BR112016021909B1 - Solução de reação e método para produção do póli alfa1,3-glucano insolúvel - Google Patents

Abstract

SOLUÇÃO DE REAÇÃO, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE PÓLI ALFA-1,3- GLUCANO INSOLÚVEL E PÓLI ALFA- 1,3-GLUCANO ISOLADO. São descritas neste documento soluções de reação que compreendem água, sacarose incompletamente refinada e uma enzima glicosiltransferase que sintetiza póli alfa-1,3-glucano insolúvel com pelo menos 50% de ligações alfa-1,3 glicosídicas e grau de polimerização médio em peso (DPw) de pelo menos 100. O rendimento de póli alfa-1,3- glucano por uma solução de reação neste documento é de pelo menos 7% do peso da sacarose que foi convertida na solução de reação. Também são descritos métodos de produção de póli alfa-1,3-glucano com o uso de sacarose incompletamente refinada e póli alfa-1,3-glucano produzido por esses métodos.

Description

[001] O presente pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório Norte-Americano N° 61/969.958 (depositado em 25 de março de 2014), o qual é integralmente incorporado ao presente como referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção encontra-se no campo de síntese de polissacarídeos. A presente invenção refere-se, por exemplo, à produção de póli alfa- 1,3-glucano insolúvel utilizando sacarose que não é completamente refinada.

REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS DEPOSITADA ELETRONICAMENTE

[003] A cópia oficial da listagem de sequência é apresentada eletronicamente via EFS-Web na forma de listagem de sequências em formatação ASCII com o nome de arquivo 20150324_CL6221USNP_SequenceListing criado em 16 de março de 2015 e com tamanho de 569 kilobytes, depositado simultaneamente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida neste documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo e é integralmente incorporado ao presente como referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] Conduzidos pelo desejo de encontrar novos polissacarídeos estruturais com o uso de sínteses enzimáticas ou engenharia genética de micro-organismos, pesquisadores descobriram polissacarídeos que são biodegradáveis e podem ser elaborados economicamente a partir de matérias-primas de fontes renováveis. Um desses polissacarídeos é póli alfa-1,3-glucano, um polímero de glucano caracterizado por ter ligações alfa-1,3-glicosídicas.

[005] Póli alfa-1,3-glucano foi isolado colocando em contato uma solução aquosa de sacarose com uma enzima glicosiltransferase (gtf) isolada de Streptococcus salivarius (Simpson et al, Microbiology (141: 1451-1460, 1995). A Patente Norte-Americana 7.000.000 descreveu a preparação de uma fibra de polissacarídeos utilizando uma enzima de S. salivarius gtfJ. Pelo menos 50% das unidades hexose dentro do polímero desta fibra foram ligadas por meio de ligações alfa-1,3-glicosídicas. O polímero descrito formou uma solução líquida cristalina quando dissolvido acima de uma concentração crítica em um solvente ou em uma mistura que compreende um solvente. A partir desta solução, fibras resistentes contínuas similares a algodão e altamente adequadas para uso em tecidos foram fiadas e utilizadas.

[006] A síntese enzimática de póli alfa-1,3-glucano foi realizada anteriormente com o uso de sacarose branca e refinada. Como esta forma de sacarose é relativamente cara, é desejável desenvolver novos processos enzimáticos de síntese de póli alfa-1,3-glucano com o uso de sacarose que não é refinada ou, de outra forma, é incompletamente refinada.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[007] Em uma realização, o relatório descritivo refere-se a uma solução de reação que compreende água, sacarose e uma enzima glicosiltransferase que sintetiza póli alfa-1,3-glucano insolúvel com pelo menos 50% de ligações alfa-1,3- glicosídicas e um grau de polimerização médio em peso (DPw) de pelo menos 100, em que a sacarose não é refinada ou é parcialmente refinada. O rendimento de póli alfa-1,3-glucano pela solução de reação é de pelo menos 7% do peso de sacarose que foi convertido em produtos na solução de reação.

[008] Em outra realização da solução de reação, a sacarose é de beterraba e não foi cristalizada.

[009] Em outra realização da solução de reação, a sacarose é de cana de açúcar e (i) não foi cristalizada, ou (ii) foi cristalizada com o uso de não mais de três etapas de cristalização.

[010] Em outra realização da solução de reação, a sacarose possui valor ICUMSA de mais de 150.

[011] Em outra realização da solução de reação, a taxa de reação relativa da solução de reação é de pelo menos 0,8 com relação à taxa de reação de uma solução de reação que compreende água, sacarose refinada branca e a enzima glicosiltransferase.

[012] Em outra realização da solução de reação, o póli alfa-1,3-glucano produzido pela solução de reação possui valor L* menor que 93.

[013] Em outra realização, a enzima glicosiltransferase compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30 ou SEQ ID N° 34.

[014] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um método de produção de póli alfa-1,3-glucano que compreende a etapa de contato de água, sacarose e uma enzima glicosiltransferase, em que a sacarose não é refinada ou é parcialmente refinada. O póli alfa-1,3-glucano produzido na etapa de contato possui pelo menos 50% de ligações alfa-1,3-glicosídicas e grau de polimerização médio em peso (DPw) de pelo menos 100. O rendimento de póli alfa-1,3-glucano produzido no método é de pelo menos 7% do peso da sacarose que foi convertida em produtos na etapa de contato. O método compreende opcionalmente o isolamento do póli alfa- 1,3-glucano produzido na etapa de contato.

[015] Em outra realização, a sacarose utilizada no método é de beterraba e não foi cristalizada.

[016] Em outra realização, a sacarose utilizada no método é de cana de açúcar e (i) não foi cristalizada, ou (ii) foi cristalizada com o uso de não mais de três etapas de cristalização.

[017] Em outra realização, a sacarose utilizada no método possui valor ICUMSA de mais de 150.

[018] Em outra realização, a taxa de reação relativa de produção de póli alfa-1,3-glucano na etapa de contato do método é de pelo menos 0,8 com relação à taxa de reação da etapa de contato se sacarose refinada branca for utilizada no lugar de sacarose não refinada ou parcialmente refinada.

[019] Em outra realização, o póli alfa-1,3-glucano opcionalmente isolado no método possui valor L* de menos de 93.

[020] Em outra realização, a enzima glicosiltransferase utilizada no método compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30 ou SEQ ID N° 34.

[021] Em outra realização, a presente invenção refere-se a póli alfa-1,3- glucano isolado produzido por meio do método acima, em que o póli alfa-1,3-glucano possui valor L* de menos de 93.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS TABELA 1

[022] Resumo dos números de identificação de sequências de ácido nucleico e proteína:

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[023] As revelações de toda a literatura de patentes e não de patentes mencionadas são integralmente incorporadas ao presente como referência.

[024] Conforme utilizado neste documento, a expressão “presente invenção” ou “invenção descrita” não limita, mas sim aplica-se de forma geral a quaisquer das invenções definidas nas reivindicações ou descritas neste documento. Estas expressões são utilizadas neste documento de forma intercambiável.

[025] As expressões “póli alfa-1,3-glucano”, “polímero alfa-1,3- glucano” e similares são utilizadas neste documento de forma intercambiável. Póli alfa-1,3-glucano é um polímero que compreende unidades monoméricas de glicose ligadas entre si por ligações glicosídicas (ou seja, ligações glucosídicas), em que pelo menos 50% das ligações glicosídicas são ligações alfa-1,3- glicosídicas. Póli alfa-1,3-glucano é um tipo de polissacarídeo. A expressão “ligação alfa-1,3-glicosídica”, da forma utilizada neste documento, refere-se ao tipo de ligação covalente que liga moléculas de alfa-D-glicose entre si através de carbonos 1 e 3 sobre anéis de alfa-D-glicose adjacentes.

[026] As expressões “ligação glicosídica” e “união glicosídica” são utilizadas neste documento de forma intercambiável e designam o tipo de ligação covalente que une uma molécula de carboidrato (açúcar) a outro grupo, como outro carboidrato. A expressão “ligação alfa-1,3-glicosídica”, da forma utilizada neste documento, refere-se ao tipo de ligação covalente que une moléculas de alfa-D-glicose entre si através de carbonos 1 e 3 sobre anéis de alfa-D-glicose adjacentes.

[027] “Alfa-D-glicose” neste documento pode também designar “glicose”.

[028] O termo “sacarose” neste documento designa um dissacarídeo não redutor composto de uma molécula de alfa-D-glicose e uma molécula de beta-D-frutose ligadas por uma ligação alfa-1,2-glicosídica. Sacarose é comumente conhecida como açúcar de cozinha.

[029] Sacarose “refinada branca” neste documento designa sacarose que compreende pelo menos 99,0% em peso de sacarose. Alternativa ou adicionalmente, sacarose refinada branca pode designar sacarose com valor ICUMSA de 150 ou menos (por exemplo, 45 ou menos), polarização mínima de 99,70% e/ou valor L* de pelo menos 87,0.

[030] Valor “ICUMSA” (Comissão Internacional para Métodos Uniformes de Análise de Açúcar), ou valor “padrão ICUMSA”, é uma unidade internacional para expressar a pureza de uma amostra de sacarose em solução e é relacionada diretamente à cor da sacarose. Quanto mais alto for o valor ICUMSA de uma amostra de sacarose, mais escura será a amostra de sacarose. Métodos de determinação de valores ICUMSA para amostras de sacarose são bem conhecidos na técnica e descritos pela Comissão Internacional de Métodos Uniformes de Análise de Açúcar em ICUMSA Methods of Sugar Analysis: Official and Tentative Methods Recommended by the International Commission for Uniform Methods of Sugar Analysis (ICUMSA) (Ed. H. C. S. de Whalley, Elsevier Pub. Co., 1964), por exemplo, que é incorporado ao presente como referência. ICUMSA pode ser medido, por exemplo, por meio do Método ICUMSA GS1/3-7 conforme descrito por R. J. McCowage, R. M. Urquhart e M. L. Burge (Determination of the Solution Colour of Raw Sugars, Brown Sugars and Coloured Syrups at pH 7.0 - Official, Verlag Dr. Albert Bartens, revisão de 2011), que é incorporado ao presente como referência. Valores ICUMSA podem ser expressos em “unidades de base de referência” (RBU).

[031] Valores ICUMSA neste documento podem ser medidos por meio de um método muito similar ao Método ICUMSA GS1/3-7, mas que difere pelo uso de filtro de acetato de celulose no lugar de filtro de nitrato de celulose. Os valores ICUMSA descritos no presente podem, portanto, ser alternativamente denominados valores “ICUMSA modificados”. Considerando a forma como ICUMSA é medido, compreender-se-ia que valores ICUMSA fornecidos neste documento para amostras de açúcar sólido (por exemplo, açúcar de cana bruto) foram obtidos com o uso de uma solução aquosa da amostra de açúcar (cerca de 200 g/l).

[032] A “polarização” (“pol”) de uma amostra de sacarose neste documento designa o teor de sacarose evidente na amostra expresso na forma de percentual em massa medido pela rotação óptica de luz polarizada que atravessa uma solução que compreende a amostra de sacarose a 20 °C. Quanto maior for a polarização de uma amostra de sacarose, mais pura será a sacarose na amostra.

[033] Sacarose que “não está completamente refinada” (sacarose “incompletamente refinada”) neste documento designa sacarose que não foi processada em sacarose refinada branca. Sacarose incompletamente refinada pode, portanto, ser completamente não refinada ou parcialmente refinada. Exemplos de sacarose não refinada são “sacarose bruta” (“açúcar bruto”) e suas soluções. Exemplos de sacarose parcialmente refinada não passaram por uma, duas, três ou mais etapas de cristalização. O ICUMSA de sacarose incompletamente refinada neste documento é de mais de 150.

[034] As expressões “cristalização”, “etapa de cristalização”, “cristalização fracionária” de sacarose e similares são utilizadas neste documento de forma intercambiável e designam um processo de cristalização de sacarose a partir de uma solução que compreende sacarose incompletamente refinada e a separação dos cristais de sacarose do sobrenadante (líquido mãe). Os cristais resultantes deste processo normalmente representam sacarose que é mais pura em comparação com a sacarose existente antes da etapa de cristalização. É importante observar, entretanto, que sacarose incompletamente refinada que sofreu uma, duas, três ou mais etapas de cristalização pode ainda constituir sacarose incompletamente refinada (ou seja, a sacarose cristalizada pode não ter a pureza de sacarose refinada branca). Açúcar de cana normalmente requer três ou mais etapas de cristalização para preparar açúcar refinado branco, enquanto suco de beterraba em certas realizações podem precisar de apenas uma etapa de cristalização para alcançar essa pureza. Vários meios são conhecidos na técnica para a cristalização de sacarose, como processos de evaporação, ebulição e/ou secagem a vácuo.

[035] A expressão “valor L*”, da forma utilizada neste documento, designa o componente de claridade do espaço de cor tridimensional CIE 1976 (L*, a*, b*) (“CIELAB) especificado pela Comissão Internacional de Iluminação (CIE, Viena, Áustria). As três coordenadas do espaço de cor L*a*b* representam, respectivamente, a claridade da cor de um sólido (L* = 0 indica preto e L* = 100 indica branco difuso), a cor do objeto ao longo de uma escala entre vermelho/magenta e verde (a*, valores negativos indicam verde, enquanto valores positivos indicam magenta), e a cor do objeto ao longo de uma escala entre amarelo e azul (b*, valores negativos indicam azul e valores positivos indicam amarelo). Os asteriscos (*) utilizados com referência a um espaço de cor L*a*b* de um objeto são pronunciados como “estrela” (por exemplo, L* é “L- estrela”) e funcionam para diferenciar esse espaço de cor do sistema de cor L, a, b de Hunter. Os componentes L*, a* e b* de um espaço de cor CIELAB de um objeto podem ser calculados utilizando as fórmulas descritas por J. Schwiegerling (Field Guide to Visual and Ophthalmic Optics, SPIE Press, Bellingham, WA, 2004), que é incorporado ao presente como referência. Os valores L*, a*, b* neste documento referem-se ao material sólido, como sacarose seca ou póli alfa-1,3-glucano seco.

[036] Sacarose “seca”, da forma utilizada neste documento, pode caracterizar sacarose que compreende não mais de 2,0, 1,5, 1,0, 0,5, 0,25, 0,10, 0,05 ou 0,01% em peso de água.

[037] O “peso molecular” de póli alfa-1,3-glucano neste documento pode ser representado como peso molecular de número médio (Mn) ou como peso molecular de peso médio (Mw). Alternativamente, peso molecular pode ser representado como Daltons, gramas/mol, DPw (grau de polimerização médio em peso) ou DPn (grau de polimerização numérico médio). Vários meios são conhecidos na técnica de cálculo dessas medições de peso molecular, tal como com cromatografia de líquidos sob alta pressão (HPLC), cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) ou cromatografia de permeação de gel (GPC).

[038] As expressões “enzima glicosiltransferase”, “enzima gtf”, “catalisador de enzima gtf”, “gtf”, “glucanossucrase” e similares são utilizadas neste documento de forma intercambiável. A atividade de uma enzima gtf neste documento catalisa a reação da sacarose de substrato para elaborar os produtos póli alfa-1,3-glucano e frutose. Outros produtos (subprodutos) de uma reação gtf podem incluir glicose (resultados de quando glicose é hidrolisada a partir do complexo intermediário de enzima glicosil-gtf), vários oligossacarídeos solúveis (por exemplo, DP2-DP7) e leucrose (resultados de quando glicose do complexo intermediário de enzima glicosil-gtf é ligada a frutose). Leucrose é um dissacarídeo composto de glicose e frutose ligadas por uma ligação alfa-1,5. Formas do tipo selvagem de enzimas de glicosiltransferase geralmente contêm (na direção terminal N a terminal C) um peptídeo de sinal, um domínio variável, um domínio catalítico e um domínio de ligação de glucano. Um gtf neste documento é classificado sob a família de glicosídeo hidrolase 70 (GH70) segundo o banco de dados CAZy (Carbohydrate-Active EnZymes) (Cantarel et al, Nucleic Acids Res. 37: D233-238, 2009).

[039] “Solução de reação”, da forma utilizada neste documento, designa geralmente uma solução que compreende sacarose, água, pelo menos uma enzima glicosiltransferase ativa e opcionalmente outros componentes. Uma solução de reação pode ser alternativamente denominada neste documento “reação de síntese de glucano”, “reação de glucano”, ou “reação gtf”, por exemplo. Outros componentes que podem encontrar-se em uma reação de síntese de glucano incluem frutose, glicose, leucrose e oligossacarídeos solúveis (por exemplo, DP2-DP7). Compreender-se-á que certos produtos de glucano, como póli alfa-1,3-glucano com grau de polimerização (DP) de pelo menos 8 ou 9, são insolúveis em água e, portanto, não são dissolvidos em uma reação de síntese de glucano, mas sim podem estar presentes fora de solução. É na solução de reação que a etapa de contato de água, sacarose e uma enzima glicosiltransferase é realizada. A expressão “sob condições de reação adequadas”, da forma utilizada neste documento, designa condições de reação que suportam a conversão de sacarose em póli alfa-1,3-glucano por meio da atividade de enzima glicosiltransferase.

[040] Solução de reação de “controle”, da forma utilizada neste documento, pode designar uma solução de reação que compreende sacarose refinada branca em vez de sacarose incompletamente refinada. Todas as outras características (por exemplo, concentração de sacarose, temperatura, pH, tipo de gtf) de uma solução de reação de controle podem ser as mesmas da solução de reação com a qual é comparada.

[041] O “percentual de sólidos secos” de uma reação de síntese de glucano designa o percentual em peso de todos os açúcares na reação de síntese de glucano. O percentual de sólidos secos de uma reação gtf pode ser calculado, por exemplo, com base na quantidade de sacarose utilizada para preparar a reação.

[042] O “rendimento” de póli alfa-1,3-glucano por uma solução de reação neste documento representa o peso do produto de póli alfa-1,3-glucano expresso na forma de percentual em peso do substrato de sacarose que é convertido na reação. Por exemplo, se 100 g de sacarose em uma solução de reação forem convertidos em produtos e 10 g dos produtos forem póli alfa-1,3- glucano, o rendimento do póli alfa-1,3-glucano seria de 10%. Este cálculo de rendimento pode ser considerado medição de seletividade da reação para póli alfa-1,3-glucano.

[043] A expressão “taxa de reação relativa”, da forma utilizada neste documento, designa a taxa de uma reação de síntese de glucano específica em comparação com outra reação de síntese de glucano. Se a reação A tiver, por exemplo, taxa x e a reação B tiver taxa y, a taxa de reação relativa da reação A com relação à taxa de reação da reação B pode ser expressa como x/y (x dividido por y). A expressão “taxa de reação” é utilizada neste documento para designar a mudança de concentração/quantidade de reagente(s) ou a mudança de concentração/quantidade de produto(s) por unidade de tempo por unidade de enzima. Reagente e produto preferidos neste documento de uma reação de síntese de glucano são, respectivamente, sacarose e póli alfa-1,3- glucano.

[044] Uma “fração” de reação de síntese de glucano neste documento designa uma porção de solução líquida de uma reação de síntese de glucano. Fração pode ser, no todo ou em parte, a solução líquida de uma reação de síntese de glucano e foi separada de um produto de glucano sólido sintetizado na reação. Fração pode ser alternativamente denominada “líquido mãe”. Um exemplo de fração é um filtrado de uma reação de síntese de glucano. Como uma fração pode conter açúcares dissolvidos, como sacarose, frutose, glicose, leucrose, oligossacarídeos solúveis (por exemplo, DP2-DP7), fração pode também ser denominada “solução de açúcares misturados” derivada de uma reação de síntese de glucano.

[045] As expressões “filtrado”, “filtrado de reação de glucano”, “filtrado de glucano” e similares são utilizadas de forma intercambiável neste documento e designam fração que foi filtrada longe de um produto de glucano sólido sintetizado em uma reação de síntese de glucano.

[046] As expressões “percentual em volume”, “porcentagem em volume”, “% vol.”, “% v/v” e similares são utilizadas de forma intercambiável no presente. O percentual em volume de um soluto em uma solução pode ser determinada utilizando a fórmula: [(volume de soluto)/(volume de solução)] x 100%.

[047] As expressões “percentual em peso”, “porcentagem em peso”, “percentual peso-peso (% p/p)” e similares são utilizadas de forma intercambiável neste documento. Percentual em peso designa o percentual de um material sobre uma base de massa conforme compreendido em uma composição, mistura ou solução.

[048] Os termos “aumentado”, “aprimorado” e “melhorado” são utilizados de forma intercambiável neste documento. Esses termos designam maior quantidade ou atividade, tal como quantidade ou atividade um pouco maior que a quantidade ou atividade original, ou quantidade ou atividade em grande excesso em comparação com a quantidade ou atividade original e inclui todas as quantidades ou atividades entre eles. Alternativamente, esses termos podem designar, por exemplo, quantidade ou atividade que é pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% maior que a quantidade ou atividade com a qual a quantidade ou atividade aumentada é comparada.

[049] As expressões “identidade de sequência” ou “identidade”, da forma utilizada neste documento com relação a sequências de polinucleotídeos ou polipeptídeos, designam as bases de ácido nucleico ou resíduos de aminoácidos em duas sequências que são idênticas quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada. Assim, “percentual de identidade de sequências” ou “percentual de identidade” designam o valor determinado pela comparação de duas sequências idealmente alinhadas sobre uma janela de comparação, em que a porção da sequência de polinucleotídeos ou polipeptídeos na janela de comparação pode compreender adições ou exclusões (ou seja, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não compreende adições nem exclusões) para alinhamento ideal das duas sequências. O percentual é calculado determinando-se o número de posições em que a base de ácidos nucleicos idênticos ou resíduo de aminoácidos ocorre nas duas sequências para gerar o número de posições coincidentes, dividindo-se o número de posições coincidentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando-se os resultados por 100 para gerar o percentual de identidade de sequências.

[050] O algoritmo Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico (BLAST), que está disponível online no site do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas (NCBI), pode ser utilizado, por exemplo, para medir o percentual de identidade entre duas ou mais das sequências de polinucleotídeos (algoritmo BLASTN) ou sequências de polipeptídeos (algoritmo BLASTP) descritas neste documento. Alternativamente, o percentual de identidade entre sequências pode ser realizado utilizando um algoritmo Clustal (por exemplo, ClustalW ou ClustalV). Para múltiplos alinhamentos utilizando um método de alinhamento Clustal, os valores padrão podem corresponder a PENALIDADE DO INTERVALO = 10 e PENALIDADE DO COMPRIMENTO DO INTERVALO = 10. Parâmetros padrão para alinhamentos em pares e cálculo do percentual de identidade de sequências de proteínas utilizando um método Clustal podem ser COMPRIMENTO DE PALAVRA = 1, PENALIDADE DO INTERVALO = 3, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 5 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 5. Para ácidos nucleicos, esses parâmetros podem ser COMPRIMENTO DE PALAVRA = 2, PENALIDADE DO INTERVALO = 5, VISUALIZAÇÃO DO MELHOR RESULTADO = 4 e ESPAÇAMENTO EM DIAGONAIS = 4. Ainda alternativamente, o percentual de identidade entre sequências pode ser realizado utilizando um programa EMBOSS (por exemplo, agulha) com parâmetros como ABERTURA DE INTERVALO = 10, ABERTURA DE FINAL DE INTERVALO = 0,5, PENALIDADE DE FINAL DE INTERVALO = falso, ABERTURA DE FINAL DE INTERVALO = 10, EXTENSÃO DE FINAL DE INTERVALO = 0,5, utilizando uma matriz BLOSUM (por exemplo, BLOSUM62).

[051] Várias sequências de polinucleotídeos e polipeptídeos são descritas neste documento como características de certas realizações. Variantes dessas sequências que são pelo menos cerca de 70-85%, 85-90% ou 90-95% idênticas às sequências descritas neste documento podem ser utilizadas. Alternativamente, uma sequência de aminoácidos variante pode ter pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade com uma sequência descrita no presente. Uma sequência de aminoácidos ou nucleotídeos variante possui a mesma função/atividade da sequência descrita ou pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% da função/atividade de uma sequência descrita.

[052] O termo “isolado” conforme utilizado em certas realizações designa qualquer componente celular que é completamente separado de sua fonte nativa (por exemplo, uma molécula de polinucleotídeo ou polipeptídeo isolada). Em alguns casos, uma molécula de polinucleotídeo ou polipeptídeo isolada é parte de uma composição, sistema de tampão ou mistura de reagentes maior. Uma molécula de polinucleotídeo ou polipeptídeo isolada pode ser compreendida, por exemplo, dentro de uma célula ou organismo de forma heteróloga. Outros exemplos são glicosiltransferase isolada e póli alfa-1,3- glucano isolado. Acredita-se que os processos de reação de glicosiltransferase descritos neste documento sejam processos sintéticos que não ocorrem naturalmente.

[053] A síntese enzimática de póli alfa-1,3-glucano foi realizada anteriormente utilizando sacarose refinada branca. Como esta forma de sacarose é relativamente cara, é desejável desenvolver novos processos enzimáticos para a síntese de póli alfa-1,3-glucano utilizando sacarose que não é refinada ou, de outra forma, é incompletamente refinada.

[054] Realizações da presente invenção referem-se a uma solução de reação que compreende pelo menos água, sacarose e uma enzima glicosiltransferase que sintetiza póli alfa-1,3-glucano insolúvel com pelo menos 50% de ligações alfa-1,3-glicosídicas e grau de polimerização médio em peso (DPw) de pelo menos 100, em que a sacarose não é refinada ou é parcialmente refinada (ou seja, é incompletamente refinada). A solução de reação produz póli alfa-1,3-glucano insolúvel com pelo menos 50% de ligações alfa-1,3-glicosídicas e um DPw de pelo menos 100. O rendimento de póli alfa-1,3-glucano pela solução de reação é pelo menos 7% do peso de sacarose que foi convertido em produtos na solução de reação.

[055] Significativamente, realizações da presente solução de reação produzem póli alfa-1,3-glucano com rendimentos e pesos moleculares comparáveis aos rendimentos de glucano e pesos moleculares produzidos por soluções de reação com o uso de sacarose refinada branca no lugar de sacarose incompletamente refinada. Estes resultados indicam que os contaminantes presentes em sacarose incompletamente refinada geralmente não impedem seu uso por glicosiltransferase na polimerização de póli alfa-1,3-glucano.

[056] Sacarose que não é completamente refinada pode ser utilizada em uma solução de reação conforme descrito no presente. Essa sacarose não foi processada em sacarose refinada branca. Exemplos incluem composições de sacarose não refinada que compreendem sacarose bruta (açúcar bruto). Outras formas de sacarose incompletamente refinada úteis neste documento incluem formas de sacarose derivadas de cana de açúcar (Saccharum spp. como S. officenarum), beterraba de açúcar (Beta spp. como B. vulgaris) (pode ser alternativamente denominada neste documento “beterraba”), tamareira (Phoenix dactylifera), sorgo (Sorghum spp. como S. vulgare e S. bicolor), bordo (Acer saccharum), mandioca (Manihot esculenta) ou milho, por exemplo. Formas incompletamente refinadas de sacarose de cana de açúcar e/ou beterraba podem ser utilizadas em realizações preferidas neste documento. Cana de açúcar contém cerca de 20% sacarose no seu suco, enquanto beterraba contém cerca de 10 a 15% sacarose no seu suco.

[057] Sacarose incompletamente refinada em certas realizações podem ser de uma planta que produz sacarose e, opcionalmente, é cultivada para a produção de sacarose. Essa planta, como as relacionadas acima, pode ser de qualquer região do mundo onde a planta é normalmente cultivada. A sacarose neste documento pode ser, por exemplo, de plantas cultivadas na América do Sul (por exemplo, Brasil, Colômbia, Argentina e Guiana), América do Norte (por exemplo, Estados Unidos, México, Índias Ocidentais e América Central (por exemplo, Belize)), Austrália, Ásia (por exemplo, Índia, China, Rússia, Turquia, Tailândia, Paquistão, Filipinas e Indonésia), África (por exemplo, Egito, Moçambique e Zimbábue) e Europa (por exemplo, França, Alemanha, Ucrânia, Rússia e Turquia).

[058] Sacarose incompletamente refinada pode ser fornecida como uma composição obtida em qualquer estágio de um processo de purificação de sacarose a partir do suco de uma planta (por exemplo, cana de açúcar ou beterraba) que contém sacarose. Esses processos são descritos em Handbook of Sugar Refining: A Manual for the Design and Operation of Sugar Refining Facilities (Ed. C. C. Chou, John Wiley & Sons, Inc., 2000), Chen e Chou (Cane Sugar Handbook: A Manual for Cane Sugar Manufacturers and Their Chemists, 12a Ed., John Wiley & Sons, Inc., 1993) e Asadi (Beet-Sugar Handbook, 1a Ed., Wiley-Interscience, 2006), por exemplo, todos os quais são incorporados ao presente como referência. Algumas composições e processos preferidos destas referências são discutidos a seguir.

[059] Sacarose incompletamente refinada neste documento pode ser fornecida na forma de composição resultante de qualquer etapa de um processo de purificação de sacarose, como (i) extração inicial (por exemplo, extração com água quente) de “suco bruto” do material de planta; (ii) purificação do suco por meio de carbonatação (ou seja, utilizando cal e dióxido de carbono para formar um precipitado de carbonato de cálcio que coprecipita as impurezas), que gera “suco fino”; (iii) evaporação da água do suco fino, gerando “suco espesso”; e/ou (iv) ebulição ou concentração a vácuo do suco espesso para cristalizar sacarose (essa sacarose já cristalizada normalmente não é açúcar refinado branco) (os cristais podem ser removidos do sobrenadante, por exemplo, por meio de centrifugação). Os produtos das etapas (i) e (ii) podem ser filtrados em certas realizações antes de processamento adicional, por exemplo. O sobrenadante da cristalização (iv) pode ser reciclado e misturado com outro sobrenadante e/ou suco espesso, que é então submetido a cristalização (que gera cristais como na etapa (iv), que também podem ser utilizados no presente). A reciclagem de sobrenadante eventualmente resulta em “melaços”. Assim, sacarose incompletamente refinada pode ser fornecida na forma de suco bruto, suco fino, suco espesso, melaços e/ou cristais de sacarose que sofreram não mais de uma cristalização, por exemplo. Estas formas de sacarose incompletamente refinada e etapas de processo correspondentes utilizadas para obtê-las preferencialmente caracterizam exemplos de sacarose incompletamente refinada obtida de beterraba, mas podem também caracterizar sacarose obtida de outras fontes, como cana de açúcar.

[060] Exemplos de sacarose incompletamente refinada de beterrabas úteis no presente incluem suco bruto de beterraba, suco fino de beterraba (compreende cerca de 10-20% em peso de sacarose), suco espesso de beterraba (compreende cerca de 60-90% em peso de sacarose) e melaços de beterraba (cerca de 50-60% em peso de sacarose). Suco fino e/ou espesso de beterraba são utilizados em certas realizações. Os valores ICUMSA neste documento podem ser de pelo menos 1.000 (por exemplo, ~1.000-1.300) para suco fino de beterraba, pelo menos 1.300 (por exemplo, ~1.300-1.800) para suco espesso de beterraba e/ou pelo menos 50.000 para melaços de beterraba (por exemplo, ~50.000-60.000), por exemplo.

[061] Alternativamente, sacarose incompletamente refinada no presente pode ser “sacarose bruta” (“açúcar bruto”), que é fornecida removendo- se toda a água do suco bruto (ou seja, sacarose bruta é sólida). Ainda alternativamente, sacarose incompletamente refinada neste documento pode ser “sacarose VHP” (“VHP”, “açúcar VHP”, sacarose com “polarização muito alta”), que é fornecida por meio da carbonatação, em primeiro lugar, e filtragem de suco bruto, seguido pela evaporação do suco bruto para cristalizar uma porção da sacarose no seu interior; a sacarose cristalizada removida do sobrenadante é sacarose VHP. Sacarose VHP sofreu, portanto, uma cristalização. Ainda alternativamente, sacarose incompletamente refinada neste documento pode ser “sacarose VVHP” (“VVHP”, “açúcar VVHP”, sacarose com “polarização muito, muito alta”), que é fornecida por meio de dissolução de sacarose VHP em água e recristalização da sacarose. Sacarose VVHP sofreu, portanto, duas cristalizações. Estas formas de sacarose incompletamente refinada (sacarose bruta, VHP, VVHP) e etapas de processo correspondentes utilizadas para sua obtenção preferencialmente caracterizam exemplos de sacarose incompletamente refinada obtida de cana de açúcar, mas também podem caracterizar sacarose obtida de outras fontes, como beterraba.

[062] Sacarose bruta (por exemplo, “açúcar de cana bruto”) neste documento pode ter valor de polarização de 94% a 97%, valor ICUMSA de cerca de 600 a 1.200 e/ou valor L* abaixo de 87,0 (por exemplo, menos de 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55 ou 50). Compreender-se-á que sacarose bruta não é “açúcar marrom”, que é um produto da mistura de xarope de melaço com açúcar refinado branco, seguido por secagem. Sacarose VHP no presente pode ter valor de polarização de pelo menos 99,30% e/ou valor ICUMSA de cerca de 300 a 1.000, por exemplo. Sacarose VHP pode ter opcionalmente qualquer uma das características a seguir: teor máximo de umidade de 0,15%, teor máximo de cinza de 0,15%, 97% de solubilidade em água e/ou cor marrom dourado. Sacarose VVHP no presente pode ter valor de polarização de pelo menos 99,50% e/ou valor ICUMSA de mais de 150 a cerca de 400, por exemplo.

[063] Sacarose incompletamente refinada neste documento não é sacarose refinada branca. Sacarose refinada branca no presente designa sacarose que compreende pelo menos 99,0% em peso de sacarose (por exemplo, pelo menos 99,5% em peso ou 99,9% em peso). Alternativa ou adicionalmente, sacarose refinada branca pode designar sacarose com valor ICUMSA de 150 ou menos (por exemplo, 45 ou menos), polarização mínima de 99,70% (por exemplo, pelo menos 99,80%) e/ou valor L* de pelo menos 87,0 (por exemplo, pelo menos 87,5, 88,0 ou 88,5). Sacarose refinada branca em certas realizações pode também ter qualquer das características a seguir: teor máximo de umidade de 0,04%, teor máximo de cinza de 0,04%, 100% de solubilidade em água, cor branca brilhante e/ou granulação fina.

[064] Em certas realizações, sacarose incompletamente refinada não foi cristalizada. Pode-se mencionar sacarose incompletamente refinada obtida de beterraba, incluindo, por exemplo, suco bruto de beterraba, suco fino de beterraba e suco espesso de beterraba. Alternativamente, sacarose incompletamente refinada neste documento passou por não mais de uma, duas, três ou mais etapas de cristalização. Pode-se utilizar, por exemplo, sacarose incompletamente refinada de cana de açúcar que passou por não mais de duas ou três cristalizações. Ainda alternativamente, pode-se utilizar sacarose incompletamente refinada se houver passado por uma, duas, três ou mais cristalizações, mas possuir ICUMSA de mais de 150. Uma etapa de cristalização pode compreender, por exemplo, ebulição e/ou secagem a vácuo de uma solução aquosa que compreende sacarose pelo menos até o ponto em que sacarose dissolvida começa a cair da solução na forma de cristais.

[065] O valor ICUMSA de sacarose incompletamente refinada neste documento pode ser, por exemplo, de mais de 150. Alternativamente, sacarose incompletamente refinada pode ter valor ICUMSA de pelo menos cerca de 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, 1.400, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000, 10.000, 20000, 30.000, 40.000, 50.000 ou 60.000 (ou qualquer valor inteiro de 151 a 60.000), por exemplo. ICUMSA em certas realizações pode variar de cerca de 1.000-1.300, tal como quando a sacarose incompletamente refinada é suco fino de beterraba. ICUMSA em outras realizações do presente pode variar de cerca de 1.300-1.800, tal como quando a sacarose incompletamente refinada é suco espesso de beterraba, ou cerca de 50.000 a 60.000, como quando a sacarose incompletamente refinada é melaço de beterraba. Ainda em outras realizações, ICUMSA pode variar de cerca de 600-1.200, como quando a sacarose incompletamente refinada é sacarose bruta; cerca de 300-1.000, como quando a sacarose incompletamente refinada é sacarose VHP; ou acima de 150 a cerca de 400, como quando a sacarose incompletamente refinada é sacarose VVHP.

[066] Acredita-se que valores ICUMSA de composições de sacarose no presente (“ICUMSA modificado”) sejam os mesmos, ou bastante similares aos valores ICUMSA que seriam medidos para as composições utilizando outros métodos ICUMSA.

[067] Solução de reação neste documento refere-se a uma solução que compreende pelo menos sacarose incompletamente refinada, água, uma enzima glicosiltransferase ativa e, opcionalmente, outros ingredientes. Outros componentes que podem estar em uma reação de síntese de glucano incluem, por exemplo, frutose, glicose, leucrose, oligossacarídeos solúveis (por exemplo, DP2-DP7). Compreender-se-á que certos produtos de glucano, como póli alfa- 1,3-glucano com DP de pelo menos 8 ou 9, pode ser insolúvel em água e, portanto, não são dissolvidos em uma reação de síntese de glucano, mas podem estar presentes fora da solução. Uma solução de reação neste documento pode ser uma que, além de gerar o produto de glucano insolúvel, gera subprodutos como leucrose e/ou oligossacarídeos solúveis.

[068] Uma solução de reação conforme descrito neste documento compreende uma enzima glicosiltransferase que produz póli alfa-1,3-glucano com pelo menos 50% de ligações alfa-1,3-glicosídicas e DPw de pelo menos 100. Exemplos dessas enzimas de glicosiltransferase úteis neste documento são descritos na Patente Norte-Americana N° 7.000.000 e nos Pedidos de Patente Norte-Americanos N° 2013/0244288 e 2013/0244287 (todos os quais são incorporados ao presente como referência). Ainda outros exemplos de glicosiltransferases que podem ser utilizados em uma solução de reação do presente para produzir póli alfa-1,3-glucano são descritos no Pedido de Patente Norte-Americano N° 2014/0087431 (Pedido de Patente Norte-Americano N° 14/036.049), que é incorporado ao presente como referência. Uma enzima glicosiltransferase neste documento, por exemplo, pode (i) compreender ou consistir de uma sequência de aminoácidos que é 100% idêntica ou pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID N° 4, 8, 10, 12, 14, 20, 26, 28, 30 ou 34 e (ii) possuir atividade de glicosiltransferase.

[069] Uma solução de reação em algumas outras realizações compreende uma enzima glicosiltransferase que (i) compreende ou consiste de uma sequência de aminoácidos que é 100% idêntica ou pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ou 64 e (ii) possui atividade de glicosiltransferase.

[070] Uma enzima glicosiltransferase neste documento pode ser derivada de qualquer fonte microbiana, como bactéria ou fungo. Exemplos de enzimas de glicosiltransferase bacterianas são aquelas derivadas de uma espécie de Streptococcus, espécie de Leuconostoc ou espécie de Lactobacillus. Exemplos de espécies de Streptococcus incluem S. salivarius, S. sobrinus, S. dentirousetti, S. downei, S. mutans, S. oralis, S. gallolyticus e S. sanguinis. Exemplos de espécies de Leuconostoc incluem L. mesenteroides, L. amelibiosum, L. argentinum, L. carnosum, L. citreum, L. cremoris, L. dextranicum e L. fructosum. Exemplos de espécies de Lactobacillus incluem L. acidophilus, L. delbrueckii, L. helveticus, L. salivarius, L. casei, L. curvatus, L. plantarum, L. sakei, L. brevis, L. buchneri, L. fermentum e L. reuteri.

[071] Uma enzima glicosiltransferase em alguns aspectos neste documento produz póli alfa-1,3-glucano com pelo menos 50% de ligações alfa- 1,3-glicosídicas em uma reação de síntese de glucano na qual se utiliza sacarose incompletamente refinada. Acredita-se que uma enzima glicosiltransferase em certas realizações sintetize póli alfa-1,3-glucano, em que pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (ou qualquer número inteiro de 60% a 100%) das ligações glicosídicas constituintes são ligações alfa- 1,3. Consequentemente, a enzima glicosiltransferase nas realizações acima sintetiza póli alfa-1,3-glucano no qual há menos de cerca de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou 0% (ou qualquer valor inteiro de 0% a 50%) de ligações glicosídicas que não são alfa-1,3.

[072] Em outros aspectos do presente, uma enzima glicosiltransferase pode sintetizar póli alfa1,3-glucano sem pontos de ramificação ou com menos de cerca de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% de pontos de ramificação como percentual das ligações glicosídicas no polímero. Exemplos de pontos de ramificação incluem pontos de ramificação alfa-1,6, como aqueles que estão presentes em polímero mutan.

[073] Uma enzima glicosiltransferase em alguns aspectos do presente pode sintetizar póli alfa-1,3-glucano com peso molecular em DPn ou DPw de pelo menos cerca de 100. Alternativamente, a enzima glicosiltransferase pode sintetizar póli alfa-1,3-glucano com um peso molecular em DPn ou DPw de pelo menos cerca de 400. Também alternativamente, a enzima glicosiltransferase pode sintetizar póli alfa-1,3-glucano com peso molecular em DPn ou DPw de pelo menos cerca de 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1.000 (ou qualquer número inteiro de 100 a 1000).

[074] Uma ou mais enzimas de glicosiltransferase diferentes podem ser utilizadas em certos aspectos. A enzima glicosiltransferase em certas realizações não possui ou possui muito pouca (menos de 1%) atividade de dextransucrase, reuteransucrase ou alternansucrase. Uma solução de reação do presente pode conter, por exemplo, uma, duas ou mais enzimas glicosiltransferase.

[075] Uma enzima glicosiltransferase no presente pode ser independente de primer ou dependente de primer. Enzimas glicosiltransferase independentes de primer não necessitam da presença de primer para realizar a síntese de glucano. Uma enzima glicosiltransferase dependente de primer requer a presença de uma molécula iniciadora na solução de reação para agir como primer para a enzima durante a síntese de polímero de glucano. O termo “primer”, conforme utilizado neste documento, designa qualquer molécula que possa agir como iniciador para uma enzima glicosiltransferase. Primers que podem ser utilizados em certas realizações incluem dextran e outros primers com base em carboidrato, tais como glucano hidrolisado. Dextran para uso como primer pode ser, por exemplo, dextran T10 (ou seja, dextran com peso molecular de 10 kD).

[076] Exemplos de enzimas de glicosiltransferase neste documento podem ser qualquer uma das sequências de aminoácidos descritas neste documento e que incluem adicionalmente 1-300 (ou qualquer número inteiro entre eles (por exemplo, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50)) resíduos sobre o terminal N e/ou terminal C. Esses resíduos adicionais podem ser de uma sequência de tipo selvagem correspondente da qual é derivada a enzima glicosiltransferase ou podem ser uma sequência heteróloga como uma marca de epítopo (no terminal N ou C) ou um peptídeo de sinal heterólogo (no terminal N), por exemplo.

[077] Uma enzima glicosiltransferase neste documento normalmente não contém um peptídeo de sinal N terminal. Um sistema de expressão para a produção de uma enzima glicosiltransferase neste documento pode empregar um polinucleotídeo que codifica enzima que também compreende uma sequência que codifica um peptídeo de sinal N terminal para secreção extracelular direta, se desejado. O peptídeo de sinal nessas realizações é dividido da enzima durante o processo de secreção. O peptídeo de sinal pode ser nativo ou heterólogo para a glicosiltransferase. Um exemplo de peptídeo de sinal útil neste documento é de uma espécie bacteriana (por exemplo, uma espécie de Bacillus, como B. subtilis) ou fúngica. Um exemplo de peptídeo de sinal bacteriano é um peptídeo de sinal aprE, tal como de Bacillus (por exemplo, B. subtilis, vide Vogtentanz et al, Protein Expr. Purif. 55: 40-52, que é incorporado ao presente como referência).

[078] Várias sequências de enzima glicosiltransferase descritas neste documento não contêm peptídeo de sinal N terminal (bem como um domínio variável) (vide a Tabela 1). Metionina inicial N terminal (posição 1 de aminoácido) foi adicionado a cada sequência para fins de expressão intracelular (enzima expressa pode ser obtida, por exemplo, em um lisato celular). O técnico no assunto compreenderá que uma sequência de aminoácidos heteróloga interventora, como um epítopo e/ou peptídeo de sinal, poderá ser opcionalmente adicionada entre a metionina inicial e a sequência de glicosiltransferase. Assim, por exemplo, uma enzima glicosiltransferase neste documento pode compreender ou consistir de uma sequência de aminoácidos que (i) é 100% idêntica ou pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à sequência de aminoácidos que começa na posição 2 de SEQ ID N° 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 59, 60, 61, 62, 63 ou 64 e (ii) possui atividade de glicosiltransferase.

[079] Uma enzima glicosiltransferase para uma reação de síntese de glucano neste documento pode ser produzida por qualquer meio conhecido na técnica. Por exemplo, uma enzima glicosiltransferase pode ser produzida de forma recombinante em um sistema de expressão heterólogo, como um sistema de expressão heterólogo microbiano. Exemplos de sistemas de expressão heterólogos incluem sistemas de expressão bacterianos (por exemplo, E. coli, como TOP10 ou MG1655; Bacillus sp.) e eucarióticos (por exemplo, leveduras, como Pichia sp. e Saccharomyces sp.).

[080] Em certas realizações, um sistema de expressão de gene heterólogo pode ser um que é projetado para secreção de proteínas. A enzima glicosiltransferase compreende um peptídeo de sinal (sequência de sinal) nessas realizações. O peptídeo de sinal pode ser seu peptídeo de sinal nativo ou um peptídeo de sinal heterólogo.

[081] Uma enzima glicosiltransferase descrita neste documento pode ser utilizada em qualquer estado de purificação (por exemplo, pura ou não pura). Por exemplo, a enzima glicosiltransferase pode ser purificada e/ou isolada antes de seu uso. Exemplos de enzimas glicosiltransferase que não são puras incluem aquelas na forma de lisato celular. Extrato ou lisato celular pode ser preparado a partir de uma bactéria (por exemplo, E. coli) utilizada para expressar a enzima de forma heteróloga. A bactéria pode ser, por exemplo, submetida à ruptura com o uso de uma célula de pressão francesa. Em realizações alternativas, bactérias podem ser homogeneizadas com um homogeneizador (por exemplo, APV, Rannie, Gaulin). Uma enzima glicosiltransferase é normalmente solúvel nesses tipos de preparações. Homogeneizado, extratou ou lisato celular bacteriano no presente pode ser utilizado a cerca de 0,15-0,3% (v/v) em uma solução de reação para produzir póli alfa-1,3-glucano a partir de sacarose.

[082] A atividade de uma enzima glicosiltransferase neste documento pode ser determinada utilizando qualquer método conhecido na técnica. A atividade de enzima glicosiltransferase pode ser determinada, por exemplo, medindo-se a produção de açúcares redutores (frutose e glicose) em uma solução de reação que contém sacarose (50 g/l), dextran T10 (1 mg/ml) e tampão fosfato de potássio (pH 6,5, 50 mM), em que a solução é mantida a 22-25 °C por 24-30 horas. Os açúcares redutores podem ser medidos por meio da adição de 0,01 ml da solução de reação a uma mistura que contém 1 N NaOH e 0,1% de cloreto de trifeniltetrazólio, monitorando em seguida o aumento da absorção a OD480nm por cinco minutos.

[083] A temperatura de uma solução de reação neste documento pode ser controlada, se desejado. Em certas realizações, a temperatura da reação é de cerca de 5 °C a cerca de 50 °C. A temperatura em algumas outras realizações é de cerca de 20 °C a cerca de 40 °C, ou cerca de 20 °C a cerca de 30 °C (por exemplo, cerca de 25 °C).

[084] A concentração inicial de sacarose em uma solução de reação neste documento pode ser de cerca de 20 g/l a cerca de 400 g/l, por exemplo. Alternativamente, a concentração inicial de sacarose pode ser de cerca de 75 g/l a cerca de 175 g/l, ou de cerca de 50 g/l a cerca de 150 g/l. Também alternativamente, a concentração inicial de sacarose pode ser, por exemplo, de cerca de 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150 ou 160 g/l (ou qualquer valor inteiro de 40 a 160 g/l). “Concentração inicial de sacarose” designa a concentração de sacarose em uma solução de reação gtf logo após a adição de todos os componentes da solução de reação (pelo menos água, sacarose incompletamente refinada, enzima gtf). A sacarose em uma solução de reação, no todo ou em parte, pode ser de sacarose incompletamente refinada adicionada à solução. Embora seja preferível que toda a sacarose seja incompletamente refinada, sacarose refinada branca pode ser adicionalmente utilizada em uma solução de reação.

[085] Compreender-se-ia que, com certas composições de sacarose incompletamente refinada que se encontram em estado líquido (por exemplo, suco fino de beterraba, suco espesso de beterraba e melaço), essas composições consequentemente adicionadas a uma solução de reação para atingir concentração inicial específica de sacarose em um volume de reação específico. Composição de sacarose incompletamente refinada de beterraba (tal como suco fino de beterraba, suco espesso de beterraba e melaço) poderá, por exemplo, ser diluída em uma solução de reação de forma que a concentração de sacarose inicial da reação seja de cerca de 70-90 g/l ou 80-85 g/l.

[086] O pH de uma reação de síntese de glucano em certas realizações pode ser de cerca de 4,0 a cerca de 8,0. Alternativamente, o pH pode ser de cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0. O pH pode ser ajustado ou controlado por meio da adição ou incorporação de um tampão adequado, que inclui, mas sem limitações: fosfato, tris, citrato ou sua combinação. A concentração de tampão em uma reação de síntese de glucano pode ser, por exemplo, de cerca de 100 mM, ou cerca de 10, 20 ou 50 mM. Uma quantidade adequada de DTT (ditiotreitol, por exemplo, cerca de 1,0 mM) pode ser opcionalmente adicionada a uma solução de reação.

[087] Uma solução de reação neste documento pode ser contida no interior de qualquer recipiente adequado para aplicação de uma ou mais das condições de reação descritas neste documento. Uma solução de reação no presente pode encontrar-se, por exemplo, em um recipiente ou receptáculo de aço inoxidável, plástico ou vidro com tamanho adequado para conter uma reação específica. Esse recipiente pode ser opcionalmente equipado com um dispositivo de agitação.

[088] Exemplos de outras condições e componentes adequados para a realização de uma solução de reação no presente são descritos na Patente Norte-Americana N° 7.000.000 e nos Pedidos de Patente Norte- Americanos N° 2013/0244288, 2013/0244287, 2013/0196384, 2013/0157316 e 2014/0087431, todos os quais são incorporados ao presente como referência.

[089] O rendimento de póli alfa-1,3-glucano por uma solução de reação de acordo com a presente invenção é de pelo menos 7% do peso de sacarose que foi convertida em produtos na solução de reação. Alternativamente, o rendimento de póli alfa-1,3-glucano pode ser de pelo menos cerca de 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46% ou 47%. Em certas realizações, o rendimento de póli alfa-1,3-glucano em uma solução de reação neste documento é aproximadamente o mesmo rendimento de póli alfa- 1,3-glucano por uma solução de reação de controle na qual se utiliza sacarose refinada branca em vez de sacarose incompletamente refinada. Todos os rendimentos acima podem ser obtidos com o uso de uma solução de reação mantida sob temperatura de cerca de 20-30 °C (por exemplo, 25 °C) e/ou utilizando gtf que compreende SEQ ID N° 8, por exemplo. Algumas destas realizações podem utilizar suco espesso de beterraba ou suco fino de beterraba como sacarose incompletamente refinada.

[090] Em certas realizações, a taxa de reação relativa de uma solução de reação é de pelo menos cerca de 0,8 com relação à taxa de reação de uma solução de reação que compreende água, sacarose refinada branca e uma enzima glicosiltransferase. A taxa de reação relativa de uma solução de reação é de pelo menos cerca de 0,8 com relação a uma reação de controle (ou seja, a taxa de reação de uma solução de reação neste documento é de pelo menos 80% da taxa de uma reação de controle). A taxa de reação relativa neste documento pode ser alternadamente de pelo menos cerca de 0,82, 0,84, 0,86, 0,88, 0,90, 0,92, 0,94, 0,96, 0,98, 1,00, 1,02 ou 1,04, por exemplo. A taxa de reação de uma solução de reação pode ser expressa em termos da mudança em concentração/quantidade de reagente(s) (por exemplo, sacarose) e/ou a mudança de concentração/quantidade de produto(s) (por exemplo, póli alfa-1,3- glucano) por unidade de tempo e unidade de concentração de enzima glicosiltransferase ativa.

[091] Uma solução de reação neste documento pode produzir, por exemplo, póli alfa-1,3-glucano com valor L* de menos de 93. Alternativamente, o valor L* de póli alfa-1,3-glucano produzido por uma solução de reação neste documento pode ser de menos de 92, 90, 88, 86, 84, 82, 80, 78, 76, 74, 72, 70, 68, 66, 64, 62 ou 60. Exemplos de faixas de valores L* de produtos de póli alfa- 1,3-glucano neste documento podem ser de cerca de 82-87 (por exemplo, quando suco fino de beterraba ou suco espesso de beterraba for utilizado em uma solução de reação) ou 80-82 (por exemplo, quando sacarose VHP for utilizada em uma solução de reação). Valores L* podem ser determinados, por exemplo, para póli alfa-1,3-glucano que foi removido de uma solução de reação, lavado com pelo menos meio volume de reação de água em duas lavagens de deslocamento (por exemplo, lavagem com pelo menos 1 l de água se o volume de reação for de 2 l) e seco em seguida, moído e peneirado através de uma peneira de 60 mesh. A secagem deve ser realizada sob temperatura que não descolore o póli alfa-1,3-glucano. Assim, qualquer cor no póli alfa-1,3-glucano deverá ser derivada da sacarose incompletamente refinada.

[092] Uma solução de reação neste documento produz póli alfa- 1,3-glucano com pelo menos 50% de ligações alfa-1,3-glicosídicas. Acredita-se que, em certas realizações, seja produzido póli alfa-1,3-glucano no qual pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% (ou qualquer número inteiro de 60% a 100%) das ligações glicosídicas constituintes sejam ligações alfa-1,3. Consequentemente, o póli alfa-1,3-glucano produzido nas realizações acima possui menos de cerca de 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou 0% (ou qualquer valor inteiro de 0% a 50%) de ligações glicosídicas que não sejam alfa-1,3.

[093] O perfil de ligação glicosídica de um produto de póli alfa-1,3- glucano neste documento pode ser determinado com o uso de qualquer método conhecido na técnica. O perfil de ligação pode ser determinado, por exemplo, utilizando métodos que utilizam espectroscopia por ressonância magnética nuclear (NMR) (por exemplo, NMR 13C ou NMR 1H). Estes e outros métodos que podem ser utilizados são descritos em Food Carbohydrates: Chemistry, Physical Properties, and Applications (S. W. Cui, Ed., Cap. 3, S. W. Cui, Structural Analysis of Polysaccharides, Taylor & Francis Group LLC, Boca Raton, FL, 2005), que é incorporado ao presente como referência.

[094] Uma solução de reação neste documento produz póli alfa- 1,3-glucano com peso molecular em DPn ou DPw de pelo menos cerca de 100. Alternativamente, póli alfa-1,3-glucano produzido em uma solução de reação neste documento pode ter peso molecular em DPn ou DPw de pelo menos cerca de 400. Também alternativamente, o póli alfa-1,3-glucano pode ter peso molecular em DPn ou DPw de pelo menos cerca de 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ou 1.000 (ou qualquer número inteiro de 100 a 1000).

[095] O peso molecular de póli alfa-1,3-glucano neste documento pode ser medido utilizando qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica. O peso molecular de polímero de glucano pode ser medido, por exemplo, utilizando cromatografia de líquidos sob alta pressão (HPLC), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) ou cromatografia de permeação de gel (GPC).

[096] A presente invenção também se refere a um método de produção de póli alfa-1,3-glucano que compreende a etapa de contato de pelo menos água, sacarose e uma enzima glicosiltransferase, em que a sacarose não é refinada ou é parcialmente refinada (ou seja, não é completamente refinada). O póli alfa-1,3-glucano produzido neste método, que pode ser opcionalmente isolado, possui pelo menos 50% de ligações alfa-1,3-glicosídicas e grau de polimerização médio em peso (DPw) de pelo menos 100. Além disso, o rendimento de póli alfa-1,3-glucano produzido no método é de pelo menos 7% do peso da sacarose que foi convertida em produtos ao entrar em contato com a água e a enzima glicosiltransferase. Qualquer uma das características de uma solução de reação do presente conforme descrito acima e nos Exemplos pode caracterizar este método. As características do método a seguir são exemplos.

[097] Sacarose incompletamente refinada em certas realizações do método podem ser de beterraba (por exemplo, suco fino de beterraba ou suco espesso de beterraba) e não foi cristalizada. Em outro exemplo, sacarose incompletamente refinada é de cana de açúcar (por exemplo, sacarose bruta, sacarose VHP ou VVHP) e não passou por mais de duas ou três etapas de cristalização.

[098] Sacarose incompletamente refinada utilizada no método descrito pode ter valor ICUMSA, por exemplo, de mais de 150.

[099] Póli alfa-1,3-glucano produzido em certas realizações do método possui valor L* de menos de 93. Valores L* neste documento podem ser determinados, por exemplo, com relação ao póli alfa-1,3-glucano que foi removido de uma solução de reação; opcionalmente lavado uma, duas ou mais vezes com água; e seco.

[100] A taxa de reação relativa de produção de póli alfa-1,3-glucano na etapa de contato do método é de pelo menos 0,8 com relação à taxa de reação se sacarose refinada branca for utilizada no lugar de sacarose incompletamente refinada.

[101] O método descrito compreende o contato de pelo menos água, sacarose incompletamente refinada e uma enzima glicosiltransferase. Essa etapa de contato pode compreender o fornecimento de uma solução de reação que compreende água, sacarose incompletamente refinada e uma enzima glicosiltransferase. Compreender-se-á que, à medida que a enzima glicosiltransferase sintetiza póli alfa-1,3-glucano, a solução de reação torna-se uma mistura de reação, considerando que póli alfa-1,3-glucano insolúvel sai da solução, conforme indicado pela opacificação da reação. A etapa de contato do método descrito pode ser realizada de várias formas diferentes. A quantidade desejada de sacarose incompletamente refinada pode, por exemplo, ser primeiramente dissolvida ou misturada em água (opcionalmente, outros componentes podem também ser adicionados neste estágio de preparação, tais como componentes de tampão), seguida pela adição de uma enzima glicosiltransferase. A solução pode ser mantida em repouso, ou agitada mexendo-se ou por meio de chacoalhar orbital, por exemplo. A reação pode ser e normalmente é livre de células.

[102] O término de uma reação em certas realizações pode ser determinado visualmente (sem acúmulo adicional de póli alfa-1,3-glucano insolúvel) e/ou medindo-se a quantidade de sacarose remanescente na solução (sacarose residual), em que um percentual de consumo de sacarose de mais de cerca de 90% pode indicar o término da reação. Normalmente, uma reação do processo descrito levará cerca de 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 ou 96 horas para completar, dependente de certos parâmetros, como a quantidade de sacarose e de enzima glicosiltransferase utilizada na reação.

[103] O percentual de consumo de sacarose de uma reação em certas realizações do método descrito é de pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% da sacarose inicialmente em contato com água e uma enzima glicosiltransferase. Alternativamente, o percentual de consumo de sacarose pode ser > 90% ou > 95%.

[104] O rendimento de póli alfa-1,3-glucano produzido em alguns aspectos de um método de síntese de glucano neste documento pode ser de pelo menos cerca de 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46% ou 47% com base no peso de sacarose convertido na reação.

[105] Póli alfa-1,3-glucano produzido no método descrito pode ser opcionalmente isolado. Póli alfa-1,3-glucano insolúvel pode ser separado, por exemplo, por meio de centrifugação ou filtragem. Ao fazer isso, póli alfa-1,3- glucano é separado da maior parte da solução de reação, que pode compreender água, frutose e certos subprodutos (por exemplo, leucrose, oligossacarídeos solúveis DP2-DP7). Esta solução pode também compreender monômero residual de sacarose e glicose. Isolamento pode também compreender opcionalmente a lavagem do póli alfa-1,3-glucano uma, duas ou mais vezes com água e/ou secagem do póli alfa-1,3-glucano.

[106] A presente invenção também se refere ao póli alfa-1,3- glucano produzido por uma solução de reação ou método descrito no presente. Este póli alfa-1,3-glucano possui valor L* que é de menos de 93. Qualquer uma das características de póli alfa-1,3-glucano conforme descrito acima e nos Exemplos pode caracterizar o póli alfa-1,3-glucano da presente realização. As características a seguir são exemplos.

[107] Um produto de póli alfa-1,3-glucano neste documento pode ser isolado e pode ser adicionalmente fornecido, por exemplo, em estado seco. Em certas realizações, um produto de póli alfa-1,3-glucano é fornecido em quantidade isolada e seca de pelo menos 1 grama (por exemplo, pelo menos 100 g ou 500 g). Póli alfa-1,3-glucano “seco” compreende, por exemplo, não mais de 2,0, 1,5, 1,0, 0,5, 0,25, 0,10, 0,05 ou 0,01% em peso de água.

[108] Acredita-se que um produto de póli alfa-1,3-glucano em certas realizações pode conter um ou mais dos compostos a seguir: caramelos, melanoidinas, produtos de degradação alcalina de hexoses (HADPs) (produtos de condensação de açúcar polimérico C6 formados sob condições alcalinas), complexos de polifenol-ferro (por exemplo, complexos de catecol ferro) e melaninas. Também se acredita que um ou mais desses compostos forneçam coloração mais escura ao produto de póli alfa-1,3-glucano, em comparação com a coloração, se houver, de um produto de póli alfa-1,3-glucano fornecido por uma solução de reação na qual apenas sacarose refinada branca é utilizada. Essas diferenças de coloração podem ser determinadas, por exemplo, com o uso de valores L*.

[109] Exemplos não limitadores de composições e métodos descritos neste documento incluem: 1. Solução de reação que compreende água, sacarose e uma enzima glicosiltransferase que sintetiza póli alfa-1,3-glucano insolúvel com pelo menos 50% de ligações alfa-1,3-glicosídicas e grau de polimerização médio em peso (DPw) de pelo menos 100, em que a sacarose não é refinada ou parcialmente refinada; em que o rendimento de póli alfa-1,3-glucano pela solução de reação é de pelo menos 7% do peso de sacarose que foi convertido em produtos na solução de reação; 2. Solução de reação de acordo com a realização 1, em que a sacarose é de beterraba e não foi cristalizada; 3. Reação de solução de acordo com a realização 1, em que a sacarose é de cana de açúcar e (i) não foi cristalizada; ou (ii) foi cristalizada com o uso de não mais de três etapas de cristalização; 4. Solução de reação de acordo com qualquer das realizações 1, 2 ou 3, em que a sacarose possui valor ICUMSA de mais de 150; 5. Solução de reação de acordo com qualquer das realizações 1, 2, 3 ou 4, em que a taxa de reação relativa da solução de reação é de pelo menos 0,8 com relação à taxa de reação de uma solução de reação que compreende água, sacarose refinada branca e a enzima glicosiltransferase; [6] Solução de reação de acordo com qualquer das realizações 1, 2, 3, 4 ou 5, em que o póli alfa-1,3-glucano produzido pela solução de reação possui valor L* de menos de 93; [7] Solução de reação de acordo com qualquer das realizações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, em que a enzima glicosiltransferase compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30 ou SEQ ID N° 34; [8] Método de produção de póli alfa-1,3-glucano insolúvel que compreende: a. contato de pelo menos água, sacarose e uma enzima glicosiltransferase, em que a sacarose não é refinada ou é parcialmente refinada, de forma que póli alfa-1,3-glucano é produzido com pelo menos 50% de ligações alfa-1,3-glicosídicas e grau de polimerização em peso médio (DPw) de pelo menos 100; e b. opcionalmente, isolamento do póli alfa-1,3-glucano produzido na etapa (a); em que o rendimento de póli alfa-1,3-glucano é pelo menos 7% do peso de sacarose convertida em produtos na etapa (a); [9] Método de acordo com a realização 8, em que a sacarose é de beterraba e não foi cristalizada; [10] Método de acordo com a realização 8, em que a sacarose é de cana de açúcar e (i) não foi cristalizada; ou (ii) foi cristalizada com o uso de não mais de três etapas de cristalização; [11] Método de acordo com qualquer das realizações 8, 9 ou 10, em que a sacarose possui valor ICUMSA de mais de 150; [12] Método de acordo com qualquer das realizações 8, 9, 10 ou 11, em que a taxa de reação relativa de produção de póli alfa-1,3-glucano na etapa (a) é de pelo menos 0,8 com relação à taxa de reação da etapa (a) caso se utilize sacarose refinada branca no lugar da sacarose não refinada ou parcialmente refinada; [13] Método de acordo com qualquer das realizações 8, 9, 10, 11 ou 12, em que o póli alfa-1,3-glucano isolado na etapa (b) possui valor L* de menos de 93; [14] Método de acordo com qualquer das realizações 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, em que a enzima glicosiltransferase compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30 ou SEQ ID N° 34; e [15] Póli alfa-1,3-glucano isolado produzido por meio do método conforme definido por qualquer das realizações 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14, em que o póli alfa-1,3-glucano possui valor L* de menos de 93.

EXEMPLOS

[110] A presente invenção é adicionalmente exemplificada nos Exemplos 2-12 fornecidos abaixo. Dever-se-á compreender que esses Exemplos, embora indiquem certos aspectos preferidos do presente, são apenas fornecidos como ilustração. A partir da discussão acima e desses Exemplos, o técnico no assunto pode determinar as características essenciais das realizações descritas e, sem abandonar o seu espírito e escopo, pode fazer diversas mudanças e modificações para adaptar as realizações descritas a vários usos e condições. MÉTODOS GERAIS MEDIÇÃO DE ICUMSA DE SACAROSE

[111] Medições de ICUMSA foram realizadas seguindo estritamente o Método ICUMSA GS1/3-7 (R. J. McCowage, R. M. Urquhart e M. L. Burge, Determination of the Solution Colour of Raw Sugers, Brown Sugars and Coloured Syrups at pH 7.0 - Official, Verlag Dr. Albert Bartens, revisão de 2011), que é incorporado ao presente como referência. As etapas essenciais da medição de cor ICUMSA de uma amostra de sacarose foram as seguintes. Adicionou-se sacarose a água deionizada (dissolvida, se em estado sólido como açúcar de cana; diluída, se em estado líquido como suco de beterraba) até concentração especificada com base na faixa de ICUMSA esperada, conforme especificado no Método ICUMSA GS1/3-7. A solução de sacarose foi filtrada para remover qualquer impureza não dissolvida e foi medida a absorção da solução de sacarose filtrada. A cor ICUMSA da solução foi então calculada de acordo com a Equação 1:

em que Abs = leitura de absorção da solução de amostra; b = caminho celular óptico (cm); e c = concentração de sacarose em g/ml.

[112] O método ICUMSA acima segue o Método ICUMSA GS1/3- 7, mas com as modificações a seguir: 1. Filtros de 0,45 micra de acetato de celulose (50 mm2) foram utilizados no lugar de filtros de 0,45 micra de nitrato de celulose. 2. Em vez de calcular RDS (“substância seca refratométrica”) e densidade, a concentração de sacarose de uma amostra foi determinada pelas etapas a seguir: salinidade ppt efetiva foi medida utilizando um refratômetro e convertida em %Brix utilizando relação linear obtida a partir de dados publicados (%Brix = 0,1258 salinidade ppt + 0,0152). As medições de índice de refração foram realizadas em amostras adicionalmente diluídas e os valores Brix convertidos de volta em concentrações padrão utilizadas na medição de UV.

[113] Utilizou-se água deionizada para dissolução de sacarose. Amostras de solução de sacarose não foram desaeradas, pois não foram observadas espumas nem bolhas nas soluções. Os filtros de acetato de celulose foram pré-abrigados em um funil de plástico para aplicações de filtro esterilizado. MEDIÇÃO DE CORES L*A*B* DE PÓLI ALFA-1,3-GLUCANO

[114] A cor de póli alfa-1,3-glucano foi medida com o uso do sistema de medição CIE L*a*b*. Dois métodos de preparação de amostra foram utilizados, dependendo da quantidade de póli alfa-1,3-glucano disponível. Os dois métodos forneceram medições L*a*b* equivalentes.

[115] No primeiro método, póli alfa-1,3-glucano seco foi moído em um moedor de café até virar um pó fino. 0,77 g de pó foram transferidos para um corante de pelotas KBr de 13 mm evacuável e o póli alfa-1,3-glucano foi formado em uma pelota a 7000 libras. A cor da pelota foi medida com o uso de um espectrofotômetro Konica Minolta 2600D.

[116] No segundo método, o póli alfa-1,3-glucano seco foi moído em um moedor de café até virar um pó fino. Póli alfa-1,3-glucano moído foi filtrado através de uma peneira de 60 mesh e colocado em uma cubeta de 1 cm. A cor do póli alfa-1,3-glucano moído foi medida utilizando um espectrofotômetro HUNTERLAB COLORQUEST XE. PREPARAÇÃO DE EXTRATOS BRUTOS DE ENZIMA GLICOSILTRANSFERASE (GTF)

[117] Enzimas gtf (por exemplo, SEQ ID N° 8) foram preparadas da seguinte forma. Células de E. coli TOP10® (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) foram transformadas com uma construção com base em pJexpress404® que contém uma sequência de DNA codificadora de gtf específica. Cada sequência foi idealizada com códon para expressar a enzima gtf em E. coli. Linhagens de E. coli individuais que expressam uma enzima gtf específica foram cultivadas em meio LB (Luria Broth) (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) com ampicilina (100 μg/mL) a 37 °C com agitação até OD6oo = 0,4-0,5, quando IPTG (isopropil beta-D-1- tiogalactopiranosida, Cat. n° I6758, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi adicionado até concentração final de 0,5 mM. As culturas foram incubadas por 2-4 horas a 37 °C após a indução de IPTG. Células foram colhidas por centrifugação a 5000 x g por quinze minutos e novamente suspensas (20% p/v) em tampão de fosfato de 50 mM com pH 7,0 suplementado com ditiotreitol (DTT, 1,0 mM). Células novamente suspensas atravessaram uma Célula de Pressão Francesa (SLM Instruments, Rochester, NY) duas vezes para garantir >95% de lise celular. Células lisadas foram centrifugadas por trinta minutos a 12000 x g a 4 °C. O sobrenadante resultante foi analisado por meio do teste de proteínas BCA (ácido bicinconínico) (Sigma-Aldrich) e SDS-PAGE para confirmar a expressão da enzima gtf e o sobrenadante foi armazenado a -20 °C. TAXA DE REAÇÃO RELATIVA DE GTF

[118] A reação enzimática de sacarose em póli alfa-1,3-glucano por glicosiltransferase segue a cinética de Michaelis-Menten. Em altas concentrações de sacarose, a taxa de reação é da ordem zero em sacarose. A concentração de sacarose foi medida por meio de HPLC periodicamente ao longo de toda a reação. A taxa de reação foi calculada como a taxa de consumo de sacarose durante a reação de ordem zero. Isso significa que a taxa de reação foi calculada como o negativo do declive da região linear de um gráfico de concentração de sacarose em comparação com o tempo. A taxa de reação foi dividida em seguida pela atividade de enzima carregada ao reator para gerar taxa de reação normalizada, o que eliminou as diferenças de taxa de reação devido a variações da concentração de enzima. Por fim, a taxa de reação normalizada foi dividida pela taxa de reação normalizada para açúcar refinado branco, para gerar a Taxa de Reação Relativa. DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA DE GTF

[119] A atividade da enzima gtf (por exemplo, SEQ ID N° 8) foi confirmada seguindo-se um protocolo como o abaixo, que mede a produção de açúcares redutores (frutose e glicose) em uma solução de reação gtf. Uma solução de reação é preparada adicionando-se um extrato de gtf bruto a uma mistura que contém sacarose (50 ou 150 g/l), tampão de fosfato de potássio (pH 6,5, 50 mM) e opcionalmente dextran (1 mg/ml, dextran T10, Cat N° D9260, SigmaAldrich); o extrato de gtf é adicionado a 2,5%-5% por volume. A solução de reação é então encubada a 22-25 °C por 24-30 horas e é centrifugada em seguida. Sobrenadante (0,01 ml) é adicionado a uma mistura que contém 1 N NaOH e 0,1% de cloreto de trifeniltetrazólio (Sigma- Aldrich). A mistura é incubada por cinco minutos e, em seguida, seu OD480nm é determinado com o uso de um espectrofotômetro ULTROSPEC (Pharmacia LKB, Nova Iorque NY) para medir a presença dos açúcares redutores, frutose e glicose. DETERMINAÇÃO DO GRAU DE POLIMERIZAÇÃO MÉDIO EM PESO (DPW):

[120] O DPw de um produto de glucano sintetizado por uma enzima gtf (por exemplo, SEQ ID N° 8) foi determinado por meio de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Um exemplo de protocolo SEC é o seguinte. Polímero de póli alfa-1,3-glucano seco é dissolvido a 5 mg/ml em N,N- dimetilacetamida (DMAc) e 5% de LiCl mediante agitação por uma noite a 100 °C. O sistema SEC é um módulo de separação Alliance® 2695 da Waters Corporation (Milford, MA) acoplado a três detectores online: um refratômetro diferencial 2410 da Waters, um fotômetro de dispersão de luz multiangular Heleos® 8+ da Wyatt Technologies (Santa Barbara, CA) e um viscômetro capilar diferencial ViscoStar® da Wyatt. As colunas utilizadas para SEC são quatro colunas de estirenodivinil benzeno da Shodex (Japão) e duas colunas lineares KD-806M, KD-802 e KD-801 para aprimorar a resolução na região de baixo peso molecular de uma distribuição de polímeros. A fase móvel é DMAc com 0,11% de LiCl. As condições cromatográficas utilizadas são 50 °C nos compartimentos de coluna e detector, 40 °C no compartimento de amostra e injetor, velocidade de fluxo de 0,5 ml/min e volume de injeção de 100 μL. Os pacotes de software utilizados para redução de dados são Empower® versão 3 da Waters (calibragem com amplo padrão de polímero de glucano) e Astra® versão 6 da Wyatt (método de detecção tripla com calibragem de coluna). DETERMINAÇÃO DE LIGAÇÕES GLICOSÍDICAS

[121] Ligações glicosídicas em um produto de glucano sintetizado por uma enzima gtf (por exemplo, SEQ ID N° 8) podem ser determinadas seguindo-se NMR 13C (ressonância magnética nuclear), conforme segue. Polímero de glucano seco (25-30 mg) é dissolvido em 1 ml de sulfóxido de dimetila deuterado (DMSO) que contém 3% em peso de LiCl com agitação a 50 °C. Utilizando uma pipeta de vidro, 0,8 ml da solução são transferidos para um tubo de NMR de 5 mm. Espectro de NMR 13C quantitativo é adquirido utilizando um espectrômetro NMR Bruker Avance de 500 MHz (Billerica, MA) equipado com uma criossonda CPDUL em frequência espectral de 125,76 MHz, utilizando uma janela espectral de 26041,7 Hz. Uma sequência de pulso de desacoplamento fechado inverso com o uso de desacoplamento de waltz é utilizada com tempo de obtenção de 0,629 segundos, atraso de pulso interno de cinco segundos e 6000 pulsos. Os dados de domínio de tempo são transformados utilizando multiplicação exponencial de 2,0 Hz. EXEMPLO 1 (COMPARATIVO) PREPARAÇÃO DE PÓLI ALFA-1,3-GLUCANO UTILIZANDO SACAROSE REFINADA BRANCA

[122] Este Exemplo descreve a produção de alfa-1,3-glucano em uma reação catalisada por gtf, utilizando sacarose refinada branca.

[123] Uma solução de sacarose de 80 g/l foi preparada da seguinte forma. 1500 g de água deionizada foram carregados em um reator de vidro de 2 l revestido e agitado, controlado a 23 °C. 2,7 g de tampão KH2PO4 foram adicionados ao reator. Em seguida, 160 g de sacarose refinada branca (ICUMSA 47; United Sugars Corporation, Bloomington, MN) foram adicionados ao reator, após o quê o volume do reator foi ajustado em 2 l com mais água deionizada. FermaSure® (DuPont) foi adicionado em seguida (1 ml/l de reação) e o pH foi ajustado em 5,5 com o uso de 5% em peso de hidróxido de sódio aquoso ou 5% em peso de ácido sulfúrico aquoso. A reação de polimerização de glucano foi iniciada adicionando-se 0,3% em volume de extrato de enzima gtf bruto (SEQ ID N° 8) (Métodos Gerais) e mantida a 23 °C.

[124] Após determinar-se a reação como concluída pelo consumo completo de sacarose ou pela falta de mudança na concentração de sacarose entre as medições, 200 ml da calda de reação foram filtrados utilizando FILTRATEST (Bokela GmbH, Karlsruhe, Alemanha). Essa filtragem separou o líquido mãe (filtrado) do bolo úmido de póli alfa-1,3- glucano. Açúcares residuais no aglomerado úmido foram retirados com duas lavagens de deslocamento (200 l cada) de água deionizada. O aglomerado úmido foi seco em seguida em forno de convecção a 80 °C por cerca de 24 horas. O rendimento de polimerização foi calculado utilizando o peso final de polímero seco dividido pela quantidade de sacarose reagida.

[125] O peso molecular do produto póli alfa-1,3-glucano foi medido por meio de SEC (Métodos Gerais) e é apresentado como DPw (Tabela 2), que pode ser calculado como o peso molecular de polímero médio dividido pelo peso molecular de monômero. A cor do produto de polímero de glucano seco foi medida de acordo com os Métodos Gerais e é apresentada como L* na Tabela 2. EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DE PÓLI ALFA-1,3 GLUCANO UTILIZANDO VHP SACAROSE

[126] Este Exemplo descreve a produção de alfa-1,3-glucano em uma reação catalisada por gtf com o uso de VHP, que é um tipo de sacarose incompletamente refinada.

[127] Seguiu-se o procedimento de polimerização do Exemplo 1, exceto pelo uso de sacarose VHP (ICUMSA 501, Moinho Iracema, Brasil) no lugar de sacarose refinada branca.

[128] Após determinar-se a reação como concluída pelo consumo completo de sacarose ou pela ausência de alteração da concentração de sacarose entre as medições, a calda de reação foi filtrada com o uso de um funil Buchner e frasco a vácuo. Essa filtragem separou o líquido mãe (filtrado) do aglomerado úmido de póli alfa-1,3-glucano. Açúcares residuais no aglomerado úmido foram retirados com duas lavagens de deslocamento (1 l cada) de água deionizada. O aglomerado úmido foi seco em seguida em um forno a vácuo a 40 °C e 360 mm Hg por cerca de 48 horas. O rendimento de polimerização foi calculado utilizando o peso final de polímero seco dividido pela quantidade de sacarose reagida. O peso molecular, o rendimento e a cor de póli alfa-1,3-glucano preparado neste procedimento são apresentados na Tabela 2.

[129] Portanto, póli alfa-1,3-glucano pode ser sintetizado em uma solução de reação de gtf que compreende sacarose incompletamente refinada. EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DE PÓLI ALFA-1,3-GLUCANO UTILIZANDO SACAROSE VVHP

[130] Este Exemplo descreve a produção de alfa-1,3-glucano em uma reação catalisada por gtf utilizando VVHP, que é um tipo de sacarose incompletamente refinada.

[131] Foram seguidos os procedimentos de polimerização e isolamento de polímero do Exemplo 2, exceto pelo uso de sacarose VVHP (ICUMSA 421, Moinho Ferrari, Brasil) em vez de sacarose VHP. O peso molecular, rendimento e cor de póli alfa-1,3-glucano preparado neste procedimento são apresentados na Tabela 2.

[132] Assim, póli alfa-1,3-glucano pode ser sintetizado em uma solução de reação gtf que compreende sacarose incompletamente refinada. EXEMPLO 4 PREPARAÇÃO DE PÓLI ALFA-1 ,3-GLUCANO UTILIZANDO SUCO ESPESSO DE BETERRABA

[133] Este Exemplo descreve a produção de alfa-1,3-glucano em uma reação catalisada por gtf utilizando uso de suco espesso de beterraba, que é um tipo de sacarose incompletamente refinada.

[134] Os procedimentos de polimerização e isolamento de polímero do Exemplo 2 foram seguidos de forma geral, exceto pelo uso de sacarose de suco espesso de beterraba (ICUMSA 1414, Southern Minnesota Beet Sugar Cooperative) foi utilizada em vez de sacarose VHP. O procedimento de polimerização foi conduzido da seguinte forma. 235 g de suco espesso de beterraba foram adicionados ao reator e diluídos com água deionizada até concentração de sacarose de 80 g/l (cerca de 1765 ml de água foram adicionados). 2,72 g de tampão KH2PO4 foram adicionados e o pH foi ajustado em 5,5 com 5% em peso de hidróxido de sódio. A reação de polimerização de glucano foi iniciada adicionando-se 0,3% em volume de extrato de enzima gtf bruta (SEQ ID N° 8) (Métodos Gerais) e mantida a 23 °C. O peso molecular, rendimento e cor do póli alfa-1,3-glucano preparado neste procedimento são apresentados na Tabela 2.

[135] Póli alfa-1,3-glucano pode ser sintetizado, portanto, em uma solução de reação gtf que compreende sacarose incompletamente refinada. EXEMPLO 5 PREPARAÇÃO DE PÓLI ALFA-1,3-GLUCAN UTILIZANDO SUCO FINO DE BETERRABA

[136] Este Exemplo descreve a produção de alfa-1,3-glucano em uma reação catalisada por gtf com o uso de suco fino de beterraba, que é um tipo de sacarose incompletamente refinada.

[137] Os procedimentos de polimerização e isolamento de polímero do Exemplo 2 foram seguidos de forma geral, exceto pelo uso de sacarose de suco fino de beterraba (ICUMSA 1158, Southern Minnesota Beet Sugar Cooperative) em vez de sacarose VHP e uma lavagem de 1 l seguida por lavagem de 500 ml com água foram utilizadas em vez de duas lavagens de 1 l. 1229 ml de suco fino de beterraba foram adicionados a 771 ml de água deionizada para preparar uma concentração de sacarose inicial de 80 g/l. 2,72 g de tampão KH2PO4 foram adicionados e o pH foi ajustado em 5,5 com 5% em peso de ácido sulfúrico. A reação de polimerização de glucano foi iniciada adicionando-se 0,3% em volume de extrato de enzima gtf bruta (SEQ ID N° 8) (Métodos Gerais) e mantida a 23 °C. O peso molecular, rendimento e cor do póli alfa-1,3-glucano preparado neste procedimento são apresentados na Tabela 2.

[138] Assim, póli alfa-1,3-glucano pode ser sintetizado em uma solução de reação gtf que compreende sacarose incompletamente refinada. EXEMPLO 6 PREPARAÇÃO DE PÓLI ALFA-1,3-GLUCANO UTILIZANDO MELAÇOS DE BETERRABA

[139] Este Exemplo descreve a produção de alfa-1,3-glucano em uma reação catalisada por gtf utilizando melaço de beterraba, que é um tipo de sacarose incompletamente refinada.

[140] Os procedimentos de polimerização e isolamento de polímero do Exemplo 2 foram seguidos de forma geral, exceto pelo uso de melaço de beterraba (ICUMSA 57781, Southern Minnesota Beet Sugar Cooperative) em vez de sacarose VHP e três lavagens com 1 l de água foram utilizadas em vez de duas lavagens de 1 l. 291 ml de melaço de beterraba foram adicionados a 1709 ml de água deionizada para preparar concentração de sacarose inicial de 83,4 g/l. 2,72 g de tampão KH2PO4 foram adicionados e o pH foi ajustado em 5,5 com 5% em peso de hidróxido de sódio. A reação de polimerização de glucano foi iniciada adicionando-se 0,3% em volume de extrato de enzima gtf bruta (SEQ ID N° 8) (Métodos Gerais) e mantida a 23 °C. O peso molecular, rendimento e cor do póli alfa-1,3-glucano preparado neste procedimento são apresentados na Tabela 2.

[141] Assim, póli alfa-1,3-glucano pode ser sintetizado em uma solução de reação de gtf que compreende sacarose incompletamente refinada. EXEMPLO 7 PREPARAÇÃO DE PÓLI ALFA-1,3-GLUCANO UTILIZANDO AÇÚCAR DE CANA BRUTO DO BRASIL

[142] Este Exemplo descreve a produção de alfa-1,3-glucano em uma reação catalisada por gtf utilizando açúcar de cana bruto do Brasil, que é um tipo de sacarose incompletamente refinada.

[143] Em um frasco Erlenmeyer de 1 litro, 75 g de açúcar de cana bruto do Brasil (ICUMSA 2655) foram dissolvidos em cerca de 500 ml de água deionizada. 1,02 g de KH2PO4 e 0,15 ml de FermaSure® foram adicionados, depois água foi adicionada para um volume de 750 mL. O pH foi ajustado em 5,5 utilizando 5% em peso de hidróxido de sódio. O frasco foi colocado em um forno agitador de incubação a 25 °C. A reação de polimerização de glucano foi iniciada adicionando-se 0,3% em volume de extrato de enzima gtf bruta (SEQ ID N° 8) (Métodos Gerais) e mantida a 25 °C. A reação foi concluída em trinta horas. Após a conclusão da reação, a reação foi filtrada com um funil de Buchner e frasco a vácuo. O aglomerado resultante foi lavado por meio de deslocamento com duas lavagens com água de 800 ml e uma lavagem com água de 200 ml. O póli alfa- 1,3-glucano foi seco em forno a vácuo a 40 °C. O peso molecular, rendimento e cor do póli alfa-1,3-glucano preparado neste procedimento são apresentados na Tabela 2.

[144] Póli alfa-1,3-glucano pode, portanto, ser sintetizado em uma solução de reação gtf que compreende sacarose incompletamente refinada. EXEMPLO 8 PREPARAÇÃO DE PÓLI ALFA-1,3-GLUCANO UTILIZANDO AÇÚCAR DE CANA BRUTO DE NOVA ORLEANS

[145] Este Exemplo descreve a produção de alfa-1,3-glucano em uma reação catalisada por gtf utilizando de açúcar de cana bruto de Nova Orleans, que é um tipo de sacarose incompletamente refinada.

[146] Foram seguidos os procedimentos de polimerização e isolamento de polímero do Exemplo 7, exceto pelo uso de açúcar de cana bruto de Nova Orleans (ICUMSA 2850) como componente de sacarose. O peso molecular, rendimento e cor do póli alfa-1,3-glucano preparado neste procedimento são apresentados na Tabela 2.

[147] Póli alfa-1,3-glucano pode, portanto, ser sintetizado em uma solução de reação gtf que compreende sacarose incompletamente refinada. EXEMPLO 9 PREPARAÇÃO DE PÓLI ALFA-1 ,3-GLUCANO UTILIZANDO O AÇÚCAR DE CANA BRUTO DE MOÇAMBIQUE

[148] Este Exemplo descreve a produção de alfa-1,3-glucano em uma reação catalisada por gtf utilizando açúcar de cana bruto de Moçambique, que é um tipo de sacarose incompletamente refinada.

[149] Foram seguidos os procedimentos de polimerização e isolamento de polímero do Exemplo 7, exceto pelo uso de açúcar de cana bruto de Moçambique (ICUMSA 3022) como componente de sacarose. O peso molecular, rendimento e cor do póli alfa-1,3-glucano preparado neste procedimento são apresentados na Tabela 2.

[150] Assim, póli alfa-1,3-glucano pode ser sintetizado em uma solução de reação gtf que compreende sacarose incompletamente refinada. EXEMPLO 10 PREPARAÇÃO DE PÓLI ALFA-1,3-GLUCANO UTILIZANDO AÇÚCAR DE CANA BRUTO DO ZIMBÁBUE

[151] Este Exemplo descreve a produção de alfa-1,3-glucano em uma reação catalisada por gtf utilizando açúcar de cana bruto do Zimbábue, que é um tipo de sacarose incompletamente refinada.

[152] Foram seguidos os procedimentos de polimerização e isolamento de polímero do Exemplo 7, exceto pelo uso de açúcar de cana bruto do Zimbábue (ICUMSA 4183) como componente de sacarose. O peso molecular, rendimento e cor do póli alfa-1,3-glucano preparado neste procedimento são apresentados na Tabela 2.

[153] Póli alfa-1,3-glucano pode, portanto, ser sintetizado em uma solução de reação gtf que compreende sacarose incompletamente refinada. EXEMPLO 11 PREPARAÇÃO DE PÓLI ALFA-1,3-GLUCANO UTILIZANDO AÇÚCAR DE CANA BRUTO DE BELIZE

[154] Este Exemplo descreve a produção de alfa-1,3-glucano em uma reação catalisada por gtf utilizando açúcar de cana bruto de Belize, que é um tipo de sacarose incompletamente refinada.

[155] Foram seguidos os procedimentos de polimerização e isolamento de polímero do Exemplo 7, exceto pelo uso de açúcar de cana bruto de Belize (ICUMSA 5150) como componente de sacarose. O peso molecular, rendimento e cor de póli alfa-1,3-glucano preparado neste procedimento são apresentados na Tabela 2.

[156] Póli alfa-1,3-glucano pode, portanto, ser sintetizado em uma solução de reação gtf que compreende sacarose incompletamente refinada. EXEMPLO 12 PREPARAÇÃO DE PÓLI ALFA-1,3-GLUCANO UTILIZANDO AÇÚCAR DE CANA BRUTO DA GUIANA

[157] Este Exemplo descreve a produção de alfa-1,3-glucano em uma reação catalisada por gtf utilizando açúcar de cana bruto de Guiana, que é um tipo de sacarose incompletamente refinada.

[158] Foram seguidos os procedimentos de polimerização e isolamento de polímero do Exemplo 7, exceto pelo uso de açúcar de cana bruto de Guiana (ICUMSA 8153) como componente de sacarose. O peso molecular, rendimento e cor de póli alfa-1,3-glucano preparado neste procedimento são apresentados na Tabela 2.

[159] Póli alfa-1,3-glucano pode, portanto, ser sintetizado em uma solução de reação gtf que compreende sacarose incompletamente refinada. TABELA 2

[160] Póli alfa-1,3-glucano produzido utilizando vários tipos de sacarose incompletamente refinada:

a Taxas relativas das reações dos Exemplos 2-12 foram calculadas com relação à taxa da reação do Exemplo 1. b Este L* foi determinado para o polímero produzido de acordo com o procedimento do Exemplo 1, exceto pelo uso de reação de 500 ml em vez de 2-L e o produto foi seco em um forno a 40 °C e 360 mm Hg por cerca de 48 horas.

[161] Os dados da Tabela 2 geralmente indicam que as soluções de reação de gtf que compreendem sacarose incompletamente refinada (Exemplos 2-12) podem apresentar desempenho no mesmo nível, ou até melhor, que soluções de reação de gtf que compreendem sacarose refinada branca (Exemplo 1). Em sua maioria, reações que contêm sacarose incompletamente refinada tiveram taxas de reação quase ou completamente equivalentes à taxa de uma reação que contém sacarose refinada branca. Além disso, várias reações que contêm sacarose incompletamente refinada produziram glucano com DPw e/ou rendimento maior do que o observado utilizando sacarose refinada branca (por exemplo, Exemplos 2-6).

[162] Diversos tipos diferentes de sacarose incompletamente refinada podem, portanto, ser utilizados para produzir enzimaticamente póli alfa- 1,3-glucano.

Claims (13)

1. SOLUÇÃO DE REAÇÃO, caracterizada por compreender água, sacarose e uma enzima glicosiltransferase que sintetiza o póli alfa-1,3- glucano insolúvel com pelo menos 50% de ligações alfa-1,3-glicosídicas e um grau de polimerização médio em peso (DPw) de pelo menos 100, em que a sacarose é não refinada ou parcialmente refinada, e tem um valor de ICUMSA (Comissão Internacional para Métodos Uniformes de Análise de Açúcar) maior do que 150; em que o rendimento do póli alfa-1,3-glucano pela solução de reação é de pelo menos 7% do peso de sacarose que foi convertido em produtos na solução de reação.

2. SOLUÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela sacarose ter um valor de ICUMSA maior do que 400.

3. SOLUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pela taxa de reação relativa da mencionada solução de reação ser de pelo menos 0,8 com relação à taxa de reação de uma solução de reação que compreende água, sacarose refinada branca e a mencionada enzima glicosiltransferase.

4. SOLUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo póli alfa-1,3-glucano produzido pela solução de reação possuir um valor de L* menor que 93, em que o valor de L* designa a claridade do póli alfa-1,3-glucano, e em que um valor de L* = 0 indica preto e um valor de L* = 100 indica branco difuso.

5. SOLUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela enzima glicosiltransferase compreender uma sequência de aminoácido de SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30 ou SEQ ID N° 34.

6. SOLUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo dito póli alfa-1,3-glucano ter pelo menos 90% de ligações alfa-1,3-glicosídicas.

7. MÉTODO PARA PRODUÇÃO DO PÓLI ALFA-1,3- GLUCANO INSOLÚVEL, caracterizado por compreender: (a) contato de pelo menos água, sacarose e uma enzima glicosiltransferase, em que a sacarose é não refinada ou parcialmente refinada e tem um valor de ICUMSA (Comissão Internacional para Métodos Uniformes de Análise de Açúcar) maior do que 150, de forma que o póli alfa-1,3-glucano é produzido com pelo menos 50% de ligações alfa-1,3-glicosídicas e um grau de polimerização médio em peso (DPw) de pelo menos 100; e em que o rendimento de póli alfa-1,3-glucano é pelo menos 7% do peso de sacarose convertido em produtos na etapa (a).

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por ainda compreender a etapa de (b) isolamento do póli alfa-1,3-glucano produzido na etapa (a).

9. SOLUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado pela sacarose ser de beterraba e não ter sido cristalizada, ou pela sacarose ser de cana de açúcar e (i) não ter sido cristalizada; ou (ii) ter sido cristalizada utilizando não mais do que três etapas de cristalização.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela sacarose possuir um valor de ICUMSA de mais de 400.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pela taxa de reação relativa de produção do póli alfa-1,3- glucano na etapa (a) ser de pelo menos 0,8 com relação à taxa de reação da etapa (a) se sacarose refinada branca for utilizada no lugar da mencionada sacarose não refinada ou parcialmente refinada.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo póli alfa-1,3-glucano isolado na etapa (b) possuir um valor de L* menor que 93, e em que o valor de L* designa a claridade do póli alfa-1,3-glucano, e em que um valor de L* = 0 indica preto e um valor de L* = 100 indica branco difuso.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pela enzima glicosiltransferase compreender uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 14, SEQ ID N° 20, SEQ ID N° 26, SEQ ID N° 28, SEQ ID N° 30 ou SEQ ID N° 34.