.72(8)：6758-69(1998))以及适当修改。简而言之，NS3/4A蛋白酶复合物表达在20℃用0.5毫摩(mM)异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)诱发22小时(h)。典型的发酵(1升(L))获得大约10克(g)的湿细胞糊剂。这些细胞被再悬浮在溶胞缓冲剂(10mL/g)中，该缓冲剂包括25mM N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)(HEPES)，pH值7.5，20％丙三醇，500mM氯化钠(NaCl)，0.5％Triton X-100，1微克/毫升(“μg/mL”)溶菌酶，5mM氯化镁(MgCl2)，1μg/mL DnaseI，5mMβ-巯基乙醇(βME)，蛋白酶抑制剂-不含乙二胺四乙酸(EDTA)(Roche)，使其均化并且在4℃培养20分钟(min)。匀浆物进行声处理，通过超离心在235000g在4℃澄清1小时。将咪唑添加到上层清液中，使得最终浓度为15mM，并且pH值被调节至8.0。将粗制蛋白质萃取物加载到用缓冲剂B(25mM HEPES，pH值8.0，20％丙三醇，500mM NaCl，0.5％ TritonX-100，15mM咪唑，5mM βME)预平衡过的镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱上。样品加载的流速为1mL/min。柱用15柱体积的缓冲剂C(与缓冲剂B相同，区别在于0.2％ Triton X-100)洗涤。蛋白质用5柱体积的缓冲剂D(与缓冲剂C相同，区别在于用200mM咪唑)洗脱。
将含NS3/4A蛋白酶复合物的级分集中，并且加载到用缓冲剂D(25mM HEPES，pH值7.5，20％丙三醇，300mM NaCl，0.2％ TritonX-100，10mM βME)预平衡过的脱盐柱Superdex-S200上。样品加载的流速为1mL/min。将含NS3/4A蛋白酶复合物的级分集中并且浓缩至大约0.5mg/ml。衍生自BMS、H77和J4L6S菌株的NS3/4A蛋白酶复合物的纯度，通过SDS-PAGE和质谱分析被判断为大于90％。酶在-80℃存储，在冰上融解并且在使用前在分析缓冲剂中稀释。
FRET肽分析以监控HCV NS3/4A蛋白质分解活性
这种体外分析的目的在于测量本公开内容的化合物对如上所述衍生自BMS菌株、H77菌株或者J4L6S菌株的HCV NS3蛋白酶复合物的抑制作用。这种分析提供了一种本公开内容的化合物在抑制HCV NS3蛋白质分解活性方面效果如何的指标。
为了监控HCV NS3/4A蛋白酶活性，使用NS3/4A肽底物。该底物是RET S1(Resonance Energy Transfer Depsipeptide Substrate；AnaSpec，Inc.cat#22991)(FRET肽)，其在Anal.Biochem.240(2)：60-67(1996)中由Taliani等人进行了描述。这种肽的序列大概基于HCV NS3蛋白酶的NS4A/NS4B天然裂解位点，不同之处在于在裂解位点处是酯键而不是酰胺键。该肽还包含荧光供体，EDANS，其靠近肽的一端，和受体，DABCYL，其靠近另一端。通过供体和受体之间的分子间共振能量传递(RET)来淬灭肽的荧光，但是当NS3蛋白酶使肽裂解时，产物从RET淬灭中释放并且供体的荧光变得明显。
在本公开内容化合物的不存在或存在的情况下，用三个重组体NS3/4A蛋白酶复合物中的一个培养肽底物。使用Cytofluor Series 4000，通过实时监控荧光反应产物的形成来测定化合物的抑制效果。
化学试剂如下：HEPES和丙三醇(超纯)，获自GIBCO-BRL。二甲亚砜(DMSO)，获自Sigma。β-巯基乙醇，获自Bio Rad。
分析缓冲剂：50mM HEPES，pH值7.5；0.15M NaCl；0.1％ Triton；15％丙三醇；10mM βME。底物：2μM最终浓度(获自在-20℃存储的DMSO中的2mM储备溶液)。HCV NS3/4A蛋白酶类型1a(1b)，2-3nM最终浓度(获自25mM HEPES中的5μM储备溶液，pH值7.5，20％丙三醇，300mM NaCl，0.2％ Triton-x100，10mM βME)。对于具有接近分析极限的潜能的化合物来说，通过将50μg/mL牛血清清蛋白(Sigma)添加到分析缓冲剂中并且将末端蛋白酶浓度降低到300pM，使得分析更加敏感。
分析在96孔的聚苯乙烯黑色板(获自Falcon)中进行。各个孔含有25μL NS3/4A蛋白酶复合物/分析缓冲剂、50μL的本公开内容的化合物/10％ DMSO/分析缓冲剂和25μL底物/分析缓冲剂。在相同的分析板上，还制备了对照物(不含化合物)。将酶复合物与化合物或者对照物溶液混合达1分钟，然后通过添加底物开始酶促反应。使用Cytofluor Series4000(Perspective Biosystems)，即刻读取分析板。对装置进行设置，以在25℃，读取340nm的发射和490nm的激发。反应通常进行大约15分钟。
用以下公式计算抑制百分比：
100-[(δFinh/δFcon)×100]
其中δF是在曲线的线性范围内荧光的变化。对抑制-浓度数据应用非线性曲线拟合，通过利用Excel XLfit软件，使用以下公式来计算50％有效浓度(IC50)：
y＝A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))。
发现所检测的全部化合物，借助8μM或以下的IC50′s，抑制了NS3/4A蛋白酶复合物的活性。进一步地发现，本公开内容的化合物，其相对于一类以上的NS3/4A复合物进行检测，具有类似的抑制性能，但这些化合物显示出更大的对抗1b菌株的潜能，相比于对抗1a菌株而言。
特异性分析
进行特异性分析以便显示，相比于其它丝氨酸或者半胱氨酸蛋白酶而言，本公开内容的化合物在抑制HCV NS3/4A蛋白酶复合物的体外选择性。
测定了本公开内容的化合物对抗各种丝氨酸蛋白酶的特异性：人嗜中性弹性酶(HNE)、猪胰腺弹性酶(PPE)和人胰腺糜蛋白酶和一种巯基蛋白酶：人肝脏组织蛋白酶B。在全部情况中，使用了96孔板形式的实验设计，对于每一酶使用特定的比色对硝基苯胺(pNA)底物或者荧光氨基-甲基-香豆素(AMC)底物，如现有技术(PCT专利申请，公开号WO00/09543)以及一些变体所述。全部酶购自Sigma或者EMDbiosciences，而底物获自Bachem。
各个pNA分析包括：在室温下2小时酶-抑制剂预培养，随后添加底物，水解至约15％的转化，如在Spectramax Pro微板读取器上测量的。在室温下，通过将底物添加到10分钟酶-抑制剂预培养物中来启动组织蛋白酶B的分析，并且使用Cytofluor Series 4000即刻测量分析板。化合物浓度从100到0.4μM变化，这取决于它们的潜能。
各个分析的最终条件如下：
50mM三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)pH值为8，0.5M硫酸钠(Na2SO4)，50mM NaCl，0.1mM EDTA，3％ DMSO，0.01％ 吐温20，和：
133μM succ-AAA-pNA和20nM HNE或8nM PPE；100μM succ-AAPF-pNA和250pM糜蛋白酶。
100mM NaHPO4(磷酸氢钠)pH值5.5，3％ DMSO，1mM TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)，5nM组织蛋白酶B(酶原料在含20mMTCEP的缓冲剂中进行活化，然后使用)，和2μM Z-FR-AMC(稀释于H2O中)。
使用以下公式计算抑制百分比：
[1-((UVinh-UV空白)/(UVctl-UV空白))]×100
对抑制-浓度数据应用非线性曲线拟合，通过利用Excel XLfit软件来计算50％有效浓度(IC50)。
HCV复制子的形成
如Lohmann V，Korner F，Koch J，Herian U，Theilmann L，Bartenschlager R.，Science 285(5424)：110-3(1999)所述，建立了HCV复制子的全细胞系统。该系统使得我们可以评估我们的HCV蛋白酶化合物对HCV RNA复制的作用。简而言之，使用HCV菌株1b序列，其描述于Lohmann论文(登记号：AJ238799)中，由Operon Technologies，Inc.(Alameda，CA)合成HCV cDNA，然后使用标准分子生物学技术在质粒pGem9zf(+)(Promega，Madison，WI)中组装全长复制子。复制子包括(i)HCV 5′UTR，其融合到衣壳蛋白质的前12个氨基酸，(ii)新霉素磷酸转移酶基因(neo)，(iii)来自脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES，和(iv)HCVNS3-NS5B基因和HCV 3′UTR。借助ScaI使质粒DNA线性化并且使用T7 MegaScript转录工具(Ambion，Austin，TX)，根据制造商的指导说明，在体外合成RNA转录产物。cDNA的体外转录产物被转入到人肝癌细胞系，HUH-7。在选择性标记——新霉素(G418)存在下，实现了基本上表达HCV复制子的细胞的选择。所得的细胞系表征了随时间的正链和负链RNA生产和蛋白质生产。
HCV复制子FRET分析
进行了HCV复制子FRET分析以便监控本公开内容中描述的化合物对HCV病毒复制的抑制效果。HUH-7细胞，基本表达HCV复制子，生长于Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)(Gibco-BRL)中，该培养基包含10％胎牛血清(FCS)(Sigma)和1mg/ml G418(Gibco-BRL)。在96孔组织培养无菌板中，天黑前进行细胞接种(1.5×104细胞/孔)。在DMEM中制备化合物和不含化合物的对照物，所述DMEM包含4％FCS、1∶100青霉素/链霉素(Gibco-BRL)、1∶100L-谷氨酰胺和5％DMSO/稀释板(在分析中DMSO最终浓度为0.5％)。化合物/DMSO混合物被添加到细胞并且在37℃培养4天。4天后，首先使用alamar Blue(Trek Diagnotstic Systems)进行CC50读数，以评估细胞的细胞毒性。通过将1/10体积的alamar Blue添加到培养细胞的介质中，确定化合物的毒性(CC50)。4小时后，借助530nm处的激发波长和580nm的发射波长，使用Cytofluor Series4000(Perspective Biosystems)，读取各个孔的荧光信号。然后，用磷酸缓冲盐水(PBS)充分地洗涤板(3次×150μl)。用25μL的溶胞分析化学试剂使细胞溶胞，所述溶胞分析化学试剂包含HCV蛋白酶底物(5×细胞萤光素酶细胞培养溶胞化学试剂)(Promega#E153A)，其用蒸馏水稀释1×，加入NaCl至最终150mM，FRET肽底物(如上述酶分析所述的)在100％DMSO中从原料的2mM稀释到最终的10μM。然后将板置于Cytofluor 4000装置中，后者已被设置为340nm激发/490nm发射，自动模式，21次循环，以动力学方式对板读数。如IC50测量所述，进行EC50测量。
HCV复制子萤光素酶指针分析
作为辅助的分析，在复制子萤光素酶指针分析中证实了来自复制子FRET分析的EC50测量结果。Krieger等首先描述了复制子萤光素酶指针分析的应用(Krieger N，Lohmann V，and Bartenschlager R，J.Virol.75(10)：4614-4624(2001))。对于我们的FRET分析所描述的复制子结构是通过如下方式改变的：插入cDNA，其编码了人化形式的Renilla萤光素酶基因，和联结子序列，其直接融合到萤光素酶基因的3’-末端。使用位于核心中的Ascl限制性位点将这种插入物引入到复制子结构中，直接位于新霉素标记基因的上游。还引入了位置1179处的适应性突变(丝氨酸至异亮氨酸)(Blight KJ，Kolykhalov，AA，Rice，CM，Science 290(5498)：1972-1974)。如上所述，形成基本上表达这种HCV复制子结构的稳定的细胞系。借助以下变体，如就HCV复制子FRET分析所述的，建立了萤光素酶指针分析。在37℃/5％ CO2培养箱中4天后，使用PromegaDual-Glo萤光素酶分析系统，分析细胞的Renilla萤光素酶活性。从含细胞的各个孔中去除介质(100μl)。向剩余50μL的介质中，添加50μL的Dual-Glo萤光素酶化学试剂，在室温下将各板摇晃10分钟-2小时。然后将Dual-Glo Stop&Glo化学试剂(50μl)添加到各个孔中，在室温下再次摇晃各板另外的10分钟至2小时。使用发光程序，在Packard TopCountNXT上对各个板读数。
使用以下公式计算抑制百分比：
将各值绘制成曲线，使用XLfit分析，从而获得EC50值。
在HCV酶分析、HCV复制子细胞分析和/或在多个概述的特异性分析中，评估本公开内容的代表性化合物。例如，在酶分析中，发现化合物56对抗NS3/4A BMS菌株的IC50为99纳摩尔(nM)。借助公开的H77(17nM的IC50)和J4L6S(9.8nM的IC50)菌株，获得了类似的潜能值。在复制子FRET分析中，EC50值是742nM，在复制子萤光素酶分析中，EC50值是247nM。
在特异性分析中，发现相同的化合物具有以下活性：HLE＞100μM；PPE＞100μM；糜蛋白酶＞100μM；组织蛋白酶B＞100μM。这些结果表明，该类化合物对于NS3蛋白酶是高度特异性的并且这些要素中的许多抑制了HCV复制子的复制。
检测了本公开内容的化合物并发现具有如下范围内的活性：
IC50活性范围(对于所检测的化合物)：A＞1μM；B为0.1-1μM；C＜0.1
EC50活性范围(NS3/4A BMS菌株)：A＞5μM；B为0.5-5μM；C＜0.5μM
根据本公开内容的一种实施方案，所述化合物的生物活性(EC50)为5μM或以下，而在另一实施方案中，为0.5μM或以下。
表1显示了典型的化合物的IC50和EC50值。可以通过遵循实施例和方案中所述的方法，替换合适的原料来制备未包含在前述实施例中的那些实施例。
表1：典型的化合物的生物学数据
对于本领域技术人员显而易见的是，本公开内容不局限于上述示意性实施例，在不背离其本质性质的情况下，它可以以其它特定的形式表现。因此期望的是全面地考虑各个实施例，如对所附权利要求而非上述实施例进行说明性的而非限制性的参考，并且落入权利要求等价物的涵义和范围内的全部变化因此旨在包含于其中。
Claims (26)
1.通式(I)的化合物或者其药学可接受的盐，
其中
L不存在或者是-C(O)-；
R1是杂芳基或杂环基，其中所述杂芳基和杂环基任选地被一个、两个、三个、四个、五个或六个独立地选自以下的取代基取代：烷氧基、烷氧羰基、烷氧基羰氧基、烷基、烷基硫烷基、芳基、芳基烷氧基、羧基、氰基、环烷基、卤素、卤烷氧基、卤代烷基，杂芳氧基、杂芳基、杂芳基羰基、杂环基、羟基、巯基、-NRaRb、(NRaRb)烷基和(NRcRd)羰基；
R2选自氢、链烯基、烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷基、烷基氨基烷基、氨基烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、二烷基氨基烷基、卤代烷氧基烷基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基和杂环基烷基；
R3选自氢和R5-NH-C(O)-；
R4选自氢、链烯基、烷基、环烷基、卤代链烯基和卤代烷基；
R5选自烷基、芳基、芳基烷基、羧烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷氧基烷基、卤代烷基、杂芳基、杂芳基烷基、杂环基和杂环基烷基；
Ra和Rb之一选自氢、烷氧羰基、烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、芳基烷基、芳基羰基、芳基磺酰基、环烷基、甲酰基和(NRaRd)羰基，而另一个选自氢、烷基和环烷基；
Rc和Rd各自独立地选自氢和烷基；
和
W选自羟基和-NH-SOn-R6，其中n是1或2并且R6选自烷基、芳基、环烷基、(环烷基)烷基、杂芳基、杂环基和-NRaRb。
2.权利要求1的化合物，其中R3是氢。
3.权利要求1的化合物，其中R3是R5-NH-C(O)-。
4.权利要求3的化合物，其中W是-NH-SOn-R6。
5.权利要求4的化合物，其中L是-C(O)-。
6.权利要求5的化合物，其中R1是
其中
R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、烷氧基、烷氧羰基、烷氧基羰氧基、烷基、烷基硫烷基、芳基、芳基烷氧基、羧基、氰基、环烷基、卤素、卤烷氧基、卤代烷基、杂芳氧基、杂芳基、杂芳基羰基、杂环基、羟基、巯基、-NRaRb、(NRaRb)烷基和(NRcRd)羰基。
7.权利要求6的化合物，其中R7、R8、R9、R10、R11和R12中的一个是卤素，而其余的是氢。
8.权利要求4的化合物，其中L是不存在的。
9.权利要求8的化合物，其中R1是
其中R7、R8、R9和R10独立地选自氢、烷氧基、烷氧羰基、烷氧基羰氧基、烷基、烷基硫烷基、芳基、芳基烷氧基、羧基、氰基、环烷基、卤素、卤烷氧基、卤代烷基、杂芳氧基、杂芳基、杂芳基羰基、杂环基、羟基、巯基、-NRaRb、(NRaRb)烷基和(NRcRd)羰基。
10.权利要求8的化合物，其中R1是
其中
X选自N和CR12；
Y选自N和CH；和
R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地选自氢、烷氧基、烷氧羰基、烷氧基羰氧基、烷基、烷基硫烷基、芳基、芳基烷氧基、羧基、氰基、环烷基、卤素、卤烷氧基、卤代烷基、杂芳氧基、杂芳基、杂芳基羰基、杂环基、羟基、巯基、-NRaRb、(NRaRb)烷基和(NRcRd)羰基。
11.通式(II)的化合物或者其药学可接受的盐，
其中
R1选自
L不存在或者是-C(O)-；
X选自N和CR12；
Y选自N和CH；和
R7、R8、R9、R10、R11和R12各自独立地选自氢、烷氧基、芳基、卤素和杂芳基；
R2选自烷氧基烷基、烷基、芳基、环烷基、(环烷基)烷基和杂芳基烷基；
R3选自氢和R5-NH-C(O)-；
R4是链烯基或烷基；
R5选自链烯基、烷基、芳基、环烷基和杂芳基烷基；
R6选自芳基、环烷基、杂芳基和-NRaRb；和
Ra和Rb是烷基。
12.权利要求11的化合物，其中R3是氢。
13.权利要求11的化合物，其中R3是R5-NH-C(O)-。
14.一种组合物，其包含权利要求1的化合物和药学可接受的载体。
15.权利要求14的组合物，还包括干扰素和三氮唑核苷。
16.权利要求14的组合物，还包括具有抗HCV活性的第二化合物。
17.权利要求16的组合物，其中具有抗HCV活性的第二化合物是干扰素。
18.权利要求17的组合物，其中干扰素选自干扰素α-2B、聚乙二醇修饰的干扰素α、组合干扰素、干扰素α-2A和淋巴细胞样干扰素τ。
19.权利要求16的组合物，其中具有抗HCV活性的第二化合物选自白介素2、白介素6、白介素12、强化1型辅助性T细胞响应形成的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特、三氮唑核苷、次黄嘌呤核苷5′-单磷酸盐脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚烷乙胺。
20.抑制HCV丝氨酸蛋白酶的功能的方法，包括使HCV丝氨酸蛋白酶与权利要求1的化合物接触。
21.处理在患者体内HCV感染的方法，包括将治疗有效量的权利要求1的化合物给予患者。
22.权利要求21的方法，其中所述化合物有效地抑制HCV丝氨酸蛋白酶的功能。
23.权利要求22的方法，还包括在给予权利要求1的化合物之前、之后或者同时，给予具有抗HCV活性的第二化合物。
24.权利要求23的方法，其中具有抗HCV活性的第二化合物是干扰素。
25.权利要求24的方法，其中干扰素选自干扰素α-2B、聚乙二醇修饰的干扰素α、组合干扰素、干扰素α-2A和淋巴细胞样干扰素τ。
26.权利要求23的方法，其中具有抗HCV活性的第二化合物选自白介素2、白介素6、白介素12、强化1型辅助性T细胞响应形成的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特、三氮唑核苷、次黄嘌呤核苷5′-单磷酸盐脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚烷乙胺。
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