JP4320484B2 - 改変グルコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子、その遺伝子組換え体及びグルカンの製造方法 - Google Patents
改変グルコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子、その遺伝子組換え体及びグルカンの製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4320484B2 JP4320484B2 JP12641999A JP12641999A JP4320484B2 JP 4320484 B2 JP4320484 B2 JP 4320484B2 JP 12641999 A JP12641999 A JP 12641999A JP 12641999 A JP12641999 A JP 12641999A JP 4320484 B2 JP4320484 B2 JP 4320484B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gtf
- gene
- base
- seq
- modified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、高いグルカンの合成速度を有する改変グルコシルトランスフェラーゼ（改変ＧＴＦ）、この改変ＧＴＦを効率よく生産し得る遺伝子組換え体、及び該遺伝子組み換え体から産生された改変ＧＴＦを用いたグルカンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
グルカンは、澱粉、グリコーゲン、デキストリン、デキストラン、及びプルラン等のグルコースから構成される多糖類の総称である。これらグルカンは医薬品、化学品及び食品などの種々の分野で幅広く利用されている。例えば、デキストランは血漿増量剤として広く用いられており、血液不足や輸血による疾病などの発生により需要が増大している。プルランは工業用フィルム、シート、プラスチック成型物を始めとして、化粧品、香料等のカプセル化、医薬品の錠剤及び食品用原料として利用されている。澱粉は食品、香粧品、及び化粧品の成分として一般的に用いられており、また、製紙工業や繊維工業でのサイジング剤や濃厚剤、更に、石油採掘における二次・三次回収用の増粘剤としても用いられている（総合多糖類科学；原田篤也、講談社サイエンティフィク、１２９９６の化学商品；化学工業日報社）。
【０００３】
近年、これらのグルカンに加えてグルコースがα−１，６又はα−１，３結合でつながった水溶性又は水不溶性のグルカンが注目を集めている。
【０００４】
例えば、水溶性のグルカンは歯垢形成抑制効果を有する口腔用組成物としての用途（特開平１０−１８２３８２号公報）、及び保湿剤としての用途（特願平１０−１５７８８４号）などが見出されている。一方、水不溶性グルカンは、その性質から各種担体等への応用も見込まれる極めてユニークな素材として着目されており、このようにグルカンは、極めて広い用途範囲をもっていることから、産業上重要な化合物として位置づけられている。
【０００５】
また、これらグルカンは、従来、植物からの抽出法や微生物を用いた発酵法などにより生産されてきた。例えば、澱粉はイモ、とうもろこし及び小麦などの穀物類を磨砕することによって粗澱粉乳を得た後、沈殿・分離などの精製工程を経て製造されていた。プルランはオウレオバシディウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）を用いた発酵生産を行った後、メタノールなどの有機溶媒を発酵液中に添加することにより、プルランを回収し、製造していた。デキストランはロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）を用いて発酵生産を行った後、メタノールなどの有機溶媒を発酵液中に添加することにより、デキストランを回収し、製造していた。
【０００６】
一方、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）を用いた酵素法に基づくグルカンの製造法も行われている。具体的には、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）の増殖に伴って産生されるスクロース６−ＧＴＦ（デキストランスクラーゼ）を発酵生産により調製し、この酵素を用いてデキストランを合成することができることが知られている。この場合、酵素法では発酵法に比べて純度の高いデキストランが得られるなどのメリットがある（多糖生化学２；江上不二夫ら、共立出版、総合多糖類科学；原田篤也、講談社サイエンティフィク）。
【０００７】
また最近、バイオテクノロジーの飛躍的な進歩に伴って、遺伝子組換え技術を応用した効率的なグルカンの生産法が開発されつつあるが、う蝕の原因菌として知られているストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）やストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）などが生産するグルカンの場合は、一般的には発酵法が用いられてきた。
【０００８】
しかしながら、これら発酵法では生きた菌体を用いるために、生産量に最も影響を与えるショ糖濃度が菌の生育に対し制限条件となり、高濃度のショ糖を添加することができず、培地当たりの収量が低いという問題点があった。
【０００９】
かかる問題点を解決すべく、本発明者らは、従来から酵素の凝集、吸着及びプロテオリシス等の問題により極めて調製が困難であったＧＴＦだけを分離精製できる、遺伝子組換え技術を応用して製造した酵素を用いた効率の良いムタンの合成法を開発した（特願平１０−２７４３１０号）。
【００１０】
しかしながら、一般に、ＧＴＦの遺伝子組換え体は、発酵生産性の低さや保存安定性の悪さなどの面で充分なものではなく、グルカンの製造効率をより一層向上させるために、発酵生産性及び保存安定性を高めるべく、更なる有効な方策の開発が望まれていた。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、遺伝子組換え技術を応用することにより、高いグルカンの製造効率を有する改変グルコシルトランスフェラーゼ（改変ＧＴＦ）、この改変ＧＴＦを効率よく生産できると共に、優れた発酵生産性と保存安定性を有する遺伝子組換え体、及び該遺伝子組換え体から産生された改変ＧＴＦを用いたグルカンの製造方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）のＣ末端側に存在するグルカン結合領域及びその近傍のアミノ酸配列のうち、遺伝子組換え技術により１０個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する改変ＧＴＦが、高いグルカンの合成速度を有すること、また、この改変ＧＴＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入したプラスミド等のベクターを大腸菌等の宿主に取り込むことにより形質転換された遺伝子組換え体が、意外にも改変ＧＴＦを効率よく生産できると共に、高い発酵生産性と優れた保存安定性を備えており、従来の課題を効果的に解決し得ることを知見した。
【００１３】
そして、上記遺伝子組換え体から産生された改変ＧＴＦを用いることにより、ムタン、デキストラン、澱粉、グリコーゲン、デキストリン、及びプルラン等を初めとする産業上有用な種々のグルカンを極めて効率よく生産できることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【００１４】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の改変グルコシルトランスフェラーゼ（改変ＧＴＦ）は下記に示すものである。
［１］．下記塩基配列（１）、（２）、（３）又は（４）でコードされたアミノ酸配列からなり、ムタンを生産する改変グルコシルトランスフェラーゼ。
（１）配列番号１に示されるストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉの塩基配列において、４４９５ベースより下流の５００ベースを欠失し、配列番号６に示される塩基配列
（２）配列番号１に示されるストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉの塩基配列において、４７５１ベースより下流の２４４ベースを欠失し、配列番号７に示される塩基配列
（３）配列番号６に示される塩基配列
（４）配列番号７に示される塩基配列
［２］．下記塩基配列（５）、（６）、（７）又は（８）でコードされたアミノ酸配列からなり、ムタンを生産する改変グルコシルトランスフェラーゼ。
（５）ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉの塩基配列において、３３４６ベース位置に１０８ベース付加し、配列番号８に示される塩基配列
（６）ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉの塩基配列において、３３４６ベース位置に３５１ベース付加し、配列番号９に示される塩基配列
（７）配列番号８に示される塩基配列
（８）配列番号９に示される塩基配列
［３］．下記塩基配列（９）、（１０）、（１１）又は（１２）でコードされたアミノ酸配列からなり、デキストランを生産する改変グルコシルトランスフェラーゼ。
（９）配列番号２に示されるロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のスクロース６−ＧＴＦの塩基配列において、４５６１ベースより下流の３４６ベースを欠失し、配列番号１０に示される塩基配列
（１０）配列番号２に示されるロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のスクロース６−ＧＴＦの塩基配列において、３６５７ベース位置に９６ベース付加し、配列番号１１に示される塩基配列
（１１）配列番号１０に示される塩基配列
（１２）配列番号１１に示される塩基配列
また、下記グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子、遺伝子組換え体、グルカンの製造方法を提供する。
［４］．上記（１）〜（１２）のいずれかに示される塩基配列からなるグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子。
［５］．［４］記載の遺伝子を挿入したベクターを宿主に取り込むことにより形質転換された［６］．［５］記載の遺伝子組換え体から産生された改変グルコシルトランスフェラーゼを用いたグルカンの製造方法。
【００１５】
ここで、本発明の改変ＧＴＦを取得するには、まず、改変していないＧＴＦ（ネイティブなＧＴＦ）のアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、この遺伝子を発現したベクターを取り込んだＧＴＦを保持した遺伝子組換え体を作成する。
【００１６】
この場合、ＧＴＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ＧＴＦを産生可能な菌株から通常の方法により染色体ＤＮＡを抽出し、既知のＧＴＦの遺伝子配列情報をもとにしてＰＣＲ法等により、取得することができる。
【００１７】
具体的には、ムタンの場合には、ＧＴＦとしては公知のものを使用することができ、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・フェラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）などに由来するＧＴＦ−Ｉ，ＳＩが挙げられる。
【００１８】
また、デキストランの場合には、ＧＴＦとしては公知のものを使用することができ、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・フェラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）などに由来するＧＴＦ−Ｓ、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロイコノストック・デキストラニカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）由来のスクロース６−ＧＴＦ（デキストランスクラーゼ）などが挙げられる。
【００１９】
これらＧＴＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は公知であり、例えば下記文献に記載されている。
・ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）Ｍｆｅ２８のＧＴＦ−Ｉ遺伝子配列（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｓｅｐｔ． １９８７ ｐ４２７１−４２７８ ＲＯＹ Ｒ． Ｂ． ＲＵＳＳＥＬら）
・ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のスクロース６−ＧＴＦ遺伝子配列（Ｇｅｎｅ，１９９６ ｖｏｌ．１８２（１−２） ｐ２３−３２ Ｍｏｎｓａｎ，Ｐ．ら）
・ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＧＳ５のＧＴＦ−Ｉ遺伝子配列（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｓｅｐｔ．１９８７ ｐ４２６３−４２７０ Ｈ．Ｋ． ＫＵＲＡＭＩＴＳＵら）
・ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＭＴ８１４８のＧＴＦ−Ｉ遺伝子配列（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ． １６１， １９９８ ｐ３３１−３３６ Ｓ．ＨＡＭＡＤＡら）・ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）６７１５のＧＴＦ−Ｉ遺伝子配列（特開平５−２３１８８号公報）
【００２０】
そして、ＧＴＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、上記公知の遺伝子配列情報をもとにして、上記菌株から抽出した染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ法を行うことにより取得することができる。
【００２１】
具体的には、上記目的とするＧＴＦの遺伝子配列情報からＧＴＦ遺伝子配列の上流と下流について３０ベース程度の長さの一対のプライマーを作成し、この一対のプライマーを用いて菌株から抽出した染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ法を行うことにより、目的とするＧＴＦ遺伝子を増幅し、取得することができる。なお、ＰＣＲ法は、特に制限されず通常の方法を採用することができる。
【００２２】
次に、得られたＧＴＦ遺伝子をプラスミド等のベクターに挿入し、このＧＴＦ遺伝子が挿入されたプラスミド等のベクターを大腸菌等の宿主に取り込み形質転換することにより、ＧＴＦ遺伝子を保持した遺伝子組換え体が得られる。
【００２３】
ここで、ベクターとしては、特に制限されないが、プラスミドが好適であり、宿主が大腸菌の場合はｐＢＲ系、ｐＵＣ系等のプラスミド、宿主がバチルス属細菌の場合はｐＵＢ１１０系、ｐＣ１９４系等のプラスミド、宿主が酵母の場合はＹＩｐ系、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系等のプラスミドなどが発現性の点から好適に用いられる。また、ベクター（プラスミド）の宿主細胞への導入（形質転換）は、コンピテントセル法、プロトプラスト化法、及び電気パルス法（エレクトロポレーション）等の方法で行うことができる。
【００２４】
上記ベクターを組み込む宿主細胞としては、特に制限されないが、例えばエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス・ミレリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｌｌｅｒｉ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバクテリア、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クリビロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）等の酵母、アスペルギルス・ニードランス（Ａｓｐｅｒｇｉｒｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）等のカビ、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）等の放線菌を使用できる。中でも基礎情報の充実しているエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。
【００２５】
本発明においては、上述したように、ＧＴＦ遺伝子を保持した遺伝子組換え体を用いて、この遺伝子組換え体に対して遺伝子組換え技術を応用することにより、ＧＴＦのＣ末端側に存在するグルカン結合領域及びその近傍のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列を欠失、置換又は付加することにより、該欠失、置換又は付加した塩基配列に対応するアミノ酸配列が欠失、置換又は付加した改変ＧＴＦを得ることができるものである。
【００２６】
ここで、上記ＧＴＦのグルカン結合領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列は、ＧＴＦの種類、産生菌種などにより異なり一概には規定できないが、例えばムタンの場合（ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来）は、配列表の配列番号１に示したように、ＧＴＦ−Ｉをコードする遺伝子の塩基配列の３３００ベースより下流、具体的には３３００〜４９９５ベースまでの領域をいう。また、デキストランの場合（ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））は、配列表の配列番号２に示したように、スクロース６−ＧＴＦ（デキストランスクラーゼ）をコードする遺伝子の３５００べースより下流、具体的には３５００〜４９０７ベースまでの領域をいう。
【００２７】
本発明の遺伝子組換え技術によるグルカン結合領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列の欠失、置換又は付加は、ＧＴＦ遺伝子を保持した遺伝子組換え体に対し制限酵素を用いた遺伝子（ＤＮＡ）の切断、結合技術及び遺伝子クローニング技術等の遺伝子組換え技術を応用することにより、行うことができる。
【００２８】
この場合、ＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域の塩基配列を欠失する場合には、グルカン結合領域及びその近傍のアミノ酸をコードする塩基配列を制限酵素を用いて切断し、これらを結合させることにより行うことができる。また、グルカン結合領域に塩基配列を付加する場合には、特にグルカン結合能を持つ塩基配列（グルカン結合領域をコードする塩基配列）の一部を切り取った塩基配列をグルカン結合領域内に付加することが好ましい。更に、グルカン結合領域の塩基配列を置換する場合にはグルカン結合領域内の所定の塩基配列部分を置換することが好ましい。
【００２９】
上記制限酵素としては、特に制限されず、５’末端型、３’末端型、ブラントエンド型のいずれでもよく、例えばＢｌｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮａｅＩ、ＮｓｐＩ、ＮｓｐＶ等を目的に応じて用いることができる。
【００３０】
具体的には、ＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域の塩基配列を欠失する方法としては、ネイティブなＧＴＦ遺伝子をプラスミドベクターに挿入し、この発現型プラスミドベクターを大腸菌等の宿主に取り込ませることにより形質転換を行い、ＧＴＦ遺伝子を導入した組換え大腸菌（遺伝子組換え体）を得る。この遺伝子組換え体のＧＴＦ遺伝子（発現型ｐＵＣ１１８）を制限酵素（例えばＢｌｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮａｅＩ、ＮｓｐＩ、ＮｓｐＶ等）を用いて切断し、結合させることにより、グルカン結合領域及びその近傍の塩基配列が欠損した改変ＧＴＦ遺伝子を保持した組換え体を得ることができる。
【００３１】
また、ＧＴＦの結合領域の塩基配列を付加する方法の一例としては、ネイティブなＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域をコードする所定長さの塩基配列からなるＤＮＡ断片を作成し、このＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した後、平滑化し、平滑化ＤＮＡ断片を作成する。次に、ＧＴＦ遺伝子が発現している組換え体のＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域を制限酵素で切断した後、平滑化し、この切断した組換え体と上記平滑化ＤＮＡとをライゲーションすることにより、ＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域内にグルカン結合領域をコードする塩基配列が付加した改変ＧＴＦ遺伝子を保持した遺伝子組換え体を得ることができる。なお、平滑化の際に、平滑化ＤＮＡ断片に数個の塩基が付加されることがあるが、本発明の目的及び作用効果を達成する上で問題とはならない。
【００３２】
なお、ＧＴＦのグルカン結合領域の塩基配列を置換する方法としては、ＯＤＡ法、ＬＡ ＰＣＲ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などにより、ＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域内の塩基配列が置換した改変ＧＴＦ遺伝子を保持した遺伝子組換え体を得ることができる。
【００３３】
この場合、欠失、置換又は付加する塩基配列の数（アミノ酸の数）は、目的とするＧＴＦの種類などにより異なり一概には規定できないが、通常３０ベース（アミノ酸１０個）以上、好ましくは３０〜２４００ベース（アミノ酸１０〜８００個）、より好ましくは９０〜１８００ベース（アミノ酸３０〜６００個）、更に好ましくは９０〜１２００ベース（アミノ酸３０〜４００個）である。
【００３４】
具体的には、例えばムタンを生産する場合には、ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のＧＦＴ−Ｉが好適に用いられるが、発酵生産性及び保存安定性を高めるためには、グルコシルトランスフェラーゼのＣ末端側に存在するグルカン結合領域の近傍において、遺伝子組換え技術により１０〜８００個のアミノ酸（３０〜２４００ベース）を欠失、置換又は付加することが好ましく、より好ましくは３０〜６００個のアミノ酸（９０〜１８００ベース）、更に好ましくは５０〜５３０個のアミノ酸（１５０〜１５９０ベース）を欠失、置換又は付加することが好ましい。
【００３５】
また、デキストランを生産する場合には、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のスクロース６−ＧＴＦが好適に用いられ、発酵生産性及び保存安定性を高めるためには、同酵素のＣ末端側に存在するグルカン結合領域にグルカン結合能を持つ１０〜６００個のアミノ酸（３０〜１８００ベース）を遺伝子組換え技術により欠失、置換又は付加することが好ましく、より好ましくは３０〜４００個のアミノ酸（９０〜１２００ベース）、更に好ましくは３０〜２００個のアミノ酸（９０〜６００ベース）を欠失、置換又は付加することが好ましい。
【００３６】
なお、ムタン、デキストラン以外の澱粉、グリコーゲン、デキスリン、プルラン等のグルカンにおいても、これらグルカンを合成する酵素の遺伝子配列情報をもとにして、上記同様に適用できることは勿論である。
【００３７】
このようにして得られるグルカン結合領域及びその近傍のアミノ酸をコードする遺伝子の塩基配列が改変されたＧＴＦを保持した遺伝子組み換え体を、通常の方法により培養することにより、本発明の改変ＧＴＦが得られる。
【００３８】
本発明の改変ＧＴＦは、そのグルカン結合領域及びその近傍のアミノ酸を欠失、置換又は付加することにより、グルカンの合成速度が飛躍的に向上するという優れた特性を備えたものである。
【００３９】
また、本発明の遺伝子組換え体は、改変ＧＴＦを効率良く生産できると共に、高い発酵生産性と優れた保存安定性を備えており、従来のＧＴＦの遺伝子組換え体における発酵生産性の低さや保存安定性の悪さなどの諸問題を解決し得、グルカンの製造効率をより一層向上させることができるものである。
【００４０】
次に、本発明のグルカンの製造方法は、上記改変ＧＴＦ遺伝子組換え体を用いて、ＧＴＦの酵素法で行われている培養条件により、菌体から産生される改変ＧＴＦ酵素を用いて通常の酵素法により、グルカンを製造するものである。
【００４１】
具体的には、遺伝子組換え体として大腸菌（宿主）を用いた場合には、例えばジャーファメンターに所定量のブレイン・ハート・インヒュージョン培地（ＢＨＩ培地、ＢＢＬ社製）を仕込み、オートクレーブで滅菌後、この培地に大腸菌組換え株を接種し、温度３７℃、回転数３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で４〜２４時間培養する。
【００４２】
培養後菌体を遠心分離（８０００ｒｐｍ×２０分）により回収した後、菌体に対し、１００ｍｌの６Ｍウレア−ＥＤＴＡ溶液（６Ｍウレア、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍトリス塩酸）加えて、室温で１時間放置する。放置後、遠心分離（１８０００ｒｐｍ×２０分）により上清を回収することにより、改変ＧＴＦ酵素液を得ることができる。
【００４３】
そして、この改変ＧＴＦ酵素液を用いて、通常のＧＴＦの酵素法と同様の方法で、効率良く、グルカンを製造することができるものである。
【００４４】
本発明のグルカンの製造方法によれば、従来の酵素法と同じ方法で、極めて効率良く有用なグルカンを製造することができるものである。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、高いグルカンの合成速度を有する高純度の改変グルコシルトランスフェラーゼ（改変ＧＴＦ）を得ることができる。
また、本発明の改変ＧＴＦ遺伝子組換え体は、上記高品質な改変ＧＴＦを極めて効率よく生産できると共に、高い発酵生産性と優れた保存安定性を有するものである。
そして、本発明の遺伝子組換え体から産生された改変ＧＴＦを用いることにより、ムタン、デキストラン、澱粉、グリコーゲン、デキストリン、及びプルラン等を初めとする産業上有用な種々のグルカンを極めて効率よく生産できるものである。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
【００４７】
[実施例１]（ムタンの場合）
ムタンの製造に用いる改変ＧＴＦ酵素の作製方法について以下に示す。
【００４８】
（１）染色体ＤＮＡの調製
ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）をトッドヘウィトブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）に接種し、３７℃で一晩培養し、菌体を得た。湿潤菌体１ｇに対してＴＥバッファー（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１ｍｌを加え、懸濁後、リゾチーム８ｍｇを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。続いてＮ−アセチルムラミダーゼを０．１ｍｇ添加し、５０℃で３０分間インキュベートして完全に溶菌させた。常法によりフェノール処理を行いＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿によりストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）の染色体ＤＮＡを得た。
【００４９】
（２）ＰＣＲ法によるＧＴＦ−Ｉ遺伝子の取得
既知のストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）のＧＴＦ−Ｉ遺伝子配列（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｓｅｐｔ． １９８７ ｐ４２７１−４２７８ ＲＯＹ Ｒ． Ｂ．ＲＵＳＳＥＬら）をもとにして、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子の上流と下流それぞれ３０ベースからなる下記一対のプライマーを作成した。この一対のプライマーを用いて上記（１）で得られた染色体ＤＮＡをテンプレートとして長鎖長用ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ・ｄａｓｈ（東洋紡）を用いたＰＣＲ法によりＧＴＦ−Ｉ遺伝子を得た。この遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００５０】
プライマー
配列表の配列番号３
５’−ＣＴＡＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＧＴ−３’
配列表の配列番号４
５’−ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＡＴＡＧＧＴＴＴＡ−３’
【００５１】
（３）遺伝子組換え体の取得
上記（２）で得られたＧＴＦ−Ｉ遺伝子をプラスミドベクター（ｐＵＣ１１８）に挿入し、この発現プラスミドベクター（発現型ｐＵＣ１１８）を大腸菌ＪＭ１０９株（宿主菌）に取り込ませることにより形質転換し、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子を導入した組換え大腸菌（遺伝子組換え体）を得た。
【００５２】
上記（３）で得た遺伝子組換え体（発現型ｐＵＣ１１８）のＧＴＦ−Ｉ遺伝子を制限酵素（ＢｌｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、及びＰｓｔＩ）を用いて切断し、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域近傍の３’末端側の塩基配列が欠失した下記３種の改変遺伝子組換え体（ＧＴＦ−Ｄ７（参考例）、ＧＴＦ−Ｄ３、ＧＴＦ−Ｄ２）を作成した。
【００５３】
ＧＴＦ−Ｄ７改変組換え体
ＧＴＦ−Ｄ７改変組換え体は、制限酵素ＢｌｎＩを用いてＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３３００ベースより下流の３’末端、具体的には３３４６ベースより下流の１６４９ベースを欠損させた。
得られたＧＴＦ−Ｄ７のＧＴＦ−Ｉ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号５に示す。
ＧＴＦ−Ｄ３の改変組換え体
ＧＴＦ−Ｄ３改変組換え体は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いてＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３３００ベースより下流の３’末端、具体的には４４９５ベースより下流の５００ベースを欠損させた。
得られたＧＴＦ−Ｄ３のＧＴＦ−Ｉ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号６に示す。
ＧＴＦ−Ｄ２の改変組換え体
ＧＴＦ−Ｄ２改変組換え体は、制限酵素ＰｓｔＩを用いてＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３３００ベースより下流の３’末端、具体的には４７５１ベースより下流の２４４ベースを欠損させた。
得られたＧＴＦ−Ｄ２のＧＴＦ−Ｉ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号７に示す。
【００５４】
また、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３３００ベースより下流に所定の長さの塩基配列を付加して下記２種の改変遺伝子組換え体（ＧＴＦ−Ａ１、ＧＴＦ−Ａ２）を作成した。
【００５５】
ＧＴＦ−Ａ１改変組換え体
ＧＴＦ−Ａ１改変組換え体は、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３４５２〜３５５５ベースの１０４ベース部分からなるＤＮＡ断片を作成し、このＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した後、平滑化し、平滑化ＤＮＡ断片を作成した。なお、平滑化ＤＮＡ断片には平滑化の際に４塩基付加されている。
次に、上記（３）で得た組換え体をＧＴＦ−Ｉ遺伝子の制限酵素ＢｌｎＩを用いて切断した後、平滑化し、この切断した組換え体と上記平滑化ＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域の３３４６ベース位置に１０８ベース付加した改変組換え体（ＧＴＦ−Ａ１）を作成した。
得られたＧＴＦ−Ａ１のＧＴＦ−Ｉ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号８に示す。
ＧＴＦ−Ａ２改変組換え体
ＧＴＦ−Ａ２改変組換え体は、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３４５２〜３７９８ベースの３４７ベース部分からなるＤＮＡ断片を作成し、このＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した後、平滑化し、平滑化ＤＮＡ断片を作成した。なお、平滑化ＤＮＡ断片には平滑化の際に４塩基付加されている。
次に、上記（３）で得た組換え体をＧＴＦ−Ｉ遺伝子の制限酵素ＢｌｎＩサイトで切断した後、平滑化し、この切断した組換え体と上記平滑化ＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域の３３４６ベース位置に３５１ベース付加した改変組換え体（ＧＴＦ−Ａ２）を作成した。
得られたＧＴＦ−Ａ２のＧＴＦ−Ｉ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号９に示す。
【００５６】
（５）組換え体による改変ＧＴＦ酵素の調製
３Ｌ容のジャーファメンターに２リットルのブレイン・ハート・インヒュージョン培地（ＢＨＩ培地、ＢＢＬ社製）を仕込み、オートクレーブで滅菌した。
この培地に上記（４）方法で取得したＧＴＦ−Ｄ７、ＧＴＦ−Ｄ３、ＧＴＦ−Ｄ２、ＧＴＦ−Ａ１、及びＧＴＦ−Ａ２の大腸菌組換え株を接種し、温度３７℃、回転数３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で１６時間培養した。
培養後菌体を遠心分離（８０００ｒｐｍ×２０分）により回収した後、菌体に対し、１００ｍｌの６Ｍウレア−ＥＤＴＡ溶液（６Ｍウレア、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍトリス塩酸）加えて、室温で１時間放置した。放置後、遠心分離（１８０００ｒｐｍ×２０分）により上清を回収し、これを酵素液とした。
【００５７】
（６）発酵生産性の比較
上記（５）で得られた各酵素液を用いてＧＴＦ−Ｉ活性を下記方法により測定した。結果を図１に示す。
【００５８】
ＧＴＦ−Ｉの活性測定
ショ糖１０％（Ｗ／Ｗ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）を０．１ｍｌ分取し、これに上記（５）で得られた各酵素液を０．１ｍｌ加え、３５℃で１０分間インキュベートして反応させた。反応終了後、ジニトロフタル酸溶液を０．４ｍｌ加え、反応を停止させてジニトロフタル酸法により、遊離した還元糖量を測定した。対照には反応時間０分の反応液を上記同様にして定量した。なお、当該酵素の１単位とは上記条件下において１分間にショ糖１μｇを分解する酵素の量と定義した。
【００５９】
図１の結果から、グルカン結合領域の塩基配列の一部が欠失した改変ＧＴＦ−Ｉ組換え体（ＧＴＦ−Ｄ２、ＧＴＦ−Ｄ３、ＧＴＦ−Ｄ７）から得たＧＴＦ−Ｉ、及びグルカン結合領域に塩基配列を付加した改変ＧＴＦ−Ｉ組換え体（ＧＴＦ−Ａ１、ＧＴＦ−Ａ２）から得たＧＴＦ−Ｉは、いずれもネイティブなＧＴＦ−Ｉ（ＧＴＦ）に比べて高い酵素活性を示し、ＧＴＦ−Ｉのグルカン結合領域の塩基配列を欠失又は付加することにより、発酵生産性が高くなることが認められた。
【００６０】
（７）保存安定性の比較
上記（４）で作成した改変組換え体（ＧＴＦ−Ｄ２、ＧＴＦ−Ａ１）、及びネイティブなＧＴＦ−Ｉを導入した組換え体（ＧＴＦ）について、−８０℃で３ヶ月間保存した後、これら組換え体を上記同様の方法で培養し、得られた酵素液を用いて上記（６）と同様の方法によりＧＴＦ−Ｉ活性を測定した。
得られたＧＴＦ−Ｉ活性値から組換え体の保存安定性を下記式より、保存前のＧＴＦ−Ｉ活性に対する保存後のＧＴＦ−Ｉの残存活性（％）として求めた。結果を表１に示す。
【００６１】
【数１】
【００６２】
【表１】
表１の結果から、ネイティブなＧＴＦ−Ｉ組換え体（ＧＴＦ）は保存安定性が極めて低いことが認められる。これに対して、グルカン結合領域を欠失又は付加したＧＴＦ−Ｉ改変組換え体（ＧＴＦ−Ｄ２、ＧＴＦ−Ａ１）は保存安定性が高いことが分かった。
【００６３】
（８）ムタン合成速度の比較
上記（４）で作成した改変組換え体（ＧＴＦ−Ｄ２、ＧＴＦ−Ａ１）及びネイティグなＧＴＦ−Ｉを導入した組換え体（ＧＴＦ）を上記（５）と同様の方法で培養し、得られた酵素液を用いて下記ムタンの定量法に従ってムタン合成速度を測定した。結果を図２に示す。
【００６４】
ムタンの定量法
２％のショ糖を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに対し１５０Ｕ相当量の上記各酵素液を加え、３５℃で０〜９０分間反応させた。加熱して酵素を失活させることにより反応を停止させ、酵素反応の結果生成したムタンを遠心分離（８０００ｒｐｍ×２０分）により回収し、よく洗浄した後、フェノール硫酸法でムタン量を測定した。
【００６５】
図２の結果から、グルカン結合領域を欠失したＧＴＦ−Ｉ（ｐＧｔｙ−Ｄ２）及びグルカン結合領域に付加したＧＴＦ−Ｉ（ｐＧｔｙ−Ａ１）は改変していないＧＴＦ−Ｉ（ｐＧｔｙ）と比較して、９０分間の合成反応でそれぞれ２．１倍量及び１．６倍量のムタンを合成できることが分かった。
【００６６】
以上のように、ＧＴＦ−ＩはそのＣ末端のグルカン結合領域のアミノ酸配列を改変することにより、発酵生産性が高まり、保存安定性の高いＧＴＦ−Ｉ組換え体が得られること、また、これら改変ＧＴＦ−Ｉ組換え体から産生された改変ＧＴＦ−Ｉは極めて効率良くムタンを合成できることが分かった。
【００６７】
[実施例２]（デキストランの場合）
（１）スクロース６−ＧＴＦ遺伝子の取得
既知のロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のスクロース６−ＧＴＦ遺伝子配列（Ｇｅｎｅ，１９９６ ｖｏｌ．１８２（１−２） ｐ２３−３２ Ｍｏｎｓａｎ，Ｐ．ら）をもとに、上述の遺伝子クローニング手法に準じてスクロース６−ＧＴＦ遺伝子を調製した。この遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
【００６８】
（２）遺伝子組換え体の取得
上記（１）で得られたスクロース６−ＧＴＦ遺伝子をプラスミドベクター（ｐＵＣ１１８）に挿入し、この発現プラスミドベクター（発現型ｐＵＣ１１８）を大腸菌ＪＭ１０９株（宿主菌）に取り込ませることにより形質転換し、スクロース６−ＧＴＦ遺伝子を導入した組換え大腸菌（遺伝子組換え体）を得た。
【００６９】
（３）改変組換え体の取得
スクロース６−ＧＴＦ−Ｄ６改変組換え体
上記（２）で得た組換え体のグルカン結合領域をコードする３５００ベースよりも下流の３’末端、具体的には４５６１ベースより下流の３４６ベースを制限酵素ＢａｍＨＩで消化することにより欠失させた。
得られたスクロース６−ＧＴＦ−Ｄ６のスクロース６−ＧＴＦ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１０に示す。
スクロース６−ＧＴＦ−Ａ１改変組換え体
スクロース６−ＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３８０８〜３９０１ベースの９４ベース部分からなるＤＮＡ断片を作成し、このＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した後、平滑化し、平滑化ＤＮＡ断片を作成した。なお、平滑化ＤＮＡ断片には平滑化の際に２塩基付加されている。
上記（２）で得た組換え体をスクロース６−ＧＴＦ遺伝子の制限酵素ＮｓｐＶサイトで切断した後、平滑化し、この切断した組換え体と上記平滑化ＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより、スクロース６−ＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域の３６５７ベース位置に９６ベース付加した改変組換え体（スクロース６−ＧＴＦ−Ａ１）を作成した。
得られたスクロース６−ＧＴＦ−Ａ１のスクロース６−ＧＴＦ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１１に示す。
【００７０】
次に、得られた各組換え体を上記実施例１と同様に培養して酵素液
を作成し、下記の通り発酵生産性、保存安定性、及びデキストラン合成速度を測定した。
【００７１】
（４）発酵生産性の比較
スクロース６−ＧＴＦ−Ａ１を上記実施例１と同様の方法で培養し、得られた酵素液を用いてスクロース６−ＧＴＦの活性を下記方法で測定した。結果を図３に示す。
【００７２】
スクロース６−ＧＴＦの活性測定
ショ糖１０％（Ｗ／Ｗ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）を０．１ｍｌとり、これに上記酵素液を０．１ｍｌ加え、３５℃で１０分間インキュベートして反応させた。反応終了後、ジニトロフタル酸溶液を０．４ｍｌ加え、反応を停止させてジニトロフタル酸法により、遊離した還元糖量を測定した。対照には反応時間０分の反応液を上記と同様にして定量した。なお、当該酵素の１単位とは上記条件下において１分間にショ糖１μｇを分解する酵素の量と定義した。
【００７３】
図３の結果から、グルカン結合領域の塩基配列を付加した組換え体（Ｓ６−ＧＴＦ−Ａ１）から得たスクロース６−ＧＴＦは、ネイティブなスクロース６−ＧＴＦ（Ｓ６−ＧＴＦ）から得たスクロース６−ＧＴＦに比べて高い酵素活性を示し、グルカン結合領域に塩基配列を付加することにより発酵生産性が高くなることが分かった。
【００７４】
（５）保存安定性の比較
各種組換え体（Ｓ６−ＧＴＦ，Ｓ６−ＧＴＦ−Ｄ６、Ｓ６−ＧＴＦ−Ａ１）を−８０℃で３ヶ月間保存後、これらの組換え体を培養し、スクロース６−ＧＴＦ活性を上記（４）と同様の方法で測定することにより、各組換え体の保存安定性を保存前に対する残存活性（％）で評価した。結果を表２に示す。
【００７５】
【表２】
表２の結果から、ネイティブなスクロース６−ＧＴＦ組換え体（Ｓ６−ＧＴＦ）は保存安定性が低かったが、グルカン結合領域の塩基配列を付加又は欠失した組換え体（Ｓ６−ＧＴＦ−Ａ１、Ｓ６−ＧＴＦ−Ｄ６）は、保存安定性が向上することが認められた。
【００７６】
（６）デキストラン合成速度の比較
組換え体（Ｓ６−ＧＴＦ、Ｓ６−ＧＴＦ−Ａ１）由来のスクロース６−ＧＴＦを用いて下記方法によりデキストラン合成速度を測定した。結果を図４に示す。
【００７７】
デキストランの定量法
２％のショ糖を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに対し１５０Ｕ相当量の上記各酵素液を加え、３５℃で０〜９０分間反応させた。加熱して酵素を失活させることにより反応を停止させ、酵素反応の結果生成したデキストランを遠心分離（８０００ｒｐｍ×２０分）により回収し、よく洗浄した後、フェノール硫酸法でデキストラン量を測定した。
【００７８】
図４の結果から、グルカン結合領域を改変したスクロース６−ＧＴＦ組換え体（Ｓ６−ＧＴＦ−Ａ１）由来のスクロース６−ＧＴＦは、ネイティブな組換え体（Ｓ６−ＧＴＦ）由来のスクロース６−ＧＴＦと比較して、９０分間の合成反応で１．７倍量のデキストランを作ることが分かった。
【００７９】
以上の結果から、スクロース６−ＧＴＦは、そのＣ末端のグルカン結合領域を改変することにより、発酵生産性が高く、保存安定性も高い改変スクロース６−ＧＴＦ組換え体が得られること、また、これらの改変スクロース６−ＧＴＦ組換え体から産生された改変スクロース６−ＧＴＦは、極めて効率よくデキストランを合成できることが分かった。
【００８０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＴＦ−Ｉ活性の差異を比較したグラフである。
【図２】ムタンの合成速度を比較したグラフである。
【図３】Ｓ６−ＧＴＦ活性の差異を比較したグラフである。
【図４】デキストランの合成速度を比較したグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、高いグルカンの合成速度を有する改変グルコシルトランスフェラーゼ（改変ＧＴＦ）、この改変ＧＴＦを効率よく生産し得る遺伝子組換え体、及び該遺伝子組み換え体から産生された改変ＧＴＦを用いたグルカンの製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
グルカンは、澱粉、グリコーゲン、デキストリン、デキストラン、及びプルラン等のグルコースから構成される多糖類の総称である。これらグルカンは医薬品、化学品及び食品などの種々の分野で幅広く利用されている。例えば、デキストランは血漿増量剤として広く用いられており、血液不足や輸血による疾病などの発生により需要が増大している。プルランは工業用フィルム、シート、プラスチック成型物を始めとして、化粧品、香料等のカプセル化、医薬品の錠剤及び食品用原料として利用されている。澱粉は食品、香粧品、及び化粧品の成分として一般的に用いられており、また、製紙工業や繊維工業でのサイジング剤や濃厚剤、更に、石油採掘における二次・三次回収用の増粘剤としても用いられている（総合多糖類科学；原田篤也、講談社サイエンティフィク、１２９９６の化学商品；化学工業日報社）。
【０００３】
近年、これらのグルカンに加えてグルコースがα−１，６又はα−１，３結合でつながった水溶性又は水不溶性のグルカンが注目を集めている。
【０００４】
例えば、水溶性のグルカンは歯垢形成抑制効果を有する口腔用組成物としての用途（特開平１０−１８２３８２号公報）、及び保湿剤としての用途（特願平１０−１５７８８４号）などが見出されている。一方、水不溶性グルカンは、その性質から各種担体等への応用も見込まれる極めてユニークな素材として着目されており、このようにグルカンは、極めて広い用途範囲をもっていることから、産業上重要な化合物として位置づけられている。
【０００５】
また、これらグルカンは、従来、植物からの抽出法や微生物を用いた発酵法などにより生産されてきた。例えば、澱粉はイモ、とうもろこし及び小麦などの穀物類を磨砕することによって粗澱粉乳を得た後、沈殿・分離などの精製工程を経て製造されていた。プルランはオウレオバシディウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）を用いた発酵生産を行った後、メタノールなどの有機溶媒を発酵液中に添加することにより、プルランを回収し、製造していた。デキストランはロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）を用いて発酵生産を行った後、メタノールなどの有機溶媒を発酵液中に添加することにより、デキストランを回収し、製造していた。
【０００６】
一方、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）を用いた酵素法に基づくグルカンの製造法も行われている。具体的には、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）の増殖に伴って産生されるスクロース６−ＧＴＦ（デキストランスクラーゼ）を発酵生産により調製し、この酵素を用いてデキストランを合成することができることが知られている。この場合、酵素法では発酵法に比べて純度の高いデキストランが得られるなどのメリットがある（多糖生化学２；江上不二夫ら、共立出版、総合多糖類科学；原田篤也、講談社サイエンティフィク）。
【０００７】
また最近、バイオテクノロジーの飛躍的な進歩に伴って、遺伝子組換え技術を応用した効率的なグルカンの生産法が開発されつつあるが、う蝕の原因菌として知られているストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）やストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）などが生産するグルカンの場合は、一般的には発酵法が用いられてきた。
【０００８】
しかしながら、これら発酵法では生きた菌体を用いるために、生産量に最も影響を与えるショ糖濃度が菌の生育に対し制限条件となり、高濃度のショ糖を添加することができず、培地当たりの収量が低いという問題点があった。
【０００９】
かかる問題点を解決すべく、本発明者らは、従来から酵素の凝集、吸着及びプロテオリシス等の問題により極めて調製が困難であったＧＴＦだけを分離精製できる、遺伝子組換え技術を応用して製造した酵素を用いた効率の良いムタンの合成法を開発した（特願平１０−２７４３１０号）。
【００１０】
しかしながら、一般に、ＧＴＦの遺伝子組換え体は、発酵生産性の低さや保存安定性の悪さなどの面で充分なものではなく、グルカンの製造効率をより一層向上させるために、発酵生産性及び保存安定性を高めるべく、更なる有効な方策の開発が望まれていた。
【００１１】
本発明は、上記事情に鑑みなされたもので、遺伝子組換え技術を応用することにより、高いグルカンの製造効率を有する改変グルコシルトランスフェラーゼ（改変ＧＴＦ）、この改変ＧＴＦを効率よく生産できると共に、優れた発酵生産性と保存安定性を有する遺伝子組換え体、及び該遺伝子組換え体から産生された改変ＧＴＦを用いたグルカンの製造方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】
本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討を重ねた結果、グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ）のＣ末端側に存在するグルカン結合領域及びその近傍のアミノ酸配列のうち、遺伝子組換え技術により１０個以上のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する改変ＧＴＦが、高いグルカンの合成速度を有すること、また、この改変ＧＴＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子を挿入したプラスミド等のベクターを大腸菌等の宿主に取り込むことにより形質転換された遺伝子組換え体が、意外にも改変ＧＴＦを効率よく生産できると共に、高い発酵生産性と優れた保存安定性を備えており、従来の課題を効果的に解決し得ることを知見した。
【００１３】
そして、上記遺伝子組換え体から産生された改変ＧＴＦを用いることにより、ムタン、デキストラン、澱粉、グリコーゲン、デキストリン、及びプルラン等を初めとする産業上有用な種々のグルカンを極めて効率よく生産できることを見出し、本発明をなすに至ったものである。
【００１４】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明の改変グルコシルトランスフェラーゼ（改変ＧＴＦ）は下記に示すものである。
［１］．下記塩基配列（１）、（２）、（３）又は（４）でコードされたアミノ酸配列からなり、ムタンを生産する改変グルコシルトランスフェラーゼ。
（１）配列番号１に示されるストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉの塩基配列において、４４９５ベースより下流の５００ベースを欠失し、配列番号６に示される塩基配列
（２）配列番号１に示されるストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉの塩基配列において、４７５１ベースより下流の２４４ベースを欠失し、配列番号７に示される塩基配列
（３）配列番号６に示される塩基配列
（４）配列番号７に示される塩基配列
［２］．下記塩基配列（５）、（６）、（７）又は（８）でコードされたアミノ酸配列からなり、ムタンを生産する改変グルコシルトランスフェラーゼ。
（５）ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉの塩基配列において、３３４６ベース位置に１０８ベース付加し、配列番号８に示される塩基配列
（６）ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉの塩基配列において、３３４６ベース位置に３５１ベース付加し、配列番号９に示される塩基配列
（７）配列番号８に示される塩基配列
（８）配列番号９に示される塩基配列
［３］．下記塩基配列（９）、（１０）、（１１）又は（１２）でコードされたアミノ酸配列からなり、デキストランを生産する改変グルコシルトランスフェラーゼ。
（９）配列番号２に示されるロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のスクロース６−ＧＴＦの塩基配列において、４５６１ベースより下流の３４６ベースを欠失し、配列番号１０に示される塩基配列
（１０）配列番号２に示されるロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のスクロース６−ＧＴＦの塩基配列において、３６５７ベース位置に９６ベース付加し、配列番号１１に示される塩基配列
（１１）配列番号１０に示される塩基配列
（１２）配列番号１１に示される塩基配列
また、下記グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子、遺伝子組換え体、グルカンの製造方法を提供する。
［４］．上記（１）〜（１２）のいずれかに示される塩基配列からなるグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子。
［５］．［４］記載の遺伝子を挿入したベクターを宿主に取り込むことにより形質転換された［６］．［５］記載の遺伝子組換え体から産生された改変グルコシルトランスフェラーゼを用いたグルカンの製造方法。
【００１５】
ここで、本発明の改変ＧＴＦを取得するには、まず、改変していないＧＴＦ（ネイティブなＧＴＦ）のアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、この遺伝子を発現したベクターを取り込んだＧＴＦを保持した遺伝子組換え体を作成する。
【００１６】
この場合、ＧＴＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、ＧＴＦを産生可能な菌株から通常の方法により染色体ＤＮＡを抽出し、既知のＧＴＦの遺伝子配列情報をもとにしてＰＣＲ法等により、取得することができる。
【００１７】
具体的には、ムタンの場合には、ＧＴＦとしては公知のものを使用することができ、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・フェラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）などに由来するＧＴＦ−Ｉ，ＳＩが挙げられる。
【００１８】
また、デキストランの場合には、ＧＴＦとしては公知のものを使用することができ、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）、ストレプトコッカス・ラッタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｔｔｕｓ）、ストレプトコッカス・クリセタス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｉｃｅｔｕｓ）、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・フェラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆｅｒｕｓ）、ストレプトコッカス・マカカエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｃａｃａｅ）、ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）などに由来するＧＴＦ−Ｓ、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ロイコノストック・デキストラニカム（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）由来のスクロース６−ＧＴＦ（デキストランスクラーゼ）などが挙げられる。
【００１９】
これらＧＴＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は公知であり、例えば下記文献に記載されている。
・ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）Ｍｆｅ２８のＧＴＦ−Ｉ遺伝子配列（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｓｅｐｔ． １９８７ ｐ４２７１−４２７８ ＲＯＹ Ｒ． Ｂ． ＲＵＳＳＥＬら）
・ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のスクロース６−ＧＴＦ遺伝子配列（Ｇｅｎｅ，１９９６ ｖｏｌ．１８２（１−２） ｐ２３−３２ Ｍｏｎｓａｎ，Ｐ．ら）
・ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＧＳ５のＧＴＦ−Ｉ遺伝子配列（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｓｅｐｔ．１９８７ ｐ４２６３−４２７０ Ｈ．Ｋ． ＫＵＲＡＭＩＴＳＵら）
・ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＭＴ８１４８のＧＴＦ−Ｉ遺伝子配列（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ． １６１， １９９８ ｐ３３１−３３６ Ｓ．ＨＡＭＡＤＡら）・ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）６７１５のＧＴＦ−Ｉ遺伝子配列（特開平５−２３１８８号公報）
【００２０】
そして、ＧＴＦのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、上記公知の遺伝子配列情報をもとにして、上記菌株から抽出した染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲ法を行うことにより取得することができる。
【００２１】
具体的には、上記目的とするＧＴＦの遺伝子配列情報からＧＴＦ遺伝子配列の上流と下流について３０ベース程度の長さの一対のプライマーを作成し、この一対のプライマーを用いて菌株から抽出した染色体ＤＮＡをテンプレートとしてＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲ法を行うことにより、目的とするＧＴＦ遺伝子を増幅し、取得することができる。なお、ＰＣＲ法は、特に制限されず通常の方法を採用することができる。
【００２２】
次に、得られたＧＴＦ遺伝子をプラスミド等のベクターに挿入し、このＧＴＦ遺伝子が挿入されたプラスミド等のベクターを大腸菌等の宿主に取り込み形質転換することにより、ＧＴＦ遺伝子を保持した遺伝子組換え体が得られる。
【００２３】
ここで、ベクターとしては、特に制限されないが、プラスミドが好適であり、宿主が大腸菌の場合はｐＢＲ系、ｐＵＣ系等のプラスミド、宿主がバチルス属細菌の場合はｐＵＢ１１０系、ｐＣ１９４系等のプラスミド、宿主が酵母の場合はＹＩｐ系、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系等のプラスミドなどが発現性の点から好適に用いられる。また、ベクター（プラスミド）の宿主細胞への導入（形質転換）は、コンピテントセル法、プロトプラスト化法、及び電気パルス法（エレクトロポレーション）等の方法で行うことができる。
【００２４】
上記ベクターを組み込む宿主細胞としては、特に制限されないが、例えばエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス・ミレリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｌｌｅｒｉ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバクテリア、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クリビロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ）等の酵母、アスペルギルス・ニードランス（Ａｓｐｅｒｇｉｒｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）等のカビ、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）等の放線菌を使用できる。中でも基礎情報の充実しているエシェリシア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。
【００２５】
本発明においては、上述したように、ＧＴＦ遺伝子を保持した遺伝子組換え体を用いて、この遺伝子組換え体に対して遺伝子組換え技術を応用することにより、ＧＴＦのＣ末端側に存在するグルカン結合領域及びその近傍のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列を欠失、置換又は付加することにより、該欠失、置換又は付加した塩基配列に対応するアミノ酸配列が欠失、置換又は付加した改変ＧＴＦを得ることができるものである。
【００２６】
ここで、上記ＧＴＦのグルカン結合領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列は、ＧＴＦの種類、産生菌種などにより異なり一概には規定できないが、例えばムタンの場合（ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来）は、配列表の配列番号１に示したように、ＧＴＦ−Ｉをコードする遺伝子の塩基配列の３３００ベースより下流、具体的には３３００〜４９９５ベースまでの領域をいう。また、デキストランの場合（ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））は、配列表の配列番号２に示したように、スクロース６−ＧＴＦ（デキストランスクラーゼ）をコードする遺伝子の３５００べースより下流、具体的には３５００〜４９０７ベースまでの領域をいう。
【００２７】
本発明の遺伝子組換え技術によるグルカン結合領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子の塩基配列の欠失、置換又は付加は、ＧＴＦ遺伝子を保持した遺伝子組換え体に対し制限酵素を用いた遺伝子（ＤＮＡ）の切断、結合技術及び遺伝子クローニング技術等の遺伝子組換え技術を応用することにより、行うことができる。
【００２８】
この場合、ＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域の塩基配列を欠失する場合には、グルカン結合領域及びその近傍のアミノ酸をコードする塩基配列を制限酵素を用いて切断し、これらを結合させることにより行うことができる。また、グルカン結合領域に塩基配列を付加する場合には、特にグルカン結合能を持つ塩基配列（グルカン結合領域をコードする塩基配列）の一部を切り取った塩基配列をグルカン結合領域内に付加することが好ましい。更に、グルカン結合領域の塩基配列を置換する場合にはグルカン結合領域内の所定の塩基配列部分を置換することが好ましい。
【００２９】
上記制限酵素としては、特に制限されず、５’末端型、３’末端型、ブラントエンド型のいずれでもよく、例えばＢｌｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮａｅＩ、ＮｓｐＩ、ＮｓｐＶ等を目的に応じて用いることができる。
【００３０】
具体的には、ＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域の塩基配列を欠失する方法としては、ネイティブなＧＴＦ遺伝子をプラスミドベクターに挿入し、この発現型プラスミドベクターを大腸菌等の宿主に取り込ませることにより形質転換を行い、ＧＴＦ遺伝子を導入した組換え大腸菌（遺伝子組換え体）を得る。この遺伝子組換え体のＧＴＦ遺伝子（発現型ｐＵＣ１１８）を制限酵素（例えばＢｌｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮａｅＩ、ＮｓｐＩ、ＮｓｐＶ等）を用いて切断し、結合させることにより、グルカン結合領域及びその近傍の塩基配列が欠損した改変ＧＴＦ遺伝子を保持した組換え体を得ることができる。
【００３１】
また、ＧＴＦの結合領域の塩基配列を付加する方法の一例としては、ネイティブなＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域をコードする所定長さの塩基配列からなるＤＮＡ断片を作成し、このＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した後、平滑化し、平滑化ＤＮＡ断片を作成する。次に、ＧＴＦ遺伝子が発現している組換え体のＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域を制限酵素で切断した後、平滑化し、この切断した組換え体と上記平滑化ＤＮＡとをライゲーションすることにより、ＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域内にグルカン結合領域をコードする塩基配列が付加した改変ＧＴＦ遺伝子を保持した遺伝子組換え体を得ることができる。なお、平滑化の際に、平滑化ＤＮＡ断片に数個の塩基が付加されることがあるが、本発明の目的及び作用効果を達成する上で問題とはならない。
【００３２】
なお、ＧＴＦのグルカン結合領域の塩基配列を置換する方法としては、ＯＤＡ法、ＬＡ ＰＣＲ法、Ｋｕｎｋｅｌ法などにより、ＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域内の塩基配列が置換した改変ＧＴＦ遺伝子を保持した遺伝子組換え体を得ることができる。
【００３３】
この場合、欠失、置換又は付加する塩基配列の数（アミノ酸の数）は、目的とするＧＴＦの種類などにより異なり一概には規定できないが、通常３０ベース（アミノ酸１０個）以上、好ましくは３０〜２４００ベース（アミノ酸１０〜８００個）、より好ましくは９０〜１８００ベース（アミノ酸３０〜６００個）、更に好ましくは９０〜１２００ベース（アミノ酸３０〜４００個）である。
【００３４】
具体的には、例えばムタンを生産する場合には、ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のＧＦＴ−Ｉが好適に用いられるが、発酵生産性及び保存安定性を高めるためには、グルコシルトランスフェラーゼのＣ末端側に存在するグルカン結合領域の近傍において、遺伝子組換え技術により１０〜８００個のアミノ酸（３０〜２４００ベース）を欠失、置換又は付加することが好ましく、より好ましくは３０〜６００個のアミノ酸（９０〜１８００ベース）、更に好ましくは５０〜５３０個のアミノ酸（１５０〜１５９０ベース）を欠失、置換又は付加することが好ましい。
【００３５】
また、デキストランを生産する場合には、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のスクロース６−ＧＴＦが好適に用いられ、発酵生産性及び保存安定性を高めるためには、同酵素のＣ末端側に存在するグルカン結合領域にグルカン結合能を持つ１０〜６００個のアミノ酸（３０〜１８００ベース）を遺伝子組換え技術により欠失、置換又は付加することが好ましく、より好ましくは３０〜４００個のアミノ酸（９０〜１２００ベース）、更に好ましくは３０〜２００個のアミノ酸（９０〜６００ベース）を欠失、置換又は付加することが好ましい。
【００３６】
なお、ムタン、デキストラン以外の澱粉、グリコーゲン、デキスリン、プルラン等のグルカンにおいても、これらグルカンを合成する酵素の遺伝子配列情報をもとにして、上記同様に適用できることは勿論である。
【００３７】
このようにして得られるグルカン結合領域及びその近傍のアミノ酸をコードする遺伝子の塩基配列が改変されたＧＴＦを保持した遺伝子組み換え体を、通常の方法により培養することにより、本発明の改変ＧＴＦが得られる。
【００３８】
本発明の改変ＧＴＦは、そのグルカン結合領域及びその近傍のアミノ酸を欠失、置換又は付加することにより、グルカンの合成速度が飛躍的に向上するという優れた特性を備えたものである。
【００３９】
また、本発明の遺伝子組換え体は、改変ＧＴＦを効率良く生産できると共に、高い発酵生産性と優れた保存安定性を備えており、従来のＧＴＦの遺伝子組換え体における発酵生産性の低さや保存安定性の悪さなどの諸問題を解決し得、グルカンの製造効率をより一層向上させることができるものである。
【００４０】
次に、本発明のグルカンの製造方法は、上記改変ＧＴＦ遺伝子組換え体を用いて、ＧＴＦの酵素法で行われている培養条件により、菌体から産生される改変ＧＴＦ酵素を用いて通常の酵素法により、グルカンを製造するものである。
【００４１】
具体的には、遺伝子組換え体として大腸菌（宿主）を用いた場合には、例えばジャーファメンターに所定量のブレイン・ハート・インヒュージョン培地（ＢＨＩ培地、ＢＢＬ社製）を仕込み、オートクレーブで滅菌後、この培地に大腸菌組換え株を接種し、温度３７℃、回転数３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で４〜２４時間培養する。
【００４２】
培養後菌体を遠心分離（８０００ｒｐｍ×２０分）により回収した後、菌体に対し、１００ｍｌの６Ｍウレア−ＥＤＴＡ溶液（６Ｍウレア、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍトリス塩酸）加えて、室温で１時間放置する。放置後、遠心分離（１８０００ｒｐｍ×２０分）により上清を回収することにより、改変ＧＴＦ酵素液を得ることができる。
【００４３】
そして、この改変ＧＴＦ酵素液を用いて、通常のＧＴＦの酵素法と同様の方法で、効率良く、グルカンを製造することができるものである。
【００４４】
本発明のグルカンの製造方法によれば、従来の酵素法と同じ方法で、極めて効率良く有用なグルカンを製造することができるものである。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば、高いグルカンの合成速度を有する高純度の改変グルコシルトランスフェラーゼ（改変ＧＴＦ）を得ることができる。
また、本発明の改変ＧＴＦ遺伝子組換え体は、上記高品質な改変ＧＴＦを極めて効率よく生産できると共に、高い発酵生産性と優れた保存安定性を有するものである。
そして、本発明の遺伝子組換え体から産生された改変ＧＴＦを用いることにより、ムタン、デキストラン、澱粉、グリコーゲン、デキストリン、及びプルラン等を初めとする産業上有用な種々のグルカンを極めて効率よく生産できるものである。
【００４６】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に制限されるものではない。
【００４７】
[実施例１]（ムタンの場合）
ムタンの製造に用いる改変ＧＴＦ酵素の作製方法について以下に示す。
【００４８】
（１）染色体ＤＮＡの調製
ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）をトッドヘウィトブロス（Ｄｉｆｃｏ社製）に接種し、３７℃で一晩培養し、菌体を得た。湿潤菌体１ｇに対してＴＥバッファー（１０ｍＭトリス塩酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）１ｍｌを加え、懸濁後、リゾチーム８ｍｇを添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。続いてＮ−アセチルムラミダーゼを０．１ｍｇ添加し、５０℃で３０分間インキュベートして完全に溶菌させた。常法によりフェノール処理を行いＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿によりストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）の染色体ＤＮＡを得た。
【００４９】
（２）ＰＣＲ法によるＧＴＦ−Ｉ遺伝子の取得
既知のストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）のＧＴＦ−Ｉ遺伝子配列（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， Ｓｅｐｔ． １９８７ ｐ４２７１−４２７８ ＲＯＹ Ｒ． Ｂ．ＲＵＳＳＥＬら）をもとにして、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子の上流と下流それぞれ３０ベースからなる下記一対のプライマーを作成した。この一対のプライマーを用いて上記（１）で得られた染色体ＤＮＡをテンプレートとして長鎖長用ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ・ｄａｓｈ（東洋紡）を用いたＰＣＲ法によりＧＴＦ−Ｉ遺伝子を得た。この遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１に示す。
【００５０】
プライマー
配列表の配列番号３
５’−ＣＴＡＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＴＴＴＴＧＴＣＴＣＴＴＣＴＴＴＧＴ−３’
配列表の配列番号４
５’−ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡＣＴＴＧＧＴＣＧＡＧＡＴＡＧＧＴＴＴＡ−３’
【００５１】
（３）遺伝子組換え体の取得
上記（２）で得られたＧＴＦ−Ｉ遺伝子をプラスミドベクター（ｐＵＣ１１８）に挿入し、この発現プラスミドベクター（発現型ｐＵＣ１１８）を大腸菌ＪＭ１０９株（宿主菌）に取り込ませることにより形質転換し、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子を導入した組換え大腸菌（遺伝子組換え体）を得た。
【００５２】
上記（３）で得た遺伝子組換え体（発現型ｐＵＣ１１８）のＧＴＦ−Ｉ遺伝子を制限酵素（ＢｌｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、及びＰｓｔＩ）を用いて切断し、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域近傍の３’末端側の塩基配列が欠失した下記３種の改変遺伝子組換え体（ＧＴＦ−Ｄ７（参考例）、ＧＴＦ−Ｄ３、ＧＴＦ−Ｄ２）を作成した。
【００５３】
ＧＴＦ−Ｄ７改変組換え体
ＧＴＦ−Ｄ７改変組換え体は、制限酵素ＢｌｎＩを用いてＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３３００ベースより下流の３’末端、具体的には３３４６ベースより下流の１６４９ベースを欠損させた。
得られたＧＴＦ−Ｄ７のＧＴＦ−Ｉ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号５に示す。
ＧＴＦ−Ｄ３の改変組換え体
ＧＴＦ−Ｄ３改変組換え体は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いてＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３３００ベースより下流の３’末端、具体的には４４９５ベースより下流の５００ベースを欠損させた。
得られたＧＴＦ−Ｄ３のＧＴＦ−Ｉ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号６に示す。
ＧＴＦ−Ｄ２の改変組換え体
ＧＴＦ−Ｄ２改変組換え体は、制限酵素ＰｓｔＩを用いてＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３３００ベースより下流の３’末端、具体的には４７５１ベースより下流の２４４ベースを欠損させた。
得られたＧＴＦ−Ｄ２のＧＴＦ−Ｉ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号７に示す。
【００５４】
また、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３３００ベースより下流に所定の長さの塩基配列を付加して下記２種の改変遺伝子組換え体（ＧＴＦ−Ａ１、ＧＴＦ−Ａ２）を作成した。
【００５５】
ＧＴＦ−Ａ１改変組換え体
ＧＴＦ−Ａ１改変組換え体は、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３４５２〜３５５５ベースの１０４ベース部分からなるＤＮＡ断片を作成し、このＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した後、平滑化し、平滑化ＤＮＡ断片を作成した。なお、平滑化ＤＮＡ断片には平滑化の際に４塩基付加されている。
次に、上記（３）で得た組換え体をＧＴＦ−Ｉ遺伝子の制限酵素ＢｌｎＩを用いて切断した後、平滑化し、この切断した組換え体と上記平滑化ＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域の３３４６ベース位置に１０８ベース付加した改変組換え体（ＧＴＦ−Ａ１）を作成した。
得られたＧＴＦ−Ａ１のＧＴＦ−Ｉ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号８に示す。
ＧＴＦ−Ａ２改変組換え体
ＧＴＦ−Ａ２改変組換え体は、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３４５２〜３７９８ベースの３４７ベース部分からなるＤＮＡ断片を作成し、このＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した後、平滑化し、平滑化ＤＮＡ断片を作成した。なお、平滑化ＤＮＡ断片には平滑化の際に４塩基付加されている。
次に、上記（３）で得た組換え体をＧＴＦ−Ｉ遺伝子の制限酵素ＢｌｎＩサイトで切断した後、平滑化し、この切断した組換え体と上記平滑化ＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより、ＧＴＦ−Ｉ遺伝子のグルカン結合領域の３３４６ベース位置に３５１ベース付加した改変組換え体（ＧＴＦ−Ａ２）を作成した。
得られたＧＴＦ−Ａ２のＧＴＦ−Ｉ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号９に示す。
【００５６】
（５）組換え体による改変ＧＴＦ酵素の調製
３Ｌ容のジャーファメンターに２リットルのブレイン・ハート・インヒュージョン培地（ＢＨＩ培地、ＢＢＬ社製）を仕込み、オートクレーブで滅菌した。
この培地に上記（４）方法で取得したＧＴＦ−Ｄ７、ＧＴＦ−Ｄ３、ＧＴＦ−Ｄ２、ＧＴＦ−Ａ１、及びＧＴＦ−Ａ２の大腸菌組換え株を接種し、温度３７℃、回転数３００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍの条件で１６時間培養した。
培養後菌体を遠心分離（８０００ｒｐｍ×２０分）により回収した後、菌体に対し、１００ｍｌの６Ｍウレア−ＥＤＴＡ溶液（６Ｍウレア、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１Ｍトリス塩酸）加えて、室温で１時間放置した。放置後、遠心分離（１８０００ｒｐｍ×２０分）により上清を回収し、これを酵素液とした。
【００５７】
（６）発酵生産性の比較
上記（５）で得られた各酵素液を用いてＧＴＦ−Ｉ活性を下記方法により測定した。結果を図１に示す。
【００５８】
ＧＴＦ−Ｉの活性測定
ショ糖１０％（Ｗ／Ｗ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）を０．１ｍｌ分取し、これに上記（５）で得られた各酵素液を０．１ｍｌ加え、３５℃で１０分間インキュベートして反応させた。反応終了後、ジニトロフタル酸溶液を０．４ｍｌ加え、反応を停止させてジニトロフタル酸法により、遊離した還元糖量を測定した。対照には反応時間０分の反応液を上記同様にして定量した。なお、当該酵素の１単位とは上記条件下において１分間にショ糖１μｇを分解する酵素の量と定義した。
【００５９】
図１の結果から、グルカン結合領域の塩基配列の一部が欠失した改変ＧＴＦ−Ｉ組換え体（ＧＴＦ−Ｄ２、ＧＴＦ−Ｄ３、ＧＴＦ−Ｄ７）から得たＧＴＦ−Ｉ、及びグルカン結合領域に塩基配列を付加した改変ＧＴＦ−Ｉ組換え体（ＧＴＦ−Ａ１、ＧＴＦ−Ａ２）から得たＧＴＦ−Ｉは、いずれもネイティブなＧＴＦ−Ｉ（ＧＴＦ）に比べて高い酵素活性を示し、ＧＴＦ−Ｉのグルカン結合領域の塩基配列を欠失又は付加することにより、発酵生産性が高くなることが認められた。
【００６０】
（７）保存安定性の比較
上記（４）で作成した改変組換え体（ＧＴＦ−Ｄ２、ＧＴＦ−Ａ１）、及びネイティブなＧＴＦ−Ｉを導入した組換え体（ＧＴＦ）について、−８０℃で３ヶ月間保存した後、これら組換え体を上記同様の方法で培養し、得られた酵素液を用いて上記（６）と同様の方法によりＧＴＦ−Ｉ活性を測定した。
得られたＧＴＦ−Ｉ活性値から組換え体の保存安定性を下記式より、保存前のＧＴＦ−Ｉ活性に対する保存後のＧＴＦ−Ｉの残存活性（％）として求めた。結果を表１に示す。
【００６１】
【数１】
【表１】
【００６３】
（８）ムタン合成速度の比較
上記（４）で作成した改変組換え体（ＧＴＦ−Ｄ２、ＧＴＦ−Ａ１）及びネイティグなＧＴＦ−Ｉを導入した組換え体（ＧＴＦ）を上記（５）と同様の方法で培養し、得られた酵素液を用いて下記ムタンの定量法に従ってムタン合成速度を測定した。結果を図２に示す。
【００６４】
ムタンの定量法
２％のショ糖を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに対し１５０Ｕ相当量の上記各酵素液を加え、３５℃で０〜９０分間反応させた。加熱して酵素を失活させることにより反応を停止させ、酵素反応の結果生成したムタンを遠心分離（８０００ｒｐｍ×２０分）により回収し、よく洗浄した後、フェノール硫酸法でムタン量を測定した。
【００６５】
図２の結果から、グルカン結合領域を欠失したＧＴＦ−Ｉ（ｐＧｔｙ−Ｄ２）及びグルカン結合領域に付加したＧＴＦ−Ｉ（ｐＧｔｙ−Ａ１）は改変していないＧＴＦ−Ｉ（ｐＧｔｙ）と比較して、９０分間の合成反応でそれぞれ２．１倍量及び１．６倍量のムタンを合成できることが分かった。
【００６６】
以上のように、ＧＴＦ−ＩはそのＣ末端のグルカン結合領域のアミノ酸配列を改変することにより、発酵生産性が高まり、保存安定性の高いＧＴＦ−Ｉ組換え体が得られること、また、これら改変ＧＴＦ−Ｉ組換え体から産生された改変ＧＴＦ−Ｉは極めて効率良くムタンを合成できることが分かった。
【００６７】
[実施例２]（デキストランの場合）
（１）スクロース６−ＧＴＦ遺伝子の取得
既知のロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）のスクロース６−ＧＴＦ遺伝子配列（Ｇｅｎｅ，１９９６ ｖｏｌ．１８２（１−２） ｐ２３−３２ Ｍｏｎｓａｎ，Ｐ．ら）をもとに、上述の遺伝子クローニング手法に準じてスクロース６−ＧＴＦ遺伝子を調製した。この遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号２に示す。
【００６８】
（２）遺伝子組換え体の取得
上記（１）で得られたスクロース６−ＧＴＦ遺伝子をプラスミドベクター（ｐＵＣ１１８）に挿入し、この発現プラスミドベクター（発現型ｐＵＣ１１８）を大腸菌ＪＭ１０９株（宿主菌）に取り込ませることにより形質転換し、スクロース６−ＧＴＦ遺伝子を導入した組換え大腸菌（遺伝子組換え体）を得た。
【００６９】
（３）改変組換え体の取得
スクロース６−ＧＴＦ−Ｄ６改変組換え体
上記（２）で得た組換え体のグルカン結合領域をコードする３５００ベースよりも下流の３’末端、具体的には４５６１ベースより下流の３４６ベースを制限酵素ＢａｍＨＩで消化することにより欠失させた。
得られたスクロース６−ＧＴＦ−Ｄ６のスクロース６−ＧＴＦ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１０に示す。
スクロース６−ＧＴＦ−Ａ１改変組換え体
スクロース６−ＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域をコードする３８０８〜３９０１ベースの９４ベース部分からなるＤＮＡ断片を作成し、このＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した後、平滑化し、平滑化ＤＮＡ断片を作成した。なお、平滑化ＤＮＡ断片には平滑化の際に２塩基付加されている。
上記（２）で得た組換え体をスクロース６−ＧＴＦ遺伝子の制限酵素ＮｓｐＶサイトで切断した後、平滑化し、この切断した組換え体と上記平滑化ＤＮＡ断片とをライゲーションすることにより、スクロース６−ＧＴＦ遺伝子のグルカン結合領域の３６５７ベース位置に９６ベース付加した改変組換え体（スクロース６−ＧＴＦ−Ａ１）を作成した。
得られたスクロース６−ＧＴＦ−Ａ１のスクロース６−ＧＴＦ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号１１に示す。
【００７０】
次に、得られた各組換え体を上記実施例１と同様に培養して酵素液
を作成し、下記の通り発酵生産性、保存安定性、及びデキストラン合成速度を測定した。
【００７１】
（４）発酵生産性の比較
スクロース６−ＧＴＦ−Ａ１を上記実施例１と同様の方法で培養し、得られた酵素液を用いてスクロース６−ＧＴＦの活性を下記方法で測定した。結果を図３に示す。
【００７２】
スクロース６−ＧＴＦの活性測定
ショ糖１０％（Ｗ／Ｗ）を含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６）を０．１ｍｌとり、これに上記酵素液を０．１ｍｌ加え、３５℃で１０分間インキュベートして反応させた。反応終了後、ジニトロフタル酸溶液を０．４ｍｌ加え、反応を停止させてジニトロフタル酸法により、遊離した還元糖量を測定した。対照には反応時間０分の反応液を上記と同様にして定量した。なお、当該酵素の１単位とは上記条件下において１分間にショ糖１μｇを分解する酵素の量と定義した。
【００７３】
図３の結果から、グルカン結合領域の塩基配列を付加した組換え体（Ｓ６−ＧＴＦ−Ａ１）から得たスクロース６−ＧＴＦは、ネイティブなスクロース６−ＧＴＦ（Ｓ６−ＧＴＦ）から得たスクロース６−ＧＴＦに比べて高い酵素活性を示し、グルカン結合領域に塩基配列を付加することにより発酵生産性が高くなることが分かった。
【００７４】
（５）保存安定性の比較
各種組換え体（Ｓ６−ＧＴＦ，Ｓ６−ＧＴＦ−Ｄ６、Ｓ６−ＧＴＦ−Ａ１）を−８０℃で３ヶ月間保存後、これらの組換え体を培養し、スクロース６−ＧＴＦ活性を上記（４）と同様の方法で測定することにより、各組換え体の保存安定性を保存前に対する残存活性（％）で評価した。結果を表２に示す。
【００７５】
【表２】
【００７６】
（６）デキストラン合成速度の比較
組換え体（Ｓ６−ＧＴＦ、Ｓ６−ＧＴＦ−Ａ１）由来のスクロース６−ＧＴＦを用いて下記方法によりデキストラン合成速度を測定した。結果を図４に示す。
【００７７】
デキストランの定量法
２％のショ糖を含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１ｍｌに対し１５０Ｕ相当量の上記各酵素液を加え、３５℃で０〜９０分間反応させた。加熱して酵素を失活させることにより反応を停止させ、酵素反応の結果生成したデキストランを遠心分離（８０００ｒｐｍ×２０分）により回収し、よく洗浄した後、フェノール硫酸法でデキストラン量を測定した。
【００７８】
図４の結果から、グルカン結合領域を改変したスクロース６−ＧＴＦ組換え体（Ｓ６−ＧＴＦ−Ａ１）由来のスクロース６−ＧＴＦは、ネイティブな組換え体（Ｓ６−ＧＴＦ）由来のスクロース６−ＧＴＦと比較して、９０分間の合成反応で１．７倍量のデキストランを作ることが分かった。
【００７９】
以上の結果から、スクロース６−ＧＴＦは、そのＣ末端のグルカン結合領域を改変することにより、発酵生産性が高く、保存安定性も高い改変スクロース６−ＧＴＦ組換え体が得られること、また、これらの改変スクロース６−ＧＴＦ組換え体から産生された改変スクロース６−ＧＴＦは、極めて効率よくデキストランを合成できることが分かった。
【００８０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧＴＦ−Ｉ活性の差異を比較したグラフである。
【図２】ムタンの合成速度を比較したグラフである。
【図３】Ｓ６−ＧＴＦ活性の差異を比較したグラフである。
【図４】デキストランの合成速度を比較したグラフである。
Claims (6)
- 下記塩基配列（１）、（２）、（３）又は（４）でコードされたアミノ酸配列からなり、ムタンを生産する改変グルコシルトランスフェラーゼ。
（１）配列番号１に示されるストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉの塩基配列において、４４９５ベースより下流の５００ベースを欠失し、配列番号６に示される塩基配列
（２）配列番号１に示されるストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉの塩基配列において、４７５１ベースより下流の２４４ベースを欠失し、配列番号７に示される塩基配列
（３）配列番号６に示される塩基配列
（４）配列番号７に示される塩基配列 - 下記塩基配列（５）、（６）、（７）又は（８）でコードされたアミノ酸配列からなり、ムタンを生産する改変グルコシルトランスフェラーゼ。
（５）ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉの塩基配列において、３３４６ベース位置に１０８ベース付加し、配列番号８に示される塩基配列
（６）ストレプトコッカス・ダウネイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｏｗｎｅｉ）由来のグルコシルトランスフェラーゼ−Ｉの塩基配列において、３３４６ベース位置に３５１ベース付加し、配列番号９に示される塩基配列
（７）配列番号８に示される塩基配列
（８）配列番号９に示される塩基配列 - 下記塩基配列（９）、（１０）、（１１）又は（１２）でコードされたアミノ酸配列からなり、デキストランを生産する改変グルコシルトランスフェラーゼ。
（９）配列番号２に示されるロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のスクロース６−ＧＴＦの塩基配列において、４５６１ベースより下流の３４６ベースを欠失し、配列番号１０に示される塩基配列
（１０）配列番号２に示されるロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のスクロース６−ＧＴＦの塩基配列において、３６５７ベース位置に９６ベース付加し、配列番号１１に示される塩基配列
（１１）配列番号１０に示される塩基配列
（１２）配列番号１１に示される塩基配列 - 上記（１）〜（１２）のいずれかに示される塩基配列からなるグルコシルトランスフェラーゼ遺伝子。
- 請求項４記載の遺伝子を挿入したベクターを宿主に取り込むことにより形質転換された遺伝子組換え体。
- 請求項５記載の遺伝子組換え体から産生された改変グルコシルトランスフェラーゼを用いたグルカンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12641999A JP4320484B2 (ja) | 1999-05-06 | 1999-05-06 | 改変グルコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子、その遺伝子組換え体及びグルカンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12641999A JP4320484B2 (ja) | 1999-05-06 | 1999-05-06 | 改変グルコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子、その遺伝子組換え体及びグルカンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000316571A JP2000316571A (ja) | 2000-11-21 |
| JP4320484B2 true JP4320484B2 (ja) | 2009-08-26 |
Family
ID=14934715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12641999A Expired - Lifetime JP4320484B2 (ja) | 1999-05-06 | 1999-05-06 | 改変グルコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子、その遺伝子組換え体及びグルカンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4320484B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11201306B2 (en) | 2017-02-20 | 2021-12-14 | Novaled Gmbh | Active OLED display, method for preparing an active OLED display and compound |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1679374A1 (en) * | 2005-01-10 | 2006-07-12 | Bayer CropScience GmbH | Transformed plant expressing a mutansucrase and synthesizing a modified starch |
| WO2019055377A1 (en) * | 2017-09-13 | 2019-03-21 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | GLUCOSYLTRANSFERASES MODIFIED |
-
1999
- 1999-05-06 JP JP12641999A patent/JP4320484B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11201306B2 (en) | 2017-02-20 | 2021-12-14 | Novaled Gmbh | Active OLED display, method for preparing an active OLED display and compound |
| US11239440B2 (en) | 2017-02-20 | 2022-02-01 | Novaled Gmbh | Electronic semiconducting device and method for preparing the electronic semiconducting device |
| US11322710B2 (en) | 2017-02-20 | 2022-05-03 | Novaled Gmbh | Electronic semiconducting device and method for preparing the electronic semiconducting device |
| US11522150B2 (en) | 2017-02-20 | 2022-12-06 | Novaled Gmbh | Electronic device, method for preparing the same and display device comprising the same |
| US11539014B2 (en) | 2017-02-20 | 2022-12-27 | Novaled Gmbh | Electronic semiconducting device, method for preparing the electronic semiconducting device and compound |
| US11825667B2 (en) | 2017-02-20 | 2023-11-21 | Novaled Gmbh | Electronic semiconducting device and method for preparing the electronic semiconducting device |
| US12022672B2 (en) | 2017-02-20 | 2024-06-25 | Novaled Gmbh | Electronic semiconducting device, method for preparing the electronic semiconducting device and compound |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2000316571A (ja) | 2000-11-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU699552B2 (en) | DNA sequences coding for enzymes capable of facilitating the synthesis of linear alpha-1,4 glucans in plants, fungi and microorganisms | |
| EP1109916A1 (en) | Nucleic acid molecules encoding an amylosucrase | |
| KR100714912B1 (ko) | 글루카나제 및 덱스트란슈크라제의 하이브리드 유전자 및효소, 및 그를 이용한 이소말토올리고당 또는 덱스트란의제조방법 | |
| JP3557289B2 (ja) | 非還元性糖質からトレハロースを遊離する組換え型耐熱性酵素 | |
| CN107236695B (zh) | 一种表达蔗糖磷酸化酶的基因工程菌及其应用 | |
| WO2001090335A1 (fr) | Nouvelle cyclodextrine glucanotransferase, procede de production de celle-ci et procede de production de cyclodextrine au moyen de cette enzyme | |
| CN101432429A (zh) | 产生芳香分子的酵母表达系统 | |
| JP3557288B2 (ja) | 還元性澱粉糖から末端にトレハロース構造を有する非還元性糖質を生成する組換え型耐熱性酵素 | |
| KR20100107591A (ko) | 류코노스톡 락티스로부터 유래된 글루칸수크라제 및 그 제조방법 | |
| JP4320484B2 (ja) | 改変グルコシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ遺伝子、その遺伝子組換え体及びグルカンの製造方法 | |
| JPH0630575B2 (ja) | γ―ＣＧターゼ | |
| CN106701800B (zh) | 一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用 | |
| JP2009521240A (ja) | プレバイオティックオリゴ糖６−ケストースを得るための新規フルクトフラノシダーゼ活性 | |
| Schepers et al. | Characterization of a novel glucoamylase from the thermoacidophilic archaeon Picrophilus torridus heterologously expressed in E. coli | |
| AU724938B2 (en) | Gene encoding recombinant trehalose phosphorylase, vector including the gene, transformant transformed by the gene, and method for preparing recombinant trehalose phosphorylase using the transformant | |
| WO2001079476A1 (fr) | Mutants de bacteries lactiques surproducteurs d'exopolysaccharides | |
| JP5792458B2 (ja) | ヒアルロン酸高生産性乳酸菌 | |
| JP4060652B2 (ja) | γ−シクロデキストリンを主生成物とするシクロデキストリン・グルカノトランスフェラーゼをコードする遺伝子およびその使用 | |
| JP2000175694A (ja) | 酵素合成によるムタンの製造方法 | |
| GB2515366A (en) | Production of butanol | |
| KR101614924B1 (ko) | 신규효소와 이를 이용한 아스코르브산 배당체의 제조방법 | |
| JPH10262683A (ja) | 組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードする 遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクタ ーを含む形質転換体とその産生物 | |
| JP3607789B2 (ja) | α−１，３−多分岐デキストラン水解酵素、その製造法及び環状イソマルトオリゴ糖の製造法 | |
| JP2003111590A (ja) | 改変デキストランスクラーゼ、その遺伝子組み換え体、グルカンの製造法 | |
| US6960461B2 (en) | Gene coding for cyclodextrin glucanotransferase chiefly producing γ-cyclodextrin and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20051227 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080716 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080904 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090128 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090310 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090507 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090520 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120612 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120612 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120612 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120612 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130612 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130612 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140612 Year of fee payment: 5 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |