CN101017159A - 一种测定白酒中吡嗪类化合物的方法 - Google Patents

Abstract

一种测定白酒中吡嗪类化合物的方法，属于酒风味研究领域。本发明应用顶空固相微萃取与气相色谱－火焰热离子检测器联用技术检测白酒中吡嗪类化合物。本方法用顶空固相微萃取无需繁琐的预处理过程，快速简单，并且提高了回收率，用气相色谱－火焰热离子检测器联用技术检测白酒中吡嗪类化合物特异性强，9种吡嗪类化合物在所测范围内具有良好的线性关系R²＞0.99，9种吡嗪类化合物检测限均小于1μg/L，重复测定的相对标准偏差小于15％，回收率均大于80％，本方法克服了以往测定方法中的诸多缺陷，可用于各种香型白酒中吡嗪类化合物的检测分析。

Description

一种测定白酒中吡嗪类化合物的方法

技术领域

一种测定白酒中吡嗪类化合物的方法，具体涉及应用顶空固相微萃取与气相色谱-火焰热离子检测器联用技术检测白酒中吡嗪类化合物的方法，属于酒风味研究领域。

背景技术

存在于白酒中的含氮化合物主要是吡嗪类化合物，吡嗪是1，4位含氮的六元杂环化合物，它的衍生物广泛存在于天然和发酵食品中，由于它们具有极低的风味阈值，对白酒风味有重要贡献，近年来，越来越受到人们的重视。

白酒中吡嗪类化合物含量甚微，大多是在几个μg/L到几百个μg/L，其定性定量检测存在一定困难。Wobben等用减压蒸馏法除去酒中大部分乙醇和水，而后用CH₂Cl₂萃取，经GC-MS分离和鉴定出朗姆酒和威士忌酒中吡嗪类化合物；Liebich采用乙醚一戊烷混合溶剂抽提，再以10％HCl萃取分离，用GC-MS鉴定朗姆酒中七种吡嗪类化合物；山东大学陆懋荪利用阳离子树脂富集白酒中含氮化合物；余晓等人在Liebich方法基础上，采用将酒样调酸旋转蒸发除去大部分水、乙醇和易挥发组分的方法，鉴定出29种吡嗪类化合物。然而，以上方法需大量有机溶剂，样品用量大，且步骤过于繁琐，预处理过程中被分析物损失较大。

固相微萃取(SPME)无需有机溶剂，集采样、萃取、浓缩、进样于一体，且可与气相、液相色谱及GC-MS联用，目前已广泛用于食品风味成分分析，SPME与气相色谱联用已用于检测葡萄酒中吡嗪类化合物。

发明内容

(1)解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种利用顶空固相微萃取与气相色谱-火焰热离子检测器联用技术检测白酒中吡嗪类化合物的方法，以对中国各种香型的白酒进行吡嗪类物质的定性定量分析。

(2)技术方案：本发明的测定白酒中吡嗪类化合物的方法，是用重蒸馏的去离子水将待测酒样稀释到最终酒精含量为12％(v/v)，然后用顶空固相微萃取技术富集白酒中吡嗪类化合物，再用气相色谱-火焰热离子检测器对白酒中吡嗪类化合物进行定性定量分析。

顶空固相微萃取：吸取已加内标的稀释后的酒样5mL放入15mL顶空瓶中，并加入2g NaCl，插入50μm/30μm CAR/DVB/PDMS萃取头，旋紧瓶盖，置于水浴中于50℃恒温萃取40min。

气相色谱-火焰热离子检测器检测：萃取完毕后将萃取头取出，插入气相色谱进样口250℃热解吸3min，毛细管柱PEG20M，30m×0.32mm i.d.×0.5μm，进样口和检测器温度均为250℃，载气为He，流速3mL/min；分流比1∶1。程序升温：起始温度50℃，保持2min，然后以2℃/min的升温速率升温到85℃，保留0.1min，再以5℃/min的升温速率升温到210℃，保持2min。

未知吡嗪类化合物的定性分析：通过比对未知化合物和标准品的保留时间来确认检测出的吡嗪类化合物。

未知吡嗪类化合物的定量分析：

(1)分别配制单标储备液：分别准确称取0.3～0.5g的9种吡嗪类化合物标准品，用优级纯乙醇配制定容于25mL容量瓶中，作为单标储备液I；分别准确吸取1mL9种吡嗪类的单标储备液I，同样用优级纯乙醇配制定容于25mL容量瓶中，作为单标储备液II；分别准确吸取1mL单标储备液II配置成12％(v/v)乙醇溶液定容于25mL容量瓶中，作为单标储备液III；

(2)配制混合标准溶液：将9种单标储备液III各吸取0.5～2mL放入一个容量瓶中，用12％(v/v)乙醇溶液定容至50mL，作为混合标准溶液；

(3)内标的配制：吸取0.3mL内标物用优级纯乙醇配制定容于25mL容量瓶中作为内标储备液I，吸取1mL内标储备液I用优级纯乙醇配制定容于25mL容量瓶中作为内标储备液II，再吸取1mL内标储备液II用12％(v/v)乙醇配制定容于50mL容量瓶中作为内标储备液III；

(4)标准曲线的建立：将配制的混合标准溶液吸取25mL用12％(v/v)的乙醇溶液稀释定容至50mL，再从中吸取25mL用12％(v/v)的乙醇溶液稀释定容至50mL，重复逐步稀释，共得到11个浓度梯度的混合标准溶液，每一浓度梯度的混合标准溶液中均加入500μL内标储备液III，均用12％(v/v)乙醇溶液定容至50mL，依次对每一浓度梯度的混合标准溶液进行顶空固相微萃取：准确吸取5mL配制好的混合标准溶液于15mL顶空瓶中，加入2g NaCl，旋紧瓶盖，置于水浴中于50℃恒温萃取40min。以吡嗪类化合物与内标物峰面积之比为纵坐标，吡嗪类化合物浓度为横坐标绘制标准曲线；

(5)酒样测定：将目标酒样稀释到12％(v/v)，加入500μL内标，进行顶空固相微萃取，气相色谱-火焰热离子检测器进行定量分析，比照标准曲线测定被测酒样中吡嗪类化合物含量。

9种吡嗪类化合物在0～200μg/L或0～400μg/L检测范围内具有良好的线性关系，其线性相关系数R²均大于0.99。9种吡嗪类化合物检测限均小于1μg/L，酒样3次重复测定的相对标准偏差小于15％，9种吡嗪类化合物的回收率均大于80％。

主要试剂与材料：吡嗪，2-甲基吡嗪，2，5-二甲基吡嗪，2，6-二甲基吡嗪，2，3-二甲基吡嗪，2，3，5-三甲基吡嗪和2，3，5，6-四甲基吡嗪，2-乙基吡嗪，2，3-二乙基吡嗪和2-乙酰基吡啶等购于美国sigma公司(纯度＞98％)。NaCl(分析纯)，茅台酒，郎酒和古井贡酒为市售商品。

仪器：GC2010-FTD(日本岛津公司)；SPME手动进样手柄及50μm/30μmCAR/DVB/PDMS萃取头，15mL具塞顶空瓶(美国Supelco公司)；具有磁力搅拌功能的电热恒温水浴锅。

回收率测定：将含有9种吡嗪类化合物的混合标准溶液加入到12％(v/v)乙醇水溶液、茅台酒、郎酒及古井贡酒中测定加标回收率，每个酒样平行3次。

酒样测定：本发明选取了茅台酒，郎酒，古井贡酒为目标酒样，将三种白酒稀释到12％(v/v)，加入500μL内标，按上述方法测定其中吡嗪类化合物含量。表2列出了所测酒样中吡嗪类化合物的含量，图3为郎酒酒样GC-FTD色谱图。

(3)有益效果：本发明采用顶空固相微萃取与气相色谱-火焰热离子检测器相结合的方法，建立了快速检测白酒中吡嗪类化合物的方法，采用快速简单的顶空固相微萃取富集白酒中挥发性风味物质，并且提高了回收率；另外采用对含氮化合物选择性强而对其他化合物无响应的火焰热离子检测器，使该方法特异性强，灵敏度高，克服了以往方法中的诸多不足；该方法可用于各种香型白酒中含氮化合物的分析检测。

附图说明

图1不同条件下的萃取效果。

图2 9种吡嗪类物质的标准曲线。

图3郎酒的GC-FTD色谱图。

1＝未知，2＝吡嗪(pyrazine)，3＝2-甲基吡嗪(2-MP)，4＝2，5-二甲基吡嗪(2，5-DMP)，5＝2，6-二甲基吡嗪(2，6-DMP)，6＝2-乙基吡嗪(2-EP)，7＝2，3-二甲基吡嗪(2，3-DMP)，8＝未知，9＝未知，10＝2，3，5-三甲基吡嗪(2，3，5-TMP)，11＝未知，12＝未知，13＝未知，14＝2，3，5，6-四甲基吡嗪(2，3，5，6-TTMP)，15＝未知，16＝未知，17＝未知，18＝内标，19、20、21、22、23、24、25、26、27＝未知。

具体实施方式

实施例1

固相微萃取条件的优化：

萃取温度对吸附采样的影响具有双面性：一方面，温度升高时较多的分析物会从基质中逸出进入液上空间，从而有利于顶空固相微萃取；另一方面，温度升高也会降低萃取头吸附分析组分的能力，使得吸附量下降。本发明比较了30℃，40℃，50℃和60℃的萃取效果，结果表明50℃时吸附效果最佳。

固相微萃取过程是被分析物在样品基质和萃取头涂层间的一个富集平衡的过程，一旦达到平衡，被分析物在两相间的浓度达到恒定。本发明比较了10min，30min，40min和50min的萃取效果，结果表明萃取时间为40min达到萃取平衡。

此外，提高酒体的离子强度可以提高萃取效率，本发明考察了NaCl加入量0g/mL、0.2g/mL、0.4g/mL、0.5g/mL，当力入0.4g/mL时溶液已饱和，0.5g/mL已过饱和，总吸附量并无明显提高。综合所有优化试验的结果，最终将SPME条件定为50℃下加入0.4g/mL NaCl，搅拌吸附40min，结果见附图1。

实施例2

方法的评价：以2-乙酰基吡啶为内标，9种吡嗪化合物的线性相关系数R2的变化范围在0.9908(2，3-二甲基吡嗪)到0.9999(2，3，5-三甲基吡嗪)之间，所得标准曲线的线性良好见附图2。同时标准曲线的线性范围包含了酒中含氮化合物的浓度范围。9种吡嗪类化合物检测限＜1μg/L，其中2，3-DEP检测限为62.50ng/L。该方法的整体精确度较好，相对标准偏差大多数在10％以内，能够满足分析的要求。本发明做了回收率的测定，结果表明该方法回收率均大于80％，见表1。

表1吡嗪化合物在白酒中的回收率(％，n＝3)

项目	模拟酒		郎酒		茅台		古井贡酒
									回收率	相对标准偏差	回收率	相对标准偏差	回收率	相对标准偏差	回收率	相对标准偏差
	吡嗪	99.39	5.70	98.67	5.97	99.59	8.93	N.D									-
2-甲基吡嗪									119.10	4.72	94.85	2.61	95.47	5.23	93.53	6.81
	2，5-二甲基吡嗪	93.74	4.70	87.19	11.18	84.54	9.41	91.58									5.42
2，6-二甲基吡嗪									103.38	4.09	98.62	9.56	89.43	5.76	108.02	5.91
	2-乙基吡嗪	103.26	5.13	103.51	9.68	89.68	10.86	88.17									10.29
2，3-二甲基吡嗪									89.66	6.17	97.29	8.16	95.67	9.64	117.16	9.72
	2，3，5-三甲基吡嗪	101.46	6.83	80.17	2.22	92.58	9.68	102.53									8.49
2，3-二乙基吡嗪									91.14	6.46	N.D.	-	116.65	3.46	80.98	5.83
	2，3，5，6-四甲基吡嗪	83.20	11.52	92.54	8.59	91.27	6.97	109.81									4.04

N.D.：未检测到

实施例3

实际酒样的测定：

本发明选取了茅台酒，郎酒，古井贡酒为目标酒样，将三种白酒稀释到12％(v/v)，加入500μL内标，按上述方法测定其中吡嗪类化合物含量。附表2列出了所测酒样中吡嗪类化合物的含量，附图3为郎酒酒样的GC-FTD色谱图。

表2不同白酒中各种吡嗪类衍生物含量(Mean±Stdev，μg/L，n＝3)

项目	茅台	郎酒	古井贡酒
				吡嗪	66.32±0.90	35.74±0.65	N.D.
2-甲基吡嗪	249.32±0.90	121.98±0.99	31.33±0.32
				2，5-二甲基吡嗪	113.38±0.03	67.82±0.29	7.29±0.18
2，6-二甲基吡嗪	790.47±1.61	414.85±1.68	56.61±0.81
				2-乙基吡嗪	120.49±0.94	39.97±0.36	19.13±0.27
2，3-二甲基吡嗪	158.81±1.01	109.38±0.54	9.36±0.12
				2，3，5-三甲基吡嗪	951.07±4.11	539.63±7.51	41.63±0.33
2，3-二乙基吡嗪	5.88±0.05	N.D.	0.78±0.01
				2，3，5，6-四甲基吡嗪	809.24±2.34	218.36±4.84	25.55±0.773

N.D.：未检测到。

Claims (7)

1.一种测定白酒中吡嗪类化合物的方法，其特征是用重蒸馏的去离子水将待测酒样稀释到最终酒精含量为12％(v/v)，然后用顶空固相微萃取技术富集白酒中吡嗪类化合物，再用气相色谱-火焰热离子检测器对白酒中吡嗪类化合物进行定性定量分析。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是顶空固相微萃取：吸取已加内标的稀释后的酒样5mL放入15mL顶空瓶中，并加入2gNaCl，插入50μm/30μmCAR/DVB/PDMS萃取头，旋紧瓶盖，置于水浴中于50℃恒温搅拌萃取40min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是气相色谱-火焰热离子检测器检测：萃取完毕后将萃取头取出，插入气相色谱进样口250℃热解吸3min，毛细管柱PEG20M，30m×0.32mm i.d.×0.5μm，进样口和检测器温度均为250℃，载气为He，流速3mL/min；分流比1∶1；程序升温：起始温度50℃，保持2min，然后以2℃/min的升温速率升温到85℃，保留0.1min，再以5℃/min的升温速率升温到210℃，保持2min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是未知吡嗪类化合物的定性分析：通过比对未知化合物和标准品的保留时间来确认检测出的吡嗪类化合物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是未知吡嗪类化合物的定量分析：

(1)分别配制单标储备液：分别准确称取0.3～0.5g的9种吡嗪类化合物标准品，用优级纯乙醇配制定容于25mL容量瓶中，作为单标储备液I；分别准确吸取1mL9种吡嗪类的单标储备液I，同样用优级纯乙醇配制定容于25mL容量瓶中，作为单标储备液II；分别准确吸取1mL单标储备液II配置成12％(v/v)乙醇溶液定容于25mL容量瓶中，作为单标储备液III；

(2)配制混合标准溶液：将9种单标储备液III各吸取0.5～2mL放入一个容量瓶中，用12％(v/v)乙醇溶液定容至50mL，作为混合标准溶液；

(3)内标的配制：吸取0.3mL内标物用优级纯乙醇配制定容于25mL容量瓶中作为内标储备液I，吸取1mL内标储备液I用优级纯乙醇配制定容于25mL容量瓶中作为内标储备液II，再吸取1mL内标储备液II用12％(v/v)乙醇配制定容于50mL容量瓶中作为内标储备液III；

(4)标准曲线的建立：将配制的混合标准溶液吸取25mL用12％(v/v)的乙醇溶液稀释定容至50mL，再从中吸取25mL用12％(v/v)的乙醇溶液稀释定容至50mL，重复逐步稀释，共得到11个浓度梯度的混合标准溶液，每一浓度梯度的混合标准溶液中均加入500μL内标储备液III，均用12％(v/v)乙醇溶液定容至50mL，依次对每一浓度梯度的混合标准溶液进行顶空固相微萃取：准确吸取5mL配制好的混合标准溶液于15mL顶空瓶中，加入2gNaCl，旋紧瓶盖，置于水浴中于50℃恒温萃取40min；以吡嗪类化合物与内标物峰面积之比为纵坐标，吡嗪类化合物浓度为横坐标绘制标准曲线；

(5)酒样测定：将目标酒样稀释到12％(v/v)，加入500μL内标，进行顶空固相微萃取，气相色谱-火焰热离子检测器进行定量分析，比照标准曲线测定被测酒样中吡嗪类化合物含量。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是9种吡嗪类化合物在0～200μg/L或0～400μg/L检测范围内具有良好的线性关系，其线性相关系数R²均大于0.99。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征是9种吡嗪类化合物检测限均小于1μg/L，酒样3次重复测定的相对标准偏差小于15％，9种吡嗪类化合物的回收率均大于80％。

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