CN101103115A - 表达齿斑葡聚糖蔗糖酶并合成改性淀粉的转化植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经基因修饰的植物细胞和植物，其中该基因修饰在此类植物细胞和植物的质体中引起具有齿斑葡聚糖蔗糖酶活性的酶表达。此外，本发明还涉及用于制造此类植物细胞和植物的手段及方法。这种类型的植物细胞和植物合成改性淀粉。本发明因此还涉及由本发明的植物细胞和植物合成的淀粉及用于产生该淀粉的方法和这种改性淀粉的淀粉衍生物的制造。

Description

表达齿斑葡聚糖蔗糖酶并合成改性淀粉的转化植物
本发明涉及经基因修饰的植物细胞和植物，其中该基因修饰在此类植物细胞和植物的质体中引起具有齿斑葡聚糖蔗糖酶活性的酶表达。此外，本发明还涉及用于制造此类植物细胞和植物的手段及方法。这种类型的植物细胞和植物合成改性淀粉。本发明因此还涉及由本发明的植物细胞和植物合成的淀粉及用于产生该淀粉的方法，以及这种改性淀粉的淀粉衍生物的制造。
鉴于近来赋予植物成分作为原料的可再生来源的重要性日益增长，生物技术研究的任务之一是努力调整植物原料以适应加工工业需要。为了在尽可能多的应用领域内能够使用再生性原料，得到非常多样的材料更重要。除油、脂和蛋白质以外，多糖构成源自植物的主要再生性原料。除纤维素之外，淀粉在多糖中占据重要地位，因为其为高等植物中量最多的贮藏物质之一。
淀粉在绿叶叶绿体内(暂存淀粉)以及块茎、根和种子的造粉体内(贮藏淀粉)作为颗粒沉积(Kossmann和Lloyd 2000)。
淀粉多糖是由化学上均一的基本成分即葡萄糖构成的聚合物。然而，淀粉组成来自多种类型分子的高度复杂的混合物，这些分子在其葡萄糖链的聚合程度以及分支程度上彼此不同。因此，淀粉不是均一的原料。人们尤其将其区分为直链淀粉和支链淀粉，前者是由α-1，4-糖苷分支的葡萄糖分子组成的基本上不分支的聚合物，后者则是多种分支的葡萄糖链的复杂混合物。分支因源于额外的α-1，6-糖苷键。
在植物贮藏器官中，淀粉的生物合成在造粉体内发生并且是不同反应如合成(葡萄糖残基的聚合)、重排和降解的结果，在其中多种淀粉合成酶(E.C.2.4.1.21)、转移酶(分支酶(E.C.2.4.1.18)及岐化酶(E.C.2.4.1.25))以及水解酶(去分枝酶(E.C.3.2.1.41))分别起重要作用。
为了能够尽可能拓宽淀粉的用途，提供能够合成特别适合于多种用途的改性淀粉的植物似乎受到欢迎。除了育种方法以外，提供这种植物的另一种可能是通过重组DNA技术对淀粉生产植物的淀粉代谢进行特定的基因修饰。
已经开展数项研究多年，其目的是将造粉体变成更为通用的多糖工厂。为此目的，已经为数种微生物酶配备了质体靶向性转运肽，并且已经研究这些酶对淀粉结构和功能性的影响。
某些细菌拥有称作葡聚糖蔗糖酶的一系列酶，其可以附加(连续的)1，6-连接的或1，3-连接的葡萄糖残基至麦芽糖糊精。除少数例外之外，葡聚糖蔗糖酶是胞外酶，由乳酸细菌如肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)菌株、口腔链球菌(Streptococci)以及乳酸杆菌(Lactobacillus)和乳酸球菌(Lactococcus)的某些种产生(Robyt 1995；van Geel-Schutten等1999)。此外，它们可由其它细菌产生，如奈瑟氏菌(Neisseria)菌株的某些种(Hehre等1949)。这些菌株在自然界中参与不同的过程。某些菌株定居在人和动物的口腔并能够引起牙龋形成。其它菌株可以侵入喉部，如共生的奈瑟氏菌种。某些乳酸杆菌属物种增加发酵乳的黏度(de Vuyst和Degeest 1999)。
葡聚糖蔗糖酶催化来自蔗糖的葡萄糖残基聚合，这导致产生具有不同大小和结构以及由多样键型组成的一大类多样的α-葡聚糖。
与通过淀粉合成酶的延伸相比，葡聚糖链通过葡聚糖蔗糖酶的延伸非常不同。首先，优选的底物是蔗糖而非ADP-葡萄糖。其次，葡萄糖残基通过所谓的两位点插入机制添加至正在生长的葡聚糖链的还原性末端(Robyt 1995)。
此外，葡聚糖的分支不象在淀粉生物合成中那样通过分枝酶发生，而是通过由葡聚糖蔗糖酶自身催化的所谓接纳体反应发生(Robyt，1995)。葡聚糖蔗糖酶被认为含有可结合接纳体分子，如新生葡聚糖链或麦芽糖糊精的接纳体结合位点(Su和Robyt，1994)。然而，催化接纳体反应，尤其是具有淀粉聚合物或麦芽糖糊精的接纳体反应的效率仍不可预测，因为不了解并且很少记录构成纳体反应基础的结构-功能关系。然而，接纳体相对效率似乎取决于接纳体分子的大小(Fu等1990)，并且对支链淀粉和直链淀粉可以作为葡聚糖蔗糖的接纳体分子不确定。
葡聚糖蔗糖酶可以根据所形成葡聚糖的结构以及特别根据所合成糖苷键的性质和频率进行分类。
在蔗糖存在下，由口腔生龋性汗毛链球菌(Streptococcus downei)MFe28细菌产生的GTFI(EC 2.4.1.5)齿斑葡聚糖蔗糖酶(Ferretti等，1987)的表达导致称作齿斑葡聚糖的葡聚糖聚合物的积累。齿斑葡聚糖聚合物主要由α-(1→3)糖苷键组成，具有少量α-(1→6)分枝点。由于其主链中α-(1→3)连接的葡萄糖残基比例高(88％)，齿斑葡聚糖聚合物呈水不溶性，而侧链中α-(1→6)连接的葡萄糖残基(12％)促成其黏附特性。
齿斑葡聚糖聚合物占齿菌斑中存在糖类的大约70％(Loesche，1986)，引起多种细菌性致病因的作用。简而言之，称为早期定居者的多种口腔细菌通过黏附素蛋白黏着至牙齿表面存在的受体，从而定居于唾液包被的釉质表面。随后这些细菌分泌出表现不同程度水溶性的多种多糖，如齿斑葡聚糖、葡聚糖和果聚糖(Sutherland，2001)。这些聚合物与早期定居者一起增强产生生物膜的晚期定居者侵入，该生物膜通常称作齿菌斑(Marsh，2003)。在形成的聚合物中，齿斑葡聚糖最粘稠并且是水不溶性的聚合物。
由于GTFI参与人牙龋，已经开展了基于GTFI基因工程的不同研究以便阐明其结构-功能关系。有趣的是，仅表达GTFI催化域即产生活性GTFI酶，其活性大约是70％(Monchois等，1999b)。
来自汗毛链球菌Mfe28细菌的gtfI基因的核酸序列已经在Ferreti等，1987，J.of Bacteriology，第4271-4278页中报道。
淀粉聚合物修饰已经通过将大肠杆菌(Escherichia coli)糖原合酶(GLGA)和糖原分枝酶(GLGB)靶向至马铃薯造粉体得到实现(Shewmaker等1994；Kortstee等1996)。在两个例子中，链的延伸和分支的天然平衡被破坏，产生具有改变的物理特性以及具有分支度更高的聚合物的淀粉颗粒。
附着新的糖残基至淀粉聚合物也已经成为目标。为此目的，将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶(E.C.2.4.1.10)导入马铃薯块茎造粉体(Gerrits等2001)。果聚糖蔗糖酶可以使供体底物蔗糖的果糖部分聚合为高分子量的果聚糖。然而，淀粉产量受到严重影响并且淀粉形态学发生极大改变。
已经试验将植物中的淀粉转化为高价值环状寡糖，环状寡糖可以在其非极性空腔内容纳疏水物质并且可以应用于多个食品和药品应用中。将来自肺炎克雷伯氏菌的环糊精糖基转移酶(CGT酶；E.C.2.4.1.19)导入马铃薯造粉体(Oakes等1991)用于产生环糊精。仅0.01％的内源性淀粉转化为所需的产品，并且该产品难以从植物材料中回收。
这些实例说明细菌酶可以作为用于修饰淀粉的潜在有力工具，然而，它们在植物中的性能事先不可预测(Kok-Jacob A.等，2003)。
因此，本发明目的基于提供改性淀粉、合成此类改性淀粉的新植物细胞和/或新植物以及用于产生此类植物的方法。
附图描述
图1：通过扫描电子显微镜分析法观察的野生型Kardal植物(I)的淀粉和改性淀粉颗粒，该分析法在以成熟的齿斑葡聚糖蔗糖酶基因(J-K)或以截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶基因(L-M)转化的所选马铃薯植物的淀粉上开展。
图2：对非转化植物(KD-UT)或对以成熟的齿斑葡聚糖蔗糖酶基因[KDI14(-)、KDI30(+)、KDI11(++)、KDI20(++)]或以截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶基因[KDIC1(-)、KDIC22(+)、KDIC14(++)、KDIC15(++)]转化的所选马铃薯植物观察到的变异淀粉颗粒的百分数，其中(-)、(+)和(++)指对Gtfi或GtfiCAT基因所表达mRNA的可比水平(分别是不可检测的、中度和高度)。
图3：利用赤藓红红色染色溶液使附着至淀粉颗粒的齿斑葡聚糖聚合物可见。齿斑葡聚糖聚合物存在于KDIC15淀粉颗粒表面(图3.C)。对于与KD-UT可比较的KDI系列，未观察到染色(图3.A)。
因此，本发明涉及基因修饰植物细胞或基因修饰植物，其特征在于它们在质体中显示齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的酶活性，并且其中与由非基因修饰的对应野生型植物细胞或野生型植物合成的淀粉相比，所述的基因修饰植物细胞或基因修饰植物分别合成改性淀粉。
术语“基因修饰的”或“转化的”指具有稳定整合至其基因组中的至少一种转基因的植物细胞或植物。优选地，转基因包括嵌合核酸序列，该嵌合核酸序列包含至少一个源自除转化植物细胞或转化植物以外的另外一个生物的元件(异源转基因)。特别地，该转基因是重组性转基因，其至少包含启动子、编码序列以及任选地包含终止信号。更优选地，重组性转基因的编码序列编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质，最优选地是齿斑葡聚糖蔗糖酶GTFI蛋白质。
与本发明有关的术语“野生型植物细胞”或“野生型植物”意指使用所涉及的植物细胞或植物作为产生本发明的植物细胞的起始材料，即除了所导入的基因修饰之外，它们的遗传信息与本发明植物细胞的遗传信息对应。
与本发明有关的术语“对应的”意指在比较数个对象中，所涉及进行相互比较的对象在相同条件下培养。在本发明中，与“野生型植物细胞”或“野生型植物”有关的术语“对应的”意指相互比较的植物细胞或植物在相同条件下培养并且它们具有相同的栽培龄。
这里，在本发明的框架内，术语“活性”分别意指基因修饰植物细胞或基因修饰植物中编码转基因的序列的表达和/或由编码转基因的序列编码的蛋白质的存在和/或由转基因所编码蛋白质产生的产物的存在。
转基因编码序列的表达可以例如通过测量转基因转录物的量测定，例如使用Northern印迹分析或RT-PCR。
引起所涉及的基因修饰植物细胞或基因修饰植物中相应蛋白质的活性的转基因所编码蛋白质的存在可以例如通过免疫学方法如蛋白质印迹法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)或RIA(放射免疫测定)确定。在转基因编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的情况下，基因修饰植物细胞或基因修饰植物中蛋白质的存在可以例如借助非变性丙烯酰胺凝胶电泳证实。在证实时，首先电泳分离含有蛋白质的植物细胞或植物提取物，并且在丙烯酰胺凝胶于含有蔗糖的各个缓冲液内温育后，丙烯酰胺凝胶在齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的位置处呈现白色沉淀。此外，凝胶中由齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质产生的齿斑葡聚糖可以用赤藓红红色染色试剂(根据一般方法中方法6)染色。
在已用编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸序列转化的本发明植物细胞或本发明植物中所产生齿斑葡聚糖的存在可以例如通过免疫分析加以证实。用于检测植物细胞中存在的齿斑葡聚糖的其它方法是用赤藓红红色染色试剂(根据一般方法中方法5)染色。
与本发明有关的术语“齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质”将理解为能够催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的酶，其中齿斑葡聚糖主要包含α-1，3-连接的葡萄糖单元。
在由齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质产生的齿斑葡聚糖中，α-1，3-键的数量优选地是75％、更优选地至少80％、特别优选地至少85％并且最优选地至少88％。
术语“齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质”还定义为与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或其部分具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％以及仍更优选地至少95％同一性的酶，所述酶具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力NO：。
大多数葡聚糖蔗糖酶，包括齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质，共有由四个不同区即信号肽、可变区、催化域和羧基末端(葡聚糖结合)域(GBD)组成的共同结构(Monchois等，1999，FEMS Microbiology Letters 177，243-248；Monchois等，1999，FEMS Microbiology Reviews 23，131-151)。
信号肽由35-38个氨基酸组成，并且天然细菌宿主表达的信号肽负责蔗糖酶的分泌。信号肽之后是140-261个氨基酸的可变区。
催化域或活性核心区由约900个氨基酸组成，并且在明串珠菌属(Leuconostoc)和链球菌属(Streptococcus)物种之间高度保守(MacGregor等1996)。催化域还被称作蔗糖结合域，因其含有在结合和切割蔗糖分子中具有重要作用的天冬氨酸及谷氨酸残基的催化三联体。在作为催化域的部分的单个氨基酸处具有多个突变的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质已经就各个突变对所产生的葡萄糖的结构及各个齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的催化活性方面进行了分析(Shimamura等，1994，J.Bacteriology 176(16)，4845-4849)。
葡聚糖结合域覆盖约500个氨基酸并且由通过共有序列定义的称作A、B、C、D的重复区组成(Monchois等1998，1999)。然而这些重复区的数目和组织方式在诸葡聚糖蔗糖酶中不同，并且已经证实为确保葡萄糖结合特性所需要的这些重复区单元的最小数目根据酶而不同，并且更特别地对于产生可溶性葡聚糖的酶和产生不可溶性葡聚糖的酶而言不同(Monchois等，1999)。
然而，本领域技术人员众所周知，能够合成齿斑葡聚糖的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质可以是包含相应的天然存在蛋白质(全长的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质)的完整氨基酸序列的蛋白质或其变体。齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的变体可以是仅包含成熟的天然存在齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的氨基酸的蛋白质，缺少编码天然存在的信号序列如引起细菌齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质分泌至培养基的信号序列的氨基酸。齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的其它变体包含天然存在的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的片段、衍生物和等位变体，其编码具有催化活性的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质(具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质)。
具有催化活性的截短的酶实例在Monchois等，1999中报道。具体而言，信号肽和氨基末端高度可变区对拥有完全催化活性的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质而言不需要。具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质是能够催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的活性酶，其中该蛋白质由仅编码保守催化域(活性核心区)或编码带全长或截短的羧基末端域的活性核心区的工程化gtfi基因编码(Monchois等，1999)。
已经令人吃惊地发现，在质体中表现具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶酶活性的基因修饰植物细胞或基因修饰植物合成了淀粉，其与在质体中表现齿斑葡聚糖蔗糖酶成熟蛋白质的酶活性的基因修饰植物细胞或基因修饰植物分别合成的改性淀粉相比，进一步得以改良。
因此，本发明的又一个目的是基因修饰植物细胞或基因修饰植物，其特征在于它们在质体中表现出具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶的酶活性并且其中与由对应的非基因修饰野生型植物细胞或对应的非基因修饰野生型植物合成的淀粉相比，该基因修饰植物细胞或基因修饰植物分别合成改性淀粉。
与本发明有关的术语“具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质”定义为酶，其至少包含天然存在的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的活性核心区的氨基酸。
具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质因此可以仅包含编码活性核心区的氨基酸序列或可以包含编码活性核心区的氨基酸序列并额外包含选自如下的氨基酸序列：
a)构成全长或截短的可变区的氨基酸序列，
b)构成全长或截短的羧基末端域的氨基酸序列，
c)构成截短的羧基末端域的氨基酸序列和构成全长的可变区的氨基酸序列。
d)构成全长羧基末端域的氨基酸序列和构成截短的可变区的氨基酸序列。
e)构成截短的羧基末端域的氨基酸序列和构成截短的可变区的氨基酸序列。
优选的具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质是这样的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质，在其中已缺部编码羧基末端域的失全氨基酸序列。因此这些具有催化活性的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质包含编码活性核心区的氨基酸序列并额外地包含编码可变区的氨基酸序列。
又一个优选的具有催化活性的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质包含活性核心区的氨基酸序列和可变区的部分。
与本发明有关的术语“活性核心区”还定义为至少包含这样的氨基酸序列的蛋白质，该氨基酸序列与SEQ ID NO：4中从位置109至1012所确定的核心区氨基酸序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％并且仍更优选地至少95％的同一性。
优选的具有催化活性的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质包含如此的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：4中所确定的氨基酸序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％并且特别更优选地至少95％的同一性。
与本发明有关的术语“转基因”理解为意指这样的分子，其或者非天然存在于对应的非基因修饰的野生型植物细胞或非基因修饰的野生型植物中，或其非天然地以具体的空间排列存在于非基因修饰的野生型植物细胞或非基因修饰的野生型植物内，或其位于非基因修饰的野生型植物细胞或非基因修饰的野生型植物基因组中的该分子非天然存在的位置内。
与本发明有关的术语“重组”意指由不同元件组成的核酸分子、在植物细胞或植物中非天然存在的组合或具体空间排列。
大量技术可用于将DNA导入植物宿主细胞。这些技术包括使用根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)作为转化介质以T-DNA转化植物细胞、原生质体融合、注射、DNA电穿孔、通过生物射弹法导入DNA以及其它任何可能技术。
土壤杆菌介导性植物转化的用途已经得到充分研究并且在EP120516；Hoekema于：The Binary Plant Vector System OffsetdrukkerijKanters B.V.，Alblasserdam(1985)，第五章；Fraley等，Crit.Rev.Plant Sci.4，1-46中并且由An等EMBO J.4，(1985)，277-287充分描述。对于马铃薯转化，例如见Rocha-Sosa等，EMBO J.8，(1989)，29-33。
借助基于土壤杆菌转化的载体对单子叶植物的转化也已经得到描述(Chan等，Plant Mol.Biol.22，(1993)，491-506；Hiei等，Plant J.6，(1994)271-282；Deng等，Science in China 33，(1990)，28-34；Wilmink等，PlantCell Reports 11，(1992)，76-80；May等，Bio/Technology 13，(1995)，486-492；Conner和Domisse，Int.J.Plant Sci.153(1992)，550-555；Ritchie等，Transgenic Res.2，(1993)，252-265)。转化单子叶植物的备选系统是通过生物射弹法的转化(Wan和Lemaux，Plant Physiol.104，(1994)，37-48；Vasil等，Bio/Technology 11(1993)，1553-1558；Ritala等，Plant Mol.Biol.24，(1994)，317-325；Spencer等，Theor.Appl.Genet.79，(1990)，625-631)、原生质体转化、已部分预透化的细胞的电穿孔及通过玻璃纤维导入DNA。玉米的转化尤其已经在文献中多次描述(参考例如WO95/06128，EP0513849，EP0465875，EP0292435；Fromm等，Biotechnology 8，(1990)，833-844；Gordon-Kamm等，Plant Cell 2，(1990)，603-618；Koziel等，Biotechnology 11(1993)，194-200；Moroc等，Theor.Appl.Genet.80，(1990)，721-726)。
对其它类型谷物的成功转化也已经描述，例如对大麦的转化(Wan和Lemaux，见如上；Ritala等，见如上；Krens等，Nature 296，(1982)，72-74)和对小麦的转化(Nehra等，Plant J.5，(1994)，285-297)。以上全部方法适于本发明。
在本发明中，导入的核酸可以整合至植物细胞的核基因组或质体基因组中。
转染质体的经典方法涉及以携带DNA分子的微抛射体轰击叶子(Svab等，1993)。如今，稳定的质体转染常规在烟草(N.tabaccum)上开展(Svab和Maliga，1990；Svab等，1993)。最近在稻(Khan和Maliga，1999)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Sikdar等，1998)、马铃薯(Sidorov等，1999)、甘蓝型油菜(colza)(WO 00/39313)、番茄(tomato)(Ruf等，2001)和大豆(soybean)(WO 04/053133)中取得进展。用于得到转原质体性植物的方法已经在专利申请WO 04/055191中描述。
除此之外，本发明的植物细胞和本发明的植物可以分别与野生型植物细胞或野生型植物区分，因为它们含有至少一个拷贝稳定整合至其基因组的外来核酸分子(转基因)，其编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质。
此外，本发明的植物细胞和本发明的植物可以通过如下特征优选地分别与野生型植物细胞或野生型植物区分：本发明的植物细胞或本发明的植物具有所导入核酸分子的转录物。这些转录物可以例如通过Northern印迹分析或通过RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)进行验证。优选地，本发明的植物细胞和本发明的植物含有由导入的核酸分子编码的蛋白质。这可以通过免疫学方法例如尤其通过蛋白质印迹分析证实。
另外，本发明的植物细胞和本发明的植物可以通过它们合成齿斑葡聚糖这个特征更优选地分别与野生型植物细胞或野生型植物区分。本发明的植物细胞或本发明的植物优选地在其质体内产生齿斑葡聚糖。
术语“与野生型植物细胞所合成的淀粉相比的改性淀粉”或“改性淀粉”或“改变的淀粉”意指这样的淀粉，当与野生型植物中合成的淀粉相比，其在物理化学性质、糊化特性、淀粉颗粒的大小和/或形状方面不同。与野生型淀粉相比，该淀粉尤其在其黏度和/或此淀粉胶的凝胶形成特性和/或增加的凝胶稳定性和/或其受消化能力和/或颗粒形态学方面经过改良。
黏度方面的改良可以通过数种手段并且尤其通过Thermo Haake验电器(Thermo Electron Cooperation)或通过快速黏度分析仪(RVA)例如Rapid Visco Analyser Super3(Newport Scientific Pty Ltd，InvestmetSupport Group，Warriewod NSW 2102，澳大利亚)根据制造商说明书测量。黏度值根据制造商操作手册以厘泊Centipoise(cP)表示，该操作手册引入本说明书作为参考。
通过快速黏度分析仪(RVA)测定黏度特征的优选方式以及用于比较不同样本的参数在本发明一般方法(方法1)中描述。
通过Thermo Haake验电器测定黏度测定曲线的另一个优选方式在本发明一般方法(方法2)中描述。
淀粉胶的凝胶形成特性(或凝胶强度)的测定和/或凝胶稳定性可以通过质构仪例如质构仪TA-XT2(Stable Micro Systems-Surrey，UK)根据制造商操作手册测定，该操作手册引入本说明书作为参考。
通过质构仪TA-XT2测定淀粉胶的凝胶形成特性的优选方式在本发明一般方法(方法3)中描述。
受消化能力可以使用Englyst H.N.等，European Journal of ClinicalNutrition 4，Suppl.2，S33-S50的方法学(在本说明书中引入作为参考)，通过测定已消化淀粉的百分数确定，所述方法学基于抗性淀粉RSIII型的测定，该淀粉是例如通过热处理和/或酶处理得到并随后回生的不可消化的回生淀粉。
Englyst的方法可随WO 00/02926(在本说明书中引入作为参考)中关于测定RS含量的信息进行调整。得到的方法在本发明一般方法(方法4)中描述。
此外，本发明涉及本发明的基因修饰植物细胞或基因修饰植物，其特征在于该植物细胞或该植物分别合成与野生型植物细胞所合成的淀粉相比，具有增加的T-起始温度、和/或增加的最小黏度、和/或增加的终黏度和/或改变的颗粒形态学的改性淀粉。
在本发明中，T-起始温度、最小黏度和终黏度可以通过验电器，尤其是Thermo Haake验电器或快速黏度分析仪确定。优选的方法在本发明一般方法(方法1和2)中描述。
本发明的又一个目的是基因修饰植物细胞或基因修饰植物，其特征在于它们在其质体中显示具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶的酶活性并且其中所述的基因修饰植物细胞或基因修饰植物分别合成这样的淀粉，即其与对应的非基因修饰的野生型植物细胞或对应的非基因修饰野生型植物所合成的淀粉相比，具有增加的T-起始温度和/或改变的颗粒形态学和/或增加的最小黏度和/或增加的终黏度。
优选地，在基因修饰植物细胞或基因修饰植物表现出成熟齿斑葡聚糖蔗糖酶的酶活性时，T-起始温度的增加为至少0.5％，并且在基因修饰植物细胞或基因修饰植物表现出具有催化活性的截短齿斑葡聚糖蔗糖酶的酶活性时，其为至少0.5％、优选为至少1％、更优选为至少1.5％、最优选为至少2％。
优选地，在基因修饰植物细胞或基因修饰植物表现出成熟齿斑葡聚糖蔗糖酶的酶活性时，最小黏度增加为至少5％、优选为10％、并且在基因修饰植物细胞或基因修饰植物表现出具有催化活性的截短齿斑葡聚糖蔗糖酶的酶活性时，其为至少10％、优选为至少40％、更优选为至少70％、最优选为至少100％。
优选地，在基因修饰植物细胞或基因修饰植物表现出成熟齿斑葡聚糖蔗糖酶的酶活性时，终黏度的增加为至少1.5％、优选为3％，并且在基因修饰植物细胞或基因修饰植物表现出具有催化活性的截短齿斑葡聚糖蔗糖酶的酶活性时，其为至少3％、优选为至少25％、更优选为至少45％、最优选为至少65％。
在本发明中，淀粉颗粒形态学可以如本发明一般方法(方法5)中所描述通过光学显微镜法(LM)和扫描电子显微镜法(SEM)确定。
在本发明中，具有改变的颗粒形态学的淀粉可以定义为具有多于5％变异淀粉颗粒的淀粉。
在本发明中，变异淀粉颗粒定义为当与野生型植物细胞所合成的淀粉颗粒的绝大多数相比时，显示出形状不常见的淀粉颗粒。作为实例，变异淀粉颗粒是具有凸起形态的淀粉颗粒、具有侵蚀的形态的淀粉颗粒、与较大淀粉颗粒结合的小淀粉颗粒、表面具有孔洞的淀粉颗粒和/或具有粗糙表面或不平整表面的淀粉颗粒。
与分离自对应的非基因修饰野生型植物细胞或非基因修饰野生型植物的淀粉颗粒分别相比，分离自本发明基因修饰植物细胞或基因修饰植物的淀粉颗粒中优选多于10％、更优选多于15％并且仍更优选多于20％显示改变的形态学，其中该修饰植物细胞或基因修饰植物表现出成熟齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的酶活性或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶的酶活性。
此外，本发明涉及基因修饰植物细胞或本发明基因修饰的植物，其特征在于与野生型植物细胞或野生型植物所合成的淀粉相比，该植物细胞或该植物分别合成凝胶强度增加的改性淀粉。
在本发明中，淀粉的凝胶强度(或胶的凝胶形成特性)可以通过本发明一般方法(方法3)中所述方法测量。
优选地，在基因修饰植物细胞或基因修饰植物表现出成熟的或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的酶活性时，凝胶强度增加10％-600％、优选20％-500％、更优选25％-400％并且最优选30％-300％。
已发现在其质体中表现具有催化活性的截短齿斑葡聚糖蔗糖酶的酶活性的本发明基因修饰植物细胞或本发明基因修饰植物合成齿斑葡聚糖与之结合的新型淀粉颗粒。
如一般方法(方法5)中所公开，齿斑葡聚糖对淀粉的结合可以通过以赤藓红红色染色试剂对淀粉颗粒染色而观察到。口腔专家常规地使用此染色反应以证实齿菌斑的存在。
因此，本发明的又一个目的是在其质体中表现出具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶酶活性的本发明基因修饰植物细胞或本发明基因修饰植物，其特征在于所述的基因修饰植物细胞或基因修饰植物分别合成齿斑葡聚糖与之结合的淀粉颗粒。本发明的优选目的是表现出齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的酶活性的本发明基因修饰植物细胞或本发明基因修饰植物，其中所述的基因修饰植物细胞或基因修饰植物分别合成齿斑葡聚糖与之结合的淀粉颗粒，其中所述的淀粉颗粒可用赤藓红红色染色试剂染色。
此外，本发明涉及使转基因整合至其基因组的本发明基因修饰植物细胞或本发明基因修饰植物，所述转基因包含如下以功能性方式彼此连接的处于转录方向的序列：
-启动植物细胞中转录的启动子序列，
-编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或编码具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的异源核酸序列，以及
-任选地在植物细胞中有活性的终止序列。
与本发明有关的术语“齿斑葡聚糖蔗糖酶基因”将理解为编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸序列。
与本发明有关的术语“截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶基因”将理解为编码具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸序列。
编码具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白的异源核酸序列可以包含仅编码活性核心区的核酸序列或可以包含编码活性核心区的核酸序列和编码选自如下氨基酸序列的额外核酸序列
a)构成全长或截短的可变区的氨基酸序列，
b)构成全长或截短的羧基末端域的氨基酸序列，
c)构成截短的羧基末端域的氨基酸序列和构成全长可变区的氨基酸序列。
d)构成全长羧基末端域的氨基酸序列和构成截短的可变区的氨基酸序列。
e)构成截短的羧基末端域的氨基酸序列和构成截短的可变区的氨基酸序列。
优选的具有催化活性的齿斑葡聚糖蔗糖酶基因包含这样的核酸序列，其与如SEQ ID NO.3中所确定的核酸序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％并且特别优选地至少95％的同一性。
此外，本发明涉及使转基因整合至其基因组的本发明基因修饰植物细胞或本发明基因修饰植物，该转基因包含如下以功能性方式彼此连接的处于转录方向的序列：
-启动植物细胞中转录的启动子序列，
-编码具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的异源核酸序列，以及
-任选地在植物细胞中有活性的终止序列，
其中所述的基因修饰植物细胞或基因修饰植物分别合成齿斑葡聚糖与之结合的淀粉。
与本发明有关的术语“基因组”将理解为意指植物细胞中存在的全部遗传物质。本领域技术人员已知，除了细胞核以外，其它区室(例如质体、线粒体)也含有遗传物质。
在优选的实施方案中，转基因整合至植物细胞的细胞核。因此，将齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质向特定细胞区室如质体的转运可以通过利用以目的细胞区室为靶的转运肽实现。编码转运肽的核酸序列插在编码序列的前部。编码转运肽的序列可以衍生自编码在细胞浆内表达并转运至目的细胞区室的蛋白质的任意核酸序列。转运肽可以通过将编码特定多肽的信使RNA与成熟蛋白质的氨基酸序列比较加以确定。成熟蛋白质中缺少并由对应信使RNA从起始密码子(通常是甲硫氨酸)处开始编码的氨基酸序列通常是转运肽，或通常含有转运肽。技术人员将能够使用预测转运肽的程序例如Chloro 1.1服务器(Emanuelsson O.等，1999，Protein Science：8：978-984)确定编码转运肽的序列。
转运肽是能够指导连接至转运肽的蛋白质进入目的细胞区室的氨基酸序列并且可以是完整的天然存在(野生型)的转运肽、其功能性片段、其功能性突变体或嵌合转运肽，在嵌合转运肽中至少两种转运肽以功能性方式彼此结合或不同转运肽的部分以功能性方式彼此结合。这种嵌合转运肽作为优化的转运肽在EP0508909和EP0924299中报道。
编码转运肽的核酸序列可以是相对于编码与之融合的酶的核酸序列而言为异源的，这意味着编码转运肽的核酸序列和编码待靶向进入质体的酶的核酸序列源自于不同基因，而基因还可以源自不同物种。
将专用于使酶靶向质体的转运肽称作质体转运肽，其中酶与转运肽翻译性地连接。
本发明还涉及使核酸构建体整合至其基因组的本发明基因修饰植物细胞或本发明基因修饰植物，该核酸构建体包含以功能性方式彼此连接的处于转录方向的如下序列：
-启动植物细胞中转录的启动子序列，
-异源核酸序列，其编码与之翻译性融合的质体转运肽，
-编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的异源核酸序列，以及
-任选地在植物细胞中有活性的终止序列。
术语“以功能性方式彼此连接”意指核酸构建体的元件彼此以允许编码区得以表达的方式连接。
与本发明有关的术语“翻译性融合”应当意指以如此方式融合核酸序列以至于它们代表在转录时引起单个信使RNA产生的单个可读框，该信使RNA在翻译时即编码单个蛋白质。
质体转运肽可选自编码蜡质蛋白(Klsgen等，Mol Gen Genet.217(1989)，155-161)、二磷酸核酮糖羧化酶小亚基(Wolter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988)，846-850；Nawrath等，Proc.Natl.Acad.Sci.10 USA 91(1994)，12760-12764)、NADP苹果酸脱氢酶(Gallardo等，Planta 197(1995)，324-332)、谷胱甘肽还原酶(Creissen等，Plant J.8(1995)，167-175)、EPSPS(US 5,188,642)基因的转运肽以及EP0508909和EP0924299中所述的优化转运肽。这些实例是非限制性的。
在优选的实施方案中，编码铁氧还蛋白还原酶基因的质体转运肽的核酸序列(Pilon等，1995)与编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸序列翻译性融合。
在另一个优选的实施方案中，编码EP0508909和EP0924299中所述的优化质体转运肽的核酸序列与编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸序列翻译性融合。
技术人员众所周知用于构建本发明核酸构建体的技术。作为非限制性的实例，可能提到Sambrook等(Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第三版(2001)Cold Spring Harbour Laboratory Press，ColdSpring Harbour，NY.ISBN：0879695773)和Ausubel等(Short Protocols inMolecular Biology，John Wiley&Sons；第五版(2002)，ISBN：0471250929)中所述的技术。
此外，含有本发明植物细胞的植物和/或其后代也是本发明的主题。这种类型的植物可以使用本领域技术人员已知的方法，如R.D.Hall编辑的“plant Cell Plant Protocols”1999，Humana Press，ISBN 0-89603-549-2中所述的方法通过再生从本发明的植物细胞中产生。
原则上，本发明的植物可以是任意的植物物种，即单子叶植物和双子叶植物。优选地，它们是有用植物，即出于食用或技术目的，尤其工业目的由人栽培的植物。
在又一个优选的实施方案中，本发明的植物是淀粉贮藏植物。术语“淀粉贮藏植物”包括具有贮藏淀粉的植物部分的全部植物，例如玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、西米、绿豆、豌豆或高粱。优选的贮藏淀粉的植物部分是例如块茎、贮藏根和含有胚乳的谷物果实；尤其优选块茎；特别优选马铃薯植物的块茎。
在又一个优选的实施方案中，本发明涉及本发明的淀粉贮藏植物，其为马铃薯植物。
与本发明有关的术语“马铃薯植物”或“马铃薯”意指茄属(Solanum)的植物物种，尤其是茄属中产生块茎的物种并且特别是马铃薯(Solanumtuberosum)。
本发明还涉及含有本发明植物细胞的本发明植物的繁殖材料。
本文中，术语“繁殖材料”包括植物中适于通过营养方式或有性方式产生后代的那些部分。例如，插条、愈伤组织培养物、根状茎或块茎适用于营养繁殖。其它繁殖材料例如包括果实、种子、幼苗、原生质体、细胞培养物等。优选地，繁殖材料是种子并且特别优选是块茎。
在又一个实施方案中，本发明涉及本发明植物的可收获植物部分，如果实、贮藏根、花、芽、苗或茎，优选地是种子或块茎，其中这些可收获部分含有本发明的植物细胞。
本发明还涉及用于产生本发明基因修饰植物的方法，其中：
a)用核酸分子转化植物细胞，所述核酸分子包含编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子。
b)从步骤a)中得到的植物细胞再生植物，并且
c)根据需要，从步骤b)中得到的植物中产生另外的植物。
可以根据技术人员已知的方法从步骤a)中得到的植物细胞再生完整植物，如使用R.D.Hall编辑的“plant Cell Plant Protocols”1999，HumanaPress，ISBN 0-89603-549-2中所述的方法。
在用于产生本发明基因修饰植物的优选方法中，步骤a)中编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子与编码质体肽序列的核酸分子翻译性融合。
根据本发明方法步骤c)产生另外的植物可以例如通过营养繁殖(例如使用插条、块茎或借助愈伤组织培养和完整植物的再生)或通过有性繁殖实现。本文中，有性繁殖优选地在受控条件下发生，即具有特定特征的所选择植物与另一植物杂交并繁殖。
本发明还涉及用于根据如上所公开方法产生基因修饰植物的方法，其中编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子整合至植物的质体基因组。
编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子可以来自任意希望的来源，编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子优选地源自表达该蛋白质的细菌。
更优选地，本发明中所用的核酸分子可以编码选自链球菌细菌的细菌性齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质。
最优选地，本发明中所用的核酸分子可以编码来自汗毛链球菌MFe28的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质。
编码具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子可以通过分子生物学领域内技术人员广泛已知的方法自任意的编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子产生。适用于产生编码具有催化活性的截短齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸序列的方法描述于例如Sambrook等(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版(2001)Cold SpringHarbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY.ISBN：0879695773)和Ausubel等(Short Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons；第五版(2002)，ISBN：0471250929)中。这些方法包括但不限于通过使用下列方法产生编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸序列的缺失突变体，所述方法为限制酶和/或使用位点定向诱变(例如插入提前终止密码子)和/或PCR扩增(例如编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的序列的部分)和/或化学合成编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸序列的各部分并连接各序列以得到编码具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子。
本发明中所用编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子可以分离自例如基因组DNA或DNA文库，其来自任何来源，优选地来自细菌。备选地，它们可以通过重组DNA技术(例如PCR)或通过化学合成产生。此类分子的鉴定和分离可以通过使用本发明的分子或这些分子的部分或者(视情况而定)这些分子的反向互补链加以开展，例如通过根据标准方法的杂交(见Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版(2001)Cold Spring Harbour Laboratory Press，Cold Spring Harbour，NY.ISBN：0879695773)和Ausubel等(Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons；第五版(2002)，ISBN：0471250929)。
作为用于杂交的探针，可以使用完全或基本上含有SEQ ID No.1所示核苷酸序列或其部分的核酸分子。用作杂交探针的片段还可以是通过常规合成方法产生并且其序列与本发明的核酸分子基本相同的合成性片段。
与本发明中所用的核酸分子杂交的分子还包括如上所述编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子的片段、衍生物和等位变体。在此上下文中，将片段定义为核酸分子中长度足以编码蛋白质的部分。在此上下文中，术语“衍生物”意指与以上所提及核酸分子的序列在一个或多个位置处不同的这些分子的序列，并且意指它们与这些序列具有高度同源性。同源性意指至少70％的序列同一性并且仍更优选地多于90％的序列同一性以及最优选地多于95％的序列同一性。当与以上所述核酸分子比较时由于缺失、置换、插入或重组可出现偏离。
此外，同源性意指在各自核酸分子间或它们编码的蛋白质之间存在功能性和/或结构性等效。与如上所述分子同源并代表这些分子的衍生物的核酸分子通常是这些分子的变异，其构成了具有相同生物学功能的修饰。这些变异可以是天然存在的变异，例如衍生自其它细菌的序列，或者突变，因而这些突变可以天然存在或它们可以通过特定诱变加以导入。另外，变异可以是合成产生的序列。等位变体可以是天然存在和合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。
在本发明优选的实施方案中，编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子选自：
a)核酸分子，其编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或其部分并具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力的蛋白质；
b)核酸分子，其编码其氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或其部分具有至少70％的同一性并具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力的蛋白质；
c)核酸分子，其包含SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列或其互补序列或者它们的部分，所述的核苷酸序列或其互补序列或者它们的部分编码具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力的蛋白质；
d)核酸分子，其核酸序列与a)或c)所述核酸序列具有至少70％的同一性；
e)核酸分子，其核苷酸序列因遗传密码子简并性而自a)、b)、c)或d)中所确定的核酸分子的序列衍生；以及
f)核酸分子，其代表在a)、b)、c)、d)或e)中所确定的核酸分子的片段、等位变体和/或衍生物。
在本发明又一个优选的实施方案，编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子编码如此蛋白质，其氨基酸序列与SEQ ID NO：2中所确定的氨基酸序列或其部分具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％并且仍更优选地至少95％的同一性并具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力。
在另外的又一个优选实施方案中，编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子具有如此序列，其与序列SEQ ID NO：NO：1或其部分具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％并且仍更优选地至少95％的同一性并编码具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力的蛋白质。
在本发明又一个优选的实施方案中，编码具有催化活性的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子选自：
a)核酸分子，其编码具有SEQ ID NO：4所示氨基酸序列或其部分并具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力；
b)核酸分子，其编码如此蛋白质，其氨基酸序列与在SEQ ID NO：4所示氨基酸序列或其部分具有至少70％的同一性并具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力；
c)核酸分子，其包含SEQ ID NO：3中所示核苷酸序列或其互补序列或者它们的部分，所述的核苷酸序列或其互补序列或者它们的部分编码具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力的蛋白质；
d)核酸分子，其核酸序列与a)或c)所述核酸序列具有至少70％的同一性；
e)核酸分子，其核苷酸序列因遗传密码子简并性而自a)、b)、c)或d)中所确定的核酸分子的序列衍生；以及
f)核酸分子，其代表在a)、b)、c)、d)或e)中所确定的核酸分子的片段、等位变体和/或衍生物。
在本发明又一个优选的实施方案，编码具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子编码如此蛋白质，其氨基酸序列与SEQ IDNO：4中所确定的氨基酸序列或其部分具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％并且仍更优选地至少95％的同一性并具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力。
编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子的优选部分是如此核酸分子，其编码与如SEQ ID NO：4中从位置109至1012所示氨基酸序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％并且仍更优选地至少95％的同一性。
在另外的又一个优选的实施方案中，编码具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子具有如此核酸序列，其与如SEQ ID NO：3所示序列或SEQ ID NO：3中从位置325至3036所示序列具有至少70％、优选地至少80％、更优选地至少90％并且仍更优选地至少95％的同一性。
与本发明有关的术语“同一性”将理解为意指与其它蛋白质/核酸的氨基酸/核苷酸对应的氨基酸/核苷酸数目，表示为百分数。同一性优选地借助计算机程序通过将SEQ.ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4或其部分与其它蛋白质/核酸比较加以确定。当相互比较的序列具有不同长度时，同一性将以如此方式确定：即较短序列与较长序列共有氨基酸的数目决定同一性的百分比商。优选地，同一性通过众所周知并且公众可获得的计算机程序ClustalW(Thompson等，Nucliec Research 22(1994)，4673-4680)确定。德国海德堡欧洲分子生物学实验室(Meyerhofatrasse 1，D69117)的Julie Thompson(Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)和TobyGibson( Gibson@EMBL-Heidelberg.DE)使ClustaIW可公开地获得。ClustalW还可以从不同因特网址上下载，包括IGBMC(Institut deGénétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire，B.P.163，67404 IllkirchCedex，法国；ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/)和EBI( ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/)以及从EBI(European BioinformaticsInstitute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，Cambridge CB101SD，UK)的全部镜像因特网址上下载。
优选地使用ClustalW计算机程序1.8版确定本发明的蛋白质与其它蛋白质之间的同一性。在实施中，必须设置如下参数：KTUPLE＝1，TOPDIAG＝5，WINDOW＝5，PAIRGAP＝3，GAPOPEN＝10，GAPEXTEND＝0.05，GAPDIST＝8，MAXDIV＝40，MATRIX＝GONNET，ENDGAPS(OFF)，NOPGAP，NOHGAP。
优选地使用ClustalW计算机程序1.8版确定例如本发明核酸分子的核苷酸序列与其它核酸分子的核苷酸序列之间的同一性。在实施中，必须设置如下参数：
KTUPLE＝2，TOPDIAGS＝4，PAIRGAP＝5，DNAMATRIX：IUB，GAPOPEN＝10，GAPEXT＝5，MAXDIV＝40，TRANSITIONS：未加权。
此外，同一性意思是指在所涉及的核酸分子或由它们编码的蛋白质之间存在功能性和/或结构等效。与上述分子同源并且构成这些分子的衍生物的核酸分子通常是这些分子的变异，其构成执行相同生物学功能的修饰。为此目的，修饰在不参与酶活性的氨基酸残基上进行。与此同时，这些变异可天然发生，例如它们可以是来自另一些细菌物种的序列，或它们可以是突变，其中这些突变可能以天然方式存在或已经通过目标诱变导入。这些变异还可以是合成产生的序列。等位变异体既可以是天然存在的变体，也可以是合成产生的变异体或通过重组DNA技术产生的变体。因遗传密码子的简并性而与衍生自本发明的核酸分子的核酸分子构成特别形式的衍生物。
本发明的主题还是如此核酸分子的用途，其编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质并且其序列因遗传密码子的简并性而不同于以上所提及核酸分子的核苷酸序列。
本发明还涉及具有如此序列的核酸分子的用途，该序列与以上所提及的核酸分子之一的部分或全部互补。
为表达上述核酸分子，这些核酸分子优选地与确保在植物细胞中启动转录的DNA调节序列连接。具体而言，这些核酸分子包含启动子。通常，在植物细胞中有活性的任意启动子均适用于表达。
与此同时，可以选择启动子以便使表达组成型地发生或仅在某种组织内、在植物发育某个阶段或在由外界影响所决定的时间内发生。启动子可以是对于植物和核酸分子而言是同源或异源的。
适宜启动子是例如以下的启动子：用于组成型表达的花椰菜花叶病毒35S RNA的启动子和来自玉米遍在蛋白的启动子、用于在马铃薯中块茎特异性表达的patatin启动子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989)，23-29)，或确保仅在光合作用活跃的组织中表达的启动子如ST-LS1启动子(Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)，7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.8(1989)，2445-2451)，或来自小麦的用于胚乳特异性表达的HMG启动子、USP启动子、菜豆蛋白启动子、来自玉米的玉米醇溶蛋白基因启动子(Pedersen等，Cell 29(1982)，1015-1026；Quatroccio等，PlantMol.Biol.15(1990)，81-93)、谷蛋白启动子(Leisy等，Plant Mol.Biol.14(1990)，41-50；Zheng等，Plant J.4(1993)，357-366；Yoshihara等，FEBS Lett.383(1996)，213-218)或shrunken-1启动子(Werr等，EMBO J.4(1985)，1373-1380)。然而，还可使用仅在由外界影响决定的时间内活化的启动子(参见例如WO 9307279)。在本文中，允许简单诱导的热休克蛋白的启动子特别有用。此外，还可使用种子特异性启动子，如确保在蚕豆(ViciaFaba)和另一些植物中表达的来自蚕豆的USP启动子(Fiedler等，Plnat Mol.Biol.22(1993)，669-679；Bumlein等，Mol.Gen.Genet.225(1991)，459-467)。
如果本发明的核酸构建体整合至植物细胞的质体基因组，则可使用在植物细胞的质体内有活性的启动子。在植物细胞的质体内有活性的启动子当中，特别提到的是例如编码PSII的D1多肽的psbA基因(Staub等1993EMBO Journal 12(2)：601-606)，以及调节核糖体RNA操纵子的组成型Prrn启动子(Staub等1992 Plant Cell 4：39-45)。
此外，可以存在终止序列(聚腺苷酸化信号)，其用于向转录物添加聚腺苷酸尾。聚腺苷酸尾具有稳定转录物的功能。这种类型的元件描述于文献(参考Gielen等，EMBO J.8(1989)，23-29)中并且可以随意交换。
通过用于产生本发明植物的方法可得到的本发明植物是本发明的又一实施方案。
此外，本发明涉及载体，特别是质粒、粘粒、病毒、噬菌体和遗传工程中常见的其它载体，其含有以上提及的编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子。此类载体优选地是可用于转化植物细胞的载体。更优选地，它们允许本发明的核酸分子整合至植物细胞的核基因组或质体基因组，其根据需要与侧翼调节序列组合。实例是可以在土壤杆菌介导性基因转移中使用的双元载体，例如pBIN20双元载体(Hennegan和Danna，1998)。可以用于直接质体转化的载体实例在WO 04/055191中给出。
包含待导入植物的异源核酸分子的质粒还可以含有选择标记或报道基因或含有这两者以促进转化细胞的鉴定和选择。备选地，选择标记可以由独立的载体携带并用于共转化方法。选择标记和报道基因均可以具有侧翼分布的使得在植物中表达的适宜调节序列。有用的选择标记和报道基因在本领域众所周知并且包括例如抗生素和除草剂抗性基因、编码β-葡糖醛酸糖苷酶(Staub等，1993)或绿色荧光蛋白(Sidorov等，1999)的基因。此类基因的具体实例公开于Weising等，1988，Svab等，1993，White等，NucleicAcid Res.18(4)：1062中。
通过使用编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子，现在有可能通过重组DNA技术以迄今不可能的方式干预植物细胞或植物的淀粉代谢。因而，淀粉代谢可以以如此方式修饰以致于合成与对应的非基因修饰野生型植物细胞或非基因修饰野生型植物中合成的淀粉分别相比，其物理化学性质、糊化特性、淀粉颗粒的大小和/或形状方面不同的改性淀粉。与野生型淀粉相比，该淀粉尤其在其黏度和/或此淀粉胶的凝胶形成特性和/或凝胶稳定性和/或其受消化能力和/或颗粒形态学方面经过改良。
本发明因此还涉及可从本发明的植物细胞或本发明的植物、从本发明的繁殖材料或从本发明的可收获植物部分中得到的改性淀粉。
本发明的又一目的是齿斑葡聚糖与之结合的本发明淀粉。本发明优选地涉及齿斑葡聚糖与之结合的改性淀粉颗粒，其中淀粉颗粒可用赤藓红红色染色试剂可染色。这种淀粉可从如此的基因修饰植物细胞或基因修饰植物中得到，其在它们的质体中表现具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的活性。
优选的本发明淀粉涉及来自本发明淀粉贮藏植物例如玉米、稻、小麦、黑麦、燕麦、大麦、木薯、马铃薯、西米、绿豆、豌豆或高粱的淀粉。特别优选马铃薯植物的淀粉。
本发明还涉及用于产生改性淀粉的方法，包括从本发明的植物细胞、从本发明的植物、从本发明的可收获植物部分或从通过用于产生本发明植物的本发明方法可得到的植物中提取淀粉的步骤。
优选地，此方法还包括在提取淀粉前收获栽培的植物和/或此类植物的淀粉贮藏部分的步骤。最优选地，该方法还包括在收获前栽培本发明植物的步骤。技术人员已知用于从植物或从植物的淀粉贮藏部分提取淀粉的方法。用于从玉米种子中提取淀粉的方法已经描述于例如Eckhoff等(CerealChem.73(1996)54-57)中。工业水平的淀粉提取通常由所谓的湿磨技术实现。此外，用于从多种其它淀粉贮藏植物中提取淀粉的方法已经描述于例如“Starch：Chemistry and Technology”(编者：Whistler，BeMiller和Paschall(1994)，第二增补版，Academic Press Inc.London Ltd；ISBN0-12-746270-8；参见例如第12章，第412-468页：Watson编写的maize andsorghum starches：production；第13章，第469-479页：Corbishley和Miller编写的tapioca，arrowroot and sago starches：production；第14章，第479-490页：Mitch编写的potato starch：production and uses；第15章，第491-506页：Knight和Oson编写的wheat starch：production，modificationand uses；以及第16章，第507-528页：Rohmer和Klem编写的rice starch：production and uses)中。广泛用于从植物材料中提取淀粉的装置是分离器、倾析器、水力旋流器、喷雾干燥器和旋风干燥器。优选地，用于制造本发明改性淀粉的方法包括实例3中所述的步骤。
因为编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子表达，故本发明中所述的转基因植物细胞和转基因植物合成这样的改性淀粉，其与对应的非基因修饰野生型植物细胞或非基因修饰野生型植物中所合成的淀粉分别相比，在其物理化学性质、糊化特性、淀粉颗粒的大小和/或形状方面经过改良。与野生型淀粉相比，该淀粉尤其在其黏度和/或此淀粉胶的凝胶形成特性和/或凝胶稳定性和/或其受消化能力和/或颗粒形态学方面经过改良。
在本发明的又一实施方案中，使用了用于制造本发明改性淀粉的方法生产本发明的改性淀粉。
因此，由制造本发明改性淀粉的方法可得到的改性淀粉也是本发明的主题。
在本发明优选的实施方案中，本发明的改性淀粉是天然淀粉。
与本发明有关的术语“天然淀粉”意指通过本领域技术人员已知的方法从本发明的植物、本发明可收获的植物部分或本发明植物的繁殖材料中分离的淀粉。
本领域技术人员知道，淀粉的特性可以例如通过热、化学、酶或机械性衍生作用加以改变。衍生淀粉尤其适于食品和/或非食品领域内的不同应用。本发明淀粉比常规淀粉更适合作为用于制造衍生淀粉的起始材料。
因此，本发明还涉及用于产生衍生淀粉的方法，其中通过本发明方法可得到的本发明改性淀粉得以回溯性衍生。
与本发明有关的术语“衍生淀粉”理解为意指本发明的改性淀粉，其特征在借助化学、酶、热或机械方法从植物细胞中分离后已经受到改变。
在本发明优选的实施方案中，本发明的衍生淀粉是已受热处理和/或酸处理的淀粉。
在又一个优选的实施方案中，衍生淀粉是是淀粉醚，尤其是淀粉烷醚、淀粉O-烯丙基醚、淀粉羟烷基醚、淀粉O-羧甲基醚、含氮的淀粉醚、含磷酸的淀粉醚或含硫的淀粉醚。
在又一个实施方案中，衍生淀粉是交联淀粉。
在又一个实施方案中，衍生淀粉是淀粉接枝聚合物。
在又一个实施方案中，衍生淀粉是氧化的淀粉。
在又一个实施方案中，衍生淀粉是淀粉酯，特别是使用有机酸导入淀粉的淀粉酯。特别优选地，这些淀粉酯是磷酸酯淀粉、硝酸酯淀粉、硫酸酯淀粉、黄原酸酯淀粉、乙酸酯淀粉或柠檬酸酯淀粉。
用于制造本发明衍生淀粉的方法为本领域技术人员所知，并且在常见文献中充分描述。关于衍生淀粉制造方面的综述可以在Orthoefer的(在Corn，Chemistry and Technology，1987，编者Watson和Ramstad，第16章，479-499)中找到。
根据用于制造衍生淀粉的本发明，通过用于产生衍生淀粉的方法可得到的衍生淀粉也是本发明的主题。
本发明又一实施方案是本发明的改性淀粉用于产生衍生淀粉的用途。
本发明还涉及本发明的植物细胞、本发明的植物、本发明植物的可收获部分或通过本发明的方法可得到的植物用于产生改性淀粉的用途。
本发明还涉及核酸分子用于制造本发明的基因修饰植物细胞、本发明的基因修饰植物、本发明的繁殖材料或本发明植物的可收获部分的用途，其中核酸分子编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质。
此外，编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质或具有催化活性的截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子用于制造本发明改性淀粉的用途是本发明的实施方案。
一般方法：
方法1：通过快速黏度分析仪(RVA)测定黏度特征
2g马铃薯淀粉(对于待使用的其它类型的淀粉或面粉，该值应当根据制造商手册进行调整)在25ml H2O(VE型水，导电性至少15兆欧)中溶解并在Rapid Visco Analyser Super3(Newport Scientific Pty Ltd.，InvestmetSupport Group，Warriewod NSW 2102，澳大利亚)分析中使用。该装置按照制造商说明书操作。黏度值根据制造商操作手册表示为厘泊(cP)，该手册引入本说明书作为参考。为测定淀粉水溶液的黏度，淀粉混悬液首先以960转/分搅拌10秒并且随后在160转/分的搅拌速度下在50℃加热，最初持续1分钟(步骤1)。随后温度以每分钟12℃的加热速度从50℃升至95℃(步骤2)。温度在95℃保持2.5分钟(步骤3)并且随后以以每分钟12℃从95℃冷却至50℃(步骤4)。在最后步骤中(步骤5)，保持温度50℃持续2分钟。黏度在整个持续期间测定。
在该程序结束后，移去搅拌器并且盖上烧杯。胶化的淀粉在室温温育24小时后可用于质构分析。
RVA分析曲线包含显示用于比较不同测量值和物质的参数。在本发明上下文中，如下术语应当做如下理解：
1.最大黏度(RVA Max)或峰值黏度
将最大黏度理解为意指在温度曲线的步骤2或3中得到的以cP度量的最高黏度值。
2.最小黏度(RVA Min)或低谷黏度
将最小黏度理解为意指在温度曲线中观察到最大黏度之后的以cP度量的最低黏度值。通常，该值在温度曲线的步骤3中出现。
3.终末黏度(RVA Fin)或终黏度
将终末黏度(或终黏度)理解为意指在测量结束时观察到的以cP度量的黏度值。
4.消减值(RVA Set)
所谓的“消减值”通过从曲线中最大黏度之后出现的最小黏度中减去终末黏度而计算。
5.胶化温度(RVA PT)或T-起始温度
将胶化温度理解为温度曲线中黏度在短时间内首次显著上升的时间点。
方法2：通过Thermo Haake验电器测定黏度测定曲线
来自2％淀粉混悬液的黏度测定曲线使用Thermo Haake验电器，通过在1Hz频率施加小的往复切变形加以测定。电流计配有平行板配列(typC70/1 Ti)并且间隙大小是0.1mm。2％淀粉-水(w/v)混悬液的成糊曲线如下得到：混悬液以2℃/每分钟的速率从40℃加热至90℃，保持15分钟，随后以2℃/每分钟的速率冷却至20℃并在20℃再次保持15分钟。测量Tg(胶化温度或T-起始温度)、Tp(峰值温度)和黏度。随后，从回生的样品中，在10Pa于60秒内增至1.000Pa时进行幅度扫描以检查测量值是否处于应力和张力的幅度彼此成正比的线性区域内。
方法3：通过质构仪TA-XT2测定淀粉胶的凝胶形成特性。
根据上述方法(方法1)通过快速黏度分析仪(RVA)将样品在RVA装置内于水质混悬液中胶化并随后于室温在封闭容器内贮藏24小时。样品在来自Stable Micro Systems(Surrey，UK)的质构仪TA-XT2的探头(具有平面的圆形活塞)下固定并使用如下参数测定凝胶强度：
-测试速度  0.5mm/s
-插入深度  7mm
-接触表面  113mm2
-压力      2g.
方法4：基于抗性淀粉RS III型的测量，测定淀粉的消化性。
抗性淀粉RS可以分为如下类型：
RS 1型  消化作用不可抵达的淀粉，例如部分磨碎的植物细胞(例如在穆兹利中)。
RS 2型  不可消化的颗粒淀粉(淀粉粒)，例如来自生马铃薯、生香蕉等。
RS 3型  例如通过热处理和/或酶处理并且随后回生得到的不可消化的回生淀粉。
RS 4型  例如通过交联或酯化(乙酰化等)形成的不可消化的化学改性淀粉。
抗性淀粉RS III型的确定使用如下步骤得到：
a)胰酶制剂/淀粉葡糖苷酶(AGS)处理
使用的胰酶制剂/淀粉葡糖苷酶消化缓冲液：
0.1M乙酸钠pH 5.2
4mM CaCl2
酶溶液的制备：
将12g胰酶制剂(Merck，产品编号1.07130.1000)在80ml脱矿质水(导电性大约18兆欧)中于37℃搅拌10分钟并且随后3000转/分离心10分钟。
离心后得到的54ml上清液以9.86ml脱矿质水和0.14ml淀粉葡糖苷酶(6000u/ml，Sigma，产品编号A-3042)处理。
胰酶制剂/淀粉葡糖苷酶(AGS)消化方法
对每批次待测量的淀粉每次制备5个胰酶制剂/淀粉葡糖苷酶(AGS)消化分析体系。随后将无酶溶液添加至这5个分析体系的两个当中。将添加无酶溶液的分析体系设定为参考并用于测定回收率。剩余的三个分析体系设定为样品，随后以酶溶液处理并用于测定RS含量。
平行处理多个不含淀粉的反应容器(空白样品)。这些不含淀粉的空白样品用于测定共沉淀物质(蛋白质、盐)的量。
测量50ml反应容器(Falcon管)的自重并且随后在每一例子中称量放入在大约200mg淀粉。将15ml乙酸钠缓冲液添加至每份线性水不溶性聚-α-1，4-D-葡聚糖样品及空白样品中，并且将20ml乙酸钠缓冲液添加至每一参考内(见如上)。将这些样品预温至37℃。
通过添加5ml酶溶液至样品及空白样品的各个反应容器内启动反应，随后反应容器在37℃(200转/分)振荡2小时。
通过添加5ml冰醋酸(平衡至pH3.0)和80ml工业级乙醇至样品、空白样品和参考内终止反应。
室温已终止的反应分析体系温育1小时，从反应混合物中沉淀淀粉。
沉淀(在2500×g离心10分钟)后，各分析体系的沉淀以80％乙醇洗涤两次以除去短链葡聚糖并且在冷却至-70℃后冻干。
样品再次称重并且重量差用于计算RS“重量”含量。
b)测定RS含量
如下方法用于测定各个批次水不溶性淀粉的RS含量：
a)测定各个样品批次淀粉的水含量(H2O重量)。
b)对各样品(RGP重量)、参考(RGR重量)和空白样品(RGB重量)测定各反应容器的自重。
c)称量大约200mg水不溶性淀粉加至用于样品(P重量)和参考(R重量)的各个反应容器内。
d)对样品(Ptr重量＝P重量-H2O重量)和参考(Rtr重量＝P重量-H2O重量)计算重量的干燥部分。
e)各样品和空白样品的酶消化。参考以相同方式处理，但不添加酶溶液。
f)在进行如e)中所述的处理后，沉淀、离心沉淀、洗涤和冻干在样品、参考和空白样品反应容器内存留的物质。
g)在进行如f)中所述的处理后，将包括反应容器在内的样品(PRG重量)、参考(RRG重量)和空白样品(BRG重量)反应容器内存留的物质称重。
h)在进行如f)中所述的处理后，计算如下反应容器内留存的物质重量
样品(Pnv重量＝PRG重量-RGP重量)，
参考(Rnv重量＝RRG重量-RGR重量)
及空白样品(Bnv重量＝BRG重量-RGB重量)。
i)在进行如f)中所述的处理后，测定反应容器内留存物质的水含量
样品(H2OPnv重量)，
参考(H2ORnv重量)
及空白样品(H2OBnv重量)。
j)在进行如f)中所述的处理后，计算如下反应容器内留存物质的干燥部分
样品(Pnvtr重量＝Pnv重量-H2OPnv重量)
参考(Rnvtr重量＝Rnv重量-H2ORnv重量)
及空白样品(Bnvtr重量＝Bnv-H2OBnv重量)。
k)对如下项测定校正的重量
样品(Pnvkorr重量＝Pnvtr重量-Bnvtr重量)
及参考(Rnvkorr重量＝Rnvtr重量-Bnvtr重量)
l)相对于样品起始量的干重，计算酶消化后经校正的存留的水不溶性淀粉重量百分数(RSaP＝Pnvkorr重量/Ptr重量×100)
并相对于参考起始量的干重，计算酶消化后参考中经校正的存留的水不溶性淀粉重量百分数(RSaR＝Rnvkorr重量/Rtr重量×100)。
m)测定酶消化样品后留存的水不溶性淀粉百分数的平均值(RSaPMW＝n×RSaP/n)
并测定参考中存留的水不溶性淀粉百分数的平均值(回收率；RSaRMW＝n×RSaR/n)
在其中n是对各批次水不溶性淀粉所实施的样品和参考分析的数目。
n)通过用回收率校正酶消化后留存的水不溶性淀粉百分数的平均值而测定各批次水不溶性淀粉的RS百分含量(RS＝RSaPMW/RSaRMW×100)。
方法5：测定淀粉颗粒的形态学特征和物理化学特征
淀粉颗粒形态学的分析通过配置索尼彩色视频照相机(CCD-Iris/RGB)的光学显微镜(LM)(Axiophot，德国)和扫描电子显微镜(SEM，JEOL 6300F，日本)开展。对于LM，颗粒在可视化前以2×稀释的Lugol溶液染色。对于SEM，在银带上铺展并固定在铜盘上的干燥淀粉样品以20nm铂层包被。随后用加速电压1.5-3.5keV操作的扫描电子显微镜检查样品。工作距离9mm。齿斑葡聚糖聚合物用LM通过以10×稀释的赤藓红红色染色试剂(Disclosing Red-Cote溶液)(American Dental TradingBV，荷兰)对淀粉颗粒染色而可视化。齿斑葡聚糖聚合物由作为阳性对照起作用的链球菌葡糖基转移酶(变异链球菌(Streptococcus mutans)20381、变异链球菌6067和远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)6070的混合物在蔗糖存在下产生(Wiater等，1999)。外切葡聚糖酶(α-1，3-葡聚糖酶，EC3.2.1.59)由哈茨木霉(Trichoderma harzianum)F-470产生(Wiater和Szczodrak，2002)。葡聚糖酶测定用乙酸钠缓冲液(pH5.5)中的0.025单位外切葡聚糖酶在10mg(转基因)淀粉存在下于40℃开展48小时。短暂离心(1分钟，10,000g)后，弃去上清液并将淀粉颗粒用赤藓红红色染色溶液染色。
方法6：SDS PAGE分析齿斑葡聚糖蔗糖酶的活性及染色。
蛋白质提取物从植物组织中制备。通过SDS PAGE分离蛋白质(大约80μg总植物蛋白)，随后用50mM pH 5.3乙酸钠缓冲液洗涤除去SDS并在50mM pH 5.3乙酸钠、5％(w/v)蔗糖中于37℃温育凝胶16小时，检测各个植物蛋白提取物中的齿斑葡聚糖蔗糖酶活性(Miller和Robyt，Analytical Biochemistry 156，(1986)，357-363)。与蔗糖温育后，白色条带在齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的位置处显现，原因在于齿斑葡聚糖是水不溶性葡聚糖。此外，SDS凝胶可以如上所述(方法5)用赤藓红红色染色试剂染色。
为进一步增强SDS PAGE测定的敏感性，可以在含有蔗糖的温育缓冲液中包含葡聚糖T10(约5％至10％)。
本发明具体由如下实例说明，这些实例无论如何不是限制性的。
实施例1：含有成熟或截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶基因的构建体的制备
含有patatin启动子(Wenzler等，1989)，来自白花蝇子草(Silenepratensis)的叶绿体铁氧还蛋白的信号肽(FD)(Pilon等，1995)和NOS终止子的表达盒克隆至pBluescript SK(pBS SK)质粒，得到pPF。来自汗毛链球菌Mfe28的成熟的齿斑葡聚糖蔗糖酶(GtfI)基因以符合可读框的方式连接于信号肽FD和NOS终止子之间。成熟的GtfI基因使用有校对作用的Pfu turbo DNA聚合酶(2.5单位/μl；Stratagene)，以及含有SmaI限制性位点的正向引物(5’-AGCTTGCGGC CCCGGGACTGAAAC-3’)和含有EcoRI限制性位点的反向引物(5’-GTGGTGGTG GAATTCGAGTTAGTTC-3’)通过PCR扩增并克隆至pPF的SmaI/EcoRI限制性位点，得到pPFGtfI。FD和融合的GtfI基因由Baseclear(荷兰)在单一方向进行完全测序以验证构建体的正确性。pPFGtfI以XhoI消化并连接至pBIN20二元载体(Hennegan和Danna，1998)，得到pPFI。
为构建包含截短的GtfI基因的FD-GtfICAT-NOS融合体，GtfI基因以含有SmaI限制性位点的正向引物(5’-AGCTTGCGGC CCCGGGACTGAAAC-3’)和含有EcoRI限制性位点的反向引物(5’-AGAAG GAATTCTCATCTTAAACATTGAGGTA-3’)通过PCR扩增并克隆至pPF的SmaI/EcoRI限制性位点，得到pPFGtfICAT。测序并克隆至pBIN20双元载体如对pDFI所述开展，得到pPFICAT。
实施例2：马铃薯植物的转化和再生
使用电穿孔法(Takken等，2000)，将pPFI和pPFICAT分别转化至根瘤土壤杆菌菌株LBA 4404。来自四倍体马铃薯基因型栽培变种Kardal(KD)的节间茎片段用于土壤杆菌介导性转化。转化体在具有含卡那霉素(100mg/l)的MS30培养基(Murashige和Skoog，1962)的平皿上选择。对于每个构建体繁殖30株形成根的转基因苗并转移至温室以便块茎发育。成熟的块茎在18周后收获。
转化的马铃薯植物系列分别称作KDIxx和KDICxx，其中I和IC分别指Gtfi和gtfiCAT基因并且xx指克隆号码。
实施例3：淀粉分离
马铃薯块茎剥皮并在Sanamat Rotor(Spangenberg，荷兰)中匀浆。得到的匀浆液于4℃过夜并将马铃薯汁液倾析并贮存于-20℃以表征可溶性齿斑葡聚糖聚合物。淀粉沉淀以水洗涤三次并且最终在室温空气干燥至少3日。将干燥的淀粉粉碎并在室温贮藏。
实施例4：使用半定量和实时定量RT-PCR分析对GtfI和GtfICAT基因进行表达分析
根据Kuipers等(1994)从所选转基因系的3g(鲜重)马铃薯块茎材料分离RNA。
对于半定量RT-PCR，50μg总RNA用DNAse I处理并使用Gene-elute哺乳动物总RNA试剂盒(Sigma，荷兰)纯化。使用5μg总RNA与500ng引物聚脱氧胸苷(5’-ttttttttttttttttttttttttt-3’)和12.5mM每一dNTP(终体积12μl)在65℃温育5分钟开展逆转录。短暂离心后(30秒；10,000g)，混合物于42℃与4μl的5×第一链缓冲液(Invitrogen，荷兰)及2μl的0.1M DTT温育2分钟。加入1μl SuperScript II RNA酶H-逆转录酶(200单位/μl；Invitrogen)并且混合物在42℃温育50分钟。此后，通过在70℃加热样品15分钟终止反应。2.5μl cDNA用于如下所述具有后续引物/Tm/循环数组合的标准PCR反应。对于每一组合，优化循环数以便保持处于对数期。GtfIRT引物5’-CCGTGCTTACAGTACCTCAGC-3’和5’-GGTCGTTAGCATTGTAGGTGAAA-3’(Tm＝59℃，35个循环)基于GtfI基因序列(Ferretti等，1987)。Ubi3引物5’-GTCAGGCCCAATTACGAAGA-3’和5’-AAGTTCCAGCACCGCACTC-3’(Tm＝55℃，40个循环)用作内部对照并且基于马铃薯的遍在蛋白核糖体蛋白基因序列(Ubi3)(Garbarino和Belknap，1994)。
在众多转化体上开展RT-PCR，将KDI或KDIC每一系列中的这些转化体基于不同PCR产物的条带密度分别分为三类。条带密度与用作内部对照的Ubi3(Garbarino和Belknap，1994)的密度相比较。因此，这些转化体被分为(-)、(+)或(++)三类，其中(-)、(+)和(++)分别代表不可检测的、中等水平的和高水平的mRNA。如所预期，在KD-UT植物中未检测到GtfImRNA
对KDI和KDIC系列的不同类别转化体开展其它特征描述。
实施例5：齿斑葡聚糖表达对淀粉颗粒形态学、对齿斑葡聚糖与淀粉的结合、对植物形态学、块茎数和产量的影响。
淀粉颗粒的形态学如本发明一般方法(方法5)中所描述通过SEM和LM测定。
借助两种手段(SEM和LM)，对于KDI和KDIC系列观察到变异淀粉颗粒的存在。图1显示通过扫描电子显微镜分析观察到的与野生型Kardal植物(Kardal)的淀粉相比，所选择的用成熟的齿斑葡聚糖蔗糖酶基因(KDI)或截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶基因(KDIC)转化的马铃薯植物改性淀粉颗粒形态学。
对于KDI系列，淀粉含有形状不常见的颗粒，具有凸出的形态以及与大颗粒结合的小颗粒。对于KDIC系列，淀粉含有形状不常见的颗粒，具有受侵蚀的和凸出的形态。常在颗粒表面观察到额外的孔洞。对每一系列如此开展变异淀粉颗粒数的定量，即对来自经实施例4中经RT-PCR所定义的(-)、(+)和(++)每一类转化体通过分析100个颗粒淀粉群体重复三次进行定量。图2显示对非转化植物(KD-UT)、系列KDI的不同类别的转化体[KDI14(-)、KDI30(+)、KDI11(++)和KDI20(++)]以及对KDIC的不同类别的转化体[KDIC1(-)、KDIC22(+)、KDIC14(++)和KDIC15(++)]的变异淀粉颗粒的百分数。对于由RT-PCR测定显示具有中等水平或高水平mRNA的转化体，变异淀粉颗粒百分数为约20％至约30％。对mRNA水平检测不到的转化植物，变异淀粉的频率为约13％。对于非转化植物，变异淀粉的频率为约3％。
赤藓红染色溶液用于使结合至淀粉颗粒的齿斑葡聚糖聚合物可视化。作为阳性对照，用该染色溶液可染色齿斑葡聚糖聚合物(Wiater等，1999)。有趣地是，齿斑葡聚糖聚合物以结合或游离的形态存在于KDIC系列转化体的淀粉颗粒表面。图3显示了存在于KDIC15淀粉颗粒表面的已染色齿斑葡聚糖。对于KDI系列未观察到染色(图3)，这与非转化植物相当。当KDIC转化体淀粉颗粒用外切葡聚糖酶溶液处理时，大部分齿斑葡聚糖聚合物从淀粉颗粒解离。这表明结合仅表层地存在于淀粉颗粒表面。
齿斑葡聚糖聚合物对KDI淀粉颗粒的不结合可能是由于产生了具有较低分子量的齿斑葡聚糖聚合物，因而限制它们对颗粒表面的黏附。
对于KDI和KDIC系列，块茎数、产量和植物形态学未改变并且与非转化植物相当。
实施例7：齿斑葡聚糖表达对通过Thermo Haake验电器所测量的黏度测量曲线的影响
已经使用本发明一般方法(方法2)中所述的方法，通过Thermo Haake验电器测定了来自淀粉混悬液的黏度测定曲线，其中所述淀粉混悬液从用成熟的齿斑葡聚糖蔗糖酶GtfI基因(KDI)或截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶gtficat基因(KDIC)转化的马铃薯植物或从野生型Kardal植物(Kardal)得到。
下表显示与野生型Kardal植物(Kardal)的淀粉相比较，提取自所选择转化体(KDI或KDIC)的淀粉样品在T-起始温度、最小(低谷)黏度和终黏度上的增加。
Kardal、KDI和KDIC：从2％淀粉溶液中两次独立分析的平均值
淀粉样品 T-起始(℃) T-峰值(℃)  峰值黏度(PaS)  低谷黏度(PaS)  终黏度(PaS)
Kardal  73.7  75.4  117  21  110
KDIC  75.3  78.1  123  44  185
KDI  74.1  76.3  96  24  114
实施例8：齿斑葡聚糖表达对胶的凝胶形成特性的影响
胶的凝胶形成特性(即凝胶强度)使用一般方法中详细说明的方法(方法3)对从用成熟齿斑葡聚糖蔗糖酶GtfI基因(齿斑葡聚糖蔗糖酶全长030系)或截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶gtficat基因(齿斑葡聚糖蔗糖酶截短014系、015系、024系)转化的马铃薯植物及从野生型Kardal植物(Kardal 1和Kardal 2)中得到的淀粉混悬液加以测定。
下表显示与野生型Kardal植物中所提取的淀粉相比，从以成熟或截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶基因转化的马铃薯植物中所提取的淀粉样品凝胶强度的增长。
 凝胶强度(g)
齿斑葡聚糖蔗糖酶全长030系  51.0
齿斑葡聚糖蔗糖酶截短014系  64.0
齿斑葡聚糖蔗糖酶截短015系白马铃薯  93.0
齿斑葡聚糖蔗糖酶截短015系棕马铃薯  73.0
齿斑葡聚糖蔗糖酶截短024系  48.0
KARDAL1  36.0
KARDAL2  38.0
实施例9：齿斑葡聚糖表达对淀粉消化性的影响
淀粉的消化性已经使用一般方法中详述的方法(方法4)测定。该测量基于Englyst(European Journal of Clinical Nutrition(1992)46(suppl.2)，第33-50页)用于测定抗性淀粉III型的方法并按照WO 00 02926中关于测定RS含量测定方面的信息加以改进。
下表显示，与野生型Kardal植物(Kardal)的淀粉相比，用截短的齿斑葡聚糖蔗糖酶基因(KDIC)转化的马铃薯植物中所提取样品的已消化淀粉百分数降低。
已消化淀粉的(平均)百分数(％)：
15  30  45  60  120  180  240  300  360分钟
Kardal 3    5    7    9    15    21    26    31    37
KDIC   3    4    6    8    13    19    25    30    35
----------------------------------------------------------------
Kardal：来自四个独立测量值的平均值
KDIC：来自四个独立测量值的平均值
所提及的全部出版物、专利申请和专利在本文中以与每一出版物、专利申请和专利具体且个别标明引用作为参考相等的程度引用作为参考。
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序列表
<110>拜尔作物科学股份公司(BAYER CROPSCIENCE AG)
<120>表达齿斑葡聚糖蔗糖酶并合成改性淀粉的转化植物
<130>BCS 04-5011-PCT
<160>4
<170>PatentIn 3.1版
<210>1
<211>4794
<212>DNA
<213>汗毛链球菌(Streptococcus downei)
<220>
<221>sig_peptide
<222>(1)..(114)
<223>编码齿斑葡聚糖蔗糖酶分泌信号肽的序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(4791)
<223>
<220>
<221>misc_feature
<222>(3154)..(4197)
<223>编码齿斑葡聚糖蔗糖酶的基因的C-末端(葡聚糖结合)结构域
<220>
<221>misc_feature
<222>(115)..(438)
<223>编码齿斑葡聚糖蔗糖酶的基因的可变区域
<220>
<221>misc_feature
<222>(439)..(3153)
<223>编码齿斑葡聚糖蔗糖酶的基因的活性核心区域
<400>1
atg gag aag aat gaa cgt ttt aag atg cat aag gtc aaa aag aga tgg   48
Met Glu Lys Asn Glu Arg Phe Lys Met His Lys Val Lys Lys Arg Trp
1               5                   10                  15
gtg act atc tca gtt gca tct gcc act atg tta gct tca gct ctc ggt   96
Val Thr Ile Ser Val Ala Ser Ala Thr Met Leu Ala Ser Ala Leu Gly
            20                  25                  30
gct tca gtt gct agc gca gat act gaa act gtt agc gaa gac agc aac   144
Ala Ser Val Ala Ser Ala Asp Thr Glu Thr Val Ser Glu Asp Ser Asn
        35                  40                  45
caa gca gtc ttg acg gct gac caa acg act acc aac caa gat act gag   192
Gln Ala Val Leu Thr Ala Asp Gln Thr Thr Thr Asn Gln Asp Thr Glu
    50                  55                  60
caa act tct gtt gca gcg aca gct aca tca gaa cag tct gct tca act   240
Gln Thr Ser Val Ala Ala Thr Ala Thr Ser Glu Gln Ser Ala Ser Thr
65                  70                  75                  80
gat gca gca aca gat caa gca tca gca aca gat caa gca tca gca gca   288
Asp Ala Ala Thr Asp Gln Ala Ser Ala Thr Asp Gln Ala Ser Ala Ala
                85                  90                  95
gag caa act caa gga aca aca gct agc aca gac acg gca gct caa aca    336
Glu Gln Thr Gln Gly Thr Thr Ala Ser Thr Asp Thr Ala Ala Gln Thr
            100                 105                 110
acc aca aat gct aat gaa gct aag tgg gtt ccg act gaa aat gag aac    384
Thr Thr Asn Ala Asn Glu Ala Lys Trp Val Pro Thr Glu Asn Glu Asn
        115                 120                 125
caa gtt ttt aca gat gag atg tta gca gaa gcc aag aat gtg gct act    432
Gln Val Phe Thr Asp Glu Met Leu Ala Glu Ala Lys Asn Val Ala Thr
    130                 135                 140
gct gaa tct aat tca att cca tca gac ttg gct aaa atg tca aat gtt    480
Ala Glu Ser Asn Ser Ile Pro Ser Asp Leu Ala Lys Met Ser Asn Val
145                 150                 155                 160
aag cag gtt gac ggt aaa tat tat tac tac gat caa gac ggc aac gtt    528
Lys Gln Val Asp Gly Lys Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Gln Asp Gly Asn Val
                165                 170                 175
aag aag aac ttt gct gtt agc gtt ggt gag aag atc tat tac ttt gat    576
Lys Lys Asn Phe Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp
            180                 185                 190
gaa act ggc gct tac aaa gac act agc aag gta gaa gcg gat aaa tca    624
Glu Thr Gly Ala Tyr Lys Asp Thr Ser Lys Val Glu Ala Asp Lys Ser
        195                 200                 205
ggt tct gat atc agc aaa gaa gaa aca acc ttt gct gct aac aac cgt    672
Gly Ser Asp Ile Ser Lys Glu Glu Thr Thr Phe Ala Ala Asn Asn Arg
    210                 215                 220
gct tac agt acc tca gct gaa aac ttt gaa gcc att gat aac tac ttg    720
Ala Tyr Ser Thr Ser Ala Glu Asn Phe Glu Ala Ile Asp Asn Tyr Leu
225                 230                 235                 240
aca gct gac tca tgg tac cgt cca aag tct atc ctc aag gat ggt aag    768
Thr Ala Asp Ser Trp Tyr Arg Pro Lys Ser Ile Leu Lys Asp Gly Lys
                245                 250                 255
act tgg aca gaa tca agc aag gat gac ttc cgt ccg cta ttg atg gct    816
Thr Trp Thr Glu Ser Ser Lys Asp Asp Phe Arg Pro Leu Leu Met Ala
            260                 265                 270
tgg tgg cca gat acc gaa acc aaa cgc aac tat gtt aac tac atg aac    864
Trp Trp Pro Asp Thr Glu Thr Lys Arg Asn Tyr Val Asn Tyr Met Asn
        275                 280                 285
aag gtt gtt ggt atc gat aaa acc tat acc gct gaa aca agc cag gct    912
Lys Val Val Gly Ile Asp Lys Thr Tyr Thr Ala Glu Thr Ser Gln Ala
    290                 295                 300
gac ctg aca gca gca gct gaa ctg gtt caa gcc cgt atc gaa caa aag    960
Asp Leu Thr Ala Ala Ala Glu Leu Val Gln Ala Arg Ile Glu Gln Lys
305                 310                 315                 320
att aca act gaa caa aat acc aaa tgg ttg cgt gaa gct atc tca gct    1008
Ile Thr Thr Glu Gln Asn Thr Lys Trp Leu Arg Glu Ala Ile Ser Ala
                325                 330                 335
ttt gtt aaa act caa cca caa tgg aat ggt gaa agc gaa aag cca tac    1056
Phe Val Lys Thr Gln Pro Gln Trp Asn Gly Glu Ser Glu Lys Pro Tyr
            340                 345                 350
gat gac cac ttg caa aat ggt gcc ctc aag ttc gat aac caa tct gat    1104
Asp Asp His Leu Gln Asn Gly Ala Leu Lys Phe Asp Asn Gln Ser Asp
        355                 360                 365
ttg aca cca gat acg caa tcg aac tat cgt ttg ctc aat cgc aca cca    1152
Leu Thr Pro Asp Thr Gln Ser Asn Tyr Arg Leu Leu Asn Arg Thr Pro
    370                 375                 380
act aac caa act ggt tcc ctg gac tct cgt ttc acc tac aat gct aac    1200
Thr Asn Gln Thr Gly Ser Leu Asp Ser Arg Phe Thr Tyr Asn Ala Asn
385                 390                 395                 400
gac ccg tta ggt ggt tat gag ttg ctt ctg gct aac gac gtg gat aac    1248
Asp Pro Leu Gly Gly Tyr Glu Leu Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn
                405                 410                 415
tct aat ccc atc gtt caa gca gag caa ctc aac tgg ctg cat tac ctg    1296
Ser Asn Pro Ile Val Gln Ala Glu Gln Leu Asn Trp Leu His Tyr Leu
            420                 425                 430
ctc aac ttc ggt act atc tat gct aaa gat gcg gat gct aac ttt gac    1344
Leu Asn Phe Gly Thr Ile Tyr Ala Lys Asp Ala Asp Ala Asn Phe Asp
        435                 440                 445
tct atc cgt gtt gat gcg gta gat aat gtc gat gct gac ctt ctg caa    1392
Ser Ile Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln
    450                 455                 460
atc tct agt gat tac ctt aag gca gct tac ggt atc gat aaa aac aac    1440
Ile Ser Ser Asp Tyr Leu Lys Ala Ala Tyr Gly Ile Asp Lys Asn Asn
465                 470                 475                 480
aaa aat gct aat aac cac gtt tct atc gta gaa gca tgg agc gac aac    1488
Lys Asn Ala Asn Asn His Val Ser Ile Val Glu Ala Trp Ser Asp Asn
                485                 490                 495
gat acc cct tat ctc cat gat gat ggc gac aac ctc atg aac atg gac    1536
Asp Thr Pro Tyr Leu His Asp Asp Gly Asp Asn Leu Met Asn Met Asp
            500                 505                 510
aac aag ttc cgt ttg tct atg ctt tgg tct ttg gct aaa cca ttg gac    1584
Asn Lys Phe Arg Leu Ser Met Leu Trp Ser Leu Ala Lys Pro Leu Asp
        515                 520                 525
aaa cgt tct ggc ttg aat ccc ctc atc cac aac agt ctg gtt gac cgt    1632
Lys Arg Ser Gly Leu Asn Pro Leu Ile His Asn Ser Leu Val Asp Arg
    530                 535                 540
gaa gtg gat gac cgt gaa gtt gaa acc gtt cca agt tac agc ttt gcc    1680
Glu Val Asp Asp Arg Glu Val Glu Thr Val Pro Ser Tyr Ser Phe Ala
545                 550                 555                 560
cgt gct cac gat agc gaa gta caa gac ctg att cgt gac atc atc aag    1728
Arg Ala His Asp Ser Glu Val Gln Asp Leu Ile Arg Asp Ile Ile Lys
                565                 570                 575
gct gaa att aat cca aat gca ttt ggt tat tca ttt act caa gac gaa    1776
Ala Glu Ile Asn Pro Asn Ala Phe Gly Tyr Ser Phe Thr Gln Asp Glu
            580                 585                 590
atc gac caa gcc ttc aag att tac aac gaa gac ctc aag aag acc gat    1824
Ile Asp Gln Ala Phe Lys Ile Tyr Asn Glu Asp Leu Lys Lys Thr Asp
        595                 600                 605
aag aaa tac act cac tac aat gtg ccg ctt tct tat acc ttg ctt ctg    1872
Lys Lys Tyr Thr His Tyr Asn Val Pro Leu Ser Tyr Thr Leu Leu Leu
    610                 615                 620
act aac aag ggt tcg att cct cgc gtc tat tat gga gat atg ttc acc    1920
Thr Asn Lys Gly Ser Ile Pro Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Met Phe Thr
625                 630                 635                 640
gat gat ggt caa tac atg gcc aac aag act gtg aac tac gat gct atc    1968
Asp Asp Gly Gln Tyr Met Ala Asn Lys Thr Val Asn Tyr Asp Ala Ile
                645                 650                 655
gaa tct ctg ctg aaa gcc cgt atg aag tac gtt gct ggt ggt caa gct    2016
Glu Ser Leu Leu Lys Ala Arg Met Lys Tyr Val Ala Gly Gly Gln Ala
            660                 665                 670
atg caa aat tac caa atc ggt aat ggc gaa atc ttg act tct gtc cgt    2064
Met Gln Asn Tyr Gln Ile Gly Asn Gly Glu Ile Leu Thr Ser Val Arg
        675                 680                 685
tat ggt aag ggt gcc ctt aaa caa agc gat aag ggt gat gcg aca act    2112
Tyr Gly Lys Gly Ala Leu Lys Gln Ser Asp Lys Gly Asp Ala Thr Thr
    690                 695                 700
cgt acg tca ggt gtc ggc gtt gtt atg gga aac caa ccc aac ttt agc    2160
Arg Thr Ser Gly Val Gly Val Val Met Gly Asn Gln Pro Asn Phe Ser
705                 710                 715                 720
ttg gat gga aag gtt gta gcc ctc aac atg ggt gct gcc cac gct aac    2208
Leu Asp Gly Lys Val Val Ala Leu Asn Met Gly Ala Ala His Ala Asn
                725                 730                 735
caa gaa tac cgt gct ctt atg gta tca act aaa gac ggt gtt gca acc    2256
Gln Glu Tyr Arg Ala Leu Met Val Ser Thr Lys Asp Gly Val Ala Thr
            740                 745                 750
tat gct aca gat gct gat gct agc aag gct ggt ctg gtt aag cgc aca    2304
Tyr Ala Thr Asp Ala Asp Ala Ser Lys Ala Gly Leu Val Lys Arg Thr
        755                 760                 765
gat gaa aat ggt tac ctc tac ttc ttg aac gac gat ctc aag ggg gtt    2352
Asp Glu Asn Gly Tyr Leu Tyr Phe Leu Asn Asp Asp Leu Lys Gly Val
    770                 775                 780
gct aac cct cag gtt tct ggt ttc ctt caa gtc tgg gta cca gtg gga    2400
Ala Asn Pro Gln Val Ser Gly Phe Leu Gln Val Trp Val Pro Val Gly
785                 790                 795                 800
gca gca gat gac caa gat att cgt gta gca gct agc gat aca gca agt    2448
Ala Ala Asp Asp Gln Asp Ile Arg Val Ala Ala Ser Asp Thr Ala Ser
                805                 810                 815
acc gat gga aaa tca ctc cat caa gat gct gcc atg gac tct cgc gtc    2496
Thr Asp Gly Lys Ser Leu His Gln Asp Ala Ala Met Asp Ser Arg Val
            820                 825                 830
atg ttt gaa ggt ttc tct aac ttc caa tct ttt gcg aca aaa gaa gaa    2544
Met Phe Glu Gly Phe Ser Asn Phe Gln Ser Phe Ala Thr Lys Glu Glu
        835                 840                 845
gag tat acc aat gtt gtt att gct aac aat gtt gat aaa ttt gtt tca    2592
Glu Tyr Thr Asn Val Val Ile Ala Asn Asn Val Asp Lys Phe Val Ser
    850                 855                 860
tgg gga atc act gac ttt gaa atg gct cct cag tat gtc tca tct act    2640
Trp Gly Ile Thr Asp Phe Glu Met Ala Pro Gln Tyr Val Ser Ser Thr
865                 870                 875                 880
gac ggt cag ttc ctt gat tct gtc att caa aat ggt tat gcc ttt acc    2688
Asp Gly Gln Phe Leu Asp Ser Val Ile Gln Asn Gly Tyr Ala Phe Thr
                885                 890                 895
gac cgt tat gac ttg ggt atg tct aaa gca aac aag tat ggt aca gcc    2736
Asp Arg Tyr Asp Leu Gly Met Ser Lys Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Ala
            900                 905                 910
gac caa ttg gtt aag gct atc aag gct ctc cat gct aaa ggc ctg aag    2784
Asp Gln Leu Val Lys Ala Ile Lys Ala Leu His Ala Lys Gly Leu Lys
        915                 920                 925
gtt atg gca gac tgg gtt cca gac caa atg tac acc ttc cct aaa caa    2832
Val Met Ala Asp Trp Val Pro Asp Gln Met Tyr Thr Phe Pro Lys Gln
    930                 935                 940
gaa gtg gtc act gtt act cgg aca gat aag ttt ggc aaa cca atc gca    2880
Glu Val Val Thr Val Thr Arg Thr Asp Lys Phe Gly Lys Pro Ile Ala
945                 950                 955                 960
gga agc caa att aat cac agt ctc tac gta aca gat aca aag agc tct    2928
Gly Ser Gln Ile Asn His Ser Leu Tyr Val Thr Asp Thr Lys Ser Ser
                965                 970                 975
ggt gat gac tat caa gct aaa tac ggc ggt gcc ttc ctt gac gaa tta    2976
Gly Asp Asp Tyr Gln Ala Lys Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Asp Glu Leu
            980                 985                 990
aag gaa aaa tat cca gaa ctc ttt acc aag aag caa atc tct acc ggc    3024
Lys Glu Lys Tyr Pro Glu Leu Phe Thr Lys Lys Gln Ile Ser Thr Gly
        995                 1000                1005
caa gcc ata gat cca tct gtt aag att aaa caa tgg tct gct aag        3069
Gln Ala Ile Asp Pro Ser Val Lys Ile Lys Gln Trp Ser Ala Lys
    1010                1015                1020
tac ttc aac ggt agc aat atc ctt ggc cgg ggt gcc gat tat gtc    3114
Tyr Phe Asn Gly Ser Asn Ile Leu Gly Arg Gly Ala Asp Tyr Val
    1025                 1030               1035
ctc agc gac caa gca agc aac aag tac ctc aat gtt tca gat gat    3159
Leu Ser Asp Gln Ala Ser Asn Lys Tyr Leu Asn Val Ser Asp Asp
    1040                1045                1050
aaa ctc ttc ttg cca aaa act ctc cta ggt caa gtc gta gaa tca    3204
Lys Leu Phe Leu Pro Lys Thr Leu Leu Gly Gln Val Val Glu Ser
    1055                1060                1065
ggt atc cgc ttt gat gga act ggt tat gtc tac aac tca agc aca    3249
Gly Ile Arg Phe Asp Gly Thr Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ser Thr
    1070                1075                1080
aca ggt gaa aag gta acc gat agc ttt att act gaa gct ggt aat    3294
Thr Gly Glu Lys Val Thr Asp Ser Phe Ile Thr Glu Ala Gly Asn
    1085                1090                1095
ctt tac tac ttt ggc caa gat ggt tac atg gtg act ggt gcc caa    3339
Leu Tyr Tyr Phe Gly Gln Asp Gly Tyr Met Val Thr Gly Ala Gln
    1100                1105                1110
aac atc aag gga tct aac tat tac ttc ctg gct aat ggt gct gcc    3384
Asn Ile Lys Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Leu Ala Asn Gly Ala Ala
    1115                1120                1125
ctt cgc aat aca gtt tat act gat gcc caa ggt caa aac cat tac    3429
Leu Arg Asn Thr Val Tyr Thr Asp Ala Gln Gly Gln Asn His Tyr
    1130                1135                1140
tat ggc aac gac ggt aaa cgt tac gaa aat ggt tac caa caa ttt    3474
Tyr Gly Asn Asp Gly Lys Arg Tyr Glu Asn Gly Tyr Gln Gln Phe
    1145                1150                1155
ggt aat gac agc tgg cgt tac ttc aag aat ggt gtc atg gca ctt    3519
Gly Asn Asp Ser Trp Arg Tyr Phe Lys Asn Gly Val Met Ala Leu
    1160                1165                1170
ggc ctg aca acc gtt gat ggt cac gtt caa tac ttt gat aaa gat    3564
Gly Leu Thr Thr Val Asp Gly His Val Gln Tyr Phe Asp Lys Asp
    1175                1180                1185
ggt gtt caa gct aag gat aag att att gtc acc cgt gat ggt aag    3609
Gly Val Gln Ala Lys Asp Lys Ile Ile Val Thr Arg Asp Gly Lys
    1190                1195                1200
gtt cgt tac ttc gac caa cat aat gga aat gct gta acc aat acc    3654
Val Arg Tyr Phe Asp Gln His Asn Gly Asn Ala Val Thr Asn Thr
    1205                1210                1215
ttc gtc gct gac aag act ggt cac tgg tac tat cta ggt aaa gat    3699
Phe Val Ala Asp Lys Thr Gly His Trp Tyr Tyr Leu Gly Lys Asp
    1220                1225                1230
ggt gtc gct gtt acc ggt gct caa act gtt ggt aaa caa cac ctt    3744
Gly Val Ala Val Thr Gly Ala Gln Thr Val Gly Lys Gln His Leu
    1235                1240                1245
tac ttc gaa gcc aat ggt caa caa gtt aag ggt gac ttt gtc aca    3789
Tyr Phe Glu Ala Asn Gly Gln Gln Val Lys Gly Asp Phe Val Thr
    1250                1255                1260
gcc aaa gat ggt aaa ctt tac ttc tac gat gtt gac tct ggt gac    3834
Ala Lys Asp Gly Lys Leu Tyr Phe Tyr Asp Val Asp Ser Gly Asp
    1265                1270                1275
atg tgg acc aat acc ttc att gaa gac aag gca ggc aac tgg ttc    3879
Met Trp Thr Asn Thr Phe Ile Glu Asp Lys Ala Gly Asn Trp Phe
    1280                1285                1290
tat ctt ggt aaa gat ggc gca gct gtc aca ggt gct caa acc atc    3924
Tyr Leu Gly Lys Asp Gly Ala Ala Val Thr Gly Ala Gln Thr Ile
    1295                1300                1305
aag ggc caa aaa ctt tac ttc aag gct aac ggc caa caa gtt aag    3969
Lys Gly Gln Lys Leu Tyr Phe Lys Ala Asn Gly Gln Gln Val Lys
    1310                1315                1320
ggt gat atc gtc aag gat gcc gat ggt aag att cgt tac tac gat    4014
Gly Asp Ile Val Lys Asp Ala Asp Gly Lys Ile Arg Tyr Tyr Asp
    1325                1330                1335
gcc caa act ggt gaa caa gtc ttt aat aag tct gta agt gtt aac    4059
Ala Gln Thr Gly Glu Gln Val Phe Asn Lys Ser Val Ser Val Asn
    1340                1345                1350
ggt aag act tac tac ttc ggt agt gat gga act gct caa act cag    4104
Gly Lys Thr Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Gly Thr Ala Gln Thr Gln
    1355                1360                1365
gct aat cca aag ggt caa acc ttt aag gat ggt tct gga gtt ctt    4149
Ala Asn Pro Lys Gly Gln Thr Phe Lys Asp Gly Ser Gly Val Leu
    1370                1375                1380
cgt ttc tac aat ctt gaa ggt cag tat gta tca ggt agt gga tgg    4194
Arg Phe Tyr Asn Leu Glu Gly Gln Tyr Val Ser Gly Ser Gly Trp
    1385                1390                1395
tat gaa aca gca gag cac gaa tgg gtt tat gtt aaa tct ggt aag    4239
Tyr Glu Thr Ala Glu His Glu Trp Val Tyr Val Lys Ser Gly Lys
    1400                1405                1410
gta ttg act ggt gct caa acc att gga aat caa cga gtt tac ttc    4284
Val Leu Thr Gly Ala Gln Thr Ile Gly Asn Gln Arg Val Tyr Phe
    1415                1420                1425
aag gat aat ggc cat caa gtc aaa ggt caa ttg gta act ggt aac    4329
Lys Asp Asn Gly His Gln Val Lys Gly Gln Leu Val Thr Gly Asn
    1430                1435                1440
gat ggt aag ctt cgc tac tat gat gcc aac tct ggc gac cag gct    4374
Asp Gly Lys Leu Arg Tyr Tyr Asp Ala Asn Ser Gly Asp Gln Ala
    1445                1450                1455
ttc aac aag tct gtg act gtt aat ggc aaa act tac tac ttc ggt 4419
Phe Asn Lys Ser Val Thr Val Asn Gly Lys Thr Tyr Tyr Phe Gly
    1460                1465                1470
agt gat gga act gct caa act cag gct aat cca aag ggt caa acc 4464
Ser Asp Gly Thr Ala Gln Thr Gln Ala Asn Pro Lys Gly Gln Thr
    1475                1480                1485
ttt aag gat ggt tct gga gtt ctt cgt ttc tac aat ctt gaa ggt 4509
Phe Lys Asp Gly Ser Gly Val Leu Arg Phe Tyr Asn Leu Glu Gly
    1490                1495                1500
cag tat gta tca ggt agt gga tgg tat aaa aat gcc caa ggt caa 4554
Gln Tyr Val Ser Gly Ser Gly Trp Tyr Lys Asn Ala Gln Gly Gln
    1505                1510                1515
tgg ctt tac gtt aaa gac gga aaa gta ttg act ggc ctg cag aca 4599
Trp Leu Tyr Val Lys Asp Gly Lys Val Leu Thr Gly Leu Gln Thr
    1520                1525                1530
gta ggt aac caa aag gtt tac ttt gat aaa aat ggt atc caa gcc 4644
Val Gly Asn Gln Lys Val Tyr Phe Asp Lys Asn Gly Ile Gln Ala
    1535                1540                1545
aaa ggt aag gct gta aga act tct gat ggt aag gtt cgc tac ttt 4689
Lys Gly Lys Ala Val Arg Thr Ser Asp Gly Lys Val Arg Tyr Phe
    1550                1555                1560
gat gaa aat tct ggt agc atg att acc aac caa tgg aaa ttt gtt 4734
Asp Glu Asn Ser Gly Ser Met Ile Thr Asn Gln Trp Lys Phe Val
    1565                1570                1575
tac gga caa tat tac tat ttc ggt agt gat ggt gct gct gtc tac 4779
Tyr Gly Gln Tyr Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Gly Ala Ala Val Tyr
    1580                1585                1590
cgt ggc tgg aac taa                                         4794
Arg Gly Trp Asn
    1595
<210>2
<211>1597
<212>PRT
<213>汗毛链球菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(3154)..(4197)
<223>编码齿斑葡聚糖蔗糖酶的基因的C-末端(葡聚糖结合)结构域
<220>
<221>misc_feature
<222>(115)..(438)
<223>编码齿斑葡聚糖蔗糖酶的基因的可变区域
<220>
<221>misc_feature
<222>(439)..(3153)
<223>编码齿斑葡聚糖蔗糖酶的基因的活性核心区域
<400>2
Met Glu Lys Asn Glu Arg Phe Lys Met His Lys Val Lys Lys Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Thr Ile Ser Val Ala Ser Ala Thr Met Leu Ala Ser Ala Leu Gly
            20                  25                  30
Ala Ser Val Ala Ser Ala Asp Thr Glu Thr Val Ser Glu Asp Ser Asn
        35                  40                  45
Gln Ala Val Leu Thr Ala Asp Gln Thr Thr Thr Asn Gln Asp Thr Glu
    50                  55                  60
Gln Thr Ser Val Ala Ala Thr Ala Thr Ser Glu Gln Ser Ala Ser Thr
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Asp Gln Ala Ser Ala Thr Asp Gln Ala Ser Ala Ala
                85                  90                  95
Glu Gln Thr Gln Gly Thr Thr Ala Ser Thr Asp Thr Ala Ala Gln Thr
            100                 105                 110
Thr Thr Asn Ala Asn Glu Ala Lys Trp Val Pro Thr Glu Asn Glu Asn
        115                120                  125
Gln Val Phe Thr Asp Glu Met Leu Ala Glu Ala Lys Asn Val Ala Thr
    130                 135                 140
Ala Glu Ser Asn Ser Ile Pro Ser Asp Leu Ala Lys Met Ser Asn Val
145                 150                 155                 160
Lys Gln Val Asp Gly Lys Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Gln Asp Gly Asn Val
                165                 170                 175
Lys Lys Asn Phe Ala Val Ser Val Gly Glu Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp
            180                 185                 190
Glu Thr Gly Ala Tyr Lys Asp Thr Ser Lys Val Glu Ala Asp Lys Ser
        195                 200                 205
Gly Ser Asp Ile Ser Lys Glu Glu Thr Thr Phe Ala Ala Asn Asn Arg
    210                 215                 220
Ala Tyr Ser Thr Ser Ala Glu Asn Phe Glu Ala Ile Asp Asn Tyr Leu
225                 230                 235                 240
Thr Ala Asp Ser Trp Tyr Arg Pro Lys Ser Ile Leu Lys Asp Gly Lys
                245                 250                 255
Thr Trp Thr Glu Ser Ser Lys Asp Asp Phe Arg Pro Leu Leu Met Ala
            260                 265                 270
Trp Trp Pro Asp Thr Glu Thr Lys Arg Asn Tyr Val Asn Tyr Met Asn
        275                 280                 285
Lys Val Val Gly Ile Asp Lys Thr Tyr Thr Ala Glu Thr Ser Gln Ala
    290                 295                 300
Asp Leu Thr Ala Ala Ala Glu Leu Val Gln Ala Arg Ile Glu Gln Lys
305                 310                 315                 320
Ile Thr Thr Glu Gln Asn Thr Lys Trp Leu Arg Glu Ala Ile Ser Ala
                325                 330                 335
Phe Val Lys Thr Gln Pro Gln Trp Asn Gly Glu Ser Glu Lys Pro Tyr
            340                 345                 350
Asp Asp His Leu Gln Asn Gly Ala Leu Lys Phe Asp Asn Gln Ser Asp
        355                 360                 365
Leu Thr Pro Asp Thr Gln Ser Asn Tyr Arg Leu Leu Asn Arg Thr Pro
    370                 375                 380
Thr Asn Gln Thr Gly Ser Leu Asp Ser Arg Phe Thr Tyr Asn Ala Asn
385                 390                 395                 400
Asp Pro Leu Gly Gly Tyr Glu Leu Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn
                405                 4l0                 415
Ser Asn Pro Ile Val Gln Ala Glu Gln Leu Asn Trp Leu His Tyr Leu
            420                 425                 430
Leu Asn Phe Gly Thr Ile Tyr Ala Lys Asp Ala Asp Ala Asn Phe Asp
        435                 440                 445
Ser Ile Arg Val Asp Ala Val Asp Asn Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln
    450                 455                 460
Ile Ser Ser Asp Tyr Leu Lys Ala Ala Tyr Gly Ile Asp Lys Asn Asn
465                 470                 475                 480
Lys Asn Ala Asn Asn His Val Ser Ile Val Glu Ala Trp Ser Asp Asn
                485                 490                 495
Asp Thr Pro Tyr Leu His Asp Asp Gly Asp Asn Leu Met Asn Met Asp
            500                 505                 510
Asn Lys Phe Arg Leu Ser Met Leu Trp Ser Leu Ala Lys Pro Leu Asp
        515                 520                 525
Lys Arg Ser Gly Leu Asn Pro Leu Ile His Asn Ser Leu Val Asp Arg
    530                 535                 540
Glu Val Asp Asp Arg Glu Val Glu Thr Val Pro Ser Tyr Ser Phe Ala
545                 550                 555                 560
Arg Ala His Asp Ser Glu Val Gln Asp Leu Ile Arg Asp Ile Ile Lys
                565                 570                 575
Ala Glu Ile Asn Pro Asn Ala Phe Gly Tyr Ser Phe Thr Gln Asp Glu
            580                 585                 590
Ile Asp Gln Ala Phe Lys Ile Tyr Asn Glu Asp Leu Lys Lys Thr Asp
        595                 600                 605
Lys Lys Tyr Thr His Tyr Asn Val Pro Leu Ser Tyr Thr Leu Leu Leu
    610                 615                 620
Thr Asn Lys Gly Ser Ile Pro Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Met Phe Thr
625                 630                 635                 640
Asp Asp Gly Gln Tyr Met Ala Asn Lys Thr Val Asn Tyr Asp Ala Ile
                645                 650                 655
Glu Ser Leu Leu Lys Ala Arg Met Lys Tyr Val Ala Gly Gly Gln Ala
            660                 665                 670
Met Gln Asn Tyr Gln Ile Gly Asn Gly Glu Ile Leu Thr Ser Val Arg
        675                 680                 685
Tyr Gly Lys Gly Ala Leu Lys Gln Ser Asp Lys Gly Asp Ala Thr Thr
    690                 695                 700
Arg Thr Ser Gly Val Gly Val Val Met Gly Asn Gln Pro Asn Phe Ser
705                 710                 715                 720
Leu Asp Gly Lys Val Val Ala Leu Asn Met Gly Ala Ala His Ala Asn
                725                 730                 735
Gln Glu Tyr Arg Ala Leu Met Val Ser Thr Lys Asp Gly Val Ala Thr
            740                 745                 750
Tyr Ala Thr Asp Ala Asp Ala Ser Lys Ala Gly Leu Val Lys Arg Thr
        755                 760                 765
Asp Glu Asn Gly Tyr Leu Tyr Phe Leu Asn Asp Asp Leu Lys Gly Val
    770                 775                 780
Ala Asn Pro Gln Val Ser Gly Phe Leu Gln Val Trp Val Pro Val Gly
785                 790                 795                 800
Ala Ala Asp Asp Gln Asp Ile Arg Val Ala Ala Ser Asp Thr Ala Ser
                805                 810                 815
Thr Asp Gly Lys Ser Leu His Gln Asp Ala Ala Met Asp Ser Arg Val
            820                 825                 830
Met Phe Glu Gly Phe Ser Asn Phe Gln Ser Phe Ala Thr Lys Glu Glu
        835                 840                 845
Glu Tyr Thr Asn Val Val Ile Ala Asn Asn Val Asp Lys Phe Val Ser
    850                 855                 860
Trp Gly Ile Thr Asp Phe Glu Met Ala Pro Gln Tyr Val Ser Ser Thr
865                 870                 875                 880
Asp Gly Gln Phe Leu Asp Ser Val Ile Gln Asn Gly Tyr Ala Phe Thr
                885                 890                 895
Asp Arg Tyr Asp Leu Gly Met Ser Lys Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Ala
            900                 905                 910
Asp Gln Leu Val Lys Ala Ile Lys Ala Leu His Ala Lys Gly Leu Lys
        915                 920                 925
Val Met Ala Asp Trp Val Pro Asp Gln Met Tyr Thr Phe Pro Lys Gln
    930                 935                 940
Glu Val Val Thr Val Thr Arg Thr Asp Lys Phe Gly Lys Pro Ile Ala
945                 950                 955                 960
Gly Ser Gln Ile Asn His Ser Leu Tyr Val Thr Asp Thr Lys Ser Ser
                965                 970                 975
Gly Asp Asp Tyr Gln Ala Lys Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Asp Glu Leu
            980                 985                 990
Lys Glu Lys Tyr Pro Glu Leu Phe Thr Lys Lys Gln Ile Ser Thr Gly
        995                 1000                1005
Gln Ala Ile Asp Pro Ser Val Lys Ile Lys Gln Trp Ser Ala Lys
    1010                1015                1020
Tyr Phe Asn Gly Ser Asn Ile Leu Gly Arg Gly Ala Asp Tyr Val
    1025                1030                1035
Leu Ser Asp Gln Ala Ser Asn Lys Tyr Leu Asn Val Ser Asp Asp
    1040                1045                1050
Lys Leu Phe Leu Pro Lys Thr Leu Leu Gly Gln Val Val Glu Ser
    1055                1060                1065
Gly Ile Arg Phe Asp Gly Thr Gly Tyr Val Tyr Asn Ser Ser Thr
    1070                1075                1080
Thr Gly Glu Lys Val Thr Asp Ser Phe Ile Thr Glu Ala Gly Asn
    1085                1090                1095
Leu Tyr Tyr Phe Gly Gln Asp Gly Tyr Met Val Thr Gly Ala Gln
    1100                1105                1110
Asn Ile Lys Gly Ser Asn Tyr Tyr Phe Leu Ala Asn Gly Ala Ala
    1115                1120                1125
Leu Arg Asn Thr Val Tyr Thr Asp Ala Gln Gly Gln Asn His Tyr
    1130                1135                1140
Tyr Gly Asn Asp Gly Lys Arg Tyr Glu Asn Gly Tyr Gln Gln Phe
    1145                1150                1155
Gly Asn Asp Ser Trp Arg Tyr Phe Lys Asn Gly Val Met Ala Leu
    1160                1165                1170
Gly Leu Thr Thr Val Asp Gly His Val Gln Tyr Phe Asp Lys Asp
    1175                1180                1185
Gly Val Gln Ala Lys Asp Lys Ile Ile Val Thr Arg Asp Gly Lys
    1190                1195                1200
Val Arg Tyr Phe Asp Gln His Asn Gly Asn Ala Val Thr Asn Thr
    1205                1210                1215
Phe Val Ala Asp Lys Thr Gly His Trp Tyr Tyr Leu Gly Lys Asp
    1220                1225                1230
Gly Val Ala Val Thr Gly Ala Gln Thr Val Gly Lys Gln His Leu
    1235                1240                1245
Tyr Phe Glu Ala Asn Gly Gln Gln Val Lys Gly Asp Phe Val Thr
    1250                1255                1260
Ala Lys Asp Gly Lys Leu Tyr Phe Tyr Asp Val Asp Ser Gly Asp
    1265                1270                1275
Met Trp Thr Asn Thr Phe Ile Glu Asp Lys Ala Gly Asn Trp Phe
    1280                1285                1290
Tyr Leu Gly Lys Asp Gly Ala Ala Val Thr Gly Ala Gln Thr Ile
    1295                1300                1305
Lys Gly Gln Lys Leu Tyr Phe Lys Ala Asn Gly Gln Gln Val Lys
    1310                1315                1320
Gly Asp Ile Val Lys Asp Ala Asp Gly Lys Ile Arg Tyr Tyr Asp
    1325                1330                1335
Ala Gln Thr Gly Glu Gln Val Phe Asn Lys Ser Val Ser Val Asn
    1340                1345                1350
Gly Lys Thr Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Gly Thr Ala Gln Thr Gln
    1355                1360                1365
Ala Asn Pro Lys Gly Gln Thr Phe Lys Asp Gly Ser Gly Val Leu
    1370                1375                1380
Arg Phe Tyr Asn Leu Glu Gly Gln Tyr Val Ser Gly Ser Gly Trp
    1385                1390                1395
Tyr Glu Thr Ala Glu His Glu Trp Val Tyr Val Lys Ser Gly Lys
    1400                1405                1410
Val Leu Thr Gly Ala Gln Thr Ile Gly Asn Gln Arg Val Tyr Phe
    1415                1420                1425
Lys Asp Asn Gly His Gln Val Lys Gly Gln Leu Val Thr Gly Asn
    1430                1435                1440
Asp Gly Lys Leu Arg Tyr Tyr Asp Ala Asn Ser Gly Asp Gln Ala
    1445                1450                1455
Phe Asn Lys Ser Val Thr Val Asn Gly Lys Thr Tyr Tyr Phe Gly
    1460                1465                1470
Ser Asp Gly Thr Ala Gln Thr Gln Ala Asn Pro Lys Gly Gln Thr
    1475                1480                1485
Phe Lys Asp Gly Ser Gly Val Leu Arg Phe Tyr Asn Leu Glu Gly
    1490                1495                1500
Gln Tyr Val Ser Gly Ser Gly Trp Tyr Lys Asn Ala Gln Gly Gln
    1505                1510                1515
Trp Leu Tyr Val Lys Asp Gly Lys Val Leu Thr Gly Leu Gln Thr
    1520                1525                1530
Val Gly  Asn Gln Lys Val Tyr Phe Asp Lys Asn Gly Ile Gln Ala
    1535                1540                1545
Lys Gly Lys Ala Val Arg Thr Ser Asp Gly Lys Val Arg Tyr Phe
    1550                 1555                 1560
Asp Glu Asn Ser Gly Ser Met Ile Thr Asn Gln Trp Lys Phe Val
    1565                1570                1575
Tyr Gly Gln Tyr Tyr Tyr Phe Gly Ser Asp Gly Ala Ala Val Tyr
    1580                1585                1590
Arg Gly Trp Asn
    1595
<210>3
<211>3039
<212>DNA
<213>汗毛链球菌
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(3036)
<223>齿斑葡聚糖蔗糖酶基因的可变区域和活性核心区域
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(324)
<223>齿斑葡聚糖蔗糖酶基因的可变区域
<220>
<221>活性核心区域
<222>(325)..(3036)
<223>齿斑葡聚糖蔗糖酶基因的活性核心区域
<220>
<221>突变
<222>(3038)..(3038)
<223>C至A
<220>
<221>突变
<222>(1)..(3)
<223>GAT至GGG
<400>3
ggg act gaa act gtt agc gaa gac agc aac caa gca gtc ttg acg gct 48
Gly Thr Glu Thr Val Ser Glu Asp Ser Asn Gln Ala Val Leu Thr Ala
1               5                   10                  15
gac caa acg act acc aac caa gat act gag caa act tct gtt gca gcg 96
Asp Gln Thr Thr Thr Asn Gln Asp Thr Glu Gln Thr Ser Val Ala Ala
            20                  25                  30
aca gct aca tca gaa cag tct gct tca act gat gca gca aca gat caa 144
Thr Ala Thr Ser Glu Gln Ser Ala Ser Thr Asp Ala Ala Thr Asp Gln
        35                  40                  45
gca tca gca aca gat caa gca tca gca gca gag caa act caa gga aca 192
Ala Ser Ala Thr Asp Gln Ala Ser Ala Ala Glu Glu Thr Gln Gly Thr
    50                  55                  60
aca gct agc aca gac acg gca gct caa aca acc aca aat gct aat gaa    240
Thr Ala Ser Thr Asp Thr Ala Ala Gln Thr Thr Thr Asn Ala Asn Glu
65                  70                  75                  80
gct aag tgg gtt ccg act gaa aat gag aac caa gtt ttt aca gat gag    288
Ala Lys Trp Val Pro Thr Glu Asn Glu Asn Gln Val Phe Thr Asp Glu
                85                  90                  95
atg tta gca gaa gcc aag aat gtg gct act gct gaa tct aat tca att    336
Met Leu Ala Glu Ala Lys Asn Val Ala Thr Ala Glu Ser Asn Ser Ile
            100                 105                 110
cca tca gac ttg gct aaa atg tca aat gtt aag cag gtt gac ggt aaa    384
Pro Ser Asp Leu Ala Lys Met Ser Asn Val Lys Gln Val Asp Gly Lys
        115                 120                 125
tat tat tac tac gat caa gac ggc aac gtt aag aag aac ttt gct gtt    432
Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Gln Asp Gly Asn Val Lys Lys Asn Phe Ala Val
    130                 135                 140
agc gtt ggt gag aag atc tat tac ttt gat gaa act ggc gct tac aaa    480
Ser Val Gly Glu Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Glu Thr Gly Ala Tyr Lys
145                 150                 155                 160
gac act agc aag gta gaa gcg gat aaa tca ggt tct gat atc agc aaa    528
Asp Thr Ser Lys Val Glu Ala Asp Lys Ser Gly Ser Asp Ile Ser Lys
                165                 170                 175
gaa gaa aca acc ttt gct gct aac aac cgt gct tac agt acc tca gct    576
Glu Glu Thr Thr Phe Ala Ala Asn Asn Arg Ala Tyr Ser Thr Ser Ala
            180                 185                 190
gaa aac ttt gaa gcc att gat aac tac ttg aca gct gac tca tgg tac    624
Glu Asn Phe Glu Ala Ile Asp Asn Tyr Leu Thr Ala Asp Ser Trp Tyr
        195                 200                 205
cgt cca aag tct atc ctc aag gat ggt aag act tgg aca gaa tca agc    672
Arg Pro Lys Ser Ile Leu Lys Asp Gly Lys Thr Trp Thr Glu Ser Ser
    210                 215                 220
aag gat gac ttc cgt ccg cta ttg atg gct tgg tgg cca gat acc gaa    720
Lys Asp Asp Phe Arg Pro Leu Leu Met Ala Trp Trp Pro Asp Thr Glu
225                 230                 235                 240
acc aaa cgc aac tat gtt aac tac atg aac aag gtt gtt ggt atc gat    768
Thr Lys Arg Asn Tyr Val Asn Tyr Met Asn Lys Val Val Gly Ile Asp
                245                 250                 255
aaa acc tat acc gct gaa aca agc cag gct gac ctg aca gca gca gct    816
Lys Thr Tyr Thr Ala Glu Thr Ser Gln Ala Asp Leu Thr Ala Ala Ala
            260                 265                 270
gaa ctg gtt caa gcc cgt atc gaa caa aag att aca act gaa caa aat    864
Glu Leu Val Gln Ala Arg Ile Glu Gln Lys Ile Thr Thr Glu Gln Asn
        275                 280                 285
acc aaa tgg ttg cgt gaa gct atc tca gct ttt gtt aaa act caa cca    912
Thr Lys Trp Leu Arg Glu Ala Ile Ser Ala Phe Val Lys Thr Gln Pro
    290                 295                 300
caa tgg aat ggt gaa agc gaa aag cca tac gat gac cac ttg caa aat    960
Gln Trp Asn Gly Glu Ser Glu Lys Pro Tyr Asp Asp His Leu Gln Asn
305                 310                 315                 320
ggt gcc ctc aag ttc gat aac caa tct gat ttg aca cca gat acg caa    1008
Gly Ala Leu Lys Phe Asp Asn Gln Ser Asp Leu Thr Pro Asp Thr Gln
                325                 330                 335
tcg aac tat cgt ttg ctc aat cgc aca cca act aac caa act ggt tcc    1056
Ser Asn Tyr Arg Leu Leu Asn Arg Thr Pro Thr Asn Gln Thr Gly Ser
            340                 345                 350
ctg gac tct cgt ttc acc tac aat gct aac gac ccg tta ggt ggt tat    1104
Leu Asp Ser Arg Phe Thr Tyr Asn Ala Asn Asp Pro Leu Gly Gly Tyr
        355                 360                 365
gag ttg ctt ctg gct aac gac gtg gat aac tct aat ccc atc gtt caa    1152
Glu Leu Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn Ser Asn Pro Ile Val Gln
    370                 375                 380
gca gag caa ctc aac tgg ctg cat tac ctg ctc aac ttc ggt act atc    1200
Ala Glu Gln Leu Asn Trp Leu His Tyr Leu Leu Asn Phe Gly Thr Ile
385                 390                 395                 400
tat gct aaa gat gcg gat gct aac ttt gac tct atc cgt gtt gat gcg    1248
Tyr Ala Lys Asp Ala Asp Ala Asn Phe Asp Ser Ile Arg Val Asp Ala
                405                 410                 415
gta gat aat gtc gat gct gac ctt ctg caa atc tct agt gat tac ctt    1296
Val Asp Asn Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln Ile Ser Ser Asp Tyr Leu
            420                 425                 430
aag gca gct tac ggt atc gat aaa aac aac aaa aat gct aat aac cac    1344
Lys Ala Ala Tyr Gly Ile Asp Lys Asn Asn Lys Asn Ala Asn Asn His
        435                 440                 445
gtt tct atc gta gaa gca tgg agc gac aac gat acc cct tat ctc cat    1392
Val Ser Ile Val Glu Ala Trp Ser Asp Asn Asp Thr Pro Tyr Leu His
    450                 455                 460
gat gat ggc gac aac ctc atg aac atg gac aac aag ttc cgt ttg tct    1440
Asp Asp Gly Asp Asn Leu Met Asn Met Asp Asn Lys Phe Arg Leu Ser
465                 470                 475                 480
atg ctt tgg tct ttg gct aaa cca ttg gac aaa cgt tct ggc ttg aat    1488
Met Leu Trp Ser Leu Ala Lys Pro Leu Asp Lys Arg Ser Gly Leu Asn
                485                 490                 495
ccc ctc atc cac aac agt ctg gtt gac cgt gaa gtg gat gac cgt gaa    1536
Pro Leu Ile His Asn Ser Leu Val Asp Arg Glu Val Asp Asp Arg Glu
            500                 505                 510
gtt gaa acc gtt cca agt tac agc ttt gcc cgt gct cac gat agc gaa    1584
Val Glu Thr Val Pro Ser Tyr Ser Phe Ala Arg Ala His Asp Ser Glu
        515                 520                 525
gta caa gac ctg att cgt gac atc atc aag gct gaa att aat cca aat    1632
Val Gln Asp Leu Ile Arg Asp Ile Ile Lys Ala Glu Ile Asn Pro Asn
    530                 535                 540
gca ttt ggt tat tca ttt act caa gac gaa atc gac caa gcc ttc aag    1680
Ala Phe Gly Tyr Ser Phe Thr Gln Asp Glu Ile Asp Gln Ala Phe Lys
545                 550                 555                 560
att tac aac gaa gac ctc aag aag acc gat aag aaa tac act cac tac    1728
Ile Tyr Asn Glu Asp Leu Lys Lys Thr Asp Lys Lys Tyr Thr His Tyr
                565                 570                 575
aat gtg ccg ctt tct tat acc ttg ctt ctg act aac aag ggt tcg att    1776
Asn Val Pro Leu Ser Tyr Thr Leu Leu Leu Thr Asn Lys Gly Ser Ile
            580                 585                 590
cct cgc gtc tat tat gga gat atg ttc acc gat gat ggt caa tac atg    1824
Pro Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Met Phe Thr Asp Asp Gly Gln Tyr Met
        595                 600                 605
gcc aac aag act gtg aac tac gat gct atc gaa tct ctg ctg aaa gcc    1872
Ala Asn Lys Thr Val Asn Tyr Asp Ala Ile Glu Ser Leu Leu Lys Ala
    610                 615                 620
cgt atg aag tac gtt gct ggt ggt caa gct atg caa aat tac caa atc    1920
Arg Met Lys Tyr Val Ala Gly Gly Gln Ala Met Gln Asn Tyr Gln Ile
625                 630                 635                 640
ggt aat ggc gaa atc ttg act tct gtc cgt tat ggt aag ggt gcc ctt    1968
Gly Asn Gly Glu Ile Leu Thr Ser Val Arg Tyr Gly Lys Gly Ala Leu
                645                 650                 655
aaa caa agc gat aag ggt gat gcg aca act cgt acg tca ggt gtc ggc    2016
Lys Gln Ser Asp Lys Gly Asp Ala Thr Thr Arg Thr Ser Gly Val Gly
            660                 665                 670
gtt gtt atg gga aac caa ccc aac ttt agc ttg gat gga aag gtt gta    2064
Val Val Met Gly Asn Gln Pro Asn Phe Ser Leu Asp Gly Lys Val Val
        675                 680                 685
gcc ctc aac atg ggt gct gcc cac gct aac caa gaa tac cgt gct ctt    2112
Ala Leu Asn Met Gly Ala Ala His Ala Asn Gln Glu Tyr Arg Ala Leu
    690                 695                 700
atg gta tca act aaa gac ggt gtt gca acc tat gct aca gat gct gat    2160
Met Val Ser Thr Lys Asp Gly Val Ala Thr Tyr Ala Thr Asp Ala Asp
705                 710                 715                 720
gct agc aag gct ggt ctg gtt aag cgc aca gat gaa aat ggt tac ctc    2208
Ala Ser Lys Ala Gly Leu Val Lys Arg Thr Asp Glu Asn Gly Tyr Leu
                725                 730                 735
tac ttc ttg aac gac gat ctc aag ggg gtt gct aac cct cag gtt tct    2256
Tyr Phe Leu Asn Asp Asp Leu Lys Gly Val Ala Asn Pro Gln Val Ser
            740                 745                 750
ggt ttc ctt caa gtc tgg gta cca gtg gga gca gca gat gac caa gat    2304
Gly Phe Leu Gln Val Trp Val Pro Val Gly Ala Ala Asp Asp Gln Asp
        755                 760                 765
att cgt gta gca gct agc gat aca gca agt acc gat gga aaa tca ctc    2352
Ile Arg Val Ala Ala Ser Asp Thr Ala Ser Thr Asp Gly Lys Ser Leu
    770                 775                 780
cat caa gat gct gcc atg gac tct cgc gtc atg ttt gaa ggt ttc tct    2400
His Gln Asp Ala Ala Met Asp Ser Arg Val Met Phe Glu Gly Phe Ser
785                 790                 795                 800
aac ttc caa tct ttt gcg aca aaa gaa gaa gag tat acc aat gtt gtt    2448
Asn Phe Gln Ser Phe Ala Thr Lys Glu Glu Glu Tyr Thr Asn Val Val
                805                 810                 815
att gct aac aat gtt gat aaa ttt gtt tca tgg gga atc act gac ttt    2496
Ile Ala Asn Asn Val Asp Lys Phe Val Ser Trp Gly Ile Thr Asp Phe
            820                 825                 830
gaa atg gct cct cag tat gtc tca tct act gac ggt cag ttc ctt gat    2544
Glu Met Ala Pro Gln Tyr Val Ser Ser Thr Asp Gly Gln Phe Leu Asp
        835                 840                 845
tct gtc att caa aat ggt tat gcc ttt acc gac cgt tat gac ttg ggt    2592
Ser Val Ile Gln Asn Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Arg Tyr Asp Leu Gly
    850                 855                 860
atg tct aaa gca aac aag tat ggt aca gcc gac caa ttg gtt aag gct    2640
Met Ser Lys Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Ala Asp Gln Leu Val Lys Ala
865                 870                 875                 880
atc aag gct ctc cat gct aaa ggc ctg aag gtt atg gca gac tgg gtt    2688
Ile Lys Ala Leu His Ala Lys Gly Leu Lys Val Met Ala Asp Trp Val
                885                 890                 895
cca gac caa atg tac acc ttc cct aaa caa gaa gtg gtc act gtt act    2736
Pro Asp Gln Met Tyr Thr Phe Pro Lys Gln Glu Val Val Thr Val Thr
            900                 905                 910
cgg aca gat aag ttt ggc aaa cca atc gca gga agc caa att aat cac    2784
Arg Thr Asp Lys Phe Gly Lys Pro Ile Ala Gly Ser Gln Ile Asn His
        915                 920                 925
agt ctc tac gta aca gat aca aag agc tct ggt gat gac tat caa gct    2832
Ser Leu Tyr Val Thr Asp Thr Lys Ser Ser Gly Asp Asp Tyr Gln Ala
    930                 935                 940
aaa tac ggc ggt gcc ttc ctt gac gaa tta aag gaa aaa tat cca gaa    2880
Lys Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Asp Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Pro Glu
945                 950                 955                 960
ctc ttt acc aag aag caa atc tct acc ggc caa gcc ata gat cca tct    2928
Leu Phe Thr Lys Lys Gln Ile Ser Thr Gly Gln Ala Ile Asp Pro Ser
                965                 970                 975
gtt aag att aaa caa tgg tct gct aag tac ttc aac ggt agc aat atc    2976
Val Lys Ile Lys Gln Trp Ser Ala Lys Tyr Phe Asn Gly Ser Asn Ile
            980                 985                 990
ctt ggc cgg ggt gcc gat tat gtc ctc agc gac caa gca agc aac aag  3024
Leu Gly Arg Gly Ala Asp Tyr Val Leu Ser Asp Gln Ala Ser Asn Lys
        995                 1000                1005
tac ctc aat gtt taa                                              3039
Tyr Leu Asn Val
    1010
<210>4
<211>1012
<212>PRT
<213>汗毛链球菌
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(324)
<223>齿斑葡聚糖蔗糖酶基因的可变区域
<400>4
Gly Thr Glu Thr Val Ser Glu Asp Ser Asn Gln Ala Val Leu Thr Ala
1               5                   10                  15
Asp Gln Thr Thr Thr Asn Gln Asp Thr Glu Gln Thr Ser Val Ala Ala
            20                  25                  30
Thr Ala Thr Ser Glu Gln Ser Ala Ser Thr Asp Ala Ala Thr Asp Gln
        35                  40                  45
Ala Ser Ala Thr Asp Gln Ala Ser Ala Ala Glu Gln Thr Gln Gly Thr
    50                  55                  60
Thr Ala Ser Thr Asp Thr Ala Ala Gln Thr Thr Thr Asn Ala Asn Glu
65                  70                  75                  80
Ala Lys Trp Val Pro Thr Glu Asn Glu Asn Gln Val Phe Thr Asp Glu
                85                  90                  95
Met Leu Ala Glu Ala Lys Asn Val Ala Thr Ala Glu Ser Asn Ser Ile
            100                 105                 110
Pro Ser Asp Leu Ala Lys Met Ser Asn Val Lys Gln Val Asp Gly Lys
        115                 120                 125
Tyr Tyr Tyr Tyr Asp Gln Asp Gly Asn Val Lys Lys Asn Phe Ala Val
    130                 135                 140
Ser Val Gly Glu Lys Ile Tyr Tyr Phe Asp Glu Thr Gly Ala Tyr Lys
145                 150                 155                 160
Asp Thr Ser Lys Val Glu Ala Asp Lys Ser Gly Ser Asp Ile Ser Lys
                165                 170                 175
Glu Glu Thr Thr Phe Ala Ala Asn Asn Arg Ala Tyr Ser Thr Ser Ala
            180                 185                 190
Glu Asn Phe Glu Ala Ile Asp Asn Tyr Leu Thr Ala Asp Ser Trp Tyr
        195                 200                 205
Arg Pro Lys Ser Ile Leu Lys Asp Gly Lys Thr Trp Thr Glu Ser Ser
    210                 215                 220
Lys Asp Asp Phe Arg Pro Leu Leu Met Ala Trp Trp Pro Asp Thr Glu
225                 230                 235                 240
Thr Lys Arg Asn Tyr Val Asn Tyr Met Asn Lys Val Val Gly Ile Asp
                245                 250                 255
Lys Thr Tyr Thr Ala Glu Thr Ser Gln Ala Asp Leu Thr Ala Ala Ala
            260                 265                 270
Glu Leu Val Gln Ala Arg Ile Glu Gln Lys Ile Thr Thr Glu Gln Asn
        275                 280                 285
Thr Lys Trp Leu Arg Glu Ala Ile Ser Ala Phe Val Lys Thr Gln Pro
    290                 295                 300
Gln Trp Asn Gly Glu Ser Glu Lys Pro Tyr Asp Asp His Leu Gln Asn
305                 310                 315                 320
Gly Ala Leu Lys Phe Asp Asn Gln Ser Asp Leu Thr Pro Asp Thr Gln
                325                 330                 335
Ser Asn Tyr Arg Leu Leu Asn Arg Thr Pro Thr Asn Gln Thr Gly Ser
            340                 345                 350
Leu Asp Ser Arg Phe Thr Tyr Asn Ala Asn Asp Pro Leu Gly Gly Tyr
        355                 360                 365
Glu Leu Leu Leu Ala Asn Asp Val Asp Asn Ser Asn Pro Ile Val Gln
    370                 375                 380
Ala Glu Gln Leu Asn Trp Leu His Tyr Leu Leu Asn Phe Gly Thr Ile
385                 390                 395                 400
Tyr Ala Lys Asp Ala Asp Ala Asn Phe Asp Ser Ile Arg Val Asp Ala
                405                 410                 415
Val Asp Asn Val Asp Ala Asp Leu Leu Gln Ile Ser Ser Asp Tyr Leu
            420                 425                 430
Lys Ala Ala Tyr Gly Ile Asp Lys Asn Asn Lys Asn Ala Asn Asn His
        435                 440                 445
Val Ser Ile Val Glu Ala Trp Ser Asp Asn Asp Thr Pro Tyr Leu His
    450                 455                 460
Asp Asp Gly Asp Asn Leu Met Asn Met Asp Asn Lys Phe Arg Leu Ser
465                 470                 475                 480
Met Leu Trp Ser Leu Ala Lys Pro Leu Asp Lys Arg Ser Gly Leu Asn
                485                 490                 495
Pro Leu Ile His Asn Ser Leu Val Asp Arg Glu Val Asp Asp Arg Glu
            500                 505                 510
Val Glu Thr Val Pro Ser Tyr Ser Phe Ala Arg Ala His Asp Ser Glu
        515                 520                 525
Val Gln Asp Leu Ile Arg Asp Ile Ile Lys Ala Glu Ile Asn Pro Asn
    530                 535                 540
Ala Phe Gly Tyr Ser Phe Thr Gln Asp Glu Ile Asp Gln Ala Phe Lys
545                 550                 555                 560
Ile Tyr Asn Glu Asp Leu Lys Lys Thr Asp Lys Lys Tyr Thr His Tyr
                565                 570                 575
Asn Val Pro Leu Ser Tyr Thr Leu Leu Leu Thr Asn Lys Gly Ser Ile
            580                 585                 590
Pro Arg Val Tyr Tyr Gly Asp Met Phe Thr Asp Asp Gly Gln Tyr Met
        595                 600                 605
Ala Asn Lys Thr Val Asn Tyr Asp Ala Ile Glu Ser Leu Leu Lys Ala
    610                 615                 620
Arg Met Lys Tyr Val Ala Gly Gly Gln Ala Met Gln Asn Tyr Gln Ile
625                 630                 635                 640
Gly Asn Gly Glu Ile Leu Thr Ser Val Arg Tyr Gly Lys Gly Ala Leu
                645                 650                 655
Lys Gln Ser Asp Lys Gly Asp Ala Thr Thr Arg Thr Ser Gly Val Gly
            660                 665                 670
Val Val Met Gly Asn Gln Pro Asn Phe Ser Leu Asp Gly Lys Val Val
        675                 680                 685
Ala Leu Asn Met Gly Ala Ala His Ala Asn Gln Glu Tyr Arg Ala Leu
    690                 695                 700
Met Val Ser Thr Lys Asp Gly Val Ala Thr Tyr Ala Thr Asp Ala Asp
705                 710                 715                 720
Ala Ser Lys Ala Gly Leu Val Lys Arg Thr Asp Glu Asn Gly Tyr Leu
                725                 730                 735
Tyr Phe Leu Asn Asp Asp Leu Lys Gly Val Ala Asn Pro Gln Val Ser
            740                 745                 750
Gly Phe Leu Gln Val Trp Val Pro Val Gly Ala Ala Asp Asp Gln Asp
        755                 760                 765
Ile Arg Val Ala Ala Ser Asp Thr Ala Ser Thr Asp Gly Lys Ser Leu
    770                 775                 780
His Gln Asp Ala Ala Met Asp Ser Arg Val Met Phe Glu Gly Phe Ser
785                 790                 795                 800
Asn Phe Gln Ser Phe Ala Thr Lys Glu Glu Glu Tyr Thr Asn Val Val
                805                 810                 815
Ile Ala Asn Asn Val Asp Lys Phe Val Ser Trp Gly Ile Thr Asp Phe
            820                 825                 830
Glu Met Ala Pro Gln Tyr Val Ser Ser Thr Asp Gly Gln Phe Leu Asp
        835                 840                 845
Ser Val Ile Gln Asn Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Arg Tyr Asp Leu Gly
    850                 855                 860
Met Ser Lys Ala Asn Lys Tyr Gly Thr Ala Asp Gln Leu Val Lys Ala
865                 870                 875                 880
Ile Lys Ala Leu His Ala Lys Gly Leu Lys Val Met Ala Asp Trp Val
                885                 890                 895
Pro Asp Gln Met Tyr Thr Phe Pro Lys Gln Glu Val Val Thr Val Thr
            900                 905                 910
Arg Thr Asp Lys Phe Gly Lys Pro Ile Ala Gly Ser Gln Ile Asn His
        915                 920                 925
Ser Leu Tyr Val Thr Asp Thr Lys Ser Ser Gly Asp Asp Tyr Gln Ala
    930                 935                 940
Lys Tyr Gly Gly Ala Phe Leu Asp Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Pro Glu
945                 950                 955                 960
Leu Phe Thr Lys Lys Gln Ile Ser Thr Gly Gln Ala Ile Asp Pro Ser
                965                 970                 975
Val Lys Ile Lys Gln Trp Ser Ala Lys Tyr Phe Asn Gly Ser Asn Ile
            980                 985                 990
Leu Gly Arg Gly Ala Asp Tyr Val Leu Ser Asp Gln Ala Ser Asn Lys
        995                 1000                1005
Tyr Leu Asn Val
    1010

Claims (17)

1.基因修饰植物细胞，其特征在于在质体中具有齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的酶活性，并且其中与对应的非基因修饰野生型植物细胞所合成的淀粉相比，所述的基因修饰植物细胞合成改性淀粉。
2.根据权利要求1所述的基因修饰植物细胞，其中植物细胞合成改性淀粉，与对应的非基因修饰的野生型植物细胞所合成的淀粉相比，改性淀粉具有增加的T-起始温度、和/或增加的最小黏度、和/或增加的终黏度和/或改变的颗粒形态学。
3.植物和/或其后代，其包含根据权利要求1或2中任一项所述的基因修饰植物细胞。
4.根据权利要求3所述的植物和/或其后代，其是淀粉贮藏植物。
5.根据权利要求4所述的植物和/或其后代，其是马铃薯植物。
6.根据权利要求3至5中任一项所述植物的繁殖材料，其包含根据权利要求1或2中任一项所述的植物细胞。
7.根据权利要求3至5中任一项所述植物的可收获部分，其包含根据权利要求1或2中任一项所述的植物细胞。
8.用于制造根据权利要求3至5中任一项所述基因修饰植物的方法，其中：
a)用核酸分子转化植物细胞，该核酸分子包含编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子，
b)从步骤a)中所得到的植物细胞再生植物，并且
c)根据需要，从步骤b)中所得到的植物产生另外的植物。
9.根据权利要求8所述的方法，其中步骤a)中编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子与编码质体信号序列的核酸分子翻译性融合。
10.根据权利要求8所述的方法，其中编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子整合至植物的质体基因组。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，或根据权利要求1或2中任一项所述的植物细胞，或根据权利要求3至5中任一项所述的植物，其中编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子选自：
a)核酸分子，其编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或其部分并具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力的蛋白质；
b)核酸分子，其编码其氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或其部分具有至少70％的同一性并具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力的蛋白质；
c)核酸分子，其包含SEQ ID NO：1中所示核苷酸序列或其互补序列或者它们的部分，所述的核苷酸序列或其互补序列或者它们的部分编码具有催化从蔗糖合成齿斑葡聚糖的能力的蛋白质；
d)核酸分子，其核酸序列与a)或c)所述核酸序列具有至少70％的同一性；
e)核酸分子，其核苷酸序列因遗传密码子简并性而自a)、b)、c)或d)中所确定的核酸分子的序列衍生；以及
f)核酸分子，其代表在a)、b)、c)、d)或e)中所确定的核酸分子的片段、等位变体和/或衍生物。
12.用于制造改性淀粉的方法，其包括从权利要求1至2中任一项所述植物细胞、从权利要求3至5中任一项所述植物、从权利要求7所述植物的可收获部分或者从通过权利要求8至11中任一项所述方法可得到的植物提取淀粉的步骤。
13.改性淀粉，其可通过权利要求12所述的方法得到。
14.用于产生衍生淀粉的方法，其中从根据权利要求13所述的改性淀粉衍生。
15.衍生淀粉，其可通过权利要求14所述的方法得到。
16.根据权利要求1或2中任一项所述的植物细胞、根据权利要求3至5中任一项所述的植物、根据权利要求7所述植物的可收获部分或根据权利要求8至11中任一项所述方法可得到的植物的用途，其用于产生改性淀粉。
17.编码齿斑葡聚糖蔗糖酶蛋白质的核酸分子的用途，其用于制造根据权利要求1或2中任一项所述的基因修饰植物细胞、根据权利要求3至5中任一项所述的基因修饰植物、根据权利要求6所述的繁殖材料或根据权利要求7所述的植物的可收获部分。
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