JP6708554B2 - 代替のスクロース原料からのグルカンポリマーの生成 - Google Patents

代替のスクロース原料からのグルカンポリマーの生成 Download PDF

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Description

本出願は、（２０１４年３月２５日付けで出願された）米国仮特許出願第６１／９６９，９５８号明細書の利益を主張するものであり、その出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、多糖合成の分野におけるものである。例えば、本発明は、完全に精製されていないスクロースを使用した不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンの生成に関する。
電子ファイルで提出された配列リストの参照
配列リストの公式コピーは、２０１５年３月１６日に作成され、５６９キロバイトのサイズを有する２０１５０３２４＿ＣＬ６２２１ＵＳＮＰ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇという名称のファイルでＡＳＣＩＩフォーマットの配列リストとして、ＥＦＳ−ウェブを介して電子ファイルで提出され、本明細書と同時に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書に含まれる配列リストは、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
微生物の酵素的合成又は遺伝子工学を用いて新規な構造の多糖を発見するという要望によって駆り立てられ、研究者らは、生物分解可能であり、且つ再生可能に供給された原料から経済的に生成可能な多糖を発見してきた。こうした多糖の１つは、アルファ−１，３−グリコシド結合を有することが特徴であるグルカンポリマー、ポリアルファ−１，３−グルカンである。
ポリアルファ−１，３−グルカンは、スクロースの水溶液を、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）（非特許文献１）から単離されたグルコシルトランスフェラーゼ（ｇｔｆ）酵素と接触させることによって単離された。特許文献１では、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ｇｔｆＪ酵素を使用した多糖繊維の調製を開示した。この繊維のポリマー中の少なくとも５０％のヘキソース単位は、アルファ−１，３−グリコシド結合を介して結合された。溶媒における又は溶媒を含む混合物における臨界濃度を超えて溶解される場合、開示されたポリマーは、液晶溶液を形成した。この溶液から、繊維製品への使用に非常に適した、連続した強度のある綿状の繊維を紡糸し使用した。
米国特許第７，０００，０００号明細書
Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４１：１４５１−１４６０，１９９５
ポリアルファ−１，３−グルカンの酵素的合成は、白色の精製されたスクロースを使用して、事前に実施された。スクロースのこの形態が、比較的高価であることから、精製されていない又は完全に精製されていないスクロースを使用して、ポリアルファ−１，３−グルカン合成のための新規な酵素的プロセスを開発することが望ましい。
一実施形態においては、本開示は、水と、スクロースと、少なくとも５０％のアルファ−１，３グリコシド結合及び少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液に関し、この場合に、スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製されている。反応溶液によるポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、反応溶液において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも７％である。
反応溶液の別の実施形態においては、スクロースは甜菜に由来し、且つ、結晶化されていない。
反応溶液の別の実施形態においては、スクロースはサトウキビに由来し、且つ、（ｉ）結晶化されていないか、又は（ｉｉ）３つ以下の結晶化工程を使用して結晶化されている。
反応溶液の別の実施形態においては、スクロースは、１５０を超えるＩＣＵＭＳＡ値を有する。
反応溶液の別の実施形態においては、反応溶液の相対反応速度は、水と、白色の精製されたスクロースと、グルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液の反応速度に対して少なくとも０．８である。
反応溶液の別の実施形態においては、反応溶液によって生成されたポリアルファ−１，３−グルカンは、９３未満のＬ＊値を有する。
別の実施形態においては、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、又は配列番号３４と少なくとも９０％相同性であるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態においては、本開示は、水、スクロース、及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程を含む、ポリアルファ−１，３−グルカンを生成する方法に関し、この場合に、スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製されている。接触工程において生成されたポリアルファ−１，３−グルカンは、少なくとも５０％のアルファ−１，３グリコシド結合及び少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する。この方法において生成されるポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、接触工程において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも７％である。この方法は、任意選択的に、接触工程で生成されたポリアルファ−１，３−グルカンを単離する工程を含む。
別の実施形態においては、この方法で使用されるスクロースは甜菜に由来し、且つ、結晶化されていない。
別の実施形態においては、この方法で使用されるスクロースはサトウキビに由来し、且つ、（ｉ）結晶化されていないか、又は（ｉｉ）３つ以下の結晶化工程を使用して結晶化されている。
別の実施形態においては、この方法で使用されるスクロースは、１５０を超えるＩＣＵＭＳＡ値を有する。
別の実施形態においては、この方法の接触工程でポリアルファ−１，３−グルカンを生成する相対反応速度は、白色の精製されたスクロースが、精製されてない又は部分的に精製されたスクロースの代わりに使用される場合、接触工程の反応速度に対して少なくとも０．８である。
別の実施形態においては、この方法において任意選択的に単離されたポリアルファ−１，３−グルカンは、９３未満のＬ＊値を有する。
別の実施形態においては、この方法において使用されるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、又は配列番号３４と少なくとも９０％相同性であるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態においては、本開示は、前述の方法によって生成される単離されたポリアルファ−１，３−グルカンに関し、この場合に、ポリアルファ−１，３−グルカンは、９３未満のＬ＊値を有する。
Figure 0006708554
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すべての引用された特許文献及び非特許文献の開示は、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において使用される場合、「発明」又は「開示された発明」という用語は、限定されることを意味するものではないが、特許請求の範囲において定義されるか、又は本明細書において記載される発明のいずれかに一般的に適用される。これらの用語は、本明細書において相互に交換して使用される。
「ポリアルファ−１，３−グルカン」、「アルファ−１，３−グルカンポリマー」等の用語は、相互に交換して使用される。ポリアルファ−１，３−グルカンは、グリコシド結合（即ち、グルコシド結合）によってともに結合されたグルコースモノマー単位を含むポリマーであり、この場合に、グリコシド結合の少なくとも約５０％は、アルファ−１，３−グリコシド結合である。ポリアルファ−１，３−グルカンは、多糖の一種類である。本明細書において使用される場合、「アルファ−１，３−グリコシド結合」という用語は、アルファ−Ｄ−グルコース分子を、隣接するアルファ−Ｄーグルコース環上の炭素１及び３を介して、互いに結合させる共有結合の種類を意味する。
「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ）」及び「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ ｂｏｎｄ）」という用語は、本明細書において相互に交換して使用され、炭水化物（糖）分子を、別の炭水化物などの別の基に結合させる共有結合の種類を意味する。本明細書において使用される場合、「アルファ−１，３−グリコシド結合」という用語は、アルファ−Ｄ−グルコース分子を、隣接するアルファ−Ｄーグルコース環上の炭素１及び３を介して、互いに結合させる共有結合の種類を意味する。
本明細書における「アルファ−Ｄ−グルコース」は、「グルコース」とも称され得る。
本明細書における「スクロース」という用語は、アルファ−１，２−グリコシドの結合によって結合されるアルファ−Ｄ−グルコース分子及びベータ−Ｄ−フルクトース分子からなる非還元二糖を意味する。スクロースは、通常は砂糖として知られている。
本明細書における「白色の精製された」スクロースは、少なくとも９９．０重量％のスクロースを含むスクロースを意味する。更に、又は別の方法として、白色の精製されたスクロースは、１５０以下（例えば、４５以下）のＩＣＵＭＳＡ値、９９．７０％の最小分極、及び／又は少なくとも８７．０のＬ＊値を有するスクロースを意味することができる。
「ＩＣＵＭＳＡ」（国際砂糖分析法統一委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｓｕｇａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ））値、又は「標準ＩＣＵＭＳＡ」値は、溶液におけるスクロース試料の純度を表すための国際単位であり、スクロースの色に直接関連している。スクロース試料のＩＣＵＭＳＡ値がより大きいほど、スクロース試料は、より濃色になる。スクロース試料のＩＣＵＭＳＡ値を決定する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ＩＣＵＭＳＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｓｕｇａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｏｆｆｉｃｉａｌ ａｎｄ Ｔｅｎｔａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｓｕｇａｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＣＵＭＳＡ）（Ｅｄ．Ｈ．Ｃ．Ｓ．ｄｅ Ｗｈａｌｌｅｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９６４）において国際砂糖分析法統一委員会によって開示されている。ＩＣＵＭＳＡは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒ．Ｊ．ＭｃＣｏｗａｇｅ，Ｒ．Ｍ．Ｕｒｑｕｈａｒｔ ａｎｄ Ｍ．Ｌ．Ｂｕｒｇｅ（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｌｏｕｒ ｏｆ Ｒａｗ Ｓｕｇａｒｓ，Ｂｒｏｗｎ Ｓｕｇａｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｕｒｅｄ Ｓｙｒｕｐｓ ａｔ ｐＨ ７．０−Ｏｆｆｉｃｉａｌ，Ｖｅｒｌａｇ Ｄｒ Ａｌｂｅｒｔ Ｂａｒｔｅｎｓ，２０１１ ｒｅｖｉｓｉｏｎ）によって記載されるように、ＩＣＵＭＳＡ Ｍｅｔｈｏｄ ＧＳ１／３−７によって測定され得る。ＩＣＵＭＳＡ値は、「基準基本単位（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂａｓｅ ｕｎｉｔｓ）」（ＲＢＵ）にて表され得る。
本明細書におけるＩＣＵＭＳＡ値は、ＩＣＵＭＳＡ Ｍｅｔｈｏｄ ＧＳ１／３−７に非常に類似した方法によって測定され得るが、ニトロセルロースフィルターの代わりに酢酸セルロースフィルターを使用することによって異なる。従って、本明細書において開示されるＩＣＵＭＳＡ値は、その代わりとして「改変ＩＣＵＭＳＡ」値と称され得る。ＩＣＵＭＳＡが測定される方法を考えると、固体の糖試料（例えば、未加工のサトウキビ）について本明細書において与えられたＩＣＵＭＳＡ値は、糖試料の水溶液（約２００ｇ／Ｌ）を使用して得られたことが理解されるであろう。
本明細書におけるスクロース試料の「分極」（「ｐｏｌ」）は、２０℃でスクロース試料を含む溶液を通過する偏光の旋光度によって測定される質量パーセントとして表される試料における見かけのスクロース含有量を意味する。スクロース試料の分極がより大きいほど、試料におけるスクロースは、より純粋である。
本明細書における「完全に精製されていない」スクロース（「不完全に精製された」スクロース）は、白色の精製されたスクロースに加工されなかったスクロースを意味する。従って、不完全に精製されたスクロースは、完全に未精製であるか、又は部分的に精製されていることができる。精製されていないスクロースの例は、「未加工のスクロース」（「未加工の糖」）、及びその溶液である。部分的に精製されたスクロースの例は、１つ、２つ、３つ、又はより多くの結晶化工程を経ていない。本明細書における不完全に精製されたスクロースのＩＣＵＭＳＡは、１５０を超える。
スクロースの「結晶化」、「結晶化工程」、「分別結晶化」等の用語は、本明細書において相互に交換して使用され、不完全に精製されたスクロースを含む溶液からスクロースを結晶化させ、上澄み（母液）からスクロース結晶を分離するプロセスを意味する。典型的には、このプロセスから得られた結晶は、結晶化工程の前に存在していたようなスクロースと比較してより純粋であるスクロースを表す。しかしながら、１つ、２つ、３つ、又はより多くの結晶化工程を経た不完全に精製されたスクロースは、不完全に精製されたスクロースを依然として構成し得ることに留意することが重要である（即ち、結晶化されたスクロースは、白色の精製されたスクロースの純度を有することができない）。典型的には、サトウキビは、白色の精製された糖を調製するために、３つ以上の結晶化工程を必要とし、一方、特定の実施形態におけるビート液は、こうした純度に達するために１つの結晶化工程のみを必要とすることができる。蒸発、沸騰、及び／又は真空乾燥プロセスなどの、スクロースを結晶化させるための様々な手段が当技術分野において知られている。
本明細書において使用される場合、「Ｌ＊値」という用語は、国際照明委員会（ＣＩＥ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）によって特定されたＣＩＥ １９７６（Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊）（「ＣＩＥＬＡＢ」）３次元色空間の明度成分を意味する。Ｌ＊ａ＊ｂ＊色空間の３つの座標はそれぞれ、固体の色の明度（Ｌ＊＝０は黒を示し、且つ、Ｌ＊＝１００は散乱性白色を示す）、赤／マゼンタと緑との間のスケールに沿った対象物の色（ａ＊、負の値は緑を示し、一方、正の値はマゼンタを示す）、並びに黄と青との間のスケールに沿った対象物の色（ｂ＊、負の値は青を示し、且つ、正の値は黄を示す）を表す。対象物のＬ＊ａ＊ｂ＊色空間に言及する際に使用される星印（＊）は、「星」（例えば、Ｌ＊は「Ｌ−星」である）として表され、且つ、この色空間とハンター（Ｈｕｎｔｅｒ）のＬ、ａ、ｂ表色系とを区別するのに役立つ。対象物のＣＩＥＬＡＢ色空間のＬ＊、ａ＊、及びｂ＊成分は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｊ．Ｓｃｈｗｉｅｇｅｒｌｉｎｇ（Ｆｉｅｌｄ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｖｉｓｕａｌ ａｎｄ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ Ｏｐｔｉｃｓ，ＳＰＩＥ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｅｌｌｉｎｇｈａｍ，ＷＡ，２００４）によって開示された式を用いて算出され得る。本明細書におけるＬ＊、ａ＊、ｂ＊値は、乾燥スクロース又は乾燥ポリアルファ−１，３−グルカンなどの固体材料に対してである。
本明細書において使用される場合、「乾燥」スクロースは、２．０、１．５、１．０、０．５、０．２５、０．１０、０．０５、又は０．０１重量％以下の水を含むスクロースを特徴とすることができる。
本明細書におけるポリアルファ−１，３−グルカンの「分子量」は、数平均分子量（Ｍｎ）として又は重量平均分子量（Ｍｗ）として表され得る。或いは、分子量は、ダルトン、グラム／モル、ＤＰｗ（重量平均重合度）、又はＤＰｎ（数平均重合度）として表され得る。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、又はゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によってなど、これらの分子量測定値を算出するための様々な手段が当技術分野において知られている。
「グルコシルトランスフェラーゼ酵素」、「ｇｔｆ酵素」、「ｇｔｆ酵素触媒」、「ｇｔｆ」、「グルカンスクラーゼ」等の用語は、本明細書において相互に交換して使用される。本明細書におけるｇｔｆ酵素の活性は、基質スクロースの反応を触媒して、生成物、ポリアルファ−１，３−グルカン及びフルクトースを生成する。ｇｔｆ反応のその他の生成物（副生成物）としては、グルコース（グルコースがグルコシル−ｇｔｆ酵素中間錯体から加水分解される場合に得られる）、様々な可溶性オリゴ糖（例えば、ＤＰ２−ＤＰ７）、及びロイクロース（グルコシル−ｇｔｆ酵素中間錯体のグルコースがフルクトースに結合される場合に得られる）を挙げることができる。ロイクロースは、アルファ−１，５結合によって結合されたグルコース及びフルクトースからなる二糖である。一般的に、グルコシルトランスフェラーゼ酵素の野生型の形態は、（Ｎ末端からＣ末端の方向において）シグナルペプチド、可変ドメイン、触媒ドメイン、及びグルカン結合ドメインを含む。本明細書におけるｇｔｆは、ＣＡＺｙ（炭水化物−活性酵素）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８，２００９）に従って、グリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ＧＨ７０）の下に分類される。
本明細書において使用される場合、一般的に、「反応溶液」は、スクロースと、水と、少なくとも１つの活性グルコシルトランスフェラーゼ酵素と、任意選択的にその他の成分とを含む溶液を意味する。或いは、例えば、反応溶液は、「グルカン合成反応」、「グルカン反応」、又は「ｇｔｆ反応」として、本明細書において称され得る。グルカン合成反応において存在することができるその他の成分としては、フルクトース、グルコース、ロイクロース、及び可溶性オリゴ糖（例えば、ＤＰ２−ＤＰ７）が挙げられる。少なくとも８又は９の重合度（ＤＰ）を有するポリアルファ−１，３−グルカンなどの特定のグルカン生成物は、水に不溶性であり、従って、グルカン合成反応において溶解しないが、溶液外に存在することができることが理解されるであろう。これは、水、スクロース、及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程が実施される反応溶液においてである。本明細書において使用される場合、「適切な反応条件下」という用語は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素活性を介するスクロースのポリアルファ−１，３−グルカンへの変換を支持する反応条件を意味する。
本明細書において使用される場合、「対照」反応溶液は、不完全に精製されたスクロースの代わりに、白色の精製されたスクロースを含む反応溶液を意味することができる。対照反応溶液のすべてのその他の特徴（例えば、スクロース濃度、温度、ｐＨ、ｇｔｆの種類）は、これが比較される反応溶液と同一であり得る。
グルカン合成反応の「パーセント乾燥固体」は、グルカン合成反応におけるすべての糖の重量％を意味する。ｇｔｆ反応のパーセント乾燥固体は、例えば、反応を調製するために使用されるスクロースの量に基づいて算出され得る。
本明細書における反応溶液によるポリアルファ−１，３−グルカンの「収率」は、反応において変換されるスクロース基質の重量のパーセンテージとして表されるポリアルファ−１，３−グルカン生成物の重量を表す。例えば、反応溶液における１００ｇのスクロースが生成物に変換され、生成物の１０ｇがポリアルファ−１，３−グルカンである場合、ポリアルファ−１，３−グルカンの収率は１０％となる。この収率の算出は、ポリアルファ−１，３−グルカンに向いた反応の選択性の尺度として考えられ得る。
本明細書において使用される場合、「相対反応速度」という用語は、別のグルカン合成反応と比較して、特定のグルカン合成反応の速度を意味する。例えば、反応Ａがｘの速度を有し、且つ、反応Ｂがｙの速度を有する場合、反応Ｂの反応速度に対する反応Ａの相対反応速度は、ｘ／ｙ（ｘをｙで割る）として表され得る。「反応速度」及び「反応の速度」という用語は、本明細書において相互に交換して使用され、酵素のユニット当たりのユニット時間当たりの、反応物の濃度／量の変化、或いは生成物の濃度／量の変化を意味する。グルカン合成反応の本明細書における好ましい反応物及び生成物はそれぞれ、スクロース及びポリアルファ−１，３−グルカンである。
本明細書におけるグルカン合成反応の「分画」とは、グルカン合成反応の液体溶液部分を意味する。分画は、グルカン合成反応からの液体溶液の一部又はすべてであり得、反応において合成された固体グルカン生成物から分離されている。或いは、分画は、「母液」と称され得る。分画の例は、グルカン合成反応の濾液である。分画は、スクロース、フルクトース、グルコース、ロイクロース、可溶性オリゴ糖（例えば、ＤＰ２−ＤＰ７）などの溶解された糖を含み得ることから、分画は、グルカン合成反応から誘導される「混合糖溶液」とも称され得る。
「濾液」、「グルカン反応濾液」、「グルカン濾液」等の用語は、本明細書において相互に交換して使用され、グルカン合成反応において合成された固体グルカン生成物から濾過された分画を意味する。
「容量パーセント」、「容量パーセント」、「容量％」、「容量／容量％」等の用語は、本明細書において相互に交換して使用される。溶液における溶質の容量パーセントは、式：［（溶質の容量）／（溶液の容量）］×１００％を用いて決定され得る。
「重量パーセント」、「重量パーセンテージ（重量％）」、「重量−重量パーセンテージ（％重量／重量）」等の用語は、本明細書において相互に交換して使用される。重量パーセントは、組成物、混合物、又は溶液において含まれることから、質量基準に基づく材料のパーセンテージを意味する。
「増加した」、「強化した」、及び「改善した」という用語は、本明細書において相互に交換して使用される。これらの用語は、元の量又は活性よりわずかに大きい量又は活性などのより大きい量又は活性を意味し、或いは元の量又は活性と比較して、大きく過剰な量又は活性を意味し、これらの間のすべての量又は活性を含む。或いは、これらの用語は、例えば、増加した量又は活性が比較される量又は活性より少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％大きい量又は活性を意味することができる。
本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対する「配列相同性」又は「相同性」という用語は、特定された比較ウインドウにわたって最大対応関係で整列される場合に同一である２つの配列における核酸塩基又はアミノ酸残基を意味する。従って、「配列相同性のパーセンテージ」又は「パーセント相同性」は、比較ウインドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定された値を意味し、この場合に、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適な整列において、基準配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含むことができる。パーセンテージは、相同性の核酸塩基又はアミノ酸残基が、両方の配列において存在する位置数を決定し、整合位置数を得て、比較ウインドウにおける総位置数で整合位置数を除算して、この結果に１００を乗算して、配列相同性のパーセンテージを得ることで算出される。
国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトにおいてオンラインで利用可能なＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）アルゴリズムを使用して、例えば、本明細書において開示される２つ以上のポリヌクレオチド配列（ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム）又はポリペプチド配列（ＢＬＡＳＴＰアルゴリズム）間のパーセント相同性を測定することができる。或いは、配列間のパーセント相同性は、Ｃｌｕｓｔａｌアルゴリズム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ又はＣｌｕｓｔａｌＶ）を使用して実施され得る。整列のＣｌｕｓｔａｌ方法を使用する複数の整列においては、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０及びＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応することができる。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用する対整列及びタンパク質配列のパーセント相同性の算出のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５であり得る。核酸の場合、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４であり得る。或いは更に、配列間のパーセント相同性は、ＢＬＯＳＵＭマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）を使用して、ＧＡＰ ＯＰＥＮ＝１０、ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ＝０．５、ＥＮＤ ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝ｆａｌｓｅ、ＥＮＤ ＧＡＰ ＯＰＥＮ＝１０、ＥＮＤ ＧＡＰ ＥＸＴＥＮＤ＝０．５などのパラメーターで、ＥＭＢＯＳＳアルゴリズム（例えば、針（ｎｅｅｄｌｅ））を使用して実施され得る。
様々なポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、特定の実施形態の特徴として、本明細書において開示される。本明細書において開示される配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％又は９０％〜９５％相同性であるこれらの配列の変異形が使用可能である。或いは、変異形アミノ酸配列は、本明細書において開示される配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の相同性を有することができる。変異形ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、開示された配列と同一の機能／活性、或いは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の開示された配列の機能／活性を有する。
特定の実施形態において使用される場合、「単離された」という用語は、その天然原料から完全に分離された任意の細胞成分を意味する（例えば、単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチド分子）。いくつかの場合においては、単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチド分子は、より大きな組成物、緩衝系、又は試薬混合物の一部である。例えば、単離されたポリヌクレオチド又はポリペプチド分子は、非相同的に細胞又は微生物内に含まれることができる。その他の例は、単離されたグルコシルトランスフェラーゼ及び単離されたポリアルファ−１，３−グルカンである。本明細書において開示されるグルコシルトランスフェラーゼ反応プロセスは、合成による非天然的に発生したプロセスであると考えられる。
ポリアルファ−１，３−グルカンの酵素的合成は、白色の精製されたスクロースを使用して事前に実施された。この形態のスクロースは比較的高価であることから、精製されてない又は不完全に精製されたスクロースを使用するポリアルファ−１，３−グルカン合成のための新規な酵素的プロセスを開発することが望ましい。
本開示の実施形態は、少なくとも水と、スクロースと、少なくとも５０％のアルファ−１，３グリコシド結合及び少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液に関し、この場合に、スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製されている（即ち、完全に精製されていない）。反応溶液は、少なくとも５０％のアルファ−１，３グリコシド結合及び少なくとも１００のＤＰｗを有する不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンを生成する。反応溶液によるポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、反応溶液において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも７％である。
重要なことには、この反応溶液の実施形態は、不完全に精製されたスクロースの代わりに、白色の精製されたスクロースを使用して、反応溶液によって生成されたグルカンの収率及び分子量と同等の収率及び分子量を有するポリアルファ−１，３−グルカンを生成する。一般的に、不完全に精製されたスクロースに存在する汚染物質は、ポリアルファ−１，３−グルカンを重合する際にグルコシルトランスフェラーゼによるその使用を妨げないことを、これらの結果は示す。
完全に精製されていないスクロースを、本開示のように反応溶液において使用することができる。こうしたスクロースは、白色の精製されたスクロースに加工されていない。例としては、未加工のスクロース（未加工の糖）を含む精製されていないスクロース組成物が挙げられる。本明細書における有用である不完全に精製されたスクロースのその他の形態としては、例えば、サトウキビ（サトウキビ（Ｓ．ｏｆｆｉｃｅｎａｒｕｍ）などのサトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）の種）、甜菜（テンサイ（Ｂ．ｖｕｌｇａｒｉｓ）などのフダンソウ属（Ｂｅｔａ）の種）（或いは「ビート」と本明細書において称され得る）、ナツメヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ）、モロコシ（Ｓ．ｖｕｌｇａｒｅ及びモロコシ（Ｓ．ｂｉｃｏｌｏｒ）などのモロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）の種）、サトウカエデ（Ａｃｅｒ ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、又はトウモロコシに由来するスクロースの形態が挙げられる。不完全に精製された形態のサトウキビ及び／又は甜菜スクロースは、本明細書における好ましい実施形態に使用され得る。サトウキビは、その液に約２０％のスクロースを含み、一方、甜菜はその液に約１０〜１５％のスクロースを含む。
特定の実施形態における不完全に精製されたスクロースは、スクロースを生成し、任意選択的に、スクロース生成用に栽培される植物から得ることができる。前述で列挙されたものなどのこうした植物は、植物が典型的に栽培される世界のいかなる地域からも得ることができる。例えば、本明細書におけるスクロースは、南アメリカ（例えば、ブラジル、コロンビア、アルゼンチン、ガイアナ）、北アメリカ（例えば、米国、メキシコ、西インド諸島、中央アメリカ［例えば、ベリーズ］）、オーストラリア、アジア（例えば、インド、中国、ロシア、トルコ、タイ、パキスタン、フィリピン、インドネシア）、アフリカ（例えば、エジプト、モザンビーク、ジンバブエ）及びヨーロッパ（例えば、フランス、ドイツ、ウクライナ、ロシア、トルコ）で栽培される植物から得ることができる。
不完全に精製されたスクロースは、スクロースを含む植物（例えば、サトウキビ又は甜菜）の液からのスクロース純化のプロセスの任意の段階で得られた組成物としてもたらされ得る。こうしたプロセスは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｕｇａｒ Ｒｅｆｉｎｉｎｇ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｇａｒ Ｒｅｆｉｎｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓ（Ｅｄ．Ｃ．Ｃ．Ｃｈｏｕ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２０００）、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｃｈｏｕ（Ｃａｎｅ Ｓｕｇａｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ Ｃａｎｅ Ｓｕｇａｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ，１２ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９３）、及びＡｓａｄｉ（Ｂｅｅｔ−Ｓｕｇａｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２００６）に開示されている。これらの参照からのいくつかの好ましい組成物及びプロセスは、以下の通りに述べられる。
本明細書における不完全に精製されたスクロースは、（ｉ）植物材料からの「未加工の液」の最初の抽出（例えば、熱水抽出）、（ｉｉ）炭酸化による液純化（即ち、石灰と二酸化炭素を使用して、不純物を共沈殿させる炭酸カルシウム沈殿物を形成すること）で、「薄液」を生成する工程、（ｉｉｉ）薄液から水を蒸発させて、「濃液」を生成する工程、及び／又は（ｉｖ）濃液を煮沸又は真空濃縮してスクロースを結晶化させる工程（典型的には、こうした一度結晶化されたスクロースは、白色の精製された糖ではない）（結晶は、例えば、遠心によって上澄みから除去され得る）などの、スクロース−純化プロセスの任意の工程から得られる組成物としてもたらされ得る。例えば、工程（ｉ）及び（ｉｉ）の生成物は、更なる処理の前に、特定の実施形態において濾過され得る。結晶化（ｉｖ）の上澄みは、再利用され、その他の上澄み及び／又は濃液と混合され得、次いで、これを結晶化に供する（本明細書においても使用可能な工程［ｉｖ］のように結晶を生成する）。最終的に、上澄みを再利用することは、「糖液」をもたらす。従って、例えば、不完全に精製されたスクロースは、未加工の液、薄液、濃液、糖液、及び／又は１つ以下の結晶化を経たスクロース結晶としてもたらされ得る。不完全に精製されたスクロースのこれらの形態、及びこれらを得るために用いるそれぞれのプロセス工程は、好ましくは、甜菜から得られる不完全に精製されたスクロースの例を特徴づけるが、サトウキビなどのその他のスクロースから得られるスクロースも特徴づけることができる。
本明細書における有用である甜菜から得られる不完全に精製されたスクロースの例としては、ビートの未加工の液、ビートの薄液（約１０〜２０重量％のスクロースを含む）、ビートの濃液（約６０〜９０重量％のスクロースを含む）、及び甜菜の糖液（約５０〜６０重量％のスクロース）が挙げられる。ビートの薄液及び／又は濃液が、特定の実施形態において使用される。例えば、本明細書におけるＩＣＵＭＳＡ値は、ビートの薄液については少なくとも１０００（例えば、約１０００〜１３００）、ビートの濃液については少なくとも１３００（例えば、約１３００〜１８００）、及び／又はビートの糖液については少なくとも５００００（例えば、約５００００〜６００００）であり得る。
或いは、本明細書における不完全に精製されたスクロースは、「未加工のスクロース」（「未加工の糖」）であり得、これは、未加工の液からすべての水を除去することによってもたらされる（即ち、未加工のスクロースは個体である）。或いは更に、本明細書における不完全に精製されたスクロースは、「ＶＨＰスクロース」、「ＶＨＰ」、「ＶＨＰ糖」、「超高分極（ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）」スクロース）であり得、これは、最初に未加工の液を炭酸化し濾過し、その後、未加工の液を蒸発させて、その中の一部のスクロースを結晶化させることによってもたらされ、上澄みから除去された結晶化したスクロースは、ＶＨＰスクロースである。ＶＨＰスクロースは、このように１つの結晶化を経た。或いは更に、本明細書における不完全に精製されたスクロースは、「ＶＶＨＰスクロース」、「ＶＶＨＰ」、「ＶＶＨＰ糖」、「超超高分極（ｖｅｒｙ ｖｅｒｙ ｈｉｇｈ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）」スクロース）であり得、これは、ＶＨＰスクロースを水に溶解し、スクロースを再結晶させることによってもたらされる。ＶＶＨＰスクロースは、このように２つの結晶化を経た。不完全に精製されたスクロース（未加工のスクロース、ＶＨＰ、ＶＶＨＰ）のこれらの形態、及びこれらを得るために用いるそれぞれのプロセス工程は、好ましくは、サトウキビから得られた不完全に精製されたスクロースの例を特徴づけるが、甜菜などのその他の原料から得られるスクロースも特徴づけることができる。
本明細書における未加工のスクロース（例えば、「未加工のサトウキビ」）は、９４％〜９７％の分極値、約６００〜１２００のＩＣＵＭＳＡ値、及び／又は８７．０（例えば、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、又は５０未満）未満のＬ＊値を有することができる。未加工のスクロースは、糖液シロップを白色の精製された糖と混合し、その後、乾燥することによって得られた生成物である「黒砂糖」ではないことを理解すべきである。例えば、本明細書におけるＶＨＰスクロースは、少なくとも９９．３０％の分極値、及び／又は約３００〜１０００のＩＣＵＭＳＡ値を有することができる。任意選択的に、ＶＨＰスクロースは、以下の特徴のいずれかを有することができる：０．１５％の最大水分含有量、０．１５％の最大灰分含有量、９７％の水への溶解度、及び／又は琥珀色。例えば、本明細書におけるＶＶＨＰスクロースは、少なくとも９９．５０％の分極値、及び／又は１５０〜約４００を超えるＩＣＵＭＳＡ値を有することができる。
本明細書における不完全に精製されたスクロースは、白色の精製されたスクロースではない。本明細書における白色の精製されたスクロースは、少なくとも９９．０重量％のスクロース（例えば、少なくとも９９．５重量％又は９９．９重量％）を含むスクロースを意味する。更に、又はこの代わりに、白色の精製されたスクロースは、１５０以下（例えば、４５以下）のＩＣＵＭＳＡ値、９９．７０％（例えば、少なくとも９９．８０％）の最小分極、及び／又は少なくとも８７．０（例えば、少なくとも８７．５、８８．０、又は８８．５）のＬ＊値を有するスクロースを意味することができる。特定の実施形態における白色の精製されたスクロースは、以下の特徴のいずれかも有することができる：０．０４％の最大水分含有量、０．０４％の最大灰分含有量、１００％の水への溶解度、光沢のある白色、及び／又は微細な顆粒。
特定の実施形態においては、不完全に精製されたスクロースは、結晶化されていない。例えば、ビートの未加工の液、ビートの薄液、及びビートの濃液を含む、不完全に精製されたスクロース、得られた甜菜を挙げることができる。或いは、本明細書における不完全に精製されたスクロースは、１つ以下、２つ以下、３つ以下、又はより多くの結晶化工程を有した。例えば、２つ又は３つ以下の結晶化を有したサトウキビから得られた不完全に精製されたスクロースが、使用可能である。或いは更に、１つ、２つ、３つ、又はより多くの結晶化を経た場合、不完全に精製されたスクロースが使用可能であるが、１５０を超えるＩＣＵＭＳＡを有する。結晶化工程は、例えば、少なくとも、溶解されたスクロースが、結晶として溶液から出始める点まで、スクロースを含む水溶液を沸騰させる工程、及び／又は真空乾燥させる工程を含むことができる。
例えば、本明細書における不完全に精製されたスクロースのＩＣＵＭＳＡ値は、１５０超であり得る。或いは、例えば、不完全に精製されたスクロースは、少なくとも約２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、２０００、２５００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、又は６００００（或いは１５１〜６００００の任意の整数値）のＩＣＵＭＳＡ値を有することができる。不完全に精製されたスクロースがビートの薄液である場合など、特定の実施形態におけるＩＣＵＭＳＡは、約１０００〜１３００の範囲であり得る。本明細書におけるその他の実施形態のＩＣＵＭＳＡは、不完全に精製されたスクロースがビートの濃液である場合など、約１３００〜１８００、或いは不完全に精製されたスクロースがビートの糖液である場合など、約５００００〜６００００の範囲であり得る。更にその他の実施形態においては、ＩＣＵＭＳＡは、不完全に精製されたスクロースが未加工のスクロースである場合など、約６００〜１２００、不完全に精製されたスクロースがＶＨＰスクロースである場合など、約３００〜１０００、或いは不完全に精製されたスクロースがＶＶＨＰスクロースである場合など、１５０〜約４００超の範囲であり得る。
本明細書におけるスクロース組成物のＩＣＵＭＳＡ値（「改変ＩＣＵＭＳＡ」）は、その他のＩＣＵＭＳＡ法を使用して組成物について測定されるＩＣＵＭＳＡ値と同一であるか、又は非常に類似していると考えられる。
本明細書における反応溶液は、少なくとも不完全に精製されたスクロースと、水と、活性グルコシルトランスフェラーゼ酵素と、任意選択的にその他の成分とを含む溶液を意味する。グルカン合成反応において存在することができるその他の成分としては、例えば、フルクトース、グルコース、ロイクロース、可溶性オリゴ糖（例えば、ＤＰ２−ＤＰ７）が挙げられる。少なくとも８又は９のＤＰを有するポリアルファ−１，３−グルカンなどの、特定のグルカン生成物は、水に不溶性であり得、従って、グルカン合成反応において溶解されないが、溶液外に存在することができることが理解されるであろう。本明細書における反応溶液は、不溶性のグルカン生成物を生成することに加えて、ロイクロース及び／又は可溶性オリゴ糖などの副生成物を生成するものであり得る。
本明細書において開示される反応溶液は、少なくとも５０％のアルファ−１，３グリコシド結合及び少なくとも１００のＤＰｗを有するポリアルファ−１，３−グルカンを生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む。本明細書における有用であるこうしたグルコシルトランスフェラーゼ酵素の例は、米国特許第７００００００号明細書、並びに米国特許出願公開第２０１３／０２４４２８８号明細書及び米国特許出願公開第２０１３／０２４４２８７号明細書に開示されている（そのすべては参照により本明細書に組み込まれる）。ポリアルファ−１，３−グルカンを生成するための本明細書における反応溶液において使用可能なグルコシルトランスフェラーゼの更にその他の例は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／００８７４３１号明細書（米国特許出願第１４／０３６，０４９号明細書）に開示されている。例えば、本明細書におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、（ｉ）配列番号４、８、１０、１２、１４、２０、２６、２８、３０、又は３４と、１００％相同性であるか、或いは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相同性であるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなることができ、且つ、（ｉｉ）グルコシルトランスフェラーゼ活性を有することができる。
特定のその他の実施形態における反応溶液は、（ｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４と１００％相同性であるか、或いは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相同性であるアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、且つ、（ｉｉ）グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、グルコシルトランスフェラーゼ酵素を含む。
本明細書におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、細菌又は菌などの任意の菌原料に由来することができる。細菌のグルコシルトランスフェラーゼ酵素の例は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の種、又はラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種に由来するものである。ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の種の例としては、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｓ．ソブリヌス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、Ｓ．デンティロセッチ（Ｓ．ｄｅｎｔｉｒｏｕｓｅｔｔｉ）、Ｓ．ダウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｉ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．ガロリティカス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、及びＳ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）が挙げられる。ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の種の例としては、Ｌ．メセントロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｌ．アメリビオスム（Ｌ．ａｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍ）、Ｌ．アルゲンティナム（Ｌ．ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ）、Ｌ．カーノサム（Ｌ．ｃａｒｎｏｓｕｍ）、Ｌ．シトレウム（Ｌ．ｃｉｔｒｅｕｍ）、Ｌ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｌ．デキストラニカム（Ｌ．ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）、及びＬ．フルクトーサム（Ｌ．ｆｒｕｃｔｏｓｕｍ）が挙げられる。ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種の例としては、Ｌ．アシドフィラス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．デルブレッキ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．カルバータス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．サケイ（Ｌ．ｓａｋｅｉ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ．ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、及びＬ．ロイテリー（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）が挙げられる。
本明細書におけるいくつかの態様でのグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、不完全に精製されたスクロースが用いられるグルカン合成反応における少なくとも５０％のアルファ−１，３グリコシド結合を有するポリアルファ−１，３−グルカンを生成する。特定の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又は６０％〜１００％の任意の整数）の構成要素であるグリコシド結合がアルファ−１，３−結合である、ポリアルファ−１，３−グルカンを合成すると考えられる。従って、前述の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満、又は０％（或いは０％〜５０％の任意の整数値）の、アルファ−１，３でないグリコシド結合が存在する、ポリアルファ−１，３−グルカンを合成する。
本明細書におけるその他の態様においては、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、分岐点のない或いはポリマーにおけるグリコシド結合のパーセントとして、約１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％未満の分岐点を有するポリアルファ−１，３−グルカンを合成することができる。分岐点の例としては、ムタンポリマーに存在するものなどのアルファ−１，６分岐点が挙げられる。
本明細書におけるいくつかの態様でのグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも約１００のＤＰｎ又はＤＰｗの分子量を有するポリアルファ−１，３−グルカンを合成することができる。或いは、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも約４００のＤＰｎ又はＤＰｗの分子量を有するポリアルファ−１，３−グルカンを合成することができる。或いは更に、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、又は１０００（又は１００〜１０００の任意の整数）のＤＰｎ又はＤＰｗの分子量を有するポリアルファ−１，３−グルカンを合成することができる。
１つ以上の異なるグルコシルトランスフェラーゼ酵素が、特定の態様において使用され得る。特定の実施形態におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、デキストラン分解酵素、ロイテランスクラーゼ（ｒｅｕｔｅｒａｎｓｕｃｒａｓｅ）、又はアルテルナンスクラーゼ（ａｌｔｅｒｎａｎｓｕｃｒａｓｅ）の活性を有しないか、又はほとんど有しない（１％未満）。例えば、本明細書における反応溶液は、１つ、２つ、又はより多くのグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含むことができる。
本明細書におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、プライマーから独立していることができるか、又はプライマーに依存していることができる。プライマーから独立しているグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、グルカン合成を実施するためにプライマーの存在を必要としない。プライマーに依存しているグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、グルカンポリマー合成の間、酵素のためのプライマーとして作用するための反応溶液における開始分子の存在を必要とする。本明細書において使用される場合、「プライマー」という用語は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素のための開始剤として作用できる任意の分子を意味する。特定の実施形態において使用可能なプライマーとしては、例えば、加水分解グルカンなどの、デキストラン及びその他の炭水化物系プライマーが挙げられる。例えば、プライマーとして使用されるデキストランは、デキストランＴ１０（即ち、１０ｋＤの分子量を有するデキストラン）であり得る。
本明細書におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素の例は、本明細書において開示され、且つ、Ｎ末端及び／又はＣ末端における１〜３００（或いは［例えば、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０］の間の任意の整数）の残基を更に含む、アミノ酸配列のいずれかであり得る。例えば、こうした更なる残基は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素が由来する、対応する野生型配列から得ることができるか、或いはエピトープ標識（Ｎ末端若しくはＣ末端で）又は非相同性のシグナルペプチド（Ｎ末端で）などの非相同性の配列であり得る。
典型的には、本明細書におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、Ｎ末端シグナルペプチドを欠失している。本明細書におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素を生成するための発現系は、必要に応じて、細胞外の分泌を導くためにＮ末端シグナルペプチドをコード化する配列を更に含む酵素−コード化ポリヌクレオチドを使用することができる。こうした実施形態におけるシグナルペプチドは、分泌プロセスの間、酵素から開裂される。シグナルペプチドは、グルコシルトランスフェラーゼに固有であり得るか、或いは非相同性であり得る。本明細書における有用なシグナルペプチドの例としては、細菌種（例えば、Ｂ．サブティルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種）又は菌種から得られるものである。細菌性シグナルペプチドの例は、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｂ．サブティルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｏｇｔｅｎｔａｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．５５：４０−５２を参照されたい）から得られるものなどのａｐｒＥシグナルペプチドである。
本明細書において開示されるいくつかのグルコシルトランスフェラーゼ酵素配列は、Ｎ末端シグナルペプチド（並びに可変ドメイン）を欠失している（表１を参照されたい）。Ｎ末端開始メチオニン（アミノ酸位置１）は、細胞内発現の目的のためにそれぞれの配列に加えられた（例えば、発現された酵素は、細胞溶解物において得ることができる）。エピトープ及び／又はシグナルペプチドなどの介在性の非相同性アミノ酸配列が、開始メチオニンとグルコシルトランスフェラーゼ配列の間に任意選択的に加えられ得ることを、当業者は理解するであろう。従って、例えば、本明細書におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、（ｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、５９、６０、６１、６２、６３、又は６４の位置２において開始するアミノ酸配列と１００％相同性であるか、或いは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％相同性であり、且つ、（ｉｉ）グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する、アミノ酸配列を含むか、又はこれからなることができる。
本明細書におけるグルカン合成反応のためのグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、当技術分野において周知の任意の手段によって生成され得る。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、菌の非相同性発現系などの非相同性発現系において、組み換え技術によって生成され得る。非相同性発現系の例としては、細菌（例えば、ＴＯＰ１０又はＭＧ１６５５などの大腸菌、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の種）の、且つ、真核生物（例えば、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）の種及びサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の種などの酵母）の発現系が挙げられる。
特定の実施形態においては、非相同性の遺伝子発現系は、タンパク質分泌のために設計されるものであり得る。グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、こうした実施形態におけるシグナルペプチド（シグナル配列）を含む。シグナルペプチドは、その固有のシグナルペプチド又は非相同性のシグナルペプチドであり得る。
本明細書において記載されるグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、任意の純化状態（例えば、純化性又は非純化性）において使用され得る。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、その使用の前に、純化及び／又は単離され得る。非純化性であるグルコシルトランスフェラーゼ酵素の例としては、細胞溶解物の形態のものが挙げられる。細胞溶解物又は抽出物は、非相同的に酵素を発現するために用いられる細菌（例えば、大腸菌）から調製され得る。例えば、細菌は、フレンチ圧力セル（Ｆｒｅｎｃｈ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）を使用して破砕され得る。代替の実施形態においては、細菌は、ホモジナイザー（例えば、ＡＰＶ、Ｒａｎｎｉｅ、Ｇａｕｌｉｎ）によって均質化され得る。典型的には、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、これらの種類の製剤に溶解する。本明細書における細菌細胞溶解物、抽出物、又はホモジネートが、ポリアルファ−１，３−グルカンをスクロースから生成するために反応溶液において約０．１５〜０．３％（容量／容量）で使用され得る。
本明細書におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素の活性は、当技術分野において周知の任意の方法を使用して決定され得る。例えば、グルコシルトランスフェラーゼ酵素活性は、溶液が２２〜２５℃で２４〜３０時間にわたり保持される、スクロース（５０ｇ／Ｌ）、デキストランＴ１０（１ｍｇ／ｍＬ）、及びリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５、５０ｍＭ）を含む反応溶液において、還元糖（フルクトース及びグルコース）の生成を測定することによって決定され得る。還元糖は、１Ｎの水酸化ナトリウム及び０．１％の塩化トリフェニルテトラゾリウムを含む混合物に０．０１ｍＬの反応溶液を加え、次いで、５分間、ＯＤ４８０ｎｍで吸光度の増加をモニターすることによって測定され得る。
必要に応じて、本明細書における反応溶液の温度が制御され得る。特定の実施形態においては、反応の温度は、約５℃〜約５０℃である。特定のその他の実施形態における温度は、約２０℃〜約４０℃、又は約２０℃〜約３０℃（例えば、約２５℃）である。
例えば、本明細書における反応溶液のスクロースの初期濃度は、約２０ｇ／Ｌ〜約４００ｇ／Ｌであり得る。或いは、スクロースの初期濃度は、約７５ｇ／Ｌ〜約１７５ｇ／Ｌ、又は約５０ｇ／Ｌ〜約１５０ｇ／Ｌであり得る。或いは更に、スクロースの初期濃度は、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、又は１６０ｇ／Ｌ（或いは４０〜１６０ｇ／Ｌの任意の整数値）であり得る。「スクロースの初期濃度」は、すべての反応溶液成分が加えられた（少なくとも水、不完全に精製されたスクロース、ｇｔｆ酵素）直後の、ｇｔｆ反応溶液におけるスクロース濃度を意味する。すべての、又は一部の、反応溶液におけるスクロースは、溶液に加えられた不完全に精製されたスクロースから得ることができる。すべてのスクロースが不完全に精製されることが好ましいが、白色の精製されたスクロースは、反応溶液において更に使用され得る。
液体形態（例えば、ビートの薄液、ビートの濃液、糖液）で存在する特定の不完全に精製されたスクロース組成物とともに、こうした組成物は、状況に応じて、反応溶液に加えられて、特定の反応容量におけるスクロースの特定の初期濃度を実現することが理解されるであろう。例えば、甜菜（例えば、ビートの薄液、ビートの濃液、糖液）から得られた不完全に精製されたスクロース組成物は、反応の初期のスクロース濃度が約７０〜９０ｇ／Ｌ又は８０〜８５ｇ／Ｌである反応溶液に希釈され得る。
特定の実施形態におけるグルカン合成反応のｐＨは、約４．０〜約８．０であり得る。或いは、ｐＨは、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、又は８．０であり得る。ｐＨは、これらに限定されるものではないが、リン酸、トリス、クエン酸、又はそれらの組み合わせを含む、適切な緩衝液を加える又は組み込むことによって調整又は制御され得る。例えば、グルカン合成反応における緩衝液濃度は、０ｍＭ〜約１００ｍＭ、或いは約１０、２０、又は５０ｍＭであり得る。ＤＴＴ（ジチオスレイトール、例えば、約１．０ｍＭ）の適切な量を任意選択的に反応溶液に加えることができる。
本明細書における反応溶液は、本明細書において開示される１つ以上の反応条件を適用することに適した任意の容器内に含まれることができる。例えば、本明細書における反応溶液は、特定の反応を含むことに適したサイズの、ステンレス鋼、プラスチック、或いはガラスの容器又は入れ物であり得る。こうした容器は、任意選択的に撹拌装置を備えることができる。
本明細書において反応溶液を実行することに適したその他の条件及び成分の例は、米国特許第７００００００号明細書、並びに米国特許出願公開第２０１３／０２４４２８８号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０２４４２８７号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０１９６３８４号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０１５７３１６号明細書、及び米国特許出願公開第２０１４／００８７４３１号明細書に開示されており、そのすべては参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の反応溶液によるポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、反応溶液において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも７％である。或いは、ポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、少なくとも約８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、又は４７％であり得る。特定の実施形態においては、本明細書における反応溶液のポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、白色の精製されたスクロースが不完全に精製されたスクロースの代わりに用いられる、対照反応溶液によるポリアルファ−１，３−グルカンの収率とほぼ同一である。例えば、すべての前述の収率は、約２０〜３０℃（例えば、２５℃）の温度に維持される反応溶液を使用して、且つ／又は配列番号８を含むｇｔｆを使用して得ることができる。特定のこれらの実施形態は、不完全に精製されたスクロースとして、濃いビート液又は薄いビート液を使用することができる。
特定の実施形態においては、反応溶液の相対反応速度は、水と、白色の精製されたスクロースと、グルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液の反応速度に対して少なくとも約０．８である。例えば、反応溶液の相対反応速度は、対照反応（即ち、本明細書における反応溶液の反応速度は、対照反応の速度の少なくとも８０％である）に対して少なくとも約０．８である。或いは、例えば、本明細書における相対反応速度は、少なくとも約０．８２、０．８４、０．８６、０．８８、０．９０、０．９２、０．９４、０．９６、０．９８、１．００、１．０２、又は１．０４であり得る。反応溶液の反応速度は、活性グルコシルトランスフェラーゼ酵素のユニット濃度当たりのユニット時間当たりの、反応物（例えば、スクロース）の濃度／量の変化、及び／又は生成物（例えば、ポリアルファ−１，３−グルカン）の濃度／量の変化という用語で表され得る。
例えば、本明細書における反応溶液は、９３未満のＬ＊値を有するポリアルファ−１，３−グルカンを生成することができる。或いは、本明細書における反応溶液によって生成されるポリアルファ−１，３−グルカンのＬ＊値は、９２、９０、８８、８６、８４、８２、８０、７８、７６、７４、７２、７０、６８、６６、６４、６２、又は６０未満であり得る。本明細書におけるポリアルファ−１，３−グルカン生成物のＬ＊値の範囲の例は、約８２〜８７（例えば、ビートの薄液又はビートの濃液が反応溶液において使用される場合）、或いは８０〜８２（例えば、ＶＨＰスクロースが反応溶液において使用される場合）であり得る。Ｌ＊値は、例えば、反応溶液から除去され、２回の置換洗浄（例えば、反応容量が２Ｌである場合、少なくとも１回、１Ｌの水で洗浄）において少なくとも２分の１の反応容量で洗浄され、次いで乾燥され、粉砕され６０−メッシュの篩を通して篩にかけられた、ポリアルファ−１，３−グルカンについて決定され得る。乾燥は、ポリアルファ−１，３−グルカンを変色させない温度で実施されなければならない。従って、ポリアルファ−１，３−グルカンの任意の色は、不完全に精製されたスクロースに由来しなければならない。
本明細書における反応溶液は、少なくとも５０％のアルファ−１，３グリコシド結合を有するポリアルファ−１，３−グルカンを生成する。特定の実施形態においては、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（或いは６０％〜１００％の任意の整数）の構成要素であるグリコシド結合がアルファ−１，３結合である、ポリアルファ−１，３−グルカンが生成すると考えられる。従って、前述の実施形態において生成されたポリアルファ−１，３−グルカンは、約５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％未満の、又は０％（或いは０％〜５０％の任意の整数値）のアルファ−１，３でないグリコシド結合を有する。
本明細書におけるポリアルファ−１，３−グルカン生成物のグリコシド結合のプロファイルは、当技術分野において周知の任意の方法を使用して決定され得る。例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（例えば、１３ＣＮＭＲ又は１ＨＮＭＲ）を使用する方法を使用して、結合プロファイルが決定され得る。使用可能なこれらの及びその他の方法は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｏｏｄ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｅｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ３，Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ Ｇｒｏｕｐ ＬＬＣ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００５）に開示されている。
本明細書における反応溶液は、少なくとも約１００のＤＰｎ又はＤＰｗの分子量を有するポリアルファ−１，３−グルカンを生成する。或いは、本明細書における反応溶液において生成されるポリアルファ−１，３−グルカンは、少なくとも約４００のＤＰｎ又はＤＰｗの分子量を有することができる。或いは更に、ポリアルファ−１，３−グルカンは、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、又は１０００（或いは１００〜１０００の任意の整数）のＤＰｎ又はＤＰｗの分子量を有することができる。
本明細書におけるポリアルファ−１，３−グルカンの分子量は、当技術分野において周知のいくつかの手段のいずれかを使用して測定され得る。例えば、グルカンポリマー分子量は、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、又はゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用して測定され得る。
本開示は、少なくとも水、スクロース、及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程を含むポリアルファ−１，３−グルカンを生成するための方法にも関し、この場合に、スクロースは精製されていないか、又は部分的に精製されている（即ち、完全に精製されていない）。任意選択的に単離され得るこの方法において生成されるポリアルファ−１，３−グルカンは、少なくとも５０％のアルファ−１，３−グリコシド結合及び少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する。更に、この方法において生成されるポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、水及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素と接触されることによって生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも７％である。前述で及び実施例で開示されるように、本明細書における反応溶液の特徴のいずれかは、この方法を特徴づけることができる。この方法の以下の特徴は、代表的な例である。
この方法の特定の実施形態における不完全に精製されたスクロースは、甜菜（例えば、ビートの薄液又はビートの濃液）から得ることができ、且つ、結晶化されていない。別の例においては、不完全に精製されたスクロースは、サトウキビ（例えば、未加工のスクロース、ＶＨＰ又はＶＶＨＰスクロース）から得られ、且つ、２つ以下又は３つ以下の結晶化工程を有する。
例えば、開示された方法で使用される不完全に精製されたスクロースは、１５０を超えるＩＣＵＭＳＡ値を有することができる。
この方法の特定の実施形態において生成されるポリアルファ−１，３−グルカンは、９３未満のＬ＊値を有する。本明細書におけるＬ＊値は、例えば、反応溶液から除去され、任意選択的に、水で１回、２回、又はより多くの回数にわたり洗浄され、乾燥されたポリアルファ−１，３−グルカンに対して決定され得る。
この方法の接触工程におけるポリアルファ−１，３−グルカンを生成する相対反応速度は、白色の精製されたスクロースが、不完全に精製されたスクロースの代わりに使用される場合、反応速度に対して少なくとも０．８である。
開示された方法は、少なくとも水、不完全に精製されたスクロース、及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程を含む。この接触工程は、水と、不完全に精製されたスクロースと、グルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液を与える工程を含むことができる。グルコシルトランスフェラーゼ酵素が、ポリアルファ−１，３−グルカンを合成することから、反応の曇りによって示されるように、不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンが溶液から出てくると想定すれば、反応溶液が反応混合物になることが理解されよう。開示された方法の接触工程は、任意の数の方法で実施され得る。例えば、所望の量の不完全に精製されたスクロースは、初めに水に溶解又は混合されることができ（任意選択的に、緩衝成分などの、その他の成分が、この段階の調製で加えられることもできる）、その後、グルコシルトランスフェラーゼ酵素が加えられる。例えば、溶液は、静的に保持されるか、或いは撹拌又は軌道振動（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｉｎｇ）を介してかき混ぜられ得る。典型的には、反応は、無細胞系であり得る。
特定の実施形態における反応の完了は、視覚的に（不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンのこれ以上の蓄積はなく）及び／又は溶液に残ったスクロース（残留スクロース）の量を測定することによって決定され得、この場合に、約９０％を超えるパーセントスクロース消費で反応完了を示すことができる。典型的には、開示されたプロセスの反応は、反応において使用されるスクロース及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素の量などの特定のパラメーターによって、約１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、又は９６時間費やして完了することになる。
開示された方法の特定の実施形態における反応のパーセントスクロース消費は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の、水とグルコシルトランスフェラーゼ酵素にと当初接触されたスクロースである。或いは、パーセントスクロース消費は、９０％超又は９５％超であり得る。
本明細書におけるグルカン合成法のいくつかの態様において生成されるポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、反応において変換されたスクロースの重量に基づいて、少なくとも約７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、又は４７％であり得る。
開示された方法で生成されるポリアルファ−１，３−グルカンは、任意選択的に単離され得る。例えば、不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンは、遠心分離又は濾過によって分離され得る。この際、ポリアルファ−１，３−グルカンは、水と、フルクトースと、特定の副生成物（例えば、ロイクロース、可溶性オリゴ糖ＤＰ２−ＤＰ７）とを含むことができる、ほとんどの反応溶液から分離される。この溶液は、残留スクロースと、グルコースモノマーとを含むこともできる。単離は、水でポリアルファ−１，３−グルカンを１回、２回、又はより多くの回数にわたり洗浄する工程、及び／又はポリアルファ−１，３−グルカンを乾燥させる工程を任意選択的に更に含むことができる。
本開示は、本明細書において開示される反応溶液又は方法によって生成されるポリアルファ−１，３−グルカンにも関する。このポリアルファ−１，３−グルカンは、９３未満であるＬ＊値を有する。前述で及び実施例で開示されるように、ポリアルファ−１，３−グルカンの特徴のいずれかは、この実施形態のポリアルファ−１，３−グルカンを特徴づけることができる。以下の特徴は、代表的な例である。
例えば、本明細書におけるポリアルファ−１，３−グルカン生成物は、単離され得、乾燥形態において更にもたらされ得る。特定の実施形態においては、ポリアルファ−１，３−グルカン生成物は、少なくとも１グラム（例えば、少なくとも１００ｇ又は５００ｇ）の単離された乾燥した量においてもたらされる。例えば、「乾燥した」ポリアルファ−１，３−グルカンは、２．０、１．５、１．０、０．５、０．２５、０．１０、０．０５、又は０．０１重量％以下の水を含む。
特定の実施形態におけるポリアルファ−１，３−グルカン生成物は、１つ以上の以下の化合物：キャラメル、メラノイジン、ヘキソースアルカリ分解生成物（ＨＡＤＰ）（アルカリ条件の下で形成された重合性Ｃ６糖縮合生成物）、ポリフェノール−鉄錯体（例えば、鉄カテコール錯体）、メラニンを含むことができると考えられる。仮にある場合、白色の精製されたスクロースのみが使用される反応溶液によって与えられたポリアルファ−１，３−グルカン生成物の呈色と比較して、１つ以上のこれらの化合物は、より濃い呈色をポリアルファ−１，３−グルカン生成物に与えると更に考えられる。例えば、こうした呈色の違いは、Ｌ＊値を使用して決定され得る。
本明細書において開示される組成物及び方法の非限定的な例としては、以下が挙げられる。
１．水と、スクロースと、少なくとも５０％のアルファ−１，３グリコシド結合及び少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液であって、スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製され、反応溶液によるポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、反応溶液において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも７％である、反応溶液。
２．スクロースは甜菜に由来し、且つ、結晶化されていない、実施形態１の反応溶液。
３．スクロースはサトウキビに由来し、且つ、（ｉ）結晶化されていないか、又は（ｉｉ）３つ以下の結晶化工程を使用して結晶化されている、実施形態１の反応溶液。
４．スクロースは、１５０を超えるＩＣＵＭＳＡ値を有する、実施形態１、３、又は３の反応溶液。
５．反応溶液の相対反応速度は、水と、白色の精製されたスクロースと、グルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液の反応速度に対して少なくとも０．８である、実施形態１、２、３、又は４の反応溶液。
６．反応溶液によって生成されたポリアルファ−１，３−グルカンは、９３未満のＬ＊値を有する、実施形態１、２、３、４、又は５の反応溶液。
７．グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、又は配列番号３４と少なくとも９０％相同性であるアミノ酸配列を含む、実施形態１、２、３、４、５、又は６の反応溶液。
８．（ａ）少なくとも水、スクロース、及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製され、これにより、少なくとも５０％のアルファ−１，３グリコシド結合及び少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有するポリアルファ−１，３−グルカンが生成される、工程と、
ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成されたポリアルファ−１，３−グルカンを単離する工程と
を含む、不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンを生成する方法であって、ポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、工程（ａ）において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも７％である、方法。
９．スクロースは甜菜に由来し、且つ、結晶化されていない、実施形態８の方法。
１０．スクロースはサトウキビに由来し、且つ、（ｉ）結晶化されていないか、又は（ｉｉ）３つ以下の結晶化工程を使用して結晶化されている、実施形態８の方法。
１１．スクロースは、１５０を超えるＩＣＵＭＳＡ値を有する、実施形態８、９、又は１０の方法。
１２．工程（ａ）でポリアルファ−１，３−グルカンを生成する相対反応速度は、白色の精製されたスクロースが、精製されていないか、又は部分的に精製されたスクロースの代わりに使用される場合、工程（ａ）の反応速度に対して少なくとも０．８である、実施形態８、９、１０、又は１１の方法。
１３．工程（ｂ）で単離されたポリアルファ−１，３−グルカンは、９３未満のＬ＊値を有する、実施形態８、９、１０、１１、又は１２の方法。
１４．グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、又は配列番号３４と少なくとも９０％相同性であるアミノ酸配列を含む、実施形態８、９、１０、１１、１２、又は１３の方法。
１５．ポリアルファ−１，３−グルカンは、９３未満のＬ＊値を有する、請求項８、９、１０、１１、１２、１３、又は１４に記載の方法によって生成される単離されたポリアルファ−１，３−グルカン。
本開示は、以下に与えられた実施例２〜１２において、更に例示される。本明細書における特定の好ましい態様を示すとともに、これらの実施例は、単に例示的なものであることを理解すべきである。前述の説明及びこれらの実施例から、当業者であれば、開示された実施形態の本質的な特徴を確認することができ、それらの本質及び範囲から逸脱することなく様々な変更形態及び改変形態をなし、開示された実施形態を様々な使用及び条件に適合させることができる。
一般方法
スクロースＩＣＵＭＳＡ測定
ＩＣＵＭＳＡ測定は、参照により本明細書に組み込まれる、以下のＩＣＵＭＳＡ Ｍｅｔｈｏｄ ＧＳ１／３−７（Ｒ．Ｊ．ＭｃＣｏｗａｇｅ，Ｒ．Ｍ．Ｕｒｑｕｈａｒｔ ａｎｄ Ｍ．Ｌ．Ｂｕｒｇｅ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｃｏｌｏｕｒ ｏｆ Ｒａｗ Ｓｕｇａｒｓ，Ｂｒｏｗｎ Ｓｕｇａｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｕｒｅｄ Ｓｙｒｕｐｓ ａｔ ｐＨ７．０−Ｏｆｆｉｃｉａｌ，Ｖｅｒｌａｇ Ｄｒ Ａｌｂｅｒｔ Ｂａｒｔｅｎｓ，２０１１ ｒｅｖｉｓｉｏｎ）に従って厳密に行われた。スクロース試料のＩＣＵＭＳＡ色測定の基本工程は、以下の通りであった。ＩＣＵＭＳＡ Ｍｅｔｈｏｄ ＧＳ１／３−７に定められた通り、予想されるＩＣＵＭＳＡ範囲に基づいて、スクロースを、定められた濃度まで脱イオン水に加えた（サトウキビなどの固体形態における場合は溶解され、ビート液などの液体形態における場合は希釈され）。スクロース溶液を濾過していかなる未溶解の不純物も除去し、濾過したスクロース溶液の吸光度を測定した。次いで、溶液のＩＣＵＭＳＡ色を、方程式１：
Figure 0006708554
 （式中、Ａｂｓ＝試料溶液吸光度測定値、ｂ＝光学セル経路（ｃｍ）、ｃ＝ｇ／ｍＬでのスクロース濃度）
に従って算出した。
前述のＩＣＵＭＳＡ法は、以下の変更以外は、ＩＣＵＭＳＡ Ｍｅｔｈｏｄ ＧＳ１／３−７に従う。
１．酢酸セルロース０．４５ミクロンフィルター（平方５０ｍｍ）を、ニトロセルロース０．４５ミクロンフィルターの代わりに使用した。
２．ＲＤＳ（「屈折率乾燥物質」（ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｉｃ ｄｒｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ））及び密度を算出する代わりに、試料のスクロース濃度を、以下の工程によって決定した。有効ｐｐｔ塩分を、屈折計を使用して測定し、公式データから得られる直線関係（％ブリックス（Ｂｒｉｘ）＝０．１２５８ｐｐｔ塩分＋０．０１５２）を使用して％ブリックスに変換した。屈折率測定を、更に希釈した試料について実施し、ブリックス値は、ＵＶ測定において使用した標準濃度に変換し直された。
脱イオン水を、スクロース溶解のために使用した。フォーム又は泡が溶液において観察されなかったことから、スクロース溶液試料を脱泡しなかった。酢酸セルロースフィルターを、ステリフィルター（ｓｔｅｒｉｆｉｌｔｅｒ）用途のためのプラスチック漏斗に事前に収納した。
ポリアルファ−１，３−グルカンのＬ＊ａ＊ｂ＊色測定
ポリアルファ−１，３−グルカンの色を、ＣＩＥＬ＊ａ＊ｂ＊測定システムを使用して測定した。利用可能なポリアルファ−１，３−グルカンの量に応じて、２つの試料調製方法を使用した。この２つの方法は、均等なＬ＊ａ＊ｂ＊測定をもたらした。
第１の方法では、乾燥したポリアルファ−１，３−グルカンを、コーヒーグラインダーにおいて微細粉末まで粉砕した。０．７７ｇの粉末を、排出可能な１３ｍｍのＫＢｒ Ｐｅｌｌｅｔ Ｄｉｅに移送し、ポリアルファ−１，３−グルカンを７０００ポンドでペレットに形成した。ペレットの色を、コニカミノルタ（Ｋｏｎｉｃａ Ｍｉｎｏｌｔａ）２６００Ｄ分光光度計を使用して測定した。
第２の方法では、乾燥したポリアルファ−１，３−グルカンを、コーヒーグラインダーにおいて微細粉末まで粉砕した。粉砕したポリアルファ−１，３−グルカンを、６０メッシュスクリーンを介して篩にかけ、１ｃｍのキュベットに充填した。粉砕したポリアルファ−１，３−グルカンの色を、ＨＵＮＴＥＲＬＡＢ ＣＯＬＯＲＱＵＥＳＴ ＸＥ分光光度計を使用して測定した。
グルコシルトランスフェラーゼ（ｇｔｆ）酵素の未精製の抽出物の調製
Ｇｔｆ酵素（例えば、配列番号８）を以下の通り調製した。大腸菌ＴＯＰ１０（登録商標）細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を、特定のｇｔｆ−コード化ＤＮＡ配列を含むｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４０４（登録商標）系のコンストラクト（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）で変換した。それぞれの配列を、コドン最適化して大腸菌におけるｇｔｆ酵素を発現させた。特定のｇｔｆ酵素を発現する個々の大腸菌株を３７℃で振動させて、ＯＤ６００＝０．４〜０．５まで、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）とともに、ＬＢ（ルリア培地）培地（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）にて培養し、この時点でＩＰＴＧ（イソプロピルベータ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド、Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｉ６７５８，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を０．５ｍＭの最終濃度まで加えた。ＩＰＴＧ誘導により３７℃で２〜４時間、培養物を培養した。細胞を、１５分間、５，０００×ｇで遠心分離によって採取し、ジチオスレイトール（ＤＴＴ、１．０ｍＭ）で補充された５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０において再懸濁した（２０％重量／容量）。再懸濁した細胞を、２回、フレンチ圧力セル（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｅｌｌ）（ＳＬＭ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を通させ、９５％を超える細胞溶解を確実にした。溶解した細胞を、４℃において１２，０００×ｇで３０分間、遠心分離した。得られた上澄みを、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質分析（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析して、ｇｔｆ酵素の発現を確認し、上澄みを−２０℃で保存した。
Ｇｔｆの相対反応速度
グルコシルトランスフェラーゼによるポリアルファ−１，３−グルカンへのスクロースの酵素的反応は、ミカエリス−メンテン反応速度論（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ）に従う。高いスクロース濃度で、反応速度は、スクロースにおいてゼロ次数である。スクロースの濃度は、反応にわたって周期的にＨＰＬＣで測定した。反応速度を、ゼロ次反応の間のスクロース消費の速度として算出した。即ち、反応速度を、スクロース濃度対時間のグラフの線形領域の傾斜の負数として算出した。次いで、反応速度を、反応物にロードされた酵素活性によって除算し、標準化した反応速度を得て、酵素濃度の変動による反応速度の差を消去した。最終的に、標準化した反応速度を、白色の精製された糖の標準化した反応速度によって除算して相対反応速度を得た。
Ｇｔｆ酵素活性の決定
Ｇｔｆ酵素（例えば、配列番号８）活性を、ｇｔｆ反応溶液における還元糖（フルクトース及びグルコース）の生成を測定する、以下のようなプロトコールに従って確認した。スクロース（５０又は１５０ｇ／Ｌ）、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５、５０ｍＭ）、及び任意選択的にデキストラン（１ｍｇ／ｍＬ、デキストランＴ１０、Ｎｏ．Ｄ９２６０，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む混合物に、未精製のｇｔｆ抽出物を加えることによって、反応溶液を調製し、ｇｔｆ抽出物を２．５容量％〜５容量％まで加える。次いで、反応溶液を２２〜２５℃で２４〜３０時間にわたりインキュベートし、その後、遠心分離する。１Ｎの水酸化ナトリウム及び０．１％の塩化トリフェニルテトラゾリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む混合物に、上澄み（０．０１ｍＬ）を加える。混合物を５分間にわたりインキュベートし、その後、そのＯＤ４８０ｎｍを、ＵＬＴＲＯＳＰＥＣ分光光度計（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を使用して決定し、還元糖フルクトース及びグルコースの存在を測定する。
重量平均重合度（ＤＰＷ）の決定
ｇｔｆ酵素（例えば、配列番号８）によって合成されたグルカン生成物のＤＰＷを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定した。代表的な例のＳＥＣプロトコールは、以下の通りである。乾燥したポリアルファ−１，３−グルカンポリマーを１００℃で終夜にわたって振動させ、５ｍｇ／ｍＬでＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）及び５％の塩化リチウムに溶解した。ＳＥＣシステムは、３つのオンライン検出器：Ｗａｔｅｒｓからの示差屈折計２４１０、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）からのマルチアングル光散乱光度計Ｈｅｌｅｏｓ（商標）８＋、及びＷｙａｔｔからの示差細管式粘度計ＶｉｓｃｏＳｔａｒ（商標）に連結した、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）からのＡｌｌｉａｎｃｅ（商標）２６９５分離モジュールである。ＳＥＣに使用したカラムは、Ｓｈｏｄｅｘ（日本）からの４つのスチレン−ジビニルベンゼンカラム、並びに２つの直線型ＫＤ−８０６Ｍ、ＫＤ−８０２及びＫＤ−８０１カラムであり、ポリマー分布の低分子量領域で分解能を改善する。移動相は、０．１１％の塩化リチウムを有するＤＭＡｃである。使用したクロマトグラフィーの条件は、カラム及び検出器区画で５０℃、試料及びインジェクター区画で４０℃、０．５ｍＬ／分の流速、及び１００μＬの注入量である。データ削減のために使用したソフトウェアパッケージは、ＷａｔｅｒｓからのＥｍｐｏｗｅｒ（商標）ｖｅｒｓｉｏｎ ３（ブロードなグルカンポリマー標準を伴う較正）、及びＷｙａｔｔからのＡｓｔｒａ（登録商標）ｖｅｒｓｉｏｎ ６（カラム較正を伴うトリプル検出法）である。
グリコシド結合の決定
ｇｔｆ酵素（例えば、配列番号８）によって合成されたグルカン生成物におけるグリコシド結合を、以下のように１３ＣＮＭＲ（核磁気共鳴）に従って測定することができる。５０℃で撹拌しながら、乾燥したグルカンポリマー（２５〜３０ｍｇ）を、３重量％の塩化リチウムを含む１ｍＬの重水素化ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解する。ガラスピペットを使用して、０．８ｍＬの溶液を、５ｍｍのＮＭＲ管に移送する。定量的１３ＣＮＭＲスペクトルを、２６０４１．７Ｈｚのスペクトルウィンドウを使用して、１２５．７６ＭＨｚのスペクトル周波数で、ＣＰＤＵＬ凍結探針を備えたＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ５００ＭＨｚのＮＭＲ分光計（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して取得する。０．６２９秒の取得時間、５秒のパルス間遅延、及び６０００パルスで、ワルツデカップリングを使用した逆ゲートデカップリングパルスシーケンス（ｉｎｖｅｒｓｅ ｇａｔｅｄ ｄｅｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｕｌｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を使用する。時間領域データを、２．０Ｈｚの指数関数的増幅を使用して変換する。
実施例１（比較）
白色の精製されたスクロースを使用したポリアルファ−１，３−グルカンの調製
この実施例は、白色の精製されたスクロースを使用してｇｔｆ−触媒反応においてアルファ−１，３−グルカンを生成する工程を記載する。
８０ｇ／Ｌのスクロース溶液を以下の通り調製した。１５００ｇの脱イオン水を、２３℃に制御されたジャケット付撹拌２Ｌガラス反応器に入れた。２．７ｇのリン酸二水素カリウム緩衝液を反応器に加えた。次に、１６０ｇの白色の精製されたスクロース（ＩＣＵＭＳＡ ４７；Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｕｇａｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＮ）を反応器に加え、その後、反応器における容量を、更なる脱イオン水を加えて２Ｌまで調整した。次いで、ＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）（ＤｕＰｏｎｔ）を加え（１ｍＬ／Ｌの反応）、５重量％の水酸化ナトリウム水溶液又は５重量％の硫酸水溶液を使用してｐＨを５．５に調整した。０．３容量％の未精製のｇｔｆ酵素（配列番号８）抽出物（一般方法）を加えることによってグルカン重合反応を開始し、２３℃で維持した。
測定の間のスクロースの完全な消費又はスクロース濃度の変化がないことによって、反応が完了したことを決定した後、２００ｍＬの反応スラリーを、ＦＩＬＴＲＡＴＥＳＴ（Ｂｏｋｅｌａ ＧｍｂＨ Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して濾過した。この濾過は、母液（濾液）をポリアルファ−１，３−グルカンの湿潤したケーキから分離した。湿潤したケーキにおける残留した糖を、脱イオン水の２回の置換洗浄（それぞれ２００Ｌ）によって洗い流した。次いで、湿潤したケーキを８０℃で約２４時間、対流式オーブンで乾燥した。重合収率を、反応したスクロースの量によって除算された乾燥ポリマーの最終重量を使用して算出した。
ポリアルファ−１，３−グルカン生成物の分子量をＳＥＣ（一般方法）で測定し、ＤＰＷとして示し（表２）、これは、モノマー分子量で除算された平均ポリマー分子量として算出され得る。乾燥したグルカンポリマー生成物の色を一般方法に従って測定し、表２にＬ＊として示す。
実施例２
ＶＨＰスクロースを使用したポリアルファ−１，３−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるＶＨＰを使用して、ｇｔｆ−触媒反応においてアルファ−１，３−グルカンを生成する工程を記載する。
ＶＨＰスクロース（ＩＣＵＭＳＡ ５０１，Ｉｒａｃｅｍａ Ｍｉｌｌ，Ｂｒａｚｉｌ）を、白色の精製されたスクロースの代わりに使用した以外は、実施例１の重合手順に従った。
測定の間のスクロースの完全な消費又はスクロース濃度の変化がないことによって、反応が完了したことを決定した後、反応スラリーを、ブフナー漏斗及び真空フラスコを使用して濾過した。この濾過は、母液（濾液）をポリアルファ−１，３−グルカンの湿潤したケーキから分離した。湿潤したケーキにおける残留した糖を、脱イオン水の２回の置換洗浄（それぞれ１Ｌ）によって洗い流した。次いで、湿潤したケーキを４０℃、３６０ｍｍＨｇで約４８時間、真空オーブンで乾燥した。重合収率を、反応したスクロースの量によって除算された乾燥ポリマーの最終重量を使用して算出した。この手順において調製したポリアルファ−１，３−グルカンの分子量、収率、及び色を表２に示す。
従って、ポリアルファ−１，３−グルカンは、不完全に精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液において合成され得る。
実施例３
ＶＶＨＰスクロースを使用したポリアルファ−１，３−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるＶＶＨＰを使用して、ｇｔｆ−触媒反応においてアルファ−１，３−グルカンを生成する工程を記載する。
ＶＶＨＰスクロース（ＩＣＵＭＳＡ ４２１，Ｆｅｒｒａｒｉ Ｍｉｌｌ，Ｂｒａｚｉｌ）を、ＶＨＰスクロースの代わりに使用した以外は、実施例２の重合及びポリマー単離手順に従った。この手順において調製したポリアルファ−１，３−グルカンの分子量、収率、及び色を表２に示す。
従って、ポリアルファ−１，３−グルカンは、不完全に精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液において合成され得る。
実施例４
ビートの濃液を使用したポリアルファ−１，３−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるビートの濃液を使用して、ｇｔｆ−触媒反応においてアルファ−１，３−グルカンを生成する工程を記載する。
ビートの濃液スクロース（ＩＣＵＭＳＡ １４１４，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｂｅｅｔ Ｓｕｇａｒ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ）を、ＶＨＰスクロースの代わりに使用した以外は、実施例２の重合及びポリマー単離手順に概して従った。重合手順を以下の通りに実行した。スクロース濃度が８０ｇ／Ｌになるまで、２３５ｇのビートの濃液を反応器に加え、脱イオン水で希釈した（約１７６５ｍＬの水を加えた）。２．７２ｇのリン酸二水素カリウム緩衝液を加え、５重量％の水酸化ナトリウムでｐＨを５．５に調整した。０．３容量％の未精製のｇｔｆ酵素（配列番号８）抽出物（一般方法）を加えることによってグルカン重合反応を開始し、２３℃で維持した。この手順において調製したポリアルファ−１，３−グルカンの分子量、収率、及び色を表２に示す。
従って、ポリアルファ−１，３−グルカンは、不完全に精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液において合成され得る。
実施例５
ビートの薄液を使用したポリアルファ−１，３−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるビートの薄液を使用して、ｇｔｆ−触媒反応においてアルファ−１，３−グルカンを生成する工程を記載する。
ビートの薄液スクロース（ＩＣＵＭＳＡ １１５８，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｂｅｅｔ Ｓｕｇａｒ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ）を、ＶＨＰスクロースの代わりに使用し、２回の１Ｌの洗浄の代わりに、１回の１Ｌの洗浄を行い、その後に５００ｍＬの水洗を使用した以外は、実施例２の重合及びポリマー単離手順に概して従った。１２２９ｍＬのビートの薄液を、７７１ｍＬの脱イオン水に加えて、８０ｇ／Ｌの出発となるスクロース濃度を調製した。２．７２ｇのリン酸二水素カリウム緩衝液を加え、５重量％の硫酸を用いてｐＨを５．５に調整した。０．３容量％の未精製のｇｔｆ酵素（配列番号８）抽出物（一般方法）を加えることによってグルカン重合反応を開始し、２３℃で維持した。この手順において調製したポリアルファ−１，３−グルカンの分子量、収率、及び色を表２に示す。
従って、ポリアルファ−１，３−グルカンは、不完全に精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液において合成され得る。
実施例６
ビートの糖液を使用したポリアルファ−１，３−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるビートの糖液を使用して、ｇｔｆ−触媒反応においてアルファ−１，３−グルカンを生成する工程を記載する。
ビートの糖液（ＩＣＵＭＳＡ ５７７８１，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｂｅｅｔ Ｓｕｇａｒ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ）を、ＶＨＰスクロースの代わりに使用し、２回の１Ｌの洗浄の代わりに、３回の１Ｌの洗浄を使用した以外は、実施例２の重合及びポリマー単離手順に概して従った。２９１ｍＬのビートの糖液を、１７０９ｍＬの脱イオン水に加えて、８３．４ｇ／Ｌの出発となるスクロース濃度を調製した。２．７２ｇのリン酸二水素カリウム緩衝液を加え、５重量％の水酸化ナトリウムを使用してｐＨを５．５に調整した。０．３容量％の未精製のｇｔｆ酵素（配列番号８）抽出物（一般方法）を加えることによってグルカン重合反応を開始し、２３℃で維持した。この手順において調製したポリアルファ−１，３−グルカンの分子量、収率、及び色を表２に示す。
従って、ポリアルファ−１，３−グルカンは、不完全に精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液において合成され得る。
実施例７
ブラジルの未加工のサトウキビを使用したポリアルファ−１，３−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるブラジルの未加工のサトウキビを使用して、ｇｔｆ−触媒反応においてアルファ−１，３−グルカンを生成する工程を記載する。
１リットルのエルレンマイヤーフラスコ中で、７５ｇのブラジルの未加工のサトウキビ（ＩＣＵＭＳＡ ２６５５）を、約５００ｍＬの脱イオン水に溶解した。１．０２ｇのリン酸二水素カリウム、及び０．１５ｍＬのＦｅｒｍａＳｕｒｅ（登録商標）を加え、その後、水を７５０ｍＬの容量まで加えた。５重量％の水酸化ナトリウムを使用してｐＨを５．５に調整した。フラスコを、２５℃でインキュベーション攪拌オーブンに置いた。０．３容量％の未精製のｇｔｆ酵素（配列番号８）抽出物（一般方法）を加えることによってグルカン重合反応を開始し、２５℃で維持した。反応を３０時間で完了した。反応完了の後、反応物を、ブフナー漏斗及び真空フラスコを用いて濾過した。得られたケーキを２回の８００ｍＬの水での洗浄及び１回の２００ｍＬの水での洗浄で置換洗浄した。ポリアルファ−１，３−グルカンを４０℃で真空オーブンにおいて乾燥した。この手順において調製したポリアルファ−１，３−グルカンの分子量、収率、及び色を表２に示す。
従って、ポリアルファ−１，３−グルカンは、不完全に精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液において合成され得る。
実施例８
ニューオリンズの未加工のサトウキビを使用したポリアルファ−１，３−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるニューオリンズの未加工のサトウキビを使用して、ｇｔｆ−触媒反応においてアルファ−１，３−グルカンを生成する工程を記載する。
ニューオリンズの未加工のサトウキビ（ＩＣＵＭＳＡ ２８５０）をスクロース成分として使用した以外は、実施例７の重合及びポリマー単離手順に従った。この手順において調製したポリアルファ−１，３−グルカンの分子量、収率、及び色を表２に示す。
従って、ポリアルファ−１，３−グルカンは、不完全に精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液において合成され得る。
実施例９
モザンビークの未加工のサトウキビを使用したポリアルファ−１，３−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるモザンビークの未加工のサトウキビを使用して、ｇｔｆ−触媒反応においてアルファ−１，３−グルカンを生成する工程を記載する。
モザンビークの未加工のサトウキビ（ＩＣＵＭＳＡ ３０２２）をスクロース成分として使用した以外は、実施例７の重合及びポリマー単離手順に従った。この手順において調製したポリアルファ−１，３−グルカンの分子量、収率、及び色を表２に示す。
従って、ポリアルファ−１，３−グルカンは、不完全に精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液において合成され得る。
実施例１０
ジンバブエの未加工のサトウキビを使用したポリアルファ−１，３−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるジンバブエの未加工のサトウキビを使用して、ｇｔｆ−触媒反応においてアルファ−１，３−グルカンを生成する工程を記載する。
ジンバブエの未加工のサトウキビ（ＩＣＵＭＳＡ ４１８３）をスクロース成分として使用した以外は、実施例７の重合及びポリマー単離手順に従った。この手順において調製したポリアルファ−１，３−グルカンの分子量、収率、及び色を表２に示す。
従って、ポリアルファ−１，３−グルカンは、不完全に精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液において合成され得る。
実施例１１
ベリーズの未加工のサトウキビを使用したポリアルファ−１，３−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるベリーズの未加工のサトウキビを使用して、ｇｔｆ−触媒反応においてアルファ−１，３−グルカンを生成する工程を記載する。
ベリーズの未加工のサトウキビ（ＩＣＵＭＳＡ ５１５０）をスクロース成分として使用した以外は、実施例７の重合及びポリマー単離手順に従った。この手順において調製したポリアルファ−１，３−グルカンの分子量、収率、及び色を表２に示す。
従って、ポリアルファ−１，３−グルカンは、不完全に精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液において合成され得る。
実施例１２
ガイアナの未加工のサトウキビを使用したポリアルファ−１，３−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるガイアナの未加工のサトウキビを使用して、ｇｔｆ−触媒反応においてアルファ−１，３−グルカンを生成する工程を記載する。
ガイアナの未加工のサトウキビ（ＩＣＵＭＳＡ ８１５３）をスクロース成分として使用した以外は、実施例７の重合及びポリマー単離手順に従った。この手順において調製したポリアルファ−１，３−グルカンの分子量、収率、及び色を表２に示す。
従って、ポリアルファ−１，３−グルカンは、不完全に精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液において合成され得る。
Figure 0006708554
不完全に精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液（実施例２〜１２）は、白色の精製されたスクロースを含むｇｔｆ反応溶液（実施例１）と同一のレベルで、又は更にはより良好に実施し得ることを、表２のデータは概して示している。ほとんどの場合、不完全に精製されたスクロースを含む反応は、白色の精製されたスクロースを含む反応の速度とほぼ同等又は完全に同等である反応速度を有した。また、不完全に精製されたスクロースを含むいくつかの反応は、白色の精製されたスクロースを使用して観察されるものより大きいＤＰＷ及び／又は収率を有するグルカンを生成した（例えば、実施例２〜６）。
従って、複数の異なる種類の不完全に精製されたスクロースを使用して、ポリアルファ−１，３−グルカンを酵素的に生成することができる。
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．水と、スクロースと、少なくとも５０％のアルファ−１，３グリコシド結合及び少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液であって、前記スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製され、前記反応溶液によるポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、前記反応溶液において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも７％である、反応溶液。
２．前記スクロースは甜菜に由来し、且つ、結晶化されていない、上記１に記載の反応溶液。
３．前記スクロースはサトウキビに由来し、且つ、（ｉ）結晶化されていないか、又は（ｉｉ）３つ以下の結晶化工程を使用して結晶化されている、上記１に記載の反応溶液。
４．前記スクロースは、１５０を超えるＩＣＵＭＳＡ値を有する、上記１に記載の反応溶液。
５．前記反応溶液の相対反応速度は、水と、白色の精製されたスクロースと、前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液の反応速度に対して少なくとも０．８であ
る、上記１に記載の反応溶液。
６．前記反応溶液によって生成された前記ポリアルファ−１，３−グルカンは、９３未満のＬ＊値を有する、上記１に記載の反応溶液。
７．前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、又は配列番号３４と少なくとも９０％相同性であるアミノ酸配列を含む、上記１に記載の反応溶液。
８．（ａ）少なくとも水、スクロース、及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、前記スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製され、これにより、少なくとも５０％のアルファ−１，３グリコシド結合及び少なくとも１００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有するポリアルファ−１，３−グルカンが生成される、工程と、
ｂ）任意選択的に、工程（ａ）で生成された前記ポリアルファ−１，３−グルカンを単離する工程と
を含む、不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンを生成する方法であって、ポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、工程（ａ）において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも７％である、方法。
９．前記スクロースは甜菜に由来し、且つ、結晶化されていない、上記８に記載の方法。１０．前記スクロースはサトウキビに由来し、且つ、（ｉ）結晶化されていないか、又は（ｉｉ）３つ以下の結晶化工程を使用して結晶化されている、上記８に記載の方法。
１１．前記スクロースは、１５０を超えるＩＣＵＭＳＡ値を有する、上記８に記載の方法。
１２．工程（ａ）でポリアルファ−１，３−グルカンを生成する相対反応速度は、白色の精製されたスクロースが、前記精製されていないか、又は部分的に精製されたスクロースの代わりに使用される場合、工程（ａ）の反応速度に対して少なくとも０．８である、上記８に記載の方法。
１３．工程（ｂ）で単離された前記ポリアルファ−１，３−グルカンは、９３未満のＬ＊値を有する、上記８に記載の方法。
１４．前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、又は配列番号３４と少なくとも９０％相同性であるアミノ酸配列を含む、上記８に記載の方法。
１５．前記ポリアルファ−１，３−グルカンは、９３未満のＬ＊値を有する、上記８に記載の方法によって生成される単離されたポリアルファ−１，３−グルカン。

Claims (14)

  1. 水と、スクロースと、少なくとも９５％のアルファ−１，３グリコシド結合及び少なくとも１００の重量平均重合度を有する不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液であって、前記スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製されたものであって、１５０を超えるＩＣＵＭＳＡ（国際砂糖分析法統一委員会）値を有するものであり、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、又は配列番号３４と少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を含み、
    前記反応溶液によるポリアルファ−１，３−グルカンの収率は、前記反応溶液において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも７％である、反応溶液。
  2. スクロースは４００を超えるＩＣＵＭＳＡ値を有する、請求項１に記載の反応溶液。
  3. 反応溶液により製造されるポリアルファ−１，３−グルカンは９３未満のＬ*値を有する、請求項１又は２に記載の反応溶液。
  4. 反応溶液により製造されるポリアルファ−１，３−グルカンは９０未満のＬ*値を有す
    る、請求項３に記載の反応溶液。
  5. グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、又は配列番号３４と少なくとも９５％同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の反応溶液。
  6. ポリアルファ−１，３−グルカンは少なくとも９９％のアルファ−１，３グリコシド結合を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の反応溶液。
  7. 少なくとも水、スクロース、及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、前記スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製されたものであっ
    て、１５０を超えるＩＣＵＭＳＡ（国際砂糖分析法統一委員会）値を有するものであり、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、又は配列番号３４と少なくとも９０％同一性であるアミノ酸配列を含み、これにより、少なくとも９５％のアルファ−１，３グリコシド結合及び少なくとも１００の重量平均重合度を有するポリアルファ−１，３−グルカンが生成される工程
    を含む、不溶性ポリアルファ−１，３−グルカンを生成する方法。
  8. ポリアルファ−１，３−グルカンを単離する工程をさらに含む、請求項７に記載の方法。
  9. スクロースは４００を超えるＩＣＵＭＳＡ値を有する、請求項７又は８に記載の方法。
  10. ポリアルファ−１，３−グルカンは９３未満のＬ*値を有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. ポリアルファ−１，３−グルカンは９０未満のＬ*値を有する、請求項１０に記載の方法。
  12. グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号４、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、又は配列番号３４と少なくとも９５％同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. ９３未満のＬ*値を有する単離されたポリアルファ−１，３−グルカンであって、少なくとも９５％のアルファ−１，３グリコシド結合と、少なくとも１００の重量平均重合度を有する、前記ポリアルファ−１，３−グルカン。
  14. ９０未満のＬ*値を有する、請求項１３に記載の単離されたポリアルファ−１，３−グルカン。
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