CH670707A5

CH670707A5 -

Info

Publication number: CH670707A5
Application number: CH4757/85A
Authority: CH
Inventors: Stephen Roderick Dr Postle; Peter John Elton; David Preston Gregory
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1984-11-15
Filing date: 1985-11-06
Publication date: 1989-06-30
Also published as: IT1182979B; GB2166979A; US4649026A; GB2166979B; SE8505371L; FR2575833A1; BE903642A; DE3540104A1; GB8428876D0; JPS61120953A; GB8527997D0; IT8548781A0; SE8505371D0; FR2575833B1

Description

BESCHREIBUNG Vorliegende Erfindung betrifft Materialien zur Verwendung bei der Elektrophorese und ähnlichen Methoden, wie Immunelektrophorese, Affinitätselektrophorese und isoelektrische Fokussierung. Solche Materialien werden im folgenden als Diagnostizierstreifen bezeichnet, obwohl sie auch in präparativen Methoden verwendbar sind.

Agarose, ein Polysaccharid aus Agar-Agar, der seinerseits aus Seetang gewonnen wird, wurde als Medium zur Durchführung solcher elektrophoretischer Trennungen verwendet. Wie Agar-Agar bildet Agarose ein steifes Gel, wenn es in Wasser gelöst und getrocknet wird. Ausgangsmaterialien zur Herstellung von Agaroseplatten sind seit einigen Jahren erhältlich ; solche Ausgangsmaterialien enthalten Agarosepulver und Schalen zur Bildung des Agarosegels. Auf Glasplatten gegossene Agarose mit einer Schichtdicke von etwa 0,5 mm ist ebenfalls erhältlich. Die Präparation von Agarose in Schalen ist jedoch sowohl zeitraubend als auch teuer. Andererseits sind vergleichsweise dicke, auf Glasplatten gegossene Agaroseschichten noch kostspieliger. Die Anwendung von Agarose war deshalb sehr beschränkt. Es wurde nun aber ein Verfahren zur Herstellung von dünn mit Agarose beschichteten Diagnosestreifen gefunden, die leicht in grossen Mengen herstellbar sind und dann zur leichteren Handhabung getrocknet werden können, aber beim Einweichen in einer Pufferlösung oder dergleichen wieder aufquellen können und so ein Medium zur Verwendung bei der Elektrophorese und ähnlichen Methoden liefern.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von mit Agarose beschichteten Diagnostizierstreifen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Rolle Bahnmaterial so präpariert, dass eine wässrige Gelatine-Sil-berhalogenidemulsion an einer Seite davon anhaften kann, das aber keine Gelatine- oder sonstige proteinhaltige Schicht auf der präparierten Seite trägt, dann nach einer kontinuierlichen Bahngiessmethode auf der präparierten Seite der Bahn bei einer Temperatur von mindestens 40 °C eine Schicht einer wässrigen Agaroselösung vergiesst, die gegossene Agaroseschicht auf eine Trockenschichtdicke von 0,1 bis 100 (im trocknet, wobei diese 10 bis 50 Gew.-% Feststoffe enthält, und die beschichtete Bahn in Streifen der erforderlichen Grösse schneidet.

Der Feststoffprozentgehalt in der getrockneten Schicht beträgt vorzugsweise 15 bis 30 Gew.-% und besonders bevorzugt ungefähr 20 Gew.-%.

Bei einem Feststoffprozentgehalt über 50% ist die Schicht klebrig und lässt sich nicht ohne Beschädigung handhaben. Liegt der Feststoffprozentgehalt unter 10%, so baut sich die getrocknete Schicht beim Einweichen in Wasser und danach in einem Puffer, was die bevorzugte Methode zur Wiederherrichtung der Schicht vor der Verwendung darstellt, nicht richtig wieder auf, und das Material ist dann für keine der oben angeführten Methoden brauchbar.

Als Bahnmaterial kann eine Bahn aus zur Verzögerung der Wasseraufnahme durch den Träger geleimten Papiermaterial vorliegen, wobei die verwendete Leimung nicht protein-haltig, aber genügend hydrophiler Art ist, um eine Beschich-tung der Bahn mit einer wässrigen Gelatine-Silberhalogenid-emulsion zuzulassen. Das Bahnmaterial kann mit Polyäthylen kaschiertes Papier sein, dessen eine Seite mit einer Koronaentladung behandelt wurde, um diese Seite für eine wässrige Gelatine-Silberhalogenidemulsionsschicht empfänglich zu machen.

Vorzugsweise stellt das Bahnmaterial jedoch ein Filmmaterial der als Filmträger für photographische Filme verwendeten Art dar, aber ohne Gelatine-Substrierschicht. Solches Filmmaterial kann aus Cellulosetriacetat oder Cellulose-acetat-butyrat bestehen, das oberflächlich hydrolysiert wurde, um es für eine wässrige Gelatine-Silberhalogenid-emulsionsschicht empfänglich zu machen.

Besonders bevorzugtes Bahnmaterial besteht aus biaxial orientiertem Polyesterfilmmaterial, das nach einem Verfahren hergestellt wurde, bei dem man nicht orientierten Polyester in Bahnform in einer Richtung auf einem Spannrahmen orientiert, dann mindestens eine Fläche des Polyesters mit einem Latex-copolymer beschichtet und die Orientierung des Polyesters in der anderen Richtung gleichzeitig mit einer Thermofixierstufe zu Ende führt. In manchen Fällen wird danach eine Koronaentladungsbehandlung der polymerbeschichteten Fläche durchgeführt. Anschliessend giesst man die Agaroselösung auf die Copolymerfläche des biaxial orientierten Polyesterfilms.

Das verwendete Copolymer enthält vorzugsweise bis 10

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Zur Verwendung bei diesem Verfahren geeignete Copoly-mere sind in den britischen Patentschriften 1 540 067, 1 583 343 und 1 589 926 beschrieben. Die in den dortigen Methoden angeführte Koronaentladungsbehandlung des biaxial orientierten Polyesters ist erforderlich, um optimale Haftung der wässrigen Giesslösung zu erzielen.

Ein weiteres geeignetes Copolymer wird in der britischen Patentschrift 1 571 583 beschrieben, wobei aber keine Koronaentladungsbehandlung der Copolymerschicht nötig ist, um die Oberfläche für eine wässrige Giesslösungsschicht empfänglich zu machen.

Das Copolymer ist besonders bevorzugt ein Copolymer auf Styrolgrundlage.

Beschichtungen mit einer Trockendicke über 100 (im lassen sich ebenfalls nach diesem Verfahren herstellen, doch wird bei solchen Beschichtungen Agarose unnötig verschwendet, da es sich gezeigt hat, dass nur 1 bis 10 jj.m dicke Beschichtungen als Diagnosestreifen schon sehr gute Leistungen erbringen.

Verschiedene Zusatzstoffe können der Agaroselösung vor dem Giessen zugegeben werden. Dazu gehören Netzmittel als Giesshilfen sowie Befeuchtungsmittel, z. B. Glycerin, welches zur Weichmachung der gegossenen Schicht beitragen. Ebenfalls verwendbar sind Zusatzstoffe, z. B. Sorbit und Galaktomannan, die zu einer Verbesserung der Wasserlöslichkeit der Agarose beitragen.

Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Streifen werden vor der Verwendung mit einer Flüssigkeit behandelt, um die Agaroseschicht zu quellen. Diese Flüssigkeit ist üblicherweise Wasser, gefolgt von einem wässrigen Puffer. Zur Förderung der Quellung der Agaroseschicht kann man der Agarosegiesslösung Zusatzstoffe, z. B. Harnstoff, zusetzen. Harnstoff beeinflusst die Gelfestigkeit der Agarosebeschichtung, und falls dies nicht als wünschenswert erachtet wird, kann man Quellhilfsmittel der Flüssigkeit zusetzen, welche die Agarose quellen lässt.

Wenn die mit Agarose beschichteten Streifen zur isoelektrischen Fokussierung verwendet werden sollen, so kann man der Agaroselösung Ampholyte zusetzen, beispielsweise Gemische aus Verbindungen, die Amid- und Carbonsäuregruppen enthalten. Solche Ampholyte können jedoch auch der Quellflüssigkeit zugesetzt werden.

Zum Giessen der Agaroselösung auf die Bahn verwendbare, kontinuierliche Bahnbeschichtungsmaschinen schliessen alle solche ein, die zur Beschichtung von Papierbahnen mit Leimlösungen verwendet werden, sowie alle zum Giessen von Gelatinelösungen auf photographische Trägermaterialien verwendeten Geräte. Dazu gehören Schlitz- und Troggiessgeräte mit oder ohne Luftrakel oder Rakelklinge als Vorrichtungen zur Regulierung der Schichtdicke. Kaskaden-und Vorhanggiessgeräte sowie Tiefdruck- und Umkehrtief-druckbeschichtungsmaschinen sind ebenfalls verwendbar.

Die wässrige Agaroselösung lässt sich dadurch herstellen, dass man die erforderliche Menge Agarosepulver in Wasser gibt und das Gemisch eine Stunde stehen lässt. Dann erhitzt man rasch unter kräftigem Rühren auf über 95 °C und hält diese erhöhte Temperatur 15 Minuten lang oder bis zur völligen Auflösung des Pulvers. Dies ist an einer erheblichen Abnahme der Trübung in der Lösung erkennbar. Dann erniedrigt man die Temperatur unter ständigem Rühren auf 5 °C über der gewünschten Giesstemperatur (üblicherweise etwa 55 °C) und bewahrt die Lösung bis zum Giessen in einem thermostatisch kontrollierten Vorratsgefäss auf. Die jeweilige Giesstemperatur über 40 °C hängt von der Art eingesetzten Agarose und der Verwendung der Diagnosestreifen ab.

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Agarose ist ein gereinigtes, festes, lineares Galaktanhydro-kolloid, das aus Agar-Agar isoliert oder direkt aus agarhal-tigen marinen Algen gewonnen wird. Verschiedene Agarosepräparate unterscheiden sich erheblich in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften werden durch die Seetangquelle, einschliesslich des Standorts und der Stufe im Wachstumszyklus, der Gewinnungsmethode und dem zur Isolierung der Agarose angewandten Verfahren beeinflusst.

Eigenschaften wie die Geliertemperatur, Gelfestigkeit, Porosität und Elektroendosmose lassen sich durch Vermischen zweier oder mehrerer Chargen einstellen. Die Gelier-und Schmelztemperaturen stehen in Beziehung mit dem Methoxylgehalt der Agarose, und Eigenschaften von Agarose lassen sich durch Einbau von Hydroxyäthylgruppen beeinflussen, wie z. B. in Miles Seaplaque-Agarose. Agarosegele sind wegen Mikrokristallinitätsgebieten nicht vollkommen klar. Kleine Konzentrationen an Harnstoff und Polyäthy-lenglykol verringern die Trübheit, aber die Gelfestigkeit wird dabei erniedrigt. Das Agarosegerüst ist zwar vorwiegend neutral, enthält aber einige anionische Reste, z. B. Sulfat und Pyruvat. Diesen Resten sind hydratisierte Gegenionen zugeordnet. Beim Anlegen eines elektrischen Stroms wandern die Gegenionen zur Kathode unter Mitnahme von Hydratwasser und jeglichen neutralen Molekülen in der Probe, was als Elektroendosmose bekannt ist. Dies ist ein Vorteil bei Gegenelektrophorese-Diagnosemethoden, aber nicht bei der isoelektrischen Fokussierung. Die isoelektrische Fokussierung bedient sich der Tatsache, dass für jedes Protein der pH, bei dem es elektrisch neutral ist, verschieden ist: der isoelektrische Punkt (pl). Proteine werden nach ihrem pl durch Elektrophorese auf einem Gel getrennt, in welchem ein stabiles pH-Gefälle durch Einbau von Ampho-lyten erzeugt wurde. Die Ampholyte können Gemische aus Amid- und Carbonsäuregruppen sein, die sich bei angelegtem elektrischem Feld in Reihenfolge ihres pl anordnen und aufgrund hoher Pufferkapazität jeweils einen ihrem pl entsprechenden lokalen pH aufrechterhalten. Die Ampholyte lassen sich während der Formulierung oder Quellung der getrockneten Agaroseschicht mit nur geringer Einwirkung auf den erzielten Trennungsgrad einbauen.

Zahlreiche weitere Methoden in der Elektrophorese und Immunologie, Zellkultur und Klonierung können mit Agaroseschichten verschiedener physikalischer und chemischer Eigenschaften durchgeführt werden, z. B. Serumproteinelektrophorese, Nukleinsäureelektrophorese, Trennung nach Molekulargewicht, zweidimensionale Elektrophorese,

Zellen- und Viruselektrophorese, Ouchterlony-Geldiffusion, radiale Immundiffusion, Immunelektrophorese, Laurell-rok-kets und Überkreuzimmunoelektrophorese, Gegenelektrophorese sowie Antigen-Antikörperüberlagerungen. Die getrockneten Agaroseschichten lassen sich leicht durch Einweichen in einem geeigneten Lösungsmittel quellen. Der Quellungsgrad hängt von der Art und Menge der aufgebrachten Agarose, der Quelltemperatur sowie der Art und dem pH der verwendeten Lösungsmittel ab. Agarosebe-schichtungen für elektrophoretische Methoden werden im allgemeinen in einer höher-konzentrierten Form des zur Proteintrennung zu verwendenden Puffers eingeweicht.

Ein wichtiges Merkmal der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Streifen besteht darin, dass sich zwischen dem Polyesterträger und der Agaroseschicht keine Gelatine-Substrierschicht befindet. Da Gelatine auf Protein basiert, verursacht sie erhebliche Störungen in Proteintrennungsmethoden, da sie sich schlecht anfärbt und Identifizierung der getrennten Proteine verhindert. Bei der bevorzugten erfindungsgemässen Methode liefert das zwischen

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den Streckstufen aufgebrachte, getrocknete Latex-copolymer auf Styrolgrundlage eine hydrophile Schicht, auf der die Aga-rosegiesslösungen aufgebracht werden und anhaften können. Vorzugsweise wird der Filmträger nach vollständiger Orientierung und Thermofixierung mit einer Koronaentladung behandelt. Dies fördert die Haftung der Agaroselösung am Träger, ist aber nicht immer notwendig.

Das nachfolgende Beispiel dient der Erläuterung der Erfindung:

Beispiel

Man verwendet einen Polyäthylenterephthalatpolyester-Filmträger, hergestellt wie in Beispiel 11 der britischen Patentschrift Nr. 1 540 067 beschrieben, aber ohne auf die mit einer Koronaentladung behandelte Filmoberfläche gegossene Silberhalogenidemulsion.

Eine wässrige Agaroselösung wird wie folgt hergestellt:

Agarose (Serva Zero EEO®) 20 g

Netzmittel (Olin 10G®) 2,0 g

Wasser auf 1 Liter

Die Agarose wird 60 Minuten lang in Gegenwart des Netzmittels in Wasser eingeweicht. Dann erhitzt man rasch unter kräftigem Rühren bis zum Sieden bei 96 C. Die Temperatur wird auf 92 ° abgesenkt und dort gehalten, bis sich das opake Aussehen der Lösung klärt. Man erniedrigt die Temperatur unter ständigem Rühren auf 60 °C und überführt die Lösung dann in ein thermostatisch kontrolliertes Giessgefäss. Die Lösung wird dann durch einen Schlitz auf den eben beschriebenen Polyesterfilmträger gegossen. Dabei wird der Filmträger mit einer Geschwindigkeit von 4,57 m pro Minute am Giessschlitz vorbeigeführt, und das pro Flächeneinheit auf den Filmträger gegossene Lösungsvolumen beträgt 1,6 cm3 • dm-2. Die Temperatur der Giesslösung während des Giessens beträgt 55 °C.

Der Guss wird dann zum Abbinden der Agarose abgekühlt und durch Aufblasen von Luft auf 20 Gew.-% Feststoffe getrocknet. Die gegossene und getrocknete Agaroseschicht ist 10 (im dick und klebfrei.

Der mit der getrockneten Agaroseschicht beschichtete Filmträger wird dann in 6 x 18 cm lange Streifen zerschnitten, was eine für Diagnosestreifen geeignete Grösse darstellt.

Sowohl nasse als auch trockene Haftprüfungen werden gemäss dem britischen Patent 1 540 067 durchgeführt, und die Agaroseschicht haftet bei beiden Prüfungen sehr gut am Filmträger.

Einer dieser Streifen wird dazu verwendet, in einem Elektrophoresetest aufzuzeigen, welche Proteine in einer Probe menschlichen Serums vorhanden sind. Dabei verwendet man eine Shandon 600 Elektrophoresekammer. Ein wie oben hergestellter Streifen wird mit Befestigungslöchern versehen.

Dann weicht man den Streifen 10 Minuten lang in Wasser ein und legt ihn danach 10 Minuten lang in ein wässriges Pufferbad (pH 8,6,0,05 m), um die Agaroseschicht zu quellen. Überschüssiger Puffer wird entfernt und der Streifen in die Elektrophoresekammer eingelegt, so dass beide Enden des Streifens in ein 0,025 m-Pufferbad eintauchen.

Mit Hilfe eines Filterpapiers wird ein kleines Volumen Serum auf ein Ende des Streifens aufgebracht. Kleine, bekannte Serumproteine enthaltende Proben werden in einer Reihe entlang des Streifens am selben Ende placiert.

Ein konstanter Strom von 3 m A, was Vi mA pro cm Streifenbreite entspricht, wird 5 Minuten lang angelegt. Der Agarosestreifen wird dann aus der Kammer herausgenommen und in eine 10%ige Ponceaurot-Lösung (C.I. Nr. 27 195) gelegt, um die Proteine anzufärben.

Fremdfärbungen werden dann durch 10 Minuten langes Eintauchen in verdünnte Essigsäure entfernt, wobei nur die abgetrennten Proteine angefärbt bleiben. Der Streifen wird dann mit einer Lösung von 10% verdünnter Essigsäure in 90% Methanol getränkt und getrocknet.

Der getrocknete Streifen zeigt die verschiedenen in der Serumprobe vorhandenen Proteine getrennt entlang der Streifenlänge. Proteine werden durch Vergleich mit den bekannten, ebenfalls entlang der Streifenlänge getrennten Proteinen identifiziert.

Diese Prüfung zeigt, dass die erfindungsgemäss hergestellten Streifen trotz der sehr dünnen gegossenen Agaroseschicht für eine elektrophoretische Proteintrennungsmethode verwendbar sind.

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PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Herstellung von mit Agarose beschichteten Diagnostizierstreifen, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Rolle Bahnmaterial so präpariert, dass eine wäss-rige Gelatine-Silberhalogenidemulsion an einer Seite davon anhaften kann, das aber keine Gelatine- oder sonstige pro-teinhaltige Schicht auf der präparierten Seite trägt, denn nach einer kontinuierlichen Bahngiessmethode auf der präparierten Seite der Bahn bei einer Temperatur von mindestens 40 °C eine Schicht einer wässrigen Agaroselösung ver-giesst, die gegossene Agaroseschicht auf eine Trockenschichtdicke von 0,1 bis 100 (im trocknet, wobei diese 10 bis 50 Gew.-% Feststoffe enthält, und die beschichtete Bahn in Streifen der erforderlichen Grösse schneidet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Feststoffprozentgehalt in der getrockneten Schicht 15 bis 30 Gew.-% beträgt.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Dicke der getrockneten Schicht 1 bis 10 p,m beträgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Bahnmaterial eine Bahn aus mit Polyäthylen kaschiertem Papier vorliegt, deren zu beschichtende Seite zwecks Präparierung mit einer Koronaentladung behandelt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem man eine Bahn aus nicht-orientiertem Polyester in einer Richtung orientiert, einen Copolymerlatex auf eine Fläche des Polyesters aufbringt, die Orientierung zu Ende führt, den beschichteten Polyester thermofixiert und dadurch als präpariertes Bahnmaterial biaxial orientierten Polyester enthält.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Copolymer ein Copolymer auf Styrolgrundlage verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass man nach der biaxialen Orientierung die Polyesterbahn auf der mit dem Copolymer beschichteten Seite einer Koronaentladung unterwirft.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die wässrige Agaroselösung mittels eines Schlitz-, Trog-, Kaskaden- oder Vorhanggiessgeräts auf die Bahn gegossen wird.
9. Agarosebeschichtete Diagnostizierstreifen, hergestellt gemäss dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
10. Verwendung von Diagnostizierstreifen nach Anspruch 8 bei einer Elektrophoresemethode oder isoleketrischen Fokussiermethode, dadurch gekennzeichnet, dass der Streifen zunächst in Wasser und dann in einem Pufferbad gequollen wird.