CN101027072B

CN101027072B - 用于预防和/或治疗心血管疾病的草药药物组合物及其制备方法

Info

Publication number: CN101027072B
Application number: CN2005800326109A
Authority: CN
Inventors: 沈重光; 庄武璋
Original assignee: Sun Ten Phytotech Co Ltd
Current assignee: Sun Ten Phytotech Co Ltd
Priority date: 2004-08-27
Filing date: 2005-08-24
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2025-08-24
Also published as: CN101027072A; WO2006026284A3; EP1781107B1; US7258877B2; EP1781107A2; KR20070060085A; EP1781107B8; KR101302377B1; CA2578181A1; EP1781107A4; WO2006026284A2; AU2005280235A1; US20050025843A1; JP2008511629A

Abstract

本发明提供了一种草药药物组合物，其包含黄芩根、黄连根状茎、大黄的根和根状茎以及人参(或西洋参)根的提取物。该草药药物组合物可有效治疗高血压或缺血、保护血管内皮免受变性、和降低血压或维持稳定血压。

Description

用于预防和/或治疗心血管疾病的草药药物组合物及其制备方法

相关申请

本发明是2002年6月10日提交的美国专利申请No.10/164,568的部分连续(CIP)申请，美国专利申请No.10/164,568要求2001年12月21日提交的台湾申请No.90131897的优先权。两个申请的内容均引入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及一种药物组合物，其包含黄芩根(Radix Scutellariae)、黄连根状茎(Rhizoma Coptidis)、大黄根/根状茎(Radix et RhizomaRhei)和人参根(Radix Ginseng)的提取物，用于改善血管扩张和/或维持正常血管扩张、降低血压和维持稳定的血压、以及保护血管中的内皮细胞免于变性。本发明还涉及制备和使用该草药药物组合物的方法。

背景技术

根据来自世界卫生组织(WHO)的资料，在1999年全球死亡中1/3是因为心血管疾病，并且预计到2010年其将是发展中国家的首要死亡原因。心血管疾病是一类心脏和血管病症的名称，包括但不限于，高血压(高血压)、冠心病(心脏病发作)、脑血管疾病(中风)、外周血管疾病、心力衰竭、风湿性心脏病、先天性心脏病和心肌病。

高血压是迄今为止最普遍的心血管疾病。据估计三分之一以上年龄为45岁或更年长的美国人患有高血压，他们中有50％以上的人年龄为60岁或更年长。未经治疗的高血压可能导致严重的并且威胁生命的并发症，例如，中风、冠心病、动脉硬化、动脉粥样硬化、心力衰竭、肾衰竭和失明。

正如美国高血压全国联合委员会第七次报告(JNC-VII)所显示的，目前高血压的治疗包括利尿剂、α-阻滞剂、β-阻滞剂、钙通道阻滞剂、ACE抑制剂和血管紧张素拮抗剂。这些药剂可以作为单一疗法使用或联合使用。然而，大多数这些药剂减轻症状但不治愈疾病。这些药剂还常常伴随着副作用。

引起人类高血压的主要机制之一是内皮功能障碍。内皮是排列在心脏以及血管和淋巴管腔内表面的内皮细胞层。其主要作用是通过产生血管扩张和血管收缩的介质来调节血管紧张度和结构。

当被特异性激动剂例如乙酰胆碱激活时，内皮细胞产生一氧化氮(“NO”)，其是通过内皮NO合酶(“eNOS”)活性进行L-精氨酸降解而衍生的不稳定物质。NO是强效松弛剂，它还抑制血小板聚集和平滑肌细胞增殖。

病理状态下，例如高血压或衰老，激动剂诱导的内皮刺激导致环氧合酶途径的激活并随之产生环氧合酶依赖因子，包括血栓烷A2或前列腺素H2、或自由基(例如超氧阴离子)。功能障碍的内皮还可引起血管损伤，尤其是，动脉粥样硬化。

环氧合酶具有两种异构体，环氧合酶1和2(COX-1和COX-2)，又称前列腺素内过氧化物合酶1和2，它们是在花生四烯酸转化成前列腺素、血栓烷和其它二十碳烷中的关键酶。由于它们在组织表达和调节中的显著差异，COX-1和COX-2被认为具有不同的生理功能。COX-1是组成型酶，所有时间都存在于机体内并负责产生细胞保护性前列腺素，这对于内环境稳定功能是重要的，例如维持胃粘膜的完整性、介导正常的血小板作用和调节肾脏血流。相比较而言，COX-2是环氧合酶的迅速诱导形式，它导致产生促炎性前列腺素。尽管COX-2的表达在基础状态下被高度限制，它在炎症期间被显著上调。COX-2的参与以及前列腺素的产生增加与多种疾病和病症有关，例如脑缺血和癌症，以及出现NO水平升高的疾病和病症。

NO调节COX-2活性并参与炎症和自身免疫介导的组织损害。NO对COX-2的作用是剂量依赖型的。低水平NO激活COX-2。相比较而言，由诱导型一氧化氮合酶(“NOS”)产生的大量NO可以抑制COX-2的诱导并阻止COX-2代谢物的形成。

iNOS在心肌梗塞(MI)后和心力衰竭中的心肌中表达。心肌是由心脏肌肉组成的心脏壁的中间和最厚的层。iNOS上调或过度表达与轻度炎症细胞浸润、心肌纤维化、肥大和扩张有关。心脏肥大是充血性心力衰竭(CHF)形成的显著风险因素。iNOS过度表达导致NO的过量产生，引起心肌功能障碍和CHF。

CHF是存在心脏功能削弱并伴随水肿的一种心脏病形式。CHF具有多种不同的原因，包括向心肌供血的动脉狭窄(冠心病)、先前的心脏病发作(心肌梗塞)使得疤痕组织足够大或其定位以致于影响正常的心电功能、高血压等等。CHF是影响成年人的最严重心血管疾病之一。CHF患者超过4百万并且发病率在上升。随着人口的老龄化，该病或病症的发病率正在增加，并且目前是老年人住院的最常见原因。美国每年用于CHF上的保健总费用超过五十亿美元。

心房纤维性颤动(AF)是以心房心肌的快速随机性收缩为特征的心房心律不齐，它引起总体上地不规律、通常快速的心率。由于炎症促使的心房结构变化，AF可能持续存在。C-反应蛋白(CRP)是全身性炎症的标记物，它可预示心血管事件和中风，它们是AF常见的后遗症。CRP还诱导内皮细胞表达粘附分子。

多年来，尽管西医一直在寻找一种万能药，但是研究者转向传统的中草药来治疗多种疾病。中草药已经存在了几千年并一直用于治疗多种疾病。

例如，三黄泻心汤是古老的草药汤药，其最早描述于《金匮要略》(翻译成英语是“the Prescriptions From the Golden Chamber”)中，用于“去火，清三体”(“purging fire and clearing the three torsos”)，并因此适用于心气不足(insufficient cardiac“Chi”)，吐血、咳血。该汤药由等量的黄芩根(Radix Scutellariae)、黄连根状茎(RhizomaCoptidis)和大黄根和根状茎(Radix et Rhizoma Rhei)制成。该汤药有苦味并且性凉。该汤药意欲用于充血、潮红、烦躁、肩膀僵硬、胃气郁滞(gastric obstructive depression)、便秘和实脉(forceful pulse)的患者。然而，该汤药禁忌或不适于长时间出血、显著贫血和微弱脉象症状的患者。

美国专利No.5,443,839公开了具有抗炎、抗过敏或抗衰老活性的组合物，其中包含黄芩提取物。没有指出该组合物可有效治疗心血管疾病和高血压。

美国专利No.6,274,177公开了一种制备姜(Zingiber officinale)提取物的方法，其有效用于抗炎和抗血小板聚集。没有指出该草药组合物可有效治疗心血管疾病和高血压。

美国专利No.6,340,480公开了一种通过促进全身血管松弛和扩张来治疗包括高血压在内的循环病症的组合物和方法。该组合物是L-精氨酸、人参和大枣(Zizyphi fructus)的口服或局部施用形式的天然组合。该组合协同作用来合成NO，由此促进全身血管松弛和扩张。所述成分组合可以用来维持NO临界阈值水平在自身不能产生NO的区域，由此促进全身血管松弛和扩张以降低高血压。然而，不清楚该草药组合物是否可有效治疗心血管疾病。

在母案申请美国专利申请No.10/164,568中描述了一种草药药物组合物，其包含黄芩根(Radix Scutellariae)提取物、黄连根状茎(Rhizoma Coptidis)提取物、大黄根/根状茎(Radix et Rhizoma Rhei)提取物、和人参根(Radix Ginseng)或西洋参根(Radix PanacisQuinquefolii)的粉末。该草药药物组合物可有效用于预防和治疗心血管疾病。该组合物还是无毒的，因此可以用于所有年龄和身体条件包括体弱、早期和虚弱的患者。

在本CIP申请中，描述了稍微不同的草药药物组合物，其中用人参根提取物代替人参根(Radix Ginseng)粉末。本发明的草药药物组合物不仅仅证实在预防和治疗心血管疾病中具有相似的作用，还显示出改善血管扩张和/或维持正常血管扩张的出色功能；以及对血管内皮细胞的保护功能，尤其是通过防止内皮细胞的变性。

发明内容

本发明提供一种草药药物组合物，其包含黄芩根(RadixScutellariae)、黄连根状茎(Rhizoma Coptidis)、大黄根/根状茎(Radixet Rhizoma Rhei)和人参根(Radix Ginseng)提取物，其中用至少一种选自水和醇的溶剂分别提取黄芩根、黄连根状茎、大黄根/根状茎、人参根来制备该提取物。

本发明药物组合物的黄芩根、黄连根状茎、大黄根和根状茎、以及人参根的重量比约为1-2∶1-2∶1-2∶1-2，优选约1∶1∶2∶1。优选地，在约98±5℃用水提取黄芩根和黄连根状茎；在约70±5℃用约95％乙醇提取大黄根/根状茎；和在约70±5℃用约50％乙醇提取人参根。

通过提取、过滤和浓缩单独地处理本发明药物组合物的提取物。这样使得每单种草药提取物变成浓缩膏。然后每种浓缩膏进一步干燥成单独的浓缩粉末。任选地，可以在浓缩步骤之前添加药学可接受的载体以便于浓缩膏的干燥。进一步混合、合并和粒化每单种草药的浓缩粉末以形成可以装入胶囊的颗粒。

本发明的药物组合物具有在哺乳动物中改善血管扩张和/或维持正常血管扩张、降低和/或维持稳定的血压、以及保护血管内皮细胞免于变性的作用。血管扩张是指血管的扩张，尤其是指导致部分血管血流增加的小动脉的扩张。

本发明进一步提供了制备本发明草药药物组合物的方法，它包含下面的步骤：(1)用溶剂(由水或乙醇或其混合物组成)单独提取黄芩根、黄连根状茎、大黄根/根状茎和人参根，分别形成黄芩根提取物、黄连根状茎提取物、大黄根/根状茎提取物、和人参根提取物；(2)独分别过滤并浓缩黄芩根、黄连根状茎、大黄根/根状茎和人参根各自的提取物，以形成黄芩根、黄连根状茎、大黄根/根状茎和人参根各自的草药浸膏；(3)分别干燥黄芩根、黄连根状茎、大黄根/根状茎和人参根各自的草药浸膏，以形成黄芩根、黄连根状茎、大黄根/根状茎和人参根各自的浓缩粉末；(4)将黄芩根、黄连根状茎和大黄根/根状茎各自的浓缩粉末与所述的人参根浓缩粉末相混合，以形成草药粉末混合物；和(5)粒化所述草药粉末混合物以形成所述草药药物组合物的颗粒。任选地，可以在干燥过程之前在各种草药浸膏中添加药学可接受的赋形剂或载体。所述药物组合物的颗粒可以装入胶囊。

最后，本发明提供通过向哺乳动物例如人施用有效量的本发明草药药物组合物，来改善所述哺乳动物中血管扩张和/或维持其正常血管扩张、降低和/或维持所述哺乳动物中稳定的血压并保护所述哺乳动物中血管内皮细胞免于变性的方法。优选地将该草药药物组合物口服施用于哺乳动物。

附图说明

图1显示生产本发明药物组合物的制造工艺流程图。QC：质量控制。在QC过程中，有4个样品收集点，它们是(a)草药成分阶段(包含原材料)；(b)药物物质阶段(包含各种草药的浓缩粉末)；(c)半成品阶段(包含混合颗粒)；和(d)药物成品阶段(包含胶囊)。

图2比较各种年龄的SHR大鼠中响应乙酰胆碱的血管扩张：SHR-12W对照(●)、SHR-15W对照(□)、SHR-18W对照(▲)和SHR-25W对照(○)。＊表示指定组的血管扩张与SHR-25W对照组有统计学差异(p＜0.05，两因素ANOVA)。

图3比较12周龄的SHR大鼠响应乙酰胆碱的血管扩张：对照(■)和SB221(◇)组。SB211组被施用了本发明的药物组合物。

图4比较15周龄的SHR大鼠响应乙酰胆碱的血管扩张：对照(■)和SB221(◇)组。SB211组被施用了本发明的药物组合物。

图5比较18周龄的SHR大鼠响应乙酰胆碱的血管扩张：对照(■)和SB221(◇)组。SB211组被施用了本发明的药物组合物。＊表示SB221组与对照组的血管扩张具有统计学显著差异(p＜0.05，两因素ANOVA)。

图6比较25周龄的SHR大鼠响应乙酰胆碱的血管扩张：对照(■)和SB221(◇)组。SB211组被施用了本发明的药物组合物。＊表示SB221组与对照组的血管扩张具有统计学显著差异(p＜0.05，两因素ANOVA)。

图7比较各种年龄的WKY大鼠响应乙酰胆碱的血管扩张：WKY-12W对照(◆)、WKY-15W对照(□)、WKY-18W对照(▲)和WKY-25W对照(○)。＊表示指定组的血管扩张与WKY-25W对照组具有统计学差异(p＜0.05，两因素ANOVA)。

图8比较12周龄的WKY大鼠响应乙酰胆碱的血管扩张：对照(■)和SB221(◇)组。SB211组被施用了本发明的药物组合物。＊表示SB221组与对照组的血管扩张具有统计学显著差异(p＜0.05，两因素ANOVA)。

图9比较15周龄的WKY大鼠响应乙酰胆碱的血管扩张：对照(■)和SB221(◇)组。SB211组被施用了本发明的药物组合物。

图10比较18周龄的WKY大鼠响应乙酰胆碱的血管扩张：对照(■)和SB221(◇)组。SB211组被施用了本发明的药物组合物。

图11比较25周龄的WKY大鼠响应乙酰胆碱的血管扩张：对照(■)和SB221(◇)组。SB211组被施用了本发明的药物组合物。

图12显示SB221对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒性研究结果，其基于细胞介质中发现的乳酸脱氢酶(LDH)活性(以细胞裂解物的％表示)(n＝3)。将LDH活性的结果与基础LDH值(其中细胞在无SB221的条件下生长)和全细胞裂解物(其中收集所有细胞并匀浆)进行比较。全细胞裂解物以100％LDH值表示。该研究结果显示基础组和SB221组的LDH活性没有统计学差异(在10^-6至10^-3g/ml之间)。HUVEC的基础LDH活性约为总裂解物的14％并且SB221组与基础组的LDH活性的差异在3％以内。基础组和SB221组的LDH活性与全细胞裂解物显著不同。

图13显示SB221对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的细胞毒性研究结果，其基于从SB221处理的细胞和给出基础值的对照细胞(即未用SB221处理的细胞)中收集的细胞介质的MTT四唑盐比色法测验(n＝7)。使用单因素ANOVA进行数据分析。结果显示对照组和SB221组之间没有统计学显著差异。

图14显示SHR对照大鼠胸主动脉组织横切面的CD31免疫组化染色：(A)SHR-12W对照、(B)SHR-15W对照、(C)SHR-18W对照和(D)SHR-25W对照。CD31是广泛分布的质量130-140kD的单链糖蛋白，在白细胞(T和B细胞、单核细胞、粒细胞、血小板、40％骨髓细胞)、内皮细胞和平滑肌细胞上发现。使用1∶300浓度的CD31抗体在光学显微镜400×下拍照片。箭头表示内皮细胞，其组成排列在血管腔内面的细胞层。(C)和(D)中显示的内皮(内皮细胞层)包含不均匀的并部分剥开的表面，暴露出一些间皮层。

图15显示用SB221处理的SHR大鼠胸主动脉组织横切面的CD31免疫组化染色：(A)SHR-12W SB221、(B)SHR-15W SB221、(C)SHR-18W SB221和(D)SHR-25W SB221。使用1∶300浓度的CD31抗体在光学显微镜400×下拍照片。箭头表示内皮细胞。SB221处理后，所有年龄组的内皮细胞包含平滑和均匀的表面，这与未用SB221处理的18周龄和25周龄大鼠相反，它们具有不均匀的并部分剥开表面的内皮细胞(见图14的(C)和(D))。

图16显示WKY对照大鼠胸主动脉组织横切面的CD31免疫组化染色：(A)WKY-12W对照、(B)WKY-15W对照、(C)WKY-18W对照和(D)WKY-25W对照。使用1∶300浓度的CD31抗体在光学显微镜400×下拍照片。箭头表示内皮细胞。WKY对照大鼠的内皮细胞显示平滑和均匀的表面。

图17显示用SB221处理的WKY大鼠胸主动脉组织横切面的CD31免疫组化染色：(A)WKY-12W SB221、(B)WKY-15W SB221、(C)WKY-18W SB221和(D)WKY-25W SB221。使用1∶300浓度的CD31抗体在光学显微镜400×下拍照片。箭头表示内皮细胞。SB221(本发明的药物组合物)处理后，WKY大鼠的内皮细胞显示平滑和均匀的表面。

具体实施方式

本发明提供用于预防和治疗心血管疾病的新的草药药物组合物，它适用于所有年龄和多种身体条件的患者，包括老年和虚弱者。

心血管疾病的科学和医学了解的最近进展提供了这些疾病中更多有关内皮损伤、一氧化氮(NO)、炎症反应和C-反应蛋白(CRP)的知识。内皮中由内皮一氧化氮合酶(eNOS)产生的NO不仅是强效的血管扩张剂，而且还抑制血小板聚集、平滑肌细胞增殖、单核细胞粘附和粘附分子表达，从而维持内皮组织的完整性。环氧合酶(COX)-依赖性因子包括前列腺素和氧自由基的产生，可能是内皮功能障碍的主要原因。然后功能障碍的内皮可能是造成血管损伤的主要机制之一，这又可以进一步导致更严重的心血管疾病。因为在原发性高血压中抑制环氧合酶可以恢复NO介导的血管扩张，抗炎症介入可具有治疗作用。

在疾病状态期间，例如，心脏肥大、心肌梗塞(MI)、缺血、心肌炎和败血性休克，诱导型一氧化氮合酶()的过度表达导致NO产生增加。升高的NO水平可导致更严重的并发症，例如心肌功能障碍、充血性心力衰竭和心脏猝死。

在炎症过程期间，形成急性期反应物，C-反应蛋白(CRP)。CRP，经常被用作全身性炎症标记物，其促进粘附分子的表达并可以在血管炎症尤其是动脉粥样硬化的发病机理中起到直接作用。CRP与血管风险因子以及普遍并易发生的动脉粥样硬化血栓性心血管疾病、即冠心病、中风和外周动脉疾病有关。

治疗心血管疾病的新方法应该考虑该疾病的所有方面。例如，除了抗高血压活性外，新药应该不但能保护健康内皮而且能改善功能障碍内皮的功能。

本发明提供一种草药药物组合物，其具有降低高血压、维持正常血压、改善血管扩张和/或维持正常血管扩张、保护血管内皮细胞免于变性的功能，从而治疗并预防心血管疾病。

本发明的草药药物组合物包含四种草药，它们是黄芩根、黄连根状茎、大黄根和根状茎以及人参根。该组合物使用的草药可以是上述草药的任何变体。例如，黄芩根具有三种密切相关的变体，它们是黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi.)、粘毛黄芩(Scutellaria viscidulaBge.)和滇黄芩(Scutellaria amoena C.H.Wright.)。黄连根状茎具有四种密切相关的变体，它们是黄连(Coptis chinensis Franch.)、三角叶黄连(Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao)、云连(Coptis teetoidesCY.Cheng)和峨嵋黄连(Coptis omeiensis(Chen)C.Y.Cheng.)。大黄的根和根状茎具有三种密切相关的变体，它们是掌叶大黄(Rheumpalmatum L.)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.)和药用大黄(Rheum officinale Baill.)。

黄芩的药学作用在干燥根中，其药学名称是黄芩根。黄芩属于唇形科。该草药主要生产在中国的河北、山西和内蒙古。该草药的最佳收获季节是春季和秋季。将黄芩根日晒干燥、切片和不加工或酒炒后或炭炒后使用。该草药味道较苦并呈凉性。根据传统中医，该草药可用于治疗肺、胆囊、胃和大肠经(channel)的疾病。尤其是，该草药可用于使患者消除湿热、抵制毒性、抑制出血并预防流产。

黄芩根含有活性成分，其包括但不限于黄芩苷(baicalin)、木蝴蝶素A-葡糖醛酸苷、汉黄芩素-7-O-葡糖醛酸苷、黄芩黄素(baicalein)、汉黄芩素(wogonin)和木蝴蝶素A。黄芩苷可用作该草药的定性或定量控制的标准。

黄连的药学作用在黄连的干燥根状茎中，其药学名称是黄连根状茎。黄连属于毛莨科。该草药主要生产在中国的四川、湖北和云南省。优选的收获季节是秋季。除去支根和土后将黄连根状茎日晒干燥并未加工或用姜汁炒后使用。该草药味道较苦并呈凉性。根据传统中医，该草药可用于治疗心脏、胃、肝脏和大肠经的疾病。

黄连根状茎含有活性成分，其包括但不限于5-羟基小檗碱、非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、掌叶防己碱和小檗碱。小檗碱可用作该草药的定性或定量控制的标准。

大黄的药学作用在大黄的干燥的根和根状茎，其药学名称是大黄根和根状茎。大黄属于蓼科。该草药主要生产在中国的青海和四川省。在晚秋当其茎和叶子开始枯萎或在早春发芽之前的大黄根和根状茎是药。将收获的草药干燥并切片。将大黄根和根状茎可以未加工或用酒炒后或碳炒(carbonized)后使用。其味道较苦并呈凉性。根据传统中医，大黄根和根状茎可用于治疗脾、大肠、肝和心经的疾病。

大黄根和根状茎含有活性成分，其包括但不限于番泻叶苷B、番泻叶苷A、芦荟-大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚(chrysophanol)。番泻叶苷A和/或大黄素可用作该草药的定性或定量控制的标准。

有两种类型的人参，Radix Ginseng(人参根)和Radix PanarisQuinquefolii(西洋参根，西洋参(Panax quinquefollum L))。RadixGinseng(人参根)用于本发明的草药药物组合物中。人参根是人参(Panax ginseng C.A.Mey)，属于五加科。人参(人参根)主要生产在中国的吉林、辽宁和黑龙江省。吉林抚松生产的人参质量特别好。该草药还可以栽培，称之为“园参”，对应于“山参”，山参指在野外发现的人参。栽培的人参在秋季收获。将收获的人参日晒或烘烤，称之为“生晒参(sun-dried ginseng)”，或蒸汽后干燥，称之为“红参”，或在糖浆中浸泡，称之为“糖参(sugar processed ginseng)”。纤维状的支根称之为人参须。日晒干燥的野参称为晒干的野生参。该草药切片后使用。该草药味道甜并略苦，呈中性。根据传统中医，人参对于治疗脾、肺和心经的疾病尤其好。

人参的药学作用在干燥根。人参还作用于中枢神经系统。它增强中枢神经系统的兴奋和抑制过程，因此改善神经反应的适应性。人参还可以降低血清葡萄糖和胆固醇。还对消化性溃疡显示治疗和预防作用。

人参根的活性成分包括但不限于人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1，其中人参皂苷Rb1可用作该草药的定性或定量控制的标准。

表1显示了本发明使用的草药的药学名称、植物学名称、科名称、常规描述和主要成分。

表1 本发明药物组合物的草药

药学名称	植物学名称	科	常规描述	主要成份
					黄芩根	黄芩	唇形科	黄芩或黄芩	黄芩素、黄芩苷、汉黄芩素、汉黄芩素-7-O-葡糖苷酸、黄芩新素、木蝴蝶素A-葡糖苷酸、油菜甾醇、β-谷甾醇、苯甲酸
黄连根茎	黄连、三角叶黄连、蛾眉黄连或云南黄连	毛莨科	黄连根茎	小檗碱、黄连碱、甲基黄连碱、掌叶防己碱、非洲防己碱、黄柏桐、黄柏内酯、掌叶防己碱、药根碱、木兰花碱、阿魏酸

大黄根和根茎	掌叶大黄或鸡爪大黄(中国北方使用)或药用大黄(中国南方使用)	蓼科	大黄根和根茎	蒽醌糖苷衍生物包括大黄酚、大黄素、芦荟-大黄素、大黄酸和大黄素甲醚、大黄鞣酸、没食子酸、儿茶素、大黄四聚素、葡糖棓苷、肉桂酸、大黄明、脂肪酸、草酸钙、葡萄糖、果糖、番泻叶苷A、B和C
					人参根	人参	五加科	人参、红人参	人参萜三醇、人参萜二醇、其它panaxisides、人参奎酮、人参英、人参宁、α-人参英、原人参萜二醇、原人参萜三醇、人参萜、人参炔醇、人参萜酸、4-α-葡糖基麦芽糖、达玛烷、葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、烟酸、核黄素、维生素B1

传统上，基于制备方法，可以将能包括植物、动物或矿物质源的中草药分类成下述剂型：丸(丸剂)、散(粉末剂)、膏(糖浆、软提取物或橡皮膏)、丹(特殊的丸剂或朱砂丸)和汤(煎剂)。其中，煎剂和粉末剂是最常见的剂型。传统上，通过混合草药方的草药成分然后在水或其它介质中煮沸该混合物来制备煎剂。通过混合草药方的草药成分并直接将该混合物研磨成粉末来制备粉末剂型。根据草药方收集草药成分、合并并混合所述成分、煮沸该混合物、过滤、浓缩、添加适量的赋形剂、制粒并最后制备成丸剂、粉末剂、胶囊和片剂来制备常规的浓缩中药。

许多因素影响草药制备物的质量，包括但不限于栽培地点和条件、收获时间和方法、挑选、储藏、制备方法。当前生产中草药的实践通常收集原草药、半成品和终产品的样品用于质量控制目的。如图1举例说明，为了提供更好的质量控制，本发明在草药成分阶段(QC，采样点1，图1)、药物物质阶段(QC，采样点2)、半成品阶段(QC，采样点3)和终产品阶段(QC，采样点4)进行4点采样，以保证药物组合物的质量一致并良好控制。

将生产工艺中每个点采集的样品进行高效液相色谱(HPLC)以确定每种草药的含量用于确保各种单独草药成分的质量。本发明草药组分的HPLC方法和试验结果描述如下：

A.制备草药提取物用于HPLC

1.准确称量0.5g草药组分样品并置于50mL样品瓶中。

2.向(1)的样品瓶中加入20mL 70％甲醇。

3.室温下将(2)的混合物超声15分钟并进一步在40℃水浴中160rpm振摇20分钟；然后将样品静置30分钟或更久直到形成两层溶液。

4.取出该溶液的澄清上层并用英国Whatman制造的0.45μmPVDF滤膜过滤。

5.将约20μL过滤溶液注入HPLC中进行定量分析。

B.HPLC分析仪器

使用的仪器包括Waters 600E泵、Waters 717plus自动进样器和Waters 996光电二极管阵列检测器。

C.每种草药的HPLC条件和结果

1.大黄

(a)HPLC条件

保护柱：Lichrospher RP-18封端(5μm，4.0ID x 10mm，Merck，德国)

柱：Symmetry Shield RP 18(5μm，4.6ID x 250mm，Waters，美国)

柱温：40℃

流动相：A：0.5％乙酸(CH3COOH)水溶液

B：乙腈(CH3CN)

洗脱梯度：

流速：0.85mL/min

检测波长：270nm

(b)结果：

大黄根/根状茎的HPLC色谱图包含番泻叶苷B、番泻叶苷A、芦荟-大黄素、大黄酸、大黄素和大黄酚的指示成分。表2显示了这些成分的保留时间和最大吸收波长。

表2：大黄成分的保留时间和波长

2.黄芩

(a)HPLC条件

保护柱：Lichrospher RP-18封端(5μm，4.0ID x 10mm，Merck，德国)

柱：Cosmosil 5C18-MS(5μm，4.6ID x 250mm，Nacalai tesque，日本)

柱温：35℃

流动相：A：20mM KH₂PO4和0.01％H₃PO4水溶液

B：乙腈(CH3CN)

C：水(H₂O)

洗脱梯度：

流速：1.0mL/min

检测波长：280nm

(b)结果：

黄芩根的HPLC色谱图包含黄芩苷、木蝴蝶素A-葡糖苷酸、汉黄芩素-7-O-葡糖苷酸、黄芩素、汉黄芩素和木蝴蝶素A的指示成分。表3显示了这些成分的保留时间和最大吸收波长。

表3：黄芩成分的保留时间和波长

3.黄连

(a)HPLC条件

保护柱：Lichrospher RP-18封端(5μm，4.0ID x 10mm，Merck，德国)

柱：Cosmosil 5C18-MS(5μm，4.6ID x 250mm，Nacalai tesque，日本)

柱温：35℃

流动相：A：缓冲的乙腈(缓冲液包含50mM CH₃COONa、2％CH₃COOH和5mM C₁₂H₂₅OSO₃Na)

B：H₂O∶CH₃CN∶CH₃OH＝10∶45∶45(v/v)

洗脱梯度：

流速：0.85mL/min

检测波长：270nm

(b)结果：

黄连根状茎的HPLC色谱图包含5-羟基小檗碱、非洲防己碱、药根碱、表小檗碱、黄连碱、掌叶防己碱和小檗碱的指示成分。表4显示了这些成分的保留时间和最大吸收波长。

表4：黄连成分的保留时间和波长

4.人参

(a)HPLC条件

保护柱：Lichrospher RP-18封端(5μm，4.0ID x 10mm，Merck，德国)

柱：Cosmosil 5C18-MS(5μm，4.6ID x 250mm，Nacalai tesque，日本)

柱温：35℃

流动相：A：20mM KH₂PO4

B：CH₃CN

C：H₂O

洗脱梯度：

流速：1.0mL/min

检测波长：203nm

(b)结果：

人参根的HPLC色谱图包含人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1的指示成分。表5显示了这些成分的保留时间和最大吸收波长。

表5：人参成分的保留时间和波长

药物组合物

本发明的药物组合物中，黄芩根、黄连根状茎、大黄根和根状茎以及人参最好通过溶剂提取随后浓缩并干燥成提取物来制备。任选地，可以在干燥之前向浓缩物中添加药物赋形剂。实例包括但不限于玉米淀粉。

本发明的药物组合物中，黄芩根、黄连根状茎、大黄根和根状茎以及人参根的重量比是约1-2∶1-2∶1-2∶1-2，最优选1∶1∶2∶1。

通过下面步骤制备本发明的药物组合物(图1)：

(1)草药提取物的制备

优选用溶剂单独提取各种草药。所述溶剂可以是药学可接受用于提取目的的水或有机溶剂、或者水和所述有机溶剂的混合物。优选的有机溶剂是乙醇。优选在98±5℃用水提取黄芩根和黄连根状茎；在70±5℃用醇，尤其是95％醇水溶液提取大黄根和根状茎；在70±5℃用用醇尤其是50％醇水溶液提取人参根。进一步单独过滤所述提取物。

(2)草药膏的制备

对于已经通过提取制备的草药，单独地过滤每种草药提取物。过滤后，减压并在水浴(维持50℃)下分别浓缩单独各种草药提取物，直到形成单种草药膏。

(3)浓缩粉末的制备

优选单独干燥各种浓缩物以制备浓缩粉末。任选地，可以向浓缩物中添加药学适宜的赋形剂并干燥所得混合物以制备提取物(药物物质)。所述赋形剂优选多糖产品，其包括但不限于淀粉、直链淀粉、支链淀粉、明胶、淀粉1500、羟乙基淀粉钠、纤维素、微晶纤维素、羟丙基纤维素(HPC)、羧甲基纤维素(CMC)、交联羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)和壳聚糖。最优选的赋形剂是玉米淀粉。

(4)颗粒的制备

混合每种草药的浓缩粉末并过筛以保证粉末混合物的大小在一定范围内。此外，向粉末混合物中添加药学适宜的赋形剂如硬脂酸镁并且彻底混合所述混合物并制粒。采用流化床通过热干步骤进行制粒。将所得的颗粒过筛以保证颗粒大小在一定范围内以形成半成品。而且，可以将该颗粒半成品和药学适宜的赋形剂例如硬脂酸镁彻底混合，并通过本领域尤其是制药工业一般技术人员众所周知的制剂方法加工成片剂、大丸剂(bolus)、粉末剂、胶囊和粒剂。

下面的实施例是为了举例说明本发明的目的而不是试图限制本发明的范围。适当的变化，例如具有适当技术的人员了解的那些，可以包含在本文中而不脱离本发明的范围。

实施例1

草药药物组合物(SB221)的制备

本发明的草药药物组合物1的制备如下：

1.单独地测量“饮片(意思是“饮用片”)”形式的每种约20g黄芩根、黄连根状茎、和人参、以及约40g大黄根/根状茎，其含有准备煎煮使用的小薄片草药。

2.在研磨器上将(1)的草药单独研磨成各自单独的粉末形式。

3.在约20体积水中分别炖和/或煮沸单独测量的黄芩根和黄连根状茎草药约60分钟，以分别制备黄芩根和黄连根状茎的草药提取物。

4.在约20体积的乙醇∶水(95∶5，v/v)中回流约60分钟，提取单独测量的大黄根/根状茎以制备大黄提取物。

5.在约20体积的乙醇∶水(50∶50，v/v)中回流约60分钟，提取单独测量的人参根以制备人参提取物。

6.在浓缩压(condensed pressure)和在50℃水浴中分别浓缩(6)的单独过滤的草药提取物直至形成草药膏。

7.向黄芩根、黄连根状茎、大黄根/根状茎和人参根的每种草药膏中添加适量的玉米淀粉(赋形剂)并充分地混合，干燥处理每种添加玉米淀粉的草药膏直到每种草药膏变成浓缩的粉末。

8.充分地混合全部四种草药膏(即黄芩根、黄连根状茎、大黄根/根状茎和人参根)的浓缩粉末，并用100目筛过筛以形成混合粉末。

9.任选地，向混合粉末中添加另外的玉米淀粉，然后在流化床中制粒以形成颗粒。

10.再次将颗粒过筛形成SB221颗粒，所述SB221颗粒被认为是本发明药物组合物的半成品。

11.将SB221颗粒装入0号硬明胶胶囊，其被认为是本发明药物组合物的最终药物产品。

药理学研究

研究1

SB221对WKY和SHR大鼠血管扩张的作用

I.研究设计：

仪器和设备：

血液张力测量仪(Biopac System MPl 50)；生物安全无菌操作台；Dynex MRX Revelation微板阅读仪；Nikon TRADE SECRET-100倒置显微镜；Galaxy R CO₂培养箱。

试剂：

CD31(PECAM-I)(Santa Cruz Cat.SC-1506)、胶原酶(SigmaCat.C-5138)、内皮细胞生长添加剂，ECGs(Sigma Cat.E-9640)、乙酰胆碱，ACh(Sigma Cat.A6625)、N^w-硝基-L-精氨酸(L-NNA)(SigmaCat.N-5501)、氯化四乙铵(Sigma Cat.T-2265)、苯肾上腺素(L-型)(Sigma Cat.P-6125)、N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸、HEPES(Sigma Cat.H-3375)、牛白蛋白，BSA(Sigma Cat.A-4503)、乙二胺四乙酸，EDTA(Sigma Cat.EDS)、葡萄糖(Sigma Cat.G-8270)、硫酸镁，MgSO4(Sigma Cat.M-7506)、溴化-3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑，MTT(Sigma Cat.M-5655)、胶原(Vitrogen 100)、胎牛血清，FBS(Gibco Cat.10270-106)、谷氨酰胺(Gibco Cat.25030-081)、M199(Gibco Cat.31100-35)、青霉素/链霉素(P/S)(Gibco Cat.15140-122)、丙酮酸(Gibco Cat.11360-070)、胰酶-EDTA(Gibco Cat.15400-054)、乳酸脱氢酶，LDH(Promega Cat.G1780)、磷酸二氢钾，KH₂PO4(MerckCat.1.04873.0250)、氯化钠，NaCl(Merck Cat.1.06404.1000)、碳酸氢钠，NaHCO3(Merck Cat.1.06329.0500)、二甲基亚砜(DMSO)(Cat.1.09678.0100)、氯化钾，KCl(Showa Cat.SE-3439K)、无水氯化钙，CaCl₂(Junsei Cat.4-22)。

研究动物：

本研究使用来自Charles River Laboratories的8周龄雄性WKY大鼠和自发性高血压大鼠(SHR)。动物保持在22±2℃、12小时黑暗/光照循环(7:00到19:00光照)的空调动物室中。给予动物不限制的水和食物。

试验溶液：

a.Krebs-Henseleit(KH)缓冲液pH 7.4，含118mM NaCl、24mM NaHCO₃、4.7mM KCl、1.2mM KH₂PO₄、1.2mM MgSO₄、1.7mMCaCl₂、30μM EDTA、10mM葡萄糖的双蒸水溶液。

b.M199pH7.4溶液，通过在1L双蒸水中溶解2.2g NaHCO₃、4.8g HEPES、1包M199、10mL P/S、15-17mg肝素、10mL丙酮酸和10mL谷胺酰胺。

II.方法：

处理：

根据各自的年龄将WKY和SHR大鼠分成4组：(a)12周龄、(b)15周龄、(c)18周龄和(d)25周龄。每个年龄组进一步分成对照和SB221小组。通过管饲法用180mg/kg SB221处理SB221处理组(以10mL/kg服用18mg/mL的SB221溶液)。对照组给予等体积的水。每日处理动物，连续4周。处理结束后的当天，在预定时间限制内处死动物并采样用于血管试验和免疫组化染色试验。

血管节段的准备

a.开始试验前，开启循环水浴并将温度设置在37℃。

b.将约10-20mL KH缓冲液置于每个Petri培养皿中，共三(3)个。用95％O₂/5％CO₂给缓冲液通气。

c.麻醉动物后，打开动物胸腔，暴露心脏。从心脏取血。切下从主动脉弓到隔膜以上的胸主动脉的节段并立即放在充氧的Petri培养皿中。

d.用眼科剪切下胸主动脉的结缔组织和分支血管。仔细洗去主动脉的血块后，使用手术刀将该主动脉切成2至4个节段(每段约2-3mm长)。通过血管钩钩住每个主动脉节段并小心地置于室中。根据动物数量，主动脉节段可以被分入4到8个室中。

e.将主动脉节段的基线张力调到2g并维持30分钟，然后进行张力测定。

血管扩张试验：

首先，用10^-6M苯肾上腺素收缩主动脉节段。收缩稳定后，向该主动脉节段添加10^-9-10^-6M乙酰胆碱(Ach)。观察主动脉节段的血管扩张率，确定内皮细胞功能是否正常。

统计分析

张力的变化表示为松弛％。最大收缩表达为最高浓度诱导剂时的收缩张力。不仅每只动物可能显示出对试验化学品不同的反应，一只动物内不同主动脉节段也可能显示出对试验化学品的不同反应。因此，在数据分析中，将每个主动脉节段的结果作为独立的数据进行处理，结果以平均值±标准偏差(SD)表示。使用两因素ANOVA进行组间比较。ANOVA中显示显著差异的那些数据使用Student-Newman-Keuls检验进行Post Hoc分析，显著性水平预设为p＜0.05。

结果

如图2所示，Ach诱导SHR对照大鼠的主动脉血管扩张。随Ach浓度从10^-9增加到10^-7M，松弛％(即血管扩张)增加，在10^-7M显示最大血管扩张率。在10^-8M Ach，SHR-25W对照大鼠与SHR-15W对照大鼠的平均血管扩张率的差异约14％(其是统计学显著的[p＜0.05])。在10^-7M Ach，25周龄SHR对照大鼠与SHR-12W和SHR-15W对照大鼠的平均血管扩张率的差异约29％(其是统计学显著的[p＜0.05])。在10^-6M Ach，25周龄SHR对照大鼠与SHR-12W和SHR-15W对照大鼠的平均血管扩张率分别显示13％和16％的显著差异。这些结果显示随年龄增长，SHR对照大鼠的血管扩张功能退化，说明血管内皮细胞功能随时间退化。

如图3和4所示，SHR-12W SB221、SHR-12W对照、SHR-15WSB221和SHR-15W对照大鼠的平均最大松弛％(即血管扩张)分别是83％、95％、91％和96％。对照和SB221组的血管扩张没有显著性差异，说明SB221处理对12和15周龄的SHR大鼠没有显著作用。

如图5所示，SHR-18W SB221和SHR-18W对照大鼠的最大松弛％(即血管扩张)发生在10^-7M Ach，这给出了SHR-18W SB221大鼠的最大松弛％约90.7％，SHR-18W对照大鼠的最大松弛％约68％。这给出约23％的统计学显著差异。在10^-8M Ach，SHR-18WSB221大鼠和SHR-18W对照大鼠之间，SHR-18W SB221大鼠显示约37％的统计学显著差异(p＜0.05)。该结果说明对于18周龄的SHR大鼠，SB221处理通过增加最大松弛％改善了内皮细胞功能。

如图6所示，SHR-25W SB221和对照组在10^-7M Ach显示最大松弛％(即血管扩张)，其中SHR-25W SB221和对照组的最大松弛％分别为约90％和约67％。显示约23.2％的统计学显著差异。在10^-8M和10^-6M Ach，SHR-25W SB221大鼠的最大松弛％显示与SHR-25W对照大鼠约19％和约12％的显著性差异。该结果说明SB221处理改善了25周龄SHR大鼠血管中内皮细胞的功能。

如图7所示，在10^-8M Ach，WKY-25W对照大鼠的最大松弛％(即血管扩张)显示与WKY-12W对照大鼠、WKY-15W对照大鼠和WKY-18W对照大鼠的显著性差异分别约21％、约25％和约13％。在10^-7M Ach，WKY-25W对照大鼠的最大松弛％显示与WKY-12W对照大鼠、WKY-15W对照大鼠和WKY-18W对照大鼠的显著性差异分别约35％、约31％和约21％。在10^-6M Ach，WKY-25W对照大鼠的血管扩张显示与WKY-12W对照大鼠和WKY-15W对照大鼠的显著性差异分别是25％和23％。这些结果说明随大鼠年龄增长，WKY对照大鼠的血管扩张功能退化，这指示内皮细胞功能的退化。

如图8和9所示，随Ach浓度从10^-9增加到10^-6M，WKY-12W和WKY-15W大鼠的最大松弛％(即血管扩张)增加，在10^-6M显示最大血管扩张率。在10^-9M、10^-7M和10^-6M Ach，WKY-12W SB221与对照大鼠的松弛％的差异约5％。在10^-8M，WKY-12W SB221与对照大鼠的最大松弛％有约28％的显著差异。WKY-15W SB221大鼠与对照大鼠的最大松弛％分别为约100％和约95％。结果显示，无论是否SB221处理，WKY-15W大鼠的内皮细胞功能无显著性差异。

如图10所示，在10^-7M和10^-6M Ach，WKY-18W SB221和对照大鼠显示最大松弛％(即血管扩张)。WKY-18W SB221和对照大鼠的最大松弛％分别为约94％和约86％。SB221组和对照组之间血管扩张没有显著性差异，指示SB221处理对WKY-18W大鼠内皮细胞功能没有显著作用。

如图11所示，随Ach浓度从10^-9增加到10^-6M，WKY-25W大鼠的最大松弛％(即血管扩张)增加。WKY-25W SB221大鼠和对照大鼠的最大松弛％分别为约78％和约73％。SB221组和对照组的血管扩张没有显著性差异，指示SB221处理对WKY-25W大鼠血管内皮细胞功能没有显著作用。

总之，正常血压(WKY)大鼠的血管扩张研究结果证明，正常大鼠的最大松弛％随年龄普遍并显著地降低(图7)，说明由于年龄原因，血管内皮细胞功能退化。然而，SB221处理WKY大鼠没有显示血管扩张的显著差异，说明SB221对正常血压大鼠的作用不显著(图8-11)。

然而，与WKY大鼠中的发现相比较，当用SHR大鼠研究各年龄动物的血管扩张作用时，如图2所示，12W组和25W组之间最大松弛％随年龄显著降低，证明与发生在WKY大鼠中的情况相似，衰老使得血管扩张发生变化。然而，与WKY大鼠(图7)所示的不同，当给予最大Ach(10^-6M)，SHR-25W组的最大松弛为约50％(图2)，而25W WKY大鼠中约70％(图7)，这指示当SHR大鼠衰老时发生了潜在高血压。同时，如图8-11所示，SHR大鼠中对照和SB221组之间的最大松弛％具有显著差异(p＜0.05)，说明SB221显示了抑制高血压发生和血管扩张降低的作用。

本研究结果显示SB221对正常血压大鼠没有显著作用。然而，SB221在高血压动物中通过显著增加血管扩张显示显著的血压降低作用，这可能是通过对血管内皮的保护作用预防内皮细胞的变性。

讨论

通过使用内皮依赖性血管扩张剂(即Ach)的功能试验，显示了SB221对内皮细胞变性的预防作用。

由于年龄原因造成的WKY和SHR大鼠中内皮细胞变性可能是因为以下原因：(1)Gαi蛋白损伤；(2)NO、前列腺素和内皮源性超极化因子(EDHF)的分泌减少；(3)内过氧化物(endoperoxide)的分泌增加；(4)活性氧物质的产生增加；(5)内皮素-1的产生增加；和(6)血管平滑肌细胞对NO、前列腺素和EDHF的敏感性降低。在老年和高血压人类患者中也发现了相同的现象。通过测量上臂动脉血流，发现这两类人群倾向于丧失NO途径中的功能并增加环氧合酶依赖性血管收缩剂的产生。

结论

本研究显示SB221在18周龄或以上的SHR大鼠中不仅具有降低血压作用，还具有内皮保护活性。

研究2

SB221对内皮细胞的保护作用：

使用CD31免疫组化法的形态学研究

血小板/内皮细胞粘附分子-1(PECAM-1)，也称为CD31，是单核细胞、中性粒细胞、血小板和某些T细胞、内皮细胞的细胞表面表达的糖蛋白(见，Simmons et al.J.EXP.Med.1990；171：2147-2152；Berman et al.J.Immunol.1996；156：1515-1524，其内容在此引用作为参考)。CD31是130～140kD的单链糖蛋白。通过Western印迹、免疫沉淀和免疫组化(用石蜡包埋切片)用PECAM-1抗体检测CD31已经用于内皮细胞的形态学研究。

以下段落中，使用亲和纯化的山羊多克隆抗体进行根据上述研究1制备的主动脉节段的形态学研究，所述亲和纯化的山羊多克隆抗体是针对在鼠源PECAM-1羧基末端的肽图谱分析产生的，以通过免疫组化法检测CD31。

方法

仪器/设备、试剂、试验溶液、动物、动物处理和血管节段与上述研究1中描述的那些相同。

CD31免疫组化染色

将主动脉节段浸在10％福尔马林中，随后用石蜡包埋并切片。在石蜡切片上进行CD31免疫组化染色。如下准备几个染色室：二甲苯1(含100％二甲苯)、二甲苯2(100％二甲苯)、二甲苯3(100％二甲苯)、100％乙醇、95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇和100％水。首先将石蜡切片依次在二甲苯1、二甲苯2、二甲苯3中分别放置10分钟，然后依次放在100％、95％、75％、50％及随后水中各5分钟。然后将石蜡切片在含3％H₂O₂/甲醇(1/4)的盒中放置10分钟；漂洗掉过量溶液并依次在0.1％胰蛋白酶中37℃放置30分钟、在3％BSA印迹液中70分钟。倒掉溶液并加入1∶300的CD31一抗之后，石蜡切片保存在4℃中过夜。然后从溶液中移走石蜡切片并依次在连接抗体溶液、链亲和素过氧化物酶溶液中分别放置15分钟。用DAB对石蜡切片进行染色。在更换溶液之间，用PBS洗涤切片5次，每次持续5分钟。染色后，在显微镜下观察石蜡切片。

统计分析

视觉评价CD31免疫组化染色结果。

结果

如图14所示，SHR-12W对照大鼠(A)和SHR-15W对照大鼠(B)的内皮分别是完整的并具有光滑表面。然而，SHR-18W对照大鼠(C)和SHR-25W对照大鼠(D)的内皮分别具有不平坦的并部分脱落的表面。该结果显示年龄为18周或以上的SHR大鼠具有损伤的内皮。

如图15(A)-(D)所示，SHR-12W SB221、SHR-15W SB221、SHR-18W SB221和SHR-25W SB221大鼠的内皮分别是完整的并具有光滑表面。该结果显示SB221对SHR大鼠的内皮细胞具有保护作用，能预防18周龄或更多周龄之后细胞变性。

如图16所示，WKY-12W对照、WKY-15W对照、WKY-18W对照和WKY-25W对照大鼠的内皮分别是完整的并具有光滑表面。该结果显示年龄在12周龄到25周龄之间的WKY-12W大鼠的内皮细胞没有退化。

如图17所示，WKY-12W SB221、WKY-15W SB221、WKY-18WSB221和WKY-25W SB221大鼠的内皮分别是完整的并具有光滑表面。该结果显示SB221处理不影响WKY-12W大鼠的内皮细胞的形态。

研究3

SB221在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的细胞毒性研究

作为丰富的并容易得到的内皮细胞类型，HUVEC经常被用作心血管研究的工具来研究血管生成和心脏病。

采用乳酸脱氢酶(LDH)试验和MTT试验研究SB221对HUVEC的细胞毒性作用。当细胞质膜被测试药物破坏时，胞浆中LDH被释放到周围介质中。因此，较低的LDH活性测量值指示测试药物的细胞毒性较小。另一方面，MTT(溴化-3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑)是水溶性的四唑染料。活细胞的活性线粒体脱氢酶将黄色的MTT转变成不溶性的深紫色甲

。死细胞内不发生该转变。水不溶性的甲

可以分离、溶解在有机溶剂中并用分光光度定量。因此，甲

的较高测量值指示测试药物的细胞毒性较小。

材料

HUVEC由Dr.K.C.Lin，President of LongShan Women′s andChildren′s Hospital，ChungHo，Taipei Hsien，Taiwan提供。人脐带样品放置在无菌PBS缓冲液中。将I型胶原酶置于该溶液中。通过反复吸/吹溶液洗涤内皮细胞。在37℃和5％CO₂/95％空气培养箱中，在含有20％血清、内皮培养生长溶液(ECGs)15mg/mL的M199培养基中培养细胞。第二天更换培养基，然后每隔一天更换(Jaffe et al.J.Clin.Invest.1973；52：2745-2756)。

其它试剂与上述研究1中描述的那些相同。

方法

1.LDH试验

HUVEC细胞在培养瓶中汇合后，通过将胰酶-EDTA溶液添加至培养基中使细胞悬起。然后将悬起的细胞以5×10³个细胞/孔放在96孔培养板中。对照组生长在不含FBS的M199培养基中以提供没有细胞毒性的基础参照值。试验组生长在含不同浓度SB221的M199培养基中。4小时后，收集培养基并与等体积LDH试剂盒试剂均匀混合。该混合物在室温下避光放置30分钟。然后将与培养基等体积的终止试剂加入该混合物中。然后在490nm波长下检测反应结果。试验还包括细胞总裂解物以提供100％细胞毒性的参照值。以％细胞裂解物表示LDH活性结果，并通过将总裂解物组的吸光度设置为100％来计算LDH活性。

2.MTT试验

HUVEC细胞在培养瓶中汇合后，通过将胰酶-EDTA溶液添加至培养基中使细胞悬起。然后将所述细胞以5×10³个细胞/孔放在96孔培养板中。然后细胞在M199培养基中培养24小时。然后对照组培养在M199培养基中提供基础参照值。试验组培养在含不同浓度SB221的M199培养基中。24小时后，培养基更换为含100μL 0.5mg/mL MTT的新鲜培养基中。细胞在37℃下培养2小时。除去MTT后，向每个孔中加入DMSO以溶解细胞。使用ELISA酶标仪在550nm处测量溶液的吸光度。确定吸光度的差异并通过将基础对照组的吸光度差异设置为100％来计算百分率。

统计分析

LDH和MTT试验的结果以平均值±标准偏差(SD)表示。使用单因素ANOVA进行组间差异分析。对ANOVA分析中显示显著差异的数据进行进一步Post Hoc Tukey检验，显著性水平预设为p＜0.05。

结果

如图12所示，与总裂解物组(代表100％细胞毒性)比较，对照组LDH活性(基础值，代表没有细胞毒性)是约14.0％。用1×10^-6至1×10^-3mg/mL SB221处理的HUVEC细胞的LDH活性与基础值的差异在3％之内并且与基础值没有显著差异。LDH试验结果显示SB221对内皮细胞没有毒性。

如图13所示，SB221对HUVEC没有细胞毒性作用。与对照组(基础值、无细胞毒性)相比，1×10^-6至1×10^-3mg/mL SB221处理的HUVEC细胞的MTT转化在从125.4％到80.0％范围。基础值和SB221组的数值之间没有显著性差异。该MTT试验结果显示SB221对内皮细胞没有毒性。

结论：

SB221对HUVEC没有细胞毒性。

虽然通过举例和以优选实施方案已经描述了本发明，但是应该理解本发明不限于所公开的实施方案。相反，其意思包含对于本领域技术人员显而易见的各种变化。因此，应当将最宽的解释给予所附权利要求的范围，使之包含所有这些变化。

Claims

1.一种草药药物组合物，其包含：

黄芩根(Radix Scutellariae)提取物；

黄连根状茎(Rhizoma Coptidis)提取物；

大黄根和根状茎(Radix et Rhizoma Rhei)提取物；

人参根(Radix Ginseng)提取物；

其中所述黄芩根的所述提取物、所述黄连根状茎的所述提取物、所述大黄根和根状茎的所述提取物、所述人参根的所述提取物是干燥形式并通过用至少一种选自水和乙醇的溶剂单独提取所述黄芩根、所述黄连根状茎、所述大黄根和根状茎和所述人参根来制备，所述大黄的根和根状茎是掌叶大黄(Rheum palmatum L.)的根和根状茎，以及其中所述黄芩根、所述黄连根状茎、所述大黄根和根状茎以及所述人参根的重量比1-2∶1-2∶1-2∶1-2。

2.权利要求1的药物组合物，其中所述黄芩根、所述黄连根状茎、所述大黄根和根状茎以及所述人参根的重量比为1∶1∶1∶1。

3.权利要求2的药物组合物，其中所述黄芩根、所述黄连根状茎、所述大黄根和根状茎以及所述人参根的重量比为1∶1∶2∶1。

4.权利要求1的药物组合物，其中用水提取所述黄芩根。

5.权利要求4的药物组合物，其中在98±5℃提取所述黄芩根。

6.权利要求1的药物组合物，其中用水提取所述黄连根状茎。

7.权利要求6的药物组合物，其中在98±5℃提取所述黄连根状茎。

8.权利要求1的药物组合物，其中在70±5℃用约95％乙醇提取所述大黄根和根状茎。

9.权利要求1的药物组合物，其中在70±5℃用约50％乙醇提取所述人参根。

10.权利要求1的药物组合物，其中单独地过滤并浓缩所述黄芩根提取物、所述黄连根状茎提取物、所述大黄根和根状茎提取物以及所述人参根提取物以形成所述黄芩根、所述黄连根状茎、所述大黄根和根状茎和所述人参根各自的浓缩粉末，和其中混合并制粒所述黄芩根、所述黄连根状茎、所述大黄根和根状茎、以及所述人参根各自的所述浓缩粉末，以产生所述药物组合物的颗粒。

11.权利要求10的药物组合物，其中在所述浓缩之前添加药学可接受的赋形剂或载体。

12.权利要求1的药物组合物，其中所述药物组合物在哺乳动物中改善血管扩张或维持正常的血管扩张。

13.权利要求1的药物组合物，其中所述药物组合物保护血管中的内皮细胞免于变性。

14.权利要求1的药物组合物，其中所述药物组合物在哺乳动物中降低血压或维持稳定的血压。

15.一种制备权利要求1的所述草药药物组合物的方法，其包括：

单独地用所述溶剂提取所述黄芩根、所述黄连根状茎、所述大黄根和根状茎以及所述人参根以分别形成所述黄芩根提取物、所述黄连根状茎提取物、所述大黄根和根状茎提取物、以及所述人参根提取物；

分别过滤并浓缩所述黄芩根提取物、所述黄连根状茎提取物、所述大黄根和根状茎提取物以及所述人参根提取物成为黄芩根的草药膏、黄连根状茎的草药膏、大黄根和根状茎的草药膏和人参根的草药膏；

分别干燥所述黄芩根草药膏、所述黄连根状茎草药膏、所述大黄根和根状茎草药膏、所述人参根草药膏以形成黄芩根浓缩粉末、黄连根状茎浓缩粉末、大黄根和根状茎浓缩粉末和人参根浓缩粉末；

混合所述黄芩根浓缩粉末、所述黄连根状茎浓缩粉末、所述大黄根和根状茎浓缩粉末和所述人参根浓缩粉末以形成草药粉末混合物；和

将所述草药粉末混合物制粒以形成所述草药药物组合物的颗粒。

16.权利要求15的方法，还包括在所述干燥步骤之前向所述单独的草药膏中添加药学可接受的赋形剂或载体的步骤。

17.权利要求1所述的草药药物组合物在制备用于改善哺乳动物中血管扩张或维持哺乳动物中正常血管扩张的药物中的用途。

18.权利要求1所述的草药药物组合物在制备用于保护哺乳动物血管内皮免于变性的药物中的用途。

19.权利要求1所述的草药药物组合物在制备用于降低哺乳动物血压或维持哺乳动物稳定的血压的药物中的用途。

20.权利要求17的用途，其中所述药物由权利要求2的草药药物组合物制得。

21.权利要求17的用途，其中所述药物由权利要求3的草药药物组合物制得。

22.权利要求18的用途，其中所述药物由权利要求2的草药药物组合物制得。

23.权利要求18的用途，其中所述药物由权利要求3的草药药物组合物制得。

24.权利要求19的用途，其中所述药物由权利要求2的草药药物组合物制得。

25.权利要求19的用途，其中所述药物由权利要求3的草药药物组合物制得。