CN106661598A - 从另选的蔗糖源制备葡聚糖聚合物 - Google Patents

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Abstract

本文公开一种反应溶液，所述反应溶液包含水、不完全精制的蔗糖和葡糖基转移酶，所述反应溶液合成不溶性聚α‑1，3‑葡聚糖，其具有至少50％的α‑1，3糖苷键和至少100的重均聚合度(DPw)。本文的反应溶液的聚α‑1，3‑葡聚糖的收率是在所述反应溶液中被转化的蔗糖的重量的至少7％。还公开利用不完全精制的蔗糖制备聚α‑1，3‑葡聚糖的方法和通过这些方法制备的聚α‑1，3‑葡聚糖。

Description

从另选的蔗糖源制备葡聚糖聚合物
本申请要求美国临时申请61/969,958(2014年3月25日提交)的优先权，该申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明属于多糖合成领域。例如，本发明涉及利用未完全精制的蔗糖制备不溶性聚α-1，3-葡聚糖。
以电子方式递交的序列表的引用
通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表递交，该文件名称为“20150324_CL6221USNP_SequenceListing”，创建日期为2015年3月16日，文件大小为569千字节，并且该文件与本说明书同时提交。在这一ASCII格式的文件中包含的序列表为所述说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。
背景技术
受到利用酶法合成或微生物的基因工程寻找新结构多糖愿望的驱使，研究人员已经发现可以生物降解且可以从可再生资源原料经济地制造的多糖。一种此类多糖是聚α-1，3-葡聚糖，一种特征为具有α-1，3-糖苷键的葡聚糖聚合物。
已经通过使蔗糖的水性溶液与从唾液链球菌(Streptococcus salivarius)分离的葡糖基转移酶(gtf)接触来分离聚α-1，3-葡聚糖(Simpson等人，Microbiology 141：1451-1460，1995)。美国专利7,000,000公开利用唾液链球菌gtfJ酶制备多糖纤维。这种纤维的聚合物中至少50％己糖单元是通过α-1，3-糖苷键连接。本发明所公开的聚合物当它在溶剂或包含溶剂的混合物中以高于临界浓度的浓度溶解时形成液晶溶液。从这一溶液中纺出高度适用于纺织品的连续的、高强度的、棉花样纤维，并且使用。
先前已经利用白色精制蔗糖进行聚α-1，3-葡聚糖的酶法合成。因为这种形式的蔗糖相对昂贵，希望开发出利用未精制或以其它方式不完全精制的蔗糖合成聚α-1，3-葡聚糖的新型酶法工艺。
发明内容
在一个实施方案中，本公开涉及一种反应溶液，所述溶液包含水、蔗糖和葡糖基转移酶，所述溶液合成不溶性聚α-1，3-葡聚糖，其具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的重均聚合度(DPw)，其中所述蔗糖是未精制或部分精制的。所述反应溶液的聚α-1，3-葡聚糖的收率是在所述反应溶液中转化为产物的蔗糖的重量的至少7％。
在反应溶液的另一个实施方案中，蔗糖来自糖用甜菜，且尚未结晶。
在反应溶液的另一个实施方案中，蔗糖来自甘蔗，且(i)尚未结晶，或(ii)已经利用不超过三个结晶步骤结晶。
在反应溶液的另一个实施方案中，蔗糖具有大于150的ICUMSA值。
在反应溶液的另一个实施方案中，反应溶液的相对反应速率为至少0.8，这是相对于包含水、白色精制蔗糖和葡糖基转移酶的反应溶液的反应速率而言。
在反应溶液的另一个实施方案中，由反应溶液制备的聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。
在另一个实施方案中，葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ IDNO：30或SEQ ID NO：34具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本公开涉及一种用于制备聚α-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括接触水、蔗糖和葡糖基转移酶的步骤，其中蔗糖是未精制或部分精制的。所述接触步骤中制备的聚α-1，3-葡聚糖具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的重均聚合度(DPw)。所述方法中制备的聚α-1，3-葡聚糖的收率是在所述接触步骤中转化为产物的蔗糖的重量的至少7％。所述方法任选地包括分离所述接触步骤中制备的聚α-1，3-葡聚糖。
在另一个实施方案中，所述方法中使用的蔗糖来自糖用甜菜，且尚未结晶。
在另一个实施方案中，所述方法中使用的蔗糖来自甘蔗，且(i)尚未结晶，或(ii)已经利用不超过三个结晶步骤结晶。
在另一个实施方案中，所述方法中使用的蔗糖具有大于150的ICUMSA值。
在另一个实施方案中，所述方法的接触步骤中制备聚α-1，3-葡聚糖的相对反应速率为至少0.8，这是相对于使用白色精制蔗糖替代未精制或部分精制蔗糖时的接触步骤的反应速率而言。
在另一个实施方案中，所述方法中任选地分离的聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。
在另一个实施方案中，所述方法中使用的葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：4、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：34具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本公开涉及通过以上方法制备的分离的聚α-1，3-葡聚糖，其中聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。
序列简述
表1.核酸和蛋白质序列识别号概述
具体实施方式
所有引用的专利和非专利文献的公开全文以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“发明”或“本发明所公开的”不旨在限制但一般适用于权利要求中所限定的或本文所述的任何发明。这些术语在本文中可互换使用。
术语“聚α-1，3-葡聚糖”、“α-1，3-葡聚糖聚合物”等在本文中可互换使用。聚α-1，3-葡聚糖是包含由糖苷键(即葡糖苷键)连接在一起的葡萄糖单体单元的聚合物，其中至少约50％的糖苷键是α-1，3-糖苷键。聚α-1，3-葡聚糖是一类多糖。如本文所用，术语“α-1，3-糖苷键”是指通过在邻近α-D-葡萄糖环上的碳1和碳3彼此接合α-D-葡萄糖分子的一类共价键。
术语“糖苷键(glycosidic linkage)”和“糖苷键(glycosidic bond)”在本文中可以互换使用，且是指将碳水化合物(糖)分子接合至另一基团诸如另一碳水化合物的一类共价键。如本文所用，术语“α-1，3-糖苷键”是指通过在邻近α-D-葡萄糖环上的碳1和碳3彼此接合α-D-葡萄糖分子的一类共价键。
“α-D-葡萄糖”在本文中也可以指“葡萄糖”。
术语“蔗糖”在本文中指由通过α-1，2-糖苷键连接的α-D-葡萄糖分子和β-D-果糖分子组成的非还原二糖。已知蔗糖常作为食糖。
“白色精制”蔗糖在本文中是指包含至少99.0重量％蔗糖的蔗糖。此外或另选地，白色精制蔗糖可以指具有150或更小(例如，45或更小)的ICUMSA值、99.70％的最小偏振和/或至少87.0的L*值的蔗糖。
“ICUMSA”(国际食糖统一分析法委员会)值或“标准ICUMSA”值是用于表示溶液中蔗糖样品纯度的国际单位，且与蔗糖的颜色直接相关。蔗糖样品的ICUMSA值越大，蔗糖样品越深。测定蔗糖样品的ICUMSA值的方法是本领域中所熟知的，且由国际食糖统一分析法委员会公开在例如ICUMSA Methods of Sugar Analvsis：Official and Tentative Methods Recommended by the International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis(ICUMSA)(Ed.H.C.S.de Whalley，Elsevier Pub.Co.，1964)中，该文献以引用的方式并入本文。ICUMSA可以例如通过如由R.J.McCowage、R.M.Urquhart和M.L.Burge(Determination of the Solution Colour of Raw Sugars，Brown Sugars and Coloured Syrups at pH 7.0-Official，Verlag Dr Albert Bartens，2011 revision)所述的ICUMSA方法GS1/3-7测定，该文献以引用的方式并入本文。ICUMSA值可以表示为“参考基本单位”(RBU)。
本文的ICUMSA值可以通过极其类似于ICUMSA方法GS1/3-7的方法测定，但不同的是利用醋酸纤维素过滤器替代硝酸纤维素过滤器。因此，本文所公开的ICUMSA值可以另外称作“改良ICUMSA”值。考虑到ICUMSA是如何测定的，应理解，本文针对固体糖样品(例如，原蔗糖)提供的ICUMSA值是利用糖样品的水性溶液(约200g/L)获得的。
蔗糖样品的“偏振”(“pol”)在本文中称为样品中的表观蔗糖含量，表示为通过在20℃下穿过含蔗糖样品的溶液的偏振光的旋光度测量的质量百分比。蔗糖样品的偏振越大，样品中的蔗糖纯度越大。
“未完全精制的”蔗糖(“不完全精制的”蔗糖)在本文中称为尚未加工成白色精制蔗糖的蔗糖。因此，不完全精制的蔗糖可以是完全未精制或部分精制的。未精制蔗糖的示例是“原蔗糖”(“原糖”)和它的溶液。部分精制的蔗糖的示例尚未经历一个、两个、三个或更多个结晶步骤。不完全精制的蔗糖的ICUMSA在本文中大于150。
术语蔗糖“结晶”“结晶步骤”、“分步结晶”等在本文中可互换使用，且是指从含不完全精制的蔗糖的溶液结晶出蔗糖，并从上清液(母液)分离蔗糖晶体的过程。由这个过程产生的晶体通常代表比在结晶步骤之前存在的蔗糖纯的蔗糖。然而，需要重点注意的是，已经经历一个、两个、三个或更多个结晶步骤的不完全精制的蔗糖仍然可以构成不完全精制的蔗糖(即，结晶蔗糖可以不具有白色精制蔗糖的纯度)。蔗糖通常需要三个或更多个结晶步骤来制备白色精制糖，而甜菜汁在一些实施方案中可能只需要一个结晶步骤就可以达到这种纯度。本领域中已知用于使蔗糖结晶的各种方式，诸如蒸发、沸腾和/或真空干燥工艺。
如本文中所用，术语“L*值”是指由国际照明委员会(CIE，Vienna，Austria)指定的CIE 1976(L*，a*，b*)(“CIELAB”)三维色彩空间的明度分量。L*a*b*色彩空间的三个坐标分别代表固体颜色的明度(L*＝0指黑色，且L*＝100指漫射白色)、对象沿着红色/品红色与绿色间的标度的颜色(a*，负值指绿色，而正值指品红色)和对象沿着黄色与蓝色间的标度的颜色(b*，负值指蓝色，且正值指黄色)。用于指对象的L*a*b*色彩空间的星号(*)的发音为“星号”(例如，L*是“L-星号”)，且作用是将这个色彩空间与Hunter的L，a，b色彩系统区分开来。对象的CIELAB色彩空间的L*、a*和b*分量可以利用J.Schwiegerling(Field Guide to Visual and Ophthalmic Optics，SPIE Press，Bellingham，WA，2004)所公开的公式计算，该文献以引用的方式并入本文。L*、a*、b*值在本文中是针对固体材料诸如干燥蔗糖或干燥聚α-1，3-葡聚糖来说。
如本文所用，“干燥”蔗糖可以表征含不超过2.0、1.5、1.0、0.5、0.25、0.10、0.05或0.01重量％水的蔗糖。
聚α-1，3-葡聚糖的“分子量”在本文中可以表示为数均分子量(Mn)或重均分子量(Mw)。另选地，分子量可以表示为道尔顿、克/摩尔、DPw(重均聚合度)或DPn(数均聚合度)。本领域中已知用于计算这些分子量测量值的各种方式，诸如利用高压液相色谱法(HPLC)、尺寸排阻色谱法(SEC)或凝胶渗透色谱法(GPC)。
术语“葡糖基转移酶”、“gtf酶”、“gtf酶催化剂”、“gtf”、“葡聚糖蔗糖酶”等在本文中可互换使用。本文gtf酶的活性催化底物蔗糖反应以制备产物聚α-1，3-葡聚糖和果糖。gtf反应的其它产物(副产物)可以包括葡萄糖(当葡萄糖从葡糖基-gtf酶中间复合物水解时产生)、各种可溶性低聚糖(例如，DP2-DP7)和明串珠菌二糖(当葡糖基-gtf酶中间复合物的葡萄糖连接至果糖时产生)。明串珠菌二糖是由通过α-1，5键连接的葡萄糖和果糖组成的二糖。野生型形式的葡糖基转移酶通常包含(在N-末端至C-末端方向上)信号肽、可变结构域、催化结构域和葡聚糖结合结构域。本文的gtf根据CAZy(碳水化合物活性酶)数据库(Cantarel等人，Nucleic Acids Res.37：D233-238，2009)归类在配糖水解酶家族70(GH70)下。
如本文所用，“反应溶液”通常是指包含蔗糖、水、至少一种活性葡糖基转移酶、和可选的其它组分的溶液。另选地，反应溶液可以在本文中称为例如“葡聚糖合成反应”、“葡聚糖反应”或“gtf反应”。可用在葡聚糖合成反应中的其它组分包括果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖和可溶性低聚糖(例如，DP2-DP7)。应当理解，某些葡聚糖产物(诸如聚合度(DP)为至少8或9的聚α-1，3-葡聚糖)是水不溶性的，且因此在葡聚糖合成反应中不溶解，而是存在于溶液之外。正是在反应溶液中进行使水、蔗糖和葡糖基转移酶接触的步骤。如本文所用，术语“在合适反应条件下”是指支持蔗糖通过葡糖基转移酶活性转化为聚α-1，3-葡聚糖的反应条件。
如本文所用，“对照”反应溶液可以指包含白色精制蔗糖而非不完全精制的蔗糖的反应溶液。对照反应溶液的所有其它特征(例如，蔗糖浓度、温度、pH、gtf类型)可以与所比较的反应溶液相同。
葡聚糖合成反应的“干燥固体百分比”是指葡聚糖合成反应中所有糖的重量％。gtf反应的干燥固体百分比可以例如基于用于制备反应的蔗糖的量计算。
本文反应溶液的聚α-1，3-葡聚糖的“收率”表示聚α-1，3-葡聚糖产物的重量，表示为反应中被转化的蔗糖底物的重量百分比。例如，如果反应溶液中100g蔗糖转化为产物，且10g产物是聚α-1，3-葡聚糖，那么聚α-1，3-葡聚糖的收率将是10％。这个收率计算可以视为反应针对聚α-1，3-葡聚糖的选择性的量度。
如本文所用，术语“相对反应速率”是指特定葡聚糖合成反应与另一种葡聚糖合成反应相比的速率。例如，如果反应A的速率为x，且反应B的速率为y，那么反应A相对于反应B的反应速率的相对反应速率可以表示为x/y(x除以y)。术语“反应速率”和“反应的速率”在本文中可以互换地指代在单位时间内每单位酶下，反应物的浓度/量的变化或者产物的浓度/量的变化。葡聚糖合成反应在本文中的优选反应物和产物分别是蔗糖和聚α-1，3-葡聚糖。
本文葡聚糖合成反应的“馏分”是指葡聚糖合成反应的液体溶液部分。馏分可以是葡聚糖合成反应的一部分或全部液体溶液，且已经从反应中合成的固体葡聚糖产物分离出来。馏分也可以称为“母液”。馏分的示例是葡聚糖合成反应的滤液。因为馏分可以包含溶解的糖，诸如蔗糖、果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、可溶性低聚糖(例如，DP2-DP7)，馏分也可以称为来源于葡聚糖合成反应的“混合糖溶液”。
术语“滤液”、“葡聚糖反应滤液”、“葡聚糖滤液”等在本文中可互换使用，且是指已经从葡聚糖合成反应中合成的固体葡聚糖产物过滤出的馏分。
术语“体积％”、“体积百分比”、“vol％”、“体积/体积％”等在本文中可互换使用。溶液中溶质的体积％可以利用下式测定：[(溶质体积)/(溶液体积)]×100％。
术语“重量％”、“重量百分比(wt％)”以及“重量-重量百分比(重量/重量％)”等在本文中可互换使用。重量％是指物质在其被包含在组合物、混合物或溶液中时以质量计的百分比。
术语“提高的”、“增强的”和“改善的”在本文中可互换使用。这些术语是指更大的数量或活性，诸如略大于原始数量或活性的数量或活性、或大大超出原始数量或活性的数量或活性，且包括其间的所有数量或活性。另选地，这些术语可以指例如该数量或活性与和它相比较的数量或活性相比，提高至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。
如本文所用，相对于多核苷酸或多肽序列的术语“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比较窗范围为获得最大对应而比对时两条序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基。因此，“序列同一性百分比”或“同一性百分比”指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列而测定的值，其中在与参考序列(其不包含添加或缺失)进行比较时，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包含添加或缺失(即缺口)以实现两个序列的最佳比对。通过以下方式计算这种百分比：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
在National Center for Biotechnology Information(NCBI)网站在线可用的Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)算法可用于例如测量本文所公开的两个或更多个多核苷酸序列(BLASTN算法)或多肽序列(BLASTP算法)之间的百分比同一性。另选地，序列间的百分比同一性可使用Clustal算法(例如ClustalW或ClustalV)进行计算。对于使用Clustal比对方法的多重比对，默认值可对应于GAP PENALTY＝10、以及GAP LENGTHPENALTY＝10。用Clustal方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数可为KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3、WINDOW＝5、以及DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数可为KTUPLE＝2，GAP PENALTY＝5，WINDOW＝4、以及DIAGONALS SAVED＝4。另选地，序列间的百分比同一性可以利用EMBOSS算法(例如，needle)进行，其中参数诸如GAP OPEN＝10、GAP EXTEND＝0.5、END GAP PENALTY＝false、END GAP OPEN＝10、END GAP EXTEND＝0.5，利用BLOSUM矩阵(例如，BLOSUM62)。
本文公开了多种多核苷酸和多肽序列作为某些实施方案的特征。可使用与本文所公开的序列具有至少约70-85％、85-90％或90％-95％同一性的这些序列的变体。另选地，变体氨基酸序列可与本文所公开的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。变体核苷酸或氨基酸序列具有与本发明所公开的序列相同的功能/活性，或者具有本发明所公开的序列的至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的功能/活性。
如某些实施方案中所用，术语“分离的”是指完全从其原始来源分离的任何细胞组分(例如，分离的多核苷酸或多肽分子)。在一些情况下，分离的多核苷酸或多肽分子是较大组合物、缓冲体系或试剂混合物的一部分。例如，分离的多核苷酸或多肽分子可以异源方式包含在细胞或生物内。其它的示例是分离的葡糖基转移酶和分离的聚α-1，3-葡聚糖。据信，本文所公开的葡糖基转移酶反应过程是合成、非天然存在的过程。
先前已经利用白色精制蔗糖进行聚α-1，3-葡聚糖的酶法合成。因为这种形式的蔗糖相对昂贵，希望开发出利用未精制或以其它方式不完全精制的蔗糖合成聚α-1，3-葡聚糖的新型酶法工艺。
本公开的实施方案涉及一种反应溶液，所述反应溶液包含至少水、蔗糖和葡糖基转移酶，所述反应溶液合成不溶性聚α-1，3-葡聚糖，其具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的重均聚合度(DPw)，其中所述蔗糖是未精制或部分精制的(即，未完全精制的)。反应溶液制备具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的DPw的不溶性聚α-1，3-葡聚糖。所述反应溶液的聚α-1，3-葡聚糖的收率是在所述反应溶液中转化为产物的蔗糖的重量的至少7％。
显著地，这种反应溶液的实施方案制备收率和分子量与通过使用白色精制蔗糖而非不完全精制的蔗糖的反应溶液制备的葡聚糖收率和分子量相当的聚α-1，3-葡聚糖。这些结果表明，不完全精制的蔗糖中存在的污染物一般不会阻碍它通过葡糖基转移酶用于使聚α-1，3-葡聚糖聚合。
未完全精制的蔗糖可以用在当前公开的反应溶液中。此类蔗糖尚未加工成白色精制蔗糖。示例包括含原蔗糖(原糖)的未精制蔗糖组合物。可用于本文中的其它形式的不完全精制的蔗糖包括以下形式：来源于例如甘蔗(甘蔗属物种(Saccharum spp.)，诸如甘蔗(S.officenarum))、糖用甜菜(甜菜属物种(Beta spp.)，诸如甜菜(B.vulgaris))(也可以在本文中称为“beet”)、枣椰(date palm)(海枣(Phoenix dactylifera))、高粱(高粱属物种(Sorghum spp.)，诸如高粱(S.vulgare)和双色高粱(S.bicolor))、糖枫(sugar maple)(糖槭(Acer saccharum))、木薯(cassava)(木薯(Manihot esculenta))或玉米的蔗糖。甘蔗和/或糖用甜菜的蔗糖的不完全精制形式可以用在本文中的优选实施方案中。甘蔗汁中含约20％蔗糖，而糖用甜菜汁中含约10％至15％蔗糖。
在某些实施方案中，不完全精制的蔗糖可以来自产蔗糖和任选地种植用于产蔗糖的植物。此类植物(诸如上文所列的那些)可以来自世界上通常种植植物的任何地区。例如，本文的蔗糖可以来自种植在南美洲(例如，巴西、哥伦比亚、阿根廷、圭亚那)、北美洲(例如，美国、墨西哥、西印度群岛、中美洲[例如，伯利兹城])、澳洲、亚洲(例如，印度、中国、俄罗斯、土耳其、泰国、巴基斯坦、菲律宾、印度尼西亚)、非洲(例如，埃及、莫桑比克、津巴布韦)和欧洲(例如，法国、德国、乌克兰、俄罗斯、土耳其)的植物。
不完全精制的蔗糖可以作为在从含蔗糖的植物(例如，甘蔗或糖用甜菜)的汁纯化蔗糖工艺的任何阶段获得的组合物提供。此类工艺公开在例如Handbook of Sugar Refining：A Manual for the Design and Operation of Sugar Refining Facilities(Ed.C.C.Chou，John Wiley&Sons，Inc.，2000)、Chen and Chou(Cane Sugar Handbook：A Manual for Cane Sugar Manufacturers and Their Chemists，第12版，John Wiley&Sons，Inc.，1993)和Asadi(Beet-Sugar Handbook，第1版，Wiley-Interscience，2006)中，这些文献全部以引用的方式并入本文。如下讨论来自这些参考文献的一些优选组合物和工艺。
本文的不完全精制的蔗糖可以作为蔗糖-纯化工艺的任何步骤所产生的组合物提供，诸如(i)初始提取(例如，热水提取)植物材料的“原汁”；(ii)通过碳酸化纯化汁(即，利用石灰和二氧化碳形成使杂质共沉淀的碳酸钙沉淀物)，得到“稀汁”；(iii)蒸发稀汁的水，得到“浓汁”，和/或(iv)使浓汁沸腾或进行真空浓缩，以使蔗糖结晶(此类一次结晶蔗糖通常不是白色精制糖)(可以例如通过离心从上清液去除晶体)。例如，在某些实施方案中，步骤(i)和(ii)的产物可以在进一步加工前过滤。结晶(iv)的上清液可以再循环，并与其它上清液和/或浓汁混合，然后使它经历结晶(得到如步骤[iv]中的晶体，它们也可以用在本文中)。上清液的再循环最终得到“糖蜜”。因此，不完全精制的蔗糖可以作为原汁、稀汁、浓汁、糖蜜和/或已经经历例如不超过一次结晶的蔗糖晶体提供。这些形式的不完全精制的蔗糖和用于获得它们的相应工艺步骤优选地表征从糖用甜菜获得的不完全精制的蔗糖的示例，而且可以表征从其它来源诸如甘蔗获得的蔗糖。
可用在本文中的来自糖用甜菜的不完全精制的蔗糖的示例包括甜菜原汁、甜菜稀汁(含约10重量％-20重量％蔗糖)、甜菜浓汁(含约60重量％-90重量％蔗糖)和糖用甜菜糖蜜(约50重量％-60重量％蔗糖)。在某些实施方案中使用甜菜稀汁和/或浓汁。本文的ICUMSA值：例如对于甜菜稀汁可以是至少1000(例如，～1000-1300)，对于甜菜浓汁可以是至少1300(例如，～1300-1800)，和/或对于甜菜糖蜜可以是至少50000(例如，～50000-60000)。
另选地，本文的不完全精制的蔗糖可以是“原蔗糖”(“原糖”)，它是通过去除原汁的所有水提供(即，原蔗糖是固体)。另选地，本文的不完全精制的蔗糖可以是“VHP蔗糖”(“VHP”、“VHP糖”、“极高偏振”蔗糖)，它是如下提供：首先碳酸化，并过滤原汁，接着蒸发原汁，以使其中蔗糖的一部分结晶；从上清液去除的结晶蔗糖是VHP蔗糖。因此，VHP蔗糖已经经历一次结晶。另选地，本文的不完全精制的蔗糖可以是“VVHP蔗糖”(“VVHP”、“VVHP糖”、“极其极其高偏振”蔗糖)，它是通过将VHP蔗糖溶解在水中，并使蔗糖重结晶而提供。因此，VVHP蔗糖已经经历两次结晶。这些形式的不完全精制的蔗糖(原蔗糖、VHP、VVHP)和用于获得它们的相应工艺步骤优选地表征从甘蔗获得的不完全精制的蔗糖的示例，而且可以表征从其它来源诸如糖用甜菜获得的蔗糖。
本文的原蔗糖(例如，“原蔗糖”)可以具有94％至97％的偏振值、约600至1200的ICUMSA值和/或低于87.0(例如，小于85、80、75、70、65、60、55或50)的L*值，应当理解，原蔗糖不是“红糖”，红糖是混合糖蜜糖浆与白色精制糖，接着干燥所得的产物。本文的VHP蔗糖可以具有例如至少99.30％的偏振值和/或约300至1000的ICUMSA值。VHP蔗糖可以任选地具有以下特性中的任一种：0.15％最大含水量、0.15％最大灰分含量、97％水中溶解度和/或金棕色。本文的VVHP蔗糖可以具有例如至少99.50％的偏振值和/或超过150至约400的ICUMSA值。
本文的不完全精制的蔗糖不是白色精制蔗糖。白色精制蔗糖在本文中是指含至少99.0重量％蔗糖(例如，至少99.5重量％或99.9重量％)的蔗糖。此外或另选地，白色精制蔗糖可以指具有150或更小(例如，45或更小)的ICUMSA值、99.70％(例如，至少99.80％)的最小偏振和/或至少87.0(例如，至少87.5、88.0或88.5)的L*值的蔗糖。在某些实施方案中，白色精制蔗糖也可以具有以下特性中的任一种：0.04％最大含水量、0.04％最大灰分含量、100％水中溶解度、亮白色和/或细化颗粒。
在某些实施方案中，不完全精制的蔗糖尚未结晶。可以提到从糖用甜菜包括例如甜菜原汁、甜菜稀汁和甜菜浓汁获得的不完全精制的蔗糖。另选地，本文的不完全精制的蔗糖已经具有不超过一个、两个、三个或更多个结晶步骤。例如，可以使用来自甘蔗且已经具有不超过两次或三次结晶的不完全精制的蔗糖。另选地，如果已经经历一次、两次、三次或更多次结晶但具有大于150的ICUMSA，可以使用不完全精制的蔗糖。结晶步骤可以包括例如使含蔗糖的水性溶液至少沸腾和/或真空干燥至使溶解的蔗糖开始作为晶体析出溶液的程度。
本文的不完全精制的蔗糖的ICUMSA值可以大于例如150。另选地，不完全精制的蔗糖可以具有例如至少约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000或60000(或介于151和60000之间的任何整数值)的ICUMSA值。在某些实施方案中，ICUMSA可在约1000-1300的范围内，诸如当不完全精制的蔗糖是甜菜稀汁时。在其它实施方案中，本文的ICUMSA可在约1300-1800的范围内，诸如当不完全精制的蔗糖是甜菜浓汁时，或约50000至60000的范围内，诸如当不完全精制的蔗糖是甜菜糖蜜时。在其它实施方案中，ICUMSA可在约600-1200的范围内，诸如当不完全精制的蔗糖是原蔗糖时；约300-1000的范围内，诸如当不完全精制的蔗糖是VHP蔗糖时；或超过150至约400的范围内，诸如当不完全精制的蔗糖是VVHP蔗糖时。
据信，本文的蔗糖组合物的ICUMSA值(“改良ICUMSA”)与针对所述组合物利用其它ICUMSA方法测得的ICUMSA值相同或极其类似。
本文的反应溶液是指至少包含不完全精制的蔗糖、水和活性葡糖基转移酶和任选的其它组分的溶液。可以用在葡聚糖合成反应中的其它组分包括例如果糖、葡萄糖、明串珠菌二糖、可溶性低聚糖(例如，DP2-DP7)。应当理解，某些葡聚糖产物(诸如DP为至少8或9的聚α-1，3-葡聚糖)可以是水不溶性的，且因此在葡聚糖合成反应中不溶解，而是存在于溶液之外。本文的反应溶液可以是一种除制备不溶性葡聚糖产物以外，制备副产物诸如明串珠菌二糖和/或可溶性低聚糖的溶液。
如本文所公开的反应溶液包含制备具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的DPw的聚α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶。此类可用于本文中的葡糖基转移酶的示例公开在美国专利7000000和美国专利申请公布2013/0244288和2013/0244287(所有这些文献以引用的方式并入本文)中。可以用在本文的反应溶液中制备聚α-1，3-葡聚糖的葡糖基转移酶的其它示例公开在美国专利申请公布2014/0087431(美国专利申请14/036,049)中，该文献以引用的方式并入本文。例如，本文的葡糖基转移酶可以(i)包含与SEQ ID NO：4、8、10、12、14、20、26、28、30或34具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成，且(ii)具有葡糖基转移酶活性。
在某些其它实施方案中，反应溶液包含这样的葡糖基转移酶，其(i)包含与SEQ IDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、59、60、61、62、63或64具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或由其组成，且(ii)具有葡糖基转移酶活性。
本文的葡糖基转移酶可以来源于任何微生物来源，诸如细菌或真菌。细菌葡糖基转移酶的示例是来源于链球菌属(Streptococcus)菌种、明串珠菌属(Leuconostoc)菌种或乳杆菌属(Lactobacillus)菌种的那些葡糖基转移酶。链球菌属菌种的示例包括唾液链球菌(S.salivarius)、远缘链球菌(S.sobrinus)、蝙蝠齿链球菌(S.dentirousetti)、汗毛链球菌(S.downei)、变异链球菌(S.mutans)、口腔链球菌(S.oralis)、解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)和血链球菌(S.sanguinis)。明串珠菌属菌种的示例包括肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)、蜜二糖明串珠菌(L.amelibiosum)、阿根廷明串珠菌(L.argentinum)、肠系膜状明串珠菌(L.carnosum)、柠檬明串珠菌(L.citreum)、乳脂明串珠菌(L.cremoris)、葡聚糖明串珠菌(L.dextranicum)和果糖明串珠菌(L.fructosum。乳杆菌属菌种的示例包括嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、德氏乳酸杆菌(L.delbrueckii)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、唾液乳杆菌(L.salivarius)、干酪乳杆菌(L.casei)、弯曲乳杆菌(L.curvatus)、植物乳杆菌(L.plantarum)、清酒乳杆菌(L.sakei)、短乳杆菌(L.brevis)、布氏乳杆菌(L.buchneri)、发酵乳杆菌(L.fermentum)和罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)。
在一些方面，本文的葡糖基转移酶在葡聚糖合成反应中制备具有至少50％的α-1，3糖苷键的聚α-1，3-葡聚糖，其中使用不完全精制的蔗糖。据信，在某些实施方案中，葡糖基转移酶合成这样的聚α-1，3-葡聚糖，其中至少约60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或介于60％和100％之间的任何整数)的组成糖苷键是α-1，3键。因此，葡糖基转移酶在上述实施方案中合成这样的聚α-1，3-葡聚糖，其中少于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或0％(或介于0％和50％之间的任何整数值)的糖苷键不是α-1，3。
在本文的其它方面，葡糖基转移酶可以合成不具有分支点或具有占聚合物中糖苷键的百分比少于约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％分支点的聚α-1，3-葡聚糖。分支点的示例包括α-1，6分支点，诸如存在于突变聚合物中的那些分支点。
在本文的一些方面，葡糖基转移酶可以合成分子量以DPn或DPw计为至少约100的聚α-1，3-葡聚糖。另选地，葡糖基转移酶可以合成分子量以DPn或DPw计为至少约400的聚α-1，3-葡聚糖。另选地，葡糖基转移酶可以合成分子量以DPn或DPw计为至少约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000(或介于100和1000之间的任何整数)的聚α-1，3-葡聚糖。
在某些方面，可以使用一种或多种不同的葡糖基转移酶。在某些实施方案中，葡糖基转移酶不具有或具有极小(小于1％的)的葡聚糖蔗糖酶活性、罗伊糖蔗糖酶活性、或交替糖蔗糖酶活性。本文的反应溶液可以包含例如一种、两种或更多种葡糖基转移酶。
本文的葡糖基转移酶可以是不依赖引物的或依赖引物的。不依赖引物的葡糖基转移酶不需要存在引物来实施葡聚糖合成。在葡聚糖聚合物合成期间，依赖引物的葡糖基转移酶需要反应溶液中存在引发分子充当酶引物。如本文所用的术语“引物”是指能够用作葡糖基转移酶的引发剂的任何分子。可以用在某些实施方案中的引物包括例如右旋糖酐和其它基于碳水化合物的引物，诸如水解的葡聚糖。用作引物的右旋糖酐可以是例如右旋糖酐T10(即，分子量为10kD的右旋糖酐)。
本文的葡糖基转移酶的示例可以具有本文所公开的任何氨基酸序列，且其还在N-末端和/或C末端包括1-300(或其中的任何整数[例如，10、15、20、25、30、35、40、45或50])个残基。此类附加残基可以来自得到葡糖基转移酶的相应野生型序列，或者可以是例如异源序列，诸如表位标记(在N-末端或C-末端)或异源信号肽(在N-末端)。
本文的葡糖基转移酶通常不含N-末端信号肽。用于产生本文的葡糖基转移酶的表达系统可以采用酶编码多核苷酸，如果需要，其还包含编码指导胞外分泌的N-末端信号肽的序列。在此类实施方案中，信号肽在分泌过程中从所述酶裂解。信号肽可以与葡糖基转移酶同源或异源。可用于本文中的信号肽的示例是一种来自细菌(例如，芽孢杆菌属菌种，诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis))或真菌菌种的信号肽。细菌信号肽的示例是aprE信号肽，诸如一种来自芽孢杆菌属的信号肽(例如，枯草芽孢杆菌，参见Vogtentanz等人，ProteinExpr.Purif.55：40-52，该文献以引用的方式并入本文)。
本文所公开的若干种葡糖基转移酶序列不含N-末端信号肽(以及可变结构域)(参考表1)。为了进行细胞内表达，已经向每条序列添加N-末端起始甲硫氨酸(氨基酸位置1)(表达的酶可以在例如细胞裂解液中得到)。本领域的技术人员应理解，可以任选地在起始甲硫氨酸与葡糖基转移酶序列之间添加居间异源氨基酸序列诸如表位和/或信号肽。因此，例如，本文的葡糖基转移酶可以包含这样的氨基酸序列，或由其组成：(i)与SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、59、60、61、62、63或64的从位置2开始的氨基酸序列具有100％同一性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，且(ii)具有葡糖基转移酶活性。
用于本文葡聚糖合成反应的葡糖基转移酶可以通过本领域内已知的任何方式制备。例如，葡糖基转移酶可以在异源表达系统中重组产生，诸如微生物异源表达系统。异源表达系统的示例包括细菌(例如，大肠杆菌，诸如TOP10或MG1655；芽孢杆菌属物种)和真核(例如，酵母，诸如毕赤酵母属物种(Pichia sp.)和酵母属物种(Saccharomyces sp.))表达系统。
在某些实施方案中，异源性基因表达系统可以是一种设计用于蛋白质分泌的表达系统。在此类实施方案中，葡糖基转移酶包含信号肽(信号序列)。信号肽可以是其天然信号肽或异源信号肽。
本文所述葡糖基转移酶可以以任何纯化状态(例如，纯化或非纯化)使用。例如，葡糖基转移酶可以在使用前纯化和/或分离。非纯化葡糖基转移酶的示例包括形式为细胞裂解液的那些葡糖基转移酶。细胞裂解液或提取物可以由用于异源表达酶的细菌(例如，大肠杆菌)制备。例如，细菌可以利用弗氏压碎器经受破坏。在另选的实施方案中，细菌可以借助匀化器(例如，APV、Rannie、Gaulin)匀化。葡糖基转移酶通常在这些类型的制剂中可溶。本文的细菌细胞裂解液、提取物、均化物可以在用于从蔗糖制备聚α-1，3-葡聚糖的反应溶液中以约0.15％-0.3％(v/v)使用。
本文葡糖基转移酶的活性可以利用本领域已知的任何方法测定。例如，葡糖基转移酶活性可以通过测量含蔗糖(50g/L)、右旋糖酐T10(1mg/mL)和磷酸钾缓冲液(pH 6.5，50mM)的反应溶液中的还原糖(果糖和葡萄糖)的产量来测定，其中将所述溶液保持在22-25℃下持续24-30小时。可以通过向含1N NaOH和0.1％氯化三苯基四唑的混合物中添加0.01mL反应溶液测量还原糖，然后监测OD480nm下的吸光度在五分钟内的增加来测量还原糖。
如果需要，可以控制本文的反应溶液的温度。在某些实施方案中，反应温度在介于约5℃至约50℃之间。在某些其它实施方案中，温度在介于约20℃至约40℃，或约20℃至约30℃之间(例如，约25℃)。
本文的反应溶液中的蔗糖的初始浓度可以为例如约20g/L至约400g/L。另选地，蔗糖的初始浓度可以为约75g/L至约175g/L，或约50g/L至约150g/L。另选地，蔗糖的初始浓度可以为例如约40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、110g/L、120g/L、130g/L、140g/L、150g/L或160g/L(或介于40g/L和160g/L之间的任何整数值)。“蔗糖的初始浓度”是指刚添加完所有反应溶液组分(至少水、不完全精制的蔗糖、gtf酶)后gtf反应溶液中的蔗糖浓度。反应溶液中的所有或一部分蔗糖可以来自添加到所述溶液中的不完全精制的蔗糖。虽然优选地是所有蔗糖都是不完全精制的，但是可以另外将白色精制蔗糖用于反应溶液中。
应理解，借助某些液体形式的不完全精制的蔗糖组合物(例如，甜菜稀汁、甜菜浓汁、糖蜜)，因此可将此类组合物添加到反应溶液中，以在特定反应体积中达到蔗糖的特定初始浓度。例如，可将来自糖用甜菜(例如，甜菜稀汁、甜菜浓汁、糖蜜)的不完全精制的蔗糖组合物稀释在反应溶液中，使得反应的初始蔗糖浓度为约70g/L-90g/L或80g/L-85g/L。
在某些实施方案中，葡聚糖合成反应的pH可以在介于约4.0至约8.0之间。另选地，pH可为约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0。可通过添加或掺入合适的缓冲液来调节或控制pH，包括但不限于磷酸盐、tris、柠檬酸盐或它们的组合。葡聚糖合成反应中的缓冲液浓度可为例如0mM至约100mM、或约10mM、20mM或50mM。可任选地将适量DTT(二硫苏糖醇，例如，约1.0mM)添加到反应溶液中。
本文的反应溶液可以包含在任何适合施加本文所公开的一个或多个反应条件的容器。例如，本文的反应溶液可以在尺寸适合容纳特定反应的不锈钢、塑料或玻璃容器中。此类容器可以任选地配备有搅拌装置。
适合进行本文反应溶液的其它条件和组分的示例公开在美国专利7000000和美国专利申请公布2013/0244288、2013/0244287、2013/0196384、2013/0157316和2014/0087431中，所有这些专利均以引用方式并入本文。
本公开的反应溶液的聚α-1，3-葡聚糖的收率是在反应溶液中转化为产物的蔗糖的重量的至少7％。另选地，聚α-1，3-葡聚糖的收率可为至少约8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％或47％。在某些实施方案中，聚α-1，3-葡聚糖在本文的反应溶液中的收率与通过对照反应溶液的聚α-1，3-葡聚糖的收率大致相同，在对照反应溶液中，使用白色精制蔗糖替代不完全精制的蔗糖。所有上述收率都可以利用保持在约20-30℃(例如，25℃)的温度下的反应溶液和/或利用含例如SEQ ID NO：8的gtf获得。这些实施方案中的某些实施方案可以使用浓甜菜汁或稀甜菜汁作为不完全精制的蔗糖。
在某些实施方案中，反应溶液的相对反应速率是至少约0.8，这是相对于包含水、白色精制蔗糖和葡糖基转移酶的反应溶液的反应速率而言。例如，反应溶液的相对反应速率是至少约0.8，这是相对于对照反应而言(即，本文的反应溶液的反应速率是对照反应的速率的至少80％)。本文的相对反应速率也可以是例如至少约0.82、0.84、0.86、0.88、0.90、0.92、0.94、0.96、0.98、1.00、1.02或1.04。反应溶液的反应速率可以依据在单位时间内每单位浓度的活性葡糖基转移酶下，反应物(例如，蔗糖)的浓度/量的变化和/或产物(例如，聚α-1，3-葡聚糖)的浓度/量的变化来表示。
本文的反应溶液可以制备L*值小于例如93的聚α-1，3-葡聚糖。另选地，由本文的反应溶液制备的聚α-1，3-葡聚糖的L*值可以小于92、90、88、86、84、82、80、78、76、74、72、70、68、66、64、62或60。本文的聚α-1，3-葡聚糖产物的L*值的范围的示例可为约82-87(例如，当反应溶液中使用甜菜稀汁或甜菜浓汁时)或80-82(例如，当反应溶液中使用VHP蔗糖时)。可以测定L*值，例如，对于已经从反应溶液去除的聚α-1，3-葡聚糖而言，在两次置换洗涤中用至少一半反应体积的水洗涤(例如，如果反应体积的2L，用至少一份1-L的水洗涤)，然后干燥、碾碎并经过60-目筛网筛分。干燥应该在不使聚α-1，3-葡聚糖变色的温度下进行。因此，聚α-1，3-葡聚糖的任何颜色都应该源自不完全精制的蔗糖。
本文的反应溶液产生具有至少50％的α-1，3糖苷键的聚α-1，3-葡聚糖。据信，在某些实施方案中，制备这样的聚α-1，3-葡聚糖，其中至少约60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或介于60％和100％之间的任何整数)的组成糖苷键是α-1，3键。因此，上述实施方案中制备的聚α-1，3-葡聚糖具有少于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或0％(或介于0％和50％之间的任何整数值)的非α-1，3糖苷键。
本文的聚α-1，3-葡聚糖产物的糖苷键分布可以利用本领域已知的任何方法测定。例如，键分布可以利用使用核磁共振(NMR)光谱法(例如，13C NMR或1H NMR)的方法测定。这些方法和可以使用的其它方法公开在Food Carbohydrates：Chemistry，Phsical Properties，and Applications(S.W.Cui编辑，第3章，S.W.Cui，Structural Analysis ofPolysaccharides，Taylor&Francis Group LLC，Boca Raton，FL，2005)中，所述文献以引用方式并入本文。
本文的反应溶液产生以DPn或DPw计的分子量为至少约100的聚α-1，3-葡聚糖。另选地，本文的反应溶液中制备的聚α-1，3-葡聚糖可以具有以DPn或DPw计为至少约400的分子量。另选地，聚α-1，3-葡聚糖可以具有以DPn或DPw计为至少约100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000(或介于100和1000之间的任何整数)的分子量。
本文的聚α-1，3-葡聚糖的分子量可以利用本领域已知的若干方法中的任一种测量。例如，葡聚糖聚合物的分子量可以利用高压液相色谱法(HPLC)、尺寸排阻色谱法(SEC)或凝胶渗透色谱法(GPC)测量。
本公开还涉及一种用于制备聚α-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括使至少水、蔗糖和葡糖基转移酶接触的步骤，其中蔗糖是未精制或部分精制的(即，不完全精制的)。这种方法中制备的，且可任选地分离的聚α-1，3-葡聚糖具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的重均聚合度(DPw)。另外，所述方法中制备的聚α-1，3-葡聚糖的收率是通过与水和葡糖基转移酶接触转化为产物的蔗糖的重量的至少7％。如上文和实施例中所公开的本文反应溶液的任何特征都可以表征所述方法。所述方法的以下特征是示例。
在所述方法的某些实施方案中，不完全精制的蔗糖可以来自糖用甜菜(例如，甜菜稀汁或甜菜浓汁)且尚未结晶。在另一个示例中，不完全精制的蔗糖来自甘蔗(例如，原蔗糖、VHP或VVHP蔗糖)且已经具有不超过两个或三个结晶步骤。
所公开的方法中使用的不完全精制的蔗糖可以具有大于例如150的ICUMSA值。
所述方法的某些实施方案中制备的聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。可以针对例如已经从反应溶液去除的聚α-1，3-葡聚糖测定本文的L*值；任选地用水洗涤一次、两次或更多次；并干燥。
所述方法的接触步骤中制备聚α-1，3-葡聚糖的相对反应速率为至少0.8，这是相对于使用白色精制蔗糖替代不完全精制蔗糖时的反应速率而言。
本公开的方法包括使至少水、不完全精制的蔗糖和葡糖基转移酶接触。该接触步骤可以包括提供包含水、不完全精制的蔗糖和葡糖基转移酶的反应溶液。应当理解，当葡糖基转移酶合成聚α-1，3-葡聚糖时，考虑到不溶性聚α-1，3-葡聚糖从溶液中析出，如反应变浑浊所指示，反应溶液变成反应混合物。本公开的方法的接触步骤可以以任意种方式进行。例如，可以首先将所需量的不完全精制的蔗糖溶解或混合在水(任选地，也可以在这个制备阶段添加其它组分，诸如缓冲液组分)中，接着添加葡糖基转移酶。溶液可以保持静置，或经由例如搅拌或回转式振荡搅动。反应可以是且通常是不含细胞的。
在某些实施方案中，可以通过视觉地(不溶性聚α-1，3-葡聚糖不再累积)和/或通过测量溶液中留下的蔗糖的量(残余蔗糖)确定反应的完成，其中蔗糖消耗百分比超过约90％可以视为反应完成。通常，本发明所公开的工艺的反应将需要约12、24、36、48、60、72、84或96小时完成，这取决于某些参数，诸如用于所述反应中的蔗糖和葡糖基转移酶的量。
在本文所公开的方法的某些实施方案中，反应的蔗糖消耗百分比是起初接触水和葡糖基转移酶的蔗糖的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。另选地，蔗糖消耗百分比可以＞90％或＞95％。
在本文的葡聚糖合成方法的一些方面中制备的聚α-1，3-葡聚糖的收率基于所述反应中转化的蔗糖的重量计可为至少约7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％或47％。
可以任选地分离本公开的方法中制备的聚α-1，3-葡聚糖。例如，可以通过离心或过滤分离不溶性聚α-1，3-葡聚糖。这样，分离大部分反应溶液的聚α-1，3-葡聚糖，所述反应溶液可包含水、果糖和某些副产物(例如，明串珠菌二糖、可溶性低聚糖DP2-DP7)。该溶液也可包含残余蔗糖和果糖单体。分离还可以任选地包括用水洗涤聚α-1，3-葡聚糖一次、两次或更多次，和/或干燥聚α-1，3-葡聚糖。
本公开还涉及通过本文所公开的反应溶液或方法制备的聚α-1，3-葡聚糖。这种聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。如上文和实施例中所公开的聚α-1，3-葡聚糖的任何特征都可以表征该实施方案的聚α-1，3-葡聚糖。以下特征是示例。
可以分离本文的聚α-1，3-葡聚糖产物，且可以任选地以例如干燥形式提供。在某些实施方案中，聚α-1，3-葡聚糖产物是以至少1克(例如，至少100g或500g)的分离的干燥量提供。“干燥”聚α-1，3-葡聚糖包含不超过例如2.0重量％、1.5重量％、1.0重量％、0.5重量％、0.25重量％、0.10重量％、0.05重量％或0.01重量％的水。
据信，在某些实施方案中，聚α-1，3-葡聚糖产物可包含以下化合物中的一种或多种：焦糖、蛋白黑素、己糖碱性降解产物(HADP)(在碱性条件下形成的聚合C6糖缩合产物)、多酚-铁络合物(例如，铁儿茶酚络合物)、黑色素。据信，与仅使用白色精制蔗糖的反应溶液赋予聚α-1，3-葡聚糖产物的着色(如果有的话)相比，这些化合物中的一种或多种还为聚α-1，3-葡聚糖产物提供更深的着色。此类着色差异可以利用例如L*值测定。
本文所公开的组合物和方法的非限制性示例包括：
1.一种反应溶液，所述反应溶液包含水、蔗糖和葡糖基转移酶，所述反应溶液合成不溶性聚α-1，3-葡聚糖，其具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的重均聚合度(DPw)，其中所述蔗糖是未精制或部分精制的；
其中所述反应溶液的聚α-1，3-葡聚糖的收率是在所述反应溶液中转化为产物的蔗糖的重量的至少7％。
2.根据实施方案1所述的反应溶液，其中所述蔗糖来自糖用甜菜，并且尚未结晶。
3.根据实施方案1所述的反应溶液，其中所述蔗糖来自甘蔗，并且(i)尚未结晶，或(ii)已经利用不超过三个结晶步骤结晶。
4.根据实施方案1、3或3所述的反应溶液，其中所述蔗糖具有大于150的ICUMSA值。
5.根据实施方案1、2、3或4所述的反应溶液，其中所述反应溶液的相对反应速率为至少0.8，这是相对于包含水、白色精制蔗糖和葡糖基转移酶的反应溶液的反应速率而言。
6.根据实施方案1、2、3、4或5所述的反应溶液，其中由所述反应溶液制备的聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。
7.根据实施方案1、2、3、4、5或6所述的反应溶液，其中所述葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：34具有至少90％同一性的氨基酸序列。
8.一种用于制备不溶性聚α-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括：
(a)使至少水、蔗糖和葡糖基转移酶接触，其中所述蔗糖是未精制或部分精制的，
由此制备聚α-1，3-葡聚糖，其具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的重均聚合度(DPw)；以及
b)任选地，分离步骤(a)中制备的聚α-1，3-葡聚糖；
其中聚α-1，3-葡聚糖的收率是在步骤(a)中转化为产物的蔗糖的重量的至少7％。
9.根据实施方案8所述的方法，其中所述蔗糖来自糖用甜菜，并且尚未结晶。
10.根据实施方案8所述的方法，其中所述蔗糖来自甘蔗，并且(i)尚未结晶，或(ii)已经利用不超过三个结晶步骤结晶。
11.根据实施方案8、9或10所述的方法，其中所述蔗糖具有大于150的ICUMSA值。
12.根据实施方案8、9、10或11所述的方法，其中步骤(a)中制备聚α-1，3-葡聚糖的相对反应速率是至少0.8，这是相对于使用白色精制蔗糖替代所述未精制或部分精制的蔗糖时的步骤(a)的反应速率而言。
13.根据实施方案8、9、10、11或12所述的方法，其中步骤(b)中分离的聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。
14.根据实施方案8、9、10、11、12或13所述的方法，其中所述葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：34具有至少90％同一性的氨基酸序列。
15.一种通过根据实施方案8、9、10、11、12、13或14所述的方法制备的分离的聚α-1，3-葡聚糖，其中所述聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。
实施例
本公开还在下文提供的实施例2-12中进一步举例说明。应该理解，尽管这些实施例说明了本文的某些优选方面，但仅是以例证的方式给出的。通过上述论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明所公开的实施方案的必要特征，并且在不脱离其实质和范围的前提下，可对本发明所公开的实施方案进行各种变化和修改以适应多种用途和条件。
一般方法
蔗糖ICUMSA测量
密切根据ICUMSA方法GS1/3-7进行ICUMSA测量(R.J.McCowage、R.M.Urquhart和M.L.Burge(Determination of the Solution Colour of Raw Sugars，Brown Sugars and Coloured Syrups at pH 7.0-Official，Verlag Dr Albert Bartens，2011版)，该文献以引用的方式并入本文。蔗糖样品的ICUMSA颜色测量的基本步骤如下。将蔗糖添加至到离子水(如果是固体形式诸如蔗糖被溶解，如果是液体形式诸如甜菜汁被稀释)中至基于预期ICUMSA范围的指定浓度，如ICUMSA方法GS1/3-7中所指定。过滤蔗糖溶液，以去除任何未溶解的杂质，并测量过滤后的蔗糖溶液的吸光度。然后根据公式1计算溶液的ICUMSA颜色：
其中吸光度(Abs)＝样品溶液吸光度读数；b＝光学单元路径(cm)；c＝蔗糖浓度，以g/mL计。
上文ICUMSA方法沿循ICUMSA方法GS1/3-7，但作了以下修改：
1.使用醋酸纤维素0.45-微米过滤器(正方形50mm)替代硝酸纤维素0.45-微米过滤器。
2.不计算RDS(“折光干物质”)和密度，通过以下步骤测定样品的蔗糖浓度：利用折射计测量有效ppt盐度，并利用从公布的数据获得的线性关系转化为％Brix(％Brix＝0.1258ppt盐度+0.0152)。对另外稀释的样品进行折射率测量，并将Brix值变回用于UV测量的标准浓度。
使用去离子水溶解蔗糖。蔗糖溶液样品未脱气，因为溶液中没观察到泡沫或气泡。将醋酸纤维素过滤器预先放置在用于无菌过滤应用的塑料漏斗中。
聚α-1，3-葡聚糖的L*a*b*颜色测量
利用CIE L*a*b*测量系统测量聚α-1，3-葡聚糖颜色。两种样品制备方法的使用取决于可用聚α-1，3-葡聚糖的量。两种方法得出相同L*a*b*测量值。
在第一方法中，在咖啡研磨机中将干燥的聚α-1，3-葡聚糖磨成细粉。将0.77g粉末转移至可排空的13-mm KBr制粒模，并在7000磅下使聚α-1，3-葡聚糖形成颗粒。利用KonicaMinolta 2600D分光光度计测量颗粒颜色。
在第二方法中，在咖啡研磨机中将干燥聚α-1，3-葡聚糖磨成细粉。使研磨过的聚α-1，3-葡聚糖经过60-目筛网筛分，并填充到1-cm比色管中。利用HUNTERLAB COLORQUESTXE分光光度计测量研磨过的聚α-1，3-葡聚糖的颜色。
制备葡糖基转移酶(gtf)的粗提物
如下制备gtf酶(例如，SEQ ID NO：8))。用含特定gtf-编码DNA序列的基于的构建体使大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad California)转化。每条序列经密码子优化以在大肠杆菌中表达gtf酶。使表达特定gtf酶的单个的大肠杆菌菌株在37℃的含氨苄青霉素(100μg/mL)的LB(Luria发酵液)培养基(Becton，Dickinson and Company，Franklin Lakes，NJ)中生长，同时振荡，至OD600＝0.4-0.5，此时添加IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷，Cat.No.I6758，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，至最终浓度为0.5mM。IPTG诱导后，在37℃下培养培养物2-4小时。通过以5,000×g离心15分钟收获细胞，并将细胞(以20％重量体积比)重悬于补充有二硫苏糖醇(DTT，1.0mM)的50mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中。使得重悬细胞两次通过弗氏压碎器(SLM Instruments，Rochester，NY)以确保＞95％的细胞裂解。在4℃下以12,000×g对裂解细胞离心30分钟。通过BCA(二喹啉甲酸)蛋白质分析(Sigma-Aldrich)和SDS-PAGE分析所得上清液，以确认表达gtf酶，并将上清液保存在-20℃下。
Gtf的相对反应速率
蔗糖通过葡糖基转移酶得到聚α-1，3-葡聚糖的酶促反应遵循Michaelis-Menten动力学。在高蔗糖浓度下，蔗糖的反应速率是零阶。在整个反应期间通过HPLC定期测量蔗糖浓度。将反应速率计算为零阶反应期间蔗糖消耗速率。即，将反应速率计算为蔗糖浓度-时间图的线性区域的负斜率。然后反应速率除以加载到反应器的酶活性，得到归一化反应速率，这消除了因为酶浓度变动引起的反应速率差异。最后，归一化反应速率除以白色精制糖的归一化反应速率，得到相对反应速率。
测定Gtf酶活性
按照诸如以下的方案确认gtf酶(例如，SEQ ID NO：8)活性，所述方案测量gtf反应溶液中的还原糖(果糖和葡萄糖)的产量。通过将gtf粗提物添加到含蔗糖(50g/L或150g/L)、磷酸钾缓冲液(pH 6.5，50mM)和任选的右旋糖酐(1mg/mL，右旋糖酐T10，Cat.No.D9260，Sigma-Aldrich)的混合物中制备反应溶液；添加gtf提取物至2.5体积％-5体积％。然后在22℃-25℃下培养反应溶液24-30小时，然后进行离心。将上清液(0.01mL)添加至包含1NNaOH和0.1％氯化三苯基四唑(Sigma-Aldrich)的混合物中。温育混合物五分钟，然后利用ULTROSPEC分光光度计(Pharmacia LKB，New York，NY)测定其OD480nm，以估计还原糖果糖和葡萄糖的存在。
测定重均聚合度(DP W )
利用尺寸排阻色谱法(SEC)测定通过gtf酶(例如，SEQ ID NO：8)合成的葡聚糖产物的DPW。示例性SEC方案如下。以5mg/mL将干燥聚α-1，3-葡聚糖聚合物溶解于N，N-二甲基-乙酰胺(DMAc)和5％LiCl，同时在100℃下振荡过夜。SEC系统是来自Waters Corporation(Milford，MA)的耦接三个在线检测器的AllianceTM2695分离模块：来自Waters的差示折射计2410、来自Wyatt Technologies(Santa Barbara，CA)的多角度散光光度计HeleosTM8+和来自Wyatt的差示毛细管粘度计ViscoStarTM。用于SEC的柱是四个来自Shodex(Japan)的苯乙烯-二乙烯基苯柱和两个线性KD-806M、KD-802和KD-801柱，以改善在聚合物分布的低分子量区域下的分辨率。移动相是具有0.11％LiCl的DMAc。所用的色谱分离条件是50℃柱和检测器隔室，40℃样品和注射器隔室，流量0.5mL/min，和注射体积100μL。用于数据还原的软件包是来自Waters的EmpowerTM版本3(用广泛葡聚糖聚合物标准进行校正)和来自Wyatt的版本6(具有柱校正的三重检测方法)。
测定糖苷键
由gtf酶(例如，SEQ ID NO：8)合成的葡聚糖产物中的糖苷键可以按照诸如以下的13C NMR(核磁共振)测定。在50℃下在搅拌下将干燥葡聚糖聚合物(25-30mg)溶解于1mL含3重量％LiCl的氘代二甲基亚砜(DMSO)。利用玻璃吸移管，将0.8mL溶液转移至5-mm NMR管中。利用配备有CPDUL冷冻探针的Bruker Avance 500-MHz NMR光谱仪(Billerica，MA)，在125.76MHz的光谱频率下，利用26041.7Hz的光谱窗采集定量13C NMR光谱。利用waltz解耦的反向门控解耦脉冲序列，采集时间为0.629秒，脉冲间延迟为5秒，并且脉冲为6000。利用2.0Hz的指数倍增转化时域数据。
实施例1(比较例)
利用白色精制蔗糖制备聚α-1，3-葡聚糖
该实施例描述在gtf-催化的反应中利用白色精制蔗糖制备α-1，3-葡聚糖。
80g/L蔗糖溶液如下制备。将1500g去离子水充入控制在23℃下的带夹套搅动的2-L玻璃反应器中。将2.7g KH2PO4缓冲液加入到反应器中。接下来，将160g白色精制蔗糖(ICUMSA 47；United Sugars Corporation，Bloomington，MN)添加至反应器，此后，用更多去离子水将反应器中的体积调节至2L。然后添加(DuPont)(1mL/L反应)，并利用5重量％氢氧化钠水溶液或5重量％硫酸水溶液将pH调节至5.5。通过添加0.3体积％gtf酶(SEQ ID NO：8)粗提物(一般方法)引发葡聚糖聚合反应，并保持在23℃下。
通过完全消耗蔗糖或测量间的蔗糖浓度无变化确定反应完成后，利用FILTRATEST(Bokela GmbH Karlsruhe，Germany)过滤200mL反应浆液。此过滤操作使母液(滤液)与聚α-1，3-葡聚糖湿饼分离。用去离子水两次置换洗涤(每次200-L)洗出湿饼中的残余糖。然后在80℃下将湿饼在对流烘箱中干燥约24小时。用干燥聚合物的最终重量除以反应的蔗糖量计算聚合收率。
通过SEC(一般方法)测量聚α-1，3-葡聚糖产物的分子量，并表示为DPW(表2)，计算方法为用平均聚合物分子量除以单体分子量。根据一般方法测量干燥葡聚糖聚合物产物的颜色，并在表2中表示为L*。
实施例2
利用VHP蔗糖制备聚α-1，3-葡聚糖
该实施例描述在gtf-催化的反应中利用VHP制备α-1，3-葡聚糖，VHP是一类不完全精制的蔗糖。
遵循实施例1的聚合过程，不同的是使用VHP蔗糖(ICUMSA 501，Iracema Mill，Brazil)替代白色精制蔗糖。
通过完全消耗蔗糖或测量间的蔗糖浓度无变化确定反应完成后，利用布氏漏斗和真空烧瓶过滤反应浆液。此过滤操作使母液(滤液)与聚α-1，3-葡聚糖湿饼分离。用去离子水两次置换洗涤(每次1-L)洗出湿饼中的残余糖。然后在40℃和360mm Hg下将湿饼在真空烘箱中干燥约48小时。用干燥聚合物的最终重量除以反应的蔗糖量计算聚合收率。该过程中制备的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和颜色呈现在表2中。
因此，可以在含不完全精制的蔗糖的gtf反应溶液中合成聚α-1，3-葡聚糖。
实施例3
利用VVHP蔗糖制备聚α-1，3-葡聚糖
该实施例描述在gtf-催化的反应中利用VVHP制备α-1，3-葡聚糖，VVHP是一类不完全精制的蔗糖。
遵循实施例2的聚合和聚合物分离过程，不同的是使用VVHP蔗糖(ICUMSA 421，Ferrari Mill，Brazil)替代VHP蔗糖。这个过程中制备的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和颜色呈现在表2中。
因此，可在包含不完全精制的蔗糖的gtf反应溶液中合成聚α-1，3-葡聚糖。
实施例4
利用甜菜浓汁制备聚α-1，3-葡聚糖
该实施例描述在gtf-催化的反应中利用甜菜浓汁制备α-1，3-葡聚糖，甜菜浓汁是一类不完全精制的蔗糖。
总体上遵循实施例2的聚合和聚合物分离过程，不同的是使用甜菜浓汁蔗糖(ICUMSA 1414，Southern Minnesota Beet Sugar Cooperative)替代VHP蔗糖。聚合过程如下进行。将235g甜菜浓汁添加到反应器中，并用去离子水稀释，直到蔗糖浓度为80g/L(添加约1765mL水)。添加2.72g KH2PO4缓冲液，并用5重量％氢氧化钠将pH调节至5.5。通过添加0.3体积％gtf酶(SEQ ID NO：8)粗提物(一般方法)引发葡聚糖聚合反应，并保持在23℃下。该过程中制备的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和颜色呈现在表2中。
因此，可在包含不完全精制的蔗糖的gtf反应溶液中合成聚α-1，3-葡聚糖。
实施例5
利用甜菜稀汁制备聚α-1，3-葡聚糖
该实施例描述在gtf-催化的反应中利用甜菜稀汁制备α-1，3-葡聚糖，甜菜稀汁是一类不完全精制的蔗糖。
总体上遵循实施例2的聚合和聚合物分离过程，不同的是使用甜菜稀汁蔗糖(ICUMSA 1158，Southern Minnesota Beet Sugar Cooperative)替代VHP蔗糖，且一次1-L洗涤后接着500-mL水洗涤，而不是两次1-L洗涤。将1229mL甜菜稀汁添加至771mL去离子水，以制备80g/L的起始蔗糖浓度。添加2.72g KH2PO4缓冲液，并用5重量％硫酸将pH调节至5.5。通过添加0.3体积％gtf酶(SEQ ID NO：8)粗提物(一般方法)引发葡聚糖聚合反应，并保持在23℃下。该过程中制备的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和颜色呈现在表2中。
因此，可在包含不完全精制的蔗糖的gtf反应溶液中合成聚α-1，3-葡聚糖。
实施例6
利用甜菜糖蜜制备聚α-1，3-葡聚糖
该实施例描述在gtf-催化的反应中利用甜菜糖蜜制备α-1，3-葡聚糖，甜菜糖蜜是一类不完全精制的蔗糖。
总体上遵循实施例2的聚合和聚合物分离过程，不同的是使用甜菜糖蜜(ICUMSA57781，Southern Minnesota Beet Sugar Cooperative)替代VHP蔗糖，并且使用三次1-L水洗涤替代两次1-L洗涤。将291mL甜菜糖蜜添加至1709mL去离子水，以制备83.4g/L的起始蔗糖浓度。添加2.72g KH2PO4缓冲液，并用5重量％氢氧化钠将pH调节至5.5。通过添加0.3体积％gtf酶(SEQ ID NO：8)粗提物(一般方法)引发葡聚糖聚合反应，并保持在23℃下。该过程中制备的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和颜色呈现在表2中。
因此，可在包含不完全精制的蔗糖的gtf反应溶液中合成聚α-1，3-葡聚糖。
实施例7
利用巴西原蔗糖制备聚α-1，3-葡聚糖
该实施例描述在gtf-催化的反应中利用巴西原蔗糖制备α-1，3-葡聚糖，巴西原蔗糖是一类不完全精制的蔗糖。
在一个1-升锥形瓶中，将75g巴西原蔗糖(ICUMSA 2655)溶解于约500mL去离子水中。添加1.02g KH2PO4和0.15mL此后添加水，直到体积为750mL。使用5重量％氢氧化钠将pH调节至5.5。将烧瓶置于25℃温育搅拌烘箱中。通过添加0.3体积％gtf酶(SEQID NO：8)粗提物(一般方法)引发葡聚糖聚合反应，并保持在25℃下。反应在30小时内完成。反应完成后，用布氏漏斗和真空烧瓶过滤反应。用两次800-mL水洗涤和一次200-mL水洗涤对所得滤饼进行置换洗涤。在40℃真空烘箱中干燥聚α-1，3-葡聚糖。该过程中制备的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和颜色呈现在表2中。
因此，可在包含不完全精制的蔗糖的gtf反应溶液中合成聚α-1，3-葡聚糖。
实施例8
利用新奥尔良原蔗糖制备聚α-1，3-葡聚糖
这个实施例描述在gtf-催化的反应中利用新奥尔良原蔗糖制备α-1，3-葡聚糖，新奥尔良原蔗糖是一类不完全精制的蔗糖。
遵循实施例7的聚合和聚合物分离过程，不同的是使用新奥尔良原蔗糖(ICUMSA2850)作为蔗糖组分。该过程中制备的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和颜色呈现在表2中。
因此，可在包含不完全精制的蔗糖的gtf反应溶液中合成聚α-1，3-葡聚糖。
实施例9
利用莫桑比克原蔗糖制备聚α-1，3-葡聚糖
该实施例描述在gtf-催化的反应中利用莫桑比克原蔗糖制备α-1，3-葡聚糖，莫桑比克原蔗糖是一类不完全精制的蔗糖。
遵循实施例7的聚合和聚合物分离过程，不同的是使用莫桑比克原蔗糖(ICUMSA3022)作为蔗糖组分。该过程中制备的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和颜色呈现在表2中。
因此，可在包含不完全精制的蔗糖的gtf反应溶液中合成聚α-1，3-葡聚糖。
实施例10
利用津巴布韦原蔗糖制备聚α-1，3-葡聚糖
该实施例描述在gtf-催化的反应中利用津巴布韦原蔗糖制备α-1，3-葡聚糖，津巴布韦原蔗糖是一类不完全精制的蔗糖。
遵循实施例7的聚合和聚合物分离过程，不同的是使用津巴布韦原蔗糖(ICUMSA4183)作为蔗糖组分。该过程中制备的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和颜色呈现在表2中。
因此，可在包含不完全精制的蔗糖的gtf反应溶液中合成聚α-1，3-葡聚糖。
实施例11
利用伯利兹原蔗糖制备聚α-1，3-葡聚糖
该实施例描述在gtf-催化的反应中利用伯利兹原蔗糖制备α-1，3-葡聚糖，伯利兹原蔗糖是一类不完全精制的蔗糖。
遵循实施例7的聚合和聚合物分离过程，不同的是使用伯利兹原蔗糖(ICUMSA5150)作为蔗糖组分。该过程中制备的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和颜色呈现在表2中。
因此，可在包含不完全精制的蔗糖的gtf反应溶液中合成聚α-1，3-葡聚糖。
实施例12
利用圭亚那原蔗糖制备聚α-1，3-葡聚糖
该实施例描述在gtf-催化的反应中利用圭亚那原蔗糖制备α-1，3-葡聚糖，圭亚那原蔗糖是一类不完全精制的蔗糖。
遵循实施例7的聚合和聚合物分离过程，不同的是使用圭亚那原蔗糖(ICUMSA8153)作为蔗糖组分。该过程中制备的聚α-1，3-葡聚糖的分子量、收率和颜色呈现在表2中。
因此，可在包含不完全精制的蔗糖的gtf反应溶液中合成聚α-1，3-葡聚糖。
表2
利用各类不完全精制的蔗糖制备聚α-1，3-葡聚糖
a实施例2-12中的相对反应速率是相对于实施例1中的反应速率计算的。
b该L*是针对遵循实施例1过程制备的聚合物测定，不同的是使用500-mL反应替代2-L，且产物在40℃和360mm Hg烘箱中干燥约48小时。
表2中的数据总体上表明，包含不完全精制的蔗糖的gtf反应溶液(实施例2-12)可表现出水平与包含白色精制蔗糖的gtf反应溶液(实施例1)相比相同或甚至更佳的水平。大多数情况下，包含不完全精制的蔗糖的反应的反应速率接近或完全等同于包含白色精制蔗糖的反应的速率。同样，包含不完全精制的蔗糖的若干反应产生DPW和/或收率大于利用白色精制蔗糖观察到的DPW和/或收率的葡聚糖(例如，实施例2-6)。
因此，可以使用多种不同类型的不完全精制的蔗糖以用酶促方法制备聚α-1，3-葡聚糖。

Claims (15)

1.一种反应溶液，所述反应溶液包含水、蔗糖和葡糖基转移酶，所述反应溶液合成不溶性聚α-1，3-葡聚糖，其具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的重均聚合度(DPw)，其中所述蔗糖是未精制或部分精制的；其中所述反应溶液的聚α-1，3-葡聚糖的收率是在所述反应溶液中转化为产物的蔗糖的重量的至少7％。
2.根据权利要求1所述的反应溶液，其中所述蔗糖来自糖用甜菜，并且尚未结晶。
3.根据权利要求1所述的反应溶液，其中所述蔗糖来自甘蔗，并且(i)尚未结晶，或(ii)已经利用不超过三个结晶步骤结晶。
4.根据权利要求1所述的反应溶液，其中所述蔗糖具有大于150的ICUMSA值。
5.根据权利要求1所述的反应溶液，其中所述反应溶液的相对反应速率为至少0.8，这是相对于包含水、白色精制蔗糖和所述葡糖基转移酶的反应溶液的反应速率而言。
6.根据权利要求1所述的反应溶液，其中由所述反应溶液制备的聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。
7.根据权利要求1所述的反应溶液，其中所述葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：4、SEQID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQID NO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：34具有至少90％同一性的氨基酸序列。
8.一种用于制备不溶性聚α-1，3-葡聚糖的方法，所述方法包括：
(a)使至少水、蔗糖和葡糖基转移酶接触，其中所述蔗糖是未精制或部分精制的，
由此制备聚α-1，3-葡聚糖，其具有至少50％的α-1，3糖苷键和至少100的重均聚合度(DPw)；以及
b)任选地，分离步骤(a)中制备的聚α-1，3-葡聚糖；
其中聚α-1，3-葡聚糖的收率是在步骤(a)中转化为产物的蔗糖的重量的至少7％。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述蔗糖来自糖用甜菜，并且尚未结晶。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述蔗糖来自甘蔗，并且(i)尚未结晶，或(ii)已经利用不超过三个结晶步骤结晶。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述蔗糖具有大于150的ICUMSA值。
12.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(a)中制备聚α-1，3-葡聚糖的相对反应速率是至少0.8，这是相对于使用白色精制蔗糖替代所述未精制或部分精制蔗糖时的步骤(a)的反应速率而言。
13.根据权利要求8所述的方法，其中步骤(b)中分离的聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。
14.根据权利要求8所述的方法，其中所述葡糖基转移酶包含与SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30或SEQ ID NO：34具有至少90％同一性的氨基酸序列。
15.一种通过根据权利要求8所述的方法制备的分离的聚α-1，3-葡聚糖，其中所述聚α-1，3-葡聚糖具有小于93的L*值。
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