KR101302377B1 - 심혈관 질환을 예방 및/또는 치료하는 한약 조성물 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 상기 황금, 상기 황련, 상기 대황 및 상기 인삼(또는 아메리칸 인삼)을 포함하는 한약 조성물에 관한 것이다. 상기 한약 조성물은 고혈압 또는 허혈에 효능이 있으며, 혈관 내피가 퇴행되는 것을 방지해 주고, 혈압을 낮추거나 안정 혈압을 유지시켜준다.

약초, 한약, 약학 조성물.

Description

심혈관 질환을 예방 및/또는 치료하는 한약 조성물 및 그 제조 방법{HERBAL PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR PROPHYLAXIS AND/OR TREATMENT OF CARDIOVASCULAR DISEASES AND THE METHOD OF PREPARING THE SAME}

본 발명은 2001년 12월 21일자로 출원된 대만 출원 제90131897호를 우선권 주장하며 2002년 6월 10일자로 출원된 미국 특허출원 제10/134,568호의 일부계속출원(CIP)이다. 상기 양 출원의 내용은 본 명세서 내에 통합되어진다.

본 발명은 황금(黃芩)(Radix Scutellariae), 황련(Rhizoma Coptidis), 대황(Radix et Rhizoma Rhei), 및 인삼(Radix Ginseng)을 함유하는 혈관 확장의 향상 및/또는 보통의 혈관 확장 유지; 혈압 강하 및 안정된 혈압의 유지, 및 혈관 내피세포의 퇴행방지를 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 한약 조성물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

세계 보건 기구(WHO)의 자료에 따르면, 심혈관 질환은 1999년도 전세계 사망자의 3분의 1을 차지하였으며, 2010년까지 개발 도상국가에 있어서 주도적인 사망원인이 될것으로 예상된다. 심혈관 질환은 고혈압, 관상동맥 심장 질환(심장마비), 뇌혈관 질환(뇌졸증), 말초혈관 질환, 심부전증, 류마티스성 심장 질환, 선천성 심장 질환, 및 심근병증을 포함하는 심장, 혈관의 이상의 그룹에 대한 명칭이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

고혈압은 가장 우세한 심혈관 질환이다. 45세 이상의 미국인 3분의 1 이상이 고혈압을 가지고 있으며, 이들 가운데 50% 이상이 60세 이상이라고 추정된다. 치료를 받지 않으면 생명을 위협하는 심각한 합병증, 예를 들면, 뇌졸중, 관상동맥 심장질환, 동맥경화, 죽상 동맥경화, 심부전증, 신부전 및 실명을 일으킬 수도 있다.

고혈압에 대한 Joint National Committee의 제7차 보고서(JNC VII)에 나타난 바에 의하면, 최근의 고혈압 치료는 이뇨제, α-차단제, β-차단제, 칼슘채널 차단제, ACE 억제제, 및 안지오텐신(angiotensin) 대항제를 포함한다. 이러한 제제들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 그러나, 이러한 제제들의 대부분은 증상을 개선시키기는 하나 질병을 치료하는 것은 아니다. 이러한 제제들은 또한 종종 부작용을 수반한다.

사람의 고혈압을 유발하는 주된 메커니즘은 내피세포의 기능장애이다. 내피세포는 심장, 혈관 및 림프관의 공동을 따라 줄지어 있는 상피세포이다. 이들의 주기능은 혈관확장신경 및 혈관수축신경 매개체를 생산하여 혈관긴장도 및 구조 모두를 조절하는 것이다.

아세틸콜린과 같은 특정의 작용제에 의해 활성화되면, 내피세포는 내피의 NO 시스템의 활성을 통해 쇠퇴된 L-알기닌에 의해 유도되는 불안정한 기질인 산화질소("NO")를 생성한다. NO는 혈소판 응집 및 평활근세포의 증식도 억제하는 강력한 이완제이다.

병리상태, 예를 들면 고혈압 또는 노화 상태에서 내피의 작용제 유도 자극은 사이클로옥시지네이즈(cyclooxygenase) 통로의 활성화 및 그로 인해 트롬복산(thromboxane) A2 또는 프로스타글란딘(prostaglandin) H2, 또는 자유라디칼(수퍼옥사이드 음이온 등)을 포함하는 사이클로옥시지네이즈 의존 인자를 생산한다. 기능장애가 온 내피는 혈관 손상, 특히 죽상동맥경화증을 유발시킬 수도 있다.

사이클로옥시지네이즈에는 두가지의 이성형(isoform)이 있다. 사이클로옥시지네이즈 1 및 2(COX-1 및COX-2)인데, 프로스타글란딘 내부 과산화물 합성효소 1 및 2라고도 하며 이들은 아라키돈산이 프로스타글란딘류, 트롬복산류 및 기타 아이코사노이드(eicosanoid)로 전환되는 데에 있어 주된 효소이다. COX-1 및 COX-2는 그들의 조직발현 및 조절에 있어 커다란 차이로 인해 서로 다른 물성을 지닌다고 여겨진다. COX-1은 인체 내에 항상 존재하는 구성효소이며, 위점막의 통합 유지,정상 혈소판 기능의 중개, 및 신장 혈류의 조절 등과 같은 항상성 기능(homeostatic function)에 중요한 세포보호성 프로스타글란딘류의 생산을 담당한다. 이에 반해, COX-2는 사이클로옥시지네이즈의 신속유도체로서 전(前)염증성 프로스타글란딘류를 생산한다. COX-2의 발현이 기초조건에서는 매우 제한되는 반면, 염증단계에서는 급격히 상향조절된다. COX-2의 함유와 프로스타글란딘류의 증가된 생산은 뇌출혈 및 암과 같은 다양한 질병 및 장애뿐만 아니라 NO 수치가 상승하는 질병 및 장애와 관련이 있다.

NO는 COX-2의 활성을 조절하고, 염증반응 및 자가면역에 의한 조직 파괴에 관여한다. COX-2에 대한 NO의 효과는 용량에 의존한다. 낮은 수치의 NO는 COX-2를 활성화 시킨다. 이에 반해, 유발성 산화질소 합성효소("iNOS")에 의해 생산된 NO의 높은 수치는 COX-2의 유도를 억제하고 COX-2 대사물의 형성을 제지한다.

iNOS는 심근 경색증(MI) 및 심장마비 후의 심근층에서 발현된다. 심근층은 심장 근육의 심벽에서 가장 두꺼운 중앙부분이다. iNOS의 상향조절 또는 과다발현은 가벼운 염증세포 침윤, 심근 섬유증, 비대 및 확장과 관련있다. 심근 비대증은 울혈성 심장기능상실(congestive heart failure:CHF)의 발전에 심각한 위험요소이다. iNOS의 과다발현은 심근층의 장애 및 CHF를 일으키는 NO의 과다생산을 야기시킨다.

CHF는 부종을 수반하며 심장 기능의 약화를 가져오는 심장질환의 한 형태이다. CHF는 매우 다양한 요인을 가지고 있는데, 심장 근융게 혈액을 공급하는 동맥의 협착(관상동맥 심장질환), 정상적인 심장의 전기적 기능을 방해하게 위치한 큰 상처 조직을 발생시키는 심장마비의 전단계(심근 경색증), 고혈압 등을 포함한다. CHF는 성인들에게 영향을 미치는 가장 심각한 심혈관 질환 중의 하나이다. 4백만명 이상의 인구가 CHF를 가지고 있으며 빈도는 증가추세이다. 상기 질환의 발생 및 그 조건은 나이를 먹음에 따라 증가하며, 말년에 입원하는 가장 일반적인 요인이다. CHF에 대한 미국의 총 의료비 지출은 연간 50억 달러가 넘는다.

심방세동(atrial fibrillation:AF)은 총체적으로 불규칙하고 종종 급격한 심실의 박동을 유발하는 심방 심근층의 불규칙한 수축에 특징이 있는 심방의 부정맥이다. AF는 염증에 의해 촉진되는 심방 내의 구조적 변화에 의해 유지될 수 있다. CRP(C-reactive protein)는 AF의 일반적 후유증인 심혈관 사고 및 뇌졸중을 예견하 는 계통적인 염증의 표지이다. CRP는 또한 내피세포에 의한 유착분자발현을 유발한다.

서구에서 수년 동안 만능 치료제를 추구하는 동안, 연구자들은 다양한 질병의 약물 치료를 위해 중국의 한방학(약초학)을 주목하였다. 중국 한약은 다양한 질병을 치료하기 위해 수천 년 동안 존재하고 쓰여왔다.

예를 들면, "열을 내리고 삼체를 정화"하며 심장의 "기"(Chi)의 부족, 토혈 및 코피 등에 처방되는 "San-Huang-Hsie-Hsin-Tang"은 "Chin-Kuei-Yao-Lueh"(번역하면, "황금 챔버로부터의 처방")에 처음 기재된 탕약이다. 상기 탕약은 동량의 황금(Radix Scutellariae), 황련(Rhizoma Coptidis), 대황(Radix et Rhizoma Rhei)으로 만들어진다. 상기 탕약은 쓴맛이 나며 찬 성질을 가진다. 이 탕약은 울혈, 홍조, 가슴 두근거림, 어깨 경직, 위장 이물 압박감, 변비 및 강한 맥박의 환자들을 위한 것이다. 그러나, 이 탕약은 지속출혈, 빈혈, 및 약한 맥박의 증상을 보이는 환자들에게는 금지되거나 또는 적절치 못하다.

미국 특허 제5,443,839호에는 특히, 황금 추출물을 함유하는 소염, 항 알러지 또는 노화방지 작용을 하는 조성물이 기재되어있다. 그러나 상기 조성물이 심혈관 질환 및 고혈압을 치료하는데 효과적이라는 것은 기재되어 있지 않다.

미국 특허 제6,274,177호는 생강(Zingiber officinale) 추출물을 제조하는 방법이 기재되어 있는데, 소염 및 혈소판응집 억제의 효능이 있다. 상기 한약재가 심혈관 질환 및 고혈압을 치료하는데 효과적이라는 것은 기재되어 있지 않다.

미국 특허 제6,340,480호에는 혈관계의 이완 및 확장을 촉진함으로써 고혈압을 포함하는 순환계 상황을 치료하는 조성물 및 방법이 기재되어 있다. 상기 조성물은 경구복용 또는 국소투여 형태의 L-알기닌, 인삼 및 대추(Zizyphifructus)의 자연 화합물이다. 상기 화합물은 NO 합성에 상승작용을 하며, 그로인해 혈관계통의 이완 및 확장을 촉진한다. 조합된 성분들은 NO를 스스로 생산하지 못하는 지역에서 NO의 위험수위를 유지시키는 기능을 할 수 있으며, 그로 인해 고혈압을 감소시키기 위한 혈관계통의 이완 및 확장을 촉진한다. 그러나, 상기 한약재가 심혈관 질환의 치료에 효과적인지는 명확하지 않다.

원출원인 미국특허출원 제10/164,568호에는 황금(Radix Scutellariae), 황련(Rhizoma Coptidis), 대황(Radix et Rhizoma Rhei) 및 인삼(Radix Ginseng) 또는 아메리칸 인삼(Radix et Rhizoma Rhei)의 분말 추출물을 함유하는 "한약 조성물"이 기재되어 있다. 상기 한약 조성물은 심혈관 질환의 예방 및 치료 모두에 효과가 있다. 상기 조성물은 또한 독성이 없으며, 따라서 모든 연령대 및 허약, 노쇠 및 쇠약 등의 신체조건의 환자들에 사용될 수 있다.

본 CIP 출원에는 약간 다른 한약 조성물이 기재되어 있는데, 인삼(Radix Ginseng) 분말이 인삼 추출물로 대체되었다. 본 발명의 한약 조성물은 심혈관 질환의 예방 및 치료 모두에 유사한 효과를 보일뿐만 아니라 혈관확장의 향상 및/또는 정상 혈관확장의 유지기능; 혈관내 내피세포의 방어기능, 특히 내피세포의 퇴행을 방지하는데 훨씬 우수한 기능을 나타낸다.

본 발명은 Radix Scutellariae(황금), Rhizoma Coptidis(황련), Radix et Rhizoma Rhei(대황), 및 Radix Ginseng(인삼) 추출물을 함유하는 한약 조성물을 제공하는 것으로서, 상기 추출물은 황금, 황련, 대황 및 인삼으로부터, 물 또는 알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매 내에서 각각 추출하여 제조된다.

황금, 황련, 대황 및 인삼의 중량비는 약 1-2:1-2:1-2:1-2, 바람직하게는 1:1:2:1이다. 바람직하게는 황금 및 황련은 98±5℃의 수중에서; 대황은 약 70±5℃의 약 95% 에틸 알코올중에서; 인삼은 약 70±5℃의 약 50% 에틸 알코올중에서 추출된다.

본 발명의 상기 한약 조성물의 추출물은 각각 추출, 여과 및 농축의 과정을 거친다. 이는 개별 약초의 각 추출물이 농축된 페이스트형태가 되게 한다. 각각의 농축된 페이스트는 개별적인 농축 분말로 더욱 건조된다. 선택적으로, 농축된 페이스트의 건조를 용이하게 하기 위해 약학적으로 허용되는 담체가 농축단계 전에 추가될 수 있다. 상기 개별 약초의 농축된 분말은 추가로 혼합, 화합 및 캡슐에 담을 수 있는 입자 형태로 과립화 된다.

본 발명의 한약 조성물은 포유류의 혈관확장의 향상 및/또는 정상 혈관확장의 유지; 혈압 강하 및/또는 정상 혈압 유지 및 혈관내 내피세포의 퇴행방지에 효과적이다. 혈관확장이란 혈관의 확장, 특히 혈관의 일부에 혈류를 증가시키는 세동맥의 확장을 말한다.

본 발명은 또한 본 발명의 한약 조성물을 제조하는 방법을 더욱 제공하는데, 상기 방법은 (1)독립된 형태의 황금, 황련, 대황 및 인삼 추출물을 제조하기 위해 황금, 황련, 대황 및 인삼을 용매(물 또는 에틸 알코올, 또는 이들의 혼합물로 구성된)와 함께 각각 추출하는 단계; (2)독립된 황금, 황련, 대황 및 인삼 추출물 각각의 한약 페이스트를 제조하기 위해 황금, 황련, 대황 및 인삼 추출물을 각각 여과 및 농축하는 단계; (3)황금, 황련, 대황 및 인삼 각각의 농축된 분말을 제조하기 위해 황금, 황련, 대황 및 인삼의 한약 페이스트를 독립적으로 건조시키는 단계; (4)한약 분말 혼합물을 제조하기 위해 황금, 황련, 대황 및 인삼 각각의 농축된 분말을 혼합하는 단계; 및 (5)상기 한약 조성물의 과립을 제조하기 위해 상기 약초 분말 혼합물을 과립화 하는 단계를 포함한다. 선택적으로는, 상기 건조과정 전에 약학적으로 허용되는 부형제(excipient) 또는 담체가 개별 한약 페이스트에 추가된다. 약학 조성물의 과립들은 캡슐에 넣어진다.

최종적으로, 본 발명은 본 발명에 따른 한약 조성물을 포유류에 유효량 투여함으로써 인간과 같은 포유류의 혈관확장 향상 및/또는 정상 혈관확장 유지; 인간과 같은 포유류의 혈압 강하 및/또는 안정된 혈압 유지; 및 인간과 같은 포유류의 혈관내 내피세포의 퇴행 방지 방법을 제공한다. 상기 한욕 조성물은 바람직하게는 포유류에게 경구복용된다.

본 발명은 심혈관 질환을 방지 및 치료하는 새로운 한약 조성물을 제공하는데, 이는 모든 연령대 및 노쇠와 쇠약을 포함하는 다양한 신체조건의 환자들에게 적합하다.

심혈관 질환에 대한 최근의 과학적, 의학적 이해의 진보는 이 질병에 있어서 내피 손상, 산화질소(NO), 염증반응 및 C-반응성 단백질(CRP)에 대한 지식을 더욱 제공한다. 내피 산화질소 합성효소(eNOS)에 의해 내피에서 생산된 NO는 유력한 혈관 확장제일 뿐만 아니라, 혈소판 응집, 평활근 세포 증식, 단핵세포 유착 및 분자 발현을 억제하며, 따라서 내피조직의 통합을 유지시킨다. 프로스타노이드류(prostanoids) 및 산소 자유라디칼을 포함하는 사이클로옥시지네이즈(COX)-의존 인자의 생산은 내피 기능장애의 주된 요인이 될 수 있다. 기능장애가 온 내피는 장래에 더욱 심각한 심혈관 질환을 야기시킬 수 있는 혈관손상을 일으키는 주된 메커니즘의 하나가 될 수 있다. 사이클로옥시지네이즈의 억제는 기초적인 고혈압에 있어서 NO로 중재되는 혈관확장을 확보하며, 항염증의 중재는 약학적 활용이 있다.

질병 상태, 즉, 심장 비대, 심근 경색(MI), 허혈, 심근염 및 패혈 쇼크 중에 있어서, 유발성 산화질소 합성효소의 과다발현은 NO의 생산을 증가시킨다. 상승된 NO수치는 더 심각한 합병증, 즉, 심근 기능장애(myocardial dysfunction), 울혈성 심장 기능상실(congestive heart failure) 및 심장 돌연사(sudden cardiac death)를 야기시킨다.

염증 과정 중에, 급성기 반응물질(acute phase reactant)인 C-반응성 단백질(CRP)이 생성된다. 종종 계통성 염증의 지표로 사용되는 CRP는 유착분자의 발현을 촉진시키고 혈관 염증, 특히 죽상동맥경화증의 발병기전(pathogenesis)에 있어서 직접적인 역할을 수행한다. CRP는 혈관 위험인자 및 우세하고 흔한 죽상판혈전성 심혈관 질환, 즉, 관상동맥 심장질환, 뇌졸중 및 말초동맥질환과 연관되어 있다.

심혈관질환에 대한 새로운 접근은 이 질병의 모든 면모를 고려해야만 한다. 예를 들면, 신약은 고혈압에 대한 저항성에 더하여 건강한 내피를 보호할 뿐만 아니라 기능장애가 온 내피의 기능을 향상시킬 수 있어야 한다.

본 발명은 높은 혈압의 강하, 정상 혈압의 유지; 혈관확장 향상 및/또는 정상 혈관확장의 유지; 및 혈관 내피세포의 퇴행 방지의 기능을 지녀 심혈관 질환을 지료하고 예방하는 한약 조성물을 제공한다.

본 발명은 4가지의 약재를 포함하는데, 황금, 황련, 대황 및 인삼이다. 상기 조성물에 쓰인 약재들은 전술한 약재들의 어떠한 변형이라도 가능하다. 예를 들면, 황금은 세가지 유사한 관련 변종이 있는데, 황금 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis Georgi), 황금 비시듈라(Scutellaria viscidula Bge), 및 황금 아모에나(Scutellaria amoena C.H.Wright)이다. 황련은 세가지 유사한 관련 변종이 있는데, 황련 키넨시스(Coptis chinensis Franch), 황련 델토이데아(Coptis deltoidea C. Y. Cheng et Hsiao), 황련 테토이데스(Coptis teetoides C. Y. Cheng) 및 황련 오메이엔시스(Chen)(Coptis C. Y. Cheng)가 있다. 대황에는 세가지 유사한 관련 변종이 있는데, 대황 팔마툼(Rheum plamatum L.), 대황 탄구티컴(Rheum tanguticum Maxim), 및 대황 오피시나엘(Rheum officinale Baill)이 있다.

황금의 약학적 효능은 약재명이 Radix Scutellariae인 건조된 뿌리에 있다. 황금은 꿀풀과(labiatae)에 속한다. 이 약재는 주로 중국의 하북(Hebei), 샹하이, 및 내륙 몽고 지방에서 주로 생산된다. 상기 약재의 최대 수확기는 봄 또는 가을철이다. 황금은 잘게 썰어 태양에 말리고, 생으로 또는 와인과 함께 볶거나 숯으로 볶아서 사용한다. 상기 약재는 쓴 맛이 나며 차가운 속성을 지닌다. 중국 전통의학에 따르면, 이 약재는 폐, 담낭, 위장 및 대장 치료에 쓰인다. 구체적으로는, 이 약재는 습열을 제하며, 독성을 상쇄시키고, 지혈을 하며 환자의 유산을 방지한다.

황금은 바이칼린(baicalin), 오록실린 A-글루쿠로나이드(oroxylin A-glucuronide), 우고닌-7-O-글루쿠로나이드(wogonin-7-O-glucuronide), 바이칼레인(baicalein), 우고닌, 및 오록실린 A를 포함하는 활성성분을 함유하는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 바이칼레인은 상기 약재의 정량 또는 정성적 조절용 기준으로 이용된다.

황련의 약학적 효능은 약재의 학명이 Rhizoma Coptidis인 황련의 마른 뿌리줄기에 있다. 황련은 미나리아재비과에 속한다. 이것은 주로 중국의 사천성, 하북 및 운남지방에서 생산된다. 바람직한 수확기는 가을철이다. 황련은 잔뿌리와 흙을 제거한 후 태양에 말리며, 생으로 또는 생강즙과 볶아서 사용된다. 이 약재는 쓴 맛을 내며, 차가운 속성을 지닌다. 중국 전통의학에 따르면, 상기 약재는 심장, 위장, 간 및 대장의 질병 치료에 쓰인다.

황련은 베르베라스틴(berberastine), 콜룸바민(columbamine), 자트로리진(jatrorrhizine), 에피베르베린(epiberberine), 콥티신(coptisine), 팔마틴(palmatine) 및 베르베린(berberine)을 포함하는 활성 성분을 함유하는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 베르베린은 상기 약재의 정량 또는 정성적 조절용 기준으로 이용될 수 있다.

대황의 효능은 약재의 학명이 Radix et Rhizoma Rhei인 뿌리 및 뿌리줄기에 있다. 대황은 마디풀과에 속한다. 이것은 주로 중국의 청해 및 사천성에서 생산된다. 대황은 그 줄기 및 잎이 시들기 시작하는 늦가을 또는 싹이 돋기 시작하기 전의 이른 봄에 채집된다. 수확된 약재는 건조하여 잘게 썬다. 대황은 생으로, 와인과 볶거나 탄화시켜 사용한다. 쓴맛을 내며, 차가운 속성을 가진다. 중국 전통의학에 따르면, 대황은 비장, 대장 및 심장 질병을 치료하는데 쓰인다.

대황은 세노사이드 B(sennoside B), 세노사이드 A(sennoside A), 알로에-에모딘(emodin), 레인(rhein), 에모딘, 및 크리소판올(chrysophanol)을 포함하는 활성 성분을 함유하는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 세노사이드 A 및/또는 에모딘은 상기 약재의 정량 또는 정성적 조절용 기준으로 이용될 수 있다.

인삼에는 두 종류가 있는데, 인삼(Radix Ginseng) 및 아메리칸 인삼(Radix Quinquefolii)이다. 인삼(Radix Ginseng)이 본 발명의 한약 조성물에 사용된다. ㅇ인삼(Radix Ginseng)은 Panax ginseng C. A. Mey로서, 두릅나무과에 속한다. 인삼(Radix Ginseng)은 주로 중국의 길림, 요령, 및 흑룡강 지방에서 생산된다. 길림성의 무송에서 생산되는 인삼이 특히 품질이 좋다. 상기 약재는 경작될 수도 있는데 이는 야생에서 발견되는 "산삼"에 반하여 "재배 인삼"이라 한다. 재배된 인삼은 가을철에 수확한다. 수확된 인삼은 태양에 말리거나 열에 익힌 것은 "건삼"이라 하며, 찐 후에 말린 것은 "홍삼"이라 하고, 시럽에 절인 것은 "절인 인삼"(sugar processed ginseng)이라 한다. 인삼의 잔뿌리는 섬유모양의 잔뿌리로 알려져있다. 태양에 말린 야생 인삼은 양건산삼(sun cured ginseng)이라 한다. 상기 약재는 잘게 썰어 사용한다. 단맛 및 약간의 쓴맛을 내며, 중간적 속성을 지닌다. 중국 전통의학에 따르면, 인삼은 비장, 폐 및 심장 질병의 치료에 특히 우수하다.

인삼의 효능은 말린 뿌리에 있다. 인삼은 또한 중추 신경계에 효능을 가진다. 이것은 중추 신경계의 자극 및 억제 과정 모두를 향상시키며, 그로 인해 신경 반응의 수용능력을 향상시킨다. 인삼은 또한 혈당 및 콜레스테롤을 낮춘다. 이것은 또한 소화궤양에 치료 및 예방 효과를 보인다.

인삼의 활성 성분은 진세노사이드(ginsenoside) Rg1, 진세노사이드 Re, 및 진세노사이드 Rb1을 함유하는데, 이들 가운데 진세노사이드 Rb1은 상기 약재의 정량 또는 정성적 조절용 기준으로 이용될 수 있다.

본 발명에 사용된 한약재의 약명(Pharmaceutical Name), 식물명(Botanical name), 과명(family name), 일반적인 표현 및 주성분을 표 1에 나타내었다.

약명	식물명	과명	일반적인 표현	주성분
Radix Scutellariae	Scutellaria baicalensis Georgi	꿀풀과 (Labiatae)	황금 또는 스큐트	바이칼린, 오록실린 A-글루쿠로나이드, 우고닌-7-O-글루쿠로나이드, 바이칼레인, 우고닌, 네오바이칼레인, β-시토스테롤, 벤조산
Rhizoma Coptidis	Coptis chinensis Franch.,C deltoidea C.Y. Cheng C. omeiensis (Chen)C.Y. Cheng, or C. teetoides C.Y. Cheng	미나리아재비과 (Ranunculaceae)	황련	우레닌, 콜룸바민, 자트로리진, 콥티신, 팔마틴, 베르베린, 오바쿠논, 오바쿨락톤, 마그노플로린, 페룰산
Radix et Rhizoma Rhei	Rheum plamatum L. 또는 R. tanguticum Maxim et Reg. (북중국에서 사용됨) 또는 R officinale Baill (남중국에서 사용됨)	마디풀과 (Polygonaceae)	대황	크리소판올, 에모딘, 알로에-에모딘, 레인을 포함하는 안트라퀴논 글리코사이드류의 유도체, 피씨온, 레움 탄닌산, 갈산, 카테킨, 테트라린, 글루코갈린, 시나몬산, 레오스민, 지방산, 칼슘 옥살산, 글루코오스, 프룩토오스, 세노사이드 A, B 및 C
Radix Ginseng	Panax ginseng C.A.Mey	두릅나무과 (Araliaceae)	인삼 또는 홍삼	파낙사트리올, 파낙사디올, 기타 파녹시사이드류, 파노퀼론, 파낙신, 진세닌, α-파낙신, 프록토파낙사디올, 파나신, 파낙시놀, 파나엔산, 파노오스, 다마란, 글루코오스, 프룩토오스, 말토오스, 수크로오스, 니크로틴산, 리보플라빈, 티아민

전통적으로, 식물, 동물 또는 광물 성분을 포함할 수 있는 중국 한약은 제조법에 따라 다음의 투약 형태로 구분할 수 있다: 환(알약), 산(가루약), 고(시럽, 부드러운 추출물 또는 반죽), 단(특수 알약, 주황색 알약) 및 탕(탕약). 이들 가운데, 탕약 및 가루약이 가장 일반적인 투약형태이다. 전통적으로, 탕약은 처방된 약재의 한약 성분들을 혼합한 후 이 혼합물을 물 또는 다른 매개체 중에서 끓인다. 분말의 투약 형태는 처방된 약재의 한약 성분들을 혼합하여 이 혼합물을 직접 갈아 가루를 낸다. 전통적으로 응집된 중국 한약들은 약재 처방에 따라 한약 성분들의 수집, 이 성분들의 조합 및 혼합, 혼합물 끓임, 거름, 농축, 적정량의 부형제 첨가, 과립화 및 최종적으로 알약, 가루약, 캡슐 및 정(錠)을 제조함으로써 만들어진다.

제조된 한약의 품질에 영향을 끼치는 많은 요인들은 재배지 및 재배조건, 수확기 및 수확방법, 선별, 저장, 제조법을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 중국 한약의 최근의 제조 실태는 품질관리의 목적으로 일반적으로 원재료 약재, 중간 생산품 및 최종 생산품의 샘플을 모은다. 도 1에 도시된 바와 같이, 더 나은 품질관리를 제공하기 위해 본 발명은 약초 원료 단계(QC, 샘플링 지점 1, 도 1); 약재 구성 단계(QC, 샘플링 지점 2); 중간 생산품 단계(QC, 샘플링 지점 3); 최종 제약 단계(QC, 샘플링 지점 4)의 4지점에서 샘플을 수집하여 약학 조성물의 일관되고 잘 제어된 품질을 보장한다.

상기 제조과정의 각 지점에서 수집된 샘플들은 각각의 약초 성분의 품질을 보장할 목적으로 각 약초의 함유량을 결정하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 수행된다. 본 발명의 한약성분의 HPLC법 및 실험결과가 다음에 기재되어 있다.

A. HPLC 를 위한 한약 추출물 제조

1. 0.5g의 약초 성분의 샘플을 정밀하게 계량하여 50ml 샘플병에 넣는다.

2. 70% 메탄올 20ml를 상기 1단계의 샘플병에 가한다.

3. 상기 2단계의 혼합물을 실온에서 15분 동안 초음파처리하고, 40℃의 물중탕에서 160rpm으로 20분 동안 흔든다. 상기 샘플은 이후 용액에 두개의 층이 생길 때 가지 30분 이상 놓아둔다.

4. 용액의 맑은 상층액을 취하여 와트만(Whatman, England)제의 0.45㎛ PVDF 필터를 통과시킨다.

5. 정량분석을 위해 여과액 약 20㎕를 HPLC에 주입한다.

B. HPLC 분석을 위한 기기

사용된 장비는 워터스 600E 펌프, 워터스 717플러스 오토샘플러, 및 워터스 996 포토다이오드 어레이 디텍터를 포함한다.

C. HPLC 조건 및 각 약초의 결과

1. 대황

(a) HPLC 조건

가드 컬럼: Lichrospher RP-18 endcapped(5㎛, 4.0ID×10mm, Merck, German)

컬럼 : Symmetry Shield RP18((5㎛, 4.6ID×250mm, Waters, USA)

컬럼 온도: 40℃

이동상 : A: 수중의 0.5% 아세트산(CH₃COOH)

B: 아세토니트릴(CH₃CN)

용리 성분

시간(분)	A(%)	B(%)	선형성(Linearity)
0	86	14	*
40	75	25	선형
60	55	45	선형
70	55	45	선형
90	0	100	선형
100	86	14	선형

유속 : 0.85mL/분

검출 파장: 270nm

(b) 결과

대황의 HPLC 크로마토그램은 세노사이드 B, 세노사이드 A, 알로에-에모딘, 레인, 에모딘 및 크리소판올의 지시성분을 포함한다. 상기 성분들의 머무름 시간 및 최대 흡수파장은 표 2에 보인 바와 같다.

표 2: 대황 내의 성분들의 머무름 시간 및 최대 흡수파장

화합물	머무름 시간(분)	최대 흡수파장(λmax)
세노사이드 B(SB)	~38	268nm
세노사이드 A(SA)	~46	269nm
알로에-에모딘(AL)	~72	277nm
레인(RH)	~87	257nm
에모딘(EM)	~92.5	287nm
크리소판올(CH)	~94	256nm

2. 황금

(a) HPLC 조건

가드 컬럼: Lichrospher RP-18 endcapped(5㎛, 4.0ID×10mm, Merck, German)

컬럼 : Cosmosil 5C18-MS (5㎛, 4.6ID×250mm, Nacalai tesque, Japan)

컬럼 온도: 35℃

이동상 : A: 20mM KH₂PO₄ 및 수중의 0.01% H₃PO₄

B: 아세토니트릴(CH₃CN)

C: 물(H₂O)

용리 성분:

시간(분)	A(%)	B(%)	C(%)	선형성
0	87	13	0	*
25	75	25	0	선형
45	65	35	0	선형
55	0	75	25	선형
60	87	13	0	선형

유속 : 1.0mL/분

검출 파장: 280nm

(b) 결과

황금의 HPLC 크로마토그램은 바이칼린, 오록실린 A-글루구로나이드, 우고닌-7-O-글루쿠로나이드, 바이칼레인, 우고닌 및 오록실린 A의 지시성분을 포함한다. 상기 성분들의 머무름 시간 및 최대 흡수파장은 표 3에 보인 바와 같다.

표 3: 황금 내의 성분들의 머무름 시간 및 최대 흡수파장

화합물	머무름 시간(분)	최대 흡수파장(λmax)
바이칼린(BG)	~30	276nm
오록실린 A-글루구로나이드(OG)	~36	269nm
우고닌-7-O-글루쿠로나이드(WG)	~39	272nm
바이칼레인(B)	~51	275nm
우고닌(W)	~56	274nm
오록실린 A(O)	~57	269nm

3. 황련

(a) HPLC 조건

가드 컬럼: Lichrospher RP-18 endcapped(5㎛, 4.0ID×10mm, Merck, German)

컬럼 : Cosmosil 5C18-MS (5㎛, 4.6ID×250mm, Nacalai tesque, Japan)

컬럼 온도: 35℃

이동상 : A: 아세토니트릴 완충용액(완충용액은 50mM의 CH₃COONa, 2%의 CH₃COOH 및 5mM의 C₁₂H₂₅OSO₃Na 포함)

B: H₂O:CH₃CN:CH₃OH = 10:45:45(v/v)

용리 성분:

시간(분)	A(%)	B(%)	선형성
0	100	0	*
15	65	35	선형
30	65	35	선형
40	100	0	선형

유속 : 0.85mL/분

검출 파장: 270nm

(b) 결과

황련의 HPLC 크로마토그램은 베르베라스틴, 콜룸바민, 자트로리진, 에피베르베린, 콥티신, 팔마틴 및 베르베린의 지시성분을 포함한다. 상기 성분들의 머무름 시간 및 최대 흡수파장은 표 4에 보인 바와 같다.

표 4: 대황 내의 성분들의 머무름 시간 및 최대 흡수파장

화합물	머무름 시간(분)	최대 흡수파장(λmax)
베르베라스틴(Berber)	~17	264nm; 357nm
콜룸바민(Col)	~21	264nm; 345nm
자트로리진(Jat)	~21.5	264nm; 345nm
에피베르베린(Epi)	~22.5	267nm; 357nm
콥티신(Cop)	~23.5	264nm; 358nm
팔마틴(Pal)	~26	272nm; 345nm
베르베린(Ber)	~27	263nm; 347nm

4. 인삼

(a) HPLC 조건

가드 컬럼: Lichrospher RP-18 endcapped(5㎛, 4.0ID×10mm, Merck, German)

컬럼 : Cosmosil 5C18-MS (5㎛, 4.6ID×250mm, Nacalai tesque, Japan)

컬럼 온도: 35℃

이동상 : A: 20mM KH₂PO₄

B: CH₃CN

C: H₂O

용리 성분:

시간(분)	A(%)	B(%)	C(%)	선형성
0	80	20	0	*
20	75	25	0	선형
40	65	35	0	선형
55	0	80	20	선형
60	0	20	80	선형
65	80	20	0	선형

유속 : 1.0mL/분

검출 파장: 203nm

인삼의 HPLC 크로마토그램은 진세노이드 Rg1, 진세노이드 Re, 및 진세노이드 Rb1의 지시성분을 포함한다. 상기 성분들의 머무름 시간 및 최대 흡수파장은 표 5에 보인 바와 같다.

표 5: 인삼 내의 성분들의 머무름 시간 및 최대 흡수파장

화합물	머무름 시간(분)	최대 흡수파장(λmax)
진세노이드 Rg1(Rg1)	~23.5	204nm
진세노이드 Re(Re)	~23.8	203nm
진세노이드 Rb1(Rb1)	~38.5	203nm

약학 조성물

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 황금, 황련, 대황 및 인삼은 용매추출 이후 추출물로 농축 및 건조를 통해 가장 우수하게 제조된다. 선택적으로는, 약학적 부형제(들)가 건조 전에 농축물에 추가될 수 있다. 그 예로는 옥수수 전분이 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물에 있어서, 황금, 황련, 대황 및 인삼의 무게비는 약 1-2:1-2:1-2:1-2, 가장 바람직하게는 1:1:2:1 이다.

본 발명의 약학적 조성물은 다음 과정을 통해 제조된다(도 1).

(1) 약초 추출물의 제조

약초들은 용매에 의해 개별적으로 추출되는 것이 바람직하다. 용매는 물 또는 추출 목적에 약학적으로 합당한 유기용매, 또는 물 및 상기 유기용매의 혼합물이 될 수 있다. 바람직한 유기용매는 에틸 알코올이다. 황금 및 황련은 98±5℃의 수중에서; 대황은 수중에서 70±5℃의 알코올, 구체적으로는 95%의 알코올(v/v)에서; 인삼은 수중에서 70±5℃의 알코올, 구체적으로는 50%의 알코올(v/v)에서 추출하는 것이 바람직하다. 추출물들은 추가로 각각 여과된다.

(2) 한약 페이스트의 제조

추출을 통해 제조된 약초들에 대하여, 각각의 약초 추출물들은 개별적으로 여과된다. 여과 후에, 각각의 약초 추출물들은 개별적인 한약 페이스트가 형성될 때까지 물중탕(50℃ 유지)으로 감압 하에 분리하여 농축한다.

(3) 농축 분말의 제조

농축물은 바람직하게는 농축 분말을 제조하기 위해 개별적으로 건조시킨다. 선택적으로는 약학적으로 적합한 부형제(들)가 농축물에 가해져 그 혼합결과물을 추출물(약재 구성)을 제조하기 위해 건조시킨다. 부형제들은 바람직하게는 전분, 아밀로오즈, 아밀로펙틴(amylopectin), 젤라틴, 스타치(starch) 1500, 나트륨전분 글리콜레이트(glycolate), 셀룰로오스, 미세결정 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스(HPC), 카르복시메틸-셀룰로오스(CMC), 크로스카멜로오스(croscarmellose), 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스(HPMC) 및 키토산을 포함하는 다당류 물품이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직한 부형제는 옥수수 전분이다.

(4) 과립의 제조

각 약초들의 농축 분말은 혼합되고 혼합분말의 크기가 특정 범위 내로 보장되도록 체를 통과시킨다. 추가로, 마그네슘 스테아르산염과 같은 약학적으로 적합한 부형제들이 혼합 분말에 더해지고 혼합물은 충분히 혼합되고 과립화된다. 과립화는 플로우 베드(flow bed)를 이용한 열건조 단계로 진행된다. 결과물인 과립들은 과립의 크기가 특정 범위내로 보장되도록 체를 통과시켜 중간 생산품을 형성한다. 나아가, 중간 과립 생산품은 약학적으로 적합한 부형제(들), 즉, 마그네슘 스테아르산염과 충분히 혼합되어 해당분야, 특히 약학 분야의 보통의 지식인에게 잘 알려진 방법으로 정, 환약, 캡슐 및 과립 공정을 거친다.

도 1은 본 발명의 약학 조성물을 제조하는 공정의 플로우 차트이다. QC는 품질 컨트롤이다. QC 공정에는 네개의 샘플 채취지점이 있는데, (a)약초 원료 단계(천연 원료 포함); (b)약재 구성 단계(각 약초의 농축된 분말 함유); (c)중간 생산품 단계(혼합된 과립 함유); (d)최종 제약 단계(캡슐 포함)이다.

도 2는 다양한 연령대의 SHR 생쥐들에 있어서 아세틸콜린에 대한 혈관확장 반응을 비교한 것이다.

●: SHR-12W 컨트롤

□: SHR-15W 컨트롤

▲: SHR-18W 컨트롤

○: SHR-25W 컨트롤

*: 특정 그룹의 혈관확장이 SHR-25W 컨트롤과 실질적으로 다른(p<0.05, 2-인자 ANOVA) 것임을 가리킴

도 3은 생후 12주의 SHR 생쥐들에 있어서 아세틸콜린에 대한 혈관확장 반응을 비교한 것이다.

■: 컨트롤

◇: SBB221 그룹

SBB221 그룹은 본 발명의 약학 조성물이 제공되었다.

도 4는 생후 15주의 SHR 생쥐들에 있어서 아세틸콜린에 대한 혈관확장 반응을 비교한 것이다.

■: 컨트롤

◇: SBB221 그룹

SBB221 그룹은 본 발명의 약학 조성물이 제공되었다.

도 5는 생후 18주의 SHR 생쥐들에 있어서 아세틸콜린에 대한 혈관확장 반응을 비교한 것이다.

■: 컨트롤

◇: SBB221 그룹

SBB221 그룹은 본 발명의 약학 조성물이 제공되었다. *는 SBB221 그룹과 컨트롤 그룹 사이의 혈관확장에 있어서 실질적으로 현저한 차이른(p<0.05, 2-인자 ANOVA)가 있다는 것을 가리킨다.

도 6은 생후 25주의 SHR 생쥐들에 있어서 아세틸콜린에 대한 혈관확장 반응을 비교한 것이다.

■: 컨트롤 그룹

◇: SBB221 그룹

SBB221 그룹은 본 발명의 약학 조성물이 제공되었다. *는 SBB221 그룹과 컨트롤 그룹 사이의 혈관확장에 있어서 실질적으로 현저한 차이른(p<0.05, 2-인자 ANOVA)가 있다는 것을 가리킨다.

도 7은 다양한 연령대의 WKY 생쥐들에 있어서 아세틸콜린에 대한 혈관확장 반응을 비교한 것이다.

◆: WKY-12W 컨트롤

□: WKY-15W 컨트롤

▲: WKY-18W 컨트롤

○: WKY-25W 컨트롤

*: 특정 그룹의 혈관확장이 WKY-25W 컨트롤과 실질적으로 다른(p<0.05, 2-인자 ANOVA) 것임을 가리킴

도 8은 생후 12주의 WKY 생쥐들에 있어서 아세틸콜린에 대한 혈관확장 반응을 비교한 것이다.

■: 컨트롤 그룹

◇: SBB221 그룹

SBB211 그룹은 본 발명의 약학 조성물이 제공되었다. *는 SBB221 그룹과 컨트롤 그룹 사이의 혈관확장에 있어서 실질적으로 현저한 차이른(p<0.05, 2-인자 ANOVA)가 있다는 것을 가리킨다.

도 9는 생후 15주의 WKY 생쥐들에 있어서 아세틸콜린에 대한 혈관확장 반응을 비교한 것이다.

■: 컨트롤 그룹

◇: SBB221 그룹

SBB211 그룹은 본 발명의 약학 조성물이 제공되었다.

도 10은 생후 18주의 WKY 생쥐들에 있어서 아세틸콜린에 대한 혈관확장 반응을 비교한 것이다.

■: 컨트롤 그룹

◇: SBB221 그룹

SBB211 그룹은 본 발명의 약학 조성물이 제공되었다.

도 11은 생후 25주의 WKY 생쥐들에 있어서 아세틸콜린에 대한 혈관확장 반응을 비교한 것이다.

■: 컨트롤 그룹

◇: SBB221 그룹

SBB211 그룹은 본 발명의 약학 조성물이 제공되었다.

도 12는 세포 배지 내에서 발견되는 락테이트 디하이드로지네이즈(lactate dehydrogenase: LDH) 활성(세포 용해물(cell lysate)의 %로 표현)(n=3)에 기초한 인간 배꼽정맥 내피세포(HUVEC)에 대한 SB221의 세포독성 연구결과이다. LDH 활성의 결과는 기초 LDH값(SB221 없이 배양된 세포) 및 전체 세포 용해물(세포들이 수집되고 균질화됨)과 비교되었다. 전체 세포 용해물은 LDH 수치 100%로 나타내었다. 상기 연구의 결과는 기초그룹과 SB221그룹(10^-6 내지 10^-3g/ml) 사이에 LDH 활성에 있어서 통계적인 차이가 없음을 보여준다. HUVEC의 기초 LDH 활성은 총 용해물의 약 14%이고, SB221 그룹의 LDH 활성은 기초 그룹의 수치에서 약 3% 이내의 차이가 난다. 기초 그룹 및 SB221 그룹의 LDH 활성은 전체 세포 용해물의 수치와 확연히 차이가 났다.

도 13은 기초값을 제공하는 컨트롤 세포(즉, SB221 처리되지 않은 세포)와 SB221 처리된 세포로부터 수집된 세포 배지의 MTT 테트라졸리움 염 비색분석법(n=7)에 기초한 인간 배꼽정맥 내피세포(HUVEC)에 대한 SB221의 세포독성 연구결과이다. 자료 분석은 1-인자 ANOVA를 이용하여 수행되었다. 결과는 컨트롤 그룹 및 SB221 그룹 사이에 통계적으로 현저한 차이가 없음을 보여주었다.

도 14는 SHR 컨트롤 생쥐들의 흉부 대동맥 조직 단면의 CD31 면역조직화학적 염색을 보여준다.

(A): SHR-12W 컨트롤, (B): SHR-15W 컨트롤, (C): SHR-18W 컨트롤, (D): SHR-25W 컨트롤이다. CD31은 널리 분포되고 백혈구(T 및 B 세포, 단핵세포, 과립구, 혈소판, 골수세포의 40%), 내피, 및 평활근세포에서 발견되는 질량 130-140kD의 단일 사슬 글리코프로틴이다. 도면들은 CD31항체를 이용하여 1:300의 농도에서 400X 배율의 광학 현미경으로 촬영되었다. 화살표들은 내피세포를 가리키는데, 혈관의 공동을 따라 줄지은 세포층을 구성한다. (C) 및 (D)에 보이는 내피(내피세포들의 층)는 중피세포를 드러내며 균일하고 부분적으로 벗겨진 표면을 포함하고 있다.

도 15는 SB221 처리된 SHR 생쥐들의 흉부 대동맥 조직 단면의 CD31 면역조직화학적 염색을 보여준다.

(A): SHR-12W SB221, (B): SHR-15W SB221, (C): SHR-18W SB221, (D): SHR- 25W SB221이다. 도면들은 CD31항체를 이용하여 1:300의 농도에서 400X 배율의 광학 현미경으로 촬영되었다. 화살표들은 내피세포들을 가리킨다. SB221 처리 후에 모든 연령대에 있어서 내피세포는 SB221 처리가 되지 않은 생후 18주 및 25주 생쥐들의 불균일하고 부분부분 표면이 벗겨진 내피세포(도 14의 (C) 및 (D))와는 대조적으로 매끄럽고 균일한 표면을 보인다.

도 16은 WKY 컨트롤 생쥐들의 흉부 대동맥 조직 단면의 CD31 면역조직화학적 염색을 보여준다.

(A): WKY-12W 컨트롤, (B): WKY-15W 컨트롤, (C): WKY-18W 컨트롤, (D): WKY-25W 컨트롤이다. 도면들은 CD31항체를 이용하여 1:300의 농도에서 400X 배율의 광학 현미경으로 촬영되었다. 화살표들은 내피세포들을 가리킨다. WKY 컨트롤된 생쥐들의 내피세포는 매끄럽고 균일한 표면을 보인다.

도 17은 SB221 처리된 WKY 생쥐들의 흉부 대동맥 조직 단면의 CD31 면역조직화학적 염색을 보여준다.

(A): WKY-12W SB221, (B): WKY-15W SB221, (C): WKY-18W SB221, (D): WKY-25W SB221이다. 도면들은 CD31항체를 이용하여 1:300의 농도에서 400X 배율의 광학 현미경으로 촬영되었다. 화살표들은 내피세포들을 가리킨다. SB221(본 발명의 약학 조성물) 처리 후에 WKY 생쥐들의 내피세포들은 매끄럽고 균일한 표면을 보인다.

다음 실시예들은 본 발명을 묘사하기 위한 것으로, 이에 제한되는 것은 아니다. 이성적인 기술자가 이해할 수 있는 합리적인 오차가 본 발명의 범위에서 존재 할 수 있다.

한약 조성물의 제조( SB221 )

본 발명의 한약 조성물(1)은 다음과같이 제조되었다.

1. 각각 약 20g의 황금, 황련 및 인삼과 약 40g의 대황이, 탕약을 위해 준비된 작고 얇은 약초 조각을 포함하는 "음편(陰片)"(번역하면 "마시는 조각")형태로 각각 계량되었다.

2. 상기 1단계의 약초들은 분쇄기 내에서 각각의 분말 형태로 개별적으로 분쇄되었다.

3. 황금 및 황련의 약초 추출물을 제조하기 위해 개별적으로 계량된 황금과 황련이 분리되어 약 20배 부피의 물에서 약 60분 동안 서서히 끓여지거나 및/또는 끓여졌다.

4. 대황의 추출물을 제조하기 위해 개별적으로 계량된 대황이 약 20배 부피의 알코올:물(95:5, v/v)에서 약 60분 동안 환류추출되었다.

5. 인삼 추출물을 제조하기 위해 개별적으로 계량된 인삼이 약 20배 부피의 알코올:물(50:50, v/v)에서 약 60분 동안 환류추출되었다.

6. 상기 6단계의 개별적으로 여과된 약초 추출물들은 한약 페이스트가 형성될 때까지 50℃ 물중탕으로 농축압력 하에서 개별적으로 농축되었다.

7. 적당한 양의 옥수수 전분(부형제)이 황금, 황련, 대황 및 인삼의 한약 페이스트 각각에 가해지고 충분히 혼합되어졌으며, 각각의 옥수수 전분이 첨가된 한약 페이스트들은 각 한약 페이스트들이 농축 분말이 될 때까지 건조처리되었다.

8. 상기 4가지 한약 페이스트(즉, 황금, 황련, 대황 및 인삼)의 농축분말 모두는 충분히 혼합되어 혼합 분말을 형성하기 위해 100-메쉬 체를 통과시켰다.

9. 선택적으로는, 혼합 분말에 옥수수 전분이 가해지고, 이후에 과립을 형성하기 위해 플로우 베드에서 과립화가 수행되었다.

10. 상기 과립들은 본 약학 조성물의 중간 생산품인 SB221 과립을 형성하기 위해 다시 체를 통과시켰다.

11. 상기 SB221 과립들은 본 약학 조성물의 최종 제약을 형성하기 위해 사이즈 0 하드 젤 캡슐에 담겨졌다.

약리학적 연구

연구 1

WKY 및 SHR 생쥐들의 혈관확장에 대한 SB221 의 효과

I. 연구 설계

장치 및 기기:

혈압 측정 기기(Biopac System MP150); 멸균된 항균 작업대; Dynex MRX Revelation 마이크로플레이트 판독기; Nikon TRADE SECRET-100 도립현미경(inverted microscope); Galaxy R CO₂ 인큐베이터.

시약:

CD31(PECAM-I)(Santa Cruz Cat. SC-1506); 콜라게나아제(Sigma Cat. C- 5138); 내피세포 성장 보조제, ECGs(Sigma Cat. E-9640); 아세틸콜린, ACh(Sigma Cat. A6625); N^W-니트로-L-알기닌(L-NNA)(Sigma Cat. N-5501); 테트라에틸암모늄 클로라이드(Sigma Cat. T-2265); 페닐에프린(Phenylephrine: L-form)(Sigma Cat. P-6125); N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄 설폰산, HEPES(Sigma Cat. H-3375); 알부민 보우빈(Albumin bovine), BSA(Sigma Cat. A-4503); 에틸렌디아민테트라아세트산, EDTA(Sigma Cat. EDS); 글루코오스(Sigma Cat. G-8270); 마그네슘 설페이트, MgSO₄(Sigma Cat. M-7506); 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 프로마이드, MTT(Sigma Cat. M-5655); 콜라겐(Vitrogen 100); 소 태아 혈청, FBS(Gibco Cat. 10270-106); 글루타민(Gibco Cat. 25030-081); M199(Gibco Cat. 31100-35); 페니실린/스트렙토마이신(P/S)(Gibco Cat. 15140-122); 피루브산염(Gibco Cat. 11360-070); 트립신-EDTA(Gibco Cat. 15400-054); 락테이트 탈수소효소, LDH(Promega Cat. G1780); 칼륨 디하이드로젠 포스페이트, KH₂PO₄(Merck Cat. 1.04873.0250); 염화 나트륨, NaCl(Merck Cat. 1.06404.1000); 탄산수소나트륨, NaHCO₃(Merck Cat. 1.06329.0500); 디메틸설폭사이드(DMSO)(Cat. 1.09678.0100); 염화 칼륨, KCl(Showa Cat. SE-3439K); 칼슘 클로라이드 무수물, CaCl₂(Junsei Cat. 4-22).

연구 동물:

찰스 리버(Charles River) 연구소의 생후 8주된 수컷 WKY 생쥐들과, 자발적 인 고혈압 생쥐들(SHR)이 이번 실험에 쓰였다. 이 동물들은 22±2℃의 공기 정화된 사육실에서 12시간의 주/야 사이클(7:00 - 19:00 동안 조광(照光)) 아래 유지되었다. 이 동물들은 물과 음식에 제한을 받지 않았다.

실험 용액:

a. 이중 증류된 수중에 118mM의 NaCl; 24mM의 NaHCO₃; 4.7mM의 KCl; 1.2mM의 KH₂PO₄; 1.2mM의 MgSO₄; 1.7mM의 CaCl₂; 30μM의 EDTA; 10mM의 글루코오스를 포함하는 pH 7.4의 Krebs-Jenseleit(KH) 버퍼.

b. 이중 증류된 수중에 2.2g의 NaHCO₃; 4.8g의 HEPES; 1 패키지의 M199; 10mL의 P/S; 15-17mg의 헤파린; 10mL의 피루브산염 및 10mL의 글루타민을 용해시켜 제조한 pH 7.4인 M199 용액.

II . 실험방법:

처리:

WKY 및 SHR 생쥐들을 상대적 연령에 따라 (a)12주; (b)15주; (c)18주; (d)25주의 4그룹으로 나누었다. 각 연령의 그룹은 추가로 컨트롤 및 SB221의 하부그룹으로 세분하였다. SB221 처리된 그룹은 튜브를 통해 180mg/kg의 SB221을 투여(18mg/mL의 SB221 용액 10mL/kg 투여)하였다. 컨트롤 그룹은 동일 부피의 물을 제공하였다. 상기 동물들은 연속해서 4주 동안 처리되었다. 처리가 완료된 다음날 설정된 제한시간 내에 상기 동물들을 희생시켜 혈관 테스트 및 면역조직병리학적 염색 분석을 위한 샘플이 채취되었다.

혈관 섹션의 준비:

a. 실험을 개시하기에 앞서, 순환수조를 37℃로 작동시켰다.

b. 약 10 ~ 20mL의 KH 버퍼를 각 세개의 페트리(Petri) 접시에 담았다. 상기 버퍼는 95% O₂/5% CO₂로 환기시켰다.

c. 동물들을 마취한 후, 심장이 노출되도록 흉곽을 절개하였다. 심장으로부터 혈액을 채취하였다. 대동맥궁(arch of the aorta)으로부터 횡경막 상의 흉부 대동맥까지의 영역을 절개하여 재빨리 산소처리한 페트리 접시로 옮겼다.

d. 안과용 가위로 흉부 대동맥의 연결조직 및 주변 혈관들을 잘라내었다. 대동맥으로부터 혈액 덩어리를 주의깊게 제거한 다음, 외과용 블레이드를 이용해 대동맥을 2-4섹션(각각 약 2-3mm 길이)으로 나누었다. 각 대동맥 섹션들은 혈관 후크로 들어올려 챔버 내에 조심스럽게 두었다. 동물들의 수에 따라, 대동맥 섹션들은 4-8개의 챔버로 분리될 수 있다.

e. 대동맥 섹션에 2g의 인장(引張)을 가하여 30분간 유지한 후, 인장력 측정이 행해졌다.

혈관확장 실험:

대동맥 섹션들은 우선 10^-6M의 페닐페린과 함께 수축되었다. 수축이 안정된 후, 10^-9~ 10^-6 M의 아세틸콜린(ACh)이 대동맥 섹션들에 가해졌다. 내피세포들이 정상인지 확인하기 위해 대동맥 섹션들의 혈관확장률이 측정되었다.

통계 분석:

인장의 변화가 이완%로 표현되었다. 최대 수축은 최대 농도의 인듀서(inducer)에서의 수축인장에 의해 표현되었다. 각 동물들이 실험 약품들에 다른 반응을 보일 수 있을 뿐만 아니라, 한 동물의 다른 대동맥 섹션도 실험 약품들에 다른 반응을 보일 수 있다. 그러므로, 각 대동맥 섹션의 결과들은 분석과정에서 독립 데이터로 취급되었고, 결과들은 평균±표준편차(SD)로 표현되었다. 그룹들 간의 비교는 2-인자 ANOVA를 이용해 수행하였다. ANOVA에서 현저한 차이를 보이는 데이터에 대해 추가로 다중범위검정(Student-Newman-Keuls' test)을 이용한 포스트 호크 분석법(Post Hoc analysis)이 수행되었다.

실험결과

도 2에 보인 바와 같이, ACh는 SHR 컨트롤 생쥐들의 대동맥에서 혈관확장을 유발하였다. Ach의 농도가 10^-9M 에서 10^-7 M로 증가함에 따라 이완%(즉, 혈관확장)은 증가하였으며, 10^-7 M에서 최대 혈관확장률을 보였다. Ach 10^-8 M에서, SHR-25W 컨트롤 생쥐들의 평균 혈관확장률은 SHR-15W 컨트롤 생쥐와 약 14%(이는 통계적으로 현저한 것이다[p<0.05]) 차이가 났다. Ach 10^-7 M에서, HR-25W 컨트롤 생쥐들의 평균 혈관확장률은 SHR-12W 및 SHR-15W 컨트롤 생쥐와 약 29%(이는 통계적으로 현저한 것이다[p<0.05]) 차이가 났다. Ach 10^-6 M에서, 생후 25주된 SHR 컨트롤 생쥐들의 평균 혈관확장률은 SHR-12W 및 SHR-15W 컨트롤 생쥐와 각각 현저한 13% 및 16%의 차이를 보였다. 이러한 결과들은 SHR 컨트롤 생쥐들의 혈관확장 기능이 생쥐 들이 나이가 듦에 따라 감쇠되는 것을 보여주는 것이며, 혈관 내피세포들의 기능이 시간이 지남에 따라 쇠약해짐을 제시하는 것이다.

도 3 및 4에 보인 바와 같이, SHR-12W SB221, SHR-12W 컨트롤, SHR-15W SB221, SHR-15W 컨트롤 생쥐들의 최대 이완%(즉, 혈관확장)의 평균은 각각 83%, 95%, 91%, 96%이다. 컨트롤 그룹과 SB221 그룹 사이에 혈관확장에서 현저한 차이가 없었는데, 이는 SB221 처리가 생후 12 및 15주된 SHR 생쥐들에게 현저한 효과가 없음을 가리킨다.

도 5에 보인 바와 같이, SHR-18W SB221 및 SHR-18W 컨트롤 생쥐들의 최대 이완%(즉, 혈관확장)는 Ach의 농도가 10^-7M 일 때 나타나는데, SHR-18W SB221 생쥐의 최대 이완%는 약 90.7%이고 SHR-18W 컨트롤 생쥐의 최대 이완%는 약 68%이다. 이는 통계적으로 현저한 약 23%의 차이를 나타낸다. Ach 10^-8 M에서, SHR-18W SB221 생쥐들은 SHR-18W 컨트롤 생쥐와의 사이에서 통계적으로 현저한(p<0.05) 약 37%의 차이를 보였다. 이러한 결과는 SB221 처리가 생후 18주 된 SHR 생쥐들의 최대 이완%를 증가시킴으로써 내피세포들의 기능을 향상시켰다는 것을 가리킨다.

도 6에 보인 바와 같이, SHR-25W SB221 및 컨트롤 그룹은 Ach의 농도가 10^-7M 일 때 최대 이완%(즉, 혈관확장)을 보이는데, SHR-25W SB221 및 컨트롤 생쥐들의 최대 이완%는 각각 90%와 67%였다. 이는 통계적으로 현저한 약 23.2%의 차이를 나타낸다. Ach 10^-8 M 및 10^-6 M에서, SHR-25W SB221 생쥐들은 SHR-25W 컨트롤 생쥐들 과는 최대 이완%에 있어서 각각 약 19% 및 12%의 현저한 차이를 보였다. 이러한 결과는 SB221 처리가 생후 25주 된 SHR 생쥐들의 내피세포들의 기능을 향상시켰다는 것을 가리킨다.

도 7에 보인 바와 같이, Ach 농도가 10^-8M일 때, WKY-25W 컨트롤 생쥐들은 최대 이완%에 있어서 WKY-12W 컨트롤, WKY-15W 컨트롤, WKY-18W 컨트롤 생쥐들과는 현저한 약 21%, 약 25% 및 약 13%의 차이를 보였다. Ach 10^-7M일 때, WKY-25W 컨트롤 생쥐들은 최대 이완%에 있어서 WKY-12W 컨트롤, WKY-15W 컨트롤, WKY-18W 컨트롤 생쥐들과는 현저한 약 35%, 약 31% 및 약 21%의 차이를 보였다. Ach 10^-6M일 때, WKY-25W 컨트롤 생쥐들은 최대 이완%에 있어서 WKY-12W 컨트롤, WKY-15W 컨트롤 생쥐들과는 현저한 약 25% 및 약 23%의 차이를 보였다. 이러한 결과는 WKY 컨트롤 생쥐들의 혈관확장 기능이 생쥐들이 나이가 듦에 따라 퇴행됨을 보여주는 것으로, 내피세포들의 기능의 퇴행을 가리킨다.

도 8 및 9에 보인 바와 같이, WKY-12W 및 WKY-15W 생쥐들의 최대 이완%(즉, 혈관확장)는 Ach의 농도가 10^-9M에서 10^-6M로 증가함에 따라 증가하는데, 10^-6M에서 최대 혈관확장을 보였다. 10^-9M, 10^-7M 및 10^-6M에서 WKY-12W SB221 와 컨트롤 생쥐들의 최대 이완% 사이에는 5% 미만의 차이가 있었다. 10^-8M에서, WKY-12W SB221 와 컨트롤 생쥐들의 최대 이완% 사이에 약 28%의 현저한 차이가 있었다. WKY-15W SB221 와 컨트롤 생쥐들의 최대 이완%는 각각 100% 및 95%였다. 이러한 결과는 WKY-15W 생쥐들의 내피세포에 있어서 SB221의 처리와 무관하게 큰 차이가 없음을 보여준다.

도 10에 보인 바와 같이, WKY-18W SB221 및 컨트롤 생쥐들은 Ach 농도가 10^-7M 및 10^-6M일 때 최대 이완%(즉, 혈관확장)를 보였다. WKY-18W SB221 및 컨트롤 생쥐들의 최대 이완%는 각각 94% 및 86%였다. SB221 그룹과 컨트롤 그룹 사이에 혈관확장에 있어서 큰 차이가 없었는데, WKY-18W 생쥐들에 있어서 내피세포들에 대한 SB221의 처리는 큰 영향을 끼치지 못함을 가리킨다.

도 11에 보인 바와 같이, WKY-25W 생쥐들의 최대 이완%(즉, 혈관확장)는 Ach의 농도가 10^-9M에서 10^-6M로 증가함에 따라 증가하였다. WKY-25W SB221 및 컨트롤 생쥐들의 최대 이완%는 각각 78%, 73% 였다. SB221 그룹과 컨트롤 그룹 사이에 혈관확장에 있어서 큰 차이가 없었는데, WKY-25W 생쥐들에 있어서 내피세포들에 대한 SB221의 처리는 큰 영향을 끼치지 못함을 가리킨다.

요약하자면, 정상 혈압 생쥐(WKY)들의 상기 혈관확장 연구 결과는 정상 생쥐들의 최대 이완%가 연령에 따라 일반적으로 현저히 감소(도 7)하였는데, 이는 노화에 따른 혈관 내피세포들의 기능의 퇴행을 보여준다. 그러나, WKY 생쥐들에 SB221 처리는 혈관확장에 있어서 큰 차이를 보이지 않았는데, 정상 혈압 생쥐들에 대한 SB221의 효과가 현저하지 않음을 제시하는 것이다.(도 8 내지 11)

그러나, WKY 생쥐들에게서 발견된 것과 비교하여, SHR 생쥐들이 다양한 연령 대의 상기 동물에 대한 혈관확장 효과의 연구에 사용된 경우, 도 2에 보인 바와 같이, 최대 이완%가 12W 그룹과 25W 그룹 사이에서 연령증가에 따라 현저히 감소(p<0.05)하였는데, WKY 생쥐들에게 일어난 것과 유사하게 노화가 혈관확장의 변화에 영향을 끼침을 보여준다. 그러나, WKY 생쥐들에게서 보인 것과는 달리(도 7), 최대의 Ach(10^-6M)가 제공된 경우 WKY 생쥐들에서는 약 70%(도 7)였던 것과는 반대로 SHR-25W 그룹에서의 최대 이완%가 약 50%(도 2)였는데, 이는 WHR 생쥐들이 노화에 따라 고혈압의 가능성이 증가된 것을 나타낸다. 또한, 도 8 내지 11에 보인 바와 같이, SHR 생쥐들의 컨트롤 그룹과 SB221 그룹간의 최대 이완%에 있어서 현저한 차이(p<0.05)가 있었는데, 이는 SB221이 고혈압의 발전 및 혈관확장의 감소를 억제하는 효과가 있음을 나타내주는 것이다.

본 연구의 결과는 정상 혈압 생쥐들에게 SB221의 효과가 현저하지 않다는 것을 보여주었다. 하지만, SB221은 아마도 내피세포의 퇴행을 방지하는 혈관 내피에 대한 보호 효과를 통해 혈관의 확장을 현저히 증가시킴으로써 동물들의 고혈압에 있어 현저한 혈압 강하의 효과를 보여준다.

토의

내피 의존성 혈관확장제(즉, ACh)를 이용한 기능 시험을 통해 SB221이내피세포들의 퇴행에 대해 방지하는 효과를 나타낸다는 것이 보여졌다.

노화에 의한 WKY 및 SHR 생쥐들 모두에 있어서 내피세포들의 퇴행은 아마도 다음 이유들 때문일 것이다:(1)Gαi 단백질의 손상; (2)NO 분비물, 프로스타사이클 린 및 내피-유도 과분극(hyperpolarizing) 인자의 감소; (3)내향 과산화물(endoperoxide) 분비물의 증가; (4)활성산소종의 생산 증가; (5)엔도텔린-1(endothelin-1)의 생산 증가; 및 (6)NO, 프로스타사이클린 및 EDHF에 대한 혈관 평활근 세포의 감도 감소. 동일한 현상이 인간의 노년층 및 고혈압 환자에게서도 발견되었다. 팔의 상부의 동맥 혈류 측정을 통해 이러한 두 종류의 사람들이 NO 통로의 기능을 상실하고 사이클로옥시지네이즈 의존성 혈관수축신경에 있어 증가하는 경향을 보인다는 것이 발견되었다.

결론

상기 연구는 생후 18주 이상의 SHR 생쥐들에 있어 SB221이 혈압 강하 효과는 물론 내피의 보호 활성을 가진다는 것을 보여주었다.

연구 2

내피세포들에 대한 SB221 의 보호 효과:

CD31 면역조직화학법을 이용한 형태학적 연구

CD31이라고도 하는 혈소판/내피세포 유착분자-1(PECAM-1)은 단핵세포, 중성구(neutrophil), 혈소판 및 특정 T 세포, 내피세포(본 명세서에 참증으로 통합된 시몬스 등, J. Exp . Med . 1990; 171:2147-2152; 베르만 등, J. Immunol . 1996; 156:1515-1524 참조)의 세포 표면 위에 발현된 글리코프로틴이다. CD31은 130-140kD의 단쇄 글리코프로틴이다. 웨스턴 블러팅(Western blotting), 면역침전(immunoprecipitation) 및 면역조직학(파라핀이 함입된 섹션과 함께)에 의한 PECAM-1 항체를 이용한 CD31의 검출이 내피세포들의 형태학적 연구에 채용되어왔다.

다음의 문단에서, 면역조직학법을 통해 CD31을 검출하기 위해 실험 1에 따라 제조된 대동맥 섹션들의 형태학적 연구가 쥐에 기원한 PECAM-1의 카르복시 종단에서의 펩티드 지도화에 대항하여 발생된 친화력 정제된 염소 다클론 항체를 이용하여 수행되어 왔다.

실험방법:

장비/기기, 시약, 시험 용액, 동물, 동물 처리, 및 혈관 섹션 작업은 전술한 연구 1에 기재된 것과 동일하다.

CD31 면역조직학 염색

대동맥 섹션을 취하여 10% 포르말린에 담근 후 파라핀에 함입시켜 분할하였다. CD31 면역조직학 염색을 파라핀 섹션에 수행하였다. 크실렌 1(100% 크실렌 함유), 크실렌 2(100% 크실렌), 크실렌 3(100% 크실렌), 100% 에탄올, 95% 에탄올, 75% 에탄올, 50% 에탄올 및 100% 물의 수 개의 염색 챔버들이 준비되었다. 파라핀 섹션들을 우선 크실렌 1, 크실렌 2 및 크실렌 3에 순서대로 각 10분씩 두었으며, 이후 100%, 95%, 75%, 50% 에탄올 및 그 다음에 100%에 각 5분씩 두었다. 파라핀 섹션들은 이후 3%의 H₂O₂/메탄올(1/4) 용액에 10분간 두었다; 과도한 용액을 세척해내었다; 그리고 순서대로 37℃의 0.1% 트립신에 30분간, 3% BSA 병에 70분간 두었다. 용액을 쏟아낸 후 CD31의 일차항체를 1:300으로 가하였으며, 파라핀 섹션들을 4℃에서 밤새 보관하였다. 그리고는 파라핀 섹션들을 용액으로부터 제거하여 연결항체 용액, 스트렙타비딘(streptavidin) 퍼옥시다아제 용액에 각각 15분간 두었다. 파라핀 섹션들은 DAB로 염색되었다. 용액들의 교체 사이에 상기 섹션들은 PBS로 각 5분씩 5회 세척하였다. 염색 후, 파라핀 섹션들을 현미경으로 관찰하였다.

통계 분석

CD31 면역조직학 염색 결과는 눈으로 평가하였다.

실험 결과:

도 14에 보인 바와 같이, SHR-12W 컨트롤 생쥐(A) 및 SHR-15W 컨트롤 생쥐(B) 각각의 내피는 온전하고 매끄러운 표면을 가졌다. 그러나, SHR-18W 컨트롤 생쥐(C) 및 SHR-25W 컨트롤 생쥐(D) 각각은 불규칙하고 일부가 벗겨진 표면을 가졌다. 이 결과는 18주 이상의 연령의 SHR 생쥐는 손상된 내피를 가짐을 가리킨다.

도 15의 (A) 내지 (D)에 보인 바와 같이, SHR-12W SB221, SHR-15W SB221, SHR-18W SB221 및 SHR-25W SB221 생쥐들 각각의 내피는 온전하고 매끄러운 표면을 가졌다. 이 결과는 SB221이 SHR 생쥐들의 내피세포에 대해 생후 18주 이후에 세포들이 퇴행되는 것을 방지하는 보호기능을 가진다는 것을 가리킨다.

도 16에 보인 바와 같이, WKY-12 컨트롤, WKY-15 컨트롤, WKY-18 컨트롤, WKY-25 컨트롤 생쥐들 각각의 내피는 온전하고 매끄러운 표면을 가졌다. 이러한 결과는 생후 12주 내지 25주 사이 범위의 연령에서 WKY 생쥐들의 내피세포가 퇴행되지 않음을 가리킨다.

도 17에 보인 바와 같이, WKY-12W SB221, WKY-15W SB221, WKY-18W SB221 및 WKY-25W SB221 생쥐들 각각의 내피세포는 온전하고 매끄러운 표면을 가졌다. 이러한 결과는 SB221이 WKY 생쥐들의 내피세포의 형태학에 영향을 끼치지 못함을 가리킨다.

연구 3

인간 배꼽정맥 내피세포( HUVEC )에 대한 SB221 의 세포독성 연구

혈관생성 및 심장질환을 조사하기 위해, 풍부하고 접근이 용이한 내피세포 타입인 HUVEC가 심장혈관연구에 있어서 도구로서 종종 사용된다.

HUVEC에 대한 SB221의 세포독성 효과는 락테이트 디하이드로지네이즈(LDH) 분석법 및 MTT 분석법을 이용하여 연구되었다. 세포의 형질막들이 시제품에 의해 분열되었을때, 세포질 LDH가 주변 매체로 방출되었다. 따라서, LDH 활성의 낮은 측정치는 시제품의 낮은 세포독성을 보여준다. 한편, MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드)는 수용성 테트라졸리움 염색제이다. 살아있는 세포의 활성 미토콘드리아 탈수소효소는 노란빛을 띤 MTT를 어두운 보라색의 불용성 포르마잔(formazan)으로 전환시켰다. 이러한 전환은 죽은 세포에서는 일어나지 않는다. 수용성 포르마잔은 분리되어 유기용매에 용해되 분광학적으로 정량될 수 있다. 따라서, 포르마잔의 높은 수치는 시제품의 낮은 세포독성을 가리킨다.

재료들:

HUVEC은 대만 타이페이 청호의 LongShan Womens and Children's 병원의 원장인 Dr.K.C.Lin으로부터 제공되었다. 인간 탯줄의 샘플은 무균 PBS 버퍼에 두었다. 콜라게나아제 타입 I이 용액에 가해졌다. 내피세포는 용액의 흡입/방출을 반복함으 로써 세척되었다. 상기 세포들은 20%의 혈청, 내피세포 배양 성장 용액(ECGs) 15mg/mL를 함유하고 37℃의 5%CO₂/95% 공기 인큐베이터 내의 M199 배지에서 배양되었다. 배양배지는 다음날 및 매일 교체하였다.(Jaffe 등, J. Clin . Invest . 1973; 52:2745-2756)

실험방법:

1. LDH 분석

HUVEC 세포들이 배양병 내에서 융합된 후, 상기 세포들은 트립신-EDTA 용액으로 현탁되었다. 현탁된 세포들은 96개의 배양판에 용기당 5×10³세포씩 두었다. 컨트롤 그룹은 세포독성이 없는 기초 기준치를 제공하기 위해 FBS를 포함하지 않은 M199 배지에서 배양되었다. 실험 그룹은 다양한 농도의 SB221을 포함하는 M199 배지에서 배양되었다. 4시간 후, 배양 배지는 수집되어 동일한 부피의 LDH 키트 시약과 혼합되었다. 이 혼합물은 실온에서 빛에 노출을 차단한 채 30분 동안 보관되었다. 배양 배지와 동일한 부피의 정지 시약이 혼합물에 가해졌다. 반응 결과물은 이후 490nm 파장에서 검출되었다. 세포들의 총 용해질 또한 100% 세포독성의 기준치를 제공하기 위해 실험에 포함되었다. LDH 활성의 결과가 셀용해질%로 표현되었고, 총 용해질 그룹의 흡수를 100%에 세팅함으로써 계산되었다.

2. MTT 분석

HUVEC 세포들이 배양병에 융합된 후, 상기 세포들은 트립신-EDTA 용액을 배양 배지에 가함으로써 현탁되었다. 세포들은 96개의 배양배지에 용기당 5×10³세포 씩 두었다. 이 세포들은 이후 M199 배지에서 24시간 동안 인큐베이터 보관되었다. 컨트롤 그룹은 이후 기초 기준치를 제공하기 위해 M199 배지에서 배양되었다. 상기 실험 그룹들은 다양한 농도의 SB221을 포함하는 M199 배지에서 배양되었다. 24시간 후에, 상기 배양 배지는 0.5mg/mL의 MTT 100μL를 포함하는 새로운 배양 배지로 교체되었다. 상기 세포들은 37℃의 인큐베이터에서 2시간 동안 배양되었다. MTT를 제거한 후 세포들을 용해시키기 위해 DMSO를 각 용기에 가하였다. 550nm에서의 용액의 흡수가 ELISA 판독기를 이용해 측정되었다. 흡수들 사이의 차이가 결정되었고, 기초 컨트롤 그룹의 흡수 차이를 100%에 세팅함으로써 %비율이 계산되었다.

통계적 분석

LDH 및 MTT 분석의 결과는 평균±표준 편차(SD)로서 표현되었다. 그룹들 사이의 차이는 1-인자 ANOVA를 이용해 분석되었다. ANOVA 분석에서 현저한 차이를 보이는 자료에 대해 추가의 Post Hoc Tukey 실험이 수행되었다. 현저한 정도의 수위는 p<0.05에 맞춰졌다.

실험결과:

도 12에 보인 바와 같이, 컨트롤 그룹의 LDH 활성(기초수치, 세포독성을 보이지 않음)은 총 용해질 그룹(100%의 세포독성을 보이는)에 대해 약 14.0%였다. 1×10^-6 내지 1×10^-3mg/mL의 SB221로 처리된 HUVEC 세포들의 LDH 활성은 기초수치로부터 3% 이내의 차이를 보였고, 이는 기초수치로부터 현저한 차이가 아니었다. LDH 분석의 결과는 SB221이 내피세포들에 세포독성이 없음을 나타낸다.

도 13에 보인 바와 같이, SB221은 HUVEC에 대해 세포독성을 갖지 않는다. 1×10^-6 내지 1×10^-3mg/mL의 SB221로 처리된 HUVEC 세포들에 의한 MTT의 전환은 컨트롤 그룹(기초수치, 무독성)에 비해 125.4% 내지 80.0% 사이의 범위였다. 기초수치와 SB221 그룹 사이에 현저한 차이가 없었다. MTT분석의 결과는 SB221이 내피세포들에 세포독성이 없음을 나타낸다.

결론:

SB221은 HUVEC에 대해 세포독성이 없다.

본 발명이 실시예 및 바람직한 양태의 견지에서 기재되었더라도, 본 발명이 기재된 실시태양들에 한정되는 것은 아니라는 것을 인지해야한다. 오히려, 해당분야의 기술자들에게 명백한 다양한 변형들을 아우르기 위한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 이러한 모든 변형들을 포함하기 위해 가장 넓은 해석이 혀용되어야 한다.

본 명세서 내에 포함되어 있음.

Claims (28)

1. 황금(黃芩)(Radix Scutellariae)(황금의 뿌리) 추출물;

   황련(Rhizoma Coptidis)(황련의 뿌리줄기) 추출물;

   대황(Radix et Rhizoma Rhei)(대황의 뿌리 및 뿌리줄기) 추출물; 및

   인삼(Radix Ginseng)(인삼의 뿌리) 추출물을 포함하고,

   상기 황금의 뿌리의 추출물, 상기 황련의 뿌리줄기의 추출물, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기의 추출물, 및 상기 인삼의 뿌리의 추출물은 건조된 형태이고, 물 및 에틸알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매로 상기 황금의 뿌리, 상기 황련의 뿌리줄기, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기, 및 상기 인삼의 뿌리를 추출함으로써 제조되고,

   상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기는 레움 팔마툼 엘(Rheum plamatum L., 대황 팔마툼)의 뿌리 및 뿌리줄기이고,

   상기 황금의 뿌리, 상기 황련의 뿌리줄기, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기, 및 상기 인삼의 뿌리는 1:1:2:1의 중량비인 것인 심혈관 질환을 예방 또는 치료하는 한약 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서,

   상기 황금의 뿌리가 물에 의해 추출되는 것인 심혈관 질환을 예방 또는 치료하는 한약 조성물.
5. 제 4항에 있어서,

   상기 황금의 뿌리가 98±5℃의 온도에서 추출되는 것인 심혈관 질환을 예방 또는 치료하는 한약 조성물.
6. 제 1항에 있어서,

   상기 황련의 뿌리줄기가 물에 의해 추출되는 것인 심혈관 질환을 예방 또는 치료하는 한약 조성물.
7. 제 6항에 있어서,

   상기 황련의 뿌리줄기가 98±5℃의 온도에서 추출되는 것인 심혈관 질환을 예방 또는 치료하는 한약 조성물.
8. 제 1항에 있어서,

   상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기가 70±5℃ 온도의 95% 에틸 알코올에 의해 추출되는 것인 심혈관 질환을 예방 또는 치료하는 한약 조성물.
9. 제 1항에 있어서,

   상기 인삼의 뿌리가 70±5℃ 온도의 50% 에틸 알코올에 의해 추출되는 심혈관질환을 예방 또는 치료하는 한약 조성물.
10. 제 1항에 있어서,

    상기 황금의 뿌리의 추출물, 상기 황련의 뿌리줄기의 추출물, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기의 추출물, 및 상기 인삼의 뿌리의 추출물은 개별적으로 여과되고 농축되어 상기 황금의 뿌리의 농축된 분말, 상기 황련의 뿌리줄기의 농축된 분말, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기의 농축된 분말, 및 상기 인삼의 뿌리의 농축된 분말을 개별적으로 형성하고,

    상기 황금의 뿌리, 상기 황련의 뿌리줄기, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기, 및 상기 인삼의 뿌리의 상기 개별적으로 농축된 분말은 혼합되고 과립화되어 한약 조성물의 과립이 제조되는 것인 심혈관 질환을 예방 또는 치료하는 한약 조성물.
11. 제 10항에 있어서,

    상기 농축 이전에 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체가 추가되는 것인 심혈관 질환을 예방 또는 치료하는 한약 조성물.
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 제 1항에 따른 심혈관 질환을 예방 또는 치료하는 한약 조성물을 제조하는 방법으로서,

    상기 용매로 상기 황금의 뿌리, 상기 황련의 뿌리줄기, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기, 및 상기 인삼의 뿌리를 개별적으로 추출하여, 상기 황금의 뿌리의 추출물, 상기 황련의 뿌리줄기의 추출물, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기의 추출물, 및 상기 인삼의 뿌리의 추출물을 개별적으로 형성하는 단계;

    상기 황금의 뿌리의 추출물, 상기 황련의 뿌리줄기의 추출물, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기의 추출물, 및 상기 인삼의 뿌리의 추출물을 개별적으로 여과 및 농축하여 상기 황금의 뿌리의 한약 페이스트(herbal paste), 상기 황련의 뿌리줄기의 한약 페이스트, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기의 한약 페이스트, 및 상기 인삼의 뿌리의 한약 페이스트를 형성하는 단계;

    상기 황금의 뿌리의 한약 페이스트, 상기 황련의 뿌리줄기의 한약 페이스트, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기의 한약 페이스트, 및 상기 인삼의 뿌리의 한약 페이스트를 개별적으로 건조시켜 상기 황금의 뿌리의 농축된 분말, 상기 황련의 뿌리줄기의 농축된 분말, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기의 농축된 분말, 및 상기 인삼의 뿌리의 농축된 분말을 형성하는 단계;

    상기 황금의 뿌리의 농축된 분말, 상기 황련의 뿌리줄기의 농축된 분말, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기의 농축된 분말, 및 상기 인삼의 뿌리의 농축된 분말을 1:1:2:1의 중량비로 혼합하고 농축하여 한약 분말 혼합물(herbal powder mixture)을 형성하는 단계; 및

    상기 한약 분말 혼합물을 과립화하여 상기 한약 조성물의 과립을 형성하는 단계를 포함하는 제 1항에 따른 심혈관 질환을 예방 또는 치료하는 한약 조성물을 제조하는 방법.
16. 제 15항에 있어서,

    상기 건조 단계 전에 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 상기 개별 한약 페이스트에 추가하는 단계를 더 포함하는 방법.
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 황금(黃芩)(Radix Scutellariae)(황금의 뿌리) 추출물;

    황련(Rhizoma Coptidis)(황련의 뿌리줄기) 추출물;

    대황(Radix et Rhizoma Rhei)(대황의 뿌리 및 뿌리줄기) 추출물; 및

    인삼(Radix Ginseng)(인삼의 뿌리) 추출물을 포함하고,

    상기 황금의 뿌리의 추출물, 상기 황련의 뿌리줄기의 추출물, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기의 추출물, 및 상기 인삼의 뿌리의 추출물은 건조된 형태이고, 물 및 에틸알코올로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매로 상기 황금의 뿌리, 상기 황련의 뿌리줄기, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기, 및 상기 인삼의 뿌리를 추출함으로써 제조되고,

    상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기는 레움 팔마툼 엘(Rheum plamatum L., 대황 팔마툼)의 뿌리 및 뿌리줄기이고,

    상기 황금의 뿌리, 상기 황련의 뿌리줄기, 상기 대황의 뿌리 및 뿌리줄기, 및 상기 인삼의 뿌리는 1:1:2:1의 중량비인 것인 식용 조성물.
27. 삭제
28. 삭제

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