CH674203A5

CH674203A5 -

Info

Publication number: CH674203A5
Application number: CH2617/85A
Authority: CH
Inventors: Luigi Rovati; Francesco Makovec; Rolando Chiste; Paolo Senin
Original assignee: Rotta Research Lab
Priority date: 1984-06-25
Filing date: 1985-06-20
Publication date: 1990-05-15
Also published as: IE851502L; NZ212436A; DE3522506A1; GB2160869B; SE8503097L; AU4410985A; DK285685D0; BE902726A; US4791215A; GB8515555D0; SE503111C2; FR2566397A1; SE8503097D0; ES544462A0; DE3522506C2; AT390949B; IE57892B1; ATA186985A; DK285685A; GB2160869A

Description

DESCRIZIONE La presente invenzione ha per oggetto derivati originali dell'acido D,L-glutammico e dell'acido D,L-aspartico che possono essere rappresentati dalle formule generali sotto indicate:

3

674 203

COOH

I

(CH2)n (IA)

I

CH-NH-CO-Ri

I

CO-R2

I

(CH2)n (IB)

I

CH-NH-CO-Ri

I

COOH

in cui n è uguale ad 1 oppure a 2, Ri è un fenile mono-, di- o tri-sostituito con gruppi alchilici C1-C4 lineari o ramificati, uguali o differenti, oppure con alogeni, con il gruppo ciano o con il gruppo trifluorometile, ed in cui R2 è scelto dal gruppo che consiste di morfolino, piperidino e amminico mono- o disostituito con gruppi alchilici lineari, ramificati o ciclici, eguali o differenti, contenenti da 1 a 8 atomi di carbonio.

I composti oggetto della presente invenzione dimostrano di possedere interessanti proprietà farmacologiche nei riguardi dei mammiferi. Una di queste proprietà è la capacità di potenziare l'attività analgesica della morfina e di altri farmaci analgesici.

Tali proprietà possono essere almeno in parte interpretate come dovute ad una potente attività antagonista della colecistochinina (CCK) o di altri peptidi bioregolatori esplicata da molti dei composti in oggetto.

I composti secondo l'invenzione possono essere quindi impiegati con vantaggio nella terapia di diverse malattie dell'uomo, quali le malattie dell'apparato digerente, come ad esempio nel trattamento delle coliti e delle discinesie biliari; oppure possono essere impiegati per il trattamento del dolore di qualsiasi eziologia ed intensità.

In base alle caratteristiche farmacologiche se ne può inoltre preconizzare l'impiego nel trattamento di disturbi psichici imputabili a scompensi dei livelli fisiologici neuronali della CCK o di altri polipeptidi bioattivi ed ancora nel trattamento dell'anoressia o come favorente l'accrescimento ponderale negli animali di allevamento oppure per il trattamento delle affezioni in cui vi sia un accrescimento cellulare patologico mediato da peptidi bioattivi (come probabilmente le neoplasie).

I composti oggetto dell'invenzione come già sopra menzionato presentano una potente attività anti CCK su diversi modelli sperimentali sia in vivo che in vitro. Così essi riducono le contrazioni indotte dalla CCK sulla cistifellea di cavia sia in vitro sia in vivo, inibiscono le contrazioni indotte su colon di coniglio, aumentano inoltre la secrezione biliare nel ratto.

Interessante risulta essere inoltre il potenziamento indotto sull'attività analgesica dei farmaci analgesico-narcotici e non narcotici.

Tale potenziamento consente infatti nel primo caso una notevole riduzione della posologia degli oppioidi limitando in tal modo tutta quella pleiade di effetti collaterali indesiderati e ben noti, senza per questo ridurne l'efficacia terapeutica ed aumentandone in definitiva notevolmente l'indice teraperutico. Questi composti possono inoltre essere impiegati per ristabilire l'attività analgesica dei farmaci oppioidi nel caso di scadimento del loro effetto farmacologico legato al ben noto fenomeno della tolleranza, senza per questo doverne aumentare il dosaggio terapeutico. Tali favorevoli caratteristiche terapeutiche potrebbero perciò servire anche a rendere possibile una grande disintossicazione di soggetti resi tossicomani dall'uso prolungato di farmaci oppioidi.

Nel caso degli analgesici non narcotici il beneficio oltre quello della maggior attività analgesica di per sè molto utile, è anche quello di una protezione della mucosa gastrica normalmente danneggiata da tali prodotti.

Questo potenziamento dell'attività dei farmaci analgesici è fra l'altro correlato alle capacità che hanno i composti secondo l'invenzione di bloccare la degradazione idrolitica delle encefali-ne, peptidi fisiologici endogeni dotati di potente attività analgesica. Ciò permetterebbe un maggior tempo di emivita ed in definitiva una maggiore attività delle encefaline stesse.

5 Forme farmaceutiche dei composti oggetto dell'invenzione possono essere preparate secondo tecniche convenzionali come ad esempio compresse, capsule, sospensioni, soluzioni e suppositori e possono essere somministrate per via orale, parenterale o rettale.

10 L'ingrediente attivo viene somministrato al paziente tipicamente in ragione da 0,1 a 10 mg/kg di peso corporeo per dose.

Per la somministrazione per via parenterale è preferibile l'impiego di una sale idrosolubile dei composti in oggetto come il sale sodico oppure un altro sale non tossico e farmaceutica-15 mente accettabile. Come ingredienti inattivi si possono impiegare sostanze comunemente impiegate nell'industria farmaceutica come eccipienti, leganti, aromatizzanti, disaggreganti, coloranti, umettanti ecc.

Il procedimento per la preparazione dei derivati dell'acido 20 glutammico e dell'acido aspartico secondo l'invenzione è caratterizzato dal fatto che comprende l'operazione di:

a) far reagire un'anidride interna di formula:

CO-

30

(CH2)„

I

CH-NH-CO-Ri

I

co

(II)

o

40

in cui n e Ri hanno il significato sopra riportato, con un'ammi-na di formula R2H in cui R2 ha il significato sopra riportato, in rapporto molare da 1 a 5 ad una temperatura da -20 a + 30°C, ricuperare i composti (IA) e (IB) dalla massa di reazione e separare detti composti (IA) e (IB).

Preferibilmente la temperatura di reazione è da —10°C a + 10°C.

Le anidridi interne di formula II sono composti nuovi, non sintetizzati fino ad oggi.

45 Dette anidridi interne (II) sono ottenute mediante le operazioni di:

b) far reagire l'acido glutammico od aspartico nelle condizioni di Schotten-Bauman (in mezzo alcalino) con una quantità 50 equimolecolare di un cloruro acilico di formula Ri-CO-Cl, in cui Ri ha il significato sopra riportato, ad una temperatura da --20°C a + 30°C per ottenere il composto N-acilato di formula:

55

60

COOH

I

(CH2)„ (III)

I

CH-NH-CO-Ri

I

COOH

65 c) disidratare il composto di formula (III) per reazione in presenza di anidride acetica in rapporto molare da 1 a 10, da sola od in presenza di un solvente inerte con essa miscibile, ad una temperatura da — 10°C a quella di riflusso.

674 283 4

La serie di operazioni del procedimento secondo l'invenzione è illustrata nella sua interezza nello schema sotto riportato:

cooh cooh

I I

(ch2)n (ch2)„ (iii)

| acilazione i ch-nh2 ■> ch-nh-co-ri

| ri -co-c1 |

cooh cooh

(fase b)

DISIDRATAZIONE

(fase c)

ai)

co

I

(CH2)n

I

ch-nh-co-ri

I

co

o amidazione

(fase a)

cooh

I

(ch2)„ isomero IA

I

ch-nh-co-ri

I

co-r2

I

(CH2)n isomero IB

I

ch-nh-co-ri

I

cooh

La fase b) di acilazione è effettuata preferibilmente ad una temperatura da 0°C a 15°C per un tempo da 1 a 24 ore, raccomandabile è una temperatura di circa 5°C ed un tempo di reazione di 12 ore.

Nella fase c) il tempo di reazione è tipicamente da circa 30 minuti a 12 ore, preferibilmente di circa 3 ore e la quantità di anidride acetica è preferibilmente di 3 moli per mole di composto (III).

Nella fase a) di ammidazione, Pammina di formula R2H è preferibilmente introdotta in rapporto molare di 2,5 a 1 riferita dell'anidride interna (II) e la reazione viene condotta per un tempo da circa 30 minuti a 12 ore, preferibilmente 3 ore.

Le percentuali relative dei composti di formula IA e IB sono funzione del tipo di sostituenti Ri e R2 impiegati.

Gli isomeri IA e IB possono essere separati o per cristallizzazione frazionata (con i solventi indicati in tabella C e D) o per estrazione in ambiente basico essendo i composti di formula IB mediamente più acidi.

I seguenti esempi vengono riportati per meglio illustrare l'invenzione.

Esempio 1

Preparazione dell'acido 3,4-dicloro-N-benzoilglutammico (Composto A-4)

40

Ad una soluzione contenente 14,7 g (0,1 moli) di acido L-glutammico in 200 mi di soda 1 N raffreddata a 5°C si aggiungono contemporaneamente sotto agitazione e raffreddamento nel tempo di circa 30 minuti, 100 mi di soda 1 N e 21 g (0,1 45 moli) di 3,4-cloro benzoilcloruro.

La miscela viene lasciata 12 ore a reagire. Si acidifica al rosso congo con HCl concentrato e si filtra il precipitato così formatosi. Il residuo viene ricristallizzato da H20.

P.f.: 141-145°C TLC (vedi nota in tabella) Rf: 0,46. Otte-50 nuti 24,5 g, resa 76,4%.

Tutti i composti di formula III vengono sintetizzati impiegando la medesima procedura (vedi schema precedente).

Nella seguente tabella A vengono riportati i composti così ottenuti con alcune caratteristiche che li identificano, nonché le 55 rese ottenute ed i solventi di cristallizzazione impiegati.

5

674 203

TABELLA A:

D,L-N-acil derivati dell'acido glutammico ed aspartico cooh i

(ch2)„

I

ch-nh-co-ri

I

cooh

„ „ Punto di Solvente di „ „ Resa _ ,

Composti n Ri , . ^ ... . Rf (*) . Formula fusione ( C) cristallizzazione (%)

A-l

2

2-cloro-fenile

116-8

h2o

0,32

76,5

CI2HI2C1nos

A-2

2

3-cloro-fenile

134-8

h2o

0,40

80,3

Ci2HI2C1NOs

A-3

2

4-cloro-fenile

105-7

h2o

0,44

84,7

CI2HJ2C1N05

A-4

2

3,4-dicloro-fenile

141-5

h2o

0,46

76,4

CI2HIIC12NOS

A-5

2

3,5-dicloro-fenile

147-9

h2o

0,48

90,1

C12H,IC12N05

A-6

2

2,4-dicloro-fenile

125-7

h2o

0,43

58,5

C12HnCl2N05

A-7

2

3,4,5-tricloro-fenile

143-5

H20/alcol 1:1

0,46

85,7

CI2H10C13NO5

A-8

1

3,4-dicloro-fenile

158-61

h2o

0,38

8 6,6

CaH9Cl2N05

A-9

2

4-fluoro-fenile

84-86

—

0,37

79,5

CI2HI2FN05

A-10

2

3,5-difluoro-fenile

148-51

h2o

0,41

85,5

Q2HIIF2N05

A-ll

2

2-bromo-fenile

127-9

h2o

0,33

93,1

ci2hi2brn05

A-12

2

4-bromo-fenile

148-50

H20/alcol 7:3

0,43

87,8

cnhnbrnos

A-13

1

2-bromo-fenile

147-9

h2o

0,19

90,2

cnhiobrn05

A-14

2

2-iodo-fenile

135-8

h2o

0,35

70,5

CI2HI2IN05

A-15

2

4-iodo-fenile

171-3

H20/alcol 7:3

0,47

84,8

CI2HI2IN05

A-16

2

3,4,5-triiodo-fenile

180-4

H20/alcol 1:1

0,53

87,0

C,2H10I3NO5

A-17

2

3-ciano-fenile

123-6

h2o

0,22

81,2

CI3HI2N205

A-18

1

3-ciano-fenile

175-9

h2o

0,12

86,5

CI2hION2oS

A-19

2

4-ciano-fenile olio

—

0,27

71,0

CI3HI2N2Os

A-20

2

3-metil-fenile

127-8

h2o

0,33

80,0

CI3H15N05

A-21

2

4-metil-fenile

102-8

h2o

0,34

95,0

c13h15no5

A-22

2

3,4-dimetil-fenile

131-3

H20/alcol 7:3

0,38

85,0

Cì4HI7N05

A-23

2

3,5-dimetil-fenile

153-5

H20/alcol 7:3

0,41

83,5

C14H17N05

A-24

2

2,4-dimetil-feniIe

98-105

H20/aIcol 7:3

0,38

65,8

Cl4 H17NO5

A-25

2

2,4,6-trimetil-fenile

170-4

H20/alcol 7:3

0,43

72,0

C15H19N05

A-26

2

4-etil-fenile

154-6

H20/alcol 7:3

0,38

88,6

C14 hi7no5

A-27

2

4-n-propil-fenile

108-13

h2o

0,41

82,3

C15H19N05

A-28

2

4-isopropil-fenile

49-52

h2o

0,37

50,8

CI5HI9N05

A-29

2

4-n-butil-fenile

-(olio)

—

0,43

61,5

c16h21no5

A-30

2

4-isobutil-fenile

118-25

h2o

0,40

78,0

CI6H21N05

A-31

2

4-trifIuorometiI-fenile

153-5

h2o

0,30

7 9,0

C I3hI2F3N05

(*) Eluente usato: Cloroformio - Acido Acetico - H20 (8-2-0,1).

Esempio 2

Preparazione dell'anidride 3,4-dicloro-benzoil-glutammica (Composto B-4 di tabella B)

A 32,0 g (0,1 moli) di acido 3,4-dicloro-benzoiI-glutammico sono aggiunti 30,6 g (0,3 moli) di anidride acetica e 60 mi di etere isopropilico. Si riscalda a riflusso (73-77°C) per 2 ore. Si raffredda, si filtra, si lava con poco etere per eliminare l'anidride acetica residua e si essica. Si ottengono così 27,0 g. Resa 89,3%.

P.f.: 188-190°C.

Tutti i composti di formula II vengono sintetizzati impie-65 gando la medesima procedura (vedi schema). Nella seguente tabella B vengono riportati a titolo esemplificativo numerosi esempi di questi composti con alcune caratteristiche che li identificano nonché le rese ottenute.

674203

6

TABELLA B

Derivati dell'anidride N-acil-glutammica ed aspartica di formula: CO

I

(CH2)n

I O

CH-NH-CO-R,

!

CO

Composti n Ri ... . ,0~ Formula di fusione (°C) (%)

B-l

2

2-cloro-fenile

129-31

79,5

C12H10CINO4

B-2

2

3-cloro-fenile

157-8

83,8

C12H10CINO4

B-3

2

4-cloro-fenile

187-90

87,8

C12H10CINO4

B-4

2

3,4-dicloro-fenile

188-90

89,3

C12H9CI2NO4

B-5

2

3,5-dicloro-fenile

214-16

74,7

C12H9CI2NO4

B-6

2

2,4-dicIoro-fenile

155-7

74,2

C12H9CI2NO4

B-7

2

3,4,5-tricloro-fenile

208-10

93,3

C12H8CI3NO4

B-8

1

3,4-dicloro-fenile

195-7

91,4

C11H7CI2NO4

B-9

2

4-fluoro-fenile

171-3

72,1

C12HioFN04

B-10

2

3,5-difluoro-fenile

198-203

91,2

C,2H9F2N04

B-ll

2

2-bromo-fenile

147-9

72,8

Ci2HioBrN04

B-12

2

4-bromo-fenile

200-3

76,9

Ci2HioBrN04

B-13

1

2-bromo-fenile

161-4

84,1

CnH8BrN04

B-14

2

2-iodo-fenile

158-60

75,6

C12H10INO4

B-15

2

4-iodo-fenile

201-3

88,0

C12H10INO4

B-16

2

3,4,5-triiodo-fenile

225-8

85.2

Ci2H8-I3N04

B-17

2

3-ciano-fenile

171-3

76,7

C13H10N2O4

B-18

1

3-ciano-fenile

173-77

81,9

C12H8N4O4

B-19

2

4-ciano-fenile

181-5

78,8

C13H10N2O4

B-20

2

3-metil-fenile

144-8

74,0

C13H13NO4

B-21

2

4-metil-fenile

188-90

74,2

C13H13NO4

B-22

2

3,4-dimetil-fenile

161-3

82,5

C14H15NO4

B-23

2

3,5-dimetil-fenile

155-7

69,0

C14H15NO4

B-24

2

2,4-dimetil-fenile

135-8

41,2

Ci4HisN04

B-25

2

2,4,6-trimetil-fenile

160-5

38,8

C,5H,7N04

B-26

2

4-etil-fenile

174-6

78,0

C14H15N04

B-27

2

4-n-propil-fenile

159-61

72,4

C,5HI7N04

B-28

2

4-isopropil-fenile

153-5

64,5

Ci5HnN04

B-29

2

4-n-butil-fenile

142-4

73,0

C16H19N04

B-30

2

4-isobutil-fenile

139-43

72,8

C16H19N04

B-31

2

4-trifluorometil-fenile

157-9

79,0

C,3H,0F3NO4

Esempio 3

Preparazione dell'acido D,L-4-(3,4-dicloro-benzoil-ammino)--5-(di-n-butilammino)-5-osso-pentanoico (Composto C-6 di tabella C)

30,2 g (0,1 moli) di anidride 3,4-dicIoro-benzoil-gIutammica sono caricati in un reattore e sospesi in 100 mi di acqua. Si raffredda a circa 5°C e si aggiungono goccia a goccia in un tempo di circa 15 minuti 32,2 g (0,25 moli), di di-n-butilammina.

Si lascia reagire per 3 ore a questa temperatura e si acidifica con acido acetico glaciale. Si filtra, si lava al neutro con acqua 60 e si essica.

Si ottengono così 16,4 g. Resa 38%.

P.f.: 81-83°C (cristallizza da etere isopropilico). TLC. Rf.: 0,92.

Tutti i composti di formula LA e IB vengono sintetizzati im-65 piegando la medesima procedura (vedi schema precedente). Nelle seguenti tabelle C e D vengono riportati a titolo esemplificativo numerosi esempi di questi composti con alcune caratteristiche che li identificano nonché le rese ottenute.

7

674 203

TABELLA C Derivati di formula:

COOH

I

(CH2)„

I

CH-NH-CO-RI

I

COR2

Composti n

Ri

R2

Punto di Fusione (°C)

Solvente di cristallizzazione

Rf (*)

Resa (%)

C-l

2

2-cloro-fenile di-n-propil-ammino

133-5

Etile acetato

0,78

53,5

C-2

2

3-cloro-fenile di-n-propil-ammino

126-8

Acetone

0,80

17,0

C-3

2

4-cloro-fenile di-n-propil-ammino

101-3

H20/Etanolo 3:7

0,88

50,0

C-4

2

4-cloro-fenile di-n-pentil-ammino

104-7

H20/Etanolo 1:1

0,94

24,2

C-5

2

3,4-dicloro-fenile di-n-propil-ammino

108-10

Etile acetato

0,87

28,0

C-6

2

3,4-dicloro-fenile di-n-butil-ammino

81-3

Etere isopropilico

0,92

38,0

C-l

2

3,4-dicloro-fenile di-n-pentil-ammino

106-8

Etere isopropilico

0,95

31,7

C-8

2

3,4-dicloro-fenile di-n-ésil-ammino

108-10

Etere isopropilico

0,97

21,8

C-9

2

3,5-dicloro-fenile di-n-butil-ammino

165-7

H20/Etanolo 1:4

0,95

53,4

C-10

2

2,4-dicloro-fenile di-n-butil-ammino

124-6

H20/Etanolo 1:2

0,92

57,6

C-ll

2

3,4,5-tricIoro-feniIe di-n-butil-ammino

132-4

H20/Etanolo 1:4

0,96

23,3

C-12

2

4-fluoro-fenile di-n-propil-ammino

123-5

H20/Etanolo 1:1

0,85

43,5

C-13

2

3,5-difluoro-fenile di-n-propil-ammino

132-6

H20/Etanolo 3:7

0,88

11,4

C-14

2

2-bromo-fenile di-n-propil-ammino

132-3

H20/Etanolo 1:1

0,85

54,2

C-15

2

4-bromo-fenile di-n-propil-ammino

129-31

Etile acetato

0,83

20,7

C-16

1

2-bromo-fenile di-n-propil-ammino

123-4

Etile acetato

0,63

40,9

C-17

2

2-iodo-fenile di-n-propil-ammino

146-8

Etile acetato

0,86

25,2

C-18

2

4-iodo-fenile di-n-propil-ammino

104-11

Etile acetato

0,83

18,3

C-19

2

3,4,5-triiodo-fenile di-n-propil-ammino

102-5

H20/Etanolo 1:1

0,88

27,6

C-20

2

3-ciano-fenile di-n-propil-ammino

120-5

Etile acetato

0,78

37,0

C-21

2

3-ciano-fenile n-butil-ammino

130-2

H20/Etanolo 1:1

0,75

28,4

C-22

1

3-ciano-fenile di-n-propil-ammino

144-5

Etile acetato

0,63

20,0

C-23

1

3-ciano-fenile cicloesile-ammino

188-92

H20/Etanolo 3:2

0,69

90,7

C-24

2

3-ciano-fenile di-n-butil-ammino

127-9

H20/Etanolo 1:1

0,82

54,8

C-25

2

4-bromo-fenile di-n-butil-ammino

120-2

Etere isopropilico

0,92

27,0

C-26

2

3,4-dicloro-fenile piperidino

183-5

Etile acetato

0,74

29,4

C-27

2

4-iodo-fenile di-n-butil-ammino

86-92

H20/Etanolo 1:2

0,81

39,8

C-28

2

3-metil-feniIe di-n-propil-ammino

132-3

Etile acetato

0,80

31,0

C-29

2

4-metil-fenile

»

137-9

»

0,85

28,8

C-30

2

3,4-dimetil-fenile

»

142-4

»

0,83

44,0

C-31

2

3,5-dimetil-fenile

»

144-6

Etanolo/acqua 3:2

0,89

23,4

C-32

2

2,4-dimetil-fenile

»

127-9

Etile acetato

0,84

50,4

C-3 3

2

2,4,6-trimetil-fenile

»

166-8

»

0,89

39,5

C-34

2

4-etil-fenile

»

129-31

»

0,86

45,7

C-35

2

4-n-propil-fenile

»

117-9

Etanolo/acqua 1:1

0,82

38,3

C-36

2

4-isopropil-fenile

»

147-150

Metanolo/acqua 7:3

0,91

48,0

C-37

2

4-n-butil-fenile

»

126-8

Metanolo/acqua 3:1

0,79

34,7

C-3 8

2

4-isobutil-fenile

»

137-41

Metanolo/acqua 7:3

0,85

24,5

C-39

2

4-trifluorometil-fenile

»

119-21

Etanolo

0,76

37,6

C-40

2

3,4-dimetil-fenile di-etil-ammino

191-2

Etanolo

0,67

65,0

C-41

2

4-n-propil-fenile

»

133-5

Etanolo/acqua 1:1

0,63

46,4

674 203

8

TABELLA C (continuazione)

Composti n

Ri

R2

Punto di Fusione (°C)

Solvente di cristallizzazione

Rf (*)

Resa (%)

C-42

2

3,4-dimetil-fenile n-butil-ammino

155-7

Etanolo/acqua 7:3

0,68

21,4

C-43

2

4-etil-fenile

»

137-9

Etanolo 95%

0,68

27,6

C-44

2

4-n-propil-fenile

»

141-4

Etanolo 95%

0,78

11,0

C-45

2

3,4-dimetil-fenile n-propil-ammino

155-7

Isopropanolo

0,76

20,2

C-46

2

3,4-dimetil-fenile n-esil-ammino

156-8

Acetonitrile

0,85

18,0

C-47

2

3,4-dimetil-fenile cicloesil-ammino

210-2

Metanolo

0,73

62,8

C-48

2

4-etil-fenile

»

190-2

Metanolo

0,78

31,3

C-49

2

4-isopropil-fenile

»

208-12

Metanolo/acqua 4:1

0,82

18,6

C-50

2

3,4-dimetil-fenile dimetil-ammino

152-4

Acqua/etanolo 9:1

0,37

29,0

C-51

2

3,4-dimetil-fenile morfolina

147-50

Etanolo

0,80

40,0

C-52

2

3,4-dimetil-fenile piperidino

172-4

Metanolo

0,82

33,8

C-53

2

3-metil-fenile di-n-butil-ammino

92-7

Etanolo/acqua 1:1

0,88

12,7

C-54

2

3,4-dimetil-fenile

»

105-8

Acetonitrile

0,91

13,3

C-55

2

3,4-dimetil-fenile di-n-pentil-ammino

109-11

Etanolo/acqua 1:1

0,92

40,5

(*) Eluente impiegato: alcol isoamilico - acetone - H2O (5.2.1)

TABELLA D Derivati di formula:

CO-R2

- I

(CH2)n

I

CH-NH-CO-Ri

I

COOH

Composti n

Ri

Rz

Punto di fusione (°C)

Solvente di cristallizzazione

Rf (*)

Resa (%)

D-l

2

3,4-dicloro-fenile di-metil-ammino

148-52

H2O/Etanolo 3:7

0,38

30,1

D-2

2

3,4-dicloro-fenile di-n-butil-ammino

106-8

H20/Etanolo 1:1

0,62

17,0

D-3

1

3,4-dicloro-fenile n-butil-ammino

131-4

H2O/Etanolo 1:1

0,36

43,3

D-4

2

4-bromo-fenile di-butil-ammino

104-7

Etere isopropilico

0,50

19,9

D-5

2

3-ciano-fenile di-butil-ammino

115-8

Etile acetato

0,50

28,2

D-6

2

4-bromo-fenile morfolino

186-9

H20/Etanolo 3:7

0,35

69,5

D-7

2

4-bromo-fenile piperidino

132-5

H20/Etanolo 3:7

0,35

40,8

D-8

2

4-ciano-fenile di-butil-ammino

112-6

Etile acetato

0,51

21,3

D-9

2

3,4-dicloro-fénile piperidino

101-3

HzO/Etanolo 1:1

0,48

29,6

D-10

2

4-ciano-fenile piperidino

177-9

H20/Etanolo 3:4

0,28

37,6

D-ll

2

3-ciano-fenile piperidino

106-10

Etile acetato

0,22

38,9

D-12

2

3,4-dimetil-fenile di-metil-ammino

204-6

Metanolo

0,27

57,6

D-13

2

4-etil-fenile n-butil-ammino

137-9

Metanolo

0,48

37,5

D-14

2

4-propil-fenile n-butil-ammino

138-40

Metanolo

0,40

53,8

D-15

2

3,4-dimetil-fenile di-n-propil-ammino

118-21

Metanolo - H2O (2:1)

0,47

28,8

D-l 6

2

3,4-dimetil-fenile n-propil-ammino

167-9

H20-acetonitrile (2:1)

0,44

41,5

D-17

2

4-isopropil-fenile piperidino

152-4

alcol isopropilico

0,34

40,3

(*) Eluente impiegato: alcol isoamilico - acetone - H2O (5.2.1)

9

674 203

L'attività analgesica esplicata dai composti oggetto dell'invenzione sarà ora illustrata con una serie di esperienze farmacologiche atte a dimostrare sia il potenziamento dell'attività analgesica degli oppioidi sia il meccanismo d'azione attraverso il quale tale potenziamento si manifesta.

Esperimento 1:

Aumento dell'analgesia di farmaci analgesico-narcotici nel ratto nel Tail Flick Test

Il metodo è quello descritto da Harris et al. (J. Pharmacol. Esp. Ther. 143 (1964) 141-148).

Si utilizzano ratti maschi del peso di cirtca 150-200 g non a digiuno. Si sceglie un punto della coda che viene irradiato con una sorgente di calore (75°C) e si misura il tempo (in secondi) per cui l'animale resiste senza spostare la coda.

Si è scelto un tempo massimo di permanenza sotto la sorgente di calore di 8 secondi, dipodichè l'animale viene comunque allontanato per evitare danni tissutali. Si ripete tale misurazione prima (controlli) e dopo il trattamento con i farmaci.

La somministrazione dei farmaci oggetto dell'invenzione è effettuata per i.p. (10 mg/kg) dieci minuti e immediatamente prima della somministrazione della morfina (2 mg/kg). La variazione percentuale viene calcolata per ogni singolo animale con la formula seguente:

5 % variazione =

Tempo dopo il trattamento (sec) - tempo controllo (sec)

x 100

8 - tempo controllo (sec)

io Le misure vengono eseguite 10, 20, 30, 45, 60 e 90 mimuti dal trattamento con gli analgesici.

I risultati così ottenuti sono descritti nella tabella 1 in cui vengono riportati i gruppi trattati e le dosi somministrate, le variazioni % media (calcolate su gruppi di 5 animali) del tempo di i5 latenza per la sensazione dolorosa, i valori medi calcolati nel periodo 10-90 minuti (± S.E.) ed il rapporto di potenza tra la morfina somministrata da sola od assieme ai composti oggetto della presente invenzione.

Dai dati esposti nella tabella 1 si vede come alla dose saggia-20 ta (10 mg/kg i.p.) i prodotti potenziano l'attività della morfina fino ad arrivare per i prodotti più attivi ad un'attività di circa 3 volte maggiore di quella della morfina da sola.

TABELLA 1

Attività potenziante la analgesia da oppioidi al test del «Tail Flick» indotte dai composti indicati ed oggetto dell'invenzione.

\ Tempi

Rapporto

di potenza

\

10'

20'

30'

45'

60'

90'

M (10-90) ± SE rispetto

Tratta-\

la morfina mento \

da sola

Controlli

-10,2 ± 0,3

19,6 ± 4,1

46,4 ± 8,2

-8,7 ± 13,5

18,2 ± 5,1

19,9 ± 8,3

14,2 ± 8,62

—

Morfina (M)

10,8 ± 4,0

54,2 ± 17,0

46,6 ± 21,0

41,7 ± 16,0

32,0 ± 17,0

-6,4 #10,0

29,8 + 23,0

1

M + C-l

65,3 ± 18,0

67,2 ± 15,0

66,3 + 14,0

82,7 ±11,0

68,8 ± 17,0

59,3 ± 25,0

68,2 ± 8,0

2,29

M + C-2

27,8 ± 13,0

43,8 ± 25,0

67,5 ± 20,0

64,2 ± 22,0

74,4 ± 16,0

57,3 ± 19,0

55,8 ± 17,0

1,87

M + C-3

44,4 ± 23,3

83,7 ± 16,3

77,8 ± 17,1

46,4 ± 24,5

73,6 ± 17,7

45,8 ± 22,8

61,9 ± 18,2

2,10

M + C-4

44,6 ± 5.3

67,5 ± 13,4

66,3 ± 14,0

60,4 ± 16,3

59,8 ± 17,0

44,2 ± 14,8

57,1 ± 10,3

1,92

M + C-5

34,5 ± 17,4

21,4 ± 16,0

59,5 ± 21,1

84,7 ± 15,2

63,9 ± 18,5

40,1 ± 23,9

50,7 + 23,0

1,70

M + C-6

89,2 ± 6,7

91,3 ± 8,7

83,6 ± 10,0

82,1 ± 16,6

79,8 ± 17,0

38,2 ± 10,6

77,4 ± 19,6

2,59

M + C-7

67,9 + 14,3

71,5 ± 17,6

79,4 ± 10,0

84,6 ± 10,5

92,9 ± 4,1

72,6 ± 7,0

78,2 ± 9,4

2,62

M + C-8

67,4 ± 20,5

74,1 ± 15,8

80,0 ± 12,9

85,9 ± 14,1

87,1 ± 12,9

60,4 ± 17,3

75,8 ± 10,6

2,54

M + C-9

67,6 ±11,0

65,8 ± 20,0

71,9 ± 17,5

59,1 ± 20,0

52,1 ± 22,0

40,4 ± 18,0

59,5 ± 11,6

2,00

M + C-10

56,9 ± 25,8

68,4 ± 21,4

72,9 ± 16,8

70,1 ± 18,5

66,2 ± 21,3

63,2 ± 23,4

66,0 ± 5,6

2,21

M + C-ll

25,2 ± 4,0

37,6 ± 16,0

50,9 ±11,0

54,4 ± 9,0

35,8 ± 5,0

18,7 ± 10,0

37,1 ± 14,0

1,24

M + C-12

54,4 ± 16,7

76,3 ± 19,0

61,6 ± 16,0

63,9 ± 20,0

65,2 ± 17,0

11,6 ± 14,0

55,5 + 22,0

1,86

M + C-13

24,6 ± 8,9

70,0 ± 18,5

75,5 ± 15,0

56,6 ± 10,5

62,3 ± 17,3

59,2 ± 25,1

58,0 ± 18,0

1,95

M + C-14

36,5 ± 28,4

76,0 ± 12,7

79,3 ± 10,6

77,0 ± 6,7

98,3 ± 1,3

71,9 ± 13,2

73,1 ± 20,0

2,45

M + C-15

59,8 ± 14,0

84,2 ± 9,6

78,3 ± 13,5

88,7 ± 8.5

82,5 ± 12,7

54,5 ± 14,7

74,7 ± 14,0

2,51

M + C-16

43,,2. ± 11,0

88,7 + 10,0

54,8 ± 5,8

47,3 ±11,8

26,1 ± 11,5

22,2 ± 16,7

47,0 ± 24,0

1,58

M + C-17

18,9 ± 10,0

37,0 ± 12,0

45,8 ±18,0

41,0 ±17,0

39,3 ± 20,0

31,2 ± 18,0

35,5 ± 9,5

1,19

M + C-18

48,9 ± 31,0

65,9 ± 24,0

80,1 ± 9,0

59,1 ± 20,0

33,5 ± 20,0

61,4 ± 12,0

58,1 ± 15,8

1,55

M + C-19

3,6 ± 12,0

42,8 ± 19,0

58,4 ± 21,0

66,1 ± 16,0

57,1 ± 18,0

35,6 ± 20,0

43,9 ± 22,7

1,47

M + C-20

53,8 ± 21,4

85,7 ± 10,0

92,0 ± 8,0

99,1 ± 1,0

91,2 ± 9,0

51,2 ± 14,0

78,8 ± 21,0

2,64

M + C-21

48,6 ± 19,0

37,4 ± 12,0

54,8 ± 19,0

44,6 ±15,0

64,0 ± 18,0

54,9 ± 10,0

50,7 ± 9,0

1,70

M + C-22

82,7 ± 9,4

67,6 ± 18,0

88,4 ± 9,3

83,3 ± 10,5

93,6 ± 6,4

53,8 ± 14,9

78,2 ± 15,0

2,62

M + C-23

33,1 ± 19,0

49,9 ± 15,0

58,2 ± 17,0

68,3 ± 20,0

72,0 ± 18,0

58,7 ± 22,0

56,7 ± 14,0

1,90

M + C-24

80,3 ± 13,6

87,2 ± 13,0

96,9 ± 3,0

100,0 ± 0,0

74,0 ± 16,0

75,3 ± 14,0

85,6 ±11,0

2,87

674 203

10

TABELLA 1 (continuazione)

Tempi

Trattamento

10'

20'

30'

45'

60'

90'

Rapporto di potenza M (10-90) ± SE rispetto la morfina da sola

Controlli

-10,2+ 0,3 19,6 ± 4,1 46,4 ± 8,2 -8,7 ± 13,5 18,2 ± 5,1 19,9 ± 8,3 14,2 + 8,62 —

M + C-25

59,7 ± 15,0

49,0 + 13,0

71,5 ± 13,0

61,9 ± 22,0

49,0 ± 22,0

20,4 + 6,0

51,9

+

18,0

1,74

M + C-26

50,1 ± 17,0

80,3 ± 20,0

84,7 ± 11,0

71,8 ± 15,0

32,2 ± 7,0

4,9 ± 6,0

54,0

+

31,1

1,81

M + C-27

52,3 ± 13,0

81,4 ± 12,0

90,2 ± 7,0

85,9 + 10,0

60,3 + 15,0

50,3 + 13,0

70,0

+

17,8

2,35

M + D-l

75,0 ± 16,0

100,0 ± 0,0

86,4 ± 14,0

100,0 +0,0

51,0 ± 21,0

85,4

+

19,7

2,86

M + D-2

85,6 + 14,0

98,1 ± 2,0

95,9 ± 4,0

96,6 ± 3,0

95,5 ± 3,0

87,5 ± 6,0

93,2

+

5,3

3,12

M + D-3

63,8 ± 17,0

79,9 ± 13,0

100,0 ± 0,0

58,6 + 18,0

33,8 + 18,0

32,9 + 10,0

61,5

+

26,2

2,06

M + D-4

72,8 ± 15,0

95,8 ± 3,0

96,3 ± 4,0

85,5 ± 10,0

87,5 ± 8,0

45,3 + 6,0

80,5

+

19,3

2,70

M + D-5

72,2 ± 17,0

92,5 ± 7,0

95,3 ± 5,0

96,0 ± 4,0

74,3 ± 11,0

75,5 ± 11,0

84,3

+

11,4

2,83

M + D-6

31,2 ± 22,0

45,8 + 23,0

50,7 ± 20,0

44,5 ± 24,0

45,3 ± 24,0

28,2 ± 19,0

41,0

+

9,0

1,37

M + D-7

31,8 ± 19,0

48,0 ± 16,0

70,5 ± 16,0

73,7 ± 13,0

88,6 + 11,0

32,4 ± 19,0

57,5

+

23,5

1,93

M + D-8

29,0 ± 15,0

50,9 + 8,0

61,4 ± 22,0

57,7 ± 18,0

52,9 ± 20,0

28,3 ± 12,0

46,7

+

14,4

1,56

M + D-9

88,5 ± 19,0

74,0 ± 16,0

70,9 ± 16,0

73,0 ± 15,0

84,5 ± 12,0

79,9 + 12,0

75,1

+

6,0

2,52

M + D-10

41,0 ± 8,0

58,6 ± 17,0

59,8 ± 17,0

62,7 ± 15,0

47,0 ± 15,0

35,4 ± 11,0

50,8

+

11,2

1,70

M + D-ll

25,3 ± 7,0

68,3 ± 20,0

74,8 ± 18,0

82,8 ± 17,0

86,2 ± 14,0

77,5 + 13,0

69,1

+

22,3

2,32

Morfina (M)

10,8 ± 4

54,2 ± 17

46,6 ±21

41,7 + 16

32 + 17

-6,4 ± 10

29,8

±

23

1

M + C-28

15,7 ± 10

66,8 + 18

68,3 ± 20

68,4 + 17

74,5 ± 11

27,5 ± 15

53,5

±

25

1,80

M + C-29

48,7 ± 20

75,5 ± 10,5

73,6 ± 11

70,0 ± 19

47,3 ± 23

6,0 ± 14

53,5

+

26

1,80

M + C-30

69,9 ± 16

100,0 + 0

95,2 ± 4,8

91,8 ± 8

100 ± 0

100,0 + 0

92,8

±

12

3,11

M + C-31

28,9 ± 17

43,3 ± 25

54,7 ± 22

68,0 + 22

57,4 ± 16

49,5 ± 19

50,4

±

14

1,69

M + C-32

21,8 ± 5

58,6 ± 17

83,5 ± 10

89,8 ± 8

78,4 + 13

52,2 + 22

64,0 ± 25

2,15

M + C-33

-0,1 ± 12

30,9 ± 8

38,7 ± 21

41,7 + 16

48,7 + 21

46,6 ± 12

34,4

±

18

1,15

M + C-34

19,6 ± 23

59 ± 17

85,5 ± 10

78,4 + 16

67 ± 20

59,1 + 23

60,6

±

23

2,03

M + C-35

39,9 ± 15

62,3 ± 23

13,7 ± 26

63,2 + 17

61,3 + 20

28,8 ± 31

44,9

±

21

1,51

M + C-36

8,6 ± 13

100,0 ± 0

96,9 ± 3

90,0 ± 10

96,9 ± 3

92,4 ± 25

80,8

±

36

2,71

M + C-37

27,6 + 13

45,8 + 18

55,0 ± 16

51,1 + 18

23,4 ± 21

12,4 ± 13

35,9

±

17

1,20

M + C-38

53,8 ± 21

85,7 ± 10

92,0 ± 8

99,1 + 1

91,2 ± 9

51,1 ± 14

78,8

21

2,64

M + C-39

44,9 ± 15

100,0 ± 0

93,3 ± 7

94,4 + 6

85,6 ± 7

81,8 ± 10

83,3

±

20

2,79

M + C-40

43,8 ± 15

69,1 ± 14

49,0 ± 23

85,6 ± 6

76,5 ± 17

61,5 ± 14

64,2

±

16

2,15

M + C-41

32,1 + 18

60,0 ± 22

40,0 ± 17

46,7 + 23

11,5 ± 14

7,4 + 20

32,9

±

20

1,10

M + C-42

49,0 ± 31

65,9 ± 24

80,1 ± 9

59,1 ± 20

33,5 ± 20

61,4 ± 12

58,2

±

16

1,95

M + C-43

54,1 ± 17

44,4 ± 23

38,9 ± 26

36,8 ± 27

47,8 ± 23

22,5 ± 13

40,7

±

11

1,36

M + C-44

-1,6 ± 11

17,0 ± 6

24,9 + 10

26,9 ± 19

35,1 ± 17

39,8 ± 8

23,7

+

15

0,79

M + C-45

57,2 ± 18

99,7 ± 0,3

95,7 ± 4

93,1 ± 7

77,7 ± 11

80,4 ± 9

84,0

+

16

2,82

M + C-46

14,7 ± 9

60,0 ± 18

28,0 ± 5

55,2 + 20

30,2 + 17

12,2 + 11

32,9

±

21

1,10

M + C-47

24,5 + 14

63,5 ± 18

52,3 ± 17

80,1 ± 22

73,2 ± 17

49,3 ± 19

57,1

±

20

1,92

M + C-48

42,1 + 14

59,5 ± 8

50,1 ± 21

78,4 ± 18

43,7 ± 30

44,9 ± 18

53,1

±

14

1,78

M + C-49

62,1 + 9

100,0 ± 0

97,6 + 2

99,5 ± 0,5

99,2 ± 0,5

65,8 + 0,8

87,4

±

18

2,93

M + C-50

22,3 + 13

68,9 ± 9

60,2 ± 19

49,4 ± 14

73,5 + 15

24,7 + 6

49,8

±

22

1,67

M + C-51

78,7 ± 18

82,8 ± 12

90,5 ± 10

86,4 ± 14

65,6 + 13

48,5 ± 10

75,4

±

16

2,53

M + C-52

72,8 + 15

95,8 ± 3

96,3 ± 4

85,5 ± 10

87,6 ± 8

45,3 ± 6

80,6

±

19

2,70

M + C-53

31,2 ± 15

46,7 ± 28

70,2 ± 23

76,9 + 22

45,6 ± 27

12,6 ± 25

47,2

±

24

1,58

M + C-54

77,0 ± 10

89,1 ± 11

100 ± 0

99,2 ± 0,8

69,6 ± 16

63,2 ± 19

83,0

±

15

2,78

M + C-55

89,3 ± 16

86,2 ± 12

94,4 ± 5

100 ± 0

81,7 ± 13

88,6

±

12

2,97

M + D-12

45,5 + 23

63,9 ± 15

84 + 16

100 + 0

78,5 + 15

56,1 ± 22

71,3

±

20

2,39

M + D-13

7,1 ± 8

32 ± 19

62,5 ± 23

31,8 ± 21

48,5 ± 22

50,9 + 14

38,8

+

20

1,30

M + D-14

69,2 + 14

93,4 ± 7

46,8 ± 15

71,3 ± 17

89,1 ± 9

60,3 ± 20

71,1

+

14

2,41

M + D-15

43,5 + 16

48,7 ± 18

72,6 + 19

60,1 + 23

59,2 + 18

43,5 ± 24

54,6

+

11

1,83

M + D-16

29,7 + 21

42,8 ± 18

40,1 ± 22

35,4 ± 18

33,3 ± 20

23,3 + 20

34,1

+

17

1,14

M + D-17

62,3 ± 15

92,9 + 7

100 ± 0

100 + 0

100 ± 0

92,5

+

15

3,10

11

674 203

Esperimento 2 Test della piastra calda

Il metodo è quello descritto da Eddy et al. [J. Pharmac. Exp. Ther. 107, 385 (1953)].

Si sono utilizzati ratti maschi del peso di circa 150 g non a digiuno in gruppi di cinque.

Gli animali vengono posti su una piastra metallica che è sul fondo di un cilindro trasparente, riscaldata a 55°C ± 1°C da una miscela azeotropica in ebollizione (acetone-etile formiato 1:1).

Si definisce come tempo di reazione l'intervallo che intercorre dal momento in cui l'animale viene appoggiato sulla piastra calda al momento in cui o si lecca le zampe o tenta di saltare fuori dal cilindro. Il tempo di reazione controllo è misurato 10 e 5 minuti prima della somministrazione dei farmaci e IO, 20, 5 30, 45, 60, 90 minuti dopo. Gli animali sono lasciati sulla piastra per un periodo massimo di 30 secondi.

La risposta alla somministrazione del prodotto è considerata positiva se si osserva almeno un raddoppio del tempo normale di reazione. I risultati così ottenuti sono descritti nelle tabelle io 2a e 2b in cui vengono riportati i gruppi trattati, le dosi somministrate ed i tempi di permanenza sulla piastra espressi come numero di positivi su numero di trattati.

TABELLA 2a

Attività potenziale l'attività di farmaci analgesici al test della piastra calda indotta da alcuni dei composti oggetto dell'invenzione

Trattamento

Dosaggio mg/kg i.p.

10'

20'

30'

45'

60'

90'

Tot. positivi X/30

Propossifene (Prop)

15

2/5

3/5

1/5

12

Pr. + Composto C-20

15 + 1 (C-20)

2/5

3/5

16

» + » »

15+3 »

3/5

5/5

4/5

5/5

4/5

25

» + » »

15 + 10 »

4/5

5/5

3/5

27

Ossifenilbutazone (Ossi)

50

2/5

1/5

2/5

0/5

7

Ossi + Composto D-2

50+3 (D-2)

2/5

1/5

2/5

3/5

1/5

12

» + » »

50 + 10 »

1/5

3/5

2/5

12

» + » »

50 + 30 »

3/5

4/5

23

Acido Acetil Salicilico (ASA)

100

1/5

2/5

0/5

1/5

8

Asa + Composto C-20

100 + 5 (C-20)

2/5

3/5

0/5

12

» + » »

100 + 20 »

1/5

3/5

4/5

3/5

17

» + » »

100 + 50 »

3/5

2/5

5/5

4/5

3/5

22

Dai risultati riportati in tabella si può notare che già a dosi 3 mg/kg i.p. il composto C-20 è in grado di raddoppiare l'attività analgesica del propossifene. Alla dose di 10 mg/kg i.p. si ha in pratica un effetto massimale.

TABELLA 2b

Trattamento

Dosaggio mg/kg i.p.

10'

20'

30'

45'

60'

90'

Tot. positivi X/30

Propossifene (Prop.)

10

1/5

2/5

1/5

0/5

8

Prop. + Composto C-30

10 + 0,3 (C-30)

2/5

1/5

3/5

2/5

0/5

11

» + » »

10 + 1 (C-30)

3/5

4/5

2/5

19

» + » , »

10 + 3 (C-30)

3/5

5/5

4/5

3/5

■ 25

Metadone (Met.)

1

1/5

2/5

1/5

2/5

1/5

8

Met. + Composto C-36

1 + 0.3 (C-36)

2/5

3/5

1/5

2

» + » »

1 + 1 (C-36)

3/5

5/5

4/5

3/5

1/5

19

» + » »

1 + 3 (C-36)

5/5

3/5

4/5

5/5

2/5

24

Ossifenilbutazone (Ossi)

50

2/5

1/5

2/5

0/5

7

Ossi + Composto C-30

50+3 (C-30)

1/5

3/5

2/5

11

» + » »

50 + 10 (C-30)

1/5

2/5

3/5

2/5

12

» + » »

50 + 30 (C-30)

2/5

3/5

4/5

3/5

20

Acido Acetil Salicilico (Asa)

Asa + Composto C-36

100

1/5

2/5

0/5

1/5

8

» + » »

100 + 10 (C-36)

1/5

2/5

3/5

2/5

1/5

10

» + » »

100 + 30 (C-36)

1/5

2/5

3/5

14

» + » »

100 + 100 (C-36)

3/5

4/5

2/5

20

674 203

12

Dai risultati riportati in tabella 2b si può notare che già a dosi di 1 mg/kg i.p. i composti ivi considerati sono capaci perlomeno di raddoppiare l'attività analgesica del propossifene e del metadone.

Per incrementare l'attività analgesica dei farmaci non narcotici sono necessarie dosi più elevate dei farmaci oggetto dell'invenzione e la significatività compare generalmente alle dosi maggiori.

Esperimento 3:

Influenza di alcuni dei composti oggetto dell'invenzione sulla attività analgesica degli oppioidi endogeni rilasciati sotto shock transcutaneo nel ratto e misurata al Tail Flick Test.

Il metodo è quello descritto da Lewis et al., J. Neurose., 1, 358 (1961). Si usano ratti maschi del peso di circa 200 g non a digiuno.

Gli animali vengono stressati applicando alla zampa anteriore una corrente di 60 Hz - 2,5 mA con impulsi della durata di 1 secondo ogni 5 secondi e questo per 20 minuti.

Questo regime di stress provoca un rilascio di oppioidi endogeni. Immediatamente dopo la stimolazione elettrica gli ani-io mali vengono sottoposti al Tail Flick ai tempi indicati in tabella.

I composti vengono somministrati i.v. immediatamente prima dello shock elettrico alle dosi indicate in tabella 3.

TABELLA 3

Latenza media (in sec) determinata al Tail Flick Test a tempi diversi (minuti) dallo shock elettrico

(valori medi di 5 animali gruppi ± ES)

Trattamento

Tempi

Dosi mg/kg i.v.

10'

15'

A: Controlli

+ 2,88 ± 0,11

3,04 ± 0,29

2,70 ± 0,27

B: Controlli stressati t verso A

5,16 ± 0,23 8,74 (***)

3,98 ± 0,203 2,64 (*)

3,10 ± 0,19 1,073

C:

Composto C-20 + stress t verso A t verso B

7,5 ± 0,3 11,18 (***) 6,03 (***)

5,34 ± 0,46 4,21 (**) 2,67

3,88 ± 0,29 2,79 (*)

2,20

D: Composto C-20 + stress t verso A t verso B

8,48 ± 0,62 8,81 (***) 4,97 (**)

6,52 ± 0,21 9,23 (***) 8,77 (***)

4,98 ± 0,36 4,92 (**) 4,0 (**)

Composto D-2 + stress t verso A t verso B

9,2 ± 0,53 10,50 (***) 6,94 (***)

7,0 ± 0,86 4,42 (**) 3,49 (**)

5,28 ± 0,64 3,59 (**) 3,22 (*)

Composto D-2 + stress t verso A t verso B

9,6 ± 0,46 12,42 (***) 8,47 (**)

7,24 ± 0,58 6,38 (***) 5,29 (**)

5,08 ± 0,52 3,97 (**) 3,57 (**)

G: Composto C-30 + stress t verso A t verso B

7,26 ± 0,52 8,11 (***) 3,64 (**)

6,10 ± 0,49 5,34 (**) 3,97 (**)

4,68 ± 0,5 3,10 (**) 2,67 (*)

H: Composto C-30 : + stress t verso A t verso B

9,46 ± 0,64 10,06 (***) 6,28 (***)

7,96 ± 0,61 7,22 (***) 6,14 (***)

6,82 ± 0,78 4,95 (**) 4,65 (**)

I: Composto C-34 + stress t verso A ' t verso B

5,40 ± 0,35 7,05 (***) 0,76

4,9 ± 0,25 4,80 (**) 2,82 (*)

3,4 ± 0,16

2,24

1,44

13

674 203

TABELLA 3 (continuazione)

Composto C-34 + stress t verso A t verso B

6,56 ± 0,33 7,11 (***) 3,45 (**)

5,58 ± 0,31 5,92 (***) 4,26 (**)

3,98 ± 0,32 2,92 (*) 2,36 (*)

M: Composto C-36 + stress t verso A t verso B

6,9 ± 0,74 5,34 (***) 3,31 (**)

6,5 ± 0,42 6,72 (***) 5,36 (***)

4,66 ± 0,55 2,92 (*) 2,48 (*)

N: Composto C-36 + stress t verso A t verso B

9,22 ± 0,67 7,70 (***) 5,66 (***)

8,1 ± 0,43 9,84 (***) 8,74 (***)

9,28 ± 0,64 9,30 (***) 9,18 (***)

O: Composto C-39 + stress t verso A t verso B

6,3 ± 0,4 8,21 (***) 2,46 (*)

5,8 ± 0,38 5,72 (***) 4,18 (**)

4,04 ± 0,36 2,85 (*)

2,30

P: Composto C-39 + stress t verso A t verso B

7,54 ± 0,65 5,05 (***) 4,43 (**)

5,98 ± 0,41 5,55 (***) 4,43 (**)

5,08 ± 0,6 3,51 (**) 3,12 (*)

Q: Composto D-l 7 + stress t verso A t verso B

6,18 ± 0,65 4,97 (**) 1,47

7,02 ± 0,76 4,90 (**) 3,89 (**)

5,31 ± 0,55 4,16 (**) 3,79 (**)

R: Composto D-17 + stress t verso A t verso B

9,08 ± 0,55 10,96 (***) 6,52 (***)

9,08 ± 0,80 7,02 (***) 6,14 (***)

6,08 ± 0,98 3,28 (*) 2,99 (*)

Nota: (*) P <0,05 (**) P < 0,01 (***) P < 0,001

Dai dati riportati in tabella si vede che già a 1 mg/kg i composti oggetto dell'invenzione sono capaci di aumentare generalmente in modo altamente significativo l'attività analgesica indotta dalle encefaline endogene; tale aumento risulta dose dipendente, aumentando infatti in dipendenza della dose sia in intensità sia in durata.

Esperimento 4:

Potenziamento delle attività analgesiche delle encefaline indotte da alcuni dei composti oggetto dell'invenzione.

Per verificare uno dei possibili meccanismi d'azione dei composti oggetto dell'invenzione cioè la loro eventuale attività inibente la degradazione enzimatica delle encefaline endogene si è effettuato l'esperimento seguente: a ratti maschi del peso di 150-200 g (furono impiegati gruppi di 5 animali) fu impiantata una cannula nel ventricolo laterale destro onde poter somministrare farmaci intracerebroventricolarmente (i.c.v.) secondo il metodo di Noble et al. (Life Sci. 6, (1970) 281-291).

Gli animali furono successivamente trattati (i.c.v.) con 3 mcg di D-ala-methionine enkephalinamide (DALA) immediatamente dopo un'iniezione (i.c.v.) dei composti in studio alle dosi riportate in tabella 4. L'analgesia fu testata con il metodo del Tail Flick Test già precedentemente citato ed ai tempi indicati 60 in tabella.

Dai dati riportati si può notare l'azione potenziante l'effetto analgesico della enkephalinamide (DALA) indotta dai composti sperimentati sia come intensità che come durata d'azione.

65 Tale attività che è altamente significativa già alla dose di 0,01 mcg/kg è probabilmente correlata ad un'attività inibitrice di un enzima (o enzimi) responsabili del metabolismo delle enkefaline.

674 203 14

TABELLA 4

Aumento dell'attività analgesica del DALA indotta da alcuni composti oggetto dell'invenzione determinata al Tail Flick Test nel ratto

Gruppo

Trattamento

Tempi

Dosi mcg/kg (ICV^X.

10'

20'

30'

45'

60'

90'

Media f di student

A

Controlli

—

-3,3 ± 4,6

0,3 ± 5,2

0,9 ± 4,5

-4,3 ± 5,0

-3,0 ± 5,5

-1,1 ± 5,0

-2,0 ± 2,1

—

B

DALA(D)

10

21,9 ± 20,0

25,9 ± 19,2

26,2 ± 18,8

26,0 ± 19,2

7,3 ± 7,1

5,0 ± 5,7

18,7 ± 9,9

Verso A: 5,07 (***)

C

DALA + Composto C-20

10 (D) + 0,003

5,7 ± 4,4

44,6 ± 15,6

32,3 ± 14

30,1 ± 9,3

24,5 ± 7,7

7,2 ± 3,6

24,1 ± 13,8

Verso A: 4,20 Verso B: 0,72

D

DALA + Composto C-20

10 (D) + 0,01

16,5 ± 4,7

62,5 ± 18,7

64.1 ±

22.2

45,4 ± 18,4

45,3 ± 20,8

16,3 ± 5,8

41,7 ± 21,2

Verso A: 5,0 (***) Verso B: 2,41 (*)

E

DALA + Composto D-2

10 (D) + 0,003

34,9 ± 24,1

54,0 ± 26,7

45.5 ±

21.6

27,5 ± 15,4

23,5 ± 9,2

14,9 ± 8,1

33.4 ±

14.5

Verso A: 5,95 (***) Verso B: 2,05

F

DALA + Composto D-2

10 (D) + 0,01

38.2 ±

18.3

53.7 +

19.8

52,6 ± 16,0

38,5 ± 16,4

33,7 ± 16,9

26,3 ± 13,0

40,5 ± 9,8

Verso A: 9,59 (***) Verso B: 3,66 (**)

A

Controlli

—

0,68 ± 5,45

5,64 ± 4,83

1,43 ± 4,42

4,86 ± 3,90

4,21 ± 4,41

4,91 ± 2,25

3,62 ± 2,05

—

B

DALA (D)

10

4,1 ± 8,89

6,24 ± 4,0

9,19 ± 2,92

8,29 ± 1,69

6,20 ± 2,60

10,56 ± 3,87

7,51 ± 2,31

Verso A: 3,09 (*)

G

DALA + Composto C-30

10 (D) + 0,01

58 ± 15,3

60,8 ± 14,2

77,0 ± 16,7

66,4 ± 12,4

48,8 ± 16,2

45.0 ±

11.1

59,33 ± 11,7

Verso A: 11,5 (***) Verso B: 10,8 (***)

H

DALA + Composto C-30

10 (D) + 0,03

59.1 ±

15.2

67,8 ± 16,0

86,0 + 9,5

83,3 ± 8,4

88,3 ± 6,41

55.1 ±

16.2

73,26 ± 14,5

Verso A: 11,6 (***) Verso B: 11,0(***)

I

DALA + Composto C-36

10 (D) + 0,01

41,1 ± 14,7

55,6 ± 15,0

38,5 ± 19,61

35,88 ± 14,31

32,03 ± 15,89

25,44 ± 16,59

38,19 ± 10,1

Verso A: 8,2 (***) Verso B: 7,25 (***)

L

DALA + Composto C-36

10 (D) + 0,03

55,82 ± 18,89

70,58 ± 18,43

53,13 ± 17,63

35,17 ± 15,95

38,00 ± 13,60

20,62 ± 9,35

45,55 ± 17,7

Verso A: 5,75 (*«) Verso B:

5,2 (***)

Nota: (*) P < 0,05

(**) P < 0,01

(***) P < 0,001

674 203

Esperimento 5:

Antagonismo di alcuni prodotti oggetto dell'invenzione allò sviluppo della tolleranza indotta nel ratto per somministrazione . ripetuta di morfina HCl.

Alcuni dei composti oggetto dell'invenzione sono stati esaminati per ricercare una loro eventuale capacità di antagoiiizza-re Io sviluppo della tolleranza indotto da morfina. Si sono utilizzati gruppi di 6 ratti maschi del peso di circa 200-250 g.

Ad intervalli di 24 ore dal primo trattamento (tempo 0) ogni animale (eccetto il gruppo controllo trattato con fisiologica), riceveva 5 mg/kg di morfina cloridrato i.p. assieme a 10 mg/kg i.p. dei composti indicati (e questo ad eccezione del gruppo trattato con la sola morfina).

La determinazióne della soglia dello stimolo doloroso veniva effettuata a 15', 30', 45' e 60' dal trattamento con il test 5 del «Tail Flick».

I dati riportati in tabella 5 si riferiscono ai valori medi di queste quattro determinazioni, ed indicano le percentuali di variazione sul tempo di latenza (comparsa del dolore) prima e dopo il trattamento con i farmaci.

io In tabella vengono anche riportati i valori di t di Student determinati ai vari tempi dei gruppi trattati con i farmaci in confronto con il gruppo di controllo ed il gruppo trattato con morfina.

TABELLA 5

Antagonismo di alcuni prodotti oggetto dell'invenzione allo sviluppo della tolleranza indotta nel ratto per somministrazione ripetuta di morfina HCl

Trattamento Dose Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo mg/kg ip 0 24h 48h 72h 96h 120h 144h 168h

A: Controlli - -0,73 ± 0,86 ± 5,43 ± 1,09 ± 3,97 ± 1,47 ± 1,08 ± -0,77 ±

4,10 1,04 ■ 1,18 1,90 1,00 1,58 3,12 1,08

Effetto % = -0,0040 • h + 1,89

(r = 0,11; t = 0,27 NS)

B: Morfina

5 mg/kg + (M)

58,03 ± 42,09 ± 26,54 ± 19,96 ± 10,79 ± 4,45 11,20 19,20 15,90 7,03 7,05 0,69

Effetto % = -0,327 • h + 48,42

3,58 ± 2,12 ± 3,31 3,47

(r = 0,95; t = 7,22 ***)

C: Composto D-8

10 mg/kg + (M)

47,32 43,65 32,80 31,78 35,45 42,08 29,33 19,17

Effetto % = -0,118 • h + 45,08

(r = 0,76; t = 2,89*)

D: Composto C-20

10 mg/kg + (M)

72,15 53,36 48,17 53,67 31,56 41,67 14,48 13,75

Effetto % = -0,320 • h + 67,97

(r = 0,93; t = 6,12 ***)

E: Composto 10 mg/kg 74,14 45,73 59,50 51,52 43,40 37,60 21,43 29,75

D-2 + (M)

Effetto % = -0,251 • h + 66,47 (r = 0,891 = 4,65 **)

Trattamento Dose Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo mg/kg ip 0 + 24h + 48h + 72h + 96h + 120h + 144h + 168h

A: Controlli — -0,73 ± 0,86 ± 5,43 ± 1,09 ± 3,97 ± 1,47 ± 1,08 ± -0,77 ±

4,1 1,04 1,18 1,90 1,0 1,58 3,12 1,08

B: Morfina 5 mg/kg 58,03 ± 42,09 ± 26,54 ± 19,96 ± 10,79 ± 4,45 ± 3,58 ± 2,12 ±

+ (M) 11,2 19,2 15,9 7,03 7,05 0,69 3,31 3,47

t di student verso A - 9,86*** 4,29** 2,64* 5,18** 1,91 3,45 * 1,1 1,58

mm

TABELLA 5 (continuazione)

Trattamento - Dose Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo Tempo mg/kg ip 0 + 24h + 48h + 72h + 96h + 120h + 144h + 168h

F: composto C-30

+ Morfina t di student verso A

t di student verso B

10 mg/kg + (M)

74,51 ± 66,53 ± 50,61 ± 47,53 ± 29,65 ± 34,24 ± 26,97 ± 21,81 ±

9,7

15,1

15,5 15,7

12,1 9,11

10,04 24,0

14,32*** 8,67 *** 5,82** 5,86** 4,23 ** 5,18** 4,92** 9,43 *** 2,23 2,00 2,16 3,2 * 2,69 * 4,79** 4,42** 8,96***

G: Composto C-36

+ Morfina t di student verso A

t di student verso B

10 mg/kg + (M)

44,52 ± 67,27 ± 67,31 ± 56,04 ± 49,48 ± 34,34 ± 27,50 ± 17,47 ± 17,2

5,11

9,6

14,0

8,55

2,26

10,34 6,13

8,07

13,78*** 8,83 *** 12,54*** 36,76*** 6,18 *** 7,91 *** 4,47**

1,31 2,35 3,84 ** 6,51 *** 10,45 *** 5,76 ** 6,86 *** 3,49 **

Note: (*): (P < 0,05) (**): (P < 0,01) (***): (P < 0,001)

Rette di regressione calcolate:

Gruppo

B:

Attività

-0,327

X

ore

+

48,41

(coeffic. di correlazione =

0,95)

Gruppo

C:

Ai ! iviià —

-0,118

X

ore

+

45,08

(coeffic. di correlazione =

0,76)

Gruppo

D:

Attività =

-0,320

X

ore

+

67,97

(coeffic. di correlazione =

0,93)

Gruppo

E:

Attività =

-0,251

X

ore

+

66,47

(coeffic. di correlazione

0,89)

Gruppo

F:

Attività =

-0,314

X

ore

+

70,38

(r = 0,96)

Grappo

G:

Attività =

-0,245

X

ore

+

66,06

(r = 0,79).

Dai dati riportati in tabella 5 e dalle rette di regressione calcolate, si può vedere come a partire dal 111° trattamento fino alla fine della durata dell'esperimento i gruppi C-G siano più attivi del gruppo B trattato con sola morfina.

Inoltre già dopo il V trattamento il gruppo morfina non è significativamente diverso dal gruppo controllo, mentre i gruppi C-G mantengono significativamente l'attività rispetto ai controlli fino all'ultimo trattamento delle 168 ore.

Dal calcolo delle rette di regressione si può inoltre vedere che mentre l'attività del gruppo morfina va a 0 al 6 giorno di trattamento, con i gruppi C-G si raggiunge il livello di inattività tra i 9 ed i 16 giorni.

Verrà ora illustrata l'attività anti CCK, l'attività antispastica, l'attività antisecretiva e quella coleretica dei composti oggetto dell'invenzione.

Attività anti CCK su cistifellea di cavia «in vitro»

Una striscia longitudinale di cistifellea di cavia viene posta in un bagno per organi isolati in presenza di Krebs alla temperatura di 32°C ed ossigenando continuamente con una miscela ossigeno-CC>2 (95-5 V/V).

Le contrazioni isometriche sono state rilevate per mezzo di un trasduttore di forza e registrate.

La cistifellea viene contratta utilizzando una concentrazione di CCK-8 di 10 ng/ml; si determina l'attività antagonista dei composti oggetto dell'invenzione verso l'effetto contratturante della CCK, impiegando differenti concentrazioni e determinando così il valore di ED50, cioè la concentrazione in mcg/ml di composto capace di antagonizzare del 50% l'effetto contratturante della CCK stessa.

I risultati così ottenuti sono esposti nella tabella seguente dove sono riportati i composti saggiati e le ED50 ricavate che sono state calcolate con il metodo della regressione su un test di almeno 3 esperienze per ogni composto studiato.

TABELLA 6

Attività anti CCK-8 (concentrazione impiegata 10 ng/ml) su cistifellea di cavia in vitro dei composti oggetto dell'invenzione espressa come ED50 in mcg/ml

Attività Attività

Composti ED50 Composti ED50

(mcg/ml) (mcg/ml)

55

Composto C-l >200

» C-2 >200

» C-3 34,4

» C-4 1,1

60 » C-5 4,2

» C-6 0,33

» C-l 0,06

» C-8 0,93

» C-9 7,40

65 » C-10 43,7

» C-ll 0,85

» C-12 64,7

Composto C-20

>200

» C-21

>200

» C-22

>200

» C-23

>200

» C-24

>200

» C-25

30,3

» C-26

146,5

» C-21

10,2

» D-l

>200

» D-2

>200

» D-3

>200

» D-4

>200

TABELLA 6 (continuazione)

Attività

Composti

ED50

Composti

ED50

(mcg/ml)

Composto C-l3

>200

Composto D-5

>200

» C-14

118,4

» D-6

>200

» C-15

>200

» D-7

>200

» C-16

>200

» D-8

>200

» C-17

>200

» D-9

>200

» C-l 8

60,3

» D-10

>200

» C-19

>200

» D-ll

>200

» C-28

>300

» C-36

13,4

» C-29

262

» C-42

50,1

» C-30

33,5

» C-47

35,1

» C-31

22,9

» C-48

119,1

» C-32

>300

» D-12

>300

» C-3 3

131,7

» D-15

245,0

» C-34

40,1

» D-17

>300

» C-35

367,1

» C-54

1,2

» C-55

0,5.

674 203

Dai dati riportati in tabella si vede come i composti rivendicati antagonizzano del 50% l'attività della CCK-8 ad una concentrazione che per i composti più attivi (come ad esempio il composto C-7) è solamente di circa 10 volte superiore a quella dell'antagonista specifico, dimostrando quindi una straordinaria specificità d'azione.

Per confermare quanto evidenziato negli studi «in vitro» alcuni dei composti più interessanti sono stati saggiati «in vivo» impiegando la cistifellea di cavia «in situ».

La metodica impiegata è stata quella descritta da Ljungberg (Svensk. Farm. Tidskr. 68, 351-354, 1964).

Sono state usate cavie del peso di circa 400 g anestetizzate con uretano; le somministrazioni delle sostanze in esame venivano fatte per i.v. nella vena giugulare.

Le risposte della cistifellea alle sostanze in esame erano rilevate per mezzo di un trasduttore di forza e registrate tramite un microdinamometro. Come dose ottimale di contratturante è stata scelta quella di 10 ng/kg di CCK-8.1 composti antagonisti saggiati venivano somministrati a dosi crescenti in modo da poter calcolare una ED50, cioè la dose (in mg/kg i.v.) capace di inbire del 50% l'effetto contratturante di 10 ng/kg i.v. di CCK-8.

I risultati così ottenuti sono illustrati nella seguente tabella 7 dove sono riportati le dosi impiegate e gli effetti ottenuti espressi come inibizione percentuale dell'effetto contratturante della CCK-8 nonché le ED50 ricavate.

TABELLA 7

Attività anti CCK-8 (concentrazione impiegata 10 ng/kg) su cistifellea di cavia «in situ» di alcuni dei composti oggetto dell'invenzione, espressa come ED50 in mg/kg i.v.

Composti Dosi Esperimento Esperimento Esperimento ED50 (ng/kg iv)

(mg/kg iv) 1 2 3 r: (coeff. di correlaz.)

C-4

0,03 0,10 0,30 1,00

36,7 44,6 92,1

-49,3 -68,4 -88,5

-11,8 -40,0 -51,7

0,30 (r: 0,90)

t = 5,46 ***

C-6

© ©

—

-12,9

0,03

—

-49,7

-40,0

0,10

- 72,6

-55,8

-62,9

0,30

- 97,0

-82,8

—

1,00

-100,0

—

0,05 (r: 0,96)

t = 9.07 ***

C-7

0,003 0,01 0,03 0,10

-36,8 -62,1 -77,5

-28,2 -57,0 -89,8

-10,6 -25,9 -59,2 -94,7

0,02 (r: 0,98)

t = 13,9 ***

(***) P < 0,001.

674 203

18

TABELLA 7 (continuazione)

(MiWÉ

DôM Espénriiéiiló Esperimento Esperimento Esperimento ED5Û

(mg/kg i.v.) 1 2 3 4 (mg/kg i.v.)

Composto C-30

3

10 30

16,7 14,6 82,1

0

20,8 92,5

6,0 31,1 79,5

13,8

coefficiente di correlaz. (r): 0,91

Composto C-31 3 16,7 0 22,8 — 16,3

10 14'6 0 31'7 " (r): 0,80

30 82,1 92,5 58,7 —

Composto C-36 1 4,3 15,7 32,7 — 5,1

3 30,0 12,1 40,0 20,3

10 64,8 71,6 63,3 78,7 (r): 0,91

30 — — — 100

I risultati ottenuti confermano sostanzialmente quanto già visto negli esperimenti in vitro e cioè che alcuni dei composti oggetto dell'invenzione sono dei potenti CCK antagonisti, capaci di bloccare anche a dosi inferiori a 0,1 mg/kg. nel caso dei composti C-6 e C-7, contrazioni della cistifellea indotte dalla CCK-8 anche a concentrazioni sicuramente superiori a quelle fisiologiche.

Notevole è anche l'attività antispastica, che i presenti composti esercitano su tutto l'apparato digerente. Misurata nel topo, col test del carbone vegetale (velocità di transito nello stomaco e nell'intestino), tale attività viene illustrata nella seguente tabella:

TABELLA 8

Esempi di attività antispastica per i composti rivendicati somministrati per via intraperitoneale nel topo.

Valori espressi con ED50 in mg/kg cioè la dose che riduce del 50% il transito intestinale del carbone

Un'attività antispastica maggiormente specifica, cioè maggiormente aderente ad una situazione fisiologica è quella illustrata nel seguente esperimento.

30 Ad un coniglio anestetizzato viene inciso l'addome ed evidenziato il colon trasverso. Nel punto stabilito viene inserito un palloncino pieno d'acqua collegato ad un trasduttore di pressione mediante una cannula di polietilene riempita di H2O.

Fissata la sensibilità ottimale in relazione alle condizioni fi-35 siologiche, si somministrano i prodotti attraverso la vena femorale. Le contrazioni vengono indotte dalla somministrazione di 100 ng/kg di CCK.

L'attività dei prodotti oggetto dell'invenzione è illustrata in tabella 9.

Composto Attività antispastica:

ED50 mg/kg (.p.)

50

Composto C-28

91,8

Composto C-30

77,7

Composto C-34

65,5

Composto C-35

180,9

Composto C-36

208

Composto C-37

160,1

Composto C-41

182,4

Composto C-46

66,9

Composto C-4

38,8

Composto C-6

29,5

Composto C-7

16,8

Composto C-20

77,5

Composto C-27

40,3

Composto D-2

50,7

Composto D-5

74,9

19

TABELLA 9

Attività antispastica nel colon di coniglio stimolato con CCK-8

674 203

Composti Dosi Esperimento Esperimento Esperimento ED50 (mg/kg i.v.)

(mg/kg i.v.) 1 2 3 r: (coeff. di correlaz.)

0,1 0 — —

0,3 - 24,1 - 14,9 - 8,5

C-6 1 - 57,9 - 45,0 -41,8

3 - 91,7 - 77,5 -81,6

ED50 = 1,53 r = 0,943 t = 8,05 (***)

0,1

0

—

-10,7

0,3

- 19,1

- 36,8

-21,8

ED50

1

- 42,6

- 74,2

-64,5

r =

3

-100,0

—

t =

(***)P < 0,01.

I dati riportati indicano che alcuni dei composti sperimentali ed oggetto della presente invenzione antagonizzano, così come già evidenziato per la cistifellea, anche a livello intestinale le contrazioni indotte dalla CCK che è stata somministrata a dosi elevate (100 ng/kg).

L'attività antispastica si manifesta a dosi molto basse comprese tra 1-3 mg/kg per i migliori dei composti impiegati.

Un'altra caratteristica interessante di questi composti è che essi incrementano notevolmente il flusso biliare.

Si procede con il seguente esperimento; a ratti anestetizzati con uretano viene incannulato il dotto biliare comune con un piccolo ago collegato ad un tubo di politene e viene così raccolto il liquido biliare. La raccolta viene effettuata per un'ora prima della somministrazione intravenosa dei composti testati e prosegue per altre 2 ore successivamente alla somministrazione, pesando i campioni raccolti ad intervalli di 30 minuti.

Onde prevedere una possibile disidratazione degli animali, si somministra ad intervalli di 30 minuti 0,5 mi di soluzione fisiologica per un totale di 3 mi.

I risultati così ottenuti per alcuni dei composti oggetto dell'invenzione sono riportati nella tabella seguente e sono espressi come ED50, cioè la quantità di sostanza in mg/kg i.v. capace di produrre un incremento del 50% del flusso biliare dopo il trattamento con i farmaci (valore medio determinato sull'intervallo delle 2 ore) rispetto al valore dei controlli (valore medio determinato durante 1 ora di raccolta prima del trattamento con i farmaci).

Dai dati esposti si può desumere che i composti in oggetto possiedono una potente attività coleretica; mediamente la ED50 per i composti saggiati è di 5-25 mg/kg i.v. e vi è una rimarchevole corrispondenza nella relazione dose-risposta farmacologica (i coefficienti di correlazione sono infatti in tutti i casi maggiori di 0,90).

TABELLA 10

Variazione percentuale del flusso biliare nel ratto indotta da alcuni composti oggetto dell'invenzione a

Composti

Dosi (mg/kg i.V.)

Effetto (aumento % rispetto ai controlli)

ED50 (mg/kg i.v.) r = (coeff. di correlazione)

40 Composto C-6

3

10 30

+ 40,4 + 69,8 + 88,7

4,2 (r = 0,93)

45 Composto C-20

12,5 25,5 50,0

+ 48,5 + 63,9 + 108,0

19,4 (r = 0,98)

5o Composto D-ll

12,5 25,0 50,0

+ 33,7 + 80,0 + 118,8

18,5 (r = 0,98)

Composto C-30

55

12,5 25 50 100

+ 33,7 + 60,2 + 121,2 +197,8

18,5 (r = 0,99)

Composto C-35

60

12,5 25,0 50,0 100

+ 9,6 + 51,9 + 91,9 +159,7

29,5 (r = 0,98)

65 Composto C-36

12,5 25,0 100,0

+ 15,5 + 48,5 +215,8

26,75 (r = 0,99)

674 203

20

Onde verificare l'ipotesi che l'attività anti CCK manifestata dalla maggior parte dei composti in oggetto possa essere vantaggiosamente utilizzata nel trattamento della anoressia nell'uomo o come stimolante l'appetito degli animali d'allevamento si è proceduto con l'esperimento seguente:

Si sono utilizzati ratti maschi del peso iniziale di circa 160 grammi suddivisi in gruppi di 10 animali. Ogni gruppo riceveva giornalmente per os per 3 settimane il farmaco alle dosi indicate.

Il farmaco era sciolto in H2O come sale sodico ed era somministrato in un volume di 10 mi di HìO/kg mentre il gruppo controllo riceveva un pari volume di solo solvente.

Nelle tabelle seguenti vengono riportati i valori medi del consumo di cibo ed il peso medio di ogni gruppo di animali calcolati settimanalmente nonché il t di student calcolato tra i vari gruppi trattati ed il gruppo di animali controllo.

Dai dati riportati nelle tabelle 11 e 12 si può notare come 5 dosi giornaliere di 0,3 mg/kg del composto C-7 inducano un aumento di circa il 15% del consumo di cibo rispetto ai controlli; tale aumento è di circa il 30% per le altre dosi saggiate ed è a tutti i tempi altamente significativo.

L'aumento di peso degli animali trattati rispetto all'aumen-10 to di peso degli animali controllo ha un andamento analogo; tutti i gruppi trattati con il composto C-7 danno un incremento ponderale significativamente superiore a quello degli animali controllo a tutti i tempi studiati.

TABELLA 11

Determinazione del peso corporeo (in g) dei vari gruppi misurato a tempi diversi

Gruppi

Dose (mg/kg os)

Tempo 0 la settimana

2a settimana

3a settimana

A: Controllo

—

166,1 ± 4,5 197,4 ± 3,8

238,6 ± 4,09

280,0 ± 3,94

B: Composto C-7 t di student vsA

0,3

162,1 ± 2,48 201,3 ± 2,7 0,78 0,83

254,5 ± 2,66 3,26 **

315,2 ± 2,72 7,33 ***

C: Composto C-7 t di student vsA

1

166,0 ± 1,56 214,7 ± 1,93 0,021 4,06 **

267,5 ± 2,6 5,96 ***

319,8 ± 2,49 8,53 ***

D: Composto C-7 t di student vsA

3

166,6 ± 1,73 227,9 ± 1,65 0,1 7,11 ***

290,9 ± 2,6 11,3 ***

349,5 ± 2,82 14,32 ***

TABELLA 11 (continuazione)

Gruppi

Dose (mg/kg os)

tempo 0 la settimana 2a settimana

3a settimana

4a settimana

Controllo

—

254,2 ± 7,71 278,9 ± 7,02 308,8 ± 4,7

352,6 ± 2,09

383,1 ± 2

Composto C-30 t di studen t vsA

3

270,8 ± 8,3 310,2 ± 7,01 380,5 ± 6,5 t = 1,464 t = 3,14** t = 8,992***

409,7 ± 2,99 t = 15,66 ***

437,3 ± 55 t = 9,24 ***

Composto C-30 t di student vsA

10

271,4 ± 9,3 332,9 ± 5,7 382,2 ± 6,5 t = 1,427 t = 5,981*** f = 9,19"***

439,1 ± 4,3 t = 18,234 ***

470,5 ± 6,5 t = 12,798 ***

Composto C-30 t di student vsA.

30

267,9 ± 7,7 315,7 ± 7,4 371,9 ± 7,9 t = 1,252 t = 3,606 ** t = 6,82 ***

437,1 ± 5,2 t = 15,108 ***

488,1 ± 6,4 t = 15,668 ***

Nota: ** (P < 0,01) .*** (p < 0,001)

21 674 203

TABELLA 12

; j .=■■-, <Ggn$umQ.çljçibio^ing/sçttimana) nei vari gruppi trattati determinato a tempi diversi

Gruppi

:• . , Pose ... (mg/kg 0;

v la settimana s) ...

2a settimana

3a settimana

A: Controllo r — •

166,1 + 1,87

197,6 ± 1,96

208,7 ± 2,16

B: Composto C-7 t di studentvsA

0,3

176,4 ± 3,70 2,5 *

216,8 ± 4,71 3,75 **

239,3 ± 4,07 6,72 ***

G Compostoci t di student vsA

•••: . 1 .

: 199,6 + 3,88 7,78 ***

230,5 ± 3,09 8,99 ***

261,4 ± 4,24 11,2 ***

D: Composto C-7 t dì student vsA

3

198,4 ± 3,66 7,87 ***

244,8 ± 3,09 12,87 ***

268,8 ± 4,86 12,68 ***

Nota:" * (P < 0,05) • ** (P < 0,01) . *** (P < 0,001)'

TABELLA 12 (continuazione)

Gruppi

Dose (mg/kg os)

la settimana 2a settimana

3a settimana

4a settimana

Controllo (A) — 174,3 ± 5,07 209,6 ± 5,01 175,4 ± 4,34 180,3 + 3,78

Composto C-30 ' 3 193,7 ± 3,58 233,2 + 4,56 187,1 ± 8,40 204,0 + 3,62

t di student vs A ; t= 3,128 ** t = 3,482** t=l,237N.S. t = 4,527 ***

Composto C-30 ; ?; - io' • 219,8 ± 5,62 264,3 ± 5,61 234,5 ± 5,05 234,6 ± 3,99

t di student vsA ' " t = 6,012*** t = 7,273 *** t = 8,875 *** t = 9,884 ***

Compostò C-30- • ' 30 233,7 ± 5,45 267,9 ± 4,92 247,0 ± 5,19 244,5 + 4,06

t di student vsA ' • • 1 • • t = 7,982 *** t = 8,307 *** t = 10,582 *** ■ t = 11,655 ***

Nota: ** (P < 0,01)

*** (P < 0,001)

N.S. (non significativo)

I risultati così ottenuti sono riportati in tabella 13 dove ven-

Azione inibitrice sulla velocità di crescita sacca guanciale furono prelevati e pesati. Il DNA venne estratto di un adenocarcinoma pancreatico indotto da CCK-8 e misurato secondo le tecniche convenzionali.

Si è voluto studiare l'effetto del più potente dei composti oggetto della presente invenzione, quale anticolecistochininico, medi ±*E S "

cioè il composto C-7, sull'attività trofica della CCK sulle cellule 55

pancreatiche normali e su quelle di un adenocarcinoma pancre- ■ I dati riportati in tabella dimostrano come l'ormone coleci-

atico. stochinina (di cui la CCK-8 è la componente biologicamente at-

A criceti maschi fu inoculato nella sacca guanciale una so- tiva), che ha un'azione trofica sulle cellule pancreatiche normali spensione di 1 x IO5 cellule tumorali di un adenocarcinoma stimola anche la crescita di un adenocarcinoma pancreatico. Il pancreatico. Dopo 5 giorni dall'inoculazione gli animali furono 60 composto C-7 potente antagonista specifico della CCK antago-

divisi a random in 4 gruppi di 10 animali ciascuno e cioè un nizza in modo altamente significativo entrambe queste azioni gruppo controllo, un gruppo di animali trattati con CCK-8 10 della CCK-8.

mcg/kg 3 volte al giorno, un gruppo di animali trattati con il I dati sperimentali sopra esposti ci sembrano predittivi nel composto C-7 5 mg/kg i.p. 3 volte al giorno, ed un quarto ritenere che l'impiego del composto C-7 o di altri composti an-

gruppo trattato contemporaneamente con il composto C-7 e 65 ticolecistochininici oggetto dell'invenzione possa risultare parti-

CCK-8 secondo le modalità sopra indicate. colarmente favorevole nel trattamento delle neoplasie sostenute

Dopo 15 giorni di tale trattamento gli animali furono sacri- da polipeptidi bioattivi endogeni (in particolare la CCK) come ficati, il pancreas normale ed i tumori pancreatici innestati nella le neoplasie pancreatiche e quelle gastrointestinali.

674 203

22

TABELLA 13

Azione inibitrice del composto C-7 sulla velocità di crescita indotta dalla CCK-8 su cellule pancreatiche normali e tumorali

Trattamento N° Dose animali

Peso del pancreas

(mg)

t di student

DNA pancreatico

(mg)

tdi student

Peso del carcinoma pancreatico (mg)

tdi student

DNA tumorale (mg)

tdi student

A:

Controllo B:

CCK-8 C:

Composto C-7 D:

Composto C-7 + CCK-8

10 -

380 ±29,7 - 0,8 ±0,10

113 ± 7,66

0,4 ± 0,05

8 O 10 mcg/kg (3 al di) 600 ± 54,1 3,76 (**) 1,5 ±0,11 4,72 («*) 180 ± 15,2 4,17 (***) 0,7 ± 0,13 2,79 (*) 10 5 mg/kg (3 al di) 336 ± 22,6 1,18 0,93 ± 0,09 1,03 104 ± 7,5 0,86 0,42 ± 0,02 0,34

10 10 mcg/kg CCK-8 + 5 mg/kg C-7

374 ±25,4 vsA: 0,15 1,0 ± 0,08 vsA: 1,53 109,5 ± 6,2 vsA:0,37 0,4 ± 0,02 vsA:0

vsB:

4,05 (***)

vsB: 3,61 (**)

vsB:

4,64 ("*)

vsB: 2,51 (♦)

(°): 2 animali sono morti nel corso del trattamento (*): P < 0,05 (**): P < 0,01

(***): P < 0,001

I dati sperimentali esposti ci sembrano inoltre ampiamente predittivi per considerare l'impiego dei farmaci oggetto dell'invenzione associato alla morfina o ad altri farmaci analgesici (narcotici e non) una notevole innovazione terapeutica, capace di mettere a disposizione del medico dei composti di preminente interesse per il trattamento del dolore di qualsiasi eziologia. Tale trattamento sembra essere particolarmente indicato nel caso di somministrazioni prolungate degli oppioidi dove è maggiormente richiesto che il medicamento non provochi assuefazione od almeno la mantenga entro limiti accettabili. Inoltre di enorme interesse terapeutico e sociale sembra essere il loro possibile utilizzo nella disintossicazione di soggetti resi tossicodipendenti dall'uso prolungato di farmaci oppioidi.

35 È stato inoltre dimostrato con i dati sperimentali sopra riportati l'utilità dell'impiego di questi composti nella terapia di diverse situazioni patologiche che interessano il settore gastrointestinale, ad esempio nelle sindromi spastiche e dolorose in generale ed in particolare nel trattamento delle discinesie biliari e 40 del colon irritabile.

Si può inoltre preconizzare, vista la potente attività anti CCK esibita da molti dei composti in oggetto, un favorevole impiego terapeutico nel trattamento dell'anoressia oppure in alcune situazioni patologiche del SNC legate a scompensi dei li-45 velli fisiologici neuronali della CCK o di altri peptidi bioattivi.

Claims

674 203

2

RIVENDICAZIONI 1. Composti derivati dell'acido D,L-glutammico e dell'acido D,L-aspartico farmaceuticamente attivi aventi formula:

COOH

I

(CH2)n

(IA)

cooh

I

(ch2)„

I

ch-nh-co-ri

I

co-r2

co-r2

I

(ia) (ch2)n gb)

I

ch-nh-co-ri

1

cooh

CH-NH-CO-Ri e

I

CO-R2

co-r2 I

(ch2)„

I

ch-nh-co-ri

I

cooh

(IB)

io in cui n è uguale ad 1 oppure a 2, Ri è un fenile mono-, di- o tri-sostituito con gruppi alchilici C1-C4 lineari o ramificati, eguali o differenti oppure con alogeni, con il gruppo ciano o con il gruppo trifluorometile e in cui R2 è scelto dal gruppo che consiste di morfolino, piperidino, e amminico mono- o di-sosti-tuito con gruppi alchilici lineari, ramificati o ciclici, eguali o differenti, contenenti da 1 a 8 atomi di carbonio, e i loro sali farmaceuticamente accettabili.
2. Composti derivati dell'acido glutammico secondo la rivendicazione 1, di formula (IA) in cui n è uguale a 2, Ri è scelto dal gruppo che consiste di 3,4-dimetil-fenile e 3,4-dicloro-fe-nile e R2 è un gruppo amminico bisostituito con gruppi alchilici lineari C4-C5, e i loro sali farmaceuticamente accettabili.
3. Composti-derivati dell'acido glutammico secondo la rivendicazione 1, di formula (IB), in cui n è uguale a 2, Ri è un gruppo 4-ciano-fenile e R2 è un gruppo amminico bisostituito con gruppi alchilici lineari C4-C5, e i loro sali farmaceuticamente accettabili.
4. Composizioni farmaceutiche comprendenti come sostanza attiva un composto secondo la rivendicazione 1 o un loro sale farmaceuticamente accettabile.
5. Impiego di un composto secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di un medicamento utile per il trattamento terapeutico di situazioni patologiche del SNC legate a scompensi dei livelli fisiologici neuronali di polipeptidi bioattivi, particolarmente della colecistochinina.
6. Impiego di un composto secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di un medicamento avente attività antispastica.
7. Impiego di un composto secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di un medicamento ad attività coleretica.

in cui n è uguale ad 1 oppure a 2, Ri è un gruppo fenile mono-, di- o tri-sostituito con gruppi alchilici C1-C4, lineari o ramificati, eguali o differenti oppure con alogeni, con il gruppo ciano o con il gruppo trifluorometile, e in cui R2 è scelto dal gruppo che consiste di morfolino, piperidino o amminico mono- o disostituito con gruppi alchilici lineari, ramificati o ciclici, eguali o differenti, contenenti da 1 a 8 atomi di carbonio, o di un loro sale farmaceuticamente accettabile, caratterizzato dal fatto che comprende le operazioni di:

20 a) far reagire un'anidride interna di formula (II):

co

I

(ch2)n

I

ch-nh-co-ri

I

co

(II)

o

30

in cui n ed Ri hanno il significato sopra riportato, con un'am-mina di formula R2H, in cui R2 ha il significato sopra riportato, in rapporto molare da 1 a 5 ad una temperatura da — 20°C a 35 + 30°C, ricuperare i composti (IA) e (IB) dalla massa di reazione e separare detti composti (IA) e (IB).
13. Procedimento secondo la rivendicazione 12, in cui l'anidride interna di formula (II) è ottenuta mediante le operazioni di:

40

b) far reagire l'acido glutammico o l'acido aspartico in mezzo alcalino con una quantità equimolecolare di un cloruro acilico di formula Ri-CO-Cl, in cui Ri ha il significato riportato nella rivendicazione 12, ad una temperature da —20°C a 45 +30°C per ottenere un composto N-acilato di formula:
8. Impiego di un composto secondo la rivendicazione 4 per la preparazione di un farmaco utile nel trattamento terapeutico dell'anoressia. 50
9. Impiego di un composto secondo la rivendicazione 1 per la preparazione di un medicamento utile nel trattamento terapeutico di affezioni tumorali nelle quali siano coinvolti polipeptidi bioattivi quali la colecistochinina.

COOH

(CH2)n

(III)

ch-nh-co-ri

I

cooh
10. Composizioni farmaceutiche secondo la rivendicazione 4, per l'impiego nella terapia umana del dolore e comprendenti inoltre in combinazione con detti composti un farmaco avente azione analgesica.
11. Composizioni per uso zootecnico, da impiegarsi come stimolanti dell'appetito degli animali di allevamento, per incrementare la velocità di accrescimento ponderale, comtenenti come sostanza attiva almeno uno dei composti secondo la rivendicazione 1.
12. Procedimento per la preparazione di un derivato dell'acido D,L-glutammico e dell'acido D,L-aspartico avente formula (IA) e (IB):

c) disidratare il composto di formula (III) per reazione in presenza di anidride acetica in rapporto molare da 1 a 10, da sola o in presenza di un solvente inerte con essa miscibile ad 60 una temperatura da —10°C a quella di riflusso.

65