CH641805A5 - Derivatives of 3-thio-6-(1-hydroxyethyl)-7-oxo-1-azabicyclo-[3.2.0]hept-2-ene-2-carbo xylic acid, process for their preparation and medicaments containing these compounds - Google Patents

Derivatives of 3-thio-6-(1-hydroxyethyl)-7-oxo-1-azabicyclo-[3.2.0]hept-2-ene-2-carbo xylic acid, process for their preparation and medicaments containing these compounds Download PDF

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CH641805A5
CH641805A5 CH233978A CH233978A CH641805A5 CH 641805 A5 CH641805 A5 CH 641805A5 CH 233978 A CH233978 A CH 233978A CH 233978 A CH233978 A CH 233978A CH 641805 A5 CH641805 A5 CH 641805A5
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    • C07D477/10—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2
    • C07D477/12—Heterocyclic compounds containing 1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring systems, i.e. compounds containing a ring system of the formula:, e.g. carbapenicillins, thienamycins; Such ring systems being further condensed, e.g. 2,3-condensed with an oxygen-, nitrogen- or sulphur-containing hetero ring with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached in position 4, and with a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. an ester or nitrile radical, directly attached in position 2 with hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, attached in position 6
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Description

Gegenstand vorliegender Erfindung sind Derivate der
Fermentationsflüssigkeit von Streptomyces olivaceus ein wei- 3-Thio-6-(l-hydroxyäthyl)-7-oxo-l-azabicyclo[3,2,0]hept-
teres Antibiotikum isoliert werden könnte. Es ist jetzt gefunden worden, dass in der Fermentationsflüssigkeit weitere
2-en-2-carbonsäure der nachstehenden Formeln I und II
h S-CH2-CH2-NH-CO-CH3
(I)
CH_ H
y; S-C=Ç-NH-CO-CH3
(II)
h und deren Salze.
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Am zweckmässigsten liegen die Verbindungen der Formeln I und II in Form ihrer Salze vor, da es scheint, dass die Salze der Verbindungen der Formeln I und II beständiger als die entsprechenden freien Säuren sind.
Geeignete Salze von Verbindungen der Formeln I und II 5 sind pharmakologisch verträgliche Alkali- und Erdalkalimetallsalze, wie die Natrium-, Kalium- und Calciumsalze, sowie pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze mit stickstoffhaltigen Basen, wie die Ammonium-, Trimethylamin-, Dimethylamin- und Pyrrolidinsalze und dergleichen. 10
Besonders geeignete Salze der Verbindungen der Formeln
I und II sind deren Natrium- und Kaliumsalze.
Eine bevorzugte Verbindung vorliegender Erfindung ist das Natriumsalz der Verbindung der Formel I. Eine weitere bevorzugte Verbindung vorliegender Erfindung ist das 15
Natriumsalz der Verbindung der Formel II.
Da vorgesehen ist, die Verbindungen der Formeln I und
II in Arzneimitteln zu verwenden, ist es ohne weiteres verständlich, dass diese Verbindungen in weitgehend reiner
Form vorliegen sollen, beispielsweise in einer Reinheit von 20 mindestens 50%, doch zweckmässigerweise mindestens 75% und vorzugsweise mindestens 90% und ganz besonders bevor-
h-c h ho
Ì
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zugt mindestens 95%. Unreine Präparate von Verbindungen der Formeln I und II und deren Salzen können zur Herstellung von reineren Verbindungen verwendet werden, die dann zur Zubereitung von Arzneimitteln eingesetzt werden können. Diese weniger reinen Präparate der Verbindungen der Formeln I und II und deren Salzen sollten mindestens 1%, zweckmässigerweise mindestens 5% und vorzugsweise 10 bis 49% an einer Verbindung der Formel I oder II oder deren Salzen enthalten. Diese weniger reinen Präparate bestehen am vorteilhaftesten aus einem Salz einer Verbindung der Formeln I oder II, wobei sich die Prozentangaben auf Gewichtsprozente beziehen, bezogen auf das Gewicht des Präparats.
Im allgemeinen ist es vorteilhaft, dass die praktisch reinen Salze einer Verbindung der Formel I oder der Formel II nicht durch wesentliche Mengen anderer antibakterieller Mittel verunreinigt sind, wie von Salzen der Verbindungen der Formeln III, IV und V, die aus der Fermentationsflüssigkeit stammen.
Die Verbindungen der Formeln I und II liegen hinsichtlich des ß-Lactamringes sowohl als Cis- als auch als Trans-Isomere vor. Diese Isomeren können durch die Formeln Ia, Ib, IIa und IIb veranschaulicht werden:
h s-ch„-ch„-nh-co-ch.
(Ia)
(Ib)
ß s-ch2-ch2-nh-co-ch3
s-c=c-nh-co-ch.
h
(IIa)
h,c
3l ho y
h
h
I
s-c=c-nh-co-ch.
(IIb)
h co2h
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Diese vorgenannten Verbindungen können wie folgt benannt werden:
Ia) (5R,6R)-3-(2-Acetamido-äthylthio)-6-[(S)-l-hydroxy-äthyl] -7-oxo-1 -azabicyclo[3,2,0]hept-2-en-2-carbonsäure ;
Ib) (5R,6S)-3-(2-Acetamido-äthylthio)-6-[(S)-l-hydroxy-äthyl] -7-oxo-l-azabicyclo[3,2,0]hept-2-en-2-carbonsäure;
IIa) (5R,6R)-3-[(E)-2-Acetamido-äthenylthio]-6-[(S)-1-hydroxyäthyl] -7-oxo-l-azabicyclo[3,2,0]hept-2-en-2-carbon-säure;
IIb) (5R,6S)-3-[(E)-2-Acetamido-äthenylthioJ-6-[(S)-1 -hydroxyäthyl] -7-oxo-1 -azabicyclo[3,2,0]hept-2-en-2-carbon-säure.
Sowohl die Cis- als auch die Trans-Isomeren der Verbindungen der Formeln I und II besitzen wertvolle antibakterielle und ß-Lactamase hemmende Eigenschaften, und demzufolge erstreckt sich die vorliegende Erfindung sowohl auf die isolierten Verbindungen der Formeln Ia und Ib und deren Gemische als auch auf die isolierten Verbindungen der Formeln IIa und IIb und deren Gemische.
Selbstverständlich sind die isolierten Cis- und Trans-Iso-meren besonders geeignet in Formen von praktisch reinen pharmazeutisch verträglichen Salzen, wie sie vorstehend beschrieben worden sind, so dass sie einen Reinheitsgrad von mindestens 50%, zweckmässigerweise von mindestens 75%, vorzugsweise von 90% und am vorteilhaftesten von mindestens 95% besitzen. Weiterhin bevorzugt man die Verwendung einer der vorgenannten Verbindungen, wenn sie praktisch frei von ihrem 6-Stellungsisomeren ist, d.h. eine von der Verbindung Ib freie Verbindung Ia, eine von der Verbindung IIb freie Verbindung IIa, eine von der Verbindung Ia freie Verbindung Ib oder eine von der Verbindung IIa freie Verbindung IIb. Im allgemeinen sollten derartige Verbindungen nicht mehr als 5% ihres 6-Stellungsisomeren und vorzugsweise nicht mehr als 1% ihres 6-Stellungsisomeren enthalten. Zur Aufzeichnung der Reinheiten kann die Hochdruckflüssigchromatographie angewendet werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform bildet den Gegenstand vorliegender Erfindung ein Alkalimetallsalz einer Verbindung der Formel Ia mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von nicht unter 7700 in Wasser bei neutralem pH-Wert, vorzugsweise nicht unter 7900, bei einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 298 nm.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bildet den Gegenstand vorliegender Erfindung ein Alkalimetallsalz einer Verbindung der Formel Ib mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von nicht unter 7700 in Wasser bei neutralem pH-Wert, vorzugsweise nicht unter 7900, bei einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 301 nm.
Nach einer dritten bevorzugten Ausführungsform bildet den Gegenstand vorliegender Erfindung ein Alkalimetallsalz einer Verbindung der Formel IIa mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von nicht unter 13 000 in Wasser bei neutralem pH-Wert, vorzugsweise nicht unter 13 500, bei einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 308 nm.
Nach einer vierten bevorzugten Ausführungsform bildet den Gegenstand vorliegender Erfindung ein Alkalimetallsalz einer Verbindung der Formel IIb mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von nicht unter 13000 in Wasser bei neutralem pH-Wert, vorzugsweise nicht unter 13 500, bei einem UV-Absorptionsmaximum bei etwa 308 nm.
Vorzugsweise handelt es sich bei den vorgenannten Alkalimetallsalzen um die Natriumsalze.
Einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung bilden Arzneimittel, die durch einen Gehalt an einer Verbindung der Formel I oder der Formel II oder deren Salze gekennzeichnet sind. Die Arzneimittel können ferner pharmakologisch verträgliche Trägermaterialien, Verdünnungsmittel, Exzipientien und/oder weitere Zusatzstoffe enthalten.
In den Arzneimitteln vorliegender Erfindung kommen gewöhnlich die pharmakologisch verträglichen Salze der Verbindungen der Formeln I oder II, beispielsweise die Natriumoder Kaliumsalze, in Betracht.
Die Arzneimittel vorliegender Erfindung können oral oder parenteral verabreicht werden. Zweckmässigerweise enthalten die Arzneimittel vorliegender Erfindung 50 bis 500 mg einer Verbindung der Formeln I oder II oder deren Salze, beispielsweise etwa 100,150,200 oder 250 mg.
Am meisten geeignet sind Arzneimittel in einer injizierbaren Form.
Diese Arzneimittel können Verdünnungs-, Binde-, Zerfall-hilfs-, Gleitmittel und andere übliche Exzipientien enthalten und können nach üblichen Verfahren, z.B. durch Vermischen, Abfüllen oder dergleichen, hergestellt sein.
Die Arzneimittel können in Form von Tabletten, Kapseln, Ampullen oder ähnlichen Formen vorliegen.
Gegebenenfalls können die Arzneimittel vorteilhafterweise ein Penicillin oder Cephalosporin als Zusatzstoffe enthalten. In diesen Fällen liegt das Verhältnis von Synergist -d.h. der Verbindung vorliegender Erfindung, vorzugsweise als Salz - zum Penicillin oder Cephalosporin gewöhnlich bei 2:1 bis 1:12, zweckmässigerweise von 1:1 bis 1:5, beispielsweise 1:2,1:3 oder 1:4. Alle Angaben beziehen sich auf das Gewicht.
Besonders geeignete Penicilline zur Verwendung in den Arzneimitteln vorliegender Erfindung sind Ampicillin, Amoxycillin, Carbenicillin, Ticarcillin und ihre Vorstufen. Wenn die Arzneimittel für Injektionszwecke zubereitet werden sollen, liegen derartige Verbindungen gewöhnlich in Form ihrer Natriumsalze vor.
Besonders geeignet sind Cephalosporine, wie Cephalori-din und Cephazolin, zur Verwendung in den erfindungsge-mässen Arzneimitteln.
Bevorzugte Penicilline in den Arzneimitteln vorliegender Erfindung sind Ampicillin-trihydrat, Amoxycillin-trihydrat, das Natriumsalz des Ampicillins und das Natriumsalz des Amoxycillins.
Bevorzugte Cephalosporine in den erfindungsgemässen Arzneimitteln sind Cephaloridin und das Natriumsalz des Cephazolins.
Die Verbindung der Formel I oder der Formel II oder deren Salze kann eine isolierte Verbindung der Formel Ia, der Formel Ib, der Formel IIa, der Formel IIb oder deren Salzen oder Gemischen von Verbindungen der Formeln Ia und Ib oder von Verbindungen der Formeln IIa und IIb oder deren Salzen sein. Bevorzugt ist jedoch die Verwendung einer Verbindung einer der vorgenannten Formeln, die frei von ihrem Isomeren ist. Eine derartige Verbindung liegt gewöhnlich in Form eines pharmakologisch verträglichen Salzes, wie des Natriumsalzes, vor.
Einen weiteren Gegenstand vorliegender Erfindung bildet ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I oder der Formel II und deren Salze, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Stamm von Streptomyces olivaceus oder Streptomyces gedanensis, die diese Verbindungen erzeugen, züchtet, bis eine beträchtliche Menge an einer Verbindung der Formel I oder der Formel II oder deren Salzen erzeugt worden ist, und dass man danach die Verbindung der Formel I oder der Formel II oder deren Salz aus dem Züchtungsmedium isoliert.
Der hier verwendete Ausdruck «Streptomyces olivaceus» ist nach der Klassifikation von R. Hütter in dem Buch «Systematik der Streptomyceten», Verlag S. Karger, Basel, S. 8-32, definiert worden. Es ist zu beachten, dass die Definitionen «Streptomyces fulvovoridis», «Streptomyces flavus» und «Streptomyces flavovirens» als Synonyme für «Streptomyces olivaceus» betrachtet werden können.
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Geeignete Stämme sind in der GB-PS 1467413 bzw. der DE-OS 2513855 beschrieben.
Ein bevorzugter Organismus zur Verwendung bei diesem Verfahren ist Streptomyces olivaceus ATCC 31126 oder eine Mutante, die hohe Ausbeuten erzielen lässt.
Ein weiterer bevorzugter Organismus zur Verwendung bei vorgenanntem Verfahren ist Streptomyces olivaceus ATCC 31365 oder eine Mutante, die hohe Ausbeuten erzielen lässt.
Die genannten Stämme wurden hinterlegt bei der «American Type Culture Collection», 12301 Parklawn Drive, Rock-ville, Maryland 2085, USA, und zwar ATCC 31126 am 18. Februar 1975 und ATCC 31365 am 26. Januar 1978 und sind seither der Öffentlichkeit zugänglich.
Wie bereits vorstehend beschrieben worden ist, sollte die isolierte Verbindung einen Reinheitsgrad von mindestens 1%, zweckmässigerweise von 5%, noch zweckmässiger von mindestens 50%, vorzugsweise von mindestens 75% und noch bevorzugter von mindestens 90% haben, beispielsweise von mindestens 95%.
Der hier verwendete Ausdruck «Züchtung» bedeutet das bewusste aerobe Wachstum eines Organismus in Gegenwart von assimilierbaren Kohlenstoff-, Stickstoff- und Schwefelquellen und Mineralsalzen. Ein derartiges aerobes Wachstum findet auf einem festen oder halbfesten Medium statt, doch bevorzugt man im allgemeinen die Verwendung eines flüssigen Mediums. Die allgemeinen Züchtungsbedingungen für das Wachstum von Streptomyces olivaceus sind in der GB-PS 1467413 bzw. der DE-OS 2513855 beschrieben. Die allgemeinen Bedingungen für das Wachstum von Streptomyces geda-nensis sind ähnlicher Art.
Das Verfahren vorliegender Erfindung ist auf die Herstellung einer Verbindung der Formel I oder deren Salz, einer Verbindung der Formel II oder deren Salz oder einer Verbindung der Formel I oder deren Salz zusammen mit einer Verbindung der Formel II oder deren Salz abgestellt.
Normalerweise ist das Verfahren eher auf die Herstellung eines Salzes als auf die Herstellung der freien Säure abgestellt.
Vorzugsweise enthält das Züchtungsmedium kein zugesetztes Sulfat, da dies häufig zur Bildung der Verbindungen MM 4550, MM 13902 und MM 17880 auf Kosten der Erzeugung der Verbindungen der Formel I und der Formel II und deren Salze führt.
Die Verbindungen der Formel I und der Formel II in Form ihrer Salze können aus dem Filtrat der Kulturflüssigkeit erhalten werden durch a) Kontaktieren des Filtrats mit Aktivkohle, bis daran die antibiotische Aktivität adsorbiert ist,
b) Eluieren der antibiotischen Aktivität von der Aktivkohle unter Verwendung von wässrigem Aceton,
c) Vereinigen der Fraktionen, die die ß-Lactamase hemmenden Fraktionen enthalten,
d) Abdampfen des Acetons und des grössten Teils des Wassers, so dass man eine konzentriertere wässrige Lösung erhält,
e) Aufbringen der Lösung auf eine Anionenaustauscher-säule,
f) Eluieren der ß-Lactamase hemmenden Stoffwechselprodukte mit einer Lösung eines bis annähernd zum Neutralpunkt gepufferten Elektrolyten und Sammeln der die Verbindungen der Formel I oder der Formel II in Salzform enthaltenden Fraktionen,
g) Aufbringen der erhaltenen Lösung auf ein Harz, das die anorganischen Substanzen von den Verbindungen der Formel I und der Formel II abtrennt und h) Isolieren des festen Salzpräparats einer Verbindung der Formel I oder der Formel II aus der erhaltenen Lösung.
Die Verbindungen der Formel I und der Formel II in
Form ihrer Salze können auch aus dem Filtrat der Kulturflüssigkeit erhalten werden durch
1. Kontaktieren der geklärten Züchtungsflüssigkeit mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz auf Acrylsäu-rebasis, bis die antibiotische Aktivität daran adsorbiert ist,
2. Elieren der antibiotischen Aktivität von dem Harz unter Verwendung einer wässrigen Pufferlösung, die gegebenenfalls auch ein Salz enthalten kann,
3. Vereinigen der Fraktionen mit einer ß-Lactamase hemmenden Aktivität,
4. Aufbringen der vereinigten Fraktionen auf eine Säule mit einem Austauscherharz auf Basis von Phenol-Formal-dehyd-Kondensationsprodukten, die speziell für wasserlösliche organische Verbindungen eingestellt sind («Amberlite XAD-4»),
5. Eluieren mit wässrigem Isopropanol,
6. Vereinigen der Fraktionen mit einer ß-Lactamase hemmenden Aktivität,
7. Entfernen des Isopropanols und Einengen der Lösung durch Eindampfen,
8. Aufbringen der Lösung auf ein Anionenaustauscherharz und Weiterarbeiten wie vorstehend bei den Stufen (f), (g) und (h) angegeben ist.
Bevorzugt verwendet man stark basische Anionenaus-tauscherharze auf Acrylsäurebasis in Form ihrer Säureadditionssalze des Hydrochlorids, wie das von der Firma Rohm & Haas im Handel befindliche «Amberlite IRA 458». Ein Vorteil eines derartigen Harzes besteht darin, dass es bei Verwendung einer wässrigen Salzlösung, beispielsweise einer gepufferten Lösung eines Chlorids, wie Natriumchlorid oder dergleichen, gestattet, die Salze der Verbindungen der Formel I und der Formel II nacheinander zu eluieren. Wenn etwas weniger vorteilhafte stark basische Harze auf Basis von Poly-styrol/Divinylbenzol verwendet werden, ist es im allgemeinen erforderlich, mit einer wässrigen, einen niederen Alkohol enthaltenden Lösung eines Salzes, z.B. eines Chlorids, wie Natriumchlorid, zu eluieren, um zufriedenstellende Ausbeuten zu erhalten. Zu beachten ist jedoch, dass derartige Lösungsmittel zu weniger reinen Produkten an den gewünschten Verbindungen führen können.
Diese Verfahrensvariante unterscheidet sich von dem Adsorptionsverfahren an Kohle insofern, als die Salze der Verbindungen MM 4550, MM 13902 und MM 17880 von den Salzen der erfindungsgemässen Verbindungen der Formeln I und II in der ersten Eluierungsstufe abgetrennt werden.
Das Verfahren vorliegender Erfindung unterscheidet sich grundlegend von dem früher beschriebenen Verfahren dadurch, dass die für die weitere Verarbeitung in der Stufe (f) ausgewählten Fraktionen solche sind, die das Salz einer Verbindung der Formeln I und II enthalten, welche praktisch frei von anderen Antibiotika sind.
Die freien Säuren der Formeln I und II können durch vorsichtiges Ansäuern der Lösung eines Salzes einer Verbindung der Formeln I oder II bzw. durch anschliessendes rasches Extrahieren in ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel mit schliesslicher Gewinnung der Säure aus der Lösung erhalten werden.
Bei den Verfahren vorliegender Erfindung ist es häufig besonders zweckmässig, mit einem Alkalimetallsalz der Verbindungen der Formeln I und/oder II zu arbeiten, wie den Lithium-, Natrium- oder Kaliumsalzen, wobei das Natriumsalz bevorzugt ist. Es ist möglich, auch andere Salze mittels des Extraktionsverfahrens herzustellen, doch ist es gewöhnlich zweckmässiger, zuerst das gereinigte Alkalimetallsalz, insbesondere das Natriumsalz, zu bilden und dann dieses in ein anderes Salz zu überführen, beispielsweise indem man die Lösung durch ein Kationenaustauscherbett in Form des anderen Salzes leitet. Somit können gemäss dieser Beschreibung
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andere Elektrolyte, wie Lithium-, Kalium- oder andere Salze, anstelle der beschriebenen Natriumsalze eingesetzt werden, doch bevorzugt man im allgemeinen, mit dem Natriumsalz zu arbeiten. In gleicher Weise können andere Salze als die Chloride, nämlich beispielsweise Bromide, Nitrate oder dergleichen, eingesetzt werden, obwohl man im allgemeinen bevorzugt, mit dem Chlorid zu arbeiten.
Bei einem bevorzugten Chromatographieverfahren zur Reinigung gemäss den Stufen (f) und (g) verwendet man eine wässrige Lösung des Natriumsalzes, die bis annähernd zum Neutralpunkt gepuffert ist, in Verbindung mit einem basischen Ionenaustauscherharz. Demzufolge kann eine wässrige Lösung von Natriumchlorid (oder einem anderen ähnlichen Salz), die mit einem geeigneten Puffer, wie einem Phosphatpuffer, auf etwa pH 7 gepuffert worden ist, in Verbindung mit einem Trägerharz verwendet werden, das sekundäre oder tertiäre Aminogruppen oder quartäre Aminogruppen enthält. Geeignete Trägerstoffe umfassen basische Ionenaustauscher auf Cellulosebasis oder aus vernetzten Dextranen, wie sie als DEAE-Cellulose, DEAE-Sephadex, QAE-Sephadex und dergleichen bekannt sind.
Bei einem verwandten geeigneten Chromatographieverfahren zur Reinigung gemäss den Stufen (f) und (g) verwendet man ein Lösungsmittelsystem, das aus einem Gemisch von Wasser und geringen Mengen eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, wie einem niederen Alkohol, z.B. mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, in Verbindung mit einem inerten Trägermaterial, wie Silikagel oder Cellulose, besteht. Beispiele geeigneter Lösungsmittelsysteme sind wässriges Iso-propanol, wässriges n-Butanol und dergleichen. Beispielsweise kann man in Verbindung mit einem Celluloseträgerma-terial ein Gemisch von grob angenähert 1 Teil Wasser und 4 Teilen Isopropanol verwenden.
Das Produkt aus den vorgenannten Verfahrensstufen enthält häufig einen hohen Anteil an Natriumchlorid, so dass es vorteilhaft ist, die vereinigten Lösungen zu entsalzen. Das Entsalzen kann dadurch bewirkt werden, dass man die Lösung durch ein Bett einer lipophilen Substanz leitet, an das das Antibiotikum, jedoch nicht das Natriumchlorid adsorbiert wird. Geeignete Substanzen sind auf Polystyrol basierende Polymerisat-Absorptionsmittel, wie «Amberlite XAD-4», «Diaion HP20» und dergleichen. Das Produkt aus dem vorgenannten Verfahren kann auch mittels Chromatographie an geeigneten Gelfiltrationsmitteln entsalzt werden, wie an vernetzten Dextranen, beispielsweise «Sephadex G10» und «Sephadex G15», sowie an Polyacrylamidgelen, wie «Biogel P2». Das Antibiotikum kann von derartigen Substanzen unter Verwendung von Wasser, wässrigem Methanol oder dergleichen eluiert werden.
Die Säulen werden mit einer solchen Geschwindigkeit eluiert, dass eine Trennung der Antibiotika in verschiedene Fraktionen erreicht werden kann. Im allgemeinen können unterschiedliche Zonen aus diesen Säulen eluiert werden, s Dies enthalten das Dinatriumsalz der Verbindung MM 4550, das Dinatriumsalz der Verbindung MM 13902, das Dinatriumsalz der Verbindung MM 17880, die Natriumsalze der Verbindungen der Formel I und die Natriumsalze der Verbindungen der Formel II, welch letztere unmittelbar nach den 10 Natriumsalzen der Verbindungen der Formel I eluiert werden. Gewöhnlich liegen die drei Dinatriumsalze ziemlich weit von den Mononatriumsalzen auf den Anionenaustauscher-harzen auseinander. Wenn die Säule nicht sorgfältig überwacht wird, kann es sein, dass die Mononatriumsalze in sich 15 überlappenden Fraktionen erhalten werden. Falls dies eintritt, kann man entweder (a) diese Lösung gefriertrocknen, um einen brauchbaren unreinen Komplex mit einem Gehalt an den Antibiotika zu erhalten, der dann später aufgearbeitet werden kann, oder (b) die Lösung per se mit einer sorgfältig 20 berechneten Menge Eluierungsmittel nochmals chromatogra-phieren, um eine Anreicherung an der Lösung des Natriumsalzes einer Verbindung der Formel I, die frei von dem Natriumsalz einer Verbindung der Formel II ist, und/oder eine Anreicherung einer Lösung des Natriumsalzes einer Ver-25 bindung der Formel II, die frei von dem Natriumsalz einer Verbindung der Formel I ist, zu erhalten. Diese erhaltenen Lösungen können dann gefriergetrocknet oder in anderer Weise lösungsmittelfrei gemacht werden.
Die für eine Anreicherung ausgewählten Fraktionen sind 30 solche, die eine bemerkenswerte ß-Lactamase hemmende Aktivität oder eine antibakterielle Aktivität zeigen. Geeignete Methoden zur Feststellung einer ß-Lactamase hemmenden Aktivität sind in den eingangs genannten britischen Patentschriften bzw. deutschen Offenlegungsschriften beschrieben, 35 obwohl auch andere geeignete Verfahren angewendet werden können.
Die nachfolgenden Schemata zeigen die bevorzugten Verfahrensstufen, um die Verbindungen der Formeln I und II in Form ihrer Natriumsalze zu erhalten. Die auf diese Art und 40 Weise erhaltenen Natriumsalze können gegebenenfalls weiter gereinigt werden, indem man die vorstehend beschriebenen chromatographischen Verfahren anwendet.
Ein Verreiben der Salze der Verbindungen der Formeln I und II in Gegenwart eines organischen Lösungsmittels, wie 45 Wasser enthaltendem Acetonitril oder Aceton, kann ein Entfernen von Verunreinigungen wertvoll unterstützen.
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Filtrat der Züchtungsflüssigkeit
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Absorption an Aktivkohle
Eluieren mit 20prozentigem wäßrigen Aceton
V
Vereinigen der Fraktionen mit ß-Lactamase hemmender Wirkung
\/
Abdampfen dés Acetons und Einengen durch Eindampfen
Cellulose-DE52-Anionenaustauscherharz
Eluieren mit Phosphatpufferlösung vom pH 7
V
Natriumsalze der Verbindungen der Formel I
V
Natriunisalze der Verbindungen der Formel II
Dinatriumsalze der Substanzen MM4550, MM 15902 und MM 17880
V
entsalzte Lösung
Chromatographie an "Amberlite XAD 4"
/
entsalzte Lösung
V
gefriergetrocknete feste Verbindung
V
gefriergetrocknete feste Verbindung
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Filtrat der Züchtungsflüssigkeit
\!/
Absorbieren an einem stark basischen Austauscherharz auf Acrylbasis
V
Eluieren mit Pufferlösung
Vereinigen der Fraktionen mit der zuerst eluierten ß-Lactamase hemmenden Aktivität
Entsalzen an Amberlite XAD 1
Eluieren mit wäßrigem. Isopropanol
\/
Vereinigen der Fraktionen mit ß-Lactamase hemmender Aktivität
Abdampfen des Isopropanols und Einengen durch Eindampfen
V
Cellulose-DE52-Anionenaustauscherharz
Eluieren mit Phosphatpufferlösung vom pH 7
Natriumsalze der Verbindungen der Formel I
Natriumsalze der Verbindungen der Formel II
£—Shromatographieren an "Amberlite XAD4"
->
v entsalzte Lösung
>/
entsalzte Lösung
gefriergetrocknete Teste Verbindung
!
gefriergetrocknete feste Verbindung
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Gegebenenfalls können die Salze der Verbindungen der Formeln I und II, die nach den vorstehenden Verfahren hergestellt worden sind, weiteren chromatographischen Trennverfahren unterworfen werden, um die isolierten jeweiligen Salze der Verbindungen der Formeln Ia, Ib, IIa oder IIb zu erhalten. Derartige Verfahren sind bevorzugte Ausführungsformen vorliegender Erfindung. Üblicherweise ist das in einem derartigen Verfahren verwendete Salz ein einwertiges Salz, wie das Ammoniumsalz oder ein Alkalimetallsalz, wie das Natriumoder Kaliumsalz.
Eines der geeigneten chromatographischen Trennverfahren ist die Hochdruckflüssigchromatographie, beispielsweise unter Verwendung einer wässrigen, mit Ammoniumformiat gepufferten Lösung. Sobald die die gewünschte Verbindung enthaltenden Fraktionen erhalten worden sind, kann man sie daraus in fester Form durch Gefriertrocknen oder dergleichen gewinnen.
Verbindungen der Formeln Ia und Ib können durch Säulenchromatographie an einem Trägermaterial, wie acetylierte Cellulose, und Elieren mit Gemischen aus Wasser und Alkohol getrennt werden. Die Verbindungen der Formeln IIa und IIb können ebenfalls unter Verwendung gleicher chromatographischer Methoden getrennt werden.
Wenn die die gewünschte Verbindung enthaltenden Fraktionen erhalten worden sind, können die Verbindungen in fester Form durch Gefriertrocknen oder dergleichen gewonnen werden.
Gegenstand vorliegender Erfindung ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel Ia, die praktisch frei von der Verbindung der Formel Ib ist, mit dem kennzeichnenden Merkmal, dass man ein Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem vernetzten Divinylbenzolharz («Diaion HP20») oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.
Des weiteren bildet einen Gegenstand vorliegender Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel Ib, die praktisch frei von einer Verbindung der Formel Ia ist, mit dem kennzeichnenden Merkmal, dass man ein Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem vernetzten Divinylbenzolharz («Diaion HP20») oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.
Des weiteren bildet einen Gegenstand vorliegender Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel IIa, die praktisch frei von einer Verbindung der Formel IIb ist, mit dem kennzeichnenden Merkmal, dass man ein Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem vernetzten Divinylbenzolharz («Diaion HP20») oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.
Schliesslich ist ein Gegenstand vorliegender Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel IIb, die praktisch frei von einer Verbindung der Formel IIa ist, mit dem kennzeichnenden Merkmal, dass man ein Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem vernetzten Divinylbenzolharz («Diaion HP 20») oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.
Die nach den vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellten Salze sind üblicherweise einwertige Salze, wie Alkali-metallsalze, beispielsweise das Lithium-, Natrium- oder Kaliumsalz, vorzugsweise das Natriumsalz.
Die nach den vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellten Salze enthalten gewöhnlich nicht mehr als etwa 5% und noch zweckmässiger nicht mehr als etwa 1% an dem unerwünschten Isomeren.
Die bei den vorgenannten Verfahren verwendeten Adsorptionsharze («Diaion») sind hochporöse Polymerisate, die von der japanischen Firma Mitsubishi Chemical Industries hergestellt werden, und stellen nicht im eigentlichen Sinne Ionenaustauscherharze dar, sondern sind synthetische
Adsorptionsmittel, die einen besonders grossen aktiven Oberflächenbereich aufweisen, an den organische Verbindungen wirksam adsorbiert werden können.
Das speziell genannte Adsorptionsmittel «Diaion HP20» ist ein Styrol-Divinylbenzol-Mischpolymerisat in Perlchenform mit einer makrovernetzten Struktur und einem spezifischen Oberflächenbereich von etwa 7,8 mVg und einem Porenvolumen von 1,16 ml/g. Weitere Einzelheiten dieses Harzes sind in dem Prospekt «Diaion HP-Series» der genannten Firma vom Oktober 1976 enthalten.
Die dem vorgenannten Adsorptionsmittel äquivalenten Harze für Chromatographiezwecke sind in chemischer und physikalischer Hinsicht gewöhnlich ähnlich, denn sie stellen im allgemeinen makrovernetzte Harze auf der Basis von Sty-rol-Divinylbenzol-Mischpolymerisaten dar und enthalten keine ionisierbaren Gruppen.
Am zweckmässigsten ist das Isomerengemisch, das auf die Säule aufgebracht wird, von guter Reinheit und praktisch frei von anderen organischen Verunreinigungen, obwohl anorganische Verunreinigungen, z.B. Alkalimetallsalze, wie ein Chlorid, z.B. Natriumchlorid, vorhanden sein können.
Zweckmässigerweise ist das verwendete Lösungsmittel Wasser oder Wasser im Gemisch mit einem niederen Alkanol oder einem ähnlichen mischbaren organischen Lösungsmittel. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel jedoch Wasser.
Die gewünschten Substanzen können dann durch Entfernen des Lösungsmittels, beispielsweise durch Abdampfen, Gefriertrocknen und dergleichen, erhalten werden. Gegebenenfalls kann die Lösung unmittelbar an einem geeigneten Harz, z.B. «Biogel P2» und/oder «Diaion HP20», zur weiteren Reinigung vor einem Entfernen des Lösungsmittels nochmals chromatographiert werden.
Aus den wässrigen Lösungen der erfindungsgemässen Salze kann das Wasser beispielsweise durch Eindampfen unter vermindertem Druck auf etwa ein Zehntel des ursprünglichen Volumens, Auffüllen mit Äthanol auf das ursprüngliche Volumen, Wiedereindampfen unter vermindertem Druck auf etwa ein Zehntel des ursprünglichen Volumens, Wiederauffüllen auf das ursprüngliche Volumen durch Zugabe von Toluol und anschliessendes Eindampfen unter vermindertem Druck zur Trockne entfernt werden. Spuren von Lösungsmittel können durch Aufbewahren der Substanzen unter Hochvakuum entfernt werden.
Beschreibung Nr. 1
Herstellung einer geklärten Züchtungsflüssigkeit
Es wird eine Sporensuspension von Streptomyces olivaceus ATCC 31126 verwendet und auf 100 ml eines Anzuchtmediums in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben überimpft, der mit einem Schaumstopfen verschlossen ist. Das Anzuchtmedium enthält 2% Glucose und 1% Sojabohnenmehl in voll entsalztem Wasser.
Das beimpfte Anzuchtmedium lässt man 48 Stunden bei 26 °C auf einem Drehschüttler wachsen. Dann werden 5-ml-Anteile des Anzuchtmediums verwendet und auf 100-ml-Anteile eines Fermentationsmediums in 500-ml-Erlenmeyer-Kolben überimpft, die mit Schaumstopfen verschlossen sind. Das Fermentationsmedium, das mit dem voll entsalztem Wasser zubereitet worden ist, enthält die folgenden Bestandteile:
Glucose 2,0%
Sojabohnenmehl 1,0%
CaCOj 0,02%
CoCh-óHzO 0,0001%
Die Fermentationsflaschen werden 72 Stunden bei 26 °C auf einem Drehschüttler bebrütet. Dann werden 20 Flaschen abgeerntet, und die gesamte erhaltene Kulturflüssigkeit wird
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
o5
641 805
12
10 Minuten bei 2200 g zentrifugiert.
Vorteilhaft ist auch die Verwendung von Streptomyces olivaceus ATCC 31365 bei dem vorgenannten Verfahren.
Beschreibung Nr. 2
Herstellung rohrer Antibiotika in Lösung
1500 ml des nach dem Zentrifugieren erhaltenen Filtrats der Züchtungsflüssigkeit werden unter Verwendung von einer Säule mit Aktivkohle wie folgt einer Reinigung unterworfen: Eine Säule mit granulierter Aktivkohle mit einer Länge von 37 cm und einem Durchmesser von 2,5 cm wird mit voll entsalztem Wasser vorbereitet. Die Säule wird dann nacheinander mit 1 Liter einer 2prozentigen Natriumhydroxidlösung, mit 1 Liter voll entsalztem Wasser, mit 1 Liter 1-n Salzsäure und schliesslich mit 1 Liter voll entsalztem Wasser gewaschen, wobei jeweils 15 ml je Minute durchlaufen. Anschliessend wird die Säule mit einer 0,05-m-Phosphatpufferlösung vom pH 7 gewaschen, bis der pH-Wert des Eluats 7,0 ist.
1500 ml des Filtrats der Züchtungsflüssigkeit lässt man durch die Säule mit Aktivkohle mit einer Geschwindigkeit von 15 ml je Minute laufen. Dann wird die Säule mit einem Gemisch von 1 Teil Aceton und 4 Teilen Wasser mit einer Geschwindigkeit von 15 ml je Minute eluiert, und es werden 22-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden auf ihre ß-Lactamase hemmende Wirkungen gegenüber einem Rtem-Enzym-Präparat, das von der Microbiological Research Establishment, Porton, geliefert worden ist, untersucht. Die Fraktionen, welche die grösste Aktivität zeigen, nämlich die Fraktionen 8 bis 22, werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft, um das Aceton zu entfernen. Die erhaltene wässrige Lösung wird vor der anschliessenden Aufarbeitung tiefgefroren gelagert.
(Das RTEM-Enzym ist typisch für plasmatisch beeinflusste ß-Lactamasen und kann gegebenenfalls durch andere R-Fak-tor-ß-Lactamasen ersetzt werden.)
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Isolierung der Verbindungen der Formeln I und II in Form ihrer Natriumsalze, die praktisch frei von Salzen der Verbindungen MM 4550, MM 13902 und MM 17880 sind •
Die nach der Beschreibung Nr. 2 erhaltene rohe Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck auf etwa 20 ml eingedampft und auf eine 3,8 x 27 cm grosse Säule mit einem schwach basischen Anionenaustauscher «DEAE-Cellulose», die mit einer 0,025-m-Phosphatpufferlösung vom pH 7 aufgezogen worden ist, gegeben. Dann wird die Säule mit einer 0,025-m-Phosphatpufferlösung vom pH 7 mit einer Geschwindigkeit von 8 ml je Minute eluiert. Es werden 25-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden auf ihre ß-Lactamase hemmende Wirkung gegenüber einem Rtem-ß-Lactamase-Präparat untersucht. Die Fraktionen mit den beiden ersten Maxima hinsichtlich einer hemmenden Aktivität werden zurückbehalten. Die Fraktionen 13 bis 16 mit dem ersten Maximum, die das Salz der Verbindung der Formel I enthalten, werden vereinigt und gefriergetrocknet, so dass man eine feste Substanz mit einem Gehalt an dem Natriumsalz der Verbindung der Formel I erhält, die praktisch frei von Salzen der dibasischen Antibiotika ist. Die Fraktionen 19 bis 21 mit dem zweiten Maximum, die das Salz der Verbindung der Formel II enthalten, werden vereinigt und gefriergetrocknet, so dass man eine feste Substanz mit einem Gehalt an dem Natriumsalz der Verbindung der Formel II erhält, die praktisch frei von Salzen der dibasischen Antibiotika ist.
(Das Gefriertrocknen der vereinigten Fraktionen 13 bis 16 und 19 bis 21 führt natürlich zu einer Substanz, die ein Gemisch der Natriumsalze der Antibiotika der Formeln I und
11 enthält. Die Dinatriumsalze der Verbindungen MM 4550,
MM 13902 und MM 17880 werden im Anschluss an die gewünschten Salze eluiert.)
Beispiel 2
Teilweise Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel I
Die gefriergetrocknete Substanz mit dem Salz der Verbindung des Beispiels 1 wird in 10 ml voll entsalztem Wasser gelöst und die Lösung wird mit 1 g Natriumchlorid versetzt. Diese Lösung wird auf eine 1,5 x 15 cm grosse Säule mit «Amberlite XAD-4» gegeben, die mit voll entsalztem Wasser aufgezogen worden ist. Die Säule wird mit einem Gemisch von 4 Teilen Wasser und 1 Teil n-Propanol mit einer Geschwindigkeit von 2 ml je Minute eluiert, und es werden 4-ml-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen werden durch Zugabe von Silbernitrat auf Chlorid und weiterhin gegen ein RTEM-ß-Lactamase-Präparat auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität geprüft. Die Fraktionen mit der grössten hemmenden Aktivität und einer negativen Silbernitratreaktion, nämlich die Fraktionen 6 bis 13, werden vereinigt und gefriergetrocknet, wobei man 32,5 mg eines amorphen Feststoffes mit einem Gehalt an dem Natriumsalz der Verbindung der Formel I erhält.
Die Eigenschaften dieser Substanz sind folgende:
A. Chromatographische Eigenschaften
I. Chromatographie an einem schwach basischen Ionen-austauschpapier («Whatman DE81»):
Eluierungsmittel
Rf-Wert des
Natriumsalzes
1. 0,05molare Phosphatpufferlösung
vom pH 7
0,69
2. 0,05molare Phosphatpufferlösung
vom pH 7 mit einem Gehalt von
0,2-m NaCl
0,80
II. Chromatographie an «Whatman Nr. 1 Paper»
Lösungsmittelsystem
RrWert des
Natriumsalzes
1. ButanohÄthanol:Wasser obere
Phase 4:1:5
0,12
2. ButanoLPyridin:Wasser 1:1:1
0,42
B. Hochspannungspapier-Elektrophorese
Die Elektrophorese wird an einem Papier Nr. 20 mit einer Pyridin/Essigsäure-Pufferlösung vom pH 5,3 als Laufmittel bei 5000 V 15 Minuten lang durchgeführt. Die RM-Werte für das Natriumsalz betragen wie für die Vergleichsverbindung Benzylpenicillin 1,0.
C. Antibakterielle Wirksamkeit
Die antibakterielle Wirksamkeit der Substanz unter Verwendung der Microtiter-Methode wurde wie folgt bestimmt:
Organismus Mindesthemmkonzentra-
tion (|ig/ml)
Bacillus subtilis A <40
Enterobacter cloacae N1 1250
Escherichia coli 10418 150
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
OD
13
641 805
Organismus
Mindesthemmkonzen-
trationen (}ig/m!)
E. coli JT 410
625
Klebsiella aerogenes A
312
Proteus mirabilis C977
625
Pseudomonas aeruginosa A
> 2500
Salmonella typhimurium CT10
312
Serratia marcescens US39
625
Staph. aureus Russell
150
D. Enzymhemmung
Die enzymhemmende Wirkung der Substanz gegenüber einer Reihe von ß-Lactamase-Präparaten ist nachstehend wie folgt zusammengefasst:
ß-Lactamase-Präparate aus :
% Hemmung
Konzentration, die
bei 200
eine 50%ige
[ig/ml
Hemmung ergibt (Hg/ml)
Staph. aureus Russell
40
E. coli JT4
-
95
Proteus mirabilis C889
-
112
Pseudomonas aeruginosa
Dalgleish
-
170
Enterobacter cloacae P99
83
Pseudomonas aeruginosa A
30
Klebsielle aerogenes E70
27
(Verfahren nach der BE-PS 827926)
Beispiel 3
Teilweise Reinigung des Natriumsalzes der Verbindungen der Formel II
Die gefriergetrocknete Substanz des Salzes der Verbindung II des Beispiels 1 wird in 10 ml voll entsalztem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 1 g Natriumchlorid versetzt.
Dann wird die Lösung auf eine 1,5 x 15 cm grosse Säule mit «Amberlite XAD-4», die mit voll entsalztem Wasser aufgezogen worden ist, gegeben. Die Säule wird mit einem Gemisch von 4 Teilen Wasser und 1 Teil n-Propanol mit einer Geschwindigkeit von 2 ml je Minute eluiert. Es werden 4-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden mittels Silbernitrat auf Chlorid und gegenüber einem RTEM-ß-Lactamase-Präparat auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität untersucht. Die Fraktionen mit der grösstem hemmenden Aktivität und einer negativen Reaktion auf Silbernitrat, nämlich die Fraktionen 7 bis 13, werden vereinigt und gefriergetrocknet, wodurch man 32,5 mg eines amorphen Feststoffes mit einem Gehalt an dem Natriumsalz der Verbindung der Formel II erhält.
Die Eigenschaften dieser Substanz sind folgende:
A. Chromatographische Eigenschaften
I. Unter Verwendung eines schwach basischen Anionen-austauschpapiers («DE81-Cellulose») beträgt der Laufwert des Natriumsalzes 0,54, wenn man mit 0,05-m-Phosphatpuff-erlösung vom pH 7 eluiert.
II. Unter Verwendung des Whatman Nr. 1 Paper: Das Natriumsalz besitzt einen Laufwert von 0,20, wenn man mit einem Gemisch von Butanol/Äthanol/Wasser im Verhältnis 4:1:5 als obere Phase eluiert.
B. Hochspannungspapier-Elektrophorese
Die Elektrophorese wird an Whatman-Nr.-20-Papier in
Pyridin/Essigsäure-Pufferlösung vom pH 5,3 als Laufmittel bei 5000 V 15 Minuten lang durchgeführt. Der RM-Wert für das Salz beträgt 0,95 gegenüber Benzylpenicillin mit dem Wert 1,0.
C. Antibakterielle Wirksamkeit
Die antibakterielle Wirksamkeit der Substanz wurde unter Verwendung der Microtiter-Methode bestimmt. Die Ergebnisse lauten wie folgt:
Organismus Mindesthemmkonzen-
trationen (ng/ml)
Bacillus subtilis A
250
Enterobacter cloacae N1
>
1000
Escherichia coli 10418
250
Klebsiella aerogenes A
500
Proteus mirabilis C?77
500
Pseudomonas aeruginosa A
>
1000
Salmonella typhimurium CT 10
250
Serratia marscens US39
>
1000
Staph. aureus Oxford
500
Staph. aureus Russell
250
D. Enzymhemmung
Die ß-Lactamase hemmende Aktivität der Substanz gegenüber einer Anzahl von Enzympräparaten wurde mit den folgenden Ergebnissen bestimmt:
ß-Lactamase-Präparate aus:
% Hemmung
Konzentration, die
bei 200
eine 50%ige
Hg/ml
Hemmung ergibt (ixg/ml)
Staph. aureus Russell
150
E. coli JT4
-
72
Proteus mirabilis C889
-
62
Pseudomonas aeruginosa
Dalgleish
-
53
Enterobacter cloacae P99
-
10
Pseudomonas aeruginosa A
39
Klebsiella aerogenes E70
13
Beispiel 4
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel I
Die nach Beispiel 2 erhaltene Substanz wird in voll entsalztem Wasser gelöst und auf eine stark basische Anionen-austauschersäule («QAE-Sephadex A25») gegeben, die mit voll entsalztem Wasser aufgezogen worden ist. Die Säule wird mit voll entsalztem Wasser mit einem steigenden Natriumchloridgradienten von 0 bis 0,18-m eluiert. Die Fraktionen aus der Säule werden gegenüber einem RTEM-Präparat auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität untersucht. Diejenigen Fraktionen mit der grössten Aktivität werden vereinigt. Zu den vereinigten Fraktionen wird Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von mindestens 5% zugegeben. Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule von «Amberlite XAD-4» gegeben. Dann wird die Säule mit einem Gemisch aus 1 Teil n-Propanol und 4 Teilen Wasser eluiert. Die Fraktionen mit einem Gehalt an dem gewünschten Salz, die aufgrund ihrer ß-Lactamase hemmenden Wirkung ausgewählt werden, werden vereinigt, zur Entfernung des organischen Lösungsmittels unter vermindertem Druck eingedampft und dann gefriergetrocknet.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
t>5
641 805
14
Beispiel 5
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel I
Die vereinigten Fraktionen aus der Chromatographie an «QAE-Sephadex» des Beispiels 4 können entsalzt und chromatographisch an einer Säule mit «Biogel P2» wie folgt weiter gereinigt werden:
Der gefriergetrocknete Feststoff aus der Säule mit «QAE-Sephadex» wird in einem geringen Volumen voll entsalztem Wasser gelöst und auf eine Säule mit «Biogel P2» gegeben. Die Säule wird mit lprozentigem wässrigen Butanol eluiert. Die Fraktionen werden auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität und auf die Reaktion mit Silbernitrat geprüft. Diejenigen Fraktionen, die eine negative Reaktion auf Silbernitrat, jedoch eine angemessene ß-Lactamase hemmende Aktivität zeigen, werden vereinigt und gefriergetrocknet.
Beispiel 6
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel I
Die nach dem Verfahren des Beispiels 2 erhaltene Substanz wird in voll entsalztem Wasser gelöst und auf eine Säule mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz «Amberlite IRA 458» gegeben. Die Säule wird mit 0,05-m-Phosphat-pufferlösung vom pH 7 aufgezogen und mit Phosphatpufferlösung mit steigendem Gehalt an Natriumchlorid eluiert, bis der Natriumchloridgehalt 1,0-molar ist. Die Fraktionen mit der grössten ß-Lactamase hemmenden Aktivität werden vereinigt. Dann wird Natriumchlorid zu den vereinigten Fraktionen zugegeben, bis zu einer Konzentration von mindestens .5%. Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule mit «Amberlite XAD-4» gegeben, die mit voll entsalztem Wasser aufgezogen worden ist. Dann wird die Säule mit einem Gemisch aus 1 Teil n-Propanol und 4 Teilen Wasser eluiert. Die Fraktionen mit der grössten ß-Lactamase hemmenden Aktivität jedoch einer negativen Reaktion auf Silbernitrat werden vereinigt und gefriergetrocknet.
Beispiel 7
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel I
Das Salz der Verbindung der Formel I kann chromatographisch an einer Säule mit Cellulose-Füllung («Cellulose CC31») wie folgt weiter gereinigt werden:
Der unreine Feststoff mit einem Gehalt an dem Salz der Verbindung der Formel I wird in der Mindestmenge voll entsalztem Wasser gelöst und bis zu etwa 50% mit n-Propanol versetzt. Die erhaltene Lösung wird auf die Säule mit Cellulose gegeben. Dann wird die Säule mit einem Gemisch aus 4 Teilen n-Propanol und 1 Teil Wasser eluiert. Die erhaltenen Fraktionen werden nach Verdünnen mit voll entsalztem Wasser auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität untersucht. Die Fraktionen mit einem Gehalt an dem gewünschten Salz werden vereinigt, zum Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck eingedampft und dann gefriergetrocknet.
Beispiel 8
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel II
Es wird das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren angewendet, jedoch wird als Ausgangssubstanz die nach dem Verfahren des Beispiels 3 erhaltene Substanz verwendet.
Beispiel 9
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel II
Es wird das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren angewendet, jedoch mit der nach Beispiel 8 erhaltenen Verbindung als Ausgangssubstanz.
Beispiel 10
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel II
Es wird das in Beispiel 6 beschriebene Verfahren angewendet, jedoch mit der nach Beispiel 3 erhaltenen Substanz als Ausgangsverbindung.
Beispiel 11
Weitere Reinigung der Natriumsalze der Verbindungen der Formel II
Es wird das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren angewendet, jedoch mit der nach Beispiel 3 erhaltenen Substanz als Ausgangsverbindung.
Beispiel 12
Herstellung der rohen Antibiotika aus dem Filtrat der Züchtungsflüssigkeit
80 ml des Filtrats der Züchtungsflüssigkeit, das im wesentlichen nach dem in der Beschreibung Nr. 1 beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, werden auf eine 1,5 x 15 cm grosse Säule mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz auf Acrylbasis («Amberlite IRA 458») gegeben. Dann wird die Säule mit 0,05-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 mit einem allmählich ansteigenden Gehalt von 0 bis 1,0-m Natriumchlorid mit einer Fliessgeschwindigkeit von 2,5 ml je Minute eluiert. Es werden 5-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden gegen ein RTEM-ß-Lactamase-Präparat auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität untersucht. Diejenigen Fraktionen mit einer guten hemmenden Aktivität und einem Gehalt an den Natriumsalzen der Verbindungen der Formeln I und II, nämlich die Fraktionen 4 bis 13, werden vereinigt. (Die Dinatriumsalze der Verbindungen MM 4550, MM 13902 und MM 17880 werden erst mit Beginn der Fraktion 17 eluiert.)
Zu den vereinigten Fraktionen werden 3 g Natriumchlorid gegeben. Die erhaltene Lösung wird auf eine 1,5 x 15 cm grosse Säule mit «Amberlite XAD-4» gegeben, die mit voll entsalztem Wasser aufgezogen worden ist. Dann wird die Säule mit einem Gemisch von 1 Teil n-Propanol und 4 Teilen Wasser mit einer Geschwindigkeit von 3 ml je Minute eluiert. Es werden 4-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität und auf ihre Reaktion mit Silbernitratlösung untersucht. Diejenigen Fraktionen mit einer guten hemmenden Aktivität und einer negativen Reaktion auf Silbernitrat werden vereinigt und gefriergetrocknet, so dass man ein teilweise gereinigtes Präparat der Natriumsalze der Verbindungen der Formeln I und II erhält. Dieses verunreinigte Präparat wird nach den vorstehend beschriebenen Verfahren weiter gereinigt.
Beispiel 13
Herstellung roher Antibiotika aus dem Filtrat der Züchtungsflüssigkeit
305 ml des Filtrats der Züchtungsflüssigkeit, die im wesentlichen nach dem in der Beschreibung Nr. 1 beschriebenen Verfahren hergestellt worden ist, werden auf eine 1,5 x 15 cm grosse Säule mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz auf Acrylbasis («Amberlite IRA 458») gegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 5 ml je Minute mit 100 ml voll entsalztem Wasser gewaschen und dann mit einer Geschwindigkeit von 5 ml je Minute mit einer 0,025-m Phosphatpufferlösung vom pH 7 eluiert. Es werden 10-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden gegen ein RTEM-ß-Lactamase-Präparat auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität untersucht. Diejenigen Fraktionen mit einer guten hemmenden Aktivität und einem Gehalt an Natriumsalzen
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
o5
15
641 805
der Verbindungen der Formeln I und II, nämlich die Fraktionen 12 bis 32, werden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen werden gefriergetrocknet. Der gefriergetrocknete Feststoff wird in 20 ml voll entsalztem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 2 g Natriumchlorid versetzt und dann auf eine 1,5 x 15 cm grosse Säule mit «Amberlite XAD-4» gegeben, die mit voll entsalztem Wasser aufgezogen worden ist. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 2 ml je Minute mit einem Gemisch aus 1 Teil n-Propanol und 4 Teilen Wasser eluiert. Es werden 4-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität und auf die Reaktion mit Silbernitratlösung untersucht. Diejenigen Fraktionen mit einer guten hemmenden Aktivität und einer negativen Reaktion mit Silbernitrat, nämlich die Fraktionen 7 bis 14, werden vereinigt und gefriergetrocknet, so dass man ein teilweise gereinigtes Präparat der Salze der Verbindungen der Formeln I und II erhält. Dieses unreine Präparat kann nach den vorstehend beschriebenen Verfahren weiter gereinigt werden.
Beispiel 14
Fermentationsbedingungen für eine 3000-Liter-Fermentation Eine gefriergetrocknete Ampulle von Streptomyces olivaceus ATCC 31365 wird in 10 ml einer sterilen Lösung von 2% Glucose und 1% Sojabohnenmehl vom pH 6,5 in voll entsalztem Wasser resuspendiert.
1 ml dieser Suspension wird auf 100 ml eines Mediums der gleichen Zusammensetzung überimpft, die in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben enthalten ist und mit einem Schaumstopfen verschlossen. Nach dem Überimpfen wird der Kolben 30 Stunden bei 28 °C auf einem Drehschüttler bebrütet. Dann werden 5-ml-Anteile des Anzuchtmediums zur Impfung eines festen Schrägagars in Roux-Flaschen überimpft. Der Agar hat die folgende Zusammensetzung:
V8-Gemüsesaft 20,0%
«Bacto-Agar (Difco)» vom pH 6,0 2,5%
Die Zusammensetzung wir din voll entsalztem Wasser hergestellt.
Jede Roux-Flasche wird eine Woche lang bei 28 °C bebrütet. Danach werden 100 ml steriles, voll entsalztes Wasser mit einem Gehalt von 0,1% einer grenzflächenaktiven Verbindung («Triton X») zu einer Roux-Flaschenkultur zugefügt und die Sporen durch Schütteln suspendiert. Die Sporensuspension wird als Impfstoff zu 75 Liter sterilisiertem Anzuchtmedium in einem Fermenter mit rostfreien Leitblechen gegeben. Die Zusammensetzung des Mediums ist
Sojabohnenmehl 1%
Glucose 2%
Antischaummittel (Pluronic L81 ») 0,03% in destilliertem Wasser
Das Medium wird 20 Minuten bei 120 °C in dem Fermenter mit Dampf sterilisiert. Die Anzuchtkultur wird mittels eines 19,05 cm Leitschaufelrührers mit 140 U/min gerührt und mit einer Geschwindigkeit von 75 Liter je Minute mit steriler Luft durch das offene Ende des Rührers belüftet. Die Einhaltung der Temperatur von 28 °C wird überprüft. Nach 48stündiger Bebrütung unter diesen Bedingungen werden 7,5 Liter dieses Anzuchtmediums als Impfstoff für 150 Liter steriles Fermentationsmedium in einem 300 Liter Fermenter überimpft, der vollständig mit rostfreien Leitblechen ausgerüstet ist. Das Fermentationsmedium besitzt die folgende Zusammensetzung:
Sojabohnenmehl 0,9%
Glucose 2,0%
Kreide 0,02%
CoCh-ÓHzO 0,0001%
Antischaummittel («Pluronic L81 ») 0,2%
Vor der Sterilisation betrug der pH-Wert 6,0. Die Zusammensetzung wird mit destilliertem Wasser hergestellt.
Das Fermentationsmedium wird mit einem 21,59-cm-Tur-binenmischer mit 340 U/min gerührt. Es wird die Einhaltung der Temperatur bei 29 °C kontrolliert. Mit einer Geschwindigkeit von 50 Liter je Minute wird Luft zugeführt und der pH-Wert bei 6,5 bis 7,0 gehalten.
Die Fermentationsprodukte können nach einer Zeit von 48 bis 54 Stunden geerntet werden.
Beispiel 15
Fermentationsbedingungen für einen 2000-Liter-Fermenta-tionsansatz
Die Fermentationsbedingungen bis zu und einschliesslich der Anzucht entsprechen im wesentlichen den in Beispiel 14 beschriebenen Bedingungen. Es werden 75 Liter Anzucht zum Impfen eines 1500 Liter sterilen Fermentationsmediums verwendet, das sich in einem 2000 Liter, voll mit Leitblechen ausgerüsteten rostfreien Fermenter befindet. Das Fermentationsmedium ist das gleiche wie in Beispiel 14.
Die Fermentationsbrühe wird mit 2 Turbinenmischern mit einem jeweiligen Durchmesser von 48,26 cm und mit 106 U/ min gerührt. Mit einer Geschwindigkeit von 400 Liter je Minute wird Luft eingeleitet. Die Temperatur wird auf 29 °C und der pH-Wert bei 6,5 bis 7,0 gehalten, und der Fermenter wird nach 48 Stunden abgeerntet.
Beispiel 16
Isolationsverfahren für die Herstellung von im wesentlichen reinen Natriumsalzen der Verbindungen der Formeln I und II 150 Liter des Gesamtmediums, das im wesentlichen wie in Beispiel 14 beschrieben hergestellt worden ist, werden in einer kontinuierlich arbeitenden Zentrifuge bei annähernd 2,4 Liter/Minute geklärt. 120 Liter des geklärten Filtrats der Fermentationsflüssigkeit werden an einer Säule mit einem Durchmesser von 15,24 cm und einem Bettvolumen von 9,6 Liter, die mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz («Amberlite IRA 458») in der Chloridform gefüllt ist, mit einer Geschwindigkeit von 400 ml je Minute perkoliert. Die Säule ist zuvor mit voll entsalztem Wasser aufgezogen worden. Nach dem Perkolieren des Filtrats der Züchtungsflüssigkeit wird die Säule mit dem halben Bettvolumen Wasser gewaschen, dann mit einer Geschwindigkeit von 230 ml je Minute mit einer 0,05-m-Natriumphosphatpufferlösung vom pH 7 mit einem Gehalt von 0,2-m Natriumchlorid eluiert. Es werden 2-Liter-Fraktionen gesammelt. Diejenigen Fraktionen mit einer guten hemmenden Aktivität gegenüber einem Rtem-ß-Lactamase-Präparat, nämlich die Fraktionen 2 bis 11, werden vereinigt. Dann werden 46,75 g/Liter Natriumchlorid den vereinigten Fraktionen zugesetzt, so dass diese eine Konzentration von 1-m NaCl enthalten. Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule von 10,16 cm Durchmesser und einem Bettvolumen von 4 Liter und einer Füllung von «Amberlite XAD-4» gegeben und mit einer 1-m-Natriumchloridlösung ins Gleichgewicht gebracht.
Die Perkolationsgeschwindigkeit beträgt 200 ml je Minute. Dann wird die Säule mit 10 Liter voll entsalztem Wasser und dann mit einem Gemisch von 4 Teilen Wasser und 1 Teil Isopropanol jeweils mit einer Geschwindigkeit von 100 ml/Minute eluiert. Die Fraktionen mit einer guten ß-Lactamase hemmenden Aktivität gegenüber einem RTEM-Enzym-Präparat, nämlich die Fraktionen 3 bis 10 und 13 bis 17, wer5
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den vereinigt, zum Entfernen des Isopropanols unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet.
Es wird eine 3,8 x 30 cm grosse Säule mit schwach basischem Anionenaustauscherharz «Cellulose DE52» in der Chloridform mit voll entsalztem Wasser vorbereitet. Der gefriergetrocknete Feststoff aus der Entsalzungsstufe wird in 300 ml voll entsalztem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit einer Geschwindigkeit von 6 ml je Minute auf die Säule mit «Cellulose DE52» gegeben. Die Säule wird mit 200 ml voll entsalztem Wasser gewaschen und dann mit 0,025-m Kaliumphosphatpufferlösung vom pH 7 mit einer Geschwindigkeit von 2,5 ml je Minute eluiert. Es werden 10-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden auf ihre ß-Lactamase hemmende Aktivität untersucht. Die ersten beiden Hauptma-xima der Aktivität, nämlich die Fraktionen 30 bis 85, die das Natriumsalz der Verbindung der Formel I enthalten, und die Fraktionen 86 bis 130, die das Natriumsalz der Verbindung der Formel II enthalten, werden jeweils für sich vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen 30 bis 85 werden auf eine 3,8 x 29 cm grosse Säule mit «QAE-Sephadex A25» in der Chloridform, die mit voll entsalztem Wasser aufgezogen worden ist, gegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 3 ml je Minute mit einer 0,1-m-Natriumchloridlösung eluiert. Es werden 18-ml-Fraktionen gesammelt.
Die Fraktionen, die ine gute RTEM-ß-Lactamase hemmende Aktivität aufweisen, nämlich die Fraktionen 58 bis 68, werden vereinigt. Zu dieser Lösung (180 ml) werden 9 g Natriumchlorid gegeben. Die erhaltene Lösung wird auf eine 1,5 x 15-cm-Säule mit «Amberlite XAD-4» gegeben. Die Säule wird mit 135 ml voll entsalztem Wasser und dann mit einem Gemisch aus 4 Teilen Wasser und 1 Teil Isopropanol mit einer Geschwindigkeit von 3 ml je Minute eluiert. Es werden 4,5-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen mit UV-Spektren, die für die teilweise gereinigten Natriumsalze der Verbindungen der Formel I charakteristisch sind, nämlich UV-Maxima bei annähernd 297 nm - es handelt sich um die Fraktionen 8 bis 16 und 34 bis 40 - werden vereinigt und gefriergetrocknet, so dass man 53 bzw. 42 mg Feststoffe mit den charakteristischen Eigenschaften von im wesentlichen reinen Natriumsalzen der Verbindungen der Formel I erhält.
Die Fraktionen 86 bis 130 aus der Säule mit «Cellulose DE52» werden auf eine 3,8 x 29 cm grosse Säule mit «QAE-Sephadex A25» in der Chloridform gegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 3 ml je Minute mit 0,1-m Natriumchloridlösung eluiert. Es werden 18-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen werden auf ihre RTEM-ß-Lacta-mase hemmende Aktivität untersucht. Diejenigen Fraktionen mit einer guten Wirkung, nämlich die Fraktionen 94 bis 100, werden vereinigt (120 ml). Zu den vereinigten Fraktionen werden 6 g Natriumchlorid gegeben. Die erhaltene Lösung wird auf eine 1,5 x 15 cm grosse Säule mit «Amberlite XAD-4» gegeben. Die Säule wird mit 90 ml voll entsalztem Wasser und dann mit einem Gemisch aus 4 Teilen Wasser und 1 Teil Isopropanol jeweils mit einer Geschwindigkeit von 3 ml je Minute eluiert. Es werden 4-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen mit den charakteristischen Spektren der unreinen Natriumsalze der Verbindungen der Formel II mit einem Maximum bei annähernd 307 nm, nämlich die Fraktionen 10 bis 16 und 26 bis 32, werden vereinigt und gefriergetrocknet, so dass man 9,7 bzw. 21,7 mg Feststoffe erhält.
Diese Feststoffe besitzen Eigenschaften, die im wesentlichen mit den reinen Antriumsalzen der Verbindungen der Formel II übereinstimmen.
Beispiel 17
Wahlweise anzuwendendes weiteres Verfahren zur Gewinnung der Natriumsalze der Verbindungen der Formeln I und II
Das Filtrat der Kulturbrühe (120 Liter), das die Natriumsalze der Verbindungen der Formeln I und II enthält, wird gemäss der Arbeitswseise des Beispiels 16 an einem Ionenaustauscherharz in der Chloridform («Amberlite IRA 458») Chromatographien und mit einem Ionenaustauscherharz entsalzt («Amberlite XAD-4»).
Der entsalzte gefriergetrocknete Feststoff wird in 300 ml entsalztem Wasser gelöst und auf eine Cellulosesäule in der Chloridform (3,8 x 25 cm, «Cellulose DE52») aufgegeben. Diese Säule wird mit 200 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit 0,025-m Kaliumphosphatpuffer, pH 7, mit einer Geschwindigkeit von 6 ml je Minute eluiert. Es werden 20-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen, die eine gute RTEM-ß-Lactamase-Hemmwirkung zeigen (350 ml) werden vereinigt und auf eine Säule mit vernetztem Dextran (3,8 x 30 cm, «QAE-Sephadex A25») aufgegeben. Die Säule wird mit 0,18-m Natriumchlorid mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/ Minute eluiert. Es werden 20-ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihres UV-Spektrums analysiert. Fraktionen, die die charakteristischen Absorptionseigenschaften der Natriumsalze der Verbindungen der Formel I (Fraktionen 50 bis 56) bzw. für das Natriumsalz der Verbindung der Formel II (Fraktionen 88 bis 97) zeigen, werden getrennt vereinigt.
Die Fraktionen 50 bis 56 werden mit 15 g Natriumchlorid versetzt und auf eine Ionenaustauschersäule aufgegeben (1,5 x 15 cm, «Amberlite XAD-4»). Die Säule wird mit 15 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit Wasser/n-Pro-panol im Verhältnis 4:1 mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/ Minute eluiert. Es werden 3-ml-Fraktionen gesammelt. Fraktionen, die das charakteristische UV-Spektrum des gereinigten Natriumsalzes der Verbindung der Formel I zeigen (Fraktionen 9 bis 15), werden vereinigt, zur Entfernung des Pro-panols unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 35 mg eines Feststoffes, der die Eigenschaften des reinen Natriumsalzes der Verbindung der Formel I zeigt.
Die Fraktionen 88 bis 97 werden mit 24 g Natriumchlorid versetzt und auf eine Ionenaustauschersäule (1,5 x 15 cm, «Amberlite XAD-4») aufgegeben. Die Säule wird mit 15 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit Wasser/n-Propanol im Verhältnis 4:1 eluiert. Die Fraktionen, die das charakteristische UV-Spektrum des reinen Natriumsalzes der Verbindung der Formel II zeigen, werden vereinigt, zur Entfernung des Propanols unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 34 mg des reinen Natriumsalzes der Verbindung der Formel II.
Beispiel 18
Das Filtrat der Kulturbrühe (105 Liter) wird gemäss der Arbeitsweise des Beispiels 16 mit Ionenaustauschersäulen des Typs «Amberlite IRA 458» und «Amberlite XAD-4» aufgearbeitet. Die Fraktionen aus der «Amberlite-XAD-4»-Säule werden zur Entfernung des Isopropanols auf das halbe Volumen eingeengt und etwa 65 Stunden bei 5 °C gelagert. Die Lösung (800 ml) wird auf eine Säule mit vernetztem Dextran in entionisiertem Wasser (3,8 x 30 cm, «QAE-Sephadex A25») aufgegeben. Die Säule wird mit 800 ml 0,05-m Natriumchlorid, dann mit 0,1-m Natriumchlorid mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/Minute eluiert. Es werden 20-ml-Fraktionen gesammelt, die auf ihre RTEM-ß-Lactamase-Hemmwirkung und anhand ihrer UV-Spektren analysiert werden. Die Fraktionen, die das Natriumsalz der Verbindung der Formel I (Fraktionen 73 bis 80) bzw. das Natriumsalz der Verbindung der Formel II (Fraktionen 112 bis 125) enthalten, werden getrennt vereinigt.
Die Fraktionen 73 bis 80 werden unter vermindertem Druck auf etwa 15 ml eingeengt und auf eine Polyacrylamid-gelsäule (3,8 x 30 cm, «Biogel P2», Teilchengrösse 0,3 bis 0,4
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mm, der Fa. Biorad Laboratories, Bromley, Kent), die mit 1% Butanol enthaltendem Wasser aufgezogen wurde, aufgegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/ Minute mit 1% Butanol enthaltendem entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 6-ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihres UV-Spektrums und der Silbernitratreaktion analysiert. Fraktionen, die das Natriumsalz der Verbindung der Formel I enthalten und eine negative Silbernitratreaktion zeigen (Fraktionen 29 bis 39), werden vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 72 mg eines Feststoffes mit den charakteristischen Eigenschaften des gereinigten Natriumsalzes der Verbindung der Formel I.
Die Fraktionen 112 bis 125 werden auf etwa 15 ml unter vermindertem Druck eingeengt und auf die oben beschriebene Polyacrylamidgelsäule aufgegeben. Die Säule wird mit entionisiertem Wasser, das 1% Butanol enthält, mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute eluiert. Es werden 6-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen, die das charakteristische UV-Spektrum des Natriumsalzes der Verbindung der Formel II sowie eine negative Silbernitratreaktion zeigen, werden vereinigt (Fraktionen 43 bis 48). Die vereinigten Fraktionen werden gefriergetrocknet, man erhält 27 mg eines Feststoffes mit den charakteristischen Eigenschaften des reinen Natriumsalzes der Verbindung der Formel II.
Beispiel 19
1500 Liter der gemäss Beispiel 15 hergestellten Gesamtbrühe werden durch Diatomeenerde auf einem drehbaren Hilfsschichtfilter filtriert. Man erhält 1400 Liter Filtrat, das durch eine Ionenaustauschersäule in der Chloridform («Amberlite IRA 458») mit einem Durchmesser von 30,5 cm und einem Bettvolumen von 100 Litern mit einer mittleren Durchflussgeschwindigkeit von 4 Litern pro Minute aufgegeben wird. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 1,6 Litern/Minute mit 0,2-m Natriumchlorid in 0,05-m Natriumphosphatpuffer, pH 6,7, eluiert. Es werden 20-Liter-Fraktio-nen gesammelt. Fraktionen mit einer guten antibakteriellen Wirkung gegen Klebsiella aerogenes A (eine Variante von NCTC 418) werden vereinigt (Fraktionen 1 bis 5). Diese Fraktionen werden mit Natriumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 1,0-m versetzt. Die Lösung wird auf eine Ionenaustauschersäule («Amberlite XAD-4») mit einem Durchmesser von 15,3 cm und einem Bettvolumen von 22,4 Litern mit einer Geschwindigkeit von 1,2 Litern/Minute aufgegeben. Diese Säule wird mit 20 Litern entionisiertem Wasser, dann mit Wasser/Isopropanol im Verhältnis 4:1 mit einer Geschwindigkeit von 500 ml/Minute eluiert. Es werden 8-Liter-Fraktionen gesammelt.
Die Fraktionen, die die gewünschten Salze enthalten (Fraktionen 2 bis 4) werden vereinigt (24 Liter) und auf 11,4 Liter eingedampft. Das Konzentrat wird nach Einstellen des pH-Werts auf 7,0 etwa 65 Stunden bei 5°C gelagert. Die Lösung wird dann auf 3,75 Liter weiter eingeengt und auf eine Cellulosesäule (7,8 x 31 cm, «DE 52») mit einer Geschwindigkeit von 6 ml/Minute aufgegeben. Die Säule wird mit 0,025-m Kaliumphosphatpuffer, pH 7, mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/Minute eluiert. Es werden 22-ml-Fraktionen gesammelt und auf ihre RTEM-ß-Lactamase-Hemmwirkung untersucht. Die Fraktionen 60 bis 135 und 136 bis 210 zeigen gute Hemmwirkung und werden getrennt vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen 60 bis 135 (1580 ml) werden auf eine Säule mit vernetztem Dextran (4,8 x 25 cm, «QAE-Sephadex A25») mit einer Geschwindigkeit von 6 ml/Minute aufgegeben. Diese Säule wird mit 0,1-m Natriumchlorid mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/Minute eluiert. Es werden 20-ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihrer UV-Spektren analysiert. Die Fraktionen, die das charakteristsiche Spektrum des Natriumsalzes der Verbindung der Formel I zeigen (Fraktionen 50 bis 70), werden vereinigt.
Die Fraktionen 136 bis 210 werden auf eine Säule mit vernetztem Dextran (4,8 x 26 cm) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 6 ml/Minute aufgegeben. Die Säule wird mit 0,1-m Natriumchlorid mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/ Minute eluiert. Es werden 20-ml-Fraktionen gesammelt. Fraktionen mit den charakteristischen Spektren der teilweise gereinigten Salze der Verbindungen der Formel II (Fraktionen 91 bis 104) werden vereinigt, mit 25 g Natriumchlorid versetzt und auf eine Ionenaustauschersäule (2,4 x 32 cm, «Amberlite XAD-4») mit einer Geschwindigkeit von 6 ml/Minute aufgegeben.
Die Säule wird mit etwa 50 ml entionisiertem Wasser gewaschen und mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Minute mit Wasser/n-Propanol im Verhältnis 4:1 eluiert. Es werden 10-ml-Fraktionen gesammelt. Fraktionen, die eine negative Silbernitratreaktion auf Chlorid ergeben, jedoch das charakteristische UV-Spektrum des Natriumsalzes der Verbindung der Formel II haben, werden vereinigt (Fraktionen 17 bis 30). Diese Fraktionen weden unter vermindertem Druck zur Entfernung des n-Propanols eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 585 mg des reinen Natriumsalzes der Verbindung der Formel II.
Beispiel 20
Die Natriumsalze der Verbindungen der Formeln I und II haben folgende Eigenschaften:
1. UV-Spektrum: Die vermischten Natriumsalze der Verbindungen der Formel I haben ein charakteristsiches Maximum bei etwa 297 nm.
Die vermischten Natriumsalze der Verbindungen der Formel II haben ein charakteristisches Maximum bei etwa 307 nm (1 von 2).
2. Das IR-Spektrum der Natriumsalze zeigt bei 1750 cm-1 charakteristsiche ß-Lactamcarbonylabsorptionen.
3. Die in vitro antibakterielle Aktivität der in den vorherigen Beispielen beschriebenen Verbindungen ist in der Tabelle zusammengestellt.
Organismus
Natriumsalz der
Natriumsalz der
Verbindung der
Verbindung der
Formel I ;
Formel II ;
Mindesthemm-
Mindesthemm-
konzentrationen konzentrationen
((ig/ml)
(Hg/ml)
Bacillus subtilis A
0,8
0,2
Enterobacter cloacae N1
25,0
25,0
Escherichia coli 10418
1,5
1,5
Klebsiella aerogenes A
12,5
6,25
Proteus mirabilis C977
6,25
6,25
Pseudomonas aeruginosa A
>100
>100
Salmonella typhimurium CT 10
3,12
0,8
Serratia marcescens US39
50,0
25,0
Staph. aureus Oxford
0,8
1,5
Beispiel 21
Die praktisch reinen vermischten Natriumsalze der Verbindungen der Formeln Ia und Ib werden durch Hochdruck-flüssigchroamtographie unter folgenden Bedingungen geprüft:
Säule: 300 x 3,9 mm, gefüllt mit einer monomolekularen Octadecylsilanschicht auf einem festen Träger.
Lösungsmittel: 0,05-m Ammoniumacetat, eingestellt auf pH 4,5 mit Essigsäure in 5% Acetonitril/95% Wasser.
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Fliessgeschwindigkeit: 2,5 ml/Minute.
Nachweis: UV-Absorption bei 295 nm.
Aufgabe: 50 Mikroliter einer Lösung von 1,6 mg in 0,5 mi Wasser.
Die beiden Natriumsalze werden in zwei Gipfel aufgelöst von 3 Min. 45 Sek. und 4 Min. 45 Sek. Die Eluate beider Gipfel werden getrennt vereinigt und mit verdünnter Natronlauge auf pH 7 neutralisiert. Die Lösungen werden eingedampft, man erhält die gewünschten festen Salze der Verbindungen der Formeln Ia und Ib.
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Beispiel 22
Gemäss der Arbeitsweise des Beispiels 21 werden die gemischten Natriumsalze der Verbindung der Formeln IIa und IIb durch Hochdruckflüssigchromatographie mit Ver-5 weilzeiten von 6,0 Minuten bzw. 7 Minuten 10 Sekunden aufgetrennt.
Beispiel 2~$
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Filtrat der Züchtungsflüssigkeit
Absorption an einem stark basischen Harz "Amberlite
IRA 458"
Eluieren mit 0,2-m NaCl in Pufferlösung
Vereinigen der Fraktionen, die die Verbindungen der Formeln Ia, Ib, IIa und IIb enthalten v
Entsalzen an "Amberlite XAD-4" Eluieren mit Isopropanol/ Wasser
Eindampfen unter vermindertem Druck zum Entfernen des Isopropanols
Ia, Ib
Entsalzen an "Amberlite XAD-4"
y
Gefriertrocknen der Fraktionen mit einem Gehalt an den Verbindungen Ia, Ib
Chromato-
Chromatographie an "QAE-Sephadex
V
IIa, IIb
V
Entsalzen an "Amberlite XAD-4"
graphie an "QAE-Sephadex
Fraktionen mit einem Gehalt an den Verbindungen Ia, Ib
Gefriertrocknen der Fraktionen mit einem Gehalt an den Verbindungen IIa, IIb
Chromatographie an Diaion HP20"
1/
Chromatographie an Diaion HP20"
vy
Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung IIa
Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung IIb
Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung Ia
Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung Ib ir Chromatographie -an "Biogel P2"
v/
Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung IIa v
Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung IIb
Chromatographie , an "Biogel P2" ^
v
Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung Ia
V
Fraktionen mit einem Gehalt an der Verbindung Ib v
IIa
Chromatographie an "Diaion HP20" und ^ ^efriertrocknen
\/ IIb
Chromatographie an "Diaion HP20" und ^1/Gefriertrocknen
Ia, Ib, IIa und IIb bedeuten hier die Natriumsalze
Ia
Ib
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Die Sporen von Streptomyces olivaceus ATCC 31365 werden gemäss der Arbeitsweise des Beispiels 14 gezüchtet.
Die Sporensuspension aus einer Roux-Flasche wird als Inoculum für 75 Liter sterilisiertes Nährmedium in einem 100 Liter fassenden, mit Leitblechen versehenen Fermenter aus rostfreiem Stahl verwendet. Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung :
Sojabohnenmehl 1%
Glucose 2%
Antischaummittel («Pluronic L81») 0,03% in destilliertem Wasser
Das Medium wird in dem Fermenter 20 Minuten bei 120°C mit Dampf sterilisiert. Die Nährlösung wird mit 140 U/min mittels eines Leitschaufelrührer mit 19 cm Durchmesser gerührt und durch eine offenendige Sprüheinrichtung mit 75 Liter/Minute steriler Luft versorgt. Die Temperatur wird auf 28° C eingeregelt. Anch 48stündiger Bebrütung unter diesen Bedingungen werden 75 Liter dieser Kulturlösung als Inoculum für 1500 Liter steriles Nährmedium in einem 2000 Liter fassenden Fermenter aus rostfreiem Stahl, der mit Leitblechen versehen ist, verwendet. Das Fermentationsmedium hat folgende Zusammensetzung:
Sojabohnenmehl 2,0%
Glucose 0,9%
Kreide 0,02%
CoCh • 6H2O 0,0001%
Antischaummittel («Pluronic L81 ») 0,2%
in destilliertem Wasser, vor der Sterilisation auf pH 6 eingestellt
Das Fermentationsmedium wird mit 2 Scheiben-Turbinenmischern mit einem Durchmesser von je 48 cm bei 106 U/ min gerührt und mit Luft mit einer Geschwindigkeit von 400 Liter/Minute versorgt. Die Temperatur wird auf 29 °C, der pH-Wert auf 6,5 bis 7,0 gehalten. Die Ernte erfolgt nach 48 Stunden.
Ein weiteres für die Extraktion der Verbindungen der Formeln Ia, Ib, IIa und IIb geeignetes Kulturfiltrat wird erhalten, indem man die Sporensuspension von S. olivaceus aus 2 Roux-Flaschen als Inoculum für 150 Liter steriles Nährmedium in einem 300 Liter fassenden Stahlfermenter verwendet. Das Medium und die Wachstumsbedingungen sind wie oben beschrieben. Nach 48 Stunden werden 150 Liter dieses Mediums zur Beimpfung von 3000 Liter Fermentationsbrühe in einem 5000 Liter fassenden Fermenter aus Stahl verwendet. Das Fermentationsmedium wird wie oben bebrütet, die Ernte erfolgt jedoch erst nach 55 Stunden.
Die Kulturbrühen aus den beiden 2000 und 5000 Liter fassenden Fermentern geben zusammen ein Volumen von 4725 Liter. Sie werden auf einem drehbaren Hilfsschichtfilter unter vermindertem Druck filtriert. Man erhält 4200 Liter klare Brühe, die auf Säulen mit stark basischem Anionenaustauscherharz in der Chloridform («Amberlite IRA 458») mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 10 Liter/Minute aufgegeben werden. Das Harz wird mit 60 Liter entionisiertem Wasser gewaschen, dann mit einer wässrigen Lösung von 0,2-m Natriumchlorid und 0,075-m Natriumphosphat, pH 6,7, eluiert. Die Elution der Verbindungen der Formeln Ia, Ib, IIa und IIb beginnt, wenn die Leitfähigkeit des Eluiermittels die Leitfähigkeit von 0,1-m Natriumchlorid erreicht hat und wenn 450 Liter Eluiermittel abgeflossen sind. Wenn notwendig, wird die Anwesenheit von Verbindungen der Formeln Ia, Ib, IIa und IIb mittels analytischer Hochdruckflüssigchromatographie gemäss Beispiel 21 bestimmt.
Die vereinigten Eluate, die die Verbindungen der Formeln
Ia, Ib, IIa und IIb enthalten, werden mit 90 kg (Feuchtgewicht) Ionenaustauscherharz («Amberlite XAD-4») versetzt. Das Gemisch wird mit 50prozentiger Salzsäure auf pH 6,0 eingestellt und 1 Stunde bei 50 C schwach gerührt. Das Harz wird dann abfiltriert und mit entionisiertem Wasser bei 5°C gewaschen, bis die Leitfähigkeit des Waschwassers unter der von 0,05-m Natriumchlorid ist. Das gewaschene Harz wird in 42 Liter Isopropanol/Wasser im Verhältnis 1:1 aufge-schlämmt und mit 20prozentiger Natronlauge versetzt, bis der pH-Wert konstant auf 7,5 bleibt. Das Eluiermittel wird filtriert und gesammelt. Die Elution des Harzes wird zuerst mit weiterem Isopropanol/Wasser im Verhältnis 1:1, dann mit Isopropanol/Wasser im Verhältnis 1:3 wiederholt. Die vereinigten Eluate (130 Liter) werden unter vermindertem Druck zur Entfernung des Isopropanols eingedampft. Die erhaltene Lösung (67 Liter) wird auf eine Säule mit vernetztem Dextran (15 x 43 cm, «QAE-Sephadex A25»), die mit 0,1-m Natriumchlorid vorbehandelt wurde, mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 15 Liter/Std. aufgegeben. Die Säule wird mit 7,5 Liter 0,05-m Natriumchlorid gewaschen und mit 0,1-m Natriumchlorid mit einer Geschwindigkeit von 7,8 Liter/Stunde eluiert. Es werden 500-ml-Fraktionen gesammelt, die mittels Hochdruckflüssigchromatographie auf die Anwesenheit von Verbindungen der Formeln Ia, Ib, IIa und IIb untersucht werden. Fraktionen, die die Verbindungen der Formeln Ia und Ib enthalten, die zusammen eluiert wurden, werden vereinigt (12,6 Liter). Fraktionen, die die Verbindungen der Formeln IIa und IIb enthalten, eluieren später und werden ebenfalls vereinigt (5,9 Liter).
Die die Verbindungen der Formeln Ia und Ib enthaltenden Fraktionen werden mit 44,16 g/Liter Natriumchlorid versetzt und auf eine Ionenaustauschersäule (10 x 36 cm, «Amberlite XAD-4») mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5,8 Liter/Stunde aufgegeben. Die Säule wird mit 3 Liter entionisiertem Wasser mit einer Geschwindigkeit von 2,9 Liter/Stunde gewaschen, dann mit Isopropanol/Wasser im Verhältnis 1:9 eluiert. Die Fraktionen, die die Verbindungen der Formeln Ia und/oder Ib in genügenden Mengen enthalten (bestimmt durch Hochdruckflüssigchromatographie), werden gesammelt, nachdem die Leitfähigkeit des Eluats der Leitfähigkeit von 0,01-m Natriumchlorid entspricht. Die die Verbindungen der Formeln Ia und Ib enthaltende eluierte Lösung (7,7 Liter) wird auf pH 7,0 mit 20prozentiger Natronlauge eingestellt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 38,5 g eines Feststoffes.
Die vereinigten Eluate aus der Säule mit dem vernetzten Dextran, die die Verbindungen der Formeln IIa und IIb enthalten, werden entsprechend behandelt. Man erhält 13,7 g Feststoff.
Das die Verbindungen der Formeln Ia und Ib enthaltende gefriergetrocknete Produkt (38,5 g) wird in 50 ml entionisiertem Wasser gelöst und auf eine Säule mit vernetztem Dextran (7,8 x 30 cm, «QAE-Sephadex A25») in entionisiertem Wasser aufgegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 8 ml/Minute zuerst mit 4 Liter 0,05-m Natriumchlorid gewaschen, dann mit 0,08-m Natriumchlorid eluiert. Es werden Fraktionen von etwa 20 ml gesammelt und anhand ihres UV-Spektrums auf die Anwesenheit von Verbindungen der Formeln Ia und Ib untersucht (Fraktionen 130 bis 170). Diese Fraktionen werden vereinigt (950 ml). Die Chromatographie wird bei 50 C durchgeführt.
450 ml dieser vereinigten, die Verbindungen der Formeln Ia und Ib enthaltenden Fraktionen werden mit 23,8 g Natriumchlorid versetzt und auf eine Säule (4,8 x 62 cm, «Diaion HP20» der Firma Mitsubishi Chemicals Ltd., Agents Nippon Rensui Co., Tokio, Japan) mit einer Geschwindigkeit von 12 ml/Minute aufgegeben. Es werden 20-ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihrer UV-Spektren bestimmt. Die Fraktio5
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nen, die die Verbindung der Formel Ia (Fraktionen 58 bis 74) bzw. die Verbindung der Formel Ib (Fraktionen 78 bis 97) enthalten, werden getrennt vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 490 bzw. 357 mg Feststoff.
Das restliche Eluat aus der Dextrankolonne wird entsprechend aufgearbeitet, man erhält 363 bzw. 258 mg Feststoff.
538 mg des die Verbindung der Formel Ia enthaltenden Feststoffes werden in 25 ml entionisiertem Wasser gelöst und auf eine Polyacrylamidgelsäule (7,8 x 40 cm, «Biogel P2», Teilchengrösse 0,3 bis 0,4 mm) aufgegeben. Die Säule wird bei 5 °C mit entionisiertem Wasser mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute eluiert. Es werden 25-ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihrer UV-Septkren analysiert. Fraktionen, die ein charakteristsiches Spektrum für sehr reine Verbindungen der Formel Ia aufweisen (Fraktionen 37 bis 42), werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa 10 ml eingeengt. Diese Lösung wird auf eine «Diaion-HP20»-Säule (3,0 x 50 cm) aufgegeben und mit entionisiertem Wasser mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Minute eluiert. Es werden 10-ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihrer UV-Spektren analysiert. Fraktionen mit einem charakteristischen Spektrum für sehr reine Verbindungen der Formel Ia (Fraktionen 50 bis 62) werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält 40 mg der Verbindung der Formel Ia als Feststoff.
5,8 mg des die Verbindung der Formel Ib enthaltenden Feststoffes werden in etwa 25 ml entionisiertem Wasser gelöst und auf eine Polyacrylamidgelsäule (7,8 x 40 cm) aufgegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute mit entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 25-ml-Fraktionen gesammelt. Fraktionen, die sehr reine Verbindungen der Formel Ib enthalten (Fraktionen 32 bis 37, bestimmt anhand ihres UV-Spektrums), werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf etwa 10 ml eingeengt. Die Lösung wird auf eine «Diaion-HP20»-Säule (2,4 x 40 cm) aufgegeben und mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Minute mit entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 10-ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihres UV-Spektrums analysiert. Fraktionen, die sehr reine Verbindungen der Formel Ib enthalten (Fraktionen 35 bis 48), werden vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 53 mg der Verbindung der Formel Ib als Feststoff.
7 g des die Verbindungen der Formeln IIa und IIb enthaltenden gefriergetrockneten Feststoffes aus der mit «Amberlite XAD-4» durchgeführten Entsalzungsbehandlung werden in 50 ml entionisiertem Wasser gelöst und auf eine «Diaion-HP20»-Säule (4,8 x 57 cm) aufgegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 10 ml/Minute mit entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 20-ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihres UV-Spektrums analysiert. Fraktionen, die die Verbindung der Formel IIa (49 bis 63) bzw. IIb (71 bis 110) enthalten, werden getrennt vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 875 mg bzw. 1,47 g Feststoff.
Der restliche, die Verbindungen der Formeln IIa und IIb enthaltende Feststoff wird entsprechend aufgearbeitet, man erhält 860 mg bzw. 1,44 g Verbindungen der Formeln IIa bzw. IIb.
860 mg der Verbindung der Formel IIa werden in 25 ml entionisiertem Wasser gelsöt und auf eine Polyacrylamidgelsäule (7,8 x 40 cm, «Biogel P2», Teilchengrösse 0,3 bis 0,4 mm) aufgegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute mit entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 25-ml-Fraktionen gesammelt. Fraktionen, die sehr reine Verbindung der Formel IIa enthalten (Fraktionen 42 bis 50, bestimmt anhand ihres UV-Spektrums), werden vereinigt, auf etwa 10 ml unter vermindertem Druck eingedampft und auf eine «Diaion-HP20»-Säule (2,8 x 40 cm) aufgegeben. Die Säule wird mit entionisiertem Wasser eluiert. Die Fraktionen,
deren UV-Spektrum auf sehr reine Verbindung der Formel IIa hinweist (Fraktionen 52 bis 64), werden vereinigt, eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält 95 mg der Verbindung der Formel IIa als Feststoff.
750 mg der Verbindung der Formel IIb werden in etwa 25 ml entionisiertem Wasser gelöst und auf eine Polyacrylamidgelsäule (7,8 x 40 cm, «Biogel P2», Teilchengrösse 0,3 bis 0,4 mm) gegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 3 ml/Minute mit entionisiertem Wasser eluiert. Es werden 25-ml-Fraktionen gesammelt. Fraktionen, deren UV-Spektrum auf sehr reine Verbindung der Formel IIb hinweist (Fraktionen 47 bis 55), werden vereinigt, unter vermindertem Druck auf etwa 10 ml eingedampft und auf eine «Diaion-HP20»-Säule (2,8 x 42 cm) aufgegeben. Die Säule wird mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Minute mit entionisiertem Wasser eluiert. Die ersten 25 Fraktionen werden als 5-ml-Fraktionen, die restlichen Fraktionen als 10-ml-Fraktionen gesammelt und anhand ihres UV-Spektrums analysiert. Fraktionen, die sehr reine Verbindung der Formel IIb (Fraktionen 77 bis 91) enthalten, werden vereinigt und gefriergetrocknet. Man erhält 105 mg der Verbindung der Formel IIb als Feststoff.
Beispiel 24
Die gemäss Beispiel 23 hergestellten Natriumsalze der Verbindungen der Formeln Ia, Ib, IIa und IIb sind rein und haben folgende Eigenschaften:
1. UV-Spektrum
Ia: ein einzelnes Maximum bei 298 nm (molare Extinktion 6 = 8131) (vgl. Fig. 1).
Ib: ein einzelnes Maximum bei 301 nm (molare Extinktion s =7930) (vgl. Fig. 2).
IIa: 2 Maxima bei 228 und 308-309 nm (s= 13627) (vcgl. Fig. 3).
IIb: 2 Maxima bei 229 und 308-310 nm (s= 13933) (vgl. Fig. 4).
2. Die antibakterielle Aktivität der Natriumsalze wird durch die Microtiter-Methode bestimmt und ist in Tabelle A angegeben.
3. Die ß-Lactamase-Hemmwirkung der Natriumsalze ist in Tabelle B angegeben.
4. NMR-Spektren (jeweils bestimmt in D2O)
Ia: vgl. Fig. 5
Ib : vgl. Fig. 6
IIa: vgl. Fig. 7
IIb: vgl. Fig. 8
5. Die synergistische Aktivität der Natriumsalze ist in Tabelle C angegeben.
6. Die Natriumsalze haben bei Mäusen nach subkutaner Verabreichung in einer Dosis von 50 mg/kg keine toxische Wirkung.
Tabelle A Mindesthemmkonzentrationen (ng/ml)
Stamm Ia Ib IIa IIb Ampicil lin
B. subtilis
0,16
1,2
<0,08 2,5
<3,0
Enterobacter cloacae N.l
2,5
10
2,5
10
200
E. coli 10418
0,3
2,5
0,3
5,0
<3,0
E. coli JT39
5,0
2,5
5,0
5,0
800
E. coli JT68
5,0
2,5
10
5,0
1600
E. coli JT410
0,6
5,0
0,6
5,0
200
Klebsiella A
2,5
5,0
1,2
5,0
100
Klebsiella E70
10
5,0
10
10
400
Klebsiella Ba95
40
10
40
10
>6400
Proteus mirabilis C977
0,6
10
0,6
10
<3,0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
DD
641 805
22
Stamm la Tb IIa IIb Ampicillin
Proteus mirabilis C889 5,0 10 10 20 400 Proteus morganii 1580 2,5 10 2,5 20 100 Proteus vulgaris Q3618 5,0 10 10 20 400 Pseudomonas aeruginosa A > 160 > 160 > 160 > 160 1600
Salmonella CT10 Serratia US39 Staph. Oxford Staph. Russell Staph. Smith Strep. faecalis
0,3 20 1,25 0,6 0,6
2,5 10 1,2 2,5 2,5
1,25 20
0,3 20 0,3 0,3 0,6 1,2
5,0 10 2,5 2,5 2,5 20
<0,3 1600 <3,0 400 <3,0 <3,0
Tabelle B
Iso (jxg/ml)
Verbindung Enterobacter Ps.aerug. Proteus E.coli Staph.
P99 A C889 JT4 Russell
15
Tabelle C
Mindesthemmkonzentrationen (ug/ml)
Verbindung
Staph. aureus Russell
E. coli JT39
Ampicillin allein
1000
2000
+ (Ia) 0,1 ug/ml
>10
>500
1 ug/ml
-
500
+ (Ib) 0,1 ug/ml
>10
500
1 p.g/ml
10
31,2
+ (IIa) 0,1 ug/ml
10
>500
1 jig/ml
-
500
-t- (IIb) 0,1 ug/ml
>10
500
1 ug/ml
10
31,2
IIa 0,02
IIb 0,04
Ia 0,02
Ib 0,04
3,0
0,04
4,0
0,4
4,0
0,1
4,0
>2,0
>2,0 0,08
0,1 >2,0
>2,0 3,25
0,28 >2,0
4 Blatt Zeichnungen

Claims (31)

  1. 641 805
  2. 2. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel Ia und deren Salze.
    2
    PATENTANSPRÜCHE 1. Derivate der 3-Thio-6-(l-hydroxyäthyl)-7-oxo-l-aza-bicyclo[3,2,0]hept-2-en-2-carbonsäure der Formeln I und II
    und deren Salze.
  3. 3
    641 805
    h s-c=c-nh-co-ch.
    h
    (Hb)
    und deren Salze. >5
    // ^ 3
    und deren Salze.
    3. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel Ib 40
    ^— s-ch2~ch2-nh-cö-ch3
    und deren Salze.
  4. 4
    net durch einen Gehalt an einem Penicillin oder Cephalosporin als Zusatzstoff.
    42. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 39 bis 41, gekennzeichnet durch einen Gehalt von 50 bis 500 mg der aktiven Komponente.
    43. Arzneimittel nach einem der Ansprüche 39 bis 42 in injizierbarer Form.
    In den britischen Patentschriften 1467 413, 1489235 und 1483 142, die den deutschen Offenlegungsschriften 2513 855, 2513 854 und 2609766 entsprechen, ist beschrieben, dass bei der Fermentation von Streptomyces olivaceus Antibiotika hergestellt werden können, die als «MM 4550, MM 13902 und MM 17880» bezeichnet worden sind und die die nachstehenden Formeln III, IV und V besitzen:
    H03S0
    ho3so
    C-NH-CO-CH.
    (III)
    S-C=C-NH-CO-CH3
    (IV)
    h„c h h
    4. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel IIa
    H3C H
    J I I
    h
    — s-c=c-nh-co-ch-
  5. 5. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel IIb
  6. 6. Pharmakologisch verträgliche Salze der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
  7. 7. Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
  8. 8. Natriumsalze der Verbindungen nach einem der 20 Ansprüche 1 bis 5.
  9. 9. Kaliumsalze der Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
  10. 10. Ein Salz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 mit einem Reinheitsgrad von mindestens 50%. 25
  11. 11. Ein Salz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 mit einem Reinheitsgrad von mindestens 75%.
  12. 12. Ein Salz nach einem der Ansprüche 6 bis 9 mit einem Reinheitsgrad von mindestens 90%.
  13. 13. Ein Salz der Verbindung der Formel Ia nach einem 20 der Ansprüche 6 bis 12, das frei von einem Salz der Verbindung der Formel Ib ist.
  14. 14. Ein Salz der Verbindung der Formel Ib nach einem der Ansprüche 6 bis 12, das frei von einem Salz der Verbindung der Formel Ia ist. 35
  15. 15. Ein Salz der Verbindung der Formel IIa nach einem der Ansprüche 6 bis 12, das frei von einem Salz der Verbindung der Formel IIb ist.
  16. 16. Ein Salz der Verbindung der Formel IIb nach einem der Ansprüche 6 bis 12, das frei von einem Salz der Verbin- 40 dung der Formel IIa ist.
  17. 17. Ein Alkalimetallsalz der Verbindung der Formel Ia nach Anspruch 2 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter 7700.
  18. 18. Ein Salz nach Anspruch 17 mit einem molaren Extink- 45 tionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter 7900.
  19. 19. Natriumsalz nach Anspruch 17 oder 18.
  20. 20. Ein Alkalimetallsalz der Verbindung der Formel Ib nach Anspruch 3 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten 50 in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter 7700.
  21. 21. Ein Salz nach Anspruch 20 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter 7900.
  22. 22. Natriumsalz nach Anspruch 20 oder 21. 55
  23. 23. Ein Alkalimetallsalz der Verbindung der Formel IIa nach Anspruch 4 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter 13 000.
  24. 24. Ein Salz nach Anspruch 20 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von 60 nicht unter 13500.
  25. 25. Natriumsalz nach Anspruch 23 oder 24.
  26. 26. Ein Alkalimetallsalz der Verbindung der Formel IIB nach Anspruch 5 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten in Wasser bei neutralem pH-Wert von nicht unter 13 000. 05
  27. 27. Ein Salz nach Anspruch 20 mit einem molaren Extinktionskoeffizienten von nicht unter 13500.
  28. 28. Natriumsalz nach Anspruch 23 oder 24.
  29. 29. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm von Streptomyces olivaceus oder Streptomyces gedanensis züchtet, bis eine wesentliche Menge der Verbindungen erzeugt ist und danach die Verbindungen aus dem Züchtungsmedium gewinnt.
  30. 30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces olivaceus ATCC 31126 verwendet.
    31. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces olivaceus ATCC 31365 verwendet.
    32. Verfahren nach einem der Ansprüche 29-31 zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel Ia, das praktisch frei von einer Verbindung der Formel Ib ist, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem auf Polystyrol basierenden Polymerisatabsorptionsmittel oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.
    33. Verfahren nach einem der Ansprüche 29-31 zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel Ib, das praktisch frei von einer Verbindung der Formel Ia ist, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem auf Polystyrol basierenden Polymerisatabsorptionsmittel oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.
    34. Verfahren nach einem der Ansprüche 29-31 zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel IIa, das praktisch frei von einer Verbindung der Formel IIb ist, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem auf Polystyrol basierenden Polymerisatabsorptionsmittel oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.
    35. Verfahren nach einem der Ansprüche 29-31 zur Herstellung eines Salzes der Verbindung der Formel IIb, das praktisch frei von einer Verbindung der Formel IIa ist, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gemisch dieser Salze einer chromatographischen Trennung an einem auf Polystyrol basierenden Polymerisatabsorptionsmittel oder einem äquivalenten Austauscherharz unterwirft.
    36. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 35 zur Herstellung eines Alkalimetallsalzes.
    37. Verfahren nach Anspruch 36 zur Herstellung des Natriumsalzes.
    38. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 37, dadurch gekennzeichnet, dass man als Lösungsmittel Wasser verwendet.
    39. Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Derivat der 3-Thio-6-(l-hydroxyäthyl)-7-oxo-l-azabi-cyclo-[3,2,0]hept-2-en-2-carbonsäure der Formel I oder II oder deren Salzen als aktive Komponente.
    40. Arzneimittel nach Anspruch 39, gekennzeichnet durch einen Gehalt an pharmakologisch verträglichen Trägermaterialien, Verdünnungsmitteln, Exzipientien und/oder Zusatzstoffen.
    41. Arzneimittel nach Anspruch 39 oder 40, gekennzeich-
    641 805
  31. 31 • i h03s0
    S-CH2-CH2-NH-CO-CH3
    (V)
    In keiner dieser britischen Patentschriften bzw. deutschen Antibiotika vorhanden sind, die isoliert worden sind.
    Offenlegungsschriften findet sich ein Hinweis, dass aus der
CH233978A 1977-03-05 1978-03-03 Derivatives of 3-thio-6-(1-hydroxyethyl)-7-oxo-1-azabicyclo-[3.2.0]hept-2-ene-2-carbo xylic acid, process for their preparation and medicaments containing these compounds CH641805A5 (en)

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