CN102112486B

CN102112486B - 丙型肝炎病毒抑制剂

Info

Publication number: CN102112486B
Application number: CN200980130146.5A
Authority: CN
Inventors: 艾伦.X.王; 保罗.M.斯科拉
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2008-05-29
Filing date: 2009-05-28
Publication date: 2014-02-12
Anticipated expiration: 2029-05-28
Also published as: CN102112486A; JP2011523651A; EP2300490B1; EP2300490A1; JP5450604B2; WO2009146347A1; US7964560B2; US20090304626A1

Abstract

本发明披露了具有下述通式的丙型肝炎病毒抑制剂。本发明也披露了包含所述化合物的组合物以及使用所述化合物抑制HCV的方法。

Description

丙型肝炎病毒抑制剂

对相关申请的交叉参考

本申请要求2008年5月29日提交的美国临时专利申请61/056,875的权益。

技术领域

本发明大体涉及抗病毒化合物，更具体涉及抑制由丙型肝炎病毒(HCV)编码的NS3蛋白酶(本申请也称作“丝氨酸蛋白酶”)的功能的化合物、包含所述化合物的组合物以及抑制NS3蛋白酶的功能的方法。

背景技术

HCV是主要的人类病原体，在世界范围内估计一亿七千万人感染HCV—大致是1型人类免疫缺陷病毒感染数量的5倍。这些HCV感染个体中相当大的部分发展成严重的进行性肝脏疾病，包括肝硬化(cirrhosis)和肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)。

目前，最有效的HCV疗法使用α-干扰素和利巴韦林的组合，其在40%的患者中生成持续的效果。最新的临床结果证明，作为单一疗法，PEG化的α-干扰素优于未修饰的α-干扰素。然而，即使就涉及PEG化α-干扰素和利巴韦林组合的实验性治疗方案而言，相当多的患者也没有出现病毒载量的持续减少。因此，就开发用于治疗HCV感染的有效疗法而言，存在明显和未满足的需要。

HCV是正链RNA病毒。基于对所推断氨基酸序列进行的比较和5’-非翻译区的广泛相似性，已经把HCV归类为黄病毒科(Flaviviridae family)中独立的属。黄病毒科的所有成员都具有包封的病毒体(enveloped virion)，其含有的正链RNA基因组通过翻译单一的、连续的、开放可读框而编码所有已知的病毒特异性蛋白质。

在整个HCV基因组的核苷酸和所编码的氨基酸序列中发现了相当程度的异质性。已经表征了至少6种主要的基因型，并且已经描述了多于50种的亚型。HCV的主要基因型在世界范围内的分布是不同的，并且HCV遗传异质性的临床重要性仍然是难以确定的，尽管对基因型对发病和治疗的可能影响行了大量的研究。

单链HCV RNA基因组的长度大约是9500个核苷酸，并且具有单一的开放可读框(ORF)，其编码由大约3000个氨基酸组成的单一的大的多蛋白(polyprotein)。在被感染的细胞中，这种多蛋白在多个位点被细胞蛋白酶和病毒蛋白酶裂解，从而生成结构蛋白和非结构(NS)蛋白。就HCV来说，成熟的非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)的生成受到两种病毒蛋白酶的影响。认为第一种病毒蛋白酶在NS2-NS3接合处进行裂解；第二种病毒蛋白酶是包含在NS3的N-末端区域内的丝氨酸蛋白酶，并且介导NS3下游的所有随后裂解，既在NS3-NS4A裂解位点以顺式进行裂解，又在其余的NS4A-NS4B、NS4B-NS5A、NS5A-NS5B位点以反式进行裂解。NS4A蛋白似乎具有多种功能，其充当NS3蛋白酶的辅因子，并且可能有助于NS3及其它病毒复制酶组分的膜定位。NS3蛋白与NS4A形成复合物，这是在所有位点进行有效多蛋白加工、提高蛋白水解所必需的。NS3蛋白还显示出三磷酸核苷酶和RNA解旋酶活性。NS5B是RNA依赖性的RNA聚合酶，其牵涉在HCV的复制中。

发明内容

本发明提供了抑制NS3蛋白酶的功能(例如，与NS4A蛋白酶组合)的肽化合物。此外，本发明描述了对患者给予联合治疗，其中可有效抑制HCVNS3蛋白酶的本发明的化合物可与一种或两种具有抗HCV活性的额外化合物给药。

在第一方面，本发明提供了式(I)的化合物

或其药用盐，其中

n为1、2或3；

R¹选自羟基和–NHSO₂R⁷；

R²选自氢、烯基、烷基和环烷基；其中所述烯基、烷基和环烷基任选取代有一、二、三或四个卤素；

R³选自烯基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；

R⁴选自-S-R⁸、-S(O)-R⁸和-S(O)₂-R⁸；

R⁵选自氢、烯基、烷氧基烷基、烷氧基羰基烷基、烷基、芳基烷基、羧基烷基、氰基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷氧基烷基、卤代烷基、羟基烷基、(NR^aR^b)烷基和(NR^aR^b)羰基烷基；

R⁶选自氢、烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、烷基磺酰基、环烷基氧基羰基、环烷基、卤代烷氧基羰基、卤代烷基、卤代烷基羰基、(NR^aR^b)羰基和(NR^aR^b)磺酰基；或

R⁶选自苯基和部分不饱和或完全不饱和的五元或六元环基，所述环基任选含有一、二、三或四个选自氮、氧和硫中的杂原子；其中每个环基任选取代有一、二、三或四个独立选自下述的取代基：烷氧基、烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、烷基硫基、羧基、氰基、环烷基、环烷基氧基、卤素、卤代烷基、卤代烷氧基、–NR^gR^h、(NR^jR^k)羰基、(NR^jR^k)磺酰基和氧代基团；

R⁷选自烷基、芳基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和–NR^cR^d；其中所述环烷基任选取代有一个选自烷基、卤素和卤代烷基中的基团；

R⁸选自烷氧基烷基、烷基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、卤代烷氧基烷基和卤代烷基；

R^a和R^b独立选自氢、烷氧基、烷氧基烷基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、卤代烷氧基烷基、卤代烷基、杂环基和杂环基烷基；

R^c和R^d独立选自烷氧基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；或R^c和R^d与它们所连接的氮原子一起形成五元或六元单环杂环基团；

R^g和R^h独立选自氢、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、芳基烷基和卤代烷基；且

R^j和R^k独立选自氢、烷基、芳基、芳基烷基和杂环基；其中所述芳基、芳基烷基中的芳基部分和杂环基任选取代有一个或两个独立选自烷氧基、烷基和卤素中的取代基。

在第一实施方案的第一方面，本发明提供了式(I)的化合物或其药用盐，其中R¹为-NHSO₂R⁷。

在第一实施方案的第二方面，本发明提供了式(I)的化合物或其药用盐，其中

n为1；

R²选自烯基、烷基和环烷基；其中所述烯基、烷基和环烷基任选取代有一、二、三或四个卤素；

R⁴选自-S-R⁸、-S(O)-R⁸和-S(O)₂-R⁸；

R⁵选自烯基、烷基和芳基烷基；

R⁶选自烷氧基羰基、环烷基氧基羰基、卤代烷氧基羰基和(NR^aR^b)羰基；

R⁷为未取代的环烷基；且

R⁸为烷基。

在第一实施方案的第三方面，本发明提供了式(I)的化合物或其药用盐，其中

R¹为-NHSO₂R⁷；

n为1；

R²选自烯基、烷基、环烷基和卤代烷基；

R⁴选自-S-R⁸、-S(O)-R⁸和-S(O)₂-R⁸；

R⁵为烷基；

R⁷为环烷基；且

R⁸为烷基。

在第一实施方案的第四方面，本发明提供了式(I)的化合物或其药用盐，其中

R¹为-NHSO₂R⁷；

n为1；

R²选自烯基、烷基、环烷基和卤代烷基；

R³为芳基；

R⁴选自-S-R⁸、-S(O)-R⁸和-S(O)₂-R⁸；

R⁵为烷基；

R⁷为环烷基；且

R⁸为烷基。

在第二方面，本发明提供了一种组合物，其包含式(I)化合物或其药用盐以及药用载体。在第二方面的第一实施方案中，所述组合物还包含至少一种具有抗HCV活性的额外化合物。在第二方面的第二实施方案中，所述额外化合物中的至少一种为干扰素或利巴韦林。在第二方面的第三实施方案中，所述干扰素选自干扰素α2B、PEG化的(pegylated)干扰素α、复合干扰素(consensus interferon)、干扰素α2A和淋巴细胞样干扰素τ(lymphoblastiodinterferon tau)。

在第二方面的第四实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含式(I)化合物或其药用盐、药用载体以及至少一种具有抗HCV活性的额外化合物；其中所述额外化合物中的至少一种选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、提高1型辅助T细胞应答发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特(Imiqimod)、利巴韦林、5’-单磷酸肌苷脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。

在第二方面的第五实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含式(I)化合物或其药用盐、药用载体以及至少一种具有抗HCV活性的额外化合物；其中所述额外化合物中的至少一种对抑制靶标的功能以治疗HCV感染是有效的，所述靶标选自HCV金属蛋白酶(HCV metalloprotease)、HCV丝氨酸蛋白酶(HCV serine protease)、HCV聚合酶(HCV polymerase)、HCV解螺旋酶(HCV helicase)、HCV NS4B蛋白(HCV NS4B protein)、HCV进入(HCVentry)、HCV组装(HCV assembly)、HCV释出(HCV egress)、HCV NS5A蛋白(HCV NS5A protein)和IMPDH。

在第三方面，本发明提供了治疗患者中HCV感染的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的式(I)的化合物或其药用盐。在第三方面的第一实施方案中，所述方法还包括在给药式(I)的化合物或其药用盐之前、之后或同时给药至少一种具有抗HCV活性的额外化合物。在第三方面的第二实施方案中，所述额外化合物中的至少一种为干扰素或利巴韦林。在第三方面的第三实施方案中，所述干扰素选自干扰素α2B、PEG化的干扰素α、复合干扰素、干扰素α2A和淋巴细胞样干扰素τ。

在第三方面的第四实施方案中，本发明提供了治疗患者中HCV感染的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的式(I)的化合物或其药用盐以及在给药式(I)的化合物或其药用盐之前、之后或同时给药至少一种具有抗HCV活性的额外化合物，其中所述额外化合物中的至少一种选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、提高1型辅助T细胞应答发展的化合物、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特、利巴韦林、5’-单磷酸肌苷脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。

在第三方面的第五实施方案中，本发明提供了治疗患者中HCV感染的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的式(I)的化合物或其药用盐以及在给药式(I)的化合物或其药用盐之前、之后或同时给药至少一种具有抗HCV活性的额外化合物，其中所述额外化合物中的至少一种对抑制靶标的功能以治疗HCV感染是有效的，所述靶标选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCV NS4B蛋白质、HCV进入、HCV组装、HCV释出、HCV NS5A蛋白和IMPDH。

在第四方面，本发明提供了一种组合物，其包含式(I)的化合物或其药用盐，一、二、三、四或五种具有抗HCV活性的额外化合物，以及药用载体。在第四方面的第一实施方案中，所述组合物包含三种或四种具有抗HCV活性的额外化合物。在第四方面的第二实施方案中，所述组合物包含一种或两种具有抗HCV活性的额外化合物。

在第五方面，本发明提供了治疗患者中的HCV感染的方法，其包括向所述患者给药治疗有效量的式(I)的化合物或其药用盐以及在给药式(I)的化合物或其药用盐之前、之后或同时给药一、二、三、四或五种具有抗HCV活性的额外化合物。在第五方面的第一实施方案中，所述方法包括给药三种或四种具有抗HCV活性的额外化合物。在第五方面的第二实施方案中，所述方法包括给药一种或两种具有抗HCV活性的额外化合物。

本发明的其它方面可包括本申请所披露的实施方案的合适组合。

其它方面和实施方案可参见本申请提供的说明书。

本发明的说明书应该被解释为与化学键合的法则和原理一致。在一些情况下，可能需要的是，为了在任何给定的位置适应取代基而除去氢原子。

应该理解的是，本发明所包括的化合物是就用作药物而言适当稳定的那些化合物。

将本说明书中引用的所有专利、专利申请和参考文献完整引入本申请作为参考。在不一致的情况下，以本发明(包括定义)为准。

在本说明书中使用的以下术语具有下面指明的意义：

除非上下文明显指明，本申请使用的单数形式“一个或一种(a)”、“一个或一种(an)”和“所述(the)”包括复数形式。

本申请使用的术语“烯基”是指具有两个至六个碳原子且含有至少一个碳-碳双键的直链或支链基团。

本申请使用的术语“烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分相连的烷基。

本申请使用的术语“烷氧基烷基”是指取代有一个、两个或三个烷氧基的烷基。

本申请使用的术语“烷氧基羰基”是指通过羰基与母体分子部分相连的烷氧基。

本申请使用的术语“烷氧基羰基烷基”是指取代有一个、两个或三个烷氧基羰基的烷基。

本申请使用的术语“烷基”是指从含有一个至十个碳原子的直链或支链的饱和烃衍生的基团。

本申请使用的术语“烷基羰基”是指通过羰基与母体分子部分相连的烷基。

本申请使用的术语“烷基硫基”是指通过硫原子与母体分子部分相连的烷基。

本申请使用的术语“烷基磺酰基”是指通过磺酰基与母体分子部分相连的烷基。

本申请使用的术语“芳基”是指苯基或其中一个或两个环基是苯基的二环稠合环系。二环稠合环系由苯基与四至六元芳族或非芳族碳环稠合而构成。本发明的芳基可通过基团中的任何可取代的碳原子与母体分子部分相连。芳基的代表性实例包括但不限于茚满基、茚基、萘基、苯基和四氢萘基。本发明的芳基任选可任选取代有一、二、三、四或五个取代基，所述取代基独立选自烷氧基、烷氧基羰基、烷基、第二芳基、氰基、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、杂环基、杂环基烷基、羟基、羟基烷基、硝基、-NR^xR^y、(NRxRy)烷氧基、(NRxRy)烷基、(NRxRy)羰基和氧代基团；其中所述第二芳基、杂环基、杂环基烷基的杂环基部分可进一步任选取代有一、二、三、四或五个取代基，所述取代基独立选自烷氧基、烷基、氰基、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、羟基和硝基。

本申请使用的术语“芳基烷基”是指取代有一、二或三个芳基的烷基。

本申请使用的术语“羰基”是指-C(O)-。

本申请使用的术语“羧基”是指-CO₂H。

本申请使用的术语“羧基烷基”是指取代有一、二或三个羧基的烷基。

本申请使用的术语“氰基”是指-CN。

本申请使用的术语“氰基烷基”是指取代有一、二或三个氰基的烷基。

本申请使用的术语“环烷基”是指具有三个至十四个碳原子和0个杂原子的饱和的单环、二环或三环烃环系。环烷基的代表性实例包括但不限于环丙基、环戊基、二环[3.1.1]庚基和金刚烷基。本发明的环烷基可任选取代有一、二、三或四个取代基，所述取代基独立选自烯基、烷氧基、烷氧基烷基、烷基、芳基烷基、芳基羰基、氰基、环烯基、(环烷基)烷基、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基和(NR^jR^k)羰基；其中R^j和R^k独立选自氢、烷基、芳基、芳基烷基和杂环基；其中所述芳基、芳基烷基中的芳基部分和杂环基任选取代有一个或两个独立选自烷氧基、烷基和卤素中的取代基。

本申请使用的术语“(环烷基)烷基”是指被一、二或三个环烷基取代的烷基。

本申请使用的术语“环烷基羰基”是指通过羰基与母体分子部分相连的环烷基。

本申请使用的术语“环烷基氧基”是指通过氧原子与母体分子部分相连的环烷基。

本申请使用的术语“环烷基氧基羰基”是指通过羰基与母体分子部分相连的环烷基氧基。

本申请使用的术语“卤代(halo)”和“卤素(halogen)”是指F、Cl、Br或I。

本申请使用的术语“卤代烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分相连的卤代烷基。

本申请使用的术语“卤代烷氧基烷基”是指取代有一、二或三个卤代烷氧基的烷基。

本申请使用的术语“卤代烷氧基羰基”是指通过羰基与母体分子部分相连的卤代烷氧基。

本申请使用的术语“卤代烷基”是指被一、二、三或四个卤素原子取代的烷基。

本申请使用的术语“卤代烷基羰基”是指通过羰基与母体分子部分相连的卤代烷基。

本申请使用的术语“杂环基”是指含有一、二或三个独立选自氮、氧和硫中的杂原子的五元、六元或七元环。所述五元环具有0至二个双键，以及所述六元环和所述七元环具有0至3个双键。术语“杂环基”还包括二环基团，其中杂环基环与四至六元芳族或非芳族碳环或与另一个单环杂环基稠合。本发明的杂环基可通过所述基团中的碳原子或氮原子与母体分子部分相连。杂环基的实例包括但不限于苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、二氢吲哚基、吲哚基、异噻唑基、异噁唑基、吗啉基、噁唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、吡咯并吡啶基、吡咯基、噻唑基、噻吩基和硫吗啉基。本发明的杂环基任选被一、二、三、四或五个取代基取代，所述取代基独立选自烷氧基、烷氧基羰基、烷基、芳基、氰基、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、第二杂环基、杂环基烷基、羟基、羟基烷基、硝基、-NR^xR^y、(NR^xR^y)烷氧基、(NR^xR^y)烷基、(NR^xR^y)羰基和氧代基团；其中所述芳基、第二杂环基和杂环基烷基中的杂环基部分可进一步任选取代有一、二、三、四或五个取代基取代，所述取代基独立选自烷氧基、烷基、氰基、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、羟基和硝基。

本申请使用的术语“杂环基烷基”是指被一、二或三个杂环基取代的烷基。

本申请使用的术语“羟基”是指-OH。

本申请使用的术语“羟基烷基”是指被一、二或三个羟基取代的烷基。

本申请使用的术语“-NR^aR^b”是指两个基团R^a和R^b通过氮原子与母体分子部分相连。R^a和R^b各自独立选自氢、烷氧基、烷氧基烷基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、卤代烷氧基烷基、卤代烷基、杂环基和杂环基烷基。

本申请使用的术语“(NR^aR^b)烷基”是指取代有一、二或三个–NR^aR^b基团的烷基。

本申请使用的术语“(NR^aR^b)羰基”是指通过羰基与母体分子部分相连的–NR^aR^b。

本申请使用的术语“(NR^aR^b)羰基烷基”是指取代有一、二或三个(NR^aR^b)羰基的烷基。

本申请使用的术语“(NR^aR^b)磺酰基”是指通过磺酰基与母体分子部分相连的–NR^aR^b。

本申请使用的术语“-NR^cR^d”是指两个基团R^c和R^d通过氮原子与母体分子部分相连。R^c和R^d独立选自烷氧基、烷基、芳基、芳基烷基、环烷基、(环烷基)烷基、杂环基和杂环基烷基；或R^c和R^d与它们所连接的氮原子一起形成五元或六元单环杂环基团。

本申请使用的术语“-NR^eR^f”是指两个基团R^e和R^f通过氮原子与母体分子部分相连。R^e和R^f独立选自氢、烷基和芳基烷基；或R^e和R^f与它们所连接的氮原子一起形成五元或六元单环杂环基团，所述杂环基团任选含有一个选自O、NR^x和S的额外杂原子；其中R^x选自氢和烷基；且其中R′选自氢和烷基。

本申请使用的术语“-NR^gR^h”是指两个基团R^g和R^h通过氮原子与母体分子部分相连。R^g和R^h独立选自氢、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、芳基烷基和卤代烷基。

本申请使用的术语“-NR^jR^k”是指两个基团R^j和R^k通过氮原子与母体分子部分相连。R^j和R^k独立选自氢、烷基、芳基、芳基烷基和杂环基；其中所述芳基、芳基烷基中的芳基部分和杂环基任选取代有一个或两个独立选自烷氧基、烷基和卤素中的取代基。

本申请使用的术语“(NR^jR^k)羰基”是指通过羰基与母体分子部分相连的_-NR^jR^k。

本申请使用的术语“(NR^jR^k)磺酰基”是指通过磺酰基与母体分子部分相连的-NR^jR^k。

本申请使用的术语“-NR^xR^y”是指两个基团R^x和R^y通过氮原子与母体分子部分相连。R^x和R^y独立选自氢和烷基。

本申请使用的术语“(NR^xR^y)烷氧基”是指通过氧原子与母体分子部分相连的(NR^xR^y)烷基。

本申请使用的术语“(NR^xR^y)烷基”是指取代有一、二或三个-NR^xR^y基团的烷基。

本申请使用的术语“(NR^xR^y)羰基”是指通过羰基与母体分子部分相连的–NR^xR^y基团。

本申请使用的术语“硝基”是指-NO₂。

本申请使用的术语“氧代”是指=O。

本申请使用的术语“磺酰基”是指-SO₂-。

本发明的化合物可按前药的形式存在。本申请使用的术语“前药”表示经在血液中水解在体内快速转化为母体化合物的化合物。本发明的前药包括在母体分子上的羟基的酯、在母体分子上的羧基的酯以及在母体分子上的胺的酰胺。

本发明的化合物可按药用盐的形式存在。本申请使用的术语“药用盐”表示本发明化合物的盐形式或两性离子形式，这些形式是水溶性或水可分散性的或是油溶性或油可分散性的，这些形式在合理的医药判断范围内适用于与患者的组织接触而不引起过度的毒性、刺激性、变态反应或其它问题或并发症，这与合理的益处/风险比例相称，并且这些形式就其预期的用途而言是有效的。所述盐可在化合物的最终分离和纯化期间制备，或可通过使合适的碱性官能团与合适的酸反应来单独制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、枸橼酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐；二葡糖酸盐(digluconate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、均三甲基苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、萘-2-磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐(palmoate)、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐(pivalate)、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一碳酸盐等。可用于形成药用加成盐的酸的实例包括无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸)以及有机酸(诸如草酸、马来酸、琥珀酸和枸橼酸)。

碱加成盐可在化合物的最终分离和纯化期间如下制备：使酸性基团与合适的碱诸如金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐反应，或使酸性基团与氨、有机伯胺、有机仲胺或有机叔胺反应。药用盐中的阳离子包括锂离子、钠离子、钾离子、钙离子、镁离子和铝离子以及无毒的季胺阳离子诸如铵根离子、四甲基铵根离子、四乙基铵根离子、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己胺、普鲁卡因(procaine)、二苄胺、N,N-二苄基苯乙胺和N,N’-二苄基乙二胺。可用于形成碱加成盐的其它代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪。

本申请使用的术语“抗HCV活性”表示化合物有效地治疗HCV病毒。

术语“本发明的化合物”以及等效表达方式意在包括式(I)的化合物以及其药用对映异构体、非对映异构体和盐。类似地，在上下文允许的情况下，当提及中间体时意在包括其盐。

术语“患者”既包括人类和其它哺乳动物。

术语“药物组合物”表示包含本发明的化合物与至少一种额外药物载体组合的组合物，按照给药方式和剂型的性质，所述药物载体即辅料、赋形剂或媒介物，诸如稀释剂、防腐剂、填充剂、流动调节剂(flow regulating agent)、崩解剂、润湿剂、乳化剂、助悬剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、抗菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂。可使用例如在Remington’s Pharmaceutical Sciences,18^th ed.,Mack Publishing Company,Easton,PA(1999)中列出的组分。

本申请使用的短语“药用”是指这样的化合物、物质、组合物和/或剂型，这些形式在合理的医药判断范围内适用于与患者的组织接触而不引起过度的毒性、刺激性、变态反应或其它问题或并发症，这与合理的益处/风险比例相称。

本申请使用的术语“治疗有效量”是指各种活性组分的总量，所述总量足以显示出有意义的患者益处(例如病毒载量的持续减少)。所述术语当用于单独给药的一种活性成分时是指所述成分的单独量。所述术语当用于组合时是指引起治疗效果的各活性成分的组合量而不论是组合给药、连续给药或同时给药。

术语“治疗”是指：(i)在可能易患疾病、障碍和/或病症但尚未诊断患有所述疾病、障碍和/或病症的患者中预防所述疾病、障碍和/或病症；(ii)抑制所述疾病、障碍和/或病症，即阻止其发展；和/或(iii)减轻所述疾病、障碍和/或病症，即引起所述疾病、障碍和/或病症的消退。

当在本发明化合物的命名中使用时，本申请使用的标记P1’、P1、P2、P2*、P3和P4描绘了相对于天然肽裂解底物而结合的蛋白酶抑制剂结合的氨基酸残基的相对位置。在P1和P1’之间的天然底物发生裂解，在此非初始位置指明氨基酸开始于肽天然裂解位点的C-端且延伸至N-端；然而，初始位置由裂解位点标记的N-端末端出发且延伸至C-端。例如，P1’是指远离裂解位点的C-端的右侧末端的第一位置(即N-端第一位置)；然而P1由C-端裂解位点的左侧开始编号，P2为自C-端的第二位置等(参见Berger,A.等,Transactions of the Royal Society London series,B257:249-264(1970)]。

下图显示了对于本发明化合物的指定。

不对称中心存在于本发明化合物中。例如，化合物可包括下式的P1环丙基单元：

其中C₁和C₂各自表示在环丙基环上的位置1和2的不对称碳原子。

应该理解的是本发明涵盖具有抑制HCV蛋白酶的能力的所有立体化学形式或其混合物。

本发明的某些化合物还可按不同的稳定构象形式存在，这些形式是可分离的。由于围绕不对称单键的受限旋转(例如因为位阻或环张力)而导致的扭转不对称(torsional asymmetry)可使不同的构象异构体得以分离。本发明包括这些化合物的每种构象异构体及其混合物。

本发明的某些化合物还可按两性离子形式存在，且本发明包括这些化合物的每个两性离子形式及其混合物。

当治疗有效量的式(I)的化合物及其药用盐可按化学物质原形式(rawchemical)给药而用于治疗时，其可按药物组合物的形式提供活性成分。因此，本发明还提供了药物组合物，其包含治疗有效量的式(I)的化合物或其药用盐以及一种或多种药用载体、稀释剂或赋形剂。式(I)的化合物及其药用盐如上文所述。载体、稀释剂或赋形剂就与制剂中的其它成分相容而言必须是可接受的，并且就其接受者而言必须是没有害处的。本发明的另一方面还提供了制备药物制剂的方法，其包括将式(I)的化合物或其药用盐与一种或多种药用载体、稀释剂或赋形剂混合。

药物制剂可按单位剂量形式提供，其在每单位剂量中含有预定量的活性成分。本发明化合物的以下剂量水平即约0.01至约250毫克/千克体重(“mg/kg”)/日，优选约0.05至约100mg/kg体重/日在对HCV介导的疾病进行预防和治疗的单一疗法中是典型的。通常，本发明的药物组合物可每日给药约1至约5次，或可选择地，可按连续输注的形式给药。上述给药可用作慢性疗法或急性疗法。可与载体物质组合以制备单一剂型的活性成分的量将基于以下因素而变化：所治疗的病症、所述病症的严重程度、给药时间、给药途径、所用化合物的排泄速率、治疗的持续时间以及患者的年龄、性别、体重和状态。优选的单位剂量制剂是这样的单位剂量制剂，所述制剂含有本申请上文所述的日剂量或亚日剂量或其适当分数的活性成分。一般而言，治疗开始于基本上小于化合物最佳剂量的小剂量。此后，剂量以小的增幅增加，直到实现对病情的最佳效果。一般而言，化合物以如下的浓度水平给药是最期望的，所述水平通常可提供有效的抗病毒结果而不引起任何有害或有毒的副作用。

当本发明的组合物包含本发明的化合物和一种或多种额外的治疗药物或预防药物的组合时，所述化合物和所述额外的药物通常都以如下的剂量水平存在，所述剂量水平为单一疗法给药方案中所通常给药的剂量的约10至150%，更优选为约10至80%。

药物制剂可适用于以任何适当的途径来给药，所述途径为例如口服(包括口腔或舌下)途径、直肠途径、经鼻途径、局部(包括口腔、舌下或透皮)途径、阴道途径或肠胃外(包括皮下注射或输注、皮内注射或输注、肌内注射或输注、关节内注射或输注、滑膜内注射或输注、胸骨内注射或输注、鞘内注射或输注、病灶内注射或输注、静脉内注射或输注或皮内注射或输注)途径。所述制剂可通过药学领域已知的任何方法来制备，所述方法为例如将活性成分与载体或赋形剂混合。

适用于口服给药的药物制剂可按以下形式提供：离散的单位形式(诸如胶囊剂或片剂)；粉末剂或颗粒剂；在含水或不含水液体中的溶液剂或混悬剂；可食用的泡沫剂(foam)或搅打剂(whip)；或水包油型液态乳剂或油包水型乳剂。

例如，就以片剂或胶囊剂形式进行的口服给药而言，可将活性药物组分与口服的无毒的药用惰性载体诸如乙醇、甘油、水等混合。粉末剂如下制备：将化合物研磨至合适的微细尺寸，然后与经类似研磨的药物载体诸如可食用的碳水化合物(例如淀粉或甘露醇)混合。矫味剂、防腐剂、分散剂和着色剂也可存在。

胶囊剂如下制备：如上所述制备粉末混合物，然后填充到成形的明胶壳中。可将助流剂和润滑剂诸如胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇加到粉末混合物中，然后进行填充操作。也可加入崩解剂或增溶剂诸如琼脂、碳酸钙或碳酸钠以改善胶囊剂被摄入时的药物利用度。

此外，当期望或需要时，也可将合适的粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂掺到混合物中。合适的粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖(诸如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味剂、天然胶和合成胶(诸如阿拉伯胶、西黄蓍胶或海藻酸钠)、羧甲基纤维素、聚乙二醇等。在这些剂型中使用的润滑剂包括油酸钠、氯化钠等。崩解剂包括但不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。片剂如下配制：例如制备粉末混合物，制粒或预压，加入润滑剂和崩解剂，然后压制成片剂。粉末混合物如下制备：将经合适研磨的化合物与上述稀释剂或基质以及任选的粘合剂(诸如羧甲基纤维素、海藻酸盐、凝胶或聚乙烯吡咯烷酮)、溶液延迟剂(solution retardant)(诸如石蜡)、吸收促进剂(诸如季胺盐)和/或吸收剂(诸如膨润土、高岭土或磷酸二钙)混合。粉末混合物可与粘合剂诸如糖浆、淀粉糊、阿拉伯胶液、纤维素溶液或聚合物溶液一起湿法制粒，然后挤压过筛。作为可选择的制粒方法，粉末混合物可通过压片机来处理，结果是不完全成形的预压片破裂成颗粒。可通过加入硬脂酸、硬脂酸盐、滑石或矿物油来对颗粒进行润滑以防止与片剂成形模粘连。然后将经润滑的混合物压制成片剂。本发明的化合物也可与自由流动的惰性载体组合，并在不经历制粒或预压步骤的情况下直接压制成片剂。可提供透明的或不透明的保护性包衣，所述包衣由以下包衣层构成：由虫胶形成的隔离包衣层、由糖或聚合物形成的包衣层和由蜡形成的光亮包衣层。可将染料加到这些包衣中以区分不同的单位剂量。

口服流体诸如溶液剂、糖浆剂和酏剂可按剂量单位形式来制备，从而使给定的量含有预定量的化合物。糖浆剂可通过将化合物溶于经合适矫味的水溶液中来制备，而酏剂通过使用无毒的媒介物来制备。也可加入增溶剂和乳化剂(诸如乙氧基化的异硬脂醇和聚氧乙烯山梨醇醚)、防腐剂、矫味添加剂(诸如薄荷油、天然甜味剂、糖精或其它人造甜味剂)等。

当适当时，可对用于口服给药的剂量单位制剂进行微囊化。也可例如通过将颗粒物质用聚合物、蜡等包衣或包埋到聚合物、蜡等中来制备制剂以延长或维持释放。

式(I)的化合物及其药用盐也可按脂质体递送系统的形式给药，所述脂质体递送系统诸如小单层脂囊(small unilamellar vesicle)、大单层脂囊(largeunilamellar vesicle)和多层脂囊(multilamellar vesicle)。脂质体可由各种磷脂诸如胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱来形成。

式(I)的化合物及其药用盐也可通过使用单克隆抗体作为与化合物分子偶联的单独载体来递送。化合物也可与作为靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。这些聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺苯酚(polyhydroxypropylmethacrylamidephenol)、聚羟基乙基天冬氨酰胺苯酚(polyhydroxyethyl aspartamidephenol)或取代有棕榈酰基的聚氧化乙烯聚赖氨酸(polyethyleneoxidepolylysine substituted with palitoyl residue)。此外，化合物可与可用于实现药物的控制释放的一类生物可降解的聚合物偶联，这类聚合物为例如聚乳酸、聚ξ-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联共聚物或水凝胶的两亲性嵌段共聚物。

适用于透皮给药的药物制剂可按离散的贴剂形式存在，其意在与接受者的表皮紧密接触且保持延长的时段。例如，如Pharm.Res.,3(6):318(1986)中所一般描述，活性成分可通过离子电渗法(iontophoresis)从贴剂中递送。

可将适用于局部给药的药物制剂配制成软膏剂、乳膏剂、混悬剂、洗液、粉末剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。

就治疗眼部或其它外部组织例如口和皮肤而言，制剂优选以软膏剂或乳膏剂的形式施用。当配制成软膏剂时，活性成分可与石蜡或水可混溶性软膏剂基质一起使用。可选择地，可将活性成分与水包油型乳膏剂基质或油包水型基质一起配制成乳膏剂。

适用于局部给药至眼部的药物制剂包括滴眼剂，其中将活性成分溶于或悬浮于合适的载体尤其是含水溶剂中。

进行调整以适于在口中局部给药的药物制剂包括锭剂、含锭剂(pastille)和口腔洗剂。

适用于直肠给药的药物制剂可按栓剂或灌肠剂的形式提供。

适用于鼻部给药的药物制剂(其中载体为固体)包括粒度范围为例如20至500微米的一系列粉末，其按照吸入的方式来给药，即从接近鼻的装有粉末的容器中经由鼻道而快速吸入。用于以鼻喷雾剂或滴鼻剂的形式给药的合适制剂(其中载体为液体)包括活性成分的含水溶液或油溶液。

适用于吸入给药的药物制剂包括微细颗粒的粉尘或气雾，其可通过各种类型的计量剂量的加压的气雾器、喷雾器或吸入器来生成。

适用于阴道给药的药物制剂可按阴道栓剂、棉塞剂、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂的形式提供。

适用于肠胃外给药的药物制剂包括：含水和不含水的无菌注射溶液剂，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与所预期接受者的血液等渗的溶质；以及含水和不含水的无菌混悬剂，其可包含助悬剂和增稠剂。所述制剂可存在于单位剂量容器或多剂量容器例如密封的安瓿和小瓶中，并可在冷冻干燥的(冻干的)状态下贮存，其恰恰在使用前仅需要加入无菌液态载体例如注射用水。现用现配的注射溶液剂和混悬剂可从无菌粉末、颗粒或片剂来制备。

应该理解的是，除了上文具体提及的成分之外，在已考虑到所涉及制剂的类型的情况下，所述制剂还可包括本领域中的其它常规物质，例如适于口服给药的那些制剂可包括矫味剂。

下表1列出了可与本发明的化合物一起给药的化合物的一些示例性实例。本发明的化合物可在联合治疗中与其它具有抗HCV活性的化合物同时给药或分开给药，或通过将各化合物组合成组合物来给药。

图1

本发明的化合物也可用作实验室试剂。所述化合物在提供以下研究工具中是有帮助的，这些研究工具用于设计病毒复制测定、验证动物测定系统和进行结构生物学研究以进一步提高对HCV疾病机理的认识。此外，本发明的化合物可例如通过竞争性抑制作用而用于建立或确定其它抗病毒化合物的结合位点。

本发明的化合物也可用于处理或预防物质的病毒污染，因此降低了与这些物质(例如血液、组织、手术器械和手术外衣、实验室仪器和实验室外衣以及血液采集装置和物质或输血装置和物质)发生接触的实验室人员或医务人员或患者感染病毒的风险。

当具有式(I)的化合物通过合成性过程或通过代谢性过程(包括发生在人类或动物体内(在体内)的那些代谢性过程或发生在体外的过程)来制备时，本发明旨在包括具有式(I)的化合物。

在本申请中(尤其包括在以下示例性方案和实施例中)使用的缩写是本领域技术人员公知的。所使用的一些缩写如下：CDI表示1,1′-羰基二咪唑；THF表示四氢呋喃；DBU表示1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯；TFA表示三氟乙酸；HATU表示O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基

磷酸盐；PyBOP表示苯并三唑-1-基-氧基-三-吡咯烷子基-鏻六氟磷酸盐；MeI表示甲基碘；Boc或BOC表示叔丁氧基羰基；OtBu表示叔丁氧基；TBME表示叔丁基甲醚；Et₃N表示三乙胺；DMSO表示二甲基亚砜；OAc表示乙酸盐；DPPA表示二苯基磷酰基叠氮化物；Me表示甲基；TBAF表示氟化四丁铵；DMAP表示4-N,N-二甲基氨基吡啶；tBuLi表示叔丁基锂；LiHMDS表示六甲基二硅叠氮化锂(lithium hexamethyl disilazide)；Tle表示叔丁基亮氨酸，也表示叔丁基甘氨酸；4-BiphMgBr表示4-联苯溴化镁；DCM表示二氯甲烷；MeO表示甲氧基；EDAC或EDC表示1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；和HOBt表示1-羟基苯并三唑。

用于合成本发明化合物的起始物质在本领域的技术人员中已知且可容易地制备或可商购得到。

提供如下阐述的下述方法以用于示例说明的目的且不意在限制权利要求的范围。将认识到制备所述化合物是必要的，其中使用常规保护基团对官能团进行保护然后除去该保护基团以提供本发明的化合物。关于本发明的保护基团的使用的详细内容对本领域的技术人员是已知的。

具体实施方式

实施例

现结合某些实施方案来描述本发明，所述实施方案不是旨在限制本发明的范围。相反地，本发明涵盖可包括在权利要求书的范围内的所有可选择形式、变化形式和等价形式。由此，以下实施例(包括具体的实施方案)将阐述本发明的一种实践，应该理解的是，所述实施例出于阐述某些实施方案的目的，并且提供这些实施例就是提供被相信是最有用的并且是有关本发明操作和概念方面的容易理解的描述。

除非另作说明，溶解百分数表示重量对体积的关系，且溶解比率表示体积与体积的关系。在Bruker300、400或500MHz光谱仪上记录核磁共振(NMR)光谱；化学位移(δ)以百万分率记录。根据Still快速色谱法技术(J.Org.Chem.,43:2923(1978))，快速色谱法在硅胶柱(SiO₂)上进行。

可使用在本申请实施例中所述的中间体以合成式1的化合物。

实施例1

P1′中间体的制备

1.环丙基磺酰胺的制备

方法1：

步骤1

将叔丁胺(3.0mol,315mL)在THF(2.5L)中溶解。将溶液冷却至-20℃。缓慢加入3-氯丙磺酰氯(1.5mol,182mL)。将反应混合物温热至室温并搅拌24小时。将混合物过滤并将滤液真空浓缩。将残留物在CH₂Cl₂(2.0L)中溶解。将所得的溶液用1.0M HCl(1.0L)、水(1.0L)和盐水(1.0L)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤，并真空浓缩，得到了微黄色固体，将其由己烷结晶，得到了产物，其为白色固体(316.0g,99%)。¹H NMR(CDCl₃)δ1.38(s,9H),2.30-2.27(m,2H),3.22(t,J=7.35Hz,2H),3.68(t,J=6.2Hz,2H),4.35(b,1H)。

步骤2

在-78℃向步骤1的产物(2.14g,10.0mmol)在THF(100mL)中的溶液中加入n-BuLi(2.5M的己烷溶液,8.0mL,20.0mmol)。历时1小时将反应混合物温热至室温并真空浓缩。将残留物在乙酸乙酯和水(各200mL)之间分配。将分离的有机相用盐水洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤，并真空浓缩。将残留物由己烷重结晶，得到了预期产物，其为白色固体(1.0g,56%)。¹H NMR(CDCl₃)δ0.98-1.00(m,2H),1.18-1.19(m,2H),1.39(s,9H),2.48-2.51(m,1H),4.19(b,1H)。

步骤3

将步骤2的产物(110g,0.62mmol)在TFA(500mL)中的溶液在室温搅拌16小时。真空除去挥发物。将残留物由乙酸乙酯/己烷(60mL/240mL)重结晶，得到了预期产物，其为白色固体(68.5g,91%)。¹H NMR(DMSO-d₆)δ0.84-0.88(m,2H),0.95-0.98(m,2H),2.41-2.58(m,1H),6.56(b,2H)。

方法2：

向冷却至0℃的100mL THF溶液，鼓泡气体氨，直到达到饱和。向该溶液中加入5g(28.45mmol)环丙基磺酰氯(购自Array Biopharma)在50mLTHF中的溶液。将溶液温热至室温，保持过夜并再搅拌一天。将混合物浓缩直到残留有1-2mL溶剂并将其倒入在30g SiO₂填料(用30%至60%的乙酸乙酯/己烷洗脱)上，得到了3.45g(100%)环丙基磺酰胺，其为白色固体。¹HNMR(甲醇-d₄)δ0.94-1.07(m,4H),2.52-2.60(m,1H)；¹³C NMR(甲醇-d₄)δ5.92,33.01。

2.C1取代的环丙基磺酰胺的制备

2a.N-叔丁基-(1-甲基)环丙基-磺酰胺的制备

步骤1：N-叔丁基-(3-氯)丙基磺酰胺的制备

如上所述制备。

步骤2：N-叔丁基-(1-甲基)环丙基-磺酰胺的制备

将步骤1的产物(4.3g,20mmol)在无水THF(100mL)中溶解并冷却至-78℃。向该溶液中缓慢加入正丁基锂(17.6mL,44mmol,2.5M的己烷溶液)。移除干冰浴并历时1.5小时将反应混合物温热至室温。将该混合物冷却至-78℃并加入正丁基锂(20mmol,8mL,2.5M的己烷溶液)的溶液。将反应混合物温热至室温，历时2小时冷却至-78℃，并用甲基碘(5.68g,40mmol)的纯溶液处理。将反应混合物温热至室温，保持过夜，然后在室温用饱和NH₄Cl(100mL)淬灭并用乙酸乙酯(100mL)萃取。将有机相用盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，并真空浓缩，得到了黄色油状物，将其由己烷结晶，得到了预期产物，其为微黄色固体(3.1g,81%)。¹H NMR(CDCl₃)δ0.79(m,2H),1.36(s,9H),1.52(m,2H),1.62(s,3H),4.10(宽单峰,1H)。

步骤3：1-甲基环丙基磺酰胺的制备

将步骤2的产物(1.91g,10mmol)在TFA(30mL)中溶解，并将反应混合物在室温搅拌16小时。真空除去溶剂，得到了黄色油状物，将其由乙酸乙酯/己烷(1:4,40mL)结晶，得到了预期产物，其为白色固体(1.25g,96%)。¹HNMR(CDCl₃)δ0.84(m,2H),1.41(m,2H),1.58(s,3H),4.65(宽单峰,2H)。对于C₄H₉NO₂S的分析计算值：C,35.54；H,6.71；N,10.36。实测值：C,35.67；H,6.80；N,10.40。

2b.1-丙基环丙基磺酰胺的制备

该化合物使用制备1-甲基环丙基磺酰胺所述的操作制备，在该方法的第二步中用卤代丙烷代替甲基碘。

2c.1-烯丙基环丙基磺酰胺的制备

步骤1：N-叔丁基-(1-烯丙基)环丙基磺酰胺的制备

该化合物根据在合成N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺中所述的操作使用1.25当量的烯丙基溴作为亲电子试剂获得，收率为97%。该化合物没有需进一步纯化就用在下一步反应中。¹H NMR(CDCl₃)δ0.83(m,2H),1.34(s,9H),1.37(m,2H),2.64(d,J=7.3Hz,2H),4.25(宽单峰,1H),5.07-5.10(m,2H),6.70-6.85(m,1H)。

步骤2：1-烯丙基环丙基磺酰胺的制备

该化合物根据在合成1-甲基环丙基磺酰胺中所述的操作由步骤1的产物获得，收率为40%。该化合物经硅胶柱色谱法使用2%甲醇在二氯甲烷中的溶液作为洗脱剂纯化。¹H NMR(CDCl₃)δ0.88(m,2H),1.37(m,2H),2.66(d,J=7.0Hz,2H),4.80(s,2H),5.16(m,2H),5.82(m,1H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ11.2,35.6,40.7,119.0,133.6。

2d.1-苄基环丙基磺酰胺的制备

步骤1：N-叔丁基-(1-苄基)环丙基-磺酰胺的制备

该化合物使用在合成N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺中所述的操作(除了使用1.05当量的苄基溴之外)接着用10%乙酸乙酯在己烷中的溶液研磨获得，收率为60%。¹H NMR(CDCl₃)δ0.92(m,2H),1.36(m,2H),1.43(s,9H),3.25(s,2H),4.62(宽单峰,1H),7.29-7.36(m,5H)。

步骤2：1-苄基环丙基磺酰胺的制备

该化合物由N-叔丁基-(1-苄基)环丙基磺酰胺使用合成1-甲基环丙基磺酰胺所述的操作接着由最少量的10%乙酸乙酯在己烷中的溶液重结晶获得，收率为66%。¹H NMR(CDCl₃)δ0.90(m,2H),1.42(m,2H),3.25(s,2H),4.05(s,2H),7.29(m,3H),7.34(m,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ11.1,36.8,41.9,127.4,128.8,129.9,136.5。

2e.1-(1-环己烯基)环丙基-磺酰胺的制备

步骤1：N-叔丁基-[1-(1-羟基)环己基]-环丙基磺酰胺的制备

该化合物使用合成N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺所述的操作(除了使用1.30当量的环己酮之外)接着由最少量的20%乙酸乙酯在己烷中的溶液重结晶获得，收率为84%。¹H NMR(CDCl₃)δ1.05(m,4H),1.26(m,2H),1.37(s,9H),1.57-1.59(m,6H),1.97(m,2H),2.87(宽单峰,1H),4.55(宽单峰,1H)。

步骤2：1-(1-环己烯基)环丙基-磺酰胺的制备

该化合物1-(1-环己烯基)-环丙基磺酰胺由N-叔丁基-[1-(1-羟基)环己基]-环丙基磺酰胺使用合成1-甲基环丙基磺酰胺所述的操作接着由最少量的乙酸乙酯和己烷重结晶获得，收率为85%。¹H NMR(DMSO-d₆)δ0.82(m,2H),1.28(m,2H),1.51(m,2H),1.55(m,2H),2.01(s,2H),2.16(s,2H),5.89(s,1H),6.46(s,2H)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ11.6,21.5,22.3,25.0,27.2,46.9,131.6,132.2；LR-MS(ESI):200(M⁺-1)。

2f.1-苯甲酰基环丙基磺酰胺的制备

步骤1：N-叔丁基-(1-苯甲酰基)环丙基-磺酰胺的制备

该化合物使用合成N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺所述的操作(除了使用1.2当量的苯甲酸甲酯作为亲电子试剂之外)获得，收率为66%。该化合物经硅胶柱色谱法使用30%至100%二氯甲烷在己烷中的溶液纯化。¹H NMR(CDCl₃)δ1.31(s,9H),1.52(m,2H),1.81(m,2H),4.16(宽单峰,1H),7.46(m,2H),7.57(m,1H),8.05(d,J=8.5Hz,2H)。

步骤2：1-苯甲酰基环丙基磺酰胺的制备

该化合物由N-叔丁基-(1-苯甲酰基)环丙基磺酰胺使用合成1-甲基环丙基磺酰胺所述的操作接着由最少量的乙酸乙酯在己烷中的溶液重结晶获得，收率为87%。¹H NMR(DMSO-d₆)δ1.39(m,2H),1.61(m,2H),7.22(s,2H),7.53(t,J=7.6Hz,2H),7.65(t,J=7.6Hz,1H),8.06(d,J=8.2Hz,2H)；¹³C NMR(DMSO-d₆)δ12.3,48.4,128.1,130.0,133.4,135.3,192.0。

2g.N-叔丁基-(1-苯基氨基羰基)-环丙基磺酰胺的制备

该化合物使用合成N-叔丁基-(1-甲基)环丙基磺酰胺所述的操作使用1当量的异氰酸苯酯接着由最少量的乙酸乙酯在己烷中的溶液重结晶获得，收率为42%。¹H NMR(CDCl₃)δ1.38(s,9H),1.67-1.71(m,4H),4.30(宽单峰,1H),7.10(t,J=7.5Hz,1H),7.34(t,J=7.5Hz,2H),7.53(t,J=7.5Hz,2H)。

3.C1-取代的环丙基磺酰胺的制备：使用N-Boc保护基团。

3a.在制备C1-取代的环丙基磺酰胺中的关键中间体，N-(环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯的制备

步骤1：3-氯丙基磺酰胺的制备

将3-氯丙磺酰氯(55g,310.7mmol)在THF(200mL)中溶解并历时30分钟在0℃逐滴加至NH₄OH(200mL)中。将反应混合物温热至室温，搅拌1小时，并将水层用二氯甲烷(4x500mL)萃取。将合并的萃取物用1N HCl(150mL)、水(150mL)洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩。将粗固体由最少量的二氯甲烷在己烷中的溶液重结晶，得到了预期产物，其为白色固体(45.3g,93%)。¹H NMR(CDCl₃)δ2.34(m,2H),3.32(t,J=7.3Hz,2H),3.70(t,J=6.2Hz,2H),4.83(s,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ27.10,42.63,52.57。

步骤2：N-(3-氯丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯的制备

历时30分钟在0℃将步骤1的产物(30.2g,191.5mmol)、三乙胺(30.2mL,217.0mmol)和4-DMAP(2.40g,19.6mmol)在二氯甲烷(350mL)中的溶液用一缩二碳酸二叔丁酯(47.2g,216.9mmol)在二氯甲烷(250mL)中的溶液逐滴处理。将反应混合物温热至室温，再搅拌3小时，并用1N HCl(300mL)、水(300mL)和盐水(300mL)洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩，得到了粗产物。将该物质用70mL5%二氯甲烷在己烷中的溶液研磨，得到了预期产物，其为灰白色固体(47.2g,96%)。¹H NMR(CDCl₃)δ1.51(s,9H),2.33(m,2H),3.60(t,J=7.3Hz,2H),3.68(t,J=6.21Hz,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ26.50,27.95,42.37,50.40,84.76,149.53。

步骤3：N-(环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯的制备

将正丁基锂(74.7mL,119.5mmol,1.6M的己烷溶液)在无水THF(105mL)中溶解并在氩气气氛下冷却至-78℃。历时20-30分钟向该溶液中逐滴加入步骤2的产物(14g,54.3mmol)在无水THF(105mL)中的溶液。移除干冰浴并历时2小时将反应混合物温热至室温。将反应混合物用冰醋酸(3.4mL)淬灭，真空浓缩，并在二氯甲烷(100mL)和水(100mL)之间分配。将有机相用盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，并真空浓缩，得到了预期产物，其为蜡状灰白色固体(12.08g,100%)。¹H NMR(CDCl₃)δ1.10(m,2H),1.34(m,2H),1.50(s,9H),2.88(m,1H),7.43(s,1H).¹³C NMR(CDCl₃)δ6.21,28.00,31.13,84.07,149.82。

3b.1-甲氧基-甲基环丙基-磺酰胺的制备

步骤1：N-(1-甲氧基甲基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯的制备

向冷却至-78℃的N-(环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯(1.0g,4.5mmol)在THF(30mL)中的溶液中加入正丁基锂(6.4mL,10.2mmol,1.6M的己烷溶液)并将反应混合物搅拌1小时。向该溶液中加入氯甲基甲醚(0.40mL,5.24mmol)的纯溶液，并将混合物缓慢温热至室温，保持过夜。使用1N HCl使溶液将溶液pH调节至3然后用乙酸乙酯(4x50mL部分)萃取。将合并的萃取物干燥(MgSO₄)，过滤，并浓缩，得到了N-(1-甲氧基甲基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯，其为蜡状固体(1.20g,100%)，其没有进一步纯化即可直接进行下一步反应。¹H NMR(CDCl₃)δ1.03(m,2H),1.52(s,9H),1.66(m,2H),3.38(s,3H),3.68(s,2H),7.54(s,1H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ11.37,28.29,40.38,58.94,73.43,83.61,149.57。

步骤2：1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺的制备

将N-(1-甲氧基甲基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯(1.14g,4.30mmol)在50%TFA/二氯甲烷(30mL)的溶液中溶解并在室温搅拌16小时。真空除去溶剂并将残留物在80g SiO₂上经色谱法纯化(用0%至60%乙酸乙酯/己烷洗脱)，得到了1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺，其为白色固体(0.55g,77%总计两步反应)。¹H NMR(CDCl₃)δ0.95(m,2H),1.44(m,2H),3.36(s,3H),3.65(s,2H),4.85(s,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ11.17,40.87,59.23,74.80；LRMS m/z183(M⁺+NH₄)。

3c.1-环丙基甲基环丙基磺酰胺的制备

步骤1：N-(1-环丙基甲基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯的制备

N-(1-环丙基甲基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯根据在合成N-(1-甲氧基甲基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯中所述的操作(除了使用1.10当量的环丙基甲基溴作为亲电子试剂之外)获得，收率为92%。化合物无需纯化即可直接进行下一步反应。¹H NMR(CDCl₃)δ0.10(m,2H),0.51(m,2H),0.67(m,1H),1.10(m,2H),1.49(s,9H),1.62(m,2H),1.87(d,J=7.0Hz,2H)。

步骤2：1-环丙基甲基-环丙基磺酰胺的制备

该化合物由N-(1-环丙基甲基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯根据在合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺中所述的操作获得，收率为65%。该化合物使用0%至60%乙酸乙酯在己烷中的溶液作为洗脱剂经硅胶柱色谱法纯化。¹HNMR(CDCl₃)δ0.15(m,2H),0.51(m,2H),1.01(m,2H),1.34(m,3H),1.86(d,J=7.0Hz,2H),4.83(s,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ4.65,7.74,11.26,35.62,41.21；LRMS m/z193(M⁺+NH₄)。

3d.1-丙基氨基甲酰基环丙基-磺酰胺的制备

步骤1：N-(1-丙基氨基甲酰基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯的制备

该化合物根据合成N-(1-甲氧基甲基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯所述的操作(除了使用1.10当量的异氰酸正丙酯作为亲电子试剂之外)获得，粗制的收率为100%。化合物无需纯化即可直接进行下一步反应。¹H NMR(CDCl₃)δ0.10(m,2H),0.51(m,2H),0.67(m,1H),1.10(m,2H),1.49(s,9H),1.62(m,2H),1.87(d,J=7.0Hz,2H)。

步骤2：1-丙基氨基甲酰基环丙基-磺酰胺的制备

该化合物由N-(1-丙基氨基甲酰基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯根据合成1-甲氧基甲基环丙基磺酰胺所述的操作(除了不使用色谱法纯化之外，因为将物质由最少量的二氯甲烷/己烷重结晶)获得，收率为50%。¹H NMR(CDCl₃)δ0.15(m,2H),0.51(m,2H),1.01(m,2H),1.34(m,3H),1.86(d,J=7.0Hz,2H),4.83(s,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ4.65,7.74,11.26,35.62,41.21；LRMS m/z193(M⁺+NH₄)。

3e.1-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)氨基甲酰基环丙基磺酰胺的制备

步骤1：N-(1-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)氨基甲酰基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯的制备

该化合物根据合成N-(1-甲氧基甲基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯所述的操作(除了使用1.20当量的异噁唑-4-异氰酸3,5-二甲酯作为亲电子试剂)获得，粗制的收率为100%。该化合物无需纯化即可直接进行下一步反应。

步骤2：1-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)氨基甲酰基环丙基磺酰胺的制备

该化合物由1.62g(4.52mmol)N-(1-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)氨基甲酰基环丙基磺酰基)氨基甲酸叔丁酯使用30mL(120mmol)4N HCl/二噁烷、搅拌过夜、浓缩并在

40M柱经色谱法纯化(用0%至5%甲醇/二氯甲烷洗脱)以50%的收率(580m_g)获得。¹H NMR(甲醇-d₄)δ1.57(m,2H),1.61(m2H),2.15(s,3H),2.30(s,3H),4.84(s,3H)；¹³C NMR(甲醇-d₄)δ9.65,10.94,15.01,46.11,114.82,159.45,165.55,168.15；LRMS m/z260(M⁺+H)。

4.由环烷基溴制备环烷基磺酰胺

4a.由环丁基溴制备环丁基磺酰胺

向冷却至-78℃的5.0g(37.0mmol)环丁基溴在30mL无水乙醚中的溶液中加入44mL(74.8mmol)1.7M叔丁基锂在戊烷中的溶液。历时1.5小时将溶液缓慢温热至-35℃。使该混合物经导管缓慢进入冷却至-40℃的5.0g(37.0mmol)新鲜蒸馏的磺酰氯在100mL己烷中的溶液中，历时1小时温热至0℃并小心地真空浓缩。将该混合物重新溶解在乙醚中，用一些冰冷的水洗涤一次，干燥(MgSO₄)，过滤，并小心地浓缩。将该混合物重新溶解在20mL THF中，逐滴加至500mL饱和NH₃在THF中的溶液中，并搅拌过夜。将混合物真空浓缩为粗制的黄色固体并由最少量的二氯甲烷在己烷中的溶液与1-2滴甲醇重结晶，得到了1.90g(38%)预期产物，其为白色固体。¹HNMR(CDCl₃)δ1.95-2.06(m,2H),2.30-2.54(m,4H),3.86(p,J=8Hz,1H),4.75(宽单峰,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ16.43,23.93,56.29.HRMS m/z(M-H)^-对于C₄H₈NSO₂的计算值：134.0276，实测值：134.0282。

4b.环戊基磺酰胺的制备

将18.5mL(37.0mmol)2M环戊基氯化镁在乙醚中的溶液逐滴加至冷却至-78℃的3.0mL(37.0mmol)新鲜蒸馏的磺酰氯(由Aldrich得到)在100mL己烷中的溶液中。历时1小时将混合物温热至0℃然后小心地真空浓缩。将该混合物重新溶解在乙醚(200mL)中，用一些冰冷的水(200mL)洗涤一次，干燥(MgSO₄)，过滤，并小心地浓缩。将该混合物重新溶解在35mL THF中，逐滴加至500mL饱和NH₃在THF中的溶液中并搅拌过夜。将混合物真空浓缩为粗制的黄色固体，将残留物经50g硅胶过滤(使用70%乙酸乙酯-己烷作为洗脱剂)然后将溶液浓缩。将残留物由最少量的二氯甲烷在己烷中的溶液与1-2滴甲醇重结晶，得到了2.49g(41%)预期产物，其为白色固体。¹H NMR(CDCl₃)δ1.58-1.72(m,2H),1.74-1.88(m,2H),1.94-2.14(m,4H),3.48-3.59(m,1H),4.80(宽单峰,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ25.90,28.33,63.54；MS m/e148(M-H)^-。

4c.环己基磺酰胺的制备

将18.5mL(37.0mmol)2M环己基氯化镁(TCI Americas)在乙醚中的溶液逐滴加至冷却至-78℃的3.0mL(37.0mmol)新鲜蒸馏的磺酰氯在100mL己烷中的溶液中。历时1小时将混合物温热至0℃然后小心地真空浓缩。将该混合物重新溶解在乙醚(200mL)中，用一些冰冷的水(200mL)洗涤一次，干燥(MgSO₄)，过滤，并小心地浓缩。将该混合物重新溶解在35mL THF中，逐滴加至500mL饱和NH₃在THF中的溶液中并搅拌过夜。将混合物真空浓缩为粗制的黄色固体，将残留物经50g硅胶过滤(使用70%乙酸乙酯-己烷作为洗脱剂)并浓缩。将浓缩物由最少量的二氯甲烷在己烷中的溶液与1-2滴甲醇重结晶，得到了1.66g(30%)预期产物，其为白色固体。¹H NMR(CDCl₃)δ1.11-1.37(m,3H),1.43-1.56(m,2H),1.67-1.76(m,1H),1.86-1.96(m,2H),2.18-2.28(m,2H),2.91(tt,J=12,3.5Hz,1H),4.70(宽单峰,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ25.04,25.04,26.56,62.74；MS m/e162(M-1)^-。

4d.新戊基磺酰胺的制备

按照制备环己基磺酰胺的操作，将49mL(37mmol)0.75M新戊基氯化镁(Alfa)在乙醚中的溶液转化为1.52g(27%)预期产物，其为白色固体。¹HNMR(CDCl₃)δ1.17(s,9H),3.12(s,2H),4.74(宽单峰,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ29.46,31.51,67.38；MS m/e150(M-1)^-。

4e.环丁基甲基磺酰胺的制备

将12.3g(83mmol)环丁基甲基溴(Aldrich)和13.7g(91mmol)碘化钠在150mL丙酮中的溶液加热回流过夜然后冷却至室温。将无机固体经过滤除去并将丙酮和环丙基甲基碘(8.41g,46%)经蒸馏除去(分别为环境温度和150托，80℃)。

使冷却至-78℃的4.0g(21.98mmol)环丁基甲基碘在30mL无水乙醚中的溶液经导管进入17mL(21.98mmol)1.3M仲丁基锂在环己烷中的溶液中并将溶液搅拌5分钟。经导管向该混合物中加入冷却至-78℃的3.0g(21.98mmol)新鲜蒸馏的磺酰氯在110mL己烷中的溶液。历时1小时将混合物温热至室温然后小心地真空浓缩。将该混合物重新溶解在乙醚中，用一些冰冷的水洗涤一次，干燥(MgSO₄)，过滤，并小心地浓缩。将该混合物重新溶解在30mL THF中，逐滴加至500mL饱和NH₃在THF中的溶液中并搅拌过夜。将混合物真空浓缩为粗制的黄色固体并由最少量的二氯甲烷在己烷中的溶液与1-2滴甲醇重结晶，得到了1.39g(42%)预期产物，其为白色固体。¹HNMR(CDCl₃)δ1.81-2.03(m,4H),2.14-2.28(m,2H),2.81-2.92(m,1H),3.22(d,J=7Hz,2H),4.74(宽单峰,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ19.10,28.21,30.64,60.93.MS m/e148(M-H)^-。

4f.环丙基甲基磺酰胺的制备

使用用于制备环丁基甲基磺酰胺的操作，由环丙基甲基溴(Aldrich)制备环丙基甲基磺酰胺(也参见JACS1981,p.442-445)。¹H NMR(CDCl₃)δ0.39-0.44(m,2H),0.67-0.76(m,2H),1.13-1.27(m,1H),3.03(d,J=7.3Hz,2H),4.74(宽单峰,2H)；¹³C NMR(CDCl₃)δ4.33,5.61,59.93；MS m/e134(M-1)。

4g.2-噻吩磺酰胺的制备

预期产物由2-噻吩磺酰氯(购自Aldrich)使用在Justus Liebigs Ann.Chem.,501:174-182(1933)中所述的方法制备。

4h.4-溴苯磺酰胺的制备

4-溴苯基磺酰胺通过用饱和氨在THF中的溶液处理可商购得到的4-溴磺酰氯来制备。

5.制备硫酰胺(sulfamides)的一般操作

中间体氨磺酰氯通过将水(1当量)在THF中的溶液加至冷的(-20℃)搅拌的异氰酸氯磺酰酯(1当量)在THF中的溶液中并将所得的溶液温热至0℃来制备。向该溶液中加入无水三乙胺(1当量)接着加入必需的仲胺(1当量)。将反应混合物温热至室温，然后过滤并将滤液浓缩，得到了预期的硫酰胺。

实施例2

P1中间体的制备

5.1-叔丁氧基羰基氨基环丙烷羧酸为可商购得到的。

6.1-氨基环丁烷羧酸甲酯盐酸盐的制备

将1-氨基环丁烷羧酸(100mg,0.869mmol)(Tocris)在10mL甲醇中溶解。将HCl气体鼓泡2小时。将反应混合物搅拌18小时，然后真空浓缩，得到了144mg黄色油状物。用10mL乙醚研磨，得到了100mg预期产物，其为白色固体。¹H NMR(CDCl₃)δ2.10-2.25(m,1H),2.28-2.42(m,1H),2.64-2.82(m,4H),3.87(s,3H),9.21(宽单峰,3H)。

7a.(1R,2R)/(1S,2S)1-氨基-2-乙基环丙烷羧酸叔丁酯(外消旋混合物)的制备

步骤1：2-乙基环丙烷-1,1-二羧酸二-叔丁酯的制备，如下显示

向苄基三乙基氯化铵(21.0g,92.2mmol)在50%NaOH水溶液(92.4g在185mL H₂O中)中的混悬液中加入1,2-二溴丁烷(30.0g,138.9mmol)和丙二酸二-叔丁酯(20.0g,92.5mmol)。将反应混合物在室温剧烈搅拌18小时并用冰水混合物处理。将粗产物用二氯甲烷(3x)萃取并接着用水(3x)和盐水洗涤。合并有机萃取物，干燥(MgSO₄)，过滤，并真空浓缩。将所得的残留物经快速柱色谱法纯化(100g SiO₂,3%乙醚在己烷中)，得到了预期产物(18.3g,67.8mmol,73%的收率)，其直接用在下一步反应中。

步骤2：2-乙基环丙烷-1,1-二羧酸叔丁酯的制备，如下显示

在0℃将步骤1的产物(18.3g,67.8mmol)加至叔丁醇钾(33.55g,299.0mmol)在无水乙醚(500mL)中的混悬液中，用H₂O(1.35mL,75.0mmol)处理，并在室温剧烈搅拌过夜。将反应混合物倒入在冰水混合物中并用乙醚(3x)洗涤。在0℃将水层用10%枸橼酸水溶液调节至酸性pH并用乙酸乙酯(3x)萃取。将合并的有机层用水(2x)、盐水洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，并真空浓缩，得到了预期产物，其为淡黄色油状物(10g,46.8mmol,69%的收率)。

步骤3：(1R,2R)/(1S,2S)2-乙基-1-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)环丙烷-羧酸叔丁酯的制备，如下显示。

向步骤2的产物(10g,46.8mmol)和3g新鲜活化的

分子筛在无水苯(160mL)中的混悬液中加入三乙胺(7.50mL,53.8mmol)和DPPA(11mL,10.21mmol)。将反应混合物加热回流且保持3.5小时，用2-三甲基甲硅烷基乙醇(13.5mL,94.2mmol)处理，并加热回流过夜。将反应混合物过滤，用乙醚稀释，先后用10%枸橼酸水溶液、水、饱和NaHCO₃水溶液、水(2x)和盐水(2x)洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，并真空浓缩。将残留物与10g Aldrich聚异氰酸酯清除剂树脂在120mL二氯甲烷中的溶液混悬，在室温搅拌过夜，并过滤，得到了预期产物(8g,24.3mmol；52%)，其为淡黄色油状物。¹H NMR(CDCl₃)δ0.03(s,9H),0.97(m,5H),1.20(宽多重峰,1H),1.45(s,9H),1.40-1.70(m,4H),4.16(m,2H),5.30(宽单峰,1H)。

步骤4：(1R,2R)/(1S,2S)1-氨基-2-乙基环丙烷羧酸叔丁酯(外消旋混合物)的制备，如下显示。

向步骤3的产物(3g,9mmol)中加入1.0M TBAF在THF中的溶液(9.3mL,9.3mmol)。将混合物加热回流且保持1.5小时，冷却至室温，并用500mL乙酸乙酯稀释。将溶液先后用水(2x100mL)和盐水(2x100mL)洗涤，干燥(MgSO₄)，过滤，并真空浓缩，得到了预期产物。

8.外消旋(1R,2S)/(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的制备

方案1

步骤1

将甘氨酸乙酯盐酸盐(304g,2.16摩尔)悬浮在叔丁基甲醚(1.6L)中。加入苯甲醛(231g,2.16摩尔)和无水硫酸钠(155g,1.09摩尔)，并使用冰水浴将混合物冷却至0℃。历时30分钟逐滴加入三乙胺(455mL,3.26摩尔)并将混合物在室温搅拌48小时。然后将反应混合物通过加入冰冷的水(1L)淬灭并分离有机层。将水相用叔丁基甲醚(0.5L)萃取并合并有机相且用饱和NaHCO₃水溶液(1L)和盐水(1L)的混合物洗涤。将有机层经MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩，得到了392.4g N-苄基亚胺产物，其为稠的黄色油状物，其直接用在下一步中。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ1.32(t,J=7.1Hz,3H),4.24(q,J=7.1Hz,2H),4.41(d,J=1.1Hz,2H),7.39-7.47(m,3H),7.78-7.81(m,2H),8.31(s,1H)。

步骤2

历时60分钟向叔丁醇锂(84.1g,1.05mol)在无水甲苯(1.2L)中的混悬液中逐滴加入甘氨酸乙酯的N-苄基亚胺(100g,0.526mol)和反式-1,4-二溴-2-丁烯(107g,0.500mol)的混合物在无水甲苯(0.6L)中的溶液中。在加入完成后，将深红色混合物通过加入水(1L)和叔丁基甲醚(TBME,1L)淬灭。分离水相并第二次用TBME(1L)萃取。合并有机相，加入1.0M HCl(1L)并将混合物在室温搅拌2小时。分离有机相并用水(0.8L)萃取。然后合并水相，用盐(700g)饱和，并加入TBME(1L)且将混合物冷却至0℃。然后通过逐滴加入10.0MNaOH使搅拌的混合物碱化为pH=14，分离有机层，并将水相用TBME(2x500mL)萃取。合并有机萃取物，经MgSO₄干燥，过滤并浓缩为1L的体积。向该游离胺的溶液中加入Boc₂O或一缩二碳酸二叔丁酯(131g,0.600mol)并将混合物在室温搅拌4天。将额外的一缩二碳酸二叔丁酯(50g,0.23mol)加至反应混合物中并将混合物回流3小时然后冷却至室温，保持过夜。将反应混合物经MgSO₄干燥，过滤，并真空浓缩，得到了80g粗物质。将该残留物经快速色谱法纯化(2.5kg SiO₂,用1%至2%CH₃OH/CH₂C1₂洗脱)，得到了57g(53%)外消旋N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，其为黄色油状物，在冰箱中静置的同时固化。¹H NMR(CDCl₃,300MHz)δ1.26(t,J=7.1Hz,3H),1.46(s,9H),1.43-1.49(m,1H),1.76-1.82(宽多重峰,1H),2.14(q,J=8.6Hz,1H),4.18(q,J=7.2Hz,2H),5.12(dd J=10.3,1.7Hz,1H),5.25(宽单峰,1H),5.29(dd,J=17.6,1.7Hz,1H),5.77(ddd,J=17.6,10.3,8.9Hz,1H)；MS m/z254.16(M-1)。

9.N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的拆分

方案2

拆分A

向置于保持在39℃且在300rpm搅拌的12升夹套反应器中的磷酸钠缓冲液(0.1M,4.25升(“L”),pH8)的水溶液中加入511克Alcalase2.4L(约425mL)(Novozymes North America Inc.)。当混合物的温度达到39℃时，通过加入50%NaOH在水中的溶液将pH调节至8.0。然后历时40分钟加入外消旋N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(85g)在850mLDMSO中的溶液。然后将反应混合物温度在40℃保持24.5小时，在此期间将混合物的pH在1.5小时和19.5小时时间点使用50%NaOH在水中的溶液调节至8.0。在24.5小时后，酯的对映体过量确定为97.2%，并将反应混合物冷却至室温(26℃)且搅拌过夜(16小时)，之后酯的对映体过量确定为100%。然后将反应混合物的pH用50%NaOH调节至8.5并将所得的混合物用MTBE(2x2L)萃取。然后将合并的MTBE萃取物用5%NaHCO₃(3x100mL)、水(3x100mL)洗涤，并真空浓缩，得到了对映异构体纯的N-Boc-(1R,2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，其为浅黄色固体(42.55g；纯度：97%210nm,不含有酸；100%对映体过量(“ee”)。

然后将由萃取过程得到的水层用50%H₂SO₄酸化至pH2并用MTBE(2x2L)萃取。将MTBE萃取物用水(3x100mL)洗涤并浓缩，得到了酸，其为浅黄色固体(42.74g；纯度：99%210nm,不含有酯)。

拆分B

向在24孔板的孔中(容量：10mL/孔)的0.5mL100mM Heps·Na缓冲液(pH8.5)中加入0.1mL Savinase16.0L(蛋白酶来自Bacillus clausii)(Novozymes North America Inc.)和外消旋N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(10mg)在0.1mL DMSO中的溶液。将板密封并在250rpm在40℃孵育。在18小时后，酯的对映体过量如下确定为44.3%：除去0.1mL反应混合物并与1mL乙醇混合均匀；在离心后，将10微升(“μL”)上清液用手性HPLC分析。向残留的反应混合物中加入0.1mLDMSO，并将板在250rpm在40℃孵育额外的3天，之后将4mL乙醇加至孔中。在离心后，将10μL上清液用手性HPLC分析并且酯的对映体过量确定为100%。

拆分C

向在24孔板的孔中(容量：10mL/孔)的0.5mL100mM Heps·Na缓冲液(pH8.5)中加入0.1mL Esperase8.0L(蛋白酶来自Bacillus halodurans)(Novozymes North America Inc.)和外消旋N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(10mg)在0.1mL DMSO中的溶液。将板密封并在250rpm在40℃孵育。在18小时后，酯的对映体过量如下确定为39.6%：除去0.1mL反应混合物并与1mL乙醇混合均匀；在离心后，将10μL上清液用手性HPLC分析。向残留的反应混合物中加入0.1mLDMSO，并将板在250rpm在40℃孵育额外的3天，之后将4mL乙醇加至孔中。在离心后，将10μL上清液用手性HPLC分析并且酯的对映体过量确定为100%。

样品分析以下述方式进行：

1)样品制备：将约0.5mL反应混合物与10倍体积的乙醇混合均匀。在离心后，将10μL上清液注射入HPLC柱中。

2)转化确定：

柱：YMC ODS A,4.6x50mm,S-5μm

溶剂：A,1mM HCl在水中的溶液；B,CH₃CN

梯度：30%B,1分钟；30%至45%B历时0.5分钟；45%B,1.5分钟；45%至30%B历时0.5分钟。

流速：2mL/min

紫外检测：210nm

保留时间：酸，1.2分钟；酯，2.8分钟。

3)对于酯的对映体过量的确定：

柱：手性OD-RH,4.6x150mm,S-5μm

流动相：CH₃CN/50mM HClO₄在水中的溶液(67/33)

流速：0.75mL/min.

紫外检测：210nm.

保留时间：

(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸，5.2分钟；

外消旋化合物(1R,2S)/(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，18.5分钟和20.0分钟；

(1R,2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，18.5分钟。

拆分D

将5L0.3M磷酸钠缓冲液(pH8)在130rpm搅拌的20升夹套反应器中在38℃保持。将4升Alcalase2.4L(Novozymes North America Inc.)和1升去离子水加至反应器中。当混合物温度接近38℃时，用10N NaOH将pH调节至7.8。历时1小时经加入漏斗将外消旋N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(500克)在5升DMSO中的溶液加至反应器中。然后将反应混合物温度调节至48℃。在21小时后，酯的对映体过量达到99.3%。在24小时停止加热并将反应混合物缓慢冷却至室温(约25℃)并搅拌过夜。用10N NaOH将反应混合物的pH调节至8.5并将混合物用MTBE(2x4L)萃取。将合并的MTBE萃取物用5%NaHCO₃(3x400mL)和水(3x400mL)洗涤，并浓缩，得到了对映异构体纯的N-Boc-(1R,2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，其为浅黄色晶体(259g；纯度：96.9%210nm,不含有酸；100%ee)。

拆分E

将10L0.1M磷酸钠缓冲液(pH8)在360rpm搅拌的20升夹套反应器中在40℃保持。将1.5升Alcalase2.4L(Novozymes North America Inc.)加至反应器中。当混合物的温度接近38℃，用10N NaOH将pH调节至8.0。历时1小时经加入漏斗将外消旋N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(200克)在2升DMSO中的溶液加至反应器中。然后将反应混合物温度调节至40℃。在3小时后，用10N NaOH将pH调节至8.0。在21小时后，将反应混合物冷却至25℃，用10N NaOH将反应混合物的pH调节至8.5并将混合物用MTBE(2x5L)萃取。将合并的MTBE萃取物用5%NaHCO₃(3x500mL)和水(3x200mL)洗涤，并浓缩，得到了110克黄色油状物。将油状物在室温在室内真空下放置并得到对映异构体纯的N-Boc-(1R,2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，其为无色长条状晶体(101g；纯度：97.9%210nm,不含有酸；100%ee)。

晶体结构对映异构体纯的N-Boc-(1R,2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯已经通过单晶分析表征(X-ray NB#:52795-093,参考号码:634592N1)。由于缺少已知的手性中心或更重原子，未建立绝对构型。沿结晶轴的链结构由在酰胺基团和羰基氧原子之间的分子间氢键(N…O

)形成。

N-Boc-(1R,2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯的结构：

拆分F

将5L0.2M硼酸钠缓冲液(pH9)在400rpm搅拌的20升夹套反应器中在45℃保持。将3升去离子水和4升Savinase16L,EX型(Novozymes NorthAmerica Inc.)加至反应器中。当混合物的温度接近45℃时，用10N NaOH将pH调节至8.5。历时40分钟经加入漏斗将外消旋N-Boc-(1R,2S)/(1S,2R)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(200克)在2升DMSO中的溶液加至反应器中。然后将反应混合物的温度调节至48℃。在2小时后，用10N NaOH将pH调节至pH9.0。在18小时，酯的对映体过量达到72%，用10N NaOH将pH调节至9.0。在24小时，将温度降低至35℃。在42小时，温度升高至48℃并用10N NaOH将pH调节至9.0。在48小时停止加热并将反应混合物缓慢冷却至室温(约25℃)并搅拌过夜。在66小时，反应混合物的pH为8.6。将混合物用MTBE(2x4L)萃取。将合并的MTBE萃取物用5%NaHCO₃(6x300mL)和水(3x300mL)洗涤，并浓缩，得到了对映异构体纯的N-Boc-(1R,2S)/-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯，其为浅黄色晶体(101Ag；纯度：95.9%210nm,不含有酸；98.6%ee)。

10.手性(1R,2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐的制备

在氮气气氛下将(1R,2S)N-Boc-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(8.5g,33.3mmol)与200mL4N HCl/二噁烷(Aldrich)在室温搅拌3小时。保持温度低于40℃减压除去溶剂。由此得到6.57g(～100%)(1R,2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯盐酸盐，其为浅褐色固体。¹H NMR(300MHz,CD₃OD)δ1.31(t,J=7.0Hz,3H),1.69-1.82(m,2H),2.38(q,J=8.8Hz,1H),4.29(q,J=7.0Hz,2H),5.22(d,J=10.3Hz,1H),5.40(d,J=17.2Hz,1H),5.69-5.81(m,1H).MSm/z156(M⁺+1)。

11.N-Boc-(1R,2S)-1-氨基-2-环丙基环丙烷羧酸乙酯的制备

将N-Boc-(1R,2S)-1-氨基-2-乙烯基环丙烷羧酸(255mg,1.0mmol)在乙醚(10mL)中的溶液用乙酸钯(5mg,0.022mmol)处理。将橙色/红色溶液置于氮气气氛下。历时1小时逐滴加入过量的重氮甲烷在乙醚中的溶液。将所得的溶液在室温搅拌18小时。使用氮气流除去过量的重氮甲烷并将所得的溶液经旋转蒸发浓缩，得到了粗产物。经快速色谱法纯化(10%乙酸乙酯/己烷)，得到了210mg(78%)(1R,2S)-N-Boc-1-氨基-2-环丙基环丙烷羧酸乙酯，其为无色油状物。MS m/z270(M⁺+H)。

P1′-P1中间体的制备

12.P1P1′的制备

方案1

步骤1

向1(R)-叔丁氧基羰基氨基-2(S)-乙烯基-环丙烷羧酸乙酯(3.28g,13.2mmol)在THF(7mL)和甲醇(7mL)中的溶液中加入LiOH(1.27g,53.0mmol)在水(14mL)中的混悬液。将混合物在室温搅拌过夜。向混合物中加入1.0MNaOH(15mL)、水(20mL)和乙酸乙酯(20mL)。振摇混合物，分离各相并将有机相再次用20mL0.5M NaOH萃取。将合并的水相用1.0M HCl酸化直到pH=4并用乙酸乙酯(3x40mL)萃取。将合并的有机萃取物用盐水洗涤，干燥(MgSO₄)，并过滤，得到了预期产物，其为白色固体(2.62g,87%)。¹H NMR:(DMSO-d₆)δ1.22-1.26(m,1H),1.37(s,9H),1.50-1.52(m,1H),2.05(q,J=9Hz,1H),5.04(d,J=10Hz,1H),5.22(d,J=17Hz,1H),5.64-5.71(m,1H),7.18,7.53(s,NH(旋转异构体),12.4(宽单峰,1H))；LC-MS MS m/z228(M⁺+H)。

步骤2

在氮气下将步骤1的产物(2.62g,11.5mmol)和CDI(2.43g,15.0mmol)在THF(40mL)中的溶液回流加热50分钟。将溶液冷却至室温并经导管转移至环丙基磺酰胺(1.82g,15.0mmol)在THF(10mL)中的溶液中。向所得的溶液中加入DBU(2.40mL,16.1mmol)并继续搅拌20小时。将混合物用1.0MHCl淬灭至pH=1，并真空蒸发THF。将混悬液用乙酸乙酯(2x50mL)萃取并合并有机萃取物且干燥(Na₂SO₄)。过滤，浓缩并通过由己烷-乙酸乙酯(1:1)重结晶进行纯化，得到了预期产物(2.4g)，其为白色固体。将母液经40S柱纯化(用9%丙酮在二氯甲烷中的溶液洗脱)，得到了第二批预期产物(1.1g)。合并两批产物(总收率为92%)。¹H NMR:(DMSO-d₆)δ0.96-1.10(m,4H),1.22(dd,J=5.5,9.5Hz,1H),1.39(s,9H),1.70(t,J=5.5Hz,1H),2.19-2.24(m,1H),2.90(m,1H),5.08(d,J=10Hz,1H),5.23(d,J=17Hz,1H),5.45(m,1H),6.85,7.22(s,NH(旋转异构体))；LC-MS,MS m/z331(M⁺+H)。

步骤3

将步骤2的产物(3.5g,10.6mmol)在二氯甲烷(35mL)和TFA(32mL)中的溶液在室温搅拌1.5小时。真空除去挥发物并将残留物在1.0M HCl悬浮在乙醚(20mL)中的溶液中并真空浓缩。重复进行该操作一次。将所得的混合物用戊烷研磨并过滤，得到了标题化合物，其为吸湿性的灰白色固体(2.60g,92%)。¹H NMR(DMSO-d₆)δ1.01-1.15(m,4H),1.69-1.73(m,1H),1.99-2.02(m,1H),2.38(q,J=9Hz,1H),2.92-2.97(m,1H),5.20(d,J=11Hz,1H),5.33(d,J=17Hz,1H),5.52-5.59(m,1H),9.17(宽单峰,3H)；LC-MS,MS m/z231(M⁺+H)。

13.P1-P1′硫酰胺衍生物的制备

向(1R,2S)1-叔丁氧基羰基氨基-2-乙烯基-环丙烷羧酸(217mg,1.194mmol)在THF(5mL)中的溶液中加入CDI(290mg,1.791mmol)并将反应混合物加热回流且保持45分钟。在另一个圆底烧瓶中，将LiHMDS(1.0M的己烷溶液的溶液,2.4mL,2.4mmol)加至N-乙基甲基硫酰胺(330mg,2.388mmol)在THF(5mL)中的溶液中并将反应混合物在室温搅拌1小时。合并两个反应混合物并在室温搅拌2小时。将水加入以淬灭反应混合物并将反应混合物溶液用乙酸乙酯萃取。分离有机层并经MgSO₄干燥。过滤并浓缩，得到了粗产物，将其经制备性HPLC纯化，得到了预期的N-Boc保护的N-酰基硫酰胺。然后在4N HCl在二噁烷(2mL)中的溶液中溶解并在室温搅拌4小时的同时除去Boc保护基团。浓缩，得到了褐色油状物，其为盐酸盐。(112mg,33%的收率)。¹H NMR(400Mz,CD₃OD)

1.16(t,J=7.21Hz,3H),1.68(dd,J=10.03,7.83Hz,1H),2.15(m,1H),2.37(m,1H),2.89(s,3H),3.30(m,2H),5.31(d,J=10.27Hz,1H),5.42(d,J=17.12Hz,3H),5.68(m,1H).LC-MS(保留时间：0.883分钟.),MS m/z270(M+Na⁺)。

化合物制备：

实施例1：化合物1

方案1

步骤1

在-78℃向甲基亚砜(28.0ml,395mmol)在DCM(150ml)中的溶液中逐滴加入草酰氯(99ml,198mmol)。将形成的溶液在此温度搅拌30分钟。在-78℃逐滴加入(2S,4R)-4-羟基吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(25.08g,90mmol)在DCM(150ml)中的溶液。将形成的白色浆液在-78℃搅拌2小时，之后逐滴加入N,N-二异丙基乙基胺(78ml,449mmol)。将最终的粉红色溶液在室温搅拌3小时。用冰冷的1M HCl、5%枸橼酸和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，蒸发。将残留的浅棕色油状物经柱色谱纯化(用4:1、3:1然后2:1的己烷-EtOAc洗脱)，得到了预期产物(17.8g,72%的收率)，其为浅棕色粘稠油状物。¹H NMR(CDCl₃)δ2.58-2.63(m,1H),2.90-2.99(m,1H),3.62,3.77(s,3H,旋转异构体),3.95-4.02(m,2H),4.82-4.89(m,1H),5.11-5.24(m,2H),7.32-7.39(m,5H)。

步骤2

在0℃向(S)-4-氧代吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(13.24g,47.8mmol)在甲苯(400mL)中的溶液中逐滴加入联苯-4-基溴化镁(124mL,62.1mmol)。将形成的浅黄色溶液在此温度搅拌1小时。用NH₄Cl淬灭，分离有机层。将水层用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，蒸发。将残留物经过硅胶填料纯化(用4:1、3:1然后2:1且最终3:2的己烷-EtOAc洗脱)，得到了10.50g白色固体，将其由EtOAc-己烷(50ml-150ml)重结晶，得到了7.50g预期产物，其为粉红色细小针状物。将母液浓缩并经

柱纯化(用5%～50%EtOAc-己烷洗脱)，又得到了1.89g预期产物。¹H NMR(CDCl₃)δ2.39-2.45(m,1H),2.70-2.75(m,1H),3.66,3.86(s,3H,旋转异构体),3.80-3.90(m,1H),4.00-4.07(m,1H),4.62(dd,J1,2=9.5,28Hz,1H),5.09-5.15(m,1H),5.21-5.25(m,1H),7.31-7.38(m,6H),7.42-7.45(m,2H),7.54-7.59(m,6H)；LC-MS(保留时间：2.77分钟,方法B),MS m/z414(M⁺-H₂O),370(M⁺-H₂O–CO₂)。

步骤3

在室温向澄清的(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-羟基吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(2.59g,6mmol)和1-丁硫醇(0.773mL,7.20mmol)在乙腈(30mL)中的溶液中一次性加入三氟甲磺酸钪(III)固体(0.295g,0.600mmol)。将形成的粉红色溶液在此温度搅拌26小时。TLC分析显示起始物质完全消耗。用饱和氯化铵淬灭，用EtOAc萃取。将有机物用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，真空蒸发。将残留物经

柱纯化(用5～40%的EtOAc-己烷梯度洗脱)，得到了非对映异构体的混合物2.54g(84%)。将该油性混合物再次经

纯化(用0～20%EtOAc-甲苯梯度洗脱)。收集柱的第一个峰的产物，为副产物(2S,4S)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(1.54g,2.60mmol,43.3%的收率)，其为蜡状物。¹H NMR(500MHz,氯仿-d)

ppm0.77(t,J=7.17,3H),1.21-1.24(m,2H),1.28-1.34(m,2H),2.20-2.29(m,2H),2.41-2.46(m,1H),2.86(dd,J=12.82,7.32Hz,1H),3.53,3.75(s,旋转异构体,3H),3.89(dd,J=17.09,11.29Hz,1H),4.23–4.36(m,1H),4.69-4.77(m,1H)5.22-5.30(m,2H)7.28-7.44(m,10H),7.53-7.60(m,4H).LC-MS(保留时间：3.28分钟,方法B),MS m/z504(M+H)。

收集柱的第二个峰产物，为预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(0.96g,1.620mmol,27.0%的收率)，其为蜡状物。¹H NMR(500MHz,氯仿-d)δppm0.77(t,J=7.17,3H),1.18-1.26(m,2H),1.27-1.35(m,2H),2.15-2.24(m,2H),2.64-2.73(m,1H),2.76-2.84(m,1H),3.61,3.77(s,旋转异构体,3H),3.93–3.95(m,1H),4.16–4.30(m,1H),4.35–4.45(m,1H),5.03-5.15(m,1H),5.22(dd,J=16.02,12.36Hz,1H),7.25-7.41(m,3H),7.33-7.39(m,4H),7.41-7.46(m,3H),7.51-7.60(m,4H).LC-MS(保留时间：3.28分钟,方法B),MS m/z504(M+H)。

步骤4

向冰冷的(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(1.19g,2.363mmol)在乙腈(20mL)中的溶液中加入碘代三甲基甲硅烷(0.404mL,2.84mmol)。将形成的浅棕色溶液在室温搅拌2小时。用冰浴冷却，用苯硫酚(0.314mL,3.07mmol)和饱和氯化铵淬灭，用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤。将滤液用盐酸(3.54mL,7.09mmol)处理并真空蒸发。将残留的油状物用乙醚研磨，倾析出乙醚层。将残留的胶状物抽吸至干燥，得到了预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-2-羧酸甲酯盐酸盐(952mg,1.876mmol,79%的收率)，其为浅黄色固体。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm0.78(t,J=7.22Hz,3H),1.23-1.32(m,4H),2.33(dt,J=11.67,7.13Hz,1H),2.37-2.43(m,1H),2.98(dd,J=14.19,10.22Hz,1H),3.13(dd,J=14.04,1.83Hz,1H),3.81(d,J=11.90Hz,1H),3.96(s,3H),4.02(d,J=11.90Hz,1H),4.79(dd,J=10.38,2.75Hz,1H),7.38(m,1H),7.44-7.52(m,4H),7.63-7.71(m,4H).LC-MS(保留时间：2.27分钟,方法B),MS m/z370(M+H)。

步骤5

向冰冷的(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-2-羧酸甲酯盐酸盐(700mg,1.724mmol)、(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酸(439mg,1.897mmol)和HATU(983mg,2.586mmol)在DCM(20mL)中的浆液中加入N,N-二异丙基乙基胺(0.903mL,5.17mmol)。将形成的无色浆液在室温搅拌5小时(其变为浅棕色溶液)。用DCM稀释，用5%枸橼酸淬灭。将有机层用0.1M NaOH和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，真空蒸发。将残留物经

柱纯化(用5～35%EtOAc-己烷洗脱)，得到了白色泡沫状物。TLC分析(甲苯-EtOAc)显示其中仍存在少量不预期的副产物。因此，经

柱进行纯化(用5～25%EtOAc-甲苯洗脱)，得到了预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(600mg,0.875mmol,50.8%的收率)，其为白色泡沫状物。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm0.78(t,J=7.22Hz,3H),1.12(s,9H),1.24-1.33(m,2H),1.32-1.40(m,2H),1.47(s,9H),2.22-2.40(m,2H),2.56(dd,J=12.82,7.32Hz,1H),2.92(dd,J=12.97,7.78Hz,1H),3.74(s,3H),4.09(d,J=10.99Hz,1H),4.36(t,J=7.48Hz,1H),4.41-4.51(m,1H),4.76(d,J=10.99Hz,1H),7.36(t,J=7.32Hz,1H),7.45(t,J=7.63Hz,3H),7.52-7.73(m,5H).LC-MS(保留时间：3.63分钟,方法B),MS m/z583(M+H)。

步骤6

向(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(430mg,0.738mmol)在THF(4mL)和MeOH(4.00mL)中的溶液中加入预先制备的氢氧化锂一水合物(61.9mg,1.476mmol)在水(4mL)中的溶液。将形成的混浊溶液在室温搅拌5小时。用5%枸橼酸淬灭，用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，蒸发，，得到了预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-2-羧酸(409mg,0.611mmol,83%的收率)，其为白色泡沫状物。LC-MS(保留时间：3.49分钟,方法B),MS m/z569(M+H)。

步骤7

向冰冷的(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-2-羧酸(60mg,0.105mmol)、(1R,2S)-1-氨基-N-(环丙基磺酰基)-2-乙烯基环丙烷甲酰胺对甲苯磺酸盐水合物(53.1mg,0.127mmol)和HATU(60.1mg,0.158mmol)在DCM(2mL)中的浆液中加入N,N-二异丙基乙基胺(0.055mL,0.316mmol)。将形成的无色浆液在室温搅拌5小时(其变为浅黄色溶液)。用DCM稀释，用5%枸橼酸淬灭。将分离的有机层用饱和枸橼酸钠和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，真空蒸发。将残留物经

柱纯化(用5%-40%丙酮-己烷梯度洗脱)，得到了预期产物(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基硫基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(69mg,0.082mmol,78%的收率)，其为白色固体。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm0.83(t,J=7.32Hz,3H),1.03-1.12(m,10H),1.19-1.36(m,4H),1.35-1.49(m,4H),1.48(s,9H),1.88(s,J=7.93,5.49Hz,3H),2.14-2.24(m,1H),2.23-2.30(m,1H),2.35(t,J=11.60Hz,1H),2.39-2.53(m,1H),2.76-2.87(m,1H),2.89-3.00(m,1H),3.93(dd,J=10.68,6.41Hz,1H),3.99(d,J=10.99Hz,1H),4.51(d,J=10.07Hz,1H),5.06(d,J=10.99Hz,1H),5.10-5.19(m,1H),5.29(d,J=17.09Hz,1H),5.69-5.83(m,1H),7.37(t,J=7.32Hz,1H),7.46(t,J=7.78Hz,2H),7.55-7.63(m,4H)7.64-7.77(m,2H).LC-MS(保留时间：3.48分钟,方法B),MS m/z781(M+H)。

实施例2：化合物2

方案2

向(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基硫基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(25mg,0.032mmol)在MeOH(2mL)中的溶液中加入预先制备的过氧代单硫酸钾(potassium peroxomonosulfate)化合物(89mg,0.144mmol)在水(4mL)中的溶液。将形成的浆液在室温搅拌过夜。用5%枸橼酸淬灭，用EtOAc萃取。将有机物用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，真空蒸发。将残留物经制备性HPLC纯化。收集制备性HPLC柱的第一个峰产物，为(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-((R)-丁基亚硫酰基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(2.3mg,2.89μmol,9.02%的收率)和(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基磺酰基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(1.9mg,2.337μmol,7.30%的收率)，其为白色固体。¹HNMR(500MHz,MeOD)

ppm0.86(t,J=7.48Hz,3H),1.01-1.16(m,12H),1.20-1.29(m,2H),1.28-1.48(m,3H),1.54(s,9H),1.66-1.71(m,1H),1.87(dd,J=7.93,5.49Hz,1H),2.17–2.22(m,1H),2.35-2.42(m,1H),2.46-2.53(m,1H),2.74–2.83(m,2H),2.92–2.97(m,1H),3.97-4.13(m,1H),4.35(d,J=10.99Hz,1H),4.50-4.61(m,1H),4.98(d,J=10.99Hz,1H),5.12(d,J=10.38Hz,1H),5.28(d,J=17.09Hz,1H),5.74–5.81(m,1H),7.40(t,J=7.17Hz,1H),7.48(t,J=7.63Hz,2H),7.61(d,J=7.63Hz,2H),7.66-7.82(m,4H).LC-MS(保留时间：3.22分钟,方法B),MS m/z797(M+H)。

实施例3：化合物3

在HPLC分离过程中化合物3，即(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基磺酰基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(1.9mg,2.337μmol,7.30%的收率)也由方案2得到，其是收集柱的第二个峰得到的，其为白色固体。¹H NMR(500MHz,MeOD)δppm0.87(t,J=7.32Hz,3H),0.98-1.14(m,11H),1.19-1.29(m,2H),1.29-1.43(m,3H),1.49(s,9H),1.51-1.74(m,2H),1.90(dd,J=8.24,5.49Hz,1H),2.24(q,J=8.85Hz,1H),2.69-2.84(m,1H),2.84-3.00(m,3H),3.11(dd,J=12.82,6.41Hz,1H),3.99(dd,J=10.83,6.56Hz,1H),4.37(d,J=10.99Hz,1H),4.50(d,J=9.77Hz,1H),5.06-5.24(m,2H),5.31(dd,J=17.09,1.22Hz,1H),5.71-5.85(m,1H),7.40(t,J=7.32Hz,1H),7.49(t,J=7.63Hz,2H),7.63(d,J=7.32Hz,2H),7.73(d,J=8.55Hz,2H),7.91(d,J=8.55Hz,2H).LC-MS(保留时间：3.51分钟,方法B),MS m/z813(M+H)。

实施例4：化合物4

方案3

步骤1：

在0℃向(1R,2S)-1-(叔丁氧基羰基氨基)-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(15.3g,59.9mmol)在THF(100ml)中的溶液中逐滴加入9-BBN(180ml,90mmol)。将形成的溶液在室温搅拌2小时。将最终的溶液冷却至0℃，同时加入3M乙酸钠(180ml,540mmol)。向该搅拌的混合物中逐滴加入过氧化氢(89ml,869mmol)(由于加入过程放热，应当小心)。将形成的温热的两层混合物搅拌过夜。分离上层有机层，将水层用EtOAc萃取。将合并的有机层用盐水洗涤。经MgSO₄干燥，过滤，蒸发。将残留物经硅胶柱纯化(用4:1、3:1、2:1然后3:2的己烷-EtOAc洗脱)，得到了预期产物(1R,2S)-1-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(2-羟基乙基)环丙烷羧酸乙酯(11.50g,42.1mmol,70.2%的收率)，其为粘稠的油状物，其在实验台上静置时固化。¹H NMR(CDCl₃)δ1.18-1.21(m,1H),1.25(t,J=7Hz,3H),1.35-1.40(m,1H),1.44(s,9H),1.61-1.65(m,1H),1.70-1.75(m1H),1.91-1.98(m,1H),3.61-3.65(m,1H),3.71-3.75(m,1H),4.10-4.21(m,2H),5.17(b,1H)。

步骤2

在0℃向(1R,2S)-1-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(2-羟基乙基)环丙烷羧酸乙酯(1.37g,5.01mmol)在DCM(50ml)中的溶液中加入Dess-Martin高碘烷(periodinane)(2.55g,6.01mmol)。将形成的浆液在室温搅拌过夜。经过滤。将滤液浓缩并再次过滤。将滤液转移至硅胶柱上，用2:1的己烷-EtOAc洗脱，得到了预期产物(1.01g,74%的收率)，其为无色油状物，其在实验台上静置时固化。¹H NMR(CDCl₃)δ1.24(t,J=7Hz,3H),1.40-1.45(m,11H),1.65-1.69(m,1H),2.75-2.80(m,2H),4.09-4.19(m,2H),5.17(b,1H),9.76(s,1H)。

步骤3

在0℃向(1R,2S)-1-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(2-氧代乙基)环丙烷羧酸乙酯(862mg,3.18mmol)在DCM(30ml)中的溶液中加入(二乙基氨基)三氟化硫(0.840ml,6.35mmol)。将形成的浆液在室温搅拌过夜。用浓氯化铵淬灭，用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，蒸发。将残留物转移至硅胶柱上，用4:1然后2:1的己烷-EtOAc洗脱，得到了预期产物(210mg,22%的收率)，其为浅黄色油状物。在柱分离后也回收得到300mg起始物质。¹H NMR(CDCl₃)δ1.26(t,J=7Hz,3H),1.35-1.39(m,1H),1.44(s,9H),1.46-1.50(m,1H),1.55-1.60(m,1H),2.18-2.24(m,2H),4.15-4.21(m,2H),5.17(b,1H),5.73,5.85,5.99(b,1H)。

步骤4.

在25℃向(1R,2S)-1-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(2,2-二氟乙基)环丙烷羧酸乙酯(210mg,0.716mmol)在THF(2ml)和MeOH(2.000ml)中的溶液中加入预先制备的氢氧化锂一水合物(0.040ml,1.432mmol)在水(2ml)中的溶液。将形成的混浊混悬液在室温搅拌过夜。真空除去挥发物。用5%枸橼酸稀释，用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥。将残留物抽吸过夜，得到了预期产物(172mg,91%的收率)，其为灰白色固体并按原样使用。¹HNMR(CD₃OD)δ1.25-1.28(m,1H),1.42-1.43(m,10H),1.46-1.53(m,1H),2.12-2.14(m,2H),4.15-4.21(m,2H),5.73,5.85,6.00(b,1H)。

步骤5

在室温向(1R,2S)-1-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(2,2-二氟乙基)环丙烷羧酸(1.50g,5.6mmol)在THF(50ml)中的溶液中加入CDI(1.14g,7.0mmol)。将所得的溶液在此温度搅拌3小时。先后加入环丙基磺酰胺(1.37g,11.2mmol)和DBU(1.65ml,11.2mmol)。将最终的混合物在室温搅拌过夜。用EtOAc稀释，用5%枸橼酸萃取。将有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，蒸发。将残留物转移至硅胶柱上，用1-5%iPrOH/CHCl₃洗脱，得到了预期产物(1.20g,58%的收率)，其为灰白色固体。¹H NMR(CDCl₃)δ1.08-1.10(m,2H),1.28-1.35(m,2H),1.45-1.46(m,1H),1.47(s,9H),1.60-1.65(m,1H),1.70-1.71(m,1H),2.07-2.15(m,2H),2.92-2.94(m,1H),5.16(b,1H),5.79,5.89,6.02(b,1H),9.35(b,1H).LC-MS(保留时间：0.1.80分钟,方法B),MSm/z369(M⁺+H)。

步骤6

向(1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-(2,2-二氟乙基)环丙基氨基甲酸叔丁酯(55mg,0.149mmol)在1,4-二噁烷(1.3ml)中的溶液中加入4M HCl(0.746ml,2.99mmol)在1,4-二噁烷中的溶液。将形成的溶液在25℃搅拌3小时。LC/MS分析显示起始物质完全转化为预期产物。真空除去溶剂。将残留物抽吸过夜并没有进一步纯化即可在下一步反应中使用。LC-MS(保留时间：0.38分钟,方法B),MS m/z269(M⁺+H)。

步骤7

向(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-2-羧酸(15mg,0.026mmol)、(1R,2S)-1-氨基-N-(环丙基磺酰基)-2-(2,2-二氟乙基)环丙烷甲酰胺(8.84mg,0.029mmol)和HATU(15.03mg,0.040mmol)在DMF(1mL)中的溶液中加入N,N-二异丙基乙基胺(0.014mL,0.079mmol)。将形成的浅黄色溶液在室温搅拌5小时。用MeOH稀释，经制备性HPLC纯化，得到了预期产物(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基硫基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-(2,2-二氟乙基)环丙基氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(14mg,0.015mmol,58.3%的收率)，其为白色固体。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm0.83(t,J=7.17Hz,3H),1.09–1.12(m,10H),1.22-1.45(m,7H)1.47–1.52(m,10H),1.66(s,2H),2.07-2.38(m,4H),2.37-2.51(m,1H),2.76-2.87(m,1H),2.91-3.04(m,1H),3.85-4.06(m,2H),4.51(d,J=9.77Hz,1H),5.05(d,J=11.29Hz,1H),5.73-6.09(m,1H),7.37(t,J=7.02Hz,1H),7.46(t,J=7.48Hz,2H),7.54-7.64(m,4H),7.68(d,J=8.24Hz,2H).LC-MS(保留时间：3.48分钟,方法B),MS m/z819(M+H)。

实施例5：化合物5

向(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-2-羧酸(14mg,0.025mmol)、(1S,2R)-2-氨基-N-(环丙基磺酰基)二(环丙烷)-2-甲酰胺盐酸盐(7.60mg,0.027mmol)和HATU(14.03mg,0.037mmol)在DMF(1mL)中的溶液中加入N,N-二异丙基乙基胺(0.013mL,0.074mmol)。将形成的浅黄色溶液在室温搅拌过夜。用MeOH稀释，经制备性HPLC纯化，得到了预期产物(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基硫基)-2-((1S,2R)-2-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)二(环丙烷)-2-基氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(6mg,7.02μmol,28.5%的收率)，其为白色固体并也回收了约30%的起始物质。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm0.25-0.35(m,2H),0.47-0.55(m,1H),0.55-0.64(m,1H),0.79-0.87(m,3H),1.02-1.14(m,11H),1.19-1.50(m,9H),1.50-1.55(m,9H),1.76(dd,J=8.24,5.49Hz,1H),2.16-2.37(m,2H),2.37-2.51(m,1H),2.79(dd,J=12.05,6.26Hz,1H),2.92-3.03(m,1H),3.91(dd,J=10.68,6.41Hz,1H),3.98(d,J=10.99Hz,1H),4.50(d,J=9.77Hz,1H),5.05(d,J=10.99Hz,1H),7.37(t,J=7.48Hz,1H),7.46(t,J=7.63Hz,2H),7.55-7.63(m,4H),7.64-7.75(m,2H).LC-MS(保留时间：3.57分钟,方法B),MS m/z795(M+H)。

实施例6：化合物6

向(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-2-羧酸(15mg,0.026mmol)、(1R,2R)-1-氨基-N-(环丙基磺酰基)-2-(二氟甲基)环丙烷甲酰胺盐酸盐(7.67mg,0.026mmol)和HATU(15.03mg,0.040mmol)在DMF(1mL)中的溶液中加入N,N-二异丙基乙基胺(0.014mL,0.079mmol)。将形成的浅黄色溶液在室温搅拌过夜。用MeOH稀释，经制备性HPLC纯化，得到了预期产物(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基硫基)-2-((1R,2R)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-(二氟甲基)环丙基氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(12mg,0.015mmol,56.5%的收率)，其为白色固体。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm0.83(t,J=7.02Hz,3H),1.04-1.16(m,11H),1.23-1.45(m,6H),1.45-1.59(m,10H),1.96-2.10(m,2H),2.20-2.38(m,2H),2.38-2.51(m,1H),2.81(dd,J=12.36,6.26Hz,1H),2.90-3.02(m,1H),3.91(dd,J=10.38,6.41Hz,1H),3.99(d,J=10.99Hz,1H),4.51(d,J=9.77Hz,1H),5.07(d,J=10.99Hz,1H),5.79–6.02(m,1H),7.37(t,J=7.02Hz,1H),7.46(t,J=7.48Hz,2H),7.55-7.65(m,4H),7.66-7.75(m,2H).LC-MS(保留时间：3.50分钟,方法B),MSm/z805(M+H)。

实施例7：化合物7

步骤1

将(1R,2S)-1-(叔丁氧基羰基氨基)-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(24g,94mmol)、Boc₂O(39.3mL,169mmol)和DMAP(2.297g,18.80mmol)在乙腈(200mL)中的溶液加热至65,，保持过夜(当加热反应混合物至约50-60,时，开始有二氧化碳放出)。然后将反应混合物冷却，浓缩并经

纯化(15-25%EtOAc/己烷)，得到了预期产物，其为轻微有色的油状物(32.6g,98%)。¹H NMR(500MHz,氯仿-d)δppm1.24(t,J=7.17Hz,3H)1.38-1.56(m,19H)1.89(dd,J=8.70,5.95Hz,1H)2.26(q,J=9.05Hz,1H)4.08-4.28(m,2H)5.15(dd,J=10.38,1.53Hz,1H)5.28(dd,J=17.24,1.68Hz,1H)5.87(ddd,J=17.17,10.15,9.00Hz,1H)。

步骤2

在0℃将OsO₄(4%wt的水溶液)(1.7mL,0.281mmol)加至用机械搅拌器搅拌的(1R,2S)-1-(二(叔丁氧基羰基)氨基)-2-乙烯基环丙烷羧酸乙酯(10g,28.1mmol)在THF(50mL)和叔丁醇(500mL)中的溶液中。向其中加入NaIO₄(15.04g,70.3mmol)在水(40mL)中的溶液。反应混合物变为白色沉淀物的稠的浆液。在15分钟后，移去冰浴并将反应混合物温热至室温并搅拌过夜。将反应混合物用EtOAc经过滤然后浓缩。将残留物吸收在EtOAc中并用盐水洗涤。干燥有机物，过滤并蒸发，得到了粗物质。将粗物质在

上纯化(15-20%EtOAc/己烷)，得到了预期产物，其为无色油状物(8.05g,80%)。¹H NMR(300MHz,氯仿-d)δppm1.27(t,J=7.14Hz,3H)1.50(s,18H)1.78(dd,J=9.51,6.22Hz,1H)2.30(td,J=9.06,5.67Hz,1H)2.48(dd,J=8.42,6.22Hz,1H)4.16-4.33(m,2H)9.47(d,J=5.86Hz,1H)。

步骤3

在-78℃将六甲基亚磷三酰胺(16.42mL,90mmol)缓慢加至二溴二氟甲烷(4.09mL,44.8mmol)和

分子筛(2g)在THF(100mL)中的混合物中。将其在-78℃搅拌30分钟(混合物变为稠的淤渣)然后温热至0℃。加入(1R,2R)-1-(二(叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲酰环丙烷羧酸乙酯(8g,22.38mmol)在THF(30mL)中的溶液并在0℃继续搅拌1小时然后在室温搅拌1小时。TLC分析显示有起始物质的消耗。将反应混合物用乙醚和磷酸盐缓冲液(pH7)稀释。将水层用乙醚萃取并将合并的有机物干燥，过滤并蒸发，得到了粗(有臭味的)物质。将其在上纯化(5-15%EtOAc/己烷)，得到了预期产物，其为无色油状物(4.7g,54%)。¹H NMR(300MHz,氯仿-d)δppm1.26(t,J=7.14Hz,3H)1.39-1.54(m,19H)1.81(dd,J=8.60,6.04Hz,1H)2.26(q,J=9.51Hz,1H)4.10-4.29(m,2H)4.50(ddd,J=24.88,9.51,1.83Hz,1H)。

步骤4

将2.0M LiOH(24mL,48.0mmol)加至(1R,2S)-1-(二(叔丁氧基羰基)氨基)-2-(2,2-二氟乙烯基)环丙烷羧酸乙酯(4.7g,12.01mmol)在THF(50mL)和MeOH(50mL)中的溶液中。将其在室温搅拌过夜。将反应混合物用Et₂O和1.0M HCl稀释。将水层用Et₂O(2x)萃取并将合并的有机物干燥，过滤并蒸发，得到了粗产物。将粗产物在

上纯化(5-20%丙酮/己烷)，得到了预期产物，其为白色泡沫状物(2.6g,82%)。¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δppm1.25-1.40(m,10H)1.40-1.51(m,1H)1.99(q,J=8.78Hz,1H)4.32-4.61(m,1H)7.24&7.58(NHBoc,1H)12.64(宽单峰,1H)。

步骤5

在室温将((1R,2S)-1-(叔丁氧基羰基氨基)-2-(2,2-二氟乙烯基)环丙烷羧酸(1.1g,4.18mmol)和二(1H-咪唑-1-基)甲酮(0.813g,5.01mmol)在THF(30ml)中溶解，形成浅黄色溶液。搅拌2小时。将环丙基磺酰胺(0.861g,7.10mmol))加至溶液中接着加入2,3,4,6,7,8,9,10-八氢嘧啶并[1,2-a]氮杂

(1.260mL,8.36mmol)。在室温搅拌1小时。用10ml水稀释，在冰浴中冷却，用6N HCl酸化至PH～1，用乙酸乙酯萃取两次(2X10ML)。经Na₂SO₄干燥。将所得的棕色固体经硅胶纯化(用5-20%丙酮/己烷梯度洗脱)。得到1.25g(78%)预期产物。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)

ppm9.44(1H,宽单峰),5.26(1H,m),2.86-2.98(1H,m),2.09-2.20(1H,m),1.77-1.89(1H,1.38-1.49(11H,m),1.02-1.14(2H,m)。

步骤6

将4.0M HCl在二噁烷(25mL,100mmol)中的溶液加至(1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-(2,2-二氟乙烯基)环丙基氨基甲酸叔丁酯(1.5g,4.09mmol)中并在室温搅拌2小时。将反应混合物浓缩并真空干燥，得到了预期产物，其为浅色的易碎泡沫状物(1.20g,97%)。LC-MS(保留时间：0.52分钟,方法B),MS m/z267(M+H)。

步骤7

向冰冷的(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(丁基硫基)吡咯烷-2-羧酸(15mg,0.026mmol)、(1R,2S)-1-氨基-N-(环丙基磺酰基)-2-(2,2-二氟乙烯基)环丙烷甲酰胺盐酸盐(8.78mg,0.029mmol)和HATU(15.04mg,0.040mmol)在DMF中的溶液中加入N,N-二异丙基乙基胺(0.018mL,0.105mmol)。将形成的浅棕色溶液在室温搅拌过夜。用MeOH稀释，经制备性HPLC纯化，得到了预期产物(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(丁基硫基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-(2,2-二氟乙烯基)环丙基氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(8mg,9.11μmol,34.5%的收率)，其为白色固体。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm0.83(t,J=7.17Hz,3H),1.02-1.14(m,11H),1.21-1.35(m,4H),1.36-1.45(m,2H),1.50(s,9H),1.74-1.83(m,1H),2.16-2.30(m,2H),2.35(t,J=11.44Hz,1H),2.44(dd,J=12.36,6.56Hz,1H),2.75-2.87(m,1H),2.92-3.00(m,1H),3.93(dd,J=10.22,6.26Hz,1H),3.99(d,J=10.99Hz,1H),4.38-4.53(m,2H),5.06(d,J=10.99Hz,1H),7.37(t,J=6.87Hz,1H),7.46(t,J=7.63Hz,2H),7.54-7.64(m,4H),7.65-7.73(m,2H).LC-MS(保留时间：3.60分钟,方法B),MS m/z817(M+H)。

实施例8：化合物8

方案5

步骤1

在室温向澄清的(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-羟基吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(2.59g,6.00mmol)和三甲基甲硅烷基甲硫醇(1.019mL,7.20mmol)在乙腈(30mL)中的溶液中一次性加入三氟甲磺酸钪(III)固体(0.295g,0.600mmol)。将形成的粉红色溶液在此温度搅拌26小时。TLC分析显示起始物质完全消耗。用饱和氯化铵淬灭，用EtOAc萃取。将有机物用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，真空蒸发。将残留物经

柱纯化(用5～40%的EtOAc-己烷梯度洗脱)，得到了非对映异构体的混合物3.10g(97%)。将该油性混合物再次经

纯化(用0～20%EtOAc-甲苯梯度洗脱)，得到了蜡状的副产物(2S,4S)-4-(联苯-4-基)-4-((三甲基甲硅烷基)甲基硫基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(1.40g,2.62mmol,43.7%的收率)和白色泡沫状的预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-((三甲基甲硅烷基)甲基硫基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(1.25g,2.108mmol,35.1%的收率)。¹H NMR(500MHz,氯仿-d)

ppm-0.03(s,9H),1.33(dd,J=28.08,11.29Hz,1H),1.49(dd,J=17.70,11.29Hz,1H),2.62-2.85(m,2H),3.62,3.77(s,3H),3.97(t,J=11.60Hz,1H),4.16(dd,J=74.62,11.44Hz,1H),4.35-4.56(m,1H),4.99-5.19(m,1H),5.17-5.27(m,1H),7.27-7.40(m,8H),7.39-7.49(m,2H),7.49-7.67(m,4H).LC-MS(保留时间：3.62分钟,方法B),MS m/z534(M+H)。

步骤2

向(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-((三甲基甲硅烷基)甲基硫基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(472mg,0.884mmol)在THF(10mL)和MeOH(10mL)中的溶液中加入预先制备的氢氧化锂一水合物(74.2mg,1.769mmol)在水(10mL)中的溶液。将形成的白色浆液在室温搅拌3天。用5%枸橼酸淬灭，用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，蒸发，得到了预期产物(2S,4R)-1-(苄基氧基羰基)-4-(联苯-4-基)-4-((三甲基甲硅烷基)甲基硫基)吡咯烷-2-羧酸(460mg,0.797mmol,90%的收率)，其为蜡状物。该产物没有进一步纯化即可在下一步反应中使用。LC-MS(保留时间：3.43分钟,方法B),MS m/z520(M+H)。

步骤3

向(2S,4R)-1-(苄基氧基羰基)-4-(联苯-4-基)-4-((三甲基甲硅烷基)甲基硫基)吡咯烷-2-羧酸(453mg,0.872mmol)在THF(10mL)中的溶液中加入四丁基氟化铵(2.61mL,2.61mmol)。将形成的浅黄色溶液在室温搅拌过夜。用EtOAc稀释，用5%枸橼酸和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，蒸发，，得到了预期产物(2S,4R)-1-(苄基氧基羰基)-4-(联苯-4-基)-4-(甲基硫基)吡咯烷-2-羧酸(390mg,0.784mmol,90%的收率)，其为白色泡沫状物。LC-MS(保留时间：3.14分钟,方法B),MS m/z448(M+H),400(M-MeSH)。

步骤4

向冰冷的(2S,4R)-1-(苄基氧基羰基)-4-(联苯-4-基)-4-(甲基硫基)吡咯烷-2-羧酸(288mg,0.644mmol)在MeOH(5mL)中的无色溶液中逐滴加入(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(3.54mL,7.08mmol)直到其变为浅黄色(有气泡生成)。将形成的浅黄色溶液在室温搅拌过夜。用EtOAc稀释，用5%枸橼酸和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，蒸发，，得到了预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(甲基硫基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(267mg,0.578mmol,90%的收率)，其为白色蜡状物。LC-MS(保留时间：3.25分钟,方法B),MS m/z462(M+H),414(M-MeSH)。

步骤5

向冰冷的(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(甲基硫基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(267mg,0.578mmol)在乙腈(3mL)中的溶液中加入碘化三甲基甲硅烷(0.123mL,0.868mmol)。将形成的浅棕色溶液在室温搅拌2小时。用冰浴冷却，用MeOH淬灭。将最终的浅棕色溶液经制备性HPLC纯化，并将收集的馏分在Speed-Vac系统上蒸发，得到了预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(甲基硫基)吡咯烷-2-羧酸甲酯TFA盐(174mg,0.355mmol,61.3%的收率)，其为浅黄色固体。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm1.89(s,3H),2.96(dd,J=13.73,10.68Hz,1H),3.13(d,J=14.04Hz,1H),3.80(d,J=11.90Hz,1H),3.96(s,3H),4.03(d,J=11.90Hz,1H),4.76-4.81(m,1H),7.38(t,J=7.48Hz,1H),7.44-7.50(m,4H)7.65(d,J=8.24Hz,2H)7.70(d,J=7.63Hz,2H).LC-MS(保留时间：2.36分钟,方法B),MS m/z328(M+H)。

步骤6

向冰冷的(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(甲基硫基)吡咯烷-2-羧酸甲酯TFA盐(174mg,0.394mmol)、(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酸(100mg,0.434mmol)和HATU(225mg,0.591mmol)在DCM(5mL)中的浆液中加入N,N-二异丙基乙基胺(0.207mL,1.182mmol)。将形成的无色浆液在室温搅拌过夜。用DCM稀释，用5%枸橼酸淬灭。将有机层用0.1M NaOH和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，真空蒸发。将残留物经

柱纯化(用5～35%的EtOAc-己烷洗脱)，得到了预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(甲基硫基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(178mg,0.296mmol,75%的收率)，其为白色固体。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm1.12(s,9H),1.46(s,9H),1.86(s,3H),2.60(dd,J=12.97,6.87Hz,1H),2.90(dd,J=12.82,7.93Hz,1H),3.74(s,3H),4.11(d,J=11.29Hz,1H),4.35-4.48(m,2H),4.73(d,J=10.99Hz,1H),7.36(t,J=7.02Hz,1H),7.42-7.51(m,3H),7.54-7.71(m,5H).LC-MS(保留时间：3.34分钟,方法B),MS m/z541(M+H)。

步骤7

向(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(甲基硫基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(164mg,0.303mmol)在THF(2mL)和MeOH(2.000mL)中的溶液中加入预先制备的氢氧化锂一水合物(25.5mg,0.607mmol)在水(2mL)中的溶液。将所得的混浊溶液在室温搅拌过夜。用5%枸橼酸淬灭，用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，蒸发，，得到了预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(甲基硫基)吡咯烷-2-羧酸(136mg,0.232mmol,77%的收率)，其为白色泡沫状物。LC-MS(保留时间：3.25分钟,方法B),MS m/z527(M+H)。

步骤8

向冰冷的(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(甲基硫基)吡咯烷-2-羧酸(26mg,0.049mmol)、(1R,2S)-1-氨基-N-(环丙基磺酰基)-2-乙烯基环丙烷甲酰胺、对甲苯磺酸盐水合物(24.85mg,0.059mmol)和HATU(28.1mg,0.074mmol)在DCM(1mL)中的浆液中加入N,N-二异丙基乙基胺(0.026mL,0.148mmol)。将形成的无色浆液在室温搅拌过夜(其变为浅黄色溶液)。用DCM稀释，用5%枸橼酸淬灭。将分离的有机层用饱和枸橼酸钠和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，真空蒸发。将残留物经制备性HPLC纯化，得到了预期产物(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)-4-(甲基硫基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(18mg,0.024mmol,49.3%的收率)，其为白色固体。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm1.03-1.12(m,11H),1.25(d,J=3.36Hz,2H),1.43-1.48(m,1H),1.50(s,9H),1.88(dd,J=8.09,5.34Hz,1H),1.92(s,3H),2.16-2.27(m,1H),2.38(t,J=11.29Hz,1H),2.82(dd,J=11.90,6.10Hz,1H),2.90-2.99(m,1H),3.97-4.04(m,2H),4.48-4.53(m,1H),5.03(d,J=10.99Hz,1H),5.13(d,J=10.68Hz,1H),5.30(d,J=17.40Hz,1H),5.70-5.81(m,1H),7.37(t,J=7.02Hz,1H),7.46(t,J=7.48Hz,2H),7.57-7.64(m,4H),7.64-7.73(m,2H).LC-MS(保留时间：3.28分钟,方法B),MS m/z739(M+H)。

实施例9：化合物9

方案6

步骤1

在室温向(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-羟基吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(1.82g,4.22mmol)和2-丙硫醇(0.470mL,5.06mmol)在乙腈(20mL)中的澄清溶液中一次性加入三氟甲磺酸钪(III)固体(0.208g,0.422mmol)。将形成的粉红色溶液在此温度搅拌26小时。TLC分析显示起始物质完全消耗。用饱和氯化铵淬灭，用EtOAc萃取。将有机物用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，真空蒸发。将残留物经

柱纯化(用5～40%的EtOAc-己烷梯度洗脱)，得到了非对映异构体的混合物1.44g(70%)。将该油性混合物再次经

纯化(用0～20%的EtOAc-甲苯梯度洗脱)，得到了白色泡沫状的副产物(2S,4S)-4-(联苯-4-基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(1.05g,1.930mmol,45.8%的收率)和白色泡沫状的预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(450mg,0.827mmol,19.61%的收率)。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm0.96(d,J=6.71Hz,1.5H,旋转异构体),1.00(d,J=6.71Hz,1.5H,旋转异构体),1.07(d,J=7.02Hz,3H),2.48-2.57(m,1H),2.57-2.68(m,1H),2.97-3.07(m,1H),3.65(s,1.5H,旋转异构体),3.77(s,1.5H,旋转异构体),3.82-3.91(m,1H),4.26-4.42(m,2H),5.00-5.28(m,2H),7.25-7.72(m,14H).LC-MS(保留时间：3.39分钟,方法B),MS m/z490(M+H)。

步骤2

向冰冷的(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(372mg,0.760mmol)在乙腈(4mL)中的溶液中加入碘化三甲基甲硅烷(0.162mL,1.140mmol)。将形成的浅棕色溶液在室温搅拌2小时。用冰浴冷却，用MeOH淬灭。将最终的浅棕色溶液经制备性HPLC纯化。将收集的馏分在Speed-Vac系统上蒸发，得到了预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-2-羧酸甲酯TFA盐(259mg,0.496mmol,65.3%的收率)，其为棕色泡沫状物。LC-MS(保留时间：2.52分钟,方法B),MS m/z356(M+H)。

步骤3

向冰冷的(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-2-羧酸甲酯TFA盐(255mg,0.543mmol)、(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酸(138mg,0.597mmol)和HATU(309mg,0.814mmol)在DCM(8mL)中的浆液中加入N,N-二异丙基乙基胺(0.285mL,1.629mmol)。将形成的无色浆液在室温搅拌过夜。用DCM稀释，用5%枸橼酸淬灭。将有机层用0.1M NaOH和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，真空蒸发。将残留物经

柱纯化(用5～35%的EtOAc-己烷洗脱)，得到了预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(240mg,0.380mmol,69.9%的收率)，其为白色泡沫状物。¹HNMR(500MHz,MeOD)ppm1.06(d,3H),1.09-1.13(m,12H),1.48(s,9H),2.48(dd,J=12.82,8.24Hz,1H),2.53-2.62(m,1H),2.97(dd,J=12.51,7.63Hz,1H),3.73(s,3H),4.03(d,J=11.29Hz,1H),4.25(t,J=7.93Hz,1H),4.45(s,1H),4.88-4.91(m,1H),7.36(t,J=7.32Hz,1H),7.45(t,J=7.78Hz,2H),7.58-7.73(m,6H).LC-MS(保留时间：3.50分钟,方法B),MS m/z569(M+H)。

步骤4

向(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(208mg,0.366mmol)在THF(2mL)和MeOH(2.000mL)中的溶液中加入预先制备的氢氧化锂一水合物(30.7mg,0.731mmol)在水(2mL)中的溶液。将所得的混浊溶液在室温搅拌过夜。用5%枸橼酸淬灭，用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，蒸发，，得到了预期产物(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-2-羧酸(202mg,0.328mmol,90%的收率)，其为白色泡沫状物。LC-MS(保留时间：3.39分钟,方法B),MSm/z555(M+H)。

步骤5

向冰冷的(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-2-羧酸(28mg,0.050mmol)、(1R,2S)-1-氨基-N-(环丙基磺酰基)-2-乙烯基环丙烷甲酰胺pTSA,0.68H₂O(23.03mg,0.056mmol)和HATU(28.5mg,0.075mmol)在DCM(1mL)中的浆液中加入N,N-二异丙基乙基胺(0.035mL,0.202mmol)。将形成的浅棕色溶液在室温搅拌过夜。用EtOAc稀释，用5%枸橼酸和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，蒸发。将形成的残留物经制备性HPLC纯化，得到了预期产物(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(23mg,59%的收率)，其为白色固体。¹H NMR(500MHz,MeOD)ppm1.03-1.07(m,3H),1.09–1.12(m,11H),1.21-1.28(m,4H),1.40-1.51(m,2H),1.52(s,9H),1.87(dd,J=7.93,5.49Hz,1H),2.20(q,J=8.85Hz,1H),2.30(t,J=11.60Hz,1H),2.54-2.62(m,1H),2.81(dd,J=12.05,6.26Hz,1H),2.90-2.98(m,1H),3.87(dd,J=10.99,6.41Hz,1H),3.97(d,J=10.99Hz,1H),4.51(d,J=9.77Hz,1H),5.08-5.19(m,2H),5.29(d,J=17.09Hz,1H),5.69-5.81(m,1H),7.37(t,J=7.32Hz,1H),7.46(t,J=7.78Hz,2H),7.60(dd,J=10.68,7.93Hz,4H),7.71(d,J=8.55Hz,2H).LC-MS(保留时间：3.42分钟,方法B),MSm/z767(M+H)。

实施例10：化合物10

方案7

步骤1

将4.0M HCl在二噁烷(3.1mL,12.47mmol)中的溶液加至(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(155mg,0.202mmol)中并在室温搅拌2小时。将反应混合物浓缩并真空干燥，得到了预期产物(2S,4R)-1-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-4-(联苯-4-基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-2-甲酰胺盐酸盐(141mg,0.180mmol,89%的收率)，其为浅黄色粉末状物。LC-MS(保留时间：2.77分钟,方法B),MS m/z667(M+H)。

步骤2

在0℃向(2S,4R)-1-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-4-(联苯-4-基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-2-甲酰胺盐酸盐(14mg,0.020mmol)和碳酸1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-基酯·吡啶-2-酯(7.44mg,0.030mmol)在THF(1mL)中的浆液中逐滴加入N,N-二异丙基乙基胺(0.014mL,0.080mmol)。将形成的浅黄色溶液在室温搅拌过夜。用EtOAc稀释，用5%枸橼酸和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤。将滤液真空浓缩。将白色残留物经制备性HPLC纯化，得到了预期产物(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸1,1,1-三氟-2-甲基丙-2-酯(11mg,0.013mmol,65.3%的收率)，其为白色固体。¹H NMR(500MHz,MeOD)ppm0.99-1.15(m,13H)1.15-1.34(m,6H)1.36-1.50(m,1H)1.72(dd,J=12.36,6.26Hz,5H)1.80-1.94(m,1H)2.15-2.23(m,1H)2.26-2.38(m,1H)2.49-2.63(m,1H)2.86(宽单峰,1H)2.93(td,J=8.32,4.12Hz,1H)3.84-3.92(m,1H)3.93-4.03(m,1H)4.46-4.54(m,1H)4.60(d,J=6.41Hz,2H)5.02-5.18(m,2H)5.20-5.35(m,1H)5.65-5.82(m,1H)7.37(t,J=7.32Hz,1H)7.41-7.53(m,3H)7.55-7.66(m,4H)7.66-7.77(m,2H).LC-MS(保留时间：3.47分钟,方法B),MS m/z821(M+H)。

实施例11：化合物11

在0℃向(2S,4R)-1-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-4-(联苯-4-基)-N-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-2-甲酰胺盐酸盐(14mg,0.020mmol)和碳酸1-甲基环戊酯·吡啶-2-酯(13.21mg,0.060mmol)在THF(1mL)中浆液中逐滴加入N,N-二异丙基乙基胺(0.017mL,0.100mmol)。将形成的浅黄色溶液在室温搅拌过夜。用EtOAc稀释，用5%枸橼酸和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤。将滤液真空浓缩。将白色残留物经制备性HPLC纯化，得到了预期产物(S)-1-((2S,4R)-4-(联苯-4-基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)-4-(异丙基硫基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸1-甲基环戊酯(8.5mg,10.40μmol,52.2%的收率)，其为白色固体。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm0.98-1.17(m,14H)1.24(t,J=6.10Hz,5H)1.44(dd,J=9.46,5.19Hz,1H)1.58-1.83(m,9H)1.88(dd,J=7.93,5.49Hz,1H)2.06-2.39(m,4H)2.54-2.66(m,1H)2.82(dd,J=11.75,5.95Hz,1H)2.89-3.01(m,1H)3.80-3.94(m,1H)3.92-4.04(m,1H)4.47-4.58(m,1H)4.58-4.66(m,1H)5.13(d,J=10.07Hz,2H)5.23-5.37(m,1H)5.75(dt,J=17.17,9.58Hz,1H)6.90-7.03(m,1H)7.33-7.43(m,1H)7.46(t,J=7.63Hz,2H)7.56-7.68(m,4H)7.71(d,J=8.55Hz,2H)。

实施例12：化合物12

方案8

步骤1

在室温向(2S,4R)-4-(联苯-4-基)-4-羟基吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(6.48g,15.02mmol)和丙-2-烯-1-硫醇(3.18g,30.0mmol)在乙腈(70mL)中的澄清溶液中一次性加入三氟甲磺酸钪(III)固体(0.739g,1.502mmol)。将形成的粉红色溶液在此温度搅拌20小时。LC/MS和TLC分析显示起始物质完全消耗且预期产物形成。用饱和氯化铵淬灭，用EtOAc萃取。将有机物用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，真空蒸发。将残留物经

柱纯化(用5%～50%的EtOAc-己烷洗脱)，得到了混合物和非对映异构体(2.88g,79%)和起始物质(0.600g,18%)。将该混合物再次经

柱纯化(用2%～8%的EtOAc-甲苯洗脱)，得到了粘稠、油状的预期产物(2S,4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(1.85g,3.41mmol,22.74%的收率)和粘稠、油状的不预期的非对映异构体和一些重叠的馏分(1.80g)。¹H NMR(500MHz,氯仿-d)δppm2.59-2.75(m,1H)2.77-2.94(m,3H)3.55,3.80(s,3H)3.92(d,J=11.60Hz,1H)4.19-4.31(m,1H)4.35-4.50(m,1H)4.89-5.07(m,3H)5.09-5.25(m,2H)5.51-5.76(m,1H)5.63(ddd,J=17.01,9.69,7.17Hz,1H)7.22-7.41(m,7H)7.40-7.49(m,3H)7.48-7.66(m,12H)7.49-7.66(m,4H).LC-MS(保留时间：3.32分钟,方法A),MS m/z488(M+H)。

步骤2

向冰冷的(2S,4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)吡咯烷-1,2-二羧酸1-苄酯·2-甲酯(1.85g,3.79mmol)在乙腈(20mL)中的溶液中加入碘化三甲基甲硅烷(0.810mL,5.69mmol)。将形成的浅棕色溶液在室温搅拌2小时。用冰浴冷却，用甲醇(7.68mL,190mmol)淬灭。将形成的浅棕色溶液经制备性HPLC纯化，并将收集的馏分在Speed-Vac系统上蒸发。将黄色残留物吸收在DCM中，用饱和Na₂CO₃和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，真空蒸发，得到了预期产物(2S,4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(664mg,1.878mmol,49.5%的收率)，其为粘稠的油状物。¹H NMR(500MHz,MeOD)δppm2.93-3.08(m,3H)3.11-3.20(m,1H)3.77-3.88(m,1H)3.92-3.99(m,3H)4.04(d,J=12.21Hz,1H)4.72-4.80(m,1H)5.02(d,J=9.77Hz,1H)5.09(dd,J=16.94,1.37Hz,1H)5.54-5.70(m,1H)7.35-7.42(m,1H)7.43-7.56(m,4H)7.60-7.68(m,2H)7.69-7.77(m,2H).LC-MS(保留时间：2.21分钟,方法A),MS m/z354(M+H)。

步骤3

向(2S,4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(355mg,1.004mmol)、(S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酸(256mg,1.105mmol)和HATU(573mg,1.506mmol)在DCM(10mL)中的浆液中加入N,N-二异丙基乙基胺(0.526mL,3.01mmol)。将形成的溶液在室温搅拌过夜。用1M HCl、1M NaOH和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，蒸发。将残留物经

柱纯化(用5%～50%的丙酮-己烷梯度洗脱)，得到了预期产物(2S,4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(416mg,0.661mmol,65.8%的收率)，其为白色泡沫状物。¹HNMR(500MHz,MeOD)

ppm1.10(s,8H)1.41-1.54(m,9H)2.54(dd,J=12.80,7.78Hz,1H)2.85-3.02(m,3H)3.63-3.80(m,3H)4.00-4.13(m,1H)4.30(t,J=7.65Hz,1H)4.37-4.49(m,1H)4.92-5.14(m,2H)5.63-5.79(m,1H)7.30-7.39(m,1H)7.44(t,J=7.53Hz,2H)7.56-7.70(m,6H).LC-MS(保留时间：3.09分钟,方法B),MS m/z567(M+H)。

步骤4

向(2S,4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)吡咯烷-2-羧酸甲酯(362mg,0.639mmol)在THF(5mL)和MeOH(5.00mL)中的溶液中加入预先制备的氢氧化锂水合物(80mg,1.916mmol)在水(5mL)中的溶液。将所得的混浊溶液在室温搅拌24小时。用5%枸橼酸淬灭，用EtOAc萃取。将有机层用盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，蒸发，，得到了预期产物(2S,4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)吡咯烷-2-羧酸(312mg,0.553mmol,87%的收率)，其为白色固体。LC-MS(保留时间：2.96分钟,方法B),MS m/z553(M+H)。

步骤5

向(2S,4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)-1-((S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-3,3-二甲基丁酰基)吡咯烷-2-羧酸(16mg,0.029mmol)、(1R,2S)-1-氨基-N-(环丙基磺酰基)-2-乙烯基环丙烷甲酰胺pTSA,0.68H₂O(15.01mg,0.036mmol)和HATU(16.51mg,0.043mmol)在DCM(1mL)中的浆液中加入N,N-二异丙基乙基胺(0.025mL,0.145mmol)。将形成的溶液在室温搅拌过夜。用DCM稀释，用1M HCl和盐水洗涤，经MgSO₄干燥，过滤，蒸发。将残留物经

柱纯化(用5%～50%的丙酮-己烷梯度洗脱)，得到了预期产物(S)-1-((2S,4R)-4-(烯丙基硫基)-4-(联苯-4-基)-2-((1R,2S)-1-(环丙基磺酰基氨基甲酰基)-2-乙烯基环丙基氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁-2-基氨基甲酸叔丁酯(13mg,0.016mmol,55.2%的收率)，其为白色泡沫状物。¹H NMR(500MHz,MeOD)

ppm0.99-1.15(m,10H)1.24(d,J=4.52Hz,2H)1.42(dd,J=9.41,5.40Hz,1H)1.49(s,9H)1.86(dd,J=8.03,5.52Hz,1H)2.19(q,J=8.78Hz,1H)2.34(t,J=11.54Hz,1H)2.81(dd,J=12.17,6.40Hz,1H)2.87-3.07(m,3H)3.89(dd,J=10.54,6.27Hz,1H)3.97(d,J=11.04Hz,1H)4.48(d,J=9.79Hz,1H)4.97-5.15(m,4H)5.27(d,J=17.07Hz,1H)5.64-5.88(m,2H)6.75(d,J=9.79Hz,1H)7.30-7.40(m,1H)7.45(t,J=7.53Hz,2H)7.54-7.63(m,4H)7.64-7.74(m,2H).LC-MS(保留时间：3.00分钟,方法B),MS m/z765(M+H)。

对于方法A的LC/MS条件：

起始%B=0

最终%B=100

梯度时间=3分钟

停止时间=4分钟

流速=4ml/min

波长=220

溶剂A=90%水-10%甲醇-0.1%TFA

溶剂B=10%水-90%甲醇-0.1%TFA

柱3=(3)

-LUNA4.6x50mm S10

对于方法B的LC/MS条件：

起始%B=30

最终%B=100

梯度时间=3分钟

停止时间=4分钟

流速=4ml/min

波长=220

溶剂A=90%水-10%甲醇-0.1%TFA

溶剂B=10%水-90%甲醇-0.1%TFA

柱3=(3)

-LUNA4.6x50mm S10

生物学研究

在本发明中使用HCV NS3/4A蛋白酶复合酶测定和基于细胞的HCV复制子测定，并如下制备、进行和验证：

重组体HCV NS3/4A蛋白酶复合物的生成

来自BMS株、H77株或J4L6S株的HCV NS3复合物如下所述生成。生成这些经纯化的重组体蛋白质以在均质测定(见下)中使用以提供对本发明化合物如何在抑制HCV NS3蛋白水解活性中发挥作用的说明。

来自HCV-感染患者的血清由Dr.T.Wright,San Francisco Hospital获得。HCV基因组(BMS株)的加工全长cDNA(互补脱氧核糖核酸)模板由经血清RNA(核糖核酸)的逆转录-PCR(RT-PCR)得到的DNA片段且使用基于其它基因型1a株之间的同源性所选择的引物来构建。由完全基因组序列的确定，根据Simmonds等(参见Simmonds,P.等,J.Clin.Microbiol.,31(6),1493-1503(1993))的分类将基因型1a归属为HCV隔离群。非结构区的氨基酸序列NS2-5B显示为与HCV基因型1a(H77)>97%相同且与基因型1b(J4L6S)87%相同。易感染的无性繁殖系H77(1a基因型)和J4L6S(1b基因型)由R.Purcell(NIH)获得且序列在

(AAB67036,参见Yanagi,M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94(16):8738-8743(1997)；AF054247,参见Yanagi,M.等,Virology,244(1):161-172(1998))中公开。

H77和J4L6S株用于生成重组体NS3/4A蛋白酶复合物。对于这些株而言，DNA编码的重组体HCV NS3/4A蛋白酶复合物(氨基酸1027至1711)如经P.Gallinari等所述进行(参见Gallinari,P.等,Biochemistry,38(17):5620-5632(1999)。简单来说，在NS4A编码区域的3'-末端加入三赖氨酸增溶尾部。将在NS4A-NS4B断裂位点的P1位置上的半胱氨酸(氨基酸1711)变为甘氨酸以避免赖氨酸标记的溶蛋白性裂解。此外，通过在氨基酸位置1454的PCR而引入半胱氨酸至丝氨酸的突变以防止在NS3解螺旋酶区域的自溶性裂解。按照有修改的P.Gallinari等所述的规程(参见Gallinari,P.等,J.Virol.,72(8):6758-6769(1998))，变体DNA片段在pET21b细菌表达载体(Novagen)中克隆并且NS3/4A复合物在Escherichia.coli菌株BL21(DE3)(Invitrogen)中表达。简单来说，将NS3/4A蛋白酶复合物表达用0.5毫摩尔(mM)异丙基-β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在20℃诱导22小时(h)。典型的发酵(1升(L))生成约10克(g)湿的细胞团块(cell paste)。将细胞在含有25mM N-(2-羟基乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES),pH7.5、20%甘油、500mM氯化钠(NaCl)、0.5%Triton X-100、1微克/毫升("μg/mL")溶菌酶、5mM氯化镁(MgCl₂)、1μg/ml DnaseI、5mMβ-巯基乙醇(βME)、蛋白酶抑制剂-游离的乙二胺四乙酸(EDTA)(Roche)的裂解缓冲液(10mL/g)中重新混悬，匀浆并在4℃孵育20分钟(min)。通过在4℃和235000g超速离心1小时对匀浆物进行超声并变为澄清。将咪唑加至上清液中，得到了最终浓度为15mM并将pH调节为8.0。将粗蛋白萃取物载入到用缓冲液B(25mM HEPES,pH8.0、20%甘油、500mM NaCl、0.5%Triton X-100、15mM咪唑、5mMβME)预先平衡的次氮基三乙酸镍(Ni-NTA)柱上。将样品以1mL/min的流速载入。将柱用15倍柱体积的缓冲液C(与缓冲液B相同，除了0.2%Triton X-100之外)洗涤。将蛋白用5倍柱体积缓冲液D(与缓冲液C相同，除了200mM咪唑之外)洗脱。

收集含有NS3/4A蛋白酶复合物的馏分并载入到用缓冲液D(25mMHEPES,pH7.5、20%甘油、300mM NaCl、0.2%Triton X-100、10mMβME)预先平衡的脱盐柱Superdex-S200。将样品以1mL/min的流速载入。收集含有NS3/4A蛋白酶复合物的馏分并浓缩为约0.5mg/ml。来源于BMS、H77和J4L6S株的NS3/4A蛋白酶复合物的纯度经SDS-PAGE和质谱法分析鉴定为大于90%。将酶在-80℃保存，使用前在冰上解冻并在测定缓冲液中稀释。

FRET肽测定以监控HCV NS3/4A蛋白水解活性

该体外测定的目的是测量本发明化合物对如上所述的来源于BMS株、H77株或J4L6S株的HCV NS3蛋白酶复合物的抑制。该测定提供了对本发明化合物如何在抑制HCV NS3蛋白水解活性中发挥作用的说明。

为了监控HCV NS3/4A蛋白酶活性，使用NS3/4A肽底物。底物为经Taliani等在Anal.Biochem.240(2):60-67(1996)中所述的RET S1(共振能量传递缩肽底物(Resonance Energy Transfer Depsipeptide Substrate)；AnaSpec,Inc.目录号22991)(FRET肽)。该肽的序列不精确地基于对于HCV NS3蛋白酶的NS4A/NS4B天然断裂位点，除了在断裂位点存在酯链而不是酰胺键之外。该肽也含有荧光供体EDANS(邻近于肽的一末端)以及荧光受体DABCYL(邻近另一末端)。肽的荧光被在供体和受体之间的分子间共振能量传递(RET)所淬灭，但由于NS3蛋白酶使所述肽断裂，产物由于RET的淬灭而释放并且供体的荧光变得明显。

在缺失或存在本发明化合物的情况下，将肽底物与三个重组体NS3/4A蛋白酶复合物中的一个培养。化合物的抑制作用通过使用

Series4000实时监控荧光反应产物的形成来确定。

试剂如下：HEPES和Glycerol(Ultrapure)获自GIBCO-BRL。二甲基亚砜(DMSO)获自Sigma。β-巯基乙醇获自Bio Rad。

测定缓冲液：50mM HEPES,pH7.5；0.15M NaCl；0.1%Triton；15%甘油；10mMβME。底物：2μM终浓度(由在-20℃保存的2mM的DMSO储备溶液)。HCV NS3/4A蛋白酶型1a(1b),2-3nM终浓度(由5μM储备溶液(在25mM HEPES中),pH7.5、20%甘油、300mM NaCl、0.2%Triton-X100、10mMβME)。对于具有接近测定极限的效能的化合物，通过将50μg/ml牛血清白蛋白(Sigma)加至测定缓冲液中并将末端蛋白酶浓度减少至300pM来使测定变得更加灵敏。

测定在来自Falcon的96-孔聚苯乙烯黑色板中进行。每孔含有在测定缓冲液中的25μl NS3/4A蛋白酶复合物、在10%DMSO/测定缓冲液中的50μl本发明的化合物和在测定缓冲液中的25μl底物。对照(无化合物)也在相同的测定板中制备。将酶复合物与化合物或对照溶液混合1分钟，之后通过加入底物开始酶促反应。立即使用

Series4000(PerspectiveBiosystems)读取测定板。设定仪器以在25℃读取340nm的发射波长和490nm的激发波长。反应通常进行约15分钟。

使用下述等式计算抑制百分数：

100-[(δF_inh/δF_con)x100]

其中δF为在曲线的线性范围内的荧光的变化。对抑制-浓度数据应用非线性曲线拟合，并通过使用Excel XLfit软件使用下述等式计算50%有效抑制浓度(IC₅₀)：y=A+((B-A)/(1+((C/x)^D)))。

发现所有测试的化合物抑制NS3/4A蛋白酶复合物的活性，其具有73nM或更小的IC50。此外，发现用多于一种类型的NS3/4A复合物测试的本发明化合物具有类似的抑制特性，尽管一致证实相比于1a株，化合物具有对1b株的更大的效能。

特异性测定

进行特异性测定以证实相比于抑制其它丝氨酸蛋白酶或半胱氨酸蛋白酶，本发明化合物在抑制HCV NS3/4A蛋白酶复合物中的体外选择性。

本发明化合物的特异性在多种丝氨酸蛋白酶(人中性白细胞弹性蛋白酶(HNE)、猪胰弹性蛋白酶(PPE)和人胰糜蛋白酶)和一种半胱氨酸蛋白酶(人肝脏组织蛋白酶B)中确定。在所有情况下，如前所述(PCT专利申请WO00/09543)使用对于丝氨酸蛋白酶测定具有一些修改的96孔板格式规程，其使用对于每个酶特异的荧光氨基-甲基-香豆素(AMC)底物。所有酶购自Sigma、EMDbiosciences，而底物来自Bachem、Sigma和EMDbiosciences。

根据它们的效能，化合物浓度由100至0.4μM变化。酶测定各自通过如下开始：将底物加至在室温预先孵育10分钟的酶抑制剂中并水解至如在测量的15%转化。

每个测定的最终条件如下：

50mM三(羟基甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)pH8、0.5M硫酸钠(Na₂SO₄)、50mM NaCl、0.1mM EDTA、3%DMSO、0.01%吐温-20与5μMLLVY-AMC和1nM糜蛋白酶。

50mM Tris-HCl,pH8.0、50mM NaCl、0.1mM EDTA、3%DMSO、0.02%吐温-20、5μM琥珀酸盐-AAPV-AMC和20nM HNE或8nM PPE；

100mM NaOAC(乙酸钠)pH5.5、3%DMSO、1mM TCEP(三(2-羧基乙基)膦盐酸盐)、5nM组织蛋白酶B(在使用前酶储备液在含有20mM TCEP的缓冲液中活化)和在H₂O中稀释的2μM Z-FR-AMC。

使用下式计算抑制百分数：

[1-((UV_inh-UV_blank)/(UV_ctl-UV_blank))]x100

对抑制-浓度数据应用非线性曲线拟合，并通过使用Excel XLfit软件计算50%有效抑制浓度(IC₅₀)。

HCV复制子的生成

HCV复制子全细胞系统如经Lohmann V.等,Science285(5424):110-113(1999)所述建立。该系统使人们能够评价本申请的HCV蛋白酶化合物在HCV RNA复制中的作用。简单来说，使用在Lohmann论文(Accession号：AJ238799)中描述的HCV株1b序列，HCV cDNA经Operon Technologies,Inc.(Alameda,CA)合成，然后使用标准分子生物学技术将全长复制子整合到质粒pGem9zf(+)(Promega,Madison,WI)中。复制子包括(i)与衣壳蛋白的前12个氨基酸融合的HCV5’UTR，(ii)新霉素磷酸转移酶基因(neo)，(iii)来自脑炎心肌炎病毒(EMCV)的IRES和(iv)HCV NS3至NS5B基因和HCV3’UTR。质粒DNAs用ScaI线性化并且RNA转录物使用T7MegaScript转录试剂盒(Ambion,Austin,TX)根据厂商指南在体外合成。将cDNA的体外转录物转染到人肝瘤细胞系HUH-7中。对于细胞组成性表达HCV复制子的选择在可选标记新霉素(G418)的存在下实现。对所得的细胞系进行关于随时间推移的正链和负链RNA生成和蛋白生成的表征。

HCV复制子FRET测定

进行HCV复制子FRET测定以监控本发明化合物对HCV病毒复制的抑制作用。组成性表达HCV复制子的HUH-7细胞在含有10%胎牛血清(FCS)(Sigma)和1mg/ml G418(Gibco-BRL)的达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle Media,DMEM)(Gibco-BRL)中生长。在前一天夜间将细胞接种(1.5x10⁴细胞/孔)在96孔组织培养无菌板中。化合物和无化合物的对照在稀释板中在含有4%FCS、1:100的青霉素/链霉素(Gibco-BRL)、1:100的L-谷氨酰胺和5%DMSO(在测定中0.5%DMSO最终浓度)的DMEM中制备。将化合物/DMSO混合物加至细胞中并在37℃培养4天。在4天后，使用alamar Blue(Trek Diagnotstic系统)读取CC₅₀首次评估细胞的细胞毒性。通过将1/10^th体积的alamar Blue加至孵育细胞的培养基中来确定化合物的毒性(CC₅₀)。在4小时后，使用

Series4000(PerspectiveBiosystems)读取各孔的荧光信号，激发波长为530nm且发射波长为580nm。然后将板用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(3次150μl)充分淋洗。将细胞用含有HCV蛋白酶底物(将5X细胞萤光素酶细胞培养裂解试剂(

#E153A)用蒸馏水稀释为1X，加入NaCl至最终的150mM，由2mM储备液在100%DMSO中的溶液将FRET肽底物(如上酶测定中所述)稀释为最终的10μM)的25μl裂解测定试剂裂解。然后将板置于

4000仪器中，所述仪器已设定为340nm激发波长/490nm发射波长，21个周期的自动化模式并在动力学模式中读取板。EC₅₀确定如IC₅₀确定所述来进行。

HCV复制子萤光素酶报告子测定

作为第二测定，由复制子FRET测定的EC50确定在复制子萤光素酶报告子测定中证实。复制子萤光素酶报告子测定的使用首先经Krieger等描述(Krieger,N.等,J.Virol.,75(10):4614-4624(2001))。所述的用于本申请FRET测定的复制子结构通过插入编码人化形式的Renilla萤光素酶基因的cDNA和与萤光素酶基因的3’-末端直接融合的连接子序列来进行修饰。使用位于核芯、新霉素标记基因的直接上游区的Asc1限制位点将该插入片段引入到复制子结构中。也引入了在位置1179(丝氨酸至异亮氨酸)的适应性突变(Blight,K.J.等,Science,290(5498):1972-1974)。组成性表达HCV复制子结构的稳定细胞系如上得到。建立如对于HCV复制子FRET测定所述具有下述修改的萤光素酶报告子测定。在37℃/5%CO₂培养箱中孵育4天后，使用Promega

萤光素酶测定系统分析细胞的Renilla萤光素酶活性。将培养基(100μl)从含有细胞的各孔中除去。向残留的50μl培养基中加入50μl

萤光素酶试剂，并将板在室温振摇10分钟至2小时。然后将

Stop & Glo试剂(50μl)加至各孔中，并将板在室温再次振摇额外的10分钟至2小时。使用发光程序在PackardNXT上读取板。

使用下式计算抑制百分数：

使用XLfit对值作图和分析，得到了EC₅₀值。

在HCV酶测定、HCV复制子细胞测定中和/或在几个阐述的特异性测定中评价本发明的代表性化合物。例如，在酶测定中发现化合物1具有对NS3/4A BMS株的4.6纳摩尔浓度(nM)的IC₅₀。类似的效能值由公开的H77(1.7nM的IC₅₀)和J4L6S(1.1nM的IC₅₀)株获得。EC₅₀值在复制子FRET测定中为7.3nM且在复制子萤光素酶测定中为6.0nM。

在特异性测定中，发现相同的化合物具有下述活性：HLE>12.1μM；PPE>25μM；糜蛋白酶=13.2μM；组织蛋白酶B=7.5μM。这些结果表明该化合物家族对于NS3蛋白酶高度特异且许多这些化合物抑制HCV复制子的复制。

测试了本发明化合物且发现其具有如下活性：

IC₅₀活性范围(NS3/4A BMS株)：A为>0.2μM；B为0.02-0.2μM；C为1-20nM。

EC₅₀活性范围(对于测试的化合物)：A为>1μM；B为0.1-1μM；C为6-100nM。

表2

实施例编号	IC50	EC50
			1	3.0nM	7.2-22nM
2	C	C
			3	1.0nM	6.6nM

4	C	C
			5	C	C
6	2.0nM	18-36nM
			7	C	C
8	C	C
			9	C	C
10	C	C
			11	C	C
12	C	C

本领域技术人员应该明白的是，本发明不限于前述示例性实施例，并且在不背离本发明基本属性的情况下本发明可按其它具体形式来实施。因此期望的是，所述实施例在各方面都应该被视为示例性的而非限制性的，应该参考所附的权利要求书而不是前述实施例，并且落入所述权利要求书的等价意义和范围内的所有变化形式都应该包括在本发明的范围内。

Claims

1.化合物或其药用盐，所述化合物选自

和

2.一种组合物，其包含权利要求1的化合物或其药用盐以及药用载体。

3.权利要求2的组合物，其还包含至少一种具有抗HCV活性的额外化合物。

4.权利要求3的组合物，其中所述额外化合物中的至少一种为干扰素或利巴韦林。

5.权利要求4的组合物，其中所述干扰素选自干扰素α2B、PEG化的干扰素α、复合干扰素和干扰素α2A。

6.权利要求3的组合物，其中所述额外化合物中的至少一种选自白细胞介素2、白细胞介素6、白细胞介素12、干扰RNA、反义RNA、咪喹莫特、利巴韦林、5’-单磷酸肌苷脱氢酶抑制剂、金刚烷胺和金刚乙胺。

7.权利要求3的组合物，其中所述额外化合物中的至少一种对抑制靶标的功能以治疗HCV感染是有效的，所述靶标选自HCV金属蛋白酶、HCV丝氨酸蛋白酶、HCV聚合酶、HCV解螺旋酶、HCV NS4B蛋白、HCV进入、HCV组装、HCV释出、HCV NS5A蛋白和IMPDH。

8.权利要求1的化合物或其药用盐在制备在患者中治疗HCV感染的药物中的用途。