JP6708554B2 - 代替のスクロース原料からのグルカンポリマーの生成 - Google Patents
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Description
配列リストの公式コピーは、2015年3月16日に作成され、569キロバイトのサイズを有する20150324_CL6221USNP_Sequence Listingという名称のファイルでASCIIフォーマットの配列リストとして、EFS−ウェブを介して電子ファイルで提出され、本明細書と同時に提出される。このASCIIフォーマットの文書に含まれる配列リストは、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
1.水と、スクロースと、少なくとも50%のアルファ−1,3グリコシド結合及び少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリアルファ−1,3−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液であって、スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製され、反応溶液によるポリアルファ−1,3−グルカンの収率は、反応溶液において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも7%である、反応溶液。
2.スクロースは甜菜に由来し、且つ、結晶化されていない、実施形態1の反応溶液。
3.スクロースはサトウキビに由来し、且つ、(i)結晶化されていないか、又は(ii)3つ以下の結晶化工程を使用して結晶化されている、実施形態1の反応溶液。
4.スクロースは、150を超えるICUMSA値を有する、実施形態1、3、又は3の反応溶液。
5.反応溶液の相対反応速度は、水と、白色の精製されたスクロースと、グルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液の反応速度に対して少なくとも0.8である、実施形態1、2、3、又は4の反応溶液。
6.反応溶液によって生成されたポリアルファ−1,3−グルカンは、93未満のL*値を有する、実施形態1、2、3、4、又は5の反応溶液。
7.グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号20、配列番号26、配列番号28、配列番号30、又は配列番号34と少なくとも90%相同性であるアミノ酸配列を含む、実施形態1、2、3、4、5、又は6の反応溶液。
8.(a)少なくとも水、スクロース、及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製され、これにより、少なくとも50%のアルファ−1,3グリコシド結合及び少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有するポリアルファ−1,3−グルカンが生成される、工程と、
b)任意選択的に、工程(a)で生成されたポリアルファ−1,3−グルカンを単離する工程と
を含む、不溶性ポリアルファ−1,3−グルカンを生成する方法であって、ポリアルファ−1,3−グルカンの収率は、工程(a)において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも7%である、方法。
9.スクロースは甜菜に由来し、且つ、結晶化されていない、実施形態8の方法。
10.スクロースはサトウキビに由来し、且つ、(i)結晶化されていないか、又は(ii)3つ以下の結晶化工程を使用して結晶化されている、実施形態8の方法。
11.スクロースは、150を超えるICUMSA値を有する、実施形態8、9、又は10の方法。
12.工程(a)でポリアルファ−1,3−グルカンを生成する相対反応速度は、白色の精製されたスクロースが、精製されていないか、又は部分的に精製されたスクロースの代わりに使用される場合、工程(a)の反応速度に対して少なくとも0.8である、実施形態8、9、10、又は11の方法。
13.工程(b)で単離されたポリアルファ−1,3−グルカンは、93未満のL*値を有する、実施形態8、9、10、11、又は12の方法。
14.グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号20、配列番号26、配列番号28、配列番号30、又は配列番号34と少なくとも90%相同性であるアミノ酸配列を含む、実施形態8、9、10、11、12、又は13の方法。
15.ポリアルファ−1,3−グルカンは、93未満のL*値を有する、請求項8、9、10、11、12、13、又は14に記載の方法によって生成される単離されたポリアルファ−1,3−グルカン。
スクロースICUMSA測定
ICUMSA測定は、参照により本明細書に組み込まれる、以下のICUMSA Method GS1/3−7(R.J.McCowage,R.M.Urquhart and M.L.Burge,Determination of the Solution Colour of Raw Sugars,Brown Sugars and Coloured Syrups at pH7.0−Official,Verlag Dr Albert Bartens,2011 revision)に従って厳密に行われた。スクロース試料のICUMSA色測定の基本工程は、以下の通りであった。ICUMSA Method GS1/3−7に定められた通り、予想されるICUMSA範囲に基づいて、スクロースを、定められた濃度まで脱イオン水に加えた(サトウキビなどの固体形態における場合は溶解され、ビート液などの液体形態における場合は希釈され)。スクロース溶液を濾過していかなる未溶解の不純物も除去し、濾過したスクロース溶液の吸光度を測定した。次いで、溶液のICUMSA色を、方程式1:
に従って算出した。
1.酢酸セルロース0.45ミクロンフィルター(平方50mm)を、ニトロセルロース0.45ミクロンフィルターの代わりに使用した。
2.RDS(「屈折率乾燥物質」(refractometric dry substance))及び密度を算出する代わりに、試料のスクロース濃度を、以下の工程によって決定した。有効ppt塩分を、屈折計を使用して測定し、公式データから得られる直線関係(%ブリックス(Brix)=0.1258ppt塩分+0.0152)を使用して%ブリックスに変換した。屈折率測定を、更に希釈した試料について実施し、ブリックス値は、UV測定において使用した標準濃度に変換し直された。
ポリアルファ−1,3−グルカンの色を、CIEL*a*b*測定システムを使用して測定した。利用可能なポリアルファ−1,3−グルカンの量に応じて、2つの試料調製方法を使用した。この2つの方法は、均等なL*a*b*測定をもたらした。
Gtf酵素(例えば、配列番号8)を以下の通り調製した。大腸菌TOP10(登録商標)細胞(Invitrogen,Carlsbad California)を、特定のgtf−コード化DNA配列を含むpJexpress404(登録商標)系のコンストラクト(construct)で変換した。それぞれの配列を、コドン最適化して大腸菌におけるgtf酵素を発現させた。特定のgtf酵素を発現する個々の大腸菌株を37℃で振動させて、OD600=0.4〜0.5まで、アンピシリン(100μg/mL)とともに、LB(ルリア培地)培地(Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ)にて培養し、この時点でIPTG(イソプロピルベータ−D−1−チオガラクトピラノシド、Cat.No.I6758,Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を0.5mMの最終濃度まで加えた。IPTG誘導により37℃で2〜4時間、培養物を培養した。細胞を、15分間、5,000×gで遠心分離によって採取し、ジチオスレイトール(DTT、1.0mM)で補充された50mMのリン酸緩衝液pH7.0において再懸濁した(20%重量/容量)。再懸濁した細胞を、2回、フレンチ圧力セル(French Pressure Cell)(SLM Instruments,Rochester,NY)を通させ、95%を超える細胞溶解を確実にした。溶解した細胞を、4℃において12,000×gで30分間、遠心分離した。得られた上澄みを、BCA(ビシンコニン酸)タンパク質分析(Sigma−Aldrich)及びSDS−PAGEによって解析して、gtf酵素の発現を確認し、上澄みを−20℃で保存した。
グルコシルトランスフェラーゼによるポリアルファ−1,3−グルカンへのスクロースの酵素的反応は、ミカエリス−メンテン反応速度論(Michaelis−Menten kinetics)に従う。高いスクロース濃度で、反応速度は、スクロースにおいてゼロ次数である。スクロースの濃度は、反応にわたって周期的にHPLCで測定した。反応速度を、ゼロ次反応の間のスクロース消費の速度として算出した。即ち、反応速度を、スクロース濃度対時間のグラフの線形領域の傾斜の負数として算出した。次いで、反応速度を、反応物にロードされた酵素活性によって除算し、標準化した反応速度を得て、酵素濃度の変動による反応速度の差を消去した。最終的に、標準化した反応速度を、白色の精製された糖の標準化した反応速度によって除算して相対反応速度を得た。
Gtf酵素(例えば、配列番号8)活性を、gtf反応溶液における還元糖(フルクトース及びグルコース)の生成を測定する、以下のようなプロトコールに従って確認した。スクロース(50又は150g/L)、リン酸カリウム緩衝液(pH6.5、50mM)、及び任意選択的にデキストラン(1mg/mL、デキストランT10、No.D9260,Sigma−Aldrich)を含む混合物に、未精製のgtf抽出物を加えることによって、反応溶液を調製し、gtf抽出物を2.5容量%〜5容量%まで加える。次いで、反応溶液を22〜25℃で24〜30時間にわたりインキュベートし、その後、遠心分離する。1Nの水酸化ナトリウム及び0.1%の塩化トリフェニルテトラゾリウム(Sigma−Aldrich)を含む混合物に、上澄み(0.01mL)を加える。混合物を5分間にわたりインキュベートし、その後、そのOD480nmを、ULTROSPEC分光光度計(Pharmacia LKB,New York,NY)を使用して決定し、還元糖フルクトース及びグルコースの存在を測定する。
gtf酵素(例えば、配列番号8)によって合成されたグルカン生成物のDPWを、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって決定した。代表的な例のSECプロトコールは、以下の通りである。乾燥したポリアルファ−1,3−グルカンポリマーを100℃で終夜にわたって振動させ、5mg/mLでN,N−ジメチルアセトアミド(DMAc)及び5%の塩化リチウムに溶解した。SECシステムは、3つのオンライン検出器:Watersからの示差屈折計2410、Wyatt Technologies(Santa Barbara,CA)からのマルチアングル光散乱光度計Heleos(商標)8+、及びWyattからの示差細管式粘度計ViscoStar(商標)に連結した、Waters Corporation(Milford,MA)からのAlliance(商標)2695分離モジュールである。SECに使用したカラムは、Shodex(日本)からの4つのスチレン−ジビニルベンゼンカラム、並びに2つの直線型KD−806M、KD−802及びKD−801カラムであり、ポリマー分布の低分子量領域で分解能を改善する。移動相は、0.11%の塩化リチウムを有するDMAcである。使用したクロマトグラフィーの条件は、カラム及び検出器区画で50℃、試料及びインジェクター区画で40℃、0.5mL/分の流速、及び100μLの注入量である。データ削減のために使用したソフトウェアパッケージは、WatersからのEmpower(商標)version 3(ブロードなグルカンポリマー標準を伴う較正)、及びWyattからのAstra(登録商標)version 6(カラム較正を伴うトリプル検出法)である。
gtf酵素(例えば、配列番号8)によって合成されたグルカン生成物におけるグリコシド結合を、以下のように13CNMR(核磁気共鳴)に従って測定することができる。50℃で撹拌しながら、乾燥したグルカンポリマー(25〜30mg)を、3重量%の塩化リチウムを含む1mLの重水素化ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解する。ガラスピペットを使用して、0.8mLの溶液を、5mmのNMR管に移送する。定量的13CNMRスペクトルを、26041.7Hzのスペクトルウィンドウを使用して、125.76MHzのスペクトル周波数で、CPDUL凍結探針を備えたBruker Avance 500MHzのNMR分光計(Billerica,MA)を使用して取得する。0.629秒の取得時間、5秒のパルス間遅延、及び6000パルスで、ワルツデカップリングを使用した逆ゲートデカップリングパルスシーケンス(inverse gated decoupling pulse sequence)を使用する。時間領域データを、2.0Hzの指数関数的増幅を使用して変換する。
白色の精製されたスクロースを使用したポリアルファ−1,3−グルカンの調製
この実施例は、白色の精製されたスクロースを使用してgtf−触媒反応においてアルファ−1,3−グルカンを生成する工程を記載する。
VHPスクロースを使用したポリアルファ−1,3−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるVHPを使用して、gtf−触媒反応においてアルファ−1,3−グルカンを生成する工程を記載する。
VVHPスクロースを使用したポリアルファ−1,3−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるVVHPを使用して、gtf−触媒反応においてアルファ−1,3−グルカンを生成する工程を記載する。
ビートの濃液を使用したポリアルファ−1,3−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるビートの濃液を使用して、gtf−触媒反応においてアルファ−1,3−グルカンを生成する工程を記載する。
ビートの薄液を使用したポリアルファ−1,3−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるビートの薄液を使用して、gtf−触媒反応においてアルファ−1,3−グルカンを生成する工程を記載する。
ビートの糖液を使用したポリアルファ−1,3−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるビートの糖液を使用して、gtf−触媒反応においてアルファ−1,3−グルカンを生成する工程を記載する。
ブラジルの未加工のサトウキビを使用したポリアルファ−1,3−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるブラジルの未加工のサトウキビを使用して、gtf−触媒反応においてアルファ−1,3−グルカンを生成する工程を記載する。
ニューオリンズの未加工のサトウキビを使用したポリアルファ−1,3−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるニューオリンズの未加工のサトウキビを使用して、gtf−触媒反応においてアルファ−1,3−グルカンを生成する工程を記載する。
モザンビークの未加工のサトウキビを使用したポリアルファ−1,3−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるモザンビークの未加工のサトウキビを使用して、gtf−触媒反応においてアルファ−1,3−グルカンを生成する工程を記載する。
ジンバブエの未加工のサトウキビを使用したポリアルファ−1,3−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるジンバブエの未加工のサトウキビを使用して、gtf−触媒反応においてアルファ−1,3−グルカンを生成する工程を記載する。
ベリーズの未加工のサトウキビを使用したポリアルファ−1,3−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるベリーズの未加工のサトウキビを使用して、gtf−触媒反応においてアルファ−1,3−グルカンを生成する工程を記載する。
ガイアナの未加工のサトウキビを使用したポリアルファ−1,3−グルカンの調製
この実施例は、不完全に精製されたスクロースの一種類であるガイアナの未加工のサトウキビを使用して、gtf−触媒反応においてアルファ−1,3−グルカンを生成する工程を記載する。
従って、複数の異なる種類の不完全に精製されたスクロースを使用して、ポリアルファ−1,3−グルカンを酵素的に生成することができる。
1.水と、スクロースと、少なくとも50%のアルファ−1,3グリコシド結合及び少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有する不溶性ポリアルファ−1,3−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液であって、前記スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製され、前記反応溶液によるポリアルファ−1,3−グルカンの収率は、前記反応溶液において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも7%である、反応溶液。
2.前記スクロースは甜菜に由来し、且つ、結晶化されていない、上記1に記載の反応溶液。
3.前記スクロースはサトウキビに由来し、且つ、(i)結晶化されていないか、又は(ii)3つ以下の結晶化工程を使用して結晶化されている、上記1に記載の反応溶液。
4.前記スクロースは、150を超えるICUMSA値を有する、上記1に記載の反応溶液。
5.前記反応溶液の相対反応速度は、水と、白色の精製されたスクロースと、前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液の反応速度に対して少なくとも0.8であ
る、上記1に記載の反応溶液。
6.前記反応溶液によって生成された前記ポリアルファ−1,3−グルカンは、93未満のL*値を有する、上記1に記載の反応溶液。
7.前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号20、配列番号26、配列番号28、配列番号30、又は配列番号34と少なくとも90%相同性であるアミノ酸配列を含む、上記1に記載の反応溶液。
8.(a)少なくとも水、スクロース、及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、前記スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製され、これにより、少なくとも50%のアルファ−1,3グリコシド結合及び少なくとも100の重量平均重合度(DPw)を有するポリアルファ−1,3−グルカンが生成される、工程と、
b)任意選択的に、工程(a)で生成された前記ポリアルファ−1,3−グルカンを単離する工程と
を含む、不溶性ポリアルファ−1,3−グルカンを生成する方法であって、ポリアルファ−1,3−グルカンの収率は、工程(a)において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも7%である、方法。
9.前記スクロースは甜菜に由来し、且つ、結晶化されていない、上記8に記載の方法。10.前記スクロースはサトウキビに由来し、且つ、(i)結晶化されていないか、又は(ii)3つ以下の結晶化工程を使用して結晶化されている、上記8に記載の方法。
11.前記スクロースは、150を超えるICUMSA値を有する、上記8に記載の方法。
12.工程(a)でポリアルファ−1,3−グルカンを生成する相対反応速度は、白色の精製されたスクロースが、前記精製されていないか、又は部分的に精製されたスクロースの代わりに使用される場合、工程(a)の反応速度に対して少なくとも0.8である、上記8に記載の方法。
13.工程(b)で単離された前記ポリアルファ−1,3−グルカンは、93未満のL*値を有する、上記8に記載の方法。
14.前記グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号20、配列番号26、配列番号28、配列番号30、又は配列番号34と少なくとも90%相同性であるアミノ酸配列を含む、上記8に記載の方法。
15.前記ポリアルファ−1,3−グルカンは、93未満のL*値を有する、上記8に記載の方法によって生成される単離されたポリアルファ−1,3−グルカン。
Claims (14)
- 水と、スクロースと、少なくとも95%のアルファ−1,3グリコシド結合及び少なくとも100の重量平均重合度を有する不溶性ポリアルファ−1,3−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素とを含む反応溶液であって、前記スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製されたものであって、150を超えるICUMSA(国際砂糖分析法統一委員会)値を有するものであり、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号20、配列番号26、配列番号28、配列番号30、又は配列番号34と少なくとも90%同一性であるアミノ酸配列を含み、
前記反応溶液によるポリアルファ−1,3−グルカンの収率は、前記反応溶液において生成物に変換されたスクロースの重量の少なくとも7%である、反応溶液。 - スクロースは400を超えるICUMSA値を有する、請求項1に記載の反応溶液。
- 反応溶液により製造されるポリアルファ−1,3−グルカンは93未満のL*値を有する、請求項1又は2に記載の反応溶液。
- 反応溶液により製造されるポリアルファ−1,3−グルカンは90未満のL*値を有す
る、請求項3に記載の反応溶液。 - グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号20、配列番号26、配列番号28、配列番号30、又は配列番号34と少なくとも95%同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の反応溶液。
- ポリアルファ−1,3−グルカンは少なくとも99%のアルファ−1,3グリコシド結合を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の反応溶液。
- 少なくとも水、スクロース、及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程であって、前記スクロースは、精製されていないか、又は部分的に精製されたものであっ
て、150を超えるICUMSA(国際砂糖分析法統一委員会)値を有するものであり、グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号20、配列番号26、配列番号28、配列番号30、又は配列番号34と少なくとも90%同一性であるアミノ酸配列を含み、これにより、少なくとも95%のアルファ−1,3グリコシド結合及び少なくとも100の重量平均重合度を有するポリアルファ−1,3−グルカンが生成される工程
を含む、不溶性ポリアルファ−1,3−グルカンを生成する方法。 - ポリアルファ−1,3−グルカンを単離する工程をさらに含む、請求項7に記載の方法。
- スクロースは400を超えるICUMSA値を有する、請求項7又は8に記載の方法。
- ポリアルファ−1,3−グルカンは93未満のL*値を有する、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
- ポリアルファ−1,3−グルカンは90未満のL*値を有する、請求項10に記載の方法。
- グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、配列番号4、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号20、配列番号26、配列番号28、配列番号30、又は配列番号34と少なくとも95%同一性であるアミノ酸配列を含む、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 93未満のL*値を有する単離されたポリアルファ−1,3−グルカンであって、少なくとも95%のアルファ−1,3グリコシド結合と、少なくとも100の重量平均重合度を有する、前記ポリアルファ−1,3−グルカン。
- 90未満のL*値を有する、請求項13に記載の単離されたポリアルファ−1,3−グルカン。
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